CN116802288A - 核酸序列测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种核酸序列测定方法,通过杂交来测定细胞悬浮液中含有的具有特定核酸序列的目标RNA,所述核酸序列测定方法包括:将细胞悬浮液以加压状态在100~200℃下加热,得到RNA提取液的工序;向所述RNA提取液中添加蛋白质分解酶来进行反应,制备样品溶液的工序;将所述样品溶液供给到包括与所述目标RNA杂交的荧光探针的核酸序列测定用器件的工序;使所述目标RNA与所述荧光探针进行杂交反应的工序;以及测量来自所述核酸序列测定用器件的荧光的工序。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸序列测定方法。
背景技术
作为测定样品中含有的具有特定核酸序列的靶标的方法,众所周知的是使用DNA微阵列(具有特定核酸序列的互补序列的检测探针设置于基板等的固相面)的方法。该方法是如下方法:利用添加于DNA微阵列的样品中含有的靶标通过杂交反应被DNA微阵列的检测探针捕集的性质来测定靶标。在该方法中,除了能够测定样品中是否包含靶标,还能够测定样品中含有的靶标的量。在专利文献1中,公开了使用DNA微阵列来测定靶标的测定方法。
为了将靶标提供给DNA微阵列,需要提取成为靶标的核酸。在靶标是细菌等微生物中含有的核酸的情况下,已知通过酶处理或化学处理来熔解微生物的细胞膜等的方法,或者通过基于弗氏压碎器或珠磨器等产生的物理刺激的破碎等来提取核酸的方法。此外,在专利文献2中公开了如下方法:不使用酶处理或化学处理、物理处理,而使用密闭的容器,通过在高温下加热来提取核酸。
现有技术文献
专利文献1:日本专利公开公报特开2015-43702号
专利文献2:日本专利公开公报特开2012-157265号
然而,也考虑到如果能够不进行任何处理而直接通过上述专利文献1的核酸序列测定方法来测定含有所提取的靶标(RNA)的样品,则能够大幅削减靶标的测定所需的工夫和时间。但是,如果将含有靶标的样品直接应用于上述专利文献1的核酸序列测定方法,则在杂交反应时,存在样品中含有的蛋白质等夹杂物产生影响从而使测定精度恶化的问题。此外,有时样品溶液出现白色混浊而不能检测到从DNA微阵列发出的荧光。此外,在荧光测量时,作为所述夹杂物的蛋白质(以下也称为夹杂蛋白质)被激发光激发而呈现荧光,因此存在使背景光上升的问题。
发明内容
鉴于上述情况,本发明的目的在于提供一种核酸序列测定方法,该核酸序列测定方法能够削减测定所需的工夫和时间,并且能够高精度地测定样品溶液中含有的具有特定序列的RNA。
为了达成上述目的,本发明采用以下结构。
[1]一种核酸序列测定方法,通过杂交来测定细胞悬浮液中含有的具有特定核酸序列的目标RNA,所述核酸序列测定方法包括:将所述细胞悬浮液以加压状态在100~200℃下加热,得到RNA提取液的工序;向所述RNA提取液中添加蛋白质分解酶来进行反应,制备样品溶液的工序;将所述样品溶液供给到包括与所述目标RNA杂交的荧光探针的核酸序列测定用器件的工序;使所述目标RNA与所述荧光探针进行杂交反应的工序;以及测量来自所述核酸序列测定用器件的荧光的工序。
[2]根据[1]所述的核酸序列测定方法,其特征在于,在测量所述荧光的工序中,在不清洗供给到所述核酸序列测定用器件的样品溶液的状态下,测量来自所述核酸序列测定用器件的荧光。
[3]根据[1]或[2]所述的核酸序列测定方法,其特征在于,在得到所述RNA提取液的工序中,在密闭的容器中加热所述细胞悬浮液。
[4]根据[1]~[3]中任意一项所述的核酸序列测定方法,其特征在于,所述蛋白质分解酶是蛋白酶K。
[5]根据[1]~[4]中任意一项所述的核酸序列测定方法,其特征在于,所述核酸序列测定用器件包括:荧光探针,具有结合部和基端,并且荧光分子附加在顶端或中途的位置;消光探针,具有结合部和基端,并且在与所述荧光探针结合时,消光分子附加在接近所述荧光探针的荧光分子的位置;以及基板,具有分别固定所述荧光探针的基端和所述消光探针的基端的固相面,所述荧光探针的结合部和所述消光探针的结合部具有相互互补的序列,所述荧光探针和所述消光探针的至少一方具有检测部,所述检测部具有与所述目标RNA的核酸序列互补的序列,在未发生所述目标RNA与所述检测部的杂交的情况下,通过维持所述荧光探针的结合部与所述消光探针的结合部的结合,通过接近所述荧光分子的所述消光分子,所述荧光分子所呈现的荧光被消光,在发生了所述目标RNA与所述检测部的杂交的情况下,通过所述荧光探针的结合部与所述消光探针的结合部的结合被解除,以从所述消光分子分离的所述荧光分子成为呈现荧光的位置关系的方式,所述荧光探针和所述消光探针各自的基端固定于固相面。
