CN116789106B - 一种三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球及其制备方法和应用。先混合多巴胺、三嵌段聚合物Pluronic F127、1，3，5‑三甲基苯和三联吡啶钌依，充分反应，再催化F127/TMB/DA复合胶束中的多巴胺聚合，制备得到三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球，增强了其电化学发光强度和稳定性将，三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球的ECL强度提高了几十倍。在涂有三联吡啶钌掺杂介孔碳球的玻碳电极表面电镀一层用于对β‑羟丁酸检测识别的分子印迹聚合物，构建用于β‑羟丁酸灵敏检测的电化学发光传感器，检测范围宽，为0.1nM～10mM的，检测限为0.03nM。具有良好的稳定性、选择性、实用性和准确性。

Description

一种三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及电化学检测技术领域，具体地，涉及一种三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球及其制备方法和应用。

背景技术

糖尿病酮症酸中毒(DKA)是糖尿病的一种并发症，其特点是发病死亡率高。β-羟丁酸被认为是诊断糖尿病酮症酸中毒的首要指标。近年来，生酮饮食(一种限制碳水化合物的高脂肪的饮食)被推广为有效的减肥饮食，并用于控制2型糖尿病患者的血糖。在这种饮食中，碳水化合物的摄入被切断，身体主要通过燃烧脂肪来获取能量。在脂肪分解的过程中，会产生三种不同的酮体：β-羟丁酸、乙酰乙酸酯和丙酮，其中β-羟丁酸约占酮体的70％。如果酮含量过高，可能会造成代谢性酸中毒等严重的健康危害。因此，实现对β-羟丁酸的灵敏检测对2型糖尿病患者或是生酮饮食人员来说是十分必要的。目前，通常用酶促法测定β-羟丁酸，需要多步酶促反应，成本较高，难以实现在市场上的广泛应用。

电化学发光(Electrochemiluminescence，ECL)是一种光传输过程，伴随电化学生成的物种经过高能转移反应形成发光激发态，然后返回基态产生发光。由于电化学发光传感技术具有高灵敏度、低背景干扰、高时空可控制等特点，已广泛应用于环境分析、医疗诊断、粮食安全等领域。在多种电化学发光分子中，三联吡啶钌([Ru(bpy)₃]²⁺)由于其良好的水溶性和生物相容性等优点，受到了极大的关注，被广泛的应用于商品化的发光体系的构件中。在过去的几十年里，纳米技术的快速发展极大地促进了电化学发光传感的发展，因为在高性能电化学发光传感器的构建中，产生高电化学发光性能的最常用的策略是将发光分子与纳米材料(如二氧化硅纳米粒子、碳纳米粒子、金属-有机框架等)复合。目前已经报道了一系列关于构建三联吡啶钌掺杂的复合纳米发光体的工作主要集中在基于纳米材料的发光基团的构建上。对于复合纳米发光体中发光分子的电化学发光效率，以及复合纳米发光体结构和表面性能对体系电化学发光增强的影响机制尚不明确。此外，大部分复合纳米发光体都是经由两步法合成：首先合成具有介孔结构的纳米材料，再通过化学键键合等方式，将三联吡啶钌或其他发光分子负载在纳米材料中。这样合成的复合纳米发光体一方面会因发光分子的掺杂量有限，导致体系的发光强度有限；另一方面，会因发光分子易在测试中从复合材料内部脱落，降低体系的发光强度和稳定性。此外，随着发光团中发光分子含量的增加，纳米复合材料中单个发光分子的平均发光强度可能会大大降低。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球及其制备方法和应用。

本发明的第一个目的是提供一种三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球的制备方法。

本发明的第二个目的是提供所述制备方法制备得到的三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球。

本发明的第三个目的是提供所述三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球在制备电化学发光检测产品、制备检测β-羟丁酸的产品或制备检测糖尿病的产品中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种电化学传感器。

本发明的第五个目的是提供一种电化学传感器的制备方法。

本发明的第六个目的是提供一种检测β-羟丁酸的产品。

本发明的第七个目的是提供一种检测糖尿病的产品。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球的制备方法，其特征在于，先混合多巴胺、三嵌段聚合物Pluronic F127、1，3，5-三甲基苯和三联吡啶钌依，充分反应，制备得到F127/TMB/DA复合胶束，再催化F127/TMB/DA复合胶束中的多巴胺聚合，制备得到三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球。

作为实施方案之一，用氨水溶液催化F127/TMB/DA复合胶束中的多巴胺聚合。

氨水溶液质量浓度可以为20～25％。

在本发明具体实施例中，氨水溶液质量浓度为25％。

制备F127/TMB/DA复合胶束过程中，可以以乙醇水为溶剂，进行反应，水和乙醇的体积比可以为1：3～3：1。

在本发明具体实施例中，水和乙醇的体积比为2：3。

制备F127/TMB/DA复合胶束过程中，催化F127/TMB/DA复合胶束中的多巴胺聚合后，再固液分离，干燥，即得三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球。

可以在7000～8000rpm离心10～20min，收集沉淀，干燥即得三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球。

作为实施方案之一，以8000rpm离心15min为例，进行离心。

在本发明具体实施例中，在400～800rpm的搅拌速度下进行反应，制备形成三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球。

优选地，搅拌速度为600rpm。

在本发明具体实施例中，反应时间为0.5～2.5h，制备形成三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球。

