CN116785332A - 一种用于抑制covid-19 xbb 1.5变异株感染的水浸提活性物及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种用于抑制COVID‑19XBB 1.5变异株感染的水浸提活性物及其应用，涉及医药的技术领域，其用于抑制COVID‑19XBB 1.5变异株感染的水浸提活性物为岩白菜水浸提活性物；岩白菜水浸提活性物的原料为岩白菜全草。本发明的有益效果在于：岩白菜水浸提活性物可用于防治COVID‑19XBB 1.5变异株感染；以及岩白菜水浸提活性物作为COVID‑19XBB 1.5变异株感染的抑制剂，可在药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及医药的技术领域，特别是涉及一种用于抑制COVID-19 XBB 1.5变异株感染的水浸提活性物及其应用。
背景技术
COVID-19病毒对弱势人群，尤其是老年人或有基础健康问题的人群，构成特别风险；COVID-19病毒的刺突(S)蛋白在渗入和感染人类细胞方面起着至关重要的作用；通过与人类细胞表面上存在的血管紧张素转换酶2(ACE2)受体的相互作用，S蛋白有助于病毒进入这些细胞；S蛋白是一种糖蛋白，由S1和S2两个亚单位组成，对病毒的侵入和复制起着至关重要的作用；在S1亚单位中，有一个受体结合结构域(RBD)，负责识别和结合ACE2受体；另一方面，S2亚单位促进病毒膜与宿主细胞膜的融合，使病毒能够侵入和在宿主细胞内复制；ACE2受体广泛分布在人体的各种组织中，特别是在肺、心脏和肾脏中；病毒的S蛋白与ACE2受体的相互作用引起了结构性变化，有助于病毒的侵入和感染；病毒进入细胞后，其遗传物质(RNA)释放到细胞质中，然后病毒控制细胞的机器开始复制，产生更多的病毒颗粒；这些颗粒随后从感染的细胞释放出来，使病毒能够在全身传播，这种感染过程可以损害感染的细胞，导致组织损伤和炎症，特别是在肺部；随着病毒的进展，它可以引起广泛的炎症，导致严重症状，如发热、咳嗽和呼吸困难；目前，研究人员正在探索针对S蛋白的潜在治疗方法，干扰其与ACE2受体的相互作用，从而阻止病毒的进入和感染；进一步的研究至关重要，以完全理解这种相互作用并开发出对COVID-19有效的治疗方法和疫苗。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种用于抑制COVID-19 XBB 1.5变异株感染的水浸提活性物及其应用，以解决上述的问题。
本发明提供一种用于抑制COVID-19 XBB 1.5变异株感染的水浸提活性物及其应用，其用于抑制COVID-19 XBB 1.5变异株感染的水浸提活性物为岩白菜水浸提活性物。
所述岩白菜水浸提活性物的水浸提方法为：
步骤一：岩白菜全草在室温下的干燥房内风干了五天；
步骤二：将岩白菜剪成0.5厘米长的段，并放入尼龙网袋中；
步骤三：进行称量，向萃取器中添加相当于草药重量30倍的纯净水进行萃取，一旦水沸腾，对草药进行为期2小时萃取；
步骤四：用电热干燥箱以60℃的温度进行水提取物的干燥，得到干燥的水提取物粉末；
步骤五：将干燥的水提取物粉末重新溶解于纯净水中，经过滤去除不溶性物质，再次使用60℃的干燥箱进行干燥，得到水浸提岩白菜活性物。
所述岩白菜水浸提活性物作为COVID-19 XBB 1.5变异株感染的抑制剂，在药物中的应用。
所述岩白菜水浸提活性物在防治COVID-19 XBB 1.5变异株感染中的应用。
本发明的有益效果在于：岩白菜水浸提活性物可用于防治COVID-19XBB 1.5变异株感染；以及岩白菜水浸提活性物作为COVID-19 XBB 1.5变异株感染的抑制剂，可在药物中的应用。
