CN116808296A - 一种基于微流控纺丝的细胞支架及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于微流控纺丝的细胞支架及其制备方法和应用，属于生物组织工程支架技术领域，使用海藻酸钠与GelMa在LPA和钙盐的作用下制备细胞支架，所述细胞支架包含以下百分质量的各组分：海藻酸钠2‑4%、GelMa5‑15%、LPA0.1‑0.5%、超纯水80.5‑92.9%，GelMA用紫外灯直射20秒，海藻酸钠接触到2%氯化钙溶液即可使溶胶转变为凝胶，联合离子的化学交联和UV的物理交联赋予复合水凝胶稳定的物理形构和生化性能。GelMA结构中的RGD序列使得材料具有生物响应性，便于支架表面细胞的信号传导和相互作用，本发明能够以明胶制得生物相容性与机械强度高的细胞支架。
Description
技术领域
本发明涉及生物组织工程支架技术领域，具体涉及一种基于微流控纺丝的细胞支架及其制备方法和应用。
背景技术
细胞体外三维培养是组织工程和类器官制造的基础，支架培养模型中细胞的生长环境更加接近生物活性组织的内环境。在传统二维培养中，单层细胞的接触抑制导致平面无法形成复杂的组织结构，并且二维平面的硬度大于胞外基质，贴壁后的细胞被过度拉伸会导致基因与蛋白的异常表达，使其形态与体内差距悬殊，三维培养时细胞支架充当了细胞外基质的角色，提供了细胞黏附位点，从而促进三维组织形成。细胞支架还为细胞提供足够的生长空间以及物质交换通道。 虽然支架的组成和表面化学性质决定其细胞生物相容性，但是支架的结构特征如孔径、形态和孔隙度等，对细胞的黏附、增殖、迁移和分化能力也起着重要的调节作用。除了允许细胞穿透外，支架结构还将允许营养物质和氧气流入，并利于去除细胞产生的废物以增加细胞存活率。
水凝胶是一种具有三维网络结构的聚合物材料，具有高度水合特性，通常生物相容性良好，机械性能可调节，降解率可预测。同时，其与细胞外基质含水量以及自然组织力学性能相似，可为种子细胞提供一个良好的迁移增殖分化平台。天然水凝胶及其衍生材料包括明胶、胶原蛋白、壳聚糖、海藻酸盐、透明质酸等，具有细胞信号传导能力，可以在细胞间产生相互作用，然而，天然水凝胶仍存在机械强度低，结构降解不受控制，免疫原性未知等问题。合成水凝胶材料包括聚乙二醇、聚乙烯醇等，这些材料降解性能和微观结构虽可控，但缺乏相应的生物组分。
现有技术中具有通将海藻酸钠与钙离子进行结合从而制得的复合水凝胶能增强其机械性能，例如公开号为CN109646713B的一种藻酸盐/纳米黏土复合微载体及制备方法及装置中就使用了海藻酸钠进行水凝胶的制备，但是在精细化3D细胞支架的制作上，公开文件中的海藻酸钠在适配于gelma时对钙离子结合时发现了很多问题，发现不适用于微纤维的制作，原因在于精细化制备细胞支架时，与海藻酸钠相适配的钙离子会由于浓度原因发生凝胶结构软塌以及交联度弱的现象，使得细胞支架不能形成完整的结构，最终产生不稳定的生长环境和不好的生物相容性。
下面针对现有细胞生长环境以及手段进行详细描述：
天然材料和合成材料复合配制打印支架的方法引起广泛的关注，甲基丙烯酸明胶水凝胶（GelMa）结合了天然和合成水凝胶的优点，保留了明胶的大部分功能氨基酸序列，同时采用光固化的交联方式保证其形态可塑性。目前已可保证诱导多能性干细胞、 间充质干细胞、 胚胎干细胞等多种细胞移植与组织修复时的活性。
常见的细胞培养三维支架材料包括水凝胶支架、 脱细胞的组织或器官，以及三维多孔支架、纤维和微球在内的其它预成型功能支架。 细胞在支架材料上成功增殖与分化后，还需设计结构成型方法使其形成宏观的工程化组织，目前微载体成型，静电纺丝成型、生物3D打印成型等技术已被研究证实为可行的支架制备手段。
而现有的甲基丙烯酸明胶水凝胶为了保证其精细制备细胞支架，能够制备成纤维类管状结构，但是其成分不能进行3D打印的操作，原因是明胶为胶原的降解产物，是一种温敏材料，低温固态、高温转为液态，其打印温度较难控制，我们通过化学改性明胶，接枝甲基丙烯酸酐基团得到光固化明胶(GelMA)，可在紫外光照射下均匀挤出，海藻酸钠是从海藻中分离的多糖聚合物，生物相容性与机械强度较高，但在打印过程中需与交联剂反应，才能实现材料的三维结构成形。