根据本发明的核酸序列测定方法,具有如下效果:能够削减测定所需的工夫和时间,并且能够高精度地测定样品溶液中含有的具有特定序列的RNA。
附图说明
图1是表示本发明的核酸序列测定方法的一例的流程图。
图2是表示在本发明的核酸序列测定方法中使用的核酸序列测定用器件的结构例的图。
图3是表示探针的结构例的图。
图4是示意性地表示检测目标RNA的原理的图。
图5是表示核酸序列检测装置的结构例的图。
图6是在实验例1中,在140℃下加热并提取RNA,通过电泳确认了所得到的RNA片段的片段长度的图。
图7是在实验例1中,在160℃下加热并提取RNA,通过电泳确认了所得到的RNA片段的片段长度的图。
图8是在实验例2中测量了添加蛋白质分解酶来进行反应时的滴加了荧光分子的基板所呈现的斑点光量的图表。
图9是在实验例2中测量了未添加蛋白质分解酶时的滴加了荧光分子的基板所呈现的斑点光量的图表。
具体实施方式
下面,参照附图,对本发明的实施方式的核酸序列测定方法进行详细说明。以下,首先对本发明的实施方式的概要进行说明,接着对本发明的实施方式的详细情况进行说明。
[概要]
本发明的实施方式能够削减测定所需的工夫和时间,并且能够高精度地测定样品溶液中含有的具有特定序列的RNA。上述专利文献1所公开的方法使用核酸序列测定器件(DNA微阵列)来测定靶标,该核酸序列测定器件设置有附加了荧光分子的荧光探针和附加了对荧光分子的荧光进行消光的消光分子的消光探针作为检测探针。在该方法中,不进行对靶标的荧光分子的附加以及DNA微阵列的清洗(用于除去未被捕集的靶标等的清洗),就能够测定靶标。
在该方法中,在使用DNA微阵列来测定特定核酸的有无或量的核酸序列测定器件中,在不存在靶标时,相互独立的荧光探针和消光探针经由结合部维持结合,通过消光分子对荧光分子的荧光进行消光。在供给了靶标的情况下,靶标与检测部结合,经由结合部的荧光探针与消光探针的结合被解除,消光分子从荧光分子脱离,由此荧光分子呈现荧光。通过使用该核酸序列测定器件,能够测定样品中含有的靶标。
上述专利文献2所公开的核酸提取方法包括:将细胞悬浮液导入容器的工序;密闭所述容器的工序;在密闭了所述容器的状态下将容纳于所述容器的所述细胞悬浮液加热到100℃以上的规定最高温度的工序。
但是,如果将含有靶标的样品直接应用于上述专利文献1的核酸序列测定方法,则存在如下问题:在杂交反应时,样品中含有的蛋白质等夹杂物产生影响,使测定精度恶化。此外,有时样品溶液出现白色混浊而不能检测到从DNA微阵列发出的荧光。此外,在荧光测量时,所述夹杂蛋白质被激发光激发而呈现荧光,因此存在使背景光上升的问题。
[实施方式]
本实施方式的核酸序列测定方法通过杂交来测定细胞悬浮液中含有的具有特定核酸序列的目标RNA,所述核酸序列测定方法包括:将所述细胞悬浮液以加压状态在100~200℃下加热,得到RNA提取液的工序;向所述RNA提取液中添加蛋白质分解酶来进行反应,制备样品溶液的工序;将所述样品溶液供给到包括与所述目标RNA杂交的荧光探针的核酸序列测定用器件的工序;使所述目标RNA与所述荧光探针进行杂交反应的工序;以及测量来自所述核酸序列测定用器件的荧光的工序。由此,能够削减测定所需的工夫和时间,并且能够抑制夹杂蛋白质的影响,高精度地测定样品溶液中含有的目标RNA。此外,在杂交反应时,能够抑制样品溶液出现白色混浊而降低荧光强度。此外,能够降低所述夹杂蛋白质引起的背景光。
以下,对本实施方式的核酸序列测定方法进行说明。图1是表示本发明的核酸序列测定方法的一例的流程图。以下,根据图1对本发明的核酸序列测定方法进行说明。
首先,将细胞悬浮液以加压状态在100~200℃下加热,得到RNA提取液(步骤S1)。作为成为RNA提取的对象的细胞没有特别限制,例如,可以列举微生物细胞等。
