CN116789865A - 一种人参杂多糖及其分离方法和应用 - Google Patents

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修雪亮
杨帆
徐继凯
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杨文腰
王文娟
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Abstract

本申请公开了一种杂多糖，包含半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、甘露糖。具体来说是一种人参杂多糖(GAPS‑FL)，为一种从人参根中分离得到的新的多糖物质，能够非特异性地改变或增强包括流感疫苗在内的多种疫苗的免疫应答反应，不仅可以增强流感疫苗免疫小鼠的体液免疫还可以增强其细胞免疫。

Description

一种人参杂多糖及其分离方法和应用
技术领域
本申请涉及医药技术领域，具体涉及一种人参杂多糖的分离、鉴定及应用。
背景技术
免疫佐剂是指能够非特异性改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答的物质，并且是疫苗的重要组成部分。免疫佐剂的作用机理主要是可以增加抗原表面积，提高免疫原性；对抗原起缓释作用，延长抗原在组织中的滞留时间；促进炎症反应，刺激主动免疫应答。目前我国市售疫苗佐剂多为铝盐佐剂，但是铝盐可引起注射部位的炎症并刺激局部红斑、肉芽肿和皮下结节，同时，铝盐佐剂会延缓疫苗的中和抗体的产生，因此在应用时受到多种限制，所以开发新型疫苗佐剂是非常必要且有意义的。
人参为五加科人参属植物人参Panax ginseng.A.Meyer的干燥根及根茎，具有大补元气、生津养血、安神益智等功效。现代药理学表明人参具有提高免疫力、抗肿瘤、抗疲劳等功效，广泛分布于中国、日本、韩国等亚洲国家。人参中主要含有皂苷、多糖、黄酮等多种活性成分。
发明内容
本申请从人参中分离出一种杂多糖，经活性追踪，通过体内实验已经证明了所述杂多糖对多种疫苗具有免疫佐剂活性。
具体的，本申请采用如下技术方案，
1、一种杂多糖，包含半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、甘露糖。
2、根据项1所述的杂多糖，所述杂多糖包含1、1，5、1，3，5连接的阿拉伯糖残基；1，4连接的半乳糖醛酸残基、1，3，4连接的鼠李糖残基；1、1，4、1，3，4连接的半乳糖残基；1、1，4、1，3，4连接的葡萄糖残基；1，2连接的甘露糖残基。
3、根据项1或2所述的杂多糖，所述杂多糖的主链由1，4连接的半乳糖醛酸交替连接组成，并有不同程度的甲基化和乙酰化，所述杂多糖的支链由阿拉伯聚糖、半乳阿拉伯聚糖和杂聚糖组成。
4、根据项1-3中任一项所述的杂多糖，其重复单元结构式如式(I)所示，
其中，
1≤n≤30，1≤m≤50，1≤p≤80。
5、一种杂多糖，其重复单元结构式如式(I)所示，
其中，
1≤n≤30，1≤m≤50，1≤p≤80。
6、根据项3所述的杂多糖，所述杂多糖由半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、甘露糖组成。
7、根据项1-6中任一项所述的杂多糖，相当于100摩尔的杂多糖，其中，下述单元的摩尔量为：
半乳糖醛酸：20.00～65.00，
阿拉伯糖：8.00～40.00，
半乳糖：5.00～25.00，
葡萄糖：5.00～25.00，
鼠李糖：3.00～20.00，
木糖：0.05～5.00，
甘露糖：0.05～5.00。
优选地，下述单元的摩尔量为：
半乳糖醛酸：40.00～50.00，
阿拉伯糖：10.00～20.00，
半乳糖：10.00～20.00，
葡萄糖：5.00～15.00，
鼠李糖：5.00～15.00，
木糖：0.2～3.00，
甘露糖：0.2～3.00。
8、根据项1-7中任一项所述的杂多糖，所述杂多糖的重均分子量为4×103Da～7×106Da。
9、根据项1-8中任一项所述的杂多糖，所述杂多糖是从人参中提取出来的。
10、一种制备项1-9中任一项所述杂多糖的方法，包括，
人参进行脱脂后，经过浸提、醇沉、浓缩、干燥，得到人参粗多糖；
所述人参粗多糖通过离子交换柱层析，洗脱，得到杂多糖提取液；
所述杂多糖提取液经过凝胶柱进行纯化，得到所述杂多糖。
11、根据项10所述的方法，所述离子交换柱为阴离子交换树脂柱，优选，填料为DEAE Sepharose Fast Flow。
12、根据项10或11所述的方法，所述水浸提过程中，料液比为1：10～40，次数为2～4次，浸提时间为1～5h。
13、根据项10-12中任一项所述的方法，所述通过离子交换柱层析过程中，以蒸馏水、氯化钠水溶液依次洗脱交换柱，洗脱流速为0.03～12mL/min。
14、根据项10-13中任一项所述的方法，所述经过凝胶柱进行纯化的过程中，以0.9～2.5M氯化钠洗脱凝胶柱，洗脱流速为0.01～0.08mL/min。
15、一种组合物，包括项1-9中任一项所述的杂多糖或根据项10-14中任一项所述的方法制备的杂多糖和药学上可接受的载体和/或辅料。
16、项1-9中任一项所述的杂多糖或项10-14中任一项所述的方法制备的杂多糖或项15所述的组合物作为疫苗佐剂用途。
17、根据项16所述的用途，其中，所述疫苗包括但不限于为流感疫苗、狂犬疫苗、乙肝疫苗、甲肝疫苗、丙肝疫苗、手足口疫苗、HPV疫苗或新型冠状病毒疫苗。
18、项1-9中任一项所述的杂多糖或项10-14中任一项所述的方法制备的杂多糖或项15所述的组合物在提升脾淋巴细胞中GATA-3、T-bet、IFN-γ或IL-4mRNA基因表达方面的用途。
19、项1-9中任一项所述的杂多糖或项10-14中任一项所述的方法制备的杂多糖或项15所述的组合物在提升脾淋巴细胞中IFN-γ和IL-4细胞因子的增殖方面的用途。
20、项1-9中任一项所述的杂多糖或项10-14中任一项所述的方法制备的杂多糖或项15所述的组合物在提高脾淋巴细胞中CD3+CD4+T或CD3+CD8+T淋巴细胞亚群的比例方面的用途。
发明效果
提供一种具有免疫佐剂活性的人参杂多糖(GAPS-FL)，为一种从人参根中分离得到的新的多糖物质，能够非特异性地改变或增强包括流感疫苗在内的多种疫苗的免疫应答反应，不仅可以增强流感疫苗免疫小鼠的体液免疫还可以增强其细胞免疫。
附图说明
图1是GAPS-FL的分离纯化流程图；
图2是GAPS-FL的DEAE洗脱曲线；
图3是GAPS-FL的凝胶柱层析洗脱曲线；
图4A是GAPS-FL的紫外光谱图；
图4B是GAPS-FL的红外光谱图；
图5是葡萄糖标准品所做的标准曲线；
图6是GAPS-FL的HPGPC谱图；
图7是GAPS-FL的离子色谱分析谱图；
图8是GAPS-FL的GC-MS分析谱图；
图9A是GAPS-FL的1H-NMR分析谱图；
图9B是GAPS-FL的13C-NMR分析谱图；
图9C是GAPS-FL的DEPT-135分析谱图；
图9D是GAPS-FL的1H-1H COSY分析谱图；
图9E是GAPS-FL的HSQC分析谱图；
