CN116783219A - 基于TCRα/β反应性的T细胞募集多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明技术提供了特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的T细胞募集多肽。本发明技术还提供了核酸、载体和组合物。所述多肽可用于治疗癌症的方法中。
Description
1技术领域
本发明技术提供了多特异性T细胞募集多肽，所述多特异性T细胞募集多肽结合T细胞上的人T细胞受体(TCR)的恒定结构域和T细胞上的非人灵长类动物TCR的恒定结构域二者以及在靶细胞上的至少一种抗原。它还涉及用于这些多特异性多肽的单价TCR结合多肽。本发明技术还提供了编码所述多肽的核酸以及产生这些多肽的载体、宿主和方法。此外，本发明技术涉及使用本发明技术的多肽和提供所述多肽的试剂盒进行治疗的方法。
2背景技术
癌症在世界各地造成了相当多的人类死亡。现在它是全球性死亡的第二个首要原因，仅位于心脏病和中风之后。癌症是全世界的发病和死亡的首要原因之一，在2018年有大约1810万新病例和960万癌症相关死亡。新病例的数量预计将在未来几十年进一步上升。人口增长、老龄化和生活方式的变化被描述为是渐增的癌症负担的促成因素。(来源：WHOCancer)全世界源于癌症的过早死亡和残疾的总经济影响在2008年已约为9000亿美元，相当于当时世界国内生产总值的1.5％。
用于实体瘤的可用治疗方案通常包括手术切除、化学疗法和放射疗法的组合。在40年的临床经验中取得了很少的进展，尤其是在癌症的晚期。亟待对抗癌症的新疗法。
抗体疗法现在是医生对抗疾病且尤其是癌症的重要部分。已经建立了单克隆抗体作为一系列疾病的关键治疗方法，已有几年之久。大多数同期批准的抗体疗法依赖于单特异性单克隆抗体(mAb)。直到今天，mAb的大多数靶标都需要激动方法或拮抗方法。虽然靶向细胞表面抗原本身可以通过诱导细胞凋亡来介导抗肿瘤活性，但针对血液恶性肿瘤的大多数基于mAb的活性依赖于Fc介导的效应物功能，如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
最近，免疫疗法已成为一种迅速增长的癌症研究领域。免疫疗法是将身体的免疫监测系统并且特别是T细胞定向至癌细胞。
细胞毒性T细胞(CTL)是杀伤癌细胞、感染(特别是病毒感染)的细胞或以其他方式受损的细胞的T淋巴细胞。T淋巴细胞(或T细胞)在细胞表面上表达T细胞受体或TCR分子和CD3受体。αβTCR-CD3复合物(或“TCR复合物”)由六个不同的I型单次跨膜蛋白构成：形成负责配体识别的TCR异二聚体的TCRα和TCRβ链；以及非共价缔合的CD3γ、CD3δ、CD3ε和ζ链，它们带有胞质序列基序，这些基序在受体激活时被磷酸化并募集大量信号传导组分(Call等人2004,Molecular Immunology 40:1295-1305)。
T细胞受体的α链和β链均由恒定结构域和可变结构域组成。在生理上，T细胞受体的αβ链识别加载有肽的MHC复合物，并在接合时与CD3链偶联。这些CD3链随后将接合信号转导至细胞内环境。
考虑到天然存在的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导细胞裂解的潜力，已经探索了各种策略来募集免疫细胞以介导肿瘤细胞杀伤。由于T淋巴细胞缺乏Fc受体的表达，它们不会通过抗肿瘤单克隆抗体的Fc尾被募集到肿瘤部位。作为替代方案，将患者的T细胞用对限定肿瘤抗原具有已知特异性的第二TCR进行修饰。这种过继细胞转移本质上是高度个性化和劳动密集型的。然而，T细胞疗法的主要问题仍然是已知在癌症患者中发生的大量免疫逃逸机制(Nagorsen等人2012,Pharmacology&Therapeutics 136:334-342)。
与引发特异性T细胞应答(依赖于癌细胞对MHC分子的表达以及特定肽抗原的存在、产生、运输和展示)不同，最近的开发尝试通过经由基于重组抗体的技术“双特异性”以多克隆方式接合患者的所有T细胞，而将免疫疗法的优势与抗体疗法结合起来。
双特异性抗体已经进行了工程化，其在一个臂(靶标结合臂)上具有肿瘤识别部分，而分子的另一个臂对T细胞抗原(通常是CD3)具有特异性(效应物结合臂)。通过两个臂同时结合它们对应的抗原，T淋巴细胞被定向至肿瘤细胞处并在此处激活，在肿瘤细胞处所述T淋巴细胞可以发挥它们的溶细胞功能。
使用双特异性抗体激活T细胞对抗肿瘤细胞的概念在30多年前就已被描述，但制造问题和临床失败使该领域陷入停滞。当通过减少抗体到其可变片段而产生的更小形式的双特异性抗体被开发出来时，取得了进一步的进展。
目前，市场上只有一种双特异性抗体博纳吐单抗(一种识别CD19和CD3的BiTE分子)用于临床治疗癌症。尽管这种T细胞接合形式于2014年12月被FDA批准用于二线治疗，但必须克服许多障碍。一方面由于神经病学不良事件、细胞因子释放综合征(CRS)和感染，以及另一方面由于缺乏客观临床反应或生物活性的稳健迹象，博纳吐单抗的第一次临床试验提前停止。CRS是首批T细胞接合疗法中报告的最重要的不良事件。