作为微生物,例如可以列举:不动杆菌(Acintobacter)种、放线菌(Actinomyces)种、气球菌(Aerococcus)种、气单胞菌(Aeromonas)种、产碱杆菌(Alclaigenes)种、芽孢杆菌(Bacillus)种、拟杆菌(Bacteriodes)种、博德特氏菌(Bordetella)种、布兰汉氏菌(Branhamella)种、短杆菌(Brevibacterium)种、弯曲杆菌(Campylobacter)种、念珠菌(Candida)种、嗜二氧化碳噬细胞菌(Capnocytophagia)种、色杆菌(Chromobacterium)种、梭菌(Clostridium)种、棒杆菌(Corynebacterium)种、隐球菌(Cryptococcus)种、异常球菌(Deinococcus)种、肠球菌(Enterococcus)种、丹毒丝菌(Erysielothrix)种、埃希氏菌(Escherichia)种、黄杆菌(Flavobacterium)种、孪生球菌(Gemella)种、嗜血杆菌(Haemophilus)种、克雷伯氏菌(Klebsiella)种、乳杆菌(Lactobacillus)种、乳球菌(Lactococcus)种、军团菌(Legionella)种、明串珠菌(Leuconostoc)种、李斯特菌(Listeria)种、微球菌(Micrococcus)种、分支杆菌(Mycobacterium)种、奈瑟菌(Neisseria)种、隐孢子虫(Cryptosporidium)种、诺卡菌(Nocardia)种、厄氏菌(Oerskovia)种、副球菌(Paracoccus)种、片球菌(Pediococcus)种、消化链球菌(Peptostreptococcus)种、丙酸杆菌(Propionibacterium)种、变形杆菌(Proteus)种、假单胞菌(Pseudomonas)种、拉恩氏菌(Rahnella)种、红球菌(Rhodococcus)种、红螺菌(Rhodospirillium)种、葡萄球菌(Staphlococcus)种、链霉菌(Streptomyces)种、链球菌(Streptococcus)种、弧菌(Vibrio)种和耶尔森菌(Yersinia)种等。本发明也可以应用于微生物以外的动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、支原体、病毒等。在本发明中的细胞中也可以混合存在多种如上所述的种类不同的细胞。此外,存在在贫营养状态下具有芽胞或胞子这样的形态的微生物,不论基于这样的生长状态的细胞的状态如何。
细胞悬浮液是通过将细胞悬浮在培养液、缓冲液等中而得到的。作为细胞悬浮液,可以是培养细胞的培养液,也可以是将培养细胞的培养液悬浮在缓冲液中的。在此,缓冲液是为了RNA的提取的稳定化、效率化等而使用的,例如使用三盐酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸钠缓冲液、SSC缓冲液(Saline Sodium Citrate Buffer)、SSPE缓冲液(Saline SodiumPhosphate-EDTA Buffer)、碳酸-碳酸氢缓冲液等。
接着,将细胞悬浮液以加压状态在100~200℃下加热,得到RNA提取液。作为将细胞悬浮液以加压状态在100~200℃下加热的方法,只要能够以大气压以上的压力在100~200℃下加热,则没有特别限制,例如,可以列举在将细胞悬浮液容纳在容器中并密闭所述容器之后,在100~200℃下加热的方法等。加热温度只要是100~200℃即可,虽然可根据所适用的细胞的种类等适当确定,但优选120~165℃,更优选120~160℃,特别优选140~160℃。通过将加热温度设为100~200℃,能够使目标RNA成为均匀且适当的片段长度。如果加热温度小于100℃,则有时从细胞提取目标RNA的效率降低。此外,有时目标RNA的片段长度过长,不能与荧光探针结合。此外,如果加热温度超过200℃,则有时目标RNA的片段长度过短,与荧光探针杂交的效率降低。
作为加压状态,只要是大气压以上,则没有特别限制,但优选100~1500kPa,更优选200~700kPa。通过将压力设为100~1500kPa,能够使目标RNA成为更均匀且适当的片段长度。如果压力小于100kPa,则有时从细胞提取目标RNA的效率降低。此外,有时目标RNA的片段长度过长,不能与荧光探针结合。此外,如果压力超过1500kPa,则有时目标RNA的片段长度过短,与荧光探针杂交的效率降低。
作为容纳细胞悬浮液的容器,只要是具有用于密闭的机械结构且具有耐热性的容器,则没有特别限制,例如,可以列举煮沸锁定型管、耐热树脂管、金属容器、玻璃容器等。作为用于加热的手段,只要能够加热至100~200℃,则没有特别限制,例如,可以列举干热块、油浴、微波、直火加热、蒸汽加热等。
作为加热的时间,没有特别限制,能够根据所适用的细胞的种类、细胞悬浮液的量等适当设定,优选20秒~10分钟,更优选30秒~5分钟,例如,可以是40秒~3分钟、1~2分钟等。
例如,在细胞为微生物细胞的情况下,作为适合于革兰氏阴性菌的加热条件的一例,可以列举加热时间为15秒以上且小于2分钟、加热温度为105~125℃以下的条件。