且现有技术将还具有以下缺点：
1.二维培养不能模拟体内细胞生长行为。
传统二维培养（2D）过程中，单层细胞一般在平坦的固体表面生长，由于接触抑制很难在孔板平面上形成复杂的组织结构，并且二维平面的硬度大于胞外基质，贴壁后的细胞被过度拉伸后会导致基因与蛋白的异常表达，使其形态差别于生物活体组织；
2.支架材料孔隙尺寸不当。
静态播种条件下，大孔径材料会增加细胞在支架空间中的穿透能力，但也相应减小了细胞和支架间的相互作用，导致细胞难以附着，并且较大的孔隙率不利于保持支架的机械性能，随着孔隙率的增加，机械性能往往呈指数下降；孔隙率较小的支架不能为细胞提供充足空间使细胞迁移和增殖，从而导致细胞聚集并因此呈现较低的活性；适当的微孔隙利于营养物质的交换，并能吸附充足的特定蛋白质来满足细胞的生长需求。
3.单一组分水凝胶支架性能有限。
天然水凝胶机械强度低，结构降解不受控制，免疫原性未知。合成水凝胶材料降解性能和微观结构虽可控，但缺乏相应的生物组分。单一水凝胶材料性能有局限，不适合用于体内，作为细胞培养的支架；
4.缺乏能仿生体内脉管系统的特定形态的细胞支架。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种基于微流控纺丝的细胞支架及其制备方法和应用，能够以明胶制得生物相容性与机械强度高的细胞支架。
为解决上述技术问题，本发明提供一种基于微流控纺丝的细胞支架，包括复合水凝胶和钙盐；
所述复合水凝胶由以下质量百分计的物质组成：
海藻酸钠2-4%；
GelMa5-15%；
LPA0.1-0.5%；
其余由纯化水补足至100%；
所述钙盐是0.1%的氯化钙。
进一步的，所述钙盐的液相载体是10%的聚乙烯醇。
本发明选用了2%低粘度海藻酸钠和10%甲基丙烯酸酐-明胶（GelMA），前者在0.1%氯化钙作用下化学交联，后者在光引发剂0.1%Lap的催化下物理交联形成超分子交联网络。
海藻酸钠是一种多糖类天然高分子聚合物，可溶于水，价格低廉，来源丰富，且可与二价离子如Ca2+、Zn2+、Cu2+形成离子型水凝胶，本发明选择0.1%浓度的氯化钙，利用钙离子置换海藻酸钠中的钠离子，形成海藻酸钙，而海藻酸钙是不溶于水的，形成交联的致密的凝胶体系。随着氯化钙浓度的增加，海藻酸钠拉伸强度和吸水率呈先增加后降低的趋势。
当内相氯化钙浓度低于0.1%时：由于Ca2+与Na+的交换速度缓慢，导致Ca2+与海藻酸钠的交联程度较低, 凝固能力过弱，中空通道易闭合及外相凝胶层较薄，所以随着氯化钙浓度的增加，凝胶的交联程度逐渐增大，因而拉伸程度也逐渐变大，与此同时交联程度的增大导致凝胶内部结构的致密，其吸水率也逐渐增大。
当氯化钙达到0.1%时：海藻酸钙凝胶的拉伸强度和吸水率最大。
当氯化钙浓度高于0.1%时，由于氯化钙浓度过高，在凝胶的表面迅速形成致密的交联结构，阻碍了Ca2+向外壁凝胶的扩散，使得外部不能形成完整的凝胶结构，凝胶变软塌，这又直接影响了凝胶的拉伸强度。
海藻酸钠的最终浓度决定了复合水凝胶的机械强度，浓度越高，杨氏模量越大，如图1。
甲基丙烯酸酐-明胶(GelMA)通常由天然细胞外基质提取纯化而得——明胶(gelatin)通过化学修饰加上甲基丙烯酸酐(MA)制备。由于明胶在动物皮肤、肌膜等组织中广泛存在，是一种易获得的天然细胞外基质，具备良好的生物相容性，可作为神经干细胞(nSC)、间充质干细胞(mSC)等多种干细胞的培养基质。
当GelMA浓度低于5%时，预制胶黏度过低，流动性大，在UV固化前不能维持稳定，容易在收集液中分离散失。
当GelMA浓度高于15%时，预制胶黏度过大，对环境温度变化敏感，在室温低于25℃时容易凝固，堵塞装置，流动性和打印适性降低。
Lap作为光引发剂，其浓度对水凝胶的最终交联度至关重要，水凝胶的交联度又决定了形成材料的孔隙率和含水量。
当Lap浓度低于0.1%时，水凝胶不能充分和快速交联，不能在收集液中形成连续螺旋下降的纤维丝或形成的纤维机械强度低，中空通道塌陷变形。