为了将不良事件和全身副作用(如细胞因子风暴)的风险最小化，在选择T细胞抗原臂时必须格外小心。后者必须以单价方式与TCR复合物结合，并且在没有靶标癌细胞的情况下不可触发T细胞信号传导。只有双特异性抗体的两个臂与其靶标(肿瘤和T细胞抗原)特异性结合才可触发溶细胞突触的形成和随后对肿瘤细胞的杀伤。
非人灵长类动物，如食蟹猴或恒河猴，通常被认为是最适合进行临床前研究(包括功效和毒性研究)的动物物种。为了使得能够评估双特异性T细胞接合抗体在非人灵长类动物中的毒性，抗体对于人TCR和非人灵长类动物TCR的良好物种交叉反应性是可取的。
虽然大多数T细胞激活性双特异性抗体靶向T细胞上的CD3受体，但靶向T细胞受体恒定结构域的一些双特异性抗体已在WO 2016180969 A1中进行了描述。
然而，仍然需要另外的多特异性T细胞接合形式，特别是靶向不同于CD3的T细胞受体的多特异性T细胞接合形式。
3发明内容
本发明技术的一个目的是提供
-免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)以及包含所述免疫球蛋白单可变结构域的多肽，它们具有改善的与人TCR的恒定结构域的结合；
-ISVD以及包含所述ISVD的多肽，它们具有改善的与非人灵长类动物TCR的恒定结构域的结合；
-ISVD以及包含所述ISVD的多肽，它们具有改善的与人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的结合；和/或
-ISVD以及包含所述ISVD的多肽，它们具有改善的与人和非人灵长类动物TCR结合的交叉反应性；
-具有改善的编排(formatting)特性的ISVD；
-包含具有改善的与人和/或非人灵长类动物TCR的恒定结构域的结合的ISVD和与靶细胞上的至少一种抗原结合的ISVD的多肽；和
-包含具有改善的与人和非人灵长类动物TCR结合的交叉反应性的ISVD和与靶细胞上的至少一种抗原结合的ISVD的多肽。
诸位发明人进行了专门的研究以改善ISVD T01700056G05的结合特征，先前描述于WO 2016180969中。当ISVD T01700056G05被编排为具有与靶细胞上的一种或多种抗原结合的一种或多种肿瘤结合ISVD的多特异性形式时，它能够裂解靶细胞。ISVD T01700056G05与结合不同肿瘤相关抗原的ISVD组合后证实了肿瘤细胞杀伤，反映了这些双特异性抗体的广泛适用性。此外，这些多特异性形式在与白蛋白结合时仍保持活性，有助于获得有利的PK曲线和患者依从性。虽然ISVD T0170056G05在被编排为与结合靶细胞上的抗原的一种或多种ISVD组合的多特异性多肽时显示实现肿瘤细胞杀伤，但发现所述ISVD与食蟹猴TCR结合的亲和力显著低于所述ISVD与人TCR结合的亲和力。为了使得能够评估多特异性T细胞接合多肽在对非人灵长类动物进行临床前研究中的毒性，抗体对于人和非人灵长类动物的良好物种交叉反应性是高度可取的。
诸位发明人鉴定出如下的某些氨基酸突变及其组合，它们引入ISVD T0170056G05的CDR中后导致所述ISVD与人TCR和/或非人灵长类动物TCR的恒定结构域的结合得到改善。另外，鉴定出如下氨基酸突变及其组合，它们导致改善的与人和非人灵长类动物TCR结合的交叉反应性，这有益于评估在非人灵长类动物物种(如食蟹猴或恒河猴)中的毒性。包含具有改善的结合特性的这种ISVD并且还包含特异性结合靶细胞上的抗原的一种或多种ISVD的本发明技术的多肽能够将T细胞重定向至靶细胞，并随后诱导T细胞激活，从而导致靶细胞的裂解。
诸位发明人鉴定出一种ISVD，其在多特异性T细胞接合多肽的形式中，在不论位于所述多肽中的C末端位置或还是N末端位置时，均出人意料地显示出改善的T细胞激活效力和改善的与人和非人灵长类动物TCR结合的交叉反应性。这些具有改善的人/食蟹猴交叉反应性和效力的多肽仅在与T细胞和靶细胞二者均结合时才显示作用。另外，在食蟹猴的功效研究中，未能观察到这些具有改善的人/食蟹猴交叉反应性的多肽的安全性相关问题。与替代地包含ISVD T0170056G05的相同多肽相比，在食蟹猴中可以观察到这种多肽的延长功效。
在一些实施方案中，因此本发明技术提供了一种包含第一ISVD和至少一种另外的ISVD的多肽，其中所述第一ISVD特异性结合T细胞上存在的人和/或非人灵长类动物TCR的恒定结构域，并且所述至少一种另外的ISVD特异性结合靶细胞上的抗原。
在一些实施方案中，所述多肽进一步包含任选地经由一个或多个肽接头连接的一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元，其中与没有所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元的相应多肽相比，所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为所述多肽提供增加的半衰期。例如，所述结合单元可以是与(人)血清蛋白如人血清白蛋白结合的ISVD。
还提供了一种编码本发明技术的多肽的核酸分子或一种包含所述核酸的载体。
本发明技术还涉及一种用编码根据本发明技术的多肽的核酸或载体转化或转染的宿主细胞。
还提供了一种产生本发明技术的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：在允许表达所述多肽的条件下培养用编码根据本发明技术的多肽的核酸或载体转化或转染的宿主细胞，以及从培养物回收产生的多肽。