图9F是GAPS-FL的HMBC分析谱图；
图9G是GAPS-FL的NOESY分析谱图；
图9H是GAPS-FL的HSQC-TOCSY NMR分析谱图；
图10是GAPS-FL的结构式与结构重复单元；
图11A是GAPS-FL的扫描电镜图；
图11B是GAPS-FL的原子力显微镜图；
图12是GAPS-FL对小鼠脾淋巴细胞毒性的影响图；
与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001；
图13是GAPS-FL协同脂多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响图；
A：GAPS-FL(500μg/mL)组；B：GAPS-FL(50μg/mL)；C：铝盐佐剂组；D：流感疫苗组；
A，B组与D组相比具有显著性差异(P＜0.05)；
图14是GAPS-FL协同刀豆蛋白对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响图；
A：GAPS-FL(500μg/mL)组；B：GAPS-FL(50μg/mL)；C：铝盐佐剂组；D：流感疫苗组；
A，C组与D组相比具有显著性差异(P＜0.001)；
图15是GAPS-FL协同流感疫苗对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响图；
A：GAPS-FL(500μg/mL)组；B：GAPS-FL(50μg/mL)；C：铝盐佐剂组；D：流感疫苗组；
A组与D组相比具有显著性差异(P＜0.05)；
图16A是GAPS-FL对流感疫苗免疫小鼠IgG效价的影响图，图中A，B，C组与D组相比具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)；
图16B是GAPS-FL对流感疫苗免疫小鼠IgG1效价的影响图，图中A，C组与D组相比具有显著性差异(P＜0.0001)；
图16C是GAPS-FL对流感疫苗免疫小鼠IgG2a效价的影响图，图中B组与D组相比具有显著性差异(P＜0.0001)；
图16D是GAPS-FL对流感疫苗免疫小鼠IgG2a/IgG1效价的影响图，图中B组与D组相比具有显著性差异(P＜0.01)；
图16E是GAPS-FL对流感疫苗免疫小鼠中和抗体效价的影响图，图中A，B，C组与D组相比具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.001，P＜0.0001)；
图17A是GAPS-FL对狂犬疫苗免疫小鼠IgG效价的影响图，图中A，B，C组与D组相比具有显著性差异(P＜0.0001)，A组与C组相比具有显著性差异(P＜0.01)；
图17B是GAPS-FL对狂犬疫苗免疫小鼠IgG1效价的影响图，图中A，C组与D组相比具有显著性差异(P＜0.01，P＜0.0001)，A组与C组相比具有显著性差异(P＜0.01)；
图17C是GAPS-FL对狂犬疫苗免疫小鼠IgG2a效价的影响图，图中A，C组与D组相比具有显著性差异(P＜0.05)；
图17D是GAPS-FL对狂犬疫苗免疫小鼠IgG2a/IgG1效价的影响图，图中A，C组与D组相比具有显著性差异(P＜0.05)；
图18A是GAPS-FL对手足口疫苗免疫小鼠IgG效价的影响图，图中A，B，C组与D组相比具有显著性差异(P＜0.0001)，A组与C组相比具有显著性差异(P＜0.05)；
图18B是GAPS-FL对手足口疫苗免疫小鼠IgG1效价的影响图，图中A，B组与D组相比具有显著性差异(P＜0.05)，A组与C组相比具有显著性差异(P＜0.05)；
图18C是GAPS-FL对手足口疫苗免疫小鼠IgG2a效价的影响图，图中A，B，C组与D组相比具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.0001)，A组与C组相比具有显著性差异(P＜0.05)；
图18D是GAPS-FL对手足口疫苗免疫小鼠IgG2a/IgG1效价的影响图，图中A，B，C组与D组相比具有显著性差异(P＜0.0001)；
图19A是GAPS-FL对甲肝疫苗免疫小鼠IgG效价的影响图，图中A，B，C组与D组相比具有显著性差异(P＜0.0001)，A组与C组相比具有显著性差异(P＜0.05)；
图19B是GAPS-FL对甲肝疫苗免疫小鼠IgG1效价的影响图，图中A，C组与D组相比具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)，A组与C组相比具有显著性差异(P＜0.05)；
图19C是GAPS-FL对甲肝疫苗免疫小鼠IgG2a效价的影响图，图中A，B，C组与D组相比具有显著性差异(P＜0.0001)；
图19D是GAPS-FL对甲肝疫苗免疫小鼠IgG2a/IgG1效价的影响图，图中A，B，C组与D组相比具有显著性差异(P＜0.01，P＜0.0001)A组与C组相比具有显著性差异(P＜0.05)；图20是实施例15中脾淋巴细胞总RNA的电泳图；
图21A是GAPS-FL对GATA-3基因表达影响图，图中A，B，C组与D组相比具有显著性差异(P＜0.01，P＜0.001)；
图21B是GAPS-FL对T-bet基因表达影响图，图中A，B，C组与D组相比具有显著性差异(P＜0.001，P＜0.0001)；
图21C是GAPS-FL对IFN-γ基因表达影响图，图中A，B组与D组相比具有显著性差异(P＜0.05)；
图21D是GAPS-FL对IL-4基因表达影响图，图中A，C组与D组相比具有显著性差异(P＜0.001，P＜0.0001)；
图22A是GAPS-FL对IFN-γ脾淋巴细胞因子的影响图，图中A组与D组相比具有显著性差异(P＜0.0001)；
图22B是GAPS-FL对IL-4脾淋巴细胞因子的影响图，图中A组与D组相比具有显著性差异(P＜0.001)；
图22C是GAPS-FL对IFN-γ脾淋巴细胞因子的影响图；
图22D是GAPS-FL对IL-4脾淋巴细胞因子的影响图；
图23A是GAPS-FL对CD3+CD4+T淋巴细胞的影响图，图中A组与D组相比具有显著性差异(P＜0.05)；
图23B是GAPS-FL对CD3+CD8+T淋巴细胞的影响图，图中B组与D组相比具有显著性差异(P＜0.05)；
图23C是GAPS-FL对CD3+CD4+T淋巴细胞的影响图；
图23D是GAPS-FL对CD3+CD8+T淋巴细胞的影响图；
图24A-24D是小鼠脾脏组织HE染色结果图
图24A是A组小鼠脾脏组织HE染色结果图；
图24B是B组小鼠脾脏组织HE染色结果图；
图24C是C组小鼠脾脏组织HE染色结果图；
图24D是D组小鼠脾脏组织HE染色结果图。
具体实施方式
以下对本申请的示范性实施例做出说明，其中包括本申请实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。
本申请提供了一种杂多糖，具体来说，所述杂多糖包含半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、甘露糖。