当Lap浓度高于0.5%时，水凝胶交联度过高交联过快，容易在装置出口处交联，堵塞导管，且浪费光引发剂，增耗成本。
GelMA和海藻酸钠混合，联合紫外光和氯化钙交联进行微流控纺丝，既能保障固化后材料的机械强度，且可通过各组分的配比浓度对固化后材料弹性模量进行调节，获得不同硬度和孔隙率的生物材料。
GelMA的混入为支架提供了细胞黏附位点，相当于支架的功能组分，若使用单纯海藻酸钠，中空纤维内的细胞不能贴壁，只能互相聚团形成细胞球，如图2。
且GelMA结构中的明胶联合海藻酸钠影响到纤维的弹性和黏度，当择取外相GelMA10%，海藻酸钠2%，内相氯化钙0.1%微流控纺丝，形成的中空纤维拉伸时的弹性模量与小鼠体内的食管粘膜相仿，见图3。
本发明的另一目的在于提供一种基于微流控纺丝的细胞支架的制备方法，具体制备步骤如下：
S1、复合水凝胶的制备，首先制备出甲基丙烯酸酐化明胶，将甲基丙烯酸酐化明胶、海藻酸钠和LPA使用超纯水进行涡旋混合，形成复合水凝胶；
S2、微流控装置的搭建，使用两根直径不同的粗中空玻璃管和细中空玻璃管同轴放置，使得细中空玻璃管的内外两侧形成内腔与外腔，并使用两个注射器分别连通内腔与外腔，注射器受到微流量泵的驱动，在连接于内腔的注射器内装入内相逃逸材料，在连接于外腔的注射器内装入复合水凝胶外相；
S3、参数设定与打印，控制微流量泵对注射器进行推进，使得内向逃逸材料与复合水凝胶外相通过内腔与外腔后形成中空的纤维材料，形成纤维，对纤维进行横竖交叠打印形成细胞支架。
进一步的，所述内相逃逸材料由质量百分浓度为10%的聚乙烯醇和0.1%的氯化钙的物质组成，其余由纯化水补足至100%。
进一步的，所述步骤S2中粗中空玻璃管与细中空玻璃管的直径比为3：1，所述粗中空玻璃管的内径与外径之比为1：2，所述细中空玻璃管的内径与外径比为1：1.2。
进一步的，所述内相逃逸材料的流速与复合水凝胶外相的流速比值为1：2-10。
进一步的，所述甲基丙烯酸酐化明胶包括如下质量计的具体成分：
2份明胶、1份无水碳酸钠、200份超纯水、4份甲基丙烯酸酐、20份氢氧化钠。
进一步的，所述甲基丙烯酸酐化明胶的制备方法如下：
将明胶和无水碳酸钠充分溶解到超纯水中，得到溶液A，将甲基丙烯酸酐缓慢滴加到溶液A中，滴加时间控制在2min，得到溶液B；
将溶液B热水浴中持续搅拌1h，其间每10min用氢氧化钠调节PH至9，滴加5次，得到溶液C；
将溶液C热水浴下透析，每2h换一次水，换水至少20次，将透析产物放在-80℃冰箱预冻2h,真空干燥5天，得到GelMa。
进一步的，所述溶液A、溶液B以及溶液C的温度均保持在50℃下进行操作。
本发明的另一目的在于提供一种基于微流控纺丝的细胞支架的制备方法在制备细胞支架时的应用。
生物支架的制造是组织工程领域研究的重要内容之一，理想的生物支架必须拥有良好的生物相容性，满足细胞生长条件的同时不与人体发生排斥现象，具有一定的力学性能且可体内降解。
微流控3D打印技术在组织工程领域的应用为生物支架的制造提供了一种新的思路，其拥有快速、精确的优点，同时可根据需求进行个性化定制；
另外，利用3D打印技术能同时打印细胞和材料，相较于传统细胞种植的办法，获得的组织工程支架细胞分布更均匀，有利于细胞的生长及分化。
目前，组织工程中应用较多的有挤压式3D打印、喷墨3D打印及激光3D打印。
其中，挤压式3D打印是通过喷头将熔融状态的材料按照预先设定的路径挤出、沉积并且凝固成形，最终经过逐层累加得到所需的组织工程支架。
相较于其他两种方式，挤压式3D打印拥有更快的打印速度和更好的沉积效果，节省打印时间、减少细胞损伤。
挤压式3D打印仍面临着许多问题，如打印精度过低、材料剪切造成细胞死亡，喷头堵塞及材料从喷嘴剪切形成液滴而导致无法纺丝是挤压式3D打印亟待解决的问题之一，此问题与打印材料的特性以及打印工艺密不可分；实际应用中，还要求材料能被打印成所需形状，如薄膜，网格，三维结构等。微流控3D打印就能很好的规避这些问题，能轻易地挤出连续长度的纤维，对微流体进行精确控制和变速，通过改变微流控芯片的设计，生物打印墨水的种类以及对应的交联方式还可形成不同形态和通道走形的纤维。