例如,在细胞为微生物细胞的情况下,作为适合于革兰氏阳性菌、真菌的加热条件的一例,可以列举加热时间为1分钟以内、加热温度为125~160℃以下的条件。
在为了成为加压状态而使用密闭容器的情况下,作为能够在短时间内均匀地加热细胞悬浮液的容器的容量,优选为2ml以下,更优选为0.6ml以下,特别优选为0.2ml以下。
细胞悬浮液也可以在加热后冷却。作为加热后的冷却方法,可以急速冷却,也可以自然冷却。作为急速冷却的方法,例如,可以列举将加热后的细胞悬浮液连同容器一起利用珀尔帖元件等急速冷却的方法等。如果对细胞悬浮液进行急速冷却,则会产生热冲击,细胞破碎效率提高,因此RNA的提取效率提高。该方法对于革兰氏阳性菌或真菌等具有坚硬结构的细胞是有效的。
作为自然冷却的方法,可以列举将容纳有加热后的细胞悬浮液的容器在室温下放置而自然冷却的方法等。在对细胞悬浮液进行自然冷却的情况下,由于不施加热冲击,所以能够在抑制对RNA的损伤的状态下提取RNA。该方法在提取长链的RNA的情况下是有效的。
细胞悬浮液在加热后将加压状态开放。加压状态的开放可以在加压状态下直接开放,也可以将加压状态降低至大气压之后开放。作为在加压状态下直接开放的方法,例如,可以列举将成为100~200℃的高温状态的容器的密闭状态开放的方法等。如果将成为100~200℃的高温状态的容器的密闭状态开放,则开放时的内压为大气压以上,产生急剧的压力变化。因此,通过产生剪切力,细胞破碎效率提高,能够提高RNA提取效率。该方法对于革兰氏阳性菌或真菌等具有坚硬结构的细胞是有效的。
作为在将加压状态降低至大气压之后开放的方法,例如,可以列举将成为100~200℃的高温状态的容器冷却到100℃以下之后开放容器的密闭状态的方法等。如果在将成为100~200℃的高温状态的容器冷却到100℃以下之后开放容器的密闭状态,则开放时不施加剪切力,因此能够在抑制了RNA的损伤的状态下提取RNA。该方法在提取长链的RNA的情况下是有效的。
在从细胞悬浮液中提取RNA时,也可以使用细胞溶解促进剂。通过使用细胞溶解促进剂,能够对革兰氏阳性菌或真菌等具有坚硬结构的细胞、芽胞、卵囊等成为更坚固状态的细胞更有效地进行RNA提取。细胞溶解促进剂的添加可以在高温处理前进行,也可以在高温处理后进行。
在高温处理前向样品中添加细胞溶解促进剂的情况下,通过细胞溶解促进剂减弱细胞的膜结构,高温处理有效地发挥作用,RNA提取效率提高。通过在细胞溶解促进剂中的高温处理,能够有效地发挥其作用。在样品量少、想要更可靠地在单一条件下提取的情况下是有效的。
在高温处理后向样品中添加细胞溶解促进剂的情况下,在通过高温处理减弱细胞的膜结构之后,能够使细胞溶解促进剂有效地发挥作用,能够在短时间内高效地提取核酸。对于具有牢固结构的细胞是有效的。
作为细胞溶解促进剂,可以列举:碱(NaOH、KOH等)、酸(HCl、H2SO4等)、酶(蛋白分解酶:蛋白酶K等,多糖分解酶:几丁质酶(chitinase)、溶菌酶(lysozyme)、溶细胞酶(zymolyase)等)、表面活性剂(阴离子性:SDS等,阳离子性:CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)等,非离子性:Triton-X等,两性离子性:甜菜碱(具有特定结构的化合物的总称、三甲基甘氨酸等)等)、氧化还原剂(过氧化氢水、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇等)、蛋白改性剂(盐酸胍、尿素等)、螯合剂(EDTA(乙二胺四乙酸)等)等。也可以将上述多种混合使用。也可以根据需要添加缓冲液。
在为了成为加压状态而使用密闭的容器的情况下,通过控制容器内的状态,能够实现向高温加压状态的转移的迅速化。具体地说,可以列举如下方法:以不残留气泡或气层等的方式向容器导入细胞悬浮液并密闭,此后转移至加热工序。此外,对于相对于容器的内容积少的细胞悬浮液,在气层部分重叠矿物油等高沸点溶剂,由此能够提高密闭性。在这种情况下,在将容器密闭后进行加热。在这种情况下,蒸汽被气相部分充满,在到达饱和蒸汽压之后进行沸点以上的加热。因此,容器内被更迅速地加压,能够达到100~200℃的高温。
在为了成为加压状态而使用密闭的容器的情况下,通过机械地封闭容器,能够防止在容器的内压上升时解除密闭状态。由此,能够稳定地实施加热处理。作为机械性的密闭例,可以列举利用与容器对接的形状的部件压入的方法(嵌入固定)等。