一种具体的实施方式中，在所述杂多糖的结构中，上述单糖残基的连接方式为1、1，5、1，3，5连接的阿拉伯糖残基；1，4连接的半乳糖醛酸残基、1，3，4连接的鼠李糖残基；1、1，4、1，3，4连接的半乳糖残基；1、1，4、1，3，4连接的葡萄糖残基；1，2连接的甘露糖残基。
一种具体的实施方式中，在所述杂多糖的结构中，其主链由1，4连接的半乳糖醛酸交替连接组成，并有不同程度的甲基化和乙酰化，一种优选的实施方式中，主链结构如下所示，
其中，1≤p≤80，优选的，1≤p≤10，R1、R2、R3为支链结构；
一种优选的实施方式中，其中R1为阿拉伯聚糖，R2为半乳阿拉伯聚糖，R3为杂聚糖，其中R1阿拉伯糖的1位与半乳糖醛酸的3位相连，R2半乳糖的3位与阿拉伯糖的1位相连。R3葡萄糖的4位与甘露糖的1位相连，构成R3杂聚糖样的结构。具体的，R1、R2、R3例如为
其中，1≤n≤30，1≤m≤50。
本申请提供了一种如式(I)所示结构的杂多糖，
其中，
1≤n≤30，1≤m≤50，1≤p≤80。
一种优选的实施方式中，本申请的杂多糖由半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、甘露糖组成。
一种优选的实施方式中，在如前所述的任一种本申请提供的杂多糖中，相当于100摩尔的杂多糖，各单糖的组成比例可以如下所示，以摩尔量计，其中，
半乳糖醛酸：20.00～65.00，例如可以为21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、54、56、58、60，一种优选的实施方式中，半乳糖醛酸的摩尔量为40.00～50.00，
阿拉伯糖：8.00～40.00，例如可以为8、9、10、11、12、13、14、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、14.7、14.8、14.9、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、36、37、38、39，一种优选的实施方式中，阿拉伯糖的摩尔量为10.00～20.00，
半乳糖：5.00～25.00，例如可以为6、7、8、9、10、11、12、13、13.6、13.7、13.8、13.9、14、14.1、14.2、14.3、14.4、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24，一种优选的实施方式汇总，半乳糖的摩尔量为10.00～20.00，
葡萄糖：5.00～25.00，例如可以为6、7、8、9、10、11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24，一种优选的实施方式中，葡萄糖的摩尔量为5.00～15.00，
鼠李糖：3.00～20.00，例如可以4、5、6、7、8、9、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11、12、13、14、15、16、17、18、19，一种优选的实施方式中，鼠李糖的摩尔量为5.00～15.00，
木糖：0.05～5.00，例如可以为0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5，一种优选的实施方式中，木糖的摩尔量为0.2～3.00，
甘露糖：0.05～5.00，例如可以0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5，一种优选的实施方式中，甘露糖的摩尔量为0.2～3.00。
一种优选的实施方式中，本申请的杂多糖的重均分子量为4×103Da～7×106Da，例如可以为5×103Da、6×103Da、7×103Da、8×103Da、9×103Da、1×104Da、2×104Da、3×104Da、4×104Da、5×104Da、6×104Da、7×104Da、8×104Da、9×104Da、1×105Da、2×105Da、3×105Da、4×105Da、5×105Da、6×105Da、7×105Da、8×105Da、9×105Da、1×106Da、2×106Da、3×106Da、4×106Da、5×106Da、6×106Da。
本申请的杂多糖的来源不受限制，只要符合本申请所提供的结构均在本申请的保护范围之内，一种优选的实施方式中，所述杂多糖可以从人参中提取。
本申请进一步提供了一种从人参中提取所述杂多糖的方法，包括，
人参进行脱脂后，经过水浸提、醇沉、浓缩、干燥，得到人参粗多糖；
所述人参粗多糖通过离子交换柱层析，洗脱，得到杂多糖提取液；
所述杂多糖提取液经过凝胶柱进行纯化，得到所述杂多糖。
在上述方法中，人参是指五加科植物，按照不同的分类方法具有多种种类，例如按生长环境分类：可分为野山参、移山参、园参三类；按炮制方式分类：可分为红参、白糖参、生晒参、保鲜人参、活性人参等；按产地分类：可分为吉林人参、高丽参、西洋参、长白山参、辽参等；按物种分类：可分为五加科植物人参的根，以及五加科植物西洋参的根，本申请的人参可以是上述任何一种人参，同时，本申请使用的人参可以是人参的茎、叶、人参花(人参果)、果实(人参籽)、根、须等任何人参植物上的部位，一种优选的实施方式中，所述人参指人参根。
人参中含有较高的脂质，脂质会影响多糖提取的过程，阻碍水溶液渗透到植物原料的内部，使多糖的提取率和含量减少。在处理之前对人参进行脱脂处理可降低脂质的干扰，使多糖更多的溶入提取液中，提高多糖提取率，且脂质通常是有颜色的，脱脂还有助于提取液的脱色。本申请对人参的脱脂处理可以使用本领域内常用的任何一种方法，例如使用有机溶剂浸泡带走脂质，有机溶剂可以是酸性、碱性、中性，或混合溶剂，本申请中，一种优选的实施方式，使用乙醇进行脱脂，所述乙醇的浓度优选为70～95％，浸泡时间不受限制，优选的实施方式为浸泡8-36小时。
收集浸泡后的人参残渣进行烘干，烘干温度为45-60℃，可以在烘箱内干燥也可以使用其他方法干燥，干燥至恒重后，粉碎成粉末用于水浸提。
所述浸提是指利用适当的溶媒和方法，从原料中将可溶性有效成分浸出的过程。浸提法也称液固萃取法，通常利用的是用挥发性有机溶剂将原料中的某些成分转移到溶剂相中，然后通过蒸发、蒸馏等手段回收有机溶剂，而得到所需的较为纯净的萃取组分。本申请使用的浸提方法不受限制，可以是本领域常用的任何方法，例如水浸提、醇浸提等，一种优选的实施方式，本申请使用水浸提，优选提取2-6次，例如可以为3、4、5次，每次提取1～5h，例如可以为2h、3h、4h，在浸提的过程中，料液比优选为1：10～40，例如可以为1：15、1：20、1：25、1：30、1：35。
浸提后对浸提液进行醇沉，所述醇沉即乙醇沉淀，是指利用有效组分溶于乙醇而杂质不溶于遗传的特性，在混合组分溶液中加入乙醇后，有效成分转入乙醇中而杂质则被沉淀出来。本申请的醇沉方法可以是本领域内常见的任何方法，不受限制。
醇沉后的液体进行浓缩、干燥，一种优选的实施方式，可以使用冻干进行干燥，然后即可得到人参粗多糖。