在一些实施方案中，本发明技术的多肽包括在组合物如药物组合物中。
此外，本发明技术涉及用作药物的多肽。在一个实施方案中，所述多肽用于治疗增殖性疾病、炎性疾病、感染性疾病或自身免疫病。在一个实施方案中，所述增殖性疾病是癌症。本发明技术还提供了治疗那些疾病的方法，所述方法包括将所述多肽施用于有需要的受试者；以及用于制备治疗那些疾病的药物的多肽。
具体地，本发明技术提供了以下实施方案：
实施方案1.一种包含第一免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和第二免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中
-所述第一ISVD特异性结合T细胞上存在的人和非人灵长类动物T细胞受体(TCR)的恒定结构域；
-所述第二ISVD特异性结合靶细胞上的第一抗原；
其中所述第一抗原不同于所述TCR；
其中所述靶细胞不同于所述T细胞；并且
其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1的氨基酸序列是Xaa Xaa Val His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa(SEQ IDNO:295)，其中
位置1处的Xaa是Gly、Trp、Gln或Tyr，
位置2处的Xaa是Asp、Glu、Tyr、Ser或Ala，
位置5处的Xaa是Lys或Gln，
位置6处的Xaa是Ile或Leu，
位置7处的Xaa是Asn或Phe，
位置8处的Xaa是Phe、Val或Tyr，
位置9处的Xaa是Leu、Tyr或Phe，
位置10处的Xaa是Gly、Thr或Arg，
(ii)CDR2的氨基酸序列是Xaa Ile Ser Ile Xaa Asp Xaa Xaa Asp(SEQ ID NO:296)，其中
位置1处的Xaa是His或Val，
位置5处的Xaa是Gly或Ala，
位置7处的Xaa是Gln、Val或Glu，
位置8处的Xaa是Thr、Ser或Val，
(iii)CDR3的氨基酸序列是Xaa Ser Xaa Ile Xaa Pro Tyr Xaa Xaa(SEQ ID NO:297)，其中
位置1处的Xaa是Phe、Leu或Met，
位置3处的Xaa是Arg、Lys或Ser，
位置5处的Xaa是Tyr或Trp，
位置8处的Xaa是Asp或Gln，
位置9处的Xaa是Tyr或Trp，并且
其中所述第一ISVD的CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ ID NO:153、209和223的氨基酸序列。
优选地，如实施方案1中所定义的CDR1的氨基酸序列与SEQ ID NO:153相比具有1、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8个氨基酸差异。更优选地，如实施方案1中所定义的CDR1的氨基酸序列与SEQ ID NO:153相比具有1、或2、或3、或4、或5、或6个氨基酸差异。甚至更优选地，如实施方案1中所定义的CDR1的氨基酸序列与SEQ ID NO:153相比具有1或2个氨基酸差异。
优选地，如实施方案1中所定义的CDR2的氨基酸序列与SEQ ID NO:209相比具有1、或2、或3、或4个氨基酸差异。更优选地，如实施方案1中所定义的CDR2的氨基酸序列与SEQID NO:209相比具有1个氨基酸差异。甚至更优选地，如实施方案1中所定义的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:209。
优选地，如实施方案1中所定义的CDR3的氨基酸序列与SEQ ID NO:223相比具有1、或2、或3、或4、或5个氨基酸差异。更优选地，如实施方案1中所定义的CDR3的氨基酸序列与SEQ ID NO:223相比具有1、或2、或3、或4个氨基酸差异。甚至更优选地，如实施方案1中所定义的CDR3的氨基酸序列与SEQ ID NO:223相比具有1或2个氨基酸差异。优选地，如实施方案1中所定义的所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1的氨基酸序列如实施方案1中所定义，并且与SEQ ID NO:153相比具有1、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8个氨基酸差异，优选地与SEQ ID NO:153相比具有1、或2、或3、或4、或5、或6个氨基酸差异，并且甚至更优选地与SEQ ID NO:153相比具有1或2个氨基酸差异；
(ii)CDR2的氨基酸序列如实施方案1中所定义，并且与SEQ ID NO:209相比具有1、或2、或3、或4个氨基酸差异，更优选地与SEQ ID NO:209相比具有1个氨基酸差异，
并且甚至更优选地是SEQ ID NO:209；
(iii)CDR3的氨基酸序列如实施方案1中所定义，并且与SEQ ID NO:223相比具有1、或2、或3、或4、或5个氨基酸差异，更优选地与SEQ ID NO:223相比具有1、或2、或3、或4个氨基酸差异，并且甚至更优选地与SEQ ID NO:223相比具有1或2个氨基酸差异。