优选地，反应时间为1.5h。

在本发明具体实施例中，多巴胺、三嵌段聚合物Pluronic F127、1，3，5-三甲基苯和三联吡啶钌依的质量比为10：20：25：3～7，制备形成三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球。

优选地，多巴胺、三嵌段聚合物Pluronic F127、1，3，5-三甲基苯和三联吡啶钌依的质量比为10：20：25：5。

本发明还提供所述制备方法制备得到的三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球。

本发明还请求保护所述三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球在制备电化学发光检测产品、制备检测β-羟丁酸的产品或制备检测糖尿病的产品中的应用。

本发明提供了一种电化学传感器，所述电化学传感器中含有所述三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球。

在制备过程中，用所述的三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球修饰玻碳电极，再沉积分子印迹聚合物。

本发明提供了所述电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：

S1：将所述三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球滴涂在玻碳电极表面，得到三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球/玻碳电极；

S2：以步骤S1的三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球/玻碳电极为工作电极，银和氯化银作参比电极，铂丝电极作对电极，得到三电极系统，将所述三电极系统置于含邻苯二胺和β-羟丁酸的溶液中，进行循环伏安法扫描，生成分子印迹聚合物/三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球/玻碳电极初产物；

S3：将步骤S2所述的分子印迹聚合物修饰的三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球/玻碳电极初产物中的邻苯二胺和β-羟丁酸去除，即得所述电化学传感器(即分子印迹聚合物/三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球/玻碳电极，MIP/RMCNs/GCE电极)。

在本发明具体实施例中，步骤S1中，将所述三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球溶于Nafion水溶液，得到三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球溶液，再将所述三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球溶液滴涂在玻碳电极表面。

其中，三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球溶液中三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球的浓度可以为3～10mg/mL。

在本发明中，设置三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球溶液中三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球的浓度为5mg/mL，进行实验。

其中，三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球溶液中Nafion的浓度可以为1～5％。

在本发明中，设置三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球溶液中Nafion的浓度为5％，进行实验。

三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球与玻碳电极的比例可以为0.03～0.1mg：19.625mm²。

在本发明中，三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球与玻碳电极的比例为0.05mg：19.625mm²。

在本发明具体实施例中，步骤S2中，溶液为含邻苯二胺和β-羟丁酸的PBS溶液。

步骤S2中，PBS溶液的pH可以为3～7。

优选地，步骤S2中，PBS溶液的pH为5。

在本发明具体实施例中，步骤S2中，循环伏安法扫描的循环次数可以为15～35。

优选地，步骤S2中，循环伏安法扫描的循环次数为25。

在本发明具体实施例中，步骤S2中，邻苯二胺与β-HB的摩尔比(单体/模板比)可以为1～20。

优选地，步骤S2中，邻苯二胺与β-HB的摩尔比为10。

作为可选择的实施方案，步骤S2中，PBS浓度可以为0.01～0.1M，邻苯二胺浓度可以为1～10mM，β-羟丁酸浓度可以为0.05～1mM。

在本发明中，步骤S2中，以PBS浓度为0.01M，邻苯二胺浓度为1mM，β-羟丁酸浓度为0.2mM为例，进行实验。

在本发明具体实施例中，步骤S2中，扫描电位为0～0.8V，扫描速率50mVs^-1。

在本发明具体实施例中，步骤S3中，将步骤S3的分子印迹聚合物/三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球/玻碳电极初产物浸泡在PBS溶液中，去除邻苯二胺，得到分子印迹聚合物/三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球/玻碳电极。

其中，浸泡在PBS溶液中的时间可以为10～40min。

作为实施方案之一，设置浸泡在PBS溶液中的时间为30min，进行实验。

作为实施方案之一，步骤S3中，将分子印迹聚合物/三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球/玻碳电极浸泡在乙腈中，去除β-羟丁酸。

其中，浸泡在乙腈中时间为1～10min。

作为实施方案之一，设置浸泡在乙腈中时间为2min，进行实验。

在用所述电化学传感器检测样本中β-HB时，将待测样本溶于PBS溶液(0.01M，pH＝5)中，得到待测样本PBS溶液。将MIP/RMCNs/GCE电极放在待测样本PBS溶液中孵育，得到孵育后的MIP/RMCNs/GCE电极。将孵育后的MIP/RMCNs/GCE电极用PBS溶液冲洗后，将其置于电解液中，电解液为三丙胺PBS溶液(0.01M，pH＝5)，三丙胺浓度为6.25mM。以孵育后的MIP/RMCNs/GCE电极作为工作电极、银/氯化银电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极进行检测，CV扫描的电压范围是0～1.5V，扫速是0.05V s^-1，通过电化学发光分析仪检测记录电化学发光强度。

在检测时，先检测已知的不同浓度的β-HB的PBS溶液(0.01M，pH＝5)，β-HB浓度为0.1nM～10mM，建立β-HB浓度与ECL强度变化的标准曲线。检测样本后，获得样本中β-HB的ECL强度，代入上述的标准曲线中，得到样本中β-HB的浓度。