所述人参粗多糖经过离子交换柱进行层析后得到杂多糖提取液。其中，洗脱过程优选使用蒸馏水、氯化钠水溶液依次洗脱，洗脱流速优选为0.03～12mL/min，例如可以为0.05mL/min、0.1mL/min、1mL/min、2mL/min、3mL/min、4mL/min、5mL/min、6mL/min、7mL/min、8mL/min、9mL/min、10mL/min、11mL/min。
所述杂多糖提取液经过凝胶柱进行纯化后得到所述杂多糖，其中，洗脱过程优选以0.9～2.5M氯化钠溶液进行洗脱，例如可以使用1M、1.2M、1.4M、1.6M、1.8M、2M、2.2M、2.3M、2.4M的氯化钠溶液，洗脱流速优选为0.01～0.08mL/min，例如可以0.02mL/min、0.03mL/min、0.04mL/min、0.05mL/min、0.06mL/min、0.07mL/min。
本申请进一步提供了一种组合物，所述组合物包含如上所述任何一种本申请提供的杂多糖和药学上可接受的载体和/或辅料。
本申请还提供了如上所述任何一种本申请提供的杂多糖或者上述组合物作为疫苗佐剂的用途。
通过本申请的实验研究发现，本申请的杂多糖能够非特异性地改变或增强疫苗的免疫应答反应，不仅可以增强小鼠的体液免疫还可以增强其细胞免疫，例如，
通过对小鼠脾淋巴细胞毒性的研究发现，不同浓度的本申请提供的杂多糖水溶液对小鼠脾淋巴细胞均无毒性作用，且有一部分浓度的杂多糖水溶液甚至可以增强小鼠脾淋巴细胞具有增殖作用，证明了本申请的杂多糖具有免疫刺激活性；
同时通过体内免疫后取小鼠脾脏进行体外的刺激实验，发现本申请的杂多糖可以协同LPS(脂多糖)、Con A(刀豆蛋白)或流感疫苗增强对小鼠脾淋巴细胞增殖作用；
以及，本申请通过小鼠动物实验，验证了本申请的杂多糖作为疫苗佐剂应用到流感疫苗、狂犬疫苗、手足口疫苗、甲肝疫苗等均具能够增强疫苗的免疫应答反应，能显著提升疫苗小鼠的IgG，IgG2a，IgG2a/IgG1和中和抗体水平，还能显著提升疫苗小鼠的IgG1抗体的水平，抗体水平总体呈现上升趋势；
本申请还进一步研究了杂多糖对GATA-3、T-bet、IFN-γ、IL-4基因表达的影响，发现所述杂多糖能够显著提升小鼠脾淋巴细胞中GATA-3、T-bet、IFN-γ、IL-4mRNA基因的表达，进一步说明本申请的杂多糖可以增强流感疫苗佐剂在细胞免疫中的作用；而通过杂多糖对IFN-γ和IL-4脾淋巴细胞因子的研究发现，本申请的杂多糖能显著提升小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ和IL-4细胞因子的增殖，说明本申请的杂多糖可同时促进脾淋巴细胞Th1和Th2免疫反应；通过杂多糖对CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞亚群的研究发现，本申请的杂多糖能显著提升小鼠脾淋巴细胞中CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞亚群的比例，说明本申请的杂多糖作为流感疫苗佐剂具有强大的细胞免疫活性。
因此，本申请的杂多糖或组合物可以作为一种疫苗佐剂应用到疫苗中。
所述疫苗包括但不限于流感疫苗、狂犬疫苗、乙肝疫苗、甲肝疫苗、丙肝疫苗、手足口疫苗、HPV疫苗或新型冠状病毒疫苗。
如本文所用，术语“疫苗“是指任何适于刺激动物或人类中的活性免疫性的抗原或致免疫性物质的制剂。
如本文所用，术语“佐剂＂，是指提高、增加、向上调节、改变或以其它方式促进动物中对抗原的免疫反应(例如，体液或细胞免疫反应)的任何物质或物质的混合物。
如本文所用，术语“抗原”是指当被引入至免疫活性的人或动物中时，刺激体液及/或细胞介导的免疫反应的任何物质。该抗原可为纯物质、物质的混合物或微粒物质(包括细胞、细胞片段或细胞衍生片段)或活的(通常经减毒)的生物或病毒。适当抗原的实例包括但不限于：蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、肤、碳水化合物/多糖、脂多糖、毒素、病毒、细菌、真菌及寄生物。抗原可以为天然(自然表达或制得)的、合成的，或由那些本领域的技术人员熟悉的重组DNA方法学所衍生的。
如本文所用，术语“药用辅料”指生产药品和调配处方时，为解决制剂的成型性、有效性、稳定性、安全性加入处方中除主药以外的一切药用物料的统称，在安全性方面已进行了合理的评估，且包含在药物制剂中的物质。药用辅料除了赋形、充当载体、提高稳定性外，还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能，是可能会影响到药品的质量、安全性和有效性的重要成分。本申请所述药用辅料可以是适当的载体或赋形剂、乳化剂、润湿剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、佐剂(例如氢氧化铝佐剂、油剂佐剂、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)等。本申请提供了一种人参杂多糖(GAPS-FL)的一级结构鉴定方法：
首先采用紫外分光光度计确定所述杂多糖中有无蛋白质和核酸；
用红外光谱扫描仪确定特征峰，初步判定含有的官能团；
用HPGPC分析仪器，其中包括高效液相色谱仪配备示差检测器测定杂多糖的分子量；
然后用GC-MS杂多糖甲基化分析确定其糖苷键的种类，用离子色谱法测定单糖组成分析确定其单糖组成；
最后通过核磁分析推断糖苷键连接及其结构单元。
实施例
实施例1：GAPS-FL分离及纯化
1、人参根(2.0kg)经70～95％乙醇浸泡24小时进行脱脂。收集残渣于50℃烘箱内干燥至恒重后，粉碎成粉末后过150目筛网备用；
2、按料液比1：15～1：30加入蒸馏水，搅拌均匀后于90℃恒温水浴锅中提取4次，每次提取1～5h；
3、冷却至室温后离心取上清，浓缩至1/10体积，Sevag法除蛋白，取上清液浓缩，使用终浓度为65～95％乙醇进行沉淀，4～15℃过夜，收集沉淀，进行冻干，即获得人参粗多糖(200g)；
4、取100g人参粗多糖用蒸馏水充分溶解，离心取上清，通过蒸馏水，氯化钠溶液依次快流速洗脱DEAE法(氯化钠浓度为0.05～1mol/L，流速为0.03～0.12mL/min)，洗脱曲线如图2所示，分别收集溶液，苯酚-硫酸法测定多糖含量并收集主峰，浓缩，4～15℃透析过夜，进行冻干；
5、将通过DEAE分离获得的人参多糖冻干粉溶液蒸馏水，以凝胶色谱柱进一步纯化，以蒸馏水，0.9～2.5M氯化钠溶液依次洗脱，洗脱曲线如图3所示，分管收集并使用苯酚-硫酸法测定多糖含量并收集主峰，浓缩，4～15℃透析过夜，进行冻干即获得人参杂多糖(GAPS-FL)，分离纯化流程图见图1。
6、通过苯酚-硫酸法、间羟基联苯法、Bradford法分别测定GAPS-FL的多糖含量、糖醛酸含量、蛋白质含量，结果见表1。
表1GAPS-FL的多糖、糖醛酸、蛋白质含量结果
样品名 多糖含量(％) 糖醛酸含量(％) 蛋白质含量(％)
GAPS-FL 96.98 27.35 0.20
实施例2：GAPS-FL紫外光谱分析
将实施例1所制备的GAPS-FL样品配置成0.04～1.0mg/mL水溶液，用紫外分光光度计在800～200nm的范围内进行扫描。见图4A，其在260nm和280nm处均无特征吸收峰，表明GAPS-FL均无蛋白质和核酸。
实施例3：GAPS-FL红外色谱分析