附图说明
图1为本发明实施例中的标准曲线图；
图2为本发明实施例中的初筛浓度柱状图；
图3为本发明实施例中11#岩白菜的毒性测试图；
图4为本发明实施例中43#酸藤果的毒性测试图；
图5为本发明实施例中11#岩白菜的抑制率曲线图；
图6为本发明实施例中43#酸藤果的抑制率曲线图；
图7为本发明实施例中的细胞图像；
图8为本发明实施例中11#岩白菜和43#酸藤果的活性散点图。
具体实施方式
实施例1
本发明提供一种用于抑制COVID-19 XBB 1.5变异株感染的水浸提活性物及其应用，其用于抑制COVID-19 XBB 1.5变异株感染的水浸提活性物为酸藤果水浸提活性物；
找到能够干扰ACE2-RBD蛋白质相互作用(PPI)并抑制SARS-CoV-2病毒感染的有效活性物，使用COVID-19血清中和抗体荧光免疫层析试剂盒对64种常用的中草药进行了筛选，进行了初步的活性评估；随后，使用COVID-19 XBB1.5变异株和Vero E6细胞建立了体外感染模型；然后利用该模型验证了活性水提取物的抗感染能力；
材料与实验方法
实验材料
使用的草药是从当地的中药市场获得的，并采取了特殊预防措施以确保其清洁度；植物表面经过彻底清洗，使用纯净水去除任何污垢或土壤残留物；随后，在受控室温条件下蒸发植物表面的水分；随后由植物分类学专家进行鉴定过程；任何无法鉴定的草药均被排除，最终选择了64种草药进行后续研究阶段；
SARS-CoV-2S1蛋白(40591-V08H)、人ACE2蛋白(10108-H08H)、COVID-19中和抗体(40591-MM43)、COVID-19核蛋白抗体(40143-R004)均从北京四方达生物技术有限公司(中国北京)购买；
XBB1.5变异株和Vero-E6细胞由广州海关技术中心(中国广东广州)提供；
免疫层析试纸由青海阿尔蒂米特生物技术有限公司(中国青海西宁)制造和提供；
干式荧光免疫分析仪由青海阿尔蒂米特生物技术有限公司(中国青海西宁)提供；
草药提取物的制备方法
草药在室温下的干燥房内风干了五天，然后，我们使用剪刀将草药剪成0.5厘米长的段，并放入尼龙网袋中，在称量草药后，我们向萃取器中添加了相当于草药重量30倍的纯净水，一旦水沸腾，我们对草药进行了为期2小时的提取；随后，用电热干燥箱以60℃的温度进行水提取物的干燥，得到干燥的水提取物粉末；然后，将干燥的粉末重新溶解于纯净水中，经过过滤以去除不溶性物质，再次使用60℃的干燥箱进行干燥；完全干燥后，我们将粉末存放在密封的玻璃瓶中，并用标签纸进行标记，最后，我们将它们存放在室温下的干燥环境中；
草药水提取物的初步筛选
我们使用免疫层析法评估了不同草药提取物在抑制ACE2和S1蛋白相互作用方面的有效性；清华爱科江研生物技术有限公司开发的半定量检测血清COVID-19中和抗体的胶体金标记抗体试剂盒已在荷兰获得医疗器械CE认证；基于他们的相关技术，由清华爱科江研生物技术有限公司为我们提供一种标有荧光微球的COVID-19血清中和抗体检测试剂盒，旨在对我们的筛选结果进行初步定量化；
我们设计了一种利用ACE2蛋白和S1蛋白之间互相作用的T线；该步骤涉及将Eu荧光微珠标记在S1蛋白上，然后均匀分布在经过预处理的玻璃纤维膜上并彻底干燥；随后，ACE2蛋白被固定在硝酸纤维膜上的指定T线位置；此外，我们通过利用天然鸡IgY抗体和山羊抗鸡IgY抗体之间的相互作用创建了C线；鸡IgY抗体被标记有Eu荧光微珠并均匀分散在经过预处理的玻璃纤维膜上；最后，山羊抗鸡IgY抗体被牢固地固定在硝酸纤维膜上的C线位置；个别测试条被精心组装到单独的塑料外壳中；青海奥迪美生物技术有限公司对该生产批次进行了细致的质量检查，所有采样标本均符合他们严格的公司标准；