接着,向RNA提取液中添加蛋白质分解酶来进行反应,制备样品溶液(步骤S2)。在此,作为蛋白质分解酶,只要能够分解RNA提取液中含有的来自细胞的夹杂蛋白质,则没有特别限制,例如,可以列举蛋白酶K、链酶蛋白酶(Actinase)E、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等。这些蛋白质分解酶可以单独使用,也可以组合多种使用。
通过本工序,RNA提取液中含有的来自细胞的夹杂蛋白质被蛋白质分解酶分解。由此,抑制了夹杂蛋白质的影响。此外,抑制了由后述的核酸序列测定器件中的杂交反应时使用的盐与所述夹杂蛋白质的反应引起的样品溶液的白色混浊。此外,在后述的测量来自核酸序列测定用器件的荧光的工序中,能够抑制所述夹杂蛋白质被激发光激发而呈现荧光,因此能够降低背景光。
添加到RNA提取液的蛋白质分解酶的添加量只要是能够分解来自细胞的夹杂蛋白质的量,则没有特别限制,例如,反应液中的终浓度是20~500μg/mL的浓度。
RNA提取液中的夹杂蛋白质与蛋白质分解酶的反应温度根据所使用的蛋白质分解酶的最佳温度适当确定,例如,在蛋白酶K的情况下为30~40℃。反应时间根据所使用的蛋白质分解酶的性质适当确定,例如,在蛋白酶K的情况下为10~20分钟。
接着,将样品溶液供给到包括与目标RNA杂交的荧光探针的核酸序列测定用器件(步骤S3)。为了使具有特定核酸序列的目标RNA与荧光探针杂交,向样品溶液中添加盐。作为所添加的盐,例如,可以列举氯化钠等。也可以添加含有盐的缓冲液来代替盐。作为含有盐的缓冲液,例如,可以列举SSC缓冲液、Church磷酸缓冲液、SSPE缓冲液等。
作为所添加的盐的浓度,例如,优选终浓度稀释2倍~10倍的浓度,更优选稀释5倍的浓度。
作为供给样品溶液的核酸序列测定用器件,例如,可以列举日本专利公开公报特开2015-43702所公开的核酸序列测定用器件等。
具体地说,所述核酸序列测定用器件包括:荧光探针,具有结合部和基端,并且荧光分子附加在顶端或中途的位置;消光探针,具有结合部和基端,并且在与所述荧光探针结合时,消光分子附加在接近所述荧光探针的荧光分子的位置;以及基板,具有固定所述荧光探针和所述消光探针各自的基端的固相面,所述荧光探针的结合部和所述消光探针的结合部具有相互互补的核酸序列,所述荧光探针和所述消光探针的至少一方具有检测部,所述检测部具有与所述目标RNA的核酸序列互补的核酸序列,在未发生所述目标RNA与所述检测部的杂交的情况下,通过维持所述荧光探针的结合部与所述消光探针的结合部的结合,通过接近所述荧光分子的所述消光分子,所述荧光分子所呈现的荧光被消光,在发生了所述目标RNA与所述检测部的杂交的情况下,所述荧光探针的结合部与所述消光探针的结合部的结合被解除,以从所述消光分子分离的所述荧光分子成为呈现荧光的位置关系的方式,所述荧光探针和所述消光探针各自的基端固定于固相面。因此,在未产生目标RNA与所述检测部的杂交的情况下,维持所述荧光探针的结合部与所述消光探针的结合部的结合。由此,通过接近所述荧光分子的所述消光分子,所述荧光分子所呈现的荧光被消光。在发生了目标RNA与所述检测部的杂交的情况下,所述荧光探针的结合部与所述消光探针的结合部的结合被解除。由此,从所述消光分子分离的所述荧光分子呈现荧光。
根据该核酸序列测定用器件,作为相互独立的分子的荧光探针和消光探针各自的基端被固定,因此能够适当地发挥消光效果,能够使检测灵敏度良好。此外,不需要贴标签工序,也可以省略清洗工序。
图2是表示在本发明的核酸序列测定方法中使用的核酸序列测定用器件的结构例的图,图3是表示探针的结构例的图。
如图2和图3所示,核酸序列测定用器件构成为,在成为检测对象的目标RNA30的互补序列上附加了荧光分子11的荧光探针10和附加了消光分子21的消光探针20分别固定在基板等的固相面100上。
在本发明中,使用基于荧光共振能量转移的消光原理。
作为在本发明中使用的荧光分子,只要是被特定的激发光激发而产生荧光的分子,则没有特别限制,例如,可以使用EDANS、Coumarin、FAM、FITC、Cy2、TF2、TF3、HEX、JOE、TET、Cy3、Cy5、Alexa Fluor(注册商标)532、Alexa Fluor(注册商标)610、Alexa Fluor(注册商标)647、ATTO532、ATTO633、Qdot(注册商标)565、Qdot(注册商标)585、Qdot(注册商标)605、Qdot(注册商标)705、iFluorTM532、iFluorTM647等公知的物质。