实施方案2.根据实施方案1所述的多肽，其中所述第一ISVD特异性结合人T细胞受体
α(TCR-α)的恒定结构域(SEQ ID NO:291)和/或人T细胞受体β(TCR-β)的恒定结构域(SEQ ID NO:292)，或其多态变体或同种型。
实施方案3.根据实施方案1或2所述的多肽，其中所述非人灵长类动物TCR是猕猴或恒河猴TCR。
实施方案4.根据实施方案3所述的多肽，其中所述猕猴或恒河猴TCR包含SEQ IDNO:293的TCR-α的恒定结构域和/或SEQ ID NO:294的TCR-β的恒定结构域，或其多态变体或同种型。
实施方案5.根据实施方案1至4中任一项所述的多肽，其中与SEQ ID NO:2的ISVD相比，所述第一ISVD以相同或更低的解离速率常数(koff)结合人TCR，优选如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，优选在ProteOn XPR36仪器上优选在25℃进行所述测量。
优选地，与SEQ ID NO:2的ISVD相比，如实施方案5中所定义的多肽的第一ISVD以相同或更低的KD结合人TCR，优选如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，优选在ProteOnXPR36仪器上优选在25℃进行所述测量。
实施方案6.根据实施方案1至5中任一项所述的多肽，其中与SEQ ID NO:2的ISVD相比，所述第一ISVD以相同或更低的koff结合非人灵长类动物TCR，优选如通过SPR测量的，优选在ProteOn XPR36仪器上优选在25℃进行所述测量。
优选地，与SEQ ID NO:2的ISVD相比，如实施方案6中所定义的多肽的第一ISVD以相同或更低的KD结合非人灵长类动物TCR，优选如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，优选在ProteOn XPR36仪器上优选在25℃进行所述测量。
实施方案7.根据实施方案5或6所述的多肽，其中所述第一ISVD关于结合人TCR具有至多约10-3s-1的koff，优选如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，优选在ProteOn XPR36仪器上优选在25℃进行所述测量。
实施方案8.根据实施方案5至7中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD关于结合非人灵长类动物TCR具有选自至多约10-2s-1的解离速率常数(koff)，优选如通过SPR测量的，优选在ProteOn XPR36仪器上优选在25℃进行所述测量。
实施方案9.根据实施方案7或8所述的多肽，其中所述第一ISVD具有关于结合人TCR的koff的5倍范围内的关于结合非人灵长类动物TCR的koff，优选如通过SPR测量的，优选在ProteOn XPR36仪器上优选在25℃进行所述测量。
实施方案10.根据实施方案1至9中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR1选自SEQ ID NO:154至169的氨基酸序列的组。
实施方案11.根据实施方案1至10中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR2选自SEQ ID NO:210至215的氨基酸序列的组。
实施方案12.根据实施方案1至11中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR3选自SEQ ID NO:224至230的氨基酸序列的组。
实施方案13.根据实施方案1至10中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
(i)CDR1选自SEQ ID NO:154至169的氨基酸序列的组；
(ii)CDR2由氨基酸序列HISIGDQTD(SEQ ID NO:209)组成；以及
(iii)CDR3由氨基酸序列FSRIYPYDY(SEQ ID NO:223)组成。
实施方案14.根据实施方案1至9或11中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
(i)CDR1由氨基酸序列GDVHKINFLG(SEQ ID NO:153)组成；
(ii)CDR2选自SEQ ID NO:210至215的氨基酸序列的组；并且
(iii)CDR3由氨基酸序列FSRIYPYDY(SEQ ID NO:223)组成。
实施方案15.根据实施方案1至9或12中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
(i)CDR1由氨基酸序列GDVHKINFLG(SEQ ID NO:153)组成；
(ii)CDR2由氨基酸序列HISIGDQTD(SEQ ID NO:209)组成；以及
(iii)CDR3选自SEQ ID NO:224至230的氨基酸序列的组。
实施方案16.根据实施方案1至9中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