常用于微流控3D打印的材料有胶原蛋白、明胶、海藻酸钠、纤维蛋白、壳聚糖等。胶原蛋白是人体含量最丰富的蛋白质，生物相容性高，但力学性能与打印性能均较差；明胶为胶原的降解产物，是一种温敏材料，低温固态、高温转为液态，其打印温度较难控制，我们通过化学改性明胶，接枝甲基丙烯酸酐基团得到光固化明胶(GelMA)，可在紫外光照射下均匀挤出，海藻酸钠是从海藻中分离的多糖聚合物，生物相容性与机械强度较高，但在打印过程中需与交联剂反应，才能实现材料的三维结构成形。我们使用同轴的毛细玻璃装置，在内相通低浓度的氯化钙与外相含有的海藻酸钠形成稳定层流的同时实现打印前的预交联，便于流出成型的纤维丝并不断堆叠游移，从而打印形成网格状支架。
支架的收集液为0.1%氯化钙，便于支架上下两层的纤维交接处部分粘连，形成交错的网格，若氯化钙浓度过低，海藻酸钠易解交联，靠单一组分GelMA的光固化所形成的支架，机械强度太低。若氯化钙浓度过高，则纤维交接处不能很好粘连，支架结构易分散，不能形成完整的网格设计。
附图说明
图1为本发明单层中空纤维3D打印的实物示意图；
图2为本发明单层中空纤维3D打印网格状支架的光镜图；
图3为本发明不同组分浓度的水凝胶和食管粘膜的弹性模量对比示意图；
图4为本发明 海藻酸钠与GelMA-Alg分别制作中空纤维支架时负载细胞的状态示意图；
图5为本发明小鼠食管拉伸应变曲线示意图；
图6为本发明FITC-DEX在中空纤维通道中的灌注和渗透的示意图；
图7为本发明3D环境下验证生物相容性的细胞存活数量树状图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图1-7，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
甲基丙烯酸明胶水凝胶：GelMa、海藻酸钠：alginate、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：LAP
3D打印机的品牌为TWO TREES，型号为TT-1S打印机
实施例一
本实施例是对甲基丙烯酸酐化明胶、海藻酸钠、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂和超纯水的比例进行的相关测试以及论证，具体实施步骤如下：
S1、复合水凝胶的制备，首先制备出甲基丙烯酸酐化明胶，将20g明胶和10g无水碳酸钠在50℃充分溶解到200mL超纯水中；将4mL甲基丙烯酸酐缓慢滴加到锥形瓶中，滴加时间控制在2min；将上述溶液在50℃热水浴中持续搅拌1h，其间每10min用10%（W/V）的氢氧化钠调节PH至9，滴加5次，共需要20ml氢氧化钠；将上述混合初品在50℃热水浴下透析，每2h换一次水，换水至少20次：将透析产物放在-80℃冰箱预冻2h，真空干燥5天则完成GelMa制备；
用超纯水配置10% GelMa，2% Alginate和0.1% LAP的均一相稳定溶胶，涡旋混匀，避光，室温26℃保存；
称取一定质量的PVA(聚乙烯醇低粘度型)固体并用超纯水配成10%（W/V）浓度，并加入氯化钙，氯化钙的终浓度为0.1%，作为内相逃逸材料，室温26℃，能够保藏数周。
S2、微流控装置的搭建，去用两根粗中空玻璃管，粗中空玻璃管的内径为580μm，粗中空玻璃管外径为1.00mm，取其中一根粗中空玻璃管，使用拉管仪将一端拉出锥形尖端，然后使用砂纸将锥形尖端磨出平口，该平口的直径为400-500μm；取另一根粗中空玻璃管，使用便携式喷枪煅烧、热拉，并利用石刻笔在合适的位置裁取出长度约5cm的细中空玻璃管，细中空玻璃管的内径为100-150µm；将两根中空玻璃管浸没于无水乙醇放入超声清洗机中处理3-5min，去除管内静电吸附的粉尘和研磨产生的玻璃残渣，中空玻璃管清洁干燥后，将较粗的作为外管，细长的作为内管，同轴排列置于载玻片上，使用环氧树脂固定，细中空玻璃管与平口之间的距离控制为200µm左右，且空间居中；取两个平口的注射器针头用刀片分别切割出一个和两个豁口分别放在内外管的入口处，同样使用环氧树脂固定，放于通风干燥处，固化时间约6h，保证良好气密性，即完成微流控装置的搭建；