作为在本发明中使用的消光分子,没有特别限制,例如,可以使用Dabcyl、TQ1、TQ2、TQ3、Eclipse(注册商标)、BHQ1、BHQ2、BHQ3、Cy5Q、Cy7Q、Iowa Black(注册商标)FQ、Iowa Black(注册商标)RQ、IRDye QC-1、QSY7、QSY21、QXL570、QXL570、QXL570等公知的物质。
关于荧光分子与消光分子的组合,没有特别限制,例如,可以列举EDANS、Coumarin或TF2与Dabcyl或TQ1的组合、FAM、FITC、TET、Alexa Fluor(注册商标)532、Cy2、Cy3、TF2或TF3与TQ2的组合、Alexa Fluor(注册商标)532、Cy3、HEX、JOE、TF2、TF3、TF4或TET与TQ3的组合、Alexa Fluor(注册商标)532、TF2、Cy3、FAM或HEX与Eclipse(注册商标)的组合、AlexaFluor(注册商标)532、TF2、TF3、Cy3、FAM、HEX、TET或Cy3与BHQ1的组合、TF3、TF4、Cy3、Cy5或HEX与BHQ2的组合、Cy5、Alexa Fluor(注册商标)647、TF5与Iowa Black(注册商标)RQ、IRDye QC-1、QSY21、TQ4、TQ5、BHQ2或BHQ3的组合、Cy3、TF3、TF4与Cy5Q、Iowa Black(注册商标)FQ、Iowa Black(注册商标)RQ、IRDye QC-1、QSY7或QXL570的组合、Alexa Fluor(注册商标)532与Cy5Q、TQ2、TQ3、Iowa Black(注册商标)FQ、Iowa Black(注册商标)RQ、IRDye QC-1、QSY7或QXL570的组合、TF3与BHQ1、BHQ2或Cy5Q的组合等。
作为在本发明中使用的基板,可以使用俯视观察时的形状形成为矩形形状的板状的石英、玻璃、硅、氟化钙和蓝宝石等单晶、陶瓷和树脂材料等。作为树脂材料,可以列举光学特性、化学和热稳定性优异的COP(环烯烃聚合物)、COC(环状烯烃共聚物)、聚碳酸酯、丙烯酸系树脂、聚乙烯树脂等。另外,俯视观察基板时的形状可以是任意形状。
如图3所示,荧光探针10包括:从3’末端开始设置、作为目标RNA30的互补序列的数个碱基的X部12;接着X部12设置、作为目标RNA30的互补序列的检测序列13;以及与检测序列13连接且持续至5’末端的接头14,在荧光探针10的3’末端固定有荧光分子11。
消光探针20包括:从5’末端开始设置的数个碱基的Y部22;接着Y部22设置、作为目标RNA30的互补序列的检测序列23;以及与检测序列23连接且持续至3’末端的接头24,在消光探针20的5’末端固定有消光分子21。
荧光探针10和消光探针20分别经由接头14和接头24在固相面100上被固定化。此外,荧光探针10的X部12的序列与消光探针20的Y部22的序列相互互补。此外,在荧光探针10的X部12与消光探针20的Y部22能够相互结合的位置上,荧光探针10和消光探针20固定,并且在荧光探针10的X部12与消光探针20的Y部22结合时,消光分子21接近荧光分子11,由此确保荧光分子11成为消光状态的位置关系。
此外,优选将荧光探针10与目标RNA30的亲和性设计为高于基于X部12和Y部22的荧光探针10与消光探针20的亲和性。
另外,在本发明中,互补是指一方的核酸序列具有能够与另一方的核酸序列形成双链状态的核酸序列,不一定需要完全互补,也可以含有若干错配碱基对。
此外,荧光分子或消光分子也可以不附加在探针的顶端,荧光分子或消光分子也可以附加在探针的中途位置。
在本发明的核酸序列测定方法中使用的核酸序列测定用器件能够以如下方式制造。
(1)溶液制备
首先,制备混合了荧光探针10和消光探针20的探针液,调整探针浓度。
(2)偶联
接着,将探针液加热后进行急冷,使荧光探针10和消光探针20偶联。由此,荧光探针10和消光探针20经由X部12和Y部22结合。在此,例如,在将探针液加热至95℃之后,将温度保持5分钟,此后急冷至25℃,由此使荧光探针10和消光探针20偶联。
(3)向固相面的固定
接着,将处于荧光探针10和消光探针20偶联的状态的探针液滴加到固相面上,使荧光探针10和消光探针20固定化在固相面100上。
(4)清洗
接着,对固相面100进行清洗,除去未固定化的剩余的探针。通过以上的步骤,制造核酸序列测定用器件。
由此,在经由X部12和Y部22相互结合的状态下,使荧光探针10和消光探针20与固相面100结合,因此能够适当地管理荧光探针10和消光探针20的位置关系,能够适当地发挥消光效果,因此能够使检测灵敏度良好。