(i)CDR1的氨基酸序列是Xaa Xaa Val His Xaa Xaa Asn Phe Xaa Xaa(SEQ IDNO:298)，其中
位置1处的Xaa是Gly、Trp或Tyr，
位置2处的Xaa是Asp、Glu、Tyr、Ser或Ala，
位置5处的Xaa是Lys或Gln，
位置6处的Xaa是Ile或Leu，
位置9处的Xaa是Leu或Tyr，
位置10处的Xaa是Gly或Thr，
(ii)CDR2的氨基酸序列是His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp(SEQ ID NO:209)，并且
(iii)CDR3的氨基酸序列是Xaa Ser Xaa Ile Xaa Pro Tyr Asp Xaa(SEQ ID NO:299)，其中
位置1处的Xaa是Phe、Leu或Met，
位置3处的Xaa是Arg或Lys，
位置5处的Xaa是Tyr或Trp，并且
位置9处的Xaa是Tyr或Trp。
优选地，如实施方案16中所定义的CDR1的氨基酸序列与SEQ ID NO:153相比具有1、或2、或3、或4、或5、或6个氨基酸差异。更优选地，如实施方案16中所定义的CDR1的氨基酸序列与SEQ ID NO:153相比具有1、或2、或3、或4个氨基酸差异。甚至更优选地，如实施方案16中所定义的CDR1的氨基酸序列与SEQ ID NO:153相比具有1或2个氨基酸差异。
优选地，如实施方案16中所定义的CDR3的氨基酸序列与SEQ ID NO:223相比具有1、或2、或3、或4个氨基酸差异。更优选地，如实施方案16中所定义的CDR3的氨基酸序列与SEQ ID NO:223相比具有1、或2、或3个氨基酸差异。甚至更优选地，如实施方案16中所定义的CDR3的氨基酸序列与SEQ ID NO:223相比具有1或2个氨基酸差异。
优选地，如实施方案16中所定义的所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1的氨基酸序列如实施方案16中所定义，并且与SEQ ID NO:153相比具有1、或2、或3、或4、或5个、或6个氨基酸差异，优选地与SEQ ID NO:153相比具有1、或2、或3、或4个氨基酸差异，并且甚至更优选地与SEQ ID NO:153相比具有1或2个氨基酸差异；
(ii)CDR2的氨基酸序列是His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp(SEQ ID NO:209)，并且
(iii)CDR3的氨基酸序列如实施方案16中所定义，并且与SEQ ID NO:223相比具有1、或2、或3、或4个氨基酸差异，更优选地与SEQ ID NO:223相比具有1、或2、或3个氨基酸差异，并且甚至更优选地与SEQ ID NO:223相比具有1或2个氨基酸差异。
实施方案17.根据实施方案16所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR1选自SEQ ID NO:154至163的氨基酸序列的组。
实施方案18.根据实施方案16或17所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR1选自SEQ IDNO:154至158的氨基酸序列的组。
实施方案19.根据实施方案16至18中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
CDR1选自SEQ ID NO:154和155的氨基酸序列的组。
实施方案20.根据实施方案16至19中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
CDR3选自SEQ ID NO:224至228的氨基酸序列的组。
实施方案21.根据实施方案16至20中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
CDR3选自SEQ ID NO:224至226的氨基酸序列的组。
实施方案22.根据实施方案16至21中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
CDR3选自SEQ ID NO:224和225的氨基酸序列的组。
实施方案23.根据实施方案16所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR1选自SEQ ID NO:171至207的氨基酸序列的组。
实施方案24.根据实施方案16或23所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR1选自SEQ IDNO:154、161、171至175、和177至191的氨基酸序列的组。
实施方案25.根据实施方案16、23或24中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR1选自SEQ ID NO:171至175的氨基酸序列的组。