S3、参数设定与打印，首先将将3d打印机的机械喷嘴替换为自制的微流控装置，并联接电脑的ultimaker cura程序对打印速度，移动方向和走形等进行精确控制。关键参数为打印速度，设置打印速度为6mm/s，与微流控泵流体挤出速度2mL/h相匹配的，过快则打印机移动臂会拖行纤维，不能充分沉积和定型，过慢则纤维走形弯曲，不能保证支架形态的横平竖直，使用两根30cm的塑胶软管 将注射针头与吸有水凝胶的注射器相连接，塑胶软管的外径为1.5 mm，内径为1.02 mm，水凝胶外相的流体通道置于无光环境下，将注射器固定于微流量泵上，开启微流量泵，使得内相流速0.8 mL/h，外相流速2mL/h，水凝胶外相以及内向逃逸材料进行流动，进行微流控纺丝，二者相配合生成单层中空结构的水凝胶骨架，两相流体形成层流，产生平滑通道的水凝胶骨架，微流控纺丝前，内外相通道均要用超纯水充盈，保持通道润滑；
在内相逃逸材料与液态的复合水凝胶外相流出内腔与外腔预交联后，复合水凝胶外相形成固态的纤维，并重复纤维的制造过程，使用3D打印机进行3D打印，对纤维进行横竖交叠打印形成细胞支架。
使用0.1%的氯化钙作为收集液收集水凝胶骨架，使用5cm高度的玻璃瓶来接收氯化钙收集液与水凝胶管，用紫外灯固化仪直射流出的水凝胶骨架15s，状态稳定时可见螺旋下降的纤维丝状水凝胶骨架；外相的水凝胶在紫外光照条件下转变为凝固状态，而内相的PVA-205溶液流散溢出到收集液中，形成具有平滑的通道的中空纤维。
实施例二
本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶、海藻酸钠、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂三者的比例进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官，具体比例如下：
甲基丙烯酸酐化明胶：海藻酸钠：苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：超纯水=5：4：0.1：90.9；
实施例三
本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶、海藻酸钠、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂三者的比例进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官，具体比例如下：
甲基丙烯酸酐化明胶：海藻酸钠：苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：超纯水=15：3：0.1：81.9；
实施例四
本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶、海藻酸钠、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂三者的比例进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官，具体比例如下：
甲基丙烯酸酐化明胶：海藻酸钠：苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：超纯水=8：3：0.1：88.9；
实施例五
本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶、海藻酸钠、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂三者的比例进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官，具体比例如下：