在本发明具体实施例中，MIP/RMCNs/GCE电极在待测样本PBS溶液中孵育时间为1～9min。

优选地，孵育时间为5min。

本发明还所述电化学传感器在制备检测β-羟丁酸的产品或制备检测糖尿病的产品中的应用。

三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球修饰玻碳电极产生ECL信号的一般机理为“氧化-还原”共反应机理，在电化学信号的激发下，在电极阳极表面，2价的三联吡啶钌和TPA，同时失去电子发生氧化反应。此时，2价的三联吡啶钌标记物被氧化成3价的三联吡啶钌的标记物，TPA被氧化成阳离子自由基TPA+*，TPA+*很不稳定，自发地失去一个质子而形成自由基TPA*，其为强还原剂，将一个电子给3价的三联吡啶钌，使其成为激发态的三联吡啶钌，而TPA自身被氧化成氧化产物。激发态的三联吡啶钌衰减时发射一个波长620nm的光子，重新形成基态的三联吡啶钌。这一过程在电极表面周而复始进行，产生许多光子，使得光信号增强。

得到的三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球的介孔结构促进了共反应物三丙胺(TPrA)扩散到球体中，促进了三联吡啶钌和三丙胺之间的反应，进而增强了体系的电化学发光强度。

本发明还提供了一种检测β-羟丁酸的产品，所述检测β-羟丁酸的产品中含有所述的电化学传感器。

本发明还提供了一种检测糖尿病的产品，所述检测糖尿病的产品中含有所述的检测β-羟丁酸的产品。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.通过一步剪切力诱导的动态装配方法合成了三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球，并将其作为发光体。有效的增强了复合纳米发光体的电化学发光强度和稳定性。

2.通过改变三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球中三联吡啶钌的掺杂量、粒径和孔径的大小，有效的提高了其中三联吡啶钌的发光效率，明确了影响发光体电化学发光强度的因素。通过调节三联吡啶钌的用量、搅拌速度和反应时间，三联吡啶钌掺杂介孔碳球的ECL强度提高了几十倍。

3.提出近似值计算方式，直观的展现了在不同的合成条件下得到复合纳米发光体中三联吡啶钌发光分子的电化学发光强度和效率变化，弥补了在复合纳米发光体合成中对电化学发光分子研究不足的缺陷。

4.结合分子印迹聚合物技术，通过电聚合的方式，在涂有三联吡啶钌掺杂介孔碳球的玻碳电极(GCE)表面电镀一层用于对β-羟丁酸检测识别的分子印迹聚合物，进而构建用于β-羟丁酸灵敏检测的电化学发光传感器。通过引入分子印迹聚合物技术，有效的延长识别电极的使用寿命，降低其制作成本。相比商业化的血酮仪和近期报道的检测β-羟丁酸的相关工作，所构建的传感器具有更大的检测范围和更低的检测限，检测范围宽，β-羟丁酸的检测浓度为0.1nM～10mM的，检测限为0.03nM。具有良好的稳定性和选择性。此外通过使用所构建的传感器和商业化血酮仪对人体血样中的β-羟丁酸检测的结果的对比，验证了所构建传感器的实用性和准确性。

附图说明

图1为三联吡啶钌掺杂介孔碳纳米球合成示意图。

图2为三联吡啶钌掺杂介孔碳纳米球的物理性质。其中，A为扫描电镜测试图；B为透射电镜测试图；C为氮气等温吸附-脱附测试图；D为ECL测试图。

图3为三联吡啶钌添加量对合成的三联吡啶钌掺杂介孔碳纳米球中三联吡啶钌掺杂量、ECL强度和效率的影响。其中A为三联吡啶钌掺杂量；B为ECL强度和效率。

图4为三联吡啶钌添加量对合成的三联吡啶钌掺杂介孔碳纳米球中粒径、孔径和Zeta电位的影响。其中A为粒径；B为孔径；C为Zeta电位。

图5为不同搅拌速度对合成的三联吡啶钌掺杂介孔碳球特性的影响，其中A为粒径分布曲线；B为三联吡啶钌掺杂量；C为孔径变化；D为Zeta电位。

图6为不同时间对合成三联吡啶钌掺杂介孔碳球特性的影响，其中A为粒径分布曲线；B为三联吡啶钌掺杂量；C为孔径变化；D为Zeta电位。

图7为一步法和两步法合成的三联吡啶钌掺杂介孔碳球比对。其中，A为一步法合成三联吡啶钌掺杂介孔碳球的ECL稳定性测试曲线；B为两步法合成三联吡啶钌掺杂介孔碳球的ECL测试曲线；C为一步法和两步法合成三联吡啶钌掺杂介孔碳球中三联吡啶钌掺杂量。

图8为分子印迹聚合物修饰电极制备的示意图。

图9为分子印迹聚合物(MIP)修饰电极的制备过程中电化学循环伏安曲线。

图10为分子印迹聚合物(MIP)修饰电极的制备过程中电聚合曲线。

图11为分子印迹聚合物(MIP)修饰电极的制备过程中电化学阻抗曲线。

图12为分子印迹聚合物制备的电极对空白样品和0.1nM的β-羟丁酸的ECL曲线。

图13为无分子印迹聚合物制备的电极对空白样品和0.1nM的β-羟丁酸的ECL曲线。

图14为不同参数对分子印迹聚合物修饰电极的影响。其中，A为电解液的pH；B为电聚合圈数；C为交联剂/模板配比；D为孵育时间。

图15为的性能研究。其中，A为传感器在不同浓度β-羟丁酸的ECL曲线；B为传感器针对β－羟丁酸检测的校准曲线；C为传感器对不同干扰物质的ECL强度；D为稳定性；E为重现性。