取干燥的实施例1所制备的GAPS-FL样品1.0mg，以KBr压片，在4000-400cm-1的范围内进行红外光谱扫描。见图4B，吸收带在3600-3200cm-1是-OH的伸缩振动吸收峰，这个区域的吸收峰是糖类的特征峰。具体如下：
在3425cm-1是O-H的伸缩振动吸收峰，是糖类的特征峰。
在2935cm-1处有一个吸收峰，可能归属于C-H伸缩振动。
在1743cm-1处有一个吸收峰，可能归属于C＝O伸缩振动。
在1608cm-1处有一个吸收峰，可能归属于C＝O非对称伸缩振动。
在1373cm-1处、1330cm-1处有一个吸收峰，可能归属于C＝O对称伸缩振动。
在1419cm-1处、1247cm-1处、1143cm-1处、1099cm-1处有吸收峰，可能归属于C-O伸缩振动。
在1022cm-1处有吸收峰，可能归属于O-H变角振动。
在960cm-1处有吸收峰，可能归属于吡喃环的非对称环伸缩振动。
实施例4：GAPS-FL纯度和相对分子量测定
精密称取实施例1所制备的GAPS-FL样品和不同分子量的标准品，样品配制成5mg/mL溶液，12000rpm离心10min，上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后将样品转置于1.8ml进样小瓶中。
使用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)进行测定，色谱方法为色谱柱：BRT105-104-102串联凝胶柱(8×300mm)；流动相：0.05M NaCl溶液；流速：0.6ml/min，柱温：40℃；进样量：20μl；检测器：示差检测器RI-10A。
以以下不同相对分子质量的葡聚糖(Mw 5000，11600，23800，48600，80900，148000，273000，409800，667800)作为标准品，做出标准曲线(图5)，测定GAPS-FL的纯度及相对分子质量，经过计算，最终得到其分子量为63350Da，同时，从HPGPC测得的谱图(图6)中可以看出，HPGPC谱图中具有单个对称的峰，表明GAPS-FL是纯的多糖。
实施例5：GAPS-FL单糖组成分析
取16种单糖标准品(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D氨基葡萄糖、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸)配成标准母液溶液。
取各单糖标准溶液精密配置浓度标准品作为混标。根据绝对定量方法，测定不同单糖质量，根据单糖摩尔质量计算出摩尔比。取干燥的GAPS-FL样品5.0mg置于安瓿瓶中，加入3mL 2.0mol/L TFA，120℃水解3h。准确吸取酸水解溶液转移至管中氮气吹干，加入5mL水涡旋混匀，吸取50μL加入950μL去离子水，12000rpm离心5min。取上清进离子色谱(IC)分析。
结果见图6，GAPS-FL的单糖组成为鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖：半乳糖醛酸(摩尔比)＝0.094：0.148：0.139：0.117：0.005：0.009：0.455。
实施例6：GAPS-FL甲基化分析
称量GAPS-FL样品(2-3mg)置于玻璃反应瓶中，加入1mL无水DMSO，快速加入甲基化试剂A液，封闭，在超声作用下溶解，再加入甲基化试剂B液。在磁力搅拌水浴30℃反应60min反应。最后将2mL超纯水加入到上述混合物中终止甲基化反应。取甲基化后的多糖，加入1mL的2M三氟乙酸(TFA)水解90min，旋转蒸发仪蒸干。残基加入2mL双蒸水，60mg硼氢化钠还原8小时，加入冰醋酸中和，旋蒸，101℃烘箱烘干，然后加入1mL乙酸酐乙酰化100℃反应1h，冷却。然后加入3mL甲苯，减压浓缩蒸干，重复4-5次，以除去多余的醋酐。将乙酰化后的产物用3mL CH2Cl2溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层水溶液，如此重复4次。CH2Cl2层以适量的无水硫酸钠干燥，定容10mL，放入液相小瓶。
分析采用气相色谱-质谱联用仪测定乙酰化产物样品；GC-MS程序升温条件为：起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min；保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1mL/min。分析谱图如图8所示，具体甲基化分析结果见表2。
表2GAPS-FL的甲基化分析结果
实施例7：GAPS-FL NMR光谱测定
取冷冻干燥后的GAPS-FL样品50mg，溶于0.5mL D2O中，氢氘交换3次后，在AVANCE600核磁共振仪上测定其1H-NMR，13C-NMR，DEPT-135，H-H COSY，HSQC，HMBC，NOESY，HSQC-TOCSY谱图，见图9A-9H。
GAPS-FL的1H-NMR和13C-NMR化学位移数据见表3。
据图9A的1H-NMR谱图显示，在5.73、5.06、5.01、5.00ppm处的信号分别对应T-Ara、3,5-Ara、1,5-Ara的H-1。5.24、5.00ppm处的信号分别对应1,3,4-GalA和1,4-GalA的H-1。5.23ppm处的信号对应1,4,6-Glcp的H-1。4.88ppm附近的信号可以归属为1,3,4-Rhap，T-Gal，1,4-Glc，1,2-Man，T-Xyl的H-1。
据图9B的13C-NMR谱图显示，GAPS-FL的13C-NMR端基峰显示在107.6、107.4、107.3ppm处的信号对应于T-Ara、3,5-Ara、1,5-Ara的C-1。104.6、102.8、100.2ppm处的信号对应于不同取代Galp的C-1。99.3ppm处的信号对应于GalA的C-1。100.9、99.9、98.7、97.6ppm分别对应1,2-Man，1,4-Glc，T-Xyl，1,3,4-Rha的H-1。96.3、92.1处的信号对应于不同取代的Glc的C-1。在160-180ppm处含有羰基碳信号，归属为GalA的C-6，由于化学位移值向高场移动，说明C-6由甲氧基的取代形成甲基化。
通过图9F的HMBC谱图将各个糖残基进行连接，残基A分别与残基B、C、D、H、I相连形成阿拉伯半乳糖聚糖侧链，残基B和C相连形成阿拉伯聚糖侧链，残基K、L、M相连形成葡聚糖侧链，残基D、E、F相连形成半乳糖醛酸主链，并通过二维核磁将各侧链与主链相连。根据GAPS-FL的相对分子质量确定重复片段个数并确定GAPS-FL的重复片段见图10。
综上可以推断GAPS-FL的重复单元结构式如图10所示。
实施例8：GAPS-FL三维结构测定
为了观察多糖的微观结构和形态特征，对实施例1制备的GAPS-FL进行扫描电镜和原子力显微镜分析(图9A和图9B)。GAPS-FL样品在镀金后，使用扫描电镜在高真空条件下以5.0kV的加速电压分析该杂多糖的微观结构。将GAPS-FL配置成10μg/mL的水溶液并超声处理15min后，将样品转移至云母板上，随后在120℃下干燥30s进行原子力显微镜分析。