甲基丙烯酸酐化明胶：海藻酸钠：苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：超纯水=12：2.5：0.1：85.4；
对比例一
本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶、海藻酸钠、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂三者的比例进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官，具体比例如下：
甲基丙烯酸酐化明胶：海藻酸钠：苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：超纯水=20：0：0.1：79.9；
对比例二
本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶、海藻酸钠、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂三者的比例进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官，具体比例如下：
甲基丙烯酸酐化明胶：海藻酸钠：苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：超纯水=2：10：0.1：87.9；
对比例三
本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶、海藻酸钠、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂三者的比例进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官，具体比例如下：
甲基丙烯酸酐化明胶：海藻酸钠：苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：超纯水=0：20：0.1：79.9；
实验方法
对实施例一、实施例二、对比例一、对比例二和对比例三制得的细胞支架置于万能材料机上选择拉伸模式，测试各种AG水凝胶的弹性模量，取5cm左右的样品将两端固定夹紧，位移和力调零开始测算，样品断裂时结束测试。比较不同浓度水凝胶纤维的拉伸应力与拉伸应变差异，为选择在弹性强度方面最为仿生的浓度组分作参考，如图3所示，并对制作得到的细胞支架进行相关的小鼠食管细胞负载，并进行拉伸，记录其拉伸曲线得到如图5所示的数据。
对实施例一制得的细胞支架，如图1所示进行细胞负载，同一时刻将等量细胞种植到孔板和细胞支架表面，第二天加入CCK8测量OD值计算细胞密度，以孔板中培养的细胞活性作为对照，即100%，如图7所示，可见纤维负载细胞活性高于70%，生物相容性良好。
对实施例一所制作的中空纤维进行细胞负载得到前后对照图，如图4所示。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于微流控纺丝的细胞支架，其特征在于，包括复合水凝胶和钙盐；
所述复合水凝胶由以下质量百分计的物质组成：
海藻酸钠2-4%；
GelMa5-15%；
LPA0.1-0.5%；
其余由纯化水补足至100%；
所述钙盐是0.1%的氯化钙。
2.如权利要求1所述的基于微流控纺丝的细胞支架，其特征在于，所述钙盐的液相载体是10%的聚乙烯醇。
3.一种基于微流控纺丝的细胞支架的制备方法，其特征在于，所述细胞支架的具体制备步骤如下：
S1、复合水凝胶的制备，首先制备出甲基丙烯酸酐化明胶，将甲基丙烯酸酐化明胶、海藻酸钠和LPA使用超纯水进行涡旋混合，形成复合水凝胶；
S2、微流控装置的搭建，使用两根直径不同的粗中空玻璃管和细中空玻璃管同轴放置，使得细中空玻璃管的内外两侧形成内腔与外腔，并使用两个注射器分别连通内腔与外腔，注射器受到微流量泵的驱动，在连接于内腔的注射器内装入内相逃逸材料，在连接于外腔的注射器内装入复合水凝胶外相；