图16为人体血液中β-羟丁酸检测结果。其中，A为男性志愿者；B为女性志愿者。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1三联吡啶钌掺杂介孔碳球的合成

一、实验方法

1、合成三联吡啶钌掺杂介孔碳纳米球(RMCNs)

(1)将600mg多巴胺、1200mg的三嵌段聚合物Pluronic F127、1.62mL的1，3，5-三甲基苯(TMB)和300mg三联吡啶钌依，次加入水(48mL)和乙醇(72mL)的混合物中，在600rpm/min的转速下搅拌，形成F127/TMB/DA复合胶束。

(2)在步骤(1)F127/TMB/DA复合胶束中快速加入1.8mL的质量浓度25％的氨水溶液，诱导多巴胺分子聚合。随后在搅拌下(600rpm/min)反应180min后，停止搅拌，8000rpm离心15min，收集沉淀物，然后用乙醇和水多次洗涤沉淀，于70℃的真空烘箱中干燥12h，得到RMCNs。

2、用扫描电镜和透射电镜观测RMCNs。

3、称取5mg的RMCNs溶于1mL质量浓度5％ Nafion的水溶液中，超声2min后，得RMCNs溶液。移液枪取10μL RMCNs溶液滴涂在清洗干净的直径为5mm玻碳电极表面，待自然干燥后，得RMCNs/玻碳电极(RMCNs/GCE)，用含6.25mM TPA 的PBS(pH＝7.4)溶液作为共反应剂，在电化学循环伏安扫描(0～1.5V)的激发下，使用三电极体系(RMCNs/GCE作为工作电极，银/氯化银作参比电极，铂丝电极作对电极)测试电化学发光(ECL)性能。

二、实验结果

本发明以三嵌段共聚物pluronic F127为软模板，1，3，5-三甲苯为介质，用剪切诱导动态组装法，制备了三联吡啶钌掺杂介孔碳纳米球。在水和乙醇混合体系中，多巴胺为掺杂剂作为碳和氮的来源(图1)。

从图2中A和图2中B可以看出，制备的RMCNs呈均匀球形结构，平均尺寸约为206nm。RMCNs的介孔结构吸附-脱附等温线(图2中C)进一步证实了RMCNs中存在介孔结构(平均孔径约22nm)。

如图2中D所示，RMCNs/GCE即使在光电倍增管的低电位(400V)下也能产生显著的ECL信号，说明本实施例制备的RMCNs具有较高ECL效率。

实施例2RMCNs ECL强度的影响因素

一、实验方法

1、三联吡啶钌使用量

设置三联吡啶钌的使用量分别为1.5、2、2.5、3和3.5mg mL^-1(180、240、300、360、420mg)，按照实施例1的方法制备RMCNs，检测其三联吡啶钌的掺杂量、ECL强度、效率、电位生物、直径和孔径。

2、搅拌速度

设置搅拌速度分别为400、500、600、700和800rpm，按照实施例1的方法制备RMCNs，检测其三联吡啶钌的掺杂量、ECL强度、效率、电位生物、直径和孔径。

3、反应时间

设置实施例1制备RMCNs过程中，步骤(2)的搅拌反应时间分别为0.5、1、1.5、2和2.5h，其他步骤与实施例1制备RMCNs的方法相同，检测其三联吡啶钌的掺杂量、ECL强度、效率、电位生物、直径和孔径。

4、作为RMCNs的对照，使用两步法合成了三联吡啶钌掺杂的碳球(RCNs)：

(1)将600mg多巴胺、1200mg的三嵌段聚合物Pluronic F127、1.62mL的1，3，5-三甲基苯(TMB)依次加入水(48mL)和乙醇(72mL)的混合物中，在600rpm/min的转速下搅拌，形成F127/TMB/DA复合胶束。

(2)在步骤1的复合胶束中快速加入1.8mL的25％的氨水溶液，诱导多巴胺分子聚合。随后在搅拌下(600rpm/min)反应180min后，停止搅拌，8000rpm离心15min，收集沉淀物，然后用乙醇和水多次洗涤沉淀，于70℃的真空烘箱中干燥12h，得介孔碳纳米球。

(3)将步骤(2)中所得的介孔碳纳米球溶于水(48mL)和乙醇(72mL)的混合物中，在600rpm/min的转速搅拌下加入300mg的三联吡啶钌中，搅拌1h，离心洗涤干燥后，得到两步法合成的三联吡啶钌掺杂碳球(RCNs)。

按照与实施例1相同的方法制备RCNs/GCE，并检测其ECL信号。

二、实验结果

1、RMCNs中三联吡啶钌发光强度的计算：

为了更加直观的展现RMCNs和三联吡啶钌的电化学发光强度变化，提出如下计算方程：

m_RMCNs＝Vρ (式2)