接着,使所述目标RNA30与所述荧光探针10进行杂交反应(步骤S4)。如图4所示,在不存在目标RNA30时,在荧光分子11和消光分子21上分别相邻的数个碱基的X部12和Y部22(图3)结合,由此荧光分子11和消光分子21处于接近的状态。在该状态下,即使照射激发光,由于消光分子21的影响,荧光分子11也不会呈现荧光。
如果将含有目标RNA30的样品溶液供给到核酸序列测定用器件的固相面100并进行杂交反应,则如图4所示,目标RNA30与荧光探针10结合。由此,X部12和Y部22的结合被解除,消光分子21与荧光分子11的距离远离,由此消光状态被解除,通过激发光的照射,荧光分子11呈现荧光。
接着,在所述杂交反应后,测量来自所述核酸序列测定用器件的荧光(步骤S5)。如上述记载的那样,在样品溶液中,如果目标RNA30与荧光探针10结合,则X部12和Y部22的结合被解除,消光分子21与荧光分子11的距离远离。由此荧光分子11的消光状态被解除,通过激发光的照射,荧光分子11呈现荧光。通过由后述的荧光读取装置测量该荧光,能够确认样品溶液中的目标RNA30的有无。此外,通过测量来自核酸序列测定用器件的荧光强度,能够对样品溶液中含有的目标RNA30进行定量。此外,此时,溶液中含有的未被捕集的目标RNA30不呈现荧光,因此不需要清洗核酸序列测定用器件。因此,在样品溶液存在下,能够透过溶液观察固相表面。在本发明中,能够抑制由夹杂蛋白质与在杂交反应时使用的盐的反应引起的样品溶液的白色混浊,并且能够降低由所述夹杂蛋白质引起的背景光。因此,能够在排除了清洗的影响的状态下,高精度地测量光量,并且还能够进行杂交中的实时测量。
接着,对核酸序列测定装置进行说明。
核酸序列测定装置具有所述核酸序列测定用器件、以及测量来自所述核酸序列测定用器件的荧光分子的荧光量的荧光读取装置。
图5是表示核酸序列测定装置的结构图的一例。核酸序列测定装置为了取得核酸序列测定用器件60的、目标RNA30与荧光探针10结合前后的图像,在取得结合前的图像之后,通过调温台46使核酸序列测定用器件60的固相面的温度上升来进行结合反应,并且再次在降低到常温的状态下取得结合后的图像。
为了促进目标RNA30与荧光探针10的结合,调温台46优选具有在目标RNA30与荧光探针10的反应中基于振动或核酸序列测定用器件的旋转、旋涡混合器等的搅拌功能。
在荧光读取装置40的光学系统中,从激光光源41射出的激光经由反射镜45被分色镜44反射,照射核酸序列测定用器件的固相。所照射的光成为对于位于核酸序列测定用器件60的固相面上的荧光分子11的激发光33,荧光分子11成为激发状态,荧光分子11放射荧光34。
从核酸序列测定用器件60的固相面发出的荧光透射分色镜44,经由成像光学系统43在CCD相机42的检测元件上成像荧光图像并被检测。在此,以防止激发光33泄漏到荧光34中为目的,可以在激发光33侧设置与激发光波长匹配的带通滤波器,也可以在荧光34侧设置与想要检测的荧光波长匹配的带通滤波器。
由核酸序列测定装置得到的荧光图像能够取得同一斑点的目标RNA30与荧光探针10的结合前后的图像。因此,不会受到固相间、斑点间的光量的偏差的影响。此外,根据结合反应前后的荧光图像来计算荧光变化量,能够计算出结合反应的分子数。荧光变化量的运算可以使用斑点整体的平均光量,也可以使用斑点图像的各像素的荧光变化量。
核酸序列测定装置也可以包括控制CCD相机42的计算机、计算图像的光量的运算装置、保存图像和光量等的记录装置。
核酸序列测定装置为了从与固相面上的检测斑点的固定化面相反侧的面检测荧光,可以使用荧光显微镜或共焦显微镜、倏逝荧光检测装置、薄膜斜光照明显微镜、片照明显微镜、结构化照明显微镜、多光子激发显微镜等。
本发明的应用范围不限定于上述实施方式。本发明能够广泛地应用于通过杂交来测定样品中含有的具有特定核酸序列的目标RNA的核酸序列测定方法。
[实施例]
以下,基于实施例对本发明更详细地进行说明,但是本发明不限定于这些。
(实验例1)从金黄色葡萄球菌提取RNA
将金黄色葡萄球菌(S.aureus、NBRC100910)在SCD培养基中培养1天,将所得到的培养液1mL以5000×g离心分离,除去上清,得到菌体。将所得到的菌体悬浮于2.50μL的溶解液(组成:50mM三盐酸缓冲液(pH8.0)、0.1% SDS),容纳于容器并密闭,在140℃或160℃的温度下加热45秒,得到RNA提取液。
向所得到的RNA提取液中添加2μL的DNase(商品名:Recombinant DNase I(RNase-free);TAKARA BIO公司制;浓度5U/μL),在37℃下培养10~30分钟,分解除去DNA后,通过电泳确认了RNA片段长度。图6、图7分别表示在140℃下加热的结果、在160℃下加热的结果。