如图1所示，为了分析试剂纸带的定量性能并建立标准曲线图，我们进行了以下步骤；购买的S1中和抗体作为参考，在试剂纸带的样品处理溶液中稀释，以获得接近抗体说明书中推荐IC50值的各种浓度；混匀后，将不同浓度的抗体应用到试剂纸带的样品孔中；然后，将试纸带水平放置且不移动15分钟；使用青海奥迪美生物技术有限公司的荧光免疫分析仪分别测量与T线和C线相对应的荧光值；使用log2(T线荧光值/C线荧光值)作为因变量，log2(中和抗体浓度)作为自变量进行回归分析，得到标准曲线；这个标准曲线使我们能够确定等效未知样品活性的S1中和抗体浓度；我们将这种活性评估措施称为等效抗体浓度；根据标准曲线图，我们可以继续测量不同草药提取物的等效抗体浓度；我们准确称量了所有草药的水提取物，并将其溶解在试剂纸带附带的样品处理溶液中，浓度为3mg/mL；然后，我们将制备好的样品应用到免疫层析试纸的样品孔中，并将试纸带放置在水平平台上，静置15分钟；最后，我们使用荧光免疫分析仪进行测试并记录结果等效抗体浓度，如表1所示，可以进行对所有测试样品活性的半定量评估；
表1 Screening the Biological Activity of 64Traditional TibetanMedicines
其中11#岩白菜和43#酸藤果的浓度明显高于其他草药；
对11#岩白菜和43#酸藤果进行高效液相色谱检测
采用装有双波长紫外检测器的汉邦高效液相色谱系统进行HPLC分析；色谱分离采用Kromasil CN柱(5μm，10.0×250mm)；流动相由水-甲酸(A；100：0.1，体积比)和乙腈-甲酸(B；100：0.1，体积比)组成，并采用梯度洗脱程序，从0％到100％的B溶液在0到40分钟内进行分离；流速设置为4.0mL/min；化合物在210nm波长下通过与254nm波长结合检测，柱温保持在55℃；
细胞培养
培养Vero-E6细胞的方法涉及几个步骤；首先，准备完整培养基，如Dulbecco改良的鹰酮培养基(DMEM)(Gibco,纽约，美国)，添加10％胎牛血清(FBS)(Gibco,纽约，美国)；接下来，在37℃水浴中化解冻结的Vero-E6细胞，直到只剩下一个小冰晶；将细胞转移到一个无菌的圆底管中，轻轻加入预热的完整培养基；以较低的速度离心圆底管，沉淀细胞，并小心去除上清液；将细胞沉淀悬浮在完整培养基中，并转移到T25或T75细胞培养瓶中(BKMAN,长沙，中国)；将培养瓶放置在37℃和5％ CO2孵化箱中；定期用新鲜的完整培养基喂养细胞，并监测它们的生长情况和充实度；当细胞达到80-90％的充实度时，用PBS洗涤并用胰酶-EDTA溶液消化；加入新鲜的完整培养基以停止胰酶活性，并将细胞悬浮物转移到新的瓶子或培养皿中；
11#岩白菜和43#酸藤果进行细胞毒性的测试
如图3-4所示，实验设置包括三组：样品处理组、细胞对照组(正常细胞)、空白对照组(无细胞)；样品从1000μg/mL开始按三倍系列稀释，共有10个不同浓度；每个浓度在三个复孔中进行测试；Vero-E6细胞在96孔板中培养，上清液被移除；然后，在每个孔中加入100μL相应的样品稀释液，并在37℃和5％ CO2下孵育24小时；孵育结束后，使用CCK-8试剂进行检测；将样品稀释液的上清液丢弃，在每个孔中加入100μL不含胎牛血清的DMEM培养基，空白对照组的孔除外；此外，在每个孔中加入10μL的CCK-8溶液，将板子在37℃和5％ CO2下孵育2小时；最后，使用分光光度计测量450nm处的吸光度；生成细胞存活曲线以确定样品的最大安全浓度；
使用活病毒测试样品的抗病毒活性