从图11A和图11B可以看出，在聚集状态下，观察到具有不均匀表面的不规则分支片状结构，表明多糖无定形结构。多糖表面厚薄不均，出现波峰和凹陷，可能具有高度分支结构。
实施例9：GAPS-FL对小鼠脾淋巴细胞毒性的研究
试剂与药品：红细胞裂解液(北京索莱宝科技有限公司)，RPMI-1640培养基(大连美伦生物科技有限公司)，胎牛血清(大连美伦生物科技有限公司)，CCK-8(大连美伦生物科技有限公司)。
动物：SPF级雌性C57BL/6小鼠(辽宁成大生物科技股份有限公司)。
取6-8周龄C57BL/6小鼠，颈椎脱臼处死，无菌制备脾淋巴细胞悬液，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基调整细胞浓度为(1～5)×106/mL，均匀铺于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，分为实验组和空白对照组，空白对照组再加100μL空白培养基；实验组分别加入浓度为25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1600ug/ml、3200ug/ml、6400ug/ml的GAPS-FL溶液，于培养箱中培养44h后每孔加入20μL的CCK-8溶液，在酶标仪上测各孔的吸光值(450nm)，并进行统计学分析。
结果：见图12所示，25-6400μg/mL的GAPS-FL水溶液对小鼠脾淋巴细胞均无毒性作用，且1600、3200、6400μg/mL的GAPS-FL水溶液可以增强小鼠脾淋巴细胞具有增殖作用，证明GAPS-FL具有免疫刺激活性。
实施例10：GAPS-FL协同LPS(脂多糖)、Con A(刀豆蛋白)或流感疫苗对小鼠脾淋巴细胞增殖的研究
试剂与药品：脂多糖(LPS，Sigma公司)，刀豆蛋白(Con A，Sigma公司)，红细胞裂解液(北京索莱宝科技有限公司)，RPMI-1640培养基(大连美伦生物科技有限公司)，胎牛血清(大连美伦生物科技有限公司)，CCK-8(大连美伦生物科技有限公司)。
动物：雌性C57BL/6小鼠50只，6-8周龄，购自辽宁成大生物科技股份有限公司。
含GAPS-FL佐剂的流感疫苗制剂：分别称取GAPS-FL为2.5mg、0.5mg和流感疫苗15μg，以生理盐水10ml溶解，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装，每支1ml。每1ml含GAPS-FL为2.5mg、0.5mg和流感疫苗15μg。按照以下分组与剂量，配制四组不同的制剂。
实验分组与剂量：
免疫方案：50只小鼠随机分成4组，每组10只。分别肌肉注射上述A、B、C、D四组制剂0.1ml/只，初次免疫1周后，然后进行第2次免疫。第2次免疫后14天将各组小鼠按实施例9方法制备脾淋巴细胞悬液，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基调整细胞浓度为(1～5)×106/mL，分别均匀铺于板1、板2、板3三个96孔板中，
板1、板2和板3分别用不同的试剂在体外培养环境下刺激淋巴细胞增殖，并考察不同分组小鼠给药后脾淋巴细胞的增殖活性。其中板1使用脂多糖作为刺激物，板2使用刀豆蛋白作为刺激物，板3使用流感疫苗原液作为刺激物加入各项试剂后使得A、B、C、D四组所对应孵育孔分别含有100μL脾淋巴细胞悬液、80μL完全培养基(RPMI 1640+10％胎牛血清)及如下成分。
板1：每孵育孔内含有5μg/mL的LPS(脂多糖)；
板2：每孵育孔内含有10μg/mL的ConA；
板3:每孵育孔内含有1μg/mL的流感疫苗原液。
置培养箱培养48h。培养结束前4h，于每孔加入20μL的CCK-8溶液，在酶标仪上测各孔的吸光值(450nm)，计算刺激指数SI其中阴性对照孔对应的是D组流感疫苗组的小鼠，取其脾脏研磨得脾细胞组。
结果：实验组中，GAPS-FL协同LPS对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响见图11所示，高、低剂量GAPS-FL与5μg/mL的LPS对小鼠脾淋巴细胞增殖均具有一定的协同作用，其中高剂量GAPS-FL(500μg)与Con A对小鼠脾淋巴细胞增殖的协同能力最强，低剂量GAPS-FL(50μg)次之，均具有显著性差异。
实验组中，GAPS-FL协同Con A对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响见图12所示，高、低剂量GAPS-FL与10μg/mL的Con A对小鼠脾淋巴细胞增殖均具有一定的协同作用，其中高剂量GAPS-FL(500μg)与Con A对小鼠脾淋巴细胞增殖的协同能力最强，并具有显著性差异，低剂量GAPS-FL(50μg)Con A对小鼠脾淋巴细胞增殖的协同能力虽无显著性差异，但总体呈上升趋势。
实验组中，GAPS-FL协同流感疫苗对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响见图13所示，高剂量GAPS-FL(500μg)与流感疫苗原液对小鼠脾淋巴细胞增殖均具有一定的协同作用，并具有显著性差异。
实施例11：GAPS-FL对流感疫苗的佐剂活性研究
流感疫苗：辽宁成大生物股份有限公司生产。
动物：雌性C57BL/6小鼠40只，6-8周龄，购自辽宁成大生物科技股份有限公司。
含GAPS-FL佐剂的流感疫苗制剂：分别称取GAPS-FL为2.5mg、0.5mg和流感疫苗15μg，以生理盐水10ml溶解，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装，每支1ml。每1ml含GAPS-FL为2.5mg、0.5mg和流感疫苗15μg。
实验分组与剂量：
免疫方案：40只小鼠随机分成4组，每组10只。肌肉注射0.1ml/只，初次免疫1周后，然后进行第2次免疫。第2次免疫后14天通过ELISA和血凝抑制实验检测小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a、中和抗体效价水平，并计算IgG2a/IgG1比率。
结果：见图16A-16E所示，与空白组相比，高剂量GAPS-FL(500μg)能显著提升流感疫苗免疫小鼠的IgG，IgG1，和中和抗体水平(P＜0.01，P＜0.0001)，低剂量GAPS-FL(50μg)能显著提升流感疫苗免疫小鼠的IgG，IgG2a/IgG1比例和中和抗体水平(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.0001)，其他剂量与流感疫苗组相比也呈现上升趋势。
实施例12：GAPS-FL对狂犬疫苗佐剂活性研究
流感疫苗：辽宁成大生物股份有限公司生产。
动物：雌性C57BL/6小鼠50只，6-8周龄，购自辽宁成大生物科技股份有限公司。
含GAPS-FL佐剂的狂犬疫苗制剂：分别称取GAPS-FL为2.5mg、0.5mg和狂犬疫苗25IU，以生理盐水10ml溶解，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装，每支1ml。每1ml含GAPS-FL为2.5mg、0.5mg和狂犬疫苗2.5IU。