其中，V：单个RMCNs的体积；

m_RMCNs：单个RMCNs的质量；

N_RMCNs：滴涂在玻碳电极(GCE)表面上RMCNs的数量；

M_Ru：钌元素的摩尔质量，101.07g mol^-1；

r：RMCNs的半径，通过动态光散射仪测得；

ρ：RMCNs的密度，通过真密度仪测得；

根据实施例1步骤3制备RMCNs/GCE过程中RMCNs溶液的组成和用量，确定M_GCE是0.05mg；

m_Ru：在RMCNs中钌的含量，通过电感耦合等离子光谱发生仪测得；

N_A：阿伏伽德罗常数，6.02×10²³mol^-1；

E：滴涂在玻碳电极(GCE)上RMCNs的ECL强度，由ECL分析仪测得。

2、三联吡啶钌使用量

如图3中A所示，随着三联吡啶钌的使用量从1.5增加到3.5mg mL^-1，三联吡啶钌在RMCNs中的掺杂量从0.98×10¹⁹涨到了1.43×10¹⁹。一般来说，RMCNs中三联吡啶钌的掺杂量越高，ECL强度越高。从图3中B和表1中可以发现，ECL强度和ECL效率随着三联吡啶钌的使用量(1.5～2.5mg mL^-1)的上升而增大。但随着三联吡啶钌的使用量继续增加(2.5～3.5mgmL^-1)，ECL的强度和效率显著降低。

如图4中A所示，三联吡啶钌掺杂量的增加不影响RMCNs的直径，但会使其孔径减小(图4中B)，特别是当添加量大于2.5mg mL^-1时，孔径急剧减小。由于孔隙较小，在以TPA作为共反应剂，进行电化学发光性能时(实施例1)，TPrA(共反应物)难以进入RMCNs与内部三联吡啶钌反应，导致掺入三联吡啶钌的ECL效率较低，当添加量大于2.5mg mL^-1时，RMCNs的ECL强度较弱。此外，由于三联吡啶钌的阳离子电荷在RMCNs中积累，RMCNs的Zeta电位由负向正增加(图4中C)。在这种情况下，RMCNs对TPrA*+反应中间体的静电吸引力减弱，最终在3.5mgmL^-1的使用量时，电荷由负变正，吸引力变为斥力，不利于ECL信号的产生。因此，掺杂量增加过多，使RMCNs孔径变小，表面正电荷增多，会对RMCNs的ECL强度产生巨大的负面影响。所以，三联吡啶钌的最佳用量为2.5mg mL^-1。表1为不同三联吡啶钌使用量对RMCNs中三联吡啶钌掺杂量及ECL强度的影响。

表1不同三联吡啶钌使用量对RMCNs中三联吡啶钌掺杂量及ECL强度的影响

3、搅拌速度

随着搅拌速度的增加，RMCNs的粒径保持不变(图5中A)，孔径增大(图5中B)，三联吡啶钌掺杂量(图5中C)和Zeta电位下降(图5中D)。

可以看出，ECL强度和效率由三个因素共同决定：三联吡啶钌掺杂量、RMCNs的孔径大小和表面电位。从表2中可以看出，随着搅拌速度从400rpm增加到600rpm，RMCNs的ECL强度和效率都有增加，其中主要影响因素为孔径大小。在600～800rpm范围内，三联吡啶钌掺杂量太低会导致ECL强度和效率受到抑制，即便此时孔径大小和表面电荷是有利于增强ECL强度和效率。因此，最佳搅拌速度选择为600rpm。

表2不同搅拌速度对RMCNs中三联吡啶钌掺杂量、ECL强度的影响

4、反应时间

随着反应时间的延长，三联吡啶钌掺杂介孔碳球的粒径(图6中A)、三联吡啶钌掺杂水平(图6中B)和Zeta电位(图6中D)均有所增加，而孔径略有减小(图6中C)。粒径越大，表明TPrA(共反应物)向RMCNs内三联吡啶钌扩散距离越远，对ECL信号的增强有负面影响。从表3可以看出，随着反应时间从0.5h增加到3.5h，ECL的强度和效率先增大后降低，在1.5h时达到最大值。0.5～1.5h，ECL信号的增强主要取决于三联吡啶钌掺杂量的增加，而1.5～3.5h，ECL信号的减弱是粒径增大所致。因此，最佳反应时间为1.5h。

表3反应时间对RMCNs中三联吡啶钌掺杂量、ECL强度的影响

5、最佳合成条件

在最佳合成条件下(三联吡啶钌使用量为2.5mg mL^-1，搅拌速度600rpm，反应时间1.5h)，RMCNs独特的结构使其具有优异的ECL性能。一方面，在光电倍增管的低电位(400V)下，RMCNs修饰GCE的ECL强度比其他报道的发光基团高数十倍(表4)。另一方面，RMCNs的ECL信号非常稳定，其强度不随重复次数的增加而下降(图7中A)。

6、两步法合成的RCNs的ECL信号表现出明显的衰减(图7中B)。此外，RMCNs的三联吡啶钌掺杂量是RCNs的近两倍(图7中C)，ECL强度超过7倍，表明掺杂三联吡啶钌的RMCNs具有出色的ECL效率。介孔结构使得共反应物TPrA很容易地从各个方向渗透到RMCNs的整个区域，极大地促进了共反应物的扩散，充分利用了RMCNs中三联吡啶钌的活性位点。

表4不同三联吡啶钌掺杂ECL发光体的ECL强度对比

表4中的参考文献为：

1.Li,J.et al.Dual-mode immunosensor for electrochemiluminescenceresonance energy transfer and electrochemical detection of rabies virusglycoprotein based on Ru(bpy)32+-loaded dendritic mesoporous silicananoparticles.Anal.Chem.94,7655-7664(2022).