如图6所示,确认到通过在140℃下加热,进行了对适合于杂交的链长的均匀的片段化处理。此外,如图7所示,确认到通过在160℃下加热,能够片段化为更短的链长,能够进一步提高杂交的效率。
(实验例2)利用核酸序列测定用器件对从大肠杆菌提取的RNA进行检测
将大肠杆菌(NBRC3972)在SCD培养基中培养1天,将培养液1mL以5000×g离心分离,除去上清,得到菌体。将所得到的菌体悬浮于2.50μL的溶解液(组成:50mM三盐酸缓冲液(pH8.0)、0.1% SDS),容纳于容器并密闭,在140℃下加热45秒,得到RNA提取液。
向所得到的RNA提取液中添加5μL(终浓度:500μg/mL)的蛋白酶K(Proteinase K、TAKARA BIO公司制),在37℃下培养15分钟。
接着,添加SSC缓冲液,将终浓度稀释5倍,并且供给到固定有能够检测大肠杆菌的荧光探针的微阵列。将微阵列在60℃下培养3小时,利用荧光读取装置测量了来自微阵列的斑点光量。图8表示其结果。
此外,作为对照,图9表示不向上述得到的RNA提取液中添加蛋白酶K而同样地供给到微阵列,利用荧光读取装置测量了斑点光量的结果。另外,在图8和图9中,NTC表示将不含有成为靶标的大肠杆菌的样品溶液供给到微阵列的结果。
如图8所示,在向RNA提取液中添加了蛋白酶K的情况下,不存在目标RNA时的背景光低,此外,存在目标RNA时的斑点光量的上升也大。相对于此,如图9所示,在未向RNA提取液中添加蛋白酶K的情况下,不存在目标RNA时的背景光高,此外,存在目标RNA时的斑点光量的上升也小。
从以上的结果确认到通过向RNA提取液中添加蛋白质分解酶,微阵列的背景光变低,并且存在目标RNA时的光量上升,能够从细胞提取液中高精度地检测RNA。
附图标记说明
10荧光探针
11荧光分子
12X部(结合部)
13检测序列(检测部)
14接头(基端)
20消光探针
21消光分子
22Y部(结合部)
23检测序列(检测部)
24接头(基端)
30目标RNA
60核酸序列测定用器件
40荧光读取装置
41激光光源
42CCD相机
43成像光学系统
44分色镜
45反射镜
46调温台
100固相面
Claims (5)
1.一种核酸序列测定方法,通过杂交来测定细胞悬浮液中含有的具有特定核酸序列的目标RNA,所述核酸序列测定方法的特征在于包括:
将所述细胞悬浮液以加压状态在100~200℃下加热,得到RNA提取液的工序;
向所述RNA提取液中添加蛋白质分解酶来进行反应,制备样品溶液的工序;
将所述样品溶液供给到包括与所述目标RNA杂交的荧光探针的核酸序列测定用器件的工序;
使所述目标RNA与所述荧光探针进行杂交反应的工序;以及
测量来自所述核酸序列测定用器件的荧光的工序。
2.根据权利要求1所述的核酸序列测定方法,其特征在于,在测量所述荧光的工序中,在不清洗供给到所述核酸序列测定用器件的样品溶液的状态下,测量来自所述核酸序列测定用器件的荧光。
3.根据权利要求1或2所述的核酸序列测定方法,其特征在于,在得到所述RNA提取液的工序中,在密闭的容器中加热所述细胞悬浮液。
4.根据权利要求1~3中任意一项所述的核酸序列测定方法,其特征在于,所述蛋白质分解酶是蛋白酶K。
5.根据权利要求1~4中任意一项所述的核酸序列测定方法,其特征在于,
所述核酸序列测定用器件包括:
荧光探针,具有结合部和基端,并且荧光分子附加在顶端或中途的位置;
消光探针,具有结合部和基端,并且在与所述荧光探针结合时,消光分子附加在接近所述荧光探针的荧光分子的位置;以及
基板,具有分别固定所述荧光探针的基端和所述消光探针的基端的固相面,
所述荧光探针的结合部和所述消光探针的结合部具有相互互补的序列,
所述荧光探针和所述消光探针的至少一方具有检测部,所述检测部具有与所述目标RNA的核酸序列互补的序列,
在未发生所述目标RNA与所述检测部的杂交的情况下,通过维持所述荧光探针的结合部与所述消光探针的结合部的结合,通过接近所述荧光分子的所述消光分子,所述荧光分子所呈现的荧光被消光,
在发生了所述目标RNA与所述检测部的杂交的情况下,通过所述荧光探针的结合部与所述消光探针的结合部的结合被解除,以从所述消光分子分离的所述荧光分子成为呈现荧光的位置关系的方式,所述荧光探针和所述消光探针各自的基端固定于固相面。
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