实施方案26.根据实施方案16、或23至25中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR1由GYVHKINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:171)组成。
实施方案27.根据实施方案16、或23至26中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR3选自SEQ ID NO:235至247的氨基酸序列的组。
实施方案28.根据实施方案16、或23至27中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR3选自SEQ ID NO:226、227、和235至243的氨基酸序列的组。
实施方案29.根据实施方案16、或23至28中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR3选自SEQ ID NO:235和236的氨基酸序列的组。
实施方案30.根据实施方案16、或23至28中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR3由LSRIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:235)组成。
实施方案31.根据实施方案1至9、16、或23至30中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
a)CDR1由GYVHKINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:171)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及CDR3由LSRIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:235)组成；或
b)CDR1由WDVHKINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:172)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及CDR3由LSKIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:236)组成；或
c)CDR1由YDVHKINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:173)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及CDR3由LSKIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:236)组成；或
d)CDR1由WDVHQINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:174)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及CDR3由LSRIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:235)组成；或
e)CDR1由WDVHKINFYT的氨基酸序列(SEQ ID NO:175)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及CDR3由LSRIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:235)组成；或
f)CDR1由WDVHKINFYT的氨基酸序列(SEQ ID NO:175)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及CDR3由LSKIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:236)组成。
实施方案32.根据实施方案1至9、16、或23至31中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR1由GYVHKINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:171)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，并且CDR3由LSRIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:235)组成。
实施方案33.根据实施方案1至32中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD的氨基酸序列与SEQ ID NO:1至152、261或262的氨基酸序列中的至少一个具有至少80％序列同一性，其中出于确定序列同一性程度的目的，形成所述CDR序列的氨基酸残基被忽略。