2.Liu,G.et al.Extremely sensitive molecularly imprinted ECL sensorwith multiple probes released from liposomes immobilized by a light-triggeredclick reaction.ACS Sensors 6,4185-4192(2021).

3.Zhao,Y.et al.A novel molecularly imprinted polymerelectrochemiluminescence sensor based on Fe2O3@Ru(bpy)32+for determination ofclenbuterol.Sensors and Actuators B:Chemical 350,130822(2022).

4.Xu,C.et al.Light Scattering and Luminophore Enrichment-EnhancedElectrochemiluminescence by a 2D Porous Ru@SiO2 Nanoparticle Membrane and ItsApplication in Ultrasensitive Detection of Prostate-SpecificAntigen.Anal.Chem.93,11641-11647(2021).

5.Feng,YQ.et al.Ru(bpy)32+Incorporated Luminescent Polymer Dots:Double-Enhanced Electrochemiluminescence for Detection of Single-NucleotidePolymorphism.Anal.Chem.89,7659-7666(2017).

6.Wang,H-M.et al.Flower-like metal-organic framework microsphere as anovel enhanced ECL luminophore to construct the coreactant-free biosensor forultrasensitive detection of breast cancer 1gene.Sensors and Actuators B:Chemical 320,128395(2020).

7.Cai,JT.et al.A versatile signal-enhanced ECL sensing platform basedon molecular imprinting technique via PET-RAFT cross-linking polymerizationusing bifunctional ruthenium complex as both catalyst and sensingprobes.Biosensors&Bioelectronics 124,15-24(2019).

实施例3制备分子印迹聚合物(MIP)修饰RMCNs/GCE(MIP/RMCNs/GCE)

一、实验方法

1、如图8所示，按照实施例1的方法制备RMCNs/GCE，用电聚合法制备了MIP修饰的RMCNs/GCE(MIP/RMCNs/GCE)：

以RMCNs/GCE电极为工作电极，构建三电极系统(银/氯化银作参比电极，铂丝电极作对电极)，将电极置于含1mM邻苯二胺和0.2mMβ-HB(β-羟丁酸)的0.01M PBS(pH 5.0)溶液中进行循环伏安法(CV)扫描，扫描电位为0～0.8V，扫描速率50mV s^-1，进行连续25次循环，生成β-HB修饰的RMCNs/GCE。之后将β-HB修饰的RMCNs/GCE依次浸泡在PBS(pH 5.0)中30min去除β-HB，浸泡在乙腈中2min提取包埋的β-HB。

其中电解液为PBS缓冲液，功能单体为邻苯二胺，模板为β-HB。

从分子印迹聚合物中去除模板分子β-HB后，聚合物中出现了特定的空腔，为共反应物TPrA扩散到RMCNs提供了通道。

2、在检测时，将待测样本溶于PBS溶液(0.01M，pH＝5)中，得到待测样本PBS溶液。将MIP/RMCNs/GCE电极放在待测样本PBS溶液中孵育，得到孵育后的MIP/RMCNs/GCE电极。将孵育后的MIP/RMCNs/GCE电极用PBS溶液冲洗后，将其置于电解液中，电解液为三丙胺PBS溶液(0.01M，pH＝5)，三丙胺浓度为6.25mM。以孵育后的MIP/RMCNs/GCE电极作为工作电极、银/氯化银电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极进行检测，CV扫描的电压范围是0～1.5V，扫速是0.05V s^-1，通过电化学发光分析仪检测记录电化学发光强度。

在检测时，先检测已知的不同浓度的β-HB的PBS溶液(0.01M，pH＝5)，β-HB浓度为0.1nM～10mM，建立β-HB浓度与ECL强度变化的标准曲线。检测样本后，获得样本中β-HB的ECL强度，代入上述的标准曲线中，得到样本中β-HB的浓度。

检测过程中，分子印迹聚合物与β-HB分子重结合后，部分空腔被β-HB占据，阻断了TPrA与RMCNs的接触，导致RMCNs的ECL强度降低。

3、为了研究分子印迹聚合物的再结合能力和印迹效应，用MIP/RMCNs/GCE电极和非分子印迹聚合物(NIP)修饰的RMCNs/GCE电极分别检测β-HB。NIP修饰的RMCNs/GCE制备过程中，不添加β-HB模板，其他制备方法与制备MIP修饰的RMCNs/GCE相同。

4、用循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱(EIS)监测MIP/RMCNs/GCE电极和IP修饰的RMCNs/GCE电极各制备步骤的电化学特性。

二、实验结果

如图9所示，在GCE上滴镀RMCNs后，由于RMCNs的电导率较低，氧化还原电流减小。在MIP沉积修饰RMCNs/GCE过程中，随着聚合循环次数的增加，氧化峰电流显著减小，表明在RMCNs/GCE表面形成了绝缘分子印迹聚合物层(图10)。这种绝缘的分子印迹聚合物膜阻碍了电极与探针(TPrA)之间的电子传递，因此MIP沉积修饰RMCNs/GCE的氧化还原电流下降。