实验分组与剂量：
免疫方案：40只小鼠随机分成4组，每组10只。肌肉注射0.1ml/只，初次免疫1周后，然后进行第2次免疫。第2次免疫后14天通过ELISA实验检测小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体效价水平，并计算IgG2a/IgG1比率。
结果：见图17A-17D所示，与铝盐佐剂组相比，高剂量GAPS-FL(500μg)能显著提升狂犬疫苗免疫小鼠的IgG和IgG1抗体水平(P＜0.01)，与空白组相比，高剂量GAPS-FL(500μg)能显著提升狂犬疫苗免疫小鼠的IgG，IgG1，IgG2a，IgG2a/IgG1抗体水平(P＜0.05，P＜0.0001)，低剂量GAPS-FL(50μg)能显著提升流感疫苗免疫小鼠的IgG抗体的水平(P＜0.0001)，其他剂量与狂犬疫苗组相比也呈现上升趋势。
实施例13：GAPS-FL对手足口疫苗佐剂活性研究
手足口疫苗：辽宁成大生物股份有限公司生产。
动物：雌性C57BL/6小鼠40只，6-8周龄，购自辽宁成大生物科技股份有限公司。
含GAPS-FL佐剂的手足口疫苗制剂：分别称取GAPS-FL为2.5mg、0.5mg和手足口疫苗50U，以生理盐水10ml溶解，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装，每支1ml。每1ml含GAPS-FL为2.5mg、0.5mg和手足口疫苗50U。
实验分组与剂量：
免疫方案：40只小鼠随机分成4组，每组10只。肌肉注射0.1ml/只，初次免疫1周后，然后进行第2次免疫。第2次免疫后14天通过ELISA实验检测小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体效价水平，并计算IgG2a/IgG1比率。
结果：见图18A-18D所示，与铝盐佐剂组相比，高剂量GAPS-FL(500μg)能显著提升手足口疫苗免疫小鼠的IgG，IgG1和IgG2a抗体水平(P＜0.05)，与空白组相比，低剂量GAPS-FL(50μg)，高剂量GAPS-FL(500μg)能显著提升手足口疫苗免疫小鼠的IgG，IgG1，IgG2a和IgG2a/IgG1抗体水平(P＜0.05，P＜0.0001)，其他剂量与手足口疫苗组相比也呈现上升趋势。
实施例14：GAPS-FL对甲肝疫苗佐剂活性研究
甲肝疫苗：辽宁成大生物股份有限公司生产。
动物：雌性C57BL/6小鼠40只，6-8周龄，购自辽宁成大生物科技股份有限公司。
含GAPS-FL佐剂的甲肝疫苗制剂：分别称取GAPS-FL为2.5mg、0.5mg和手足口疫苗4IU，以生理盐水10ml溶解，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装，每支1ml。每1ml含GAPS-FL为2.5mg、0.5mg和甲肝疫苗4IU。
实验分组与剂量：
免疫方案：40只小鼠随机分成4组，每组10只。肌肉注射0.1ml/只，初次免疫1周后，然后进行第2次免疫。第2次免疫后14天通过ELISA实验检测小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体效价水平，并计算IgG2a/IgG1比率。
结果：见图19A-19D所示，与铝盐佐剂组相比，高剂量GAPS-FL(500μg)能显著提升甲肝疫苗免疫小鼠的IgG，IgG1和IgG2a/IgG1抗体水平(P＜0.05)，与空白组相比，高剂量GAPS-FL(500μg)能显著提升甲肝疫苗免疫小鼠的IgG，IgG1，IgG2a和IgG2a/IgG1抗体水平(P＜0.01，P＜0.0001)，低剂量GAPS-FL(50μg)能显著提升甲肝疫苗免疫小鼠的IgG，IgG2a和IgG2a/IgG1抗体水平(P＜0.0001)，其他剂量与甲肝疫苗组相比也呈现上升趋势。
实施例15：GAPS-FL对GATA-3、T-bet、IFN-γ、IL-4基因表达的研究
1、制备各组小鼠脾淋巴细胞悬液
按照实施例9的方法制备各组小鼠脾淋巴细胞悬液，并调整细胞浓度为(6～8)×107/mL。按照实施例10的动物分组铺于6孔培养板中，每孔加入1mL细胞悬液，再加入100μL流感疫苗原液培养48h，离心并收集细胞备用。
2、总RNA的提取
采用经典的异硫氰酸胍方法提取脾淋巴细胞总RNA。
3、总RNA浓度测定及电泳鉴定
取4μL总RNA，用DEPC水稀释至1000μL，用超微量分光光度计测定总RNA的OD260及OD280。另取0.5g琼脂糖，加入30mL 0.1％DEPC水，在微波炉中加热至熔化，冷却至50℃，加入2μL EP溶液，混匀后将胶加到制胶槽内，取5μL总RNA上样，电泳，紫外灯下观察并拍照鉴定RNA的完整性，结果见图18，可以发现28S和18S两条明显的条带，并且28S的亮度是18S的两倍左右，且260/280紫外吸收比值在1.7-2.0之间，表明RNA没有发生明显的降解可以用于后续实验。
4、RP-PCR
由Genebank获取小鼠细胞因子GATA-3、T-bet、IFN-γ、IL-4及内标β-actin基因全序列见表4。
PCR系统如下：模板cDNA 4μL，Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 10μL，上下游引物各0.4μL，无菌超纯水补足至20μL。扩增程序为预变性95℃后按下列程序循环40次，95℃10s，60℃20s，72℃20s。然后72℃延伸10min。
用Bio-Rad RT-PCR测定各组Ct值，并计算2-ΔΔCt。结果见图21A-21D，低剂量GAPS-FL(50μg)，高剂量GAPS-FL(500μg)能显著提升小鼠脾淋巴细胞中GATA-3、T-bet、IFN-γ、IL-4mRNA基因的表达，说明GAPS-FL可以增强流感疫苗佐剂在细胞免疫中的作用。
表4GATA-3、T-bet、IFN-γ、IL-4及内标β-actin基因全序列
实施例16：GAPS-FL对IFN-γ和IL-4脾淋巴细胞因子的研究
按照实施例9的方法制备各组小鼠脾细胞悬液，并调整细胞浓度为(1～2)×105/mL，根据ELISPOT试剂盒的操作说明均匀接种于96孔培养板中，每孔加入100μL细胞悬液，仅加入100μL培养基(背景对照)，100μL细胞悬液(阴性对照)，100μL细胞悬液加10μL PMA刺激物(阳性对照)以及按照实施例10的动物分组的各实验孔。所有样品和刺激物加完后，放入培养箱中培养48h。经过细胞裂解、洗板、IFN-γ和IL-4检测抗体孵育、酶联亲和素孵育、显色等步骤，最终在读板机下读取各个孔的斑点数。各组斑点图片和统计结果见图22A-D，从图中可以看出，高剂量GAPS-FL(500μg)能显著提升小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ和IL-4细胞因子的增殖，与流感疫苗组相比具有显著性差异，低剂量GAPS-FL(50μg)虽然无显著性差异，但总体呈升高趋势，说明GAPS-FL可同时促进脾淋巴细胞Th1和Th2免疫反应。