新冠病毒XBB1.5变异株的朔源和定量，该病毒的完整基因组序列由广州海关技术中心预先确定；完整的基因组序列已上传到Nextclade数据库(https://clades.nextstrain.org/)进行比较，以确定目标病毒的分类；证明本研究中使用的病毒确实是COVID-19 XBB1.5.7变种；
Vero E6细胞以每孔2×104细胞的密度在96孔底平底细胞培养板中培养；12小时后，当细胞达到90％的密度时，上清液被丢弃；然后，准备一个96孔圆底板，在每个孔中加入180μL无血清DMEM；在A行，向每个孔中加入20μL病毒存储液，然后进行10倍的稀释，每个稀释有8个孔；然后，将稀释后的病毒液加入已经丢弃细胞上清液的孔中，每孔加入100μL；将板子在37℃和5％ CO2下孵育72小时；观察和记录细胞病变效应(CPE)，特别是记录显示CPE的孔数；随后，使用Reed-Muench方法计算TCID50；
活性验证实验
如图7所示，为了建立药物孵育培养基，11#岩白菜和43#酸藤果水浸提活性物经过精心稀释，以达到0.33、0.11、0.037、0.012和0.0041mg/ml的浓度，使用D2培养基(DMEM+2％FBS)；实验包括三个不同的组：只有细胞的对照组、病毒感染组和药物-病毒相互作用组；在每个组中，使用每种药物稀释的三个平行复制品；在Vero E6细胞受病毒感染之前，细胞培养上清液被精心更换为适当的药物孵育培养基，每孔加入100μL；随后，细胞在含5％ CO2的37℃环境中孵育2小时；
在BSL-3实验室中，对细胞培养板进行预处理后，上清液被丢弃；Omicron XBB.1.5病毒以感染度为0.2的倍数稀释在D2培养基(DMEM+2％FBS)中；药物处理培养基是通过在D2培养基(DMEM+2％ FBS)中将酸藤果水浸提活性物稀释到浓度为0.66、0.22、0.073、0.024和0.0081mg/ml来制备的；这五个药物浓度被用作处理点；然后，稀释后的病毒与相应浓度的药物以等体积混合；混合物以每孔50μL的体积加入到细胞培养板中；细胞在37℃和5％ CO2浓度下孵育1小时；孵育含病毒的培养基1小时后，上清液被丢弃；随后，每孔加入100μL的含有适当药物浓度的D2培养基(DMEM+2％ FBS)；接下来，培养板在37℃和5％ CO2浓度下孵育24小时；
在BSL-3实验室中，每孔加入200μL 4％的PFA固定液，旨在灭活病毒并固定细胞；在室温下固定超过1小时后，吸去固定液，再加入200μL 4％的PFA固定液；对细胞培养板的外部表面进行消毒，为随后的分析做准备；对孔中的固定细胞进行PBS缓冲液的彻底洗涤，然后用Triton-X100进行处理；接下来，细胞在室温下与一种针对SARS-CoV-2核心蛋白的兔单克隆抗体孵育1小时；在进行彻底的洗涤步骤以去除任何多余的一抗后，细胞与AlexaFluor 488标记的抗兔IgG再孵育1小时；最后，使用DAPI染色细胞核，作为细胞计数的对照；利用Celigo系统定量评估细胞培养板中的荧光强度并捕获细胞图像，如图7所述，以确定病毒感染水平；
实验结果
筛选方法的建立
如图1所示选择Eu荧光微球分别标记S1蛋白和鸡IgY抗体，进行层析实验；当与涂有ACE2的T线相互作用时，标记有S蛋白的Eu荧光微球在T线位置形成了明亮的荧光线；类似地，当与涂有羊抗鸡IgY抗体的C线相互作用时，标记有鸡IgY的Eu荧光微球产生了醒目的荧光线；在存在抑制剂的情况下，S蛋白和ACE2之间的结合受到阻碍，导致T线的荧光下降；然而，无论样品液体如何，C线上的荧光保持不变且不受影响；