经PBS和乙腈洗脱后，分子印迹聚合物层中嵌入的β-HB被去除，形成印迹腔，有利于TPrA向电极内层扩散，氧化还原电流增大。

EIS的结果与CV一致。如图11所示，随着RMCNs在GCE上的滴涂修饰，由于RMCNs的导电性较差，玻碳电极的电子转移电阻(Ret)从20.8Ω上升到121.2Ω。在MIP沉积修饰RMCNs/GCE过程中，分子印迹聚合物层的形成使Ret进一步增加到10722.8Ω，而随后经PBS和乙腈洗脱，导致Ret的降低。绝缘分子印迹聚合物膜阻碍了电子的转移，但洗脱形成的空腔有利于电子和TPrA的穿透。

上述结果表明MIP修饰的RMCNs/GCE制备成功。如图12所示，将MIP修饰的RMCNs/GCE和NIP修饰的RMCNs/GCE分别在0.1nMβ-HB中孵育5min后，MIP修饰的RMCNs/GCE的ECL强度显著降低。相反，NIP修饰的RMCNs/GCE由于缺乏印迹腔，ECL强度变化较小，信号减弱，可能源于非特异性结合(图13)。这些结果表明，构建的MIP修饰的RMCNs/GCE对β-羟丁酸具有较强的特异性识别能力。

实施例4制备参数对MIP修饰RMCNs/GCE的影响

一、实验方法

为了提高MIP修饰RMCNs/GCE的传感性能，研究了其制备过程中，pH值、电化学循环伏安曲线扫描循环次数和单体/模板比(M/T比)，以及检测过程中，孵育时间对识别目标化合物β-HB的影响。对传感器响应10μMβ-HB和空白时的ECL强度变化(△I)进行评估。

1、PBS的pH值

设置制备过程中，PBS的pH值分别为3、4、5、6和7，其他制备方法与实施例3相同，检测MIP修饰RMCNs/GCE响应10μMβ-HB和空白对照溶剂时的ECL强度变化(△I)。

2、电化学循环伏安曲线扫描循环次数

设置电化学循环伏安曲线扫描循环次数分别为15、20、25、30和35，其他制备方法与实施例3相同，检测MIP修饰RMCNs/GCE响应10μMβ-HB和空白对照溶剂时的ECL强度变化(△I)。

3、单体/模板比(M/T比，即邻苯二胺与β-HB的摩尔比)

设置单体/模板比(M/T比)分别为1、5、10、15和20，其他制备方法与实施例3相同，检测MIP修饰RMCNs/GCE响应10μMβ-HB和空白对照溶剂时的ECL强度变化(△I)。

4、孵育时间

设置检测过程中，孵育时间分别为1、3、5、7和9min，其他制备方法与实施例3相同，检测MIP修饰RMCNs/GCE响应10μMβ-HB和空白对照溶剂时的ECL强度变化(△I)。

二、实验结果

1、如图14中A所示，MIP修饰RMCNs/GCE的ECL信号从pH 3.0到pH 5.0急剧增加，然后从pH 5.0到pH 9.0急剧下降，这可能是由于β-HB和o-PD官能团之间的强相互作用。因此，选择PBS的pH为5.0。

2、分子印迹聚合物的厚度是影响传感器识别和重结合能力的另一个重要参数，可以通过调节电聚合过程中的CV扫描周期来调节。电聚合循环次数越多，分子印迹聚合物膜越厚。如图14中B所示，随着CV扫描次数从5次增加到25次，响应信号逐渐增大，但随着CV扫描次数的进一步增加，响应信号逐渐减弱。薄分子印迹聚合物膜缺乏足够的印迹腔，而厚膜具有高电阻，阻碍β-HB的完全去除。因此，电聚合为25个循环。

3、从图14中C可以看出，随着M/T比的增大，响应信号在M/T比为10时达到最大值，之后略有减小。低M/T比会导致单体数量过少，形成稳定的分子印迹聚合物膜。相反，M/T比越高，模板分子嵌入越少，结合位点越少。因此，M/T比设为10。

4、从图14中D可以看出，随着孵育时间的延长，信号逐渐增强，并在5min时达到饱和，说明此时分子印迹聚合物与β-HB溶液之间处于动态平衡。因此，孵育时间选择5min。

实施例5MIP修饰RMCNs/GCE的性能

一、实验方法

对实施例3制备的MIP/RMCNs/GCE电极及其检测方法，对β-HB的检测范围、选择性、稳定性和重现性进行了评价。

1、检测范围

用MIP/RMCNs/GCE电极检测浓度分别为0.1nM～10mM的β-HB的ECL强度。

2、选择性

通常情况下，生物样品中存在多种物质共存，可能会干扰β-羟丁酸的测定，影响检测结果的准确性。本发明用MIP/RMCNs/GCE电极分别检测葡萄糖(GI)、抗坏血酸(AA)、乳酸(LA)、丙酮酸(PA)、尿素(Urea)和丁酸(BA)干扰物质的ECL强度，对传感器的选择性进行了评价。其中Blank是空白对照，mixture包含上面所有干扰物质及待测物β-HB。

3、稳定性

将MIP/RMCNs/GCE电极保存于4℃，每5天用其检测β-HB，评估其稳定性。

4、重复性

用10个独立制备的MIP/RMCNs/GCE对β-HB传感器测定β-HB，评价其重复性。

二、实验结果

1、检测范围：

从图15中A可以看出，随着β-HB浓度的增加，ECL强度逐渐降低，表明β-HB占据空腔阻碍了TPrA的扩散。

从图15中B可以看出，在0.1nM～10mM范围内，ECL强度随β-HB的对数浓度呈线性变化，回归方程为I＝1635.6-142lgCβ-HB。检测限(LOD)为0.03nM(S/N＝3)。