实施例17：GAPS-FL对CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞亚群的研究
按照实施例9的方法制备各组小鼠脾细胞悬液，并调整细胞浓度为3-6×106/mL，接种于24孔培养板中，每孔加入1000μL细胞悬液和100μL流感疫苗原液，置于培养箱中培养48h。离心，收集细胞，并加入100μL无菌PBS重悬，每组加入2μg APC-CD3、FITC-CD4、PE-CD8抗体进行染色，4℃孵育30min后，离心，收集细胞，并加入100μL无菌PBS重悬细胞，上机检测。各组染色图片和统计结果见图23A-23D，低剂量GAPS-FL(50μg)与高剂量GAPS-FL(500μg)能显著提升小鼠脾淋巴细胞中CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞亚群的比例，其中高剂量GAPS-FL(500μg)可以显著提高小鼠脾淋巴细胞CD3+CD4+T淋巴细胞亚群的比例，与流感疫苗组相比具有显著性差异，低剂量GAPS-FL(50μg)可以显著提高小鼠脾淋巴细胞CD3+CD8+T淋巴细胞亚群的比例，与流感疫苗组相比具有显著性差异，说明GAPS-FL作为流感疫苗佐剂具有强大的细胞免疫活性。
实施例18：小鼠脾脏组织HE染色
随机取实施例10中A，B，C，D组制剂处理过的小鼠各3只，脱臼处死并在无菌条件下取脾脏，并置于4％多聚甲醛中固定，在不同浓度的酒精溶液中脱水后，将脾脏包埋于石蜡中，并进行HE染色，使用光学显微镜观察病理切片。结果见图24，高剂量GAPS-FL(500μg)脾白髓中心区(WP)和边缘区(MZ)淋巴细胞比例最高且脾红髓区(RP)出现大量红细胞，小鼠脾脏组织HE染色提示GAPS-FL可以增强流感疫苗的免疫反应。
尽管以上结合对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护之列。

Claims (20)

1.一种杂多糖，其特征在于，包含半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、甘露糖。
2.根据权利要求1所述的杂多糖，其特征在于，所述杂多糖包含1、1，5、1，3，5连接的阿拉伯糖残基；1，4连接的半乳糖醛酸残基、1，3，4连接的鼠李糖残基；1、1，4、1，3，4连接的半乳糖残基；1、1，4、1，3，4连接的葡萄糖残基；1，2连接的甘露糖残基。
3.根据权利要求1或2所述的杂多糖，其特征在于，所述杂多糖的主链由1，4连接的半乳糖醛酸交替连接组成，并有不同程度的甲基化和乙酰化，所述杂多糖的支链由阿拉伯聚糖、半乳阿拉伯聚糖和杂聚糖组成。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的杂多糖，其重复单元结构式如式(I)所示，
其中，
1≤n≤30，1≤m≤50，1≤p≤80。
5.一种杂多糖，其特征在于，其重复单元结构式如式(I)所示，
其中，
1≤n≤30，1≤m≤50，1≤p≤80。
6.根据权利要求3所述的杂多糖，其特征在于，所述杂多糖由半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、甘露糖组成。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的杂多糖，其特征在于，相当于100摩尔的杂多糖，其中，下述单元的摩尔量为：
半乳糖醛酸：20.00～65.00，
阿拉伯糖：8.00～40.00，
半乳糖：5.00～25.00，
葡萄糖：5.00～25.00，
鼠李糖：3.00～20.00，
木糖：0.05～5.00，
甘露糖：0.05～5.00。
优选地，下述单元的摩尔量为：
半乳糖醛酸：40.00～50.00，
阿拉伯糖：10.00～20.00，
半乳糖：10.00～20.00，
葡萄糖：5.00～15.00，
鼠李糖：5.00～15.00，
木糖：0.2～3.00，
甘露糖：0.2～3.00。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的杂多糖，其特征在于，所述杂多糖的重均分子量为4×103Da～7×106Da。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的杂多糖，其特征在于，所述杂多糖是从人参中提取出来的。
10.一种制备权利要求1-9中任一项所述杂多糖的方法，其特征在于，包括，
人参进行脱脂后，经过浸提、醇沉、浓缩、干燥，得到人参粗多糖；
所述人参粗多糖通过离子交换柱层析，洗脱，得到杂多糖提取液；
所述杂多糖提取液经过凝胶柱进行纯化，得到所述杂多糖。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述离子交换柱为阴离子交换树脂柱，优选，填料为DEAE Sepharose Fast Flow。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述水浸提过程中，料液比为1：10～40，次数为2～4次，浸提时间为1～5h。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述通过离子交换柱层析过程中，以蒸馏水、氯化钠水溶液依次洗脱交换柱，洗脱流速为0.03～12mL/min。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述经过凝胶柱进行纯化的过程中，以0.9～2.5M氯化钠洗脱凝胶柱，洗脱流速为0.01～0.08mL/min。
15.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1-9中任一项所述的杂多糖或根据权利要求10-14中任一项所述的方法制备的杂多糖和药学上可接受的载体和/或辅料。
16.权利要求1-9中任一项所述的杂多糖或权利要求10-14中任一项所述的方法制备的杂多糖或权利要求15所述的组合物作为疫苗佐剂用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中，所述疫苗包括但不限于为流感疫苗、狂犬疫苗、乙肝疫苗、甲肝疫苗、丙肝疫苗、手足口疫苗、HPV疫苗或新型冠状病毒疫苗。
18.权利要求1-9中任一项所述的杂多糖或权利要求10-14中任一项所述的方法制备的杂多糖或权利要求15所述的组合物在提升脾淋巴细胞中GATA-3、T-bet、IFN-γ或IL-4mRNA基因表达方面的用途。
19.权利要求1-9中任一项所述的杂多糖或权利要求10-14中任一项所述的方法制备的杂多糖或权利要求15所述的组合物在提升脾淋巴细胞中IFN-γ和IL-4细胞因子的增殖方面的用途。
20.权利要求1-9中任一项所述的杂多糖或权利要求10-14中任一项所述的方法制备的杂多糖或权利要求15所述的组合物在提高脾淋巴细胞中CD3+CD4+T或CD3+CD8+T淋巴细胞亚群的比例方面的用途。
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