实施方案34.根据实施方案1至33中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD的氨基酸序列与SEQ ID NO:1至152、261或262的氨基酸序列中的至少一个具有至少90％、优选至少95％、更优选至少99％序列同一性，其中出于确定序列同一性程度的目的，形成所述CDR序列的氨基酸残基被忽略。
实施方案35.根据实施方案1至34中任一项所述的多肽，所述多肽包含第一ISVD，其中：
(i)FR1选自SEQ ID NO:248至250的氨基酸序列的组，
(ii)FR2是SEQ ID NO:251的氨基酸序列，
(iii)FR3选自SEQ ID NO:252至259的氨基酸序列的组，并且
(iv)FR4是SEQ ID NO:260的氨基酸序列。
优选地，如实施方案35中定义的多肽包含第一ISVD，其中：
(i)FR1是SEQ ID NO:249的氨基酸序列，
(ii)FR2是SEQ ID NO:251的氨基酸序列，
(iii)FR3选自SEQ ID NO:253和256的氨基酸序列的组，并且
(iv)FR4是SEQ ID NO:260的氨基酸序列。
实施方案36.根据实施方案1至35中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD选自SEQ ID NO:1至20、22至27、35至41、46至147、150至152、和261至262的氨基酸序列的组。
实施方案37.根据实施方案1至36中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD选自SEQ ID NO:1至20、22至27、和35至41的氨基酸序列的组。
实施方案38.根据实施方案1至36中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD选自SEQ ID NO:46至147、150至152、261和262的氨基酸序列的组。
实施方案39.根据实施方案1至36、或38中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD选自SEQ ID NO:46至50、147和150至152、261和262的氨基酸序列的组。
实施方案40.根据实施方案1至36、38或39中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD选自SEQ ID NO:46、150至152、261和262的氨基酸序列的组。
实施方案41.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中所述多肽将所述T细胞定向至所述靶细胞。
实施方案42.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中所述多肽诱导T细胞激活。
实施方案43.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中所述T细胞激活不依赖于MHC识别。
实施方案44.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中所述T细胞激活依赖于将与靶细胞上的所述第一抗原结合的所述多肽呈递给T细胞。
实施方案45.根据实施方案42至44的多肽，其中所述T细胞激活引起所述T细胞的一种或多种细胞应答，其中所述细胞应答选自增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性、激活标记物的表达和重定向的靶细胞裂解。
实施方案46.根据实施方案42至45所述的多肽，其中所述T细胞激活引起所述靶细胞裂解超过约10％，如20％、30％或40％，或甚至超过50％，如超过60％。
实施方案47.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中所述多肽关于结合所述人TCR具有选自至少约103M-1s-1、至少约104M-1s-1、和至少约105M-1s-1的结合速率常数(kon)，优选如通过SPR测量的，优选在ProteOn XPR36仪器上优选在25℃进行所述测量。
实施方案48.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中所述多肽关于结合所述非人灵长类动物TCR具有选自至少约103M-1s-1、至少约104M-1s-1、和至少约105M-1s-1的kon，优选如通过SPR测量的，优选在ProteOn XPR36仪器上优选在25℃进行所述测量。
实施方案49.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中所述多肽关于结合所述人TCR具有选自至多约10-2s-1、至多约10-3s-1、和至多约10-4s-1的koff，优选如通过SPR测量的，优选在ProteOn XPR36仪器上优选在25℃进行所述测量。
实施方案50.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中所述多肽关于结合所述非人灵长类动物TCR具有选自至多约10-1s-1、至多约10-2s-1、至多约10-3s-1、和至多约10- 4s-1的koff，优选如通过SPR测量的，优选在ProteOn XPR36仪器上优选在25℃进行所述测量。