为了进行半定量分析，建立荧光试纸的标准曲线是必不可少的；为此，使用纯化的重组新冠病毒S1蛋白中和抗体；该抗体使用试剂条的样品溶液稀释得到六种不同浓度，范围从1到60μg/mL；然后将每种稀释后的抗体溶液应用到试剂条的样品孔中；经过15分钟的孵育后，记录荧光值；收集到的数据呈线性关系，如图1所示；标准曲线方程显示具有很高的相关系数，用R2值表示为0.97，表明有良好的关联性；这个标准曲线方程可以用于后续的半定量分析；
筛选活性水提取物
在初步筛选实验中，所有水浸提活性物样品均以相同的浓度3mg/mL使用，每个样品重复两次；表1和图2中显示11#岩白菜和43#酸藤果水浸提活性物表现出了优于1000μg/mL中和抗体的异常活性；随后，如图8所示，对11#岩白菜和43#酸藤果水浸提活性物的抑制活性进行了重复测试，从3mg/mL的初始浓度开始，达到最终浓度为0.25、0.13、0.063、0.031、0.016、0.0078和0.0039mg/mL，以验证初步筛选结果；如图5-6所示，对于3mg/mL浓度，酸藤果水浸提活性物的抗体浓度大于1000μg/mL；随着浓度的降低，抑制活性减弱；酸藤果水浸提活性物在其抑制特性方面表现出浓度-活性效应，并且其抑制效果具有良好的重复性。
Claims (4)
1.一种用于抑制COVID-19XBB 1.5变异株感染的水浸提活性物，其特征在于：用于抑制COVID-19XBB 1.5变异株感染的水浸提活性物为岩白菜水浸提活性物。
2.根据权利要求1所述的一种用于抑制COVID-19XBB 1.5变异株感染的水浸提活性物，其特征在于：所述岩白菜水浸提活性物的水浸提方法为：
步骤一：岩白菜全草在室温下的干燥房内风干了五天；
步骤二：将岩白菜剪成0.5厘米长的段，并放入尼龙网袋中；
步骤三：进行称量，向萃取器中添加相当于草药重量30倍的纯净水进行萃取，一旦水沸腾，对草药进行为期2小时萃取；
步骤四：用电热干燥箱以60℃的温度进行水提取物的干燥，得到干燥的水提取物粉末；
步骤五：将干燥的水提取物粉末重新溶解于纯净水中，经过滤去除不溶性物质，再次使用60℃的干燥箱进行干燥，得到水浸提岩白菜活性物。
3.根据权利要求1所述的一种用于抑制COVID-19XBB 1.5变异株感染的水浸提活性物的应用，其特征在于：所述岩白菜水浸提活性物作为COVID-19XBB 1.5变异株感染的抑制剂，在药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的一种用于抑制COVID-19XBB 1.5变异株感染的水浸提活性物的应用，其特征在于：所述岩白菜水浸提活性物在防治COVID-19XBB 1.5变异株感染中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202310914606.5A CN116785332A (zh) | 2023-07-25 | 2023-07-25 | 一种用于抑制covid-19 xbb 1.5变异株感染的水浸提活性物及其应用 |
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|---|---|---|---|---|
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2023
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| CN116898885B (zh) * | 2023-07-25 | 2024-04-16 | 中国科学院西北高原生物研究所 | 一种用于抑制covid-19 xbb 1.5变异株感染的水浸提活性物及其应用 |
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