为了进行比较，本发明总结了所制备的MIP/RMCNs/GCE电极与其他已报道的β-HB检测传感器的传感性能。如表5所示，本发明所制备的MIP/RMCNs/GCE电极可以在更宽的线性范围内检测β-HB，LOD更低，这是由于实施例1制备的RMCNsECL特性优越。

2、如图15中C所示，MIP/RMCNs/GCE对β-HB产生了显著的信号，而对干扰物质的响应可以忽略，尽管这些干扰物质的浓度远高于β-HB，这表明实施例3制备的MIP/RMCNs/GCE具有良好的选择性和抗干扰能力。

3、从图15中D可以看出，ECL强度在30天内没有明显下降，保持在初始信号的95％以上。

4、其相对标准偏差小于4％(图15中E)。结果表明，β-HB的选择性强、长期稳定性好、重复性好，具有较大的实际应用潜力。

表5

a:glutaraldehyde/chitosan/polyvinyl chloride/microneedle.

b:β-Hydroxybutyrate dehydrogenase/screen-printed carbon electrodes.

c:D-3-hydroxybutyate dehydrogenase-horse radish peroxidase/nanoporousgold/fluorine-doped tin oxide.

表5中的参考文献为：

8.Zhang,X.et al.Integrated Wearable Sensors for Sensing PhysiologicalPressure Signals andβ-Hydroxybutyrate in Physiological Fluids.Anal.Chem.94,993-1002(2022).

9.Teymourian,H.et al.Microneedle-Based Detection of Ketone Bodiesalong with Glucose and Lactate:Toward Real-Time Continuous Interstitial FluidMonitoring of Diabetic Ketosis and Ketoacidosis.Anal.Chem.92,2291-2300(2020).

10.Li,G.et al.A new handheld biosensor for monitoring bloodketones.Sensors and Actuators B:Chemical 109,285-290(2005).

11.Li,J.et al.A novel photoelectrochemical microfluidic chip formulti-index determination of diabetes and its complications.Biosens.Bioelectron.217,114719(2022).

实施例6实际样本检测

一、实验方法

为了评估实施例3制备的MIP/RMCNs/GCE及其检测方法的可行性，测量了正常饮食和生酮饮食的志愿者的血清β-羟丁酸水平。

首先，测试志愿者在正常饮食5天情况下血清中的β-HB水平，然后测试志愿者在生酮饮食5天情况下血清中的β-HB水平。在这10天中，采血时间为每天下午3点。生酮饮食指的是每日摄取的食物中，碳水化合物含量低，蛋白质含量适中，脂肪含量高。

二、实验方法

如图16所示，在前5天，正常饮食的男性(图16中A)和女性(图16中B)志愿者β-HB水平分别稳定在0.12mM和0.13mM左右，说明β-HB水平在不同性别之间存在差异。生酮饮食后，志愿者体内β-HB水平均显著升高。在随后连续4天的生酮饮食中，β-HB含量有波动，但基本维持在0.25mM和0.35mM左右，说明生酮饮食可导致β-HB水平明显升高。在生酮饮食的最后一天，志愿者体内的β-HB水平略有下降，这表明志愿者已经适应了生酮饮食。此外，这些结果已被商用酮仪(雅培越佳型血糖血酮仪)验证，两种方法得到的结果吻合良好，表明实施例3制备的传感器具有良好的精度和可靠性。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球的制备方法，其特征在于，先混合多巴胺、三嵌段聚合物Pluronic F127、1，3，5-三甲基苯和三联吡啶钌依，在400～800rpm的搅拌速度下进行反应，制备得到F127/TMB/DA复合胶束，再在400～800rpm的搅拌速度下催化F127/TMB/DA复合胶束中的多巴胺聚合，制备得到三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球；

所述多巴胺聚合的反应时间为0.5～2.5h；

所述多巴胺、三嵌段聚合物Pluronic F127、1，3，5-三甲基苯和三联吡啶钌依的质量比为10：20：25：3～7。

2.权利要求1所述制备方法制备得到的三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球。

3.权利要求2所述三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球在制备电化学发光检测产品、制备检测β-羟丁酸的产品或制备检测糖尿病的产品中的应用。

4.一种电化学传感器，其特征在于，所述电化学传感器中含有权利要求2所述三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球。

5.一种电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将权利要求2所述三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球滴涂在玻碳电极表面，得到三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球/玻碳电极；

S2：以步骤S1的三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球/玻碳电极为工作电极，银和氯化银作参比电极，铂丝电极作对电极，得到三电极系统，将所述三电极系统置于含邻苯二胺和β-羟丁酸的溶液中，进行循环伏安法扫描，生成分子印迹聚合物/三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球/玻碳电极初产物；

S3：将步骤S2所述的分子印迹聚合物/三联吡啶钌掺杂的介孔碳纳米球/玻碳电极初产物中的邻苯二胺和β-羟丁酸去除，即得所述电化学传感器。

6.一种检测β-羟丁酸的产品，其特征在于，所述检测β-羟丁酸的产品中含有权利要求4所述的电化学传感器。

7.一种检测糖尿病的产品，其特征在于，所述检测糖尿病的产品中含有权利要求6所述的检测β-羟丁酸的产品。