S3、参数设定与打印，控制微流量泵对注射器进行推进，使得内向逃逸材料与复合水凝胶外相通过内腔与外腔后形成中空的纤维材料，形成纤维，对纤维进行横竖交叠打印形成细胞支架。
4.如权利要求3所述的基于微流控纺丝的细胞支架的制备方法，其特征在于，所述内相逃逸材料由质量百分浓度为10%的聚乙烯醇和0.1%的氯化钙的物质组成，其余由纯化水补足至100%。
5.如权利要求3所述的基于微流控纺丝的细胞支架的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中粗中空玻璃管与细中空玻璃管的直径比为3：1，所述粗中空玻璃管的内径与外径之比为1：2，所述细中空玻璃管的内径与外径比为1：1.2。
6.如权利要求3所述的基于微流控纺丝的细胞支架的制备方法，其特征在于，所述内相逃逸材料的流速与复合水凝胶外相的流速比值为1：2-10。
7.如权利要求3所述的基于微流控纺丝的细胞支架的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸酐化明胶包括如下质量计的具体成分：
2份明胶、1份无水碳酸钠、200份超纯水、4份甲基丙烯酸酐、20份氢氧化钠。
8.如权利要求3所述的基于微流控纺丝的细胞支架的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸酐化明胶的制备方法如下：
将明胶和无水碳酸钠充分溶解到超纯水中，得到溶液A，将甲基丙烯酸酐缓慢滴加到溶液A中，滴加时间控制在2min，得到溶液B；
将溶液B热水浴中持续搅拌1h，其间每10min用氢氧化钠调节PH至9，滴加5次，得到溶液C；
将溶液C热水浴下透析，每2h换一次水，换水至少20次，将透析产物放在-80℃冰箱预冻2h,真空干燥5天，得到GelMa。
9.如权利要求3所述的基于微流控纺丝的细胞支架的制备方法，其特征在于，所述溶液A、溶液B以及溶液C的温度均保持在50℃下进行操作。
10.权利要求3-9任一项所述的基于微流控纺丝的细胞支架的制备方法在制备细胞支架时的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310758786.2A CN116808296A (zh) | 2023-06-26 | 2023-06-26 | 一种基于微流控纺丝的细胞支架及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310758786.2A CN116808296A (zh) | 2023-06-26 | 2023-06-26 | 一种基于微流控纺丝的细胞支架及其制备方法和应用 |
Publications (1)
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| CN116808296A true CN116808296A (zh) | 2023-09-29 |
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ID=88119780
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| CN202310758786.2A Pending CN116808296A (zh) | 2023-06-26 | 2023-06-26 | 一种基于微流控纺丝的细胞支架及其制备方法和应用 |
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- 2023-06-26 CN CN202310758786.2A patent/CN116808296A/zh active Pending
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