实施方案51.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中所述多肽关于结合所述人TCR具有选自至多约10-6M、至多约10-7M、至多约10-8M、至多约10-8M、和至多约10-9M的亲和力(KD)，优选如通过SPR测量的，优选在ProteOn XPR36仪器上优选在25℃进行所述测量。
实施方案52.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中所述多肽关于结合所述非人灵长类动物TCR具有选自至多约10-6M、至多约10-7M和至多约10-8M的KD，优选如通过SPR测量的，优选在ProteOn XPR36仪器上优选在25℃进行所述测量。
优选地，根据前述实施方案中任一项所述的多肽(i)关于结合所述人TCR具有选自至多约10-6M、至多约10-7M、至多约10-8M、至多约10-8M、和至多约10-9M的亲和力(KD)，并且(ii)关于结合非人灵长类动物TCR具有选自至多约10-6M、至多约10-7M、和至多约10-8M的KD，优选如通过SPR测量的，优选在ProteOn XPR36仪器上优选在25℃进行所述测量。
实施方案53.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中，与其中所述第一ISVD被
SEQ ID NO:1的ISVD替代的相同多肽相比，所述多肽以更低的KD结合所述人TCR，所述KD优选通过SPR测定，优选在ProteOn XPR36仪器上优选在25℃进行所述测定。
实施方案54.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中，与其中所述第一ISVD被
SEQ ID NO:1的ISVD替代的相同多肽相比，所述多肽以更低的KD结合所述非人灵长类动物TCR，所述KD优选通过SPR测定，优选在ProteOn XPR36仪器上优选在25℃进行所述测定。
优选地，与其中所述第一ISVD被SEQ ID NO:1的ISVD替代的相同多肽相比，根据前述实施方案中任一项所述的多肽显示改善的交叉反应性，即关于结合人和非人灵长类动物TCR更低的KD，所述KD优选通过SPR测定，优选在ProteOn XPR36仪器上优选在25℃进行所述测定。
例如，基于KD，与其中所述第一ISVD被SEQ ID NO:1的ISVD替代的相同多肽在人-食蟹猴交叉反应性方面的差异相比，根据前述实施方案中任一项所述的多肽显示在人-食蟹猴交叉反应性方面更低的差异。优选地，KD通过SPR测定，优选在ProteOn XPR36仪器上优选在25℃进行。
实施方案55.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中所述多肽导致人T细胞以选自至多约10-9M和至多约10-10M的EC50值裂解所述靶细胞，所述EC50值是如在T细胞介导的杀伤测定中测定的。
实施方案56.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中所述多肽导致非人灵长类动物T细胞以选自至多约10-9M和至多约10-10M的EC50值裂解所述靶细胞，所述EC50值是如在T细胞介导的杀伤测定中测定的。
实施方案57.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中所述多肽导致人T细胞以比其中所述第一ISVD被SEQ ID NO:1的ISVD替代的相同多肽更低的EC50值裂解所述靶细胞，所述EC50值是如在T细胞介导的杀伤测定中测定的。
实施方案58.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中所述多肽导致非人灵长类动物T细胞以比其中所述第一ISVD被SEQ ID NO:1的ISVD替代的相同多肽更低的EC50值裂解所述靶细胞，所述EC50值是如在T细胞介导的杀伤测定中测定的。
实施方案59.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD位于所述第二ISVD的N末端，其中所述第一ISVD任选地位于所述多肽的N末端。
实施方案60.根据实施方案1至58中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD位于所述第二ISVD的C末端。
实施方案61.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中靶细胞上的所述第一抗原是肿瘤抗原，优选肿瘤相关抗原(TAA)。
实施方案62.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，所述多肽还包含特异性结合靶细胞上的第二抗原的第三ISVD。
实施方案63.根据实施方案62所述的多肽，其中所述第二抗原不同于所述第一抗原。实施方案64.根据实施方案62所述的多肽，其中所述第二抗原与所述第一抗原相同。实施方案65.根据实施方案64所述的多肽，其中所述第二ISVD和所述第三ISVD结合所述抗原的相同表位。
实施方案66.根据实施方案64所述的多肽，其中所述第二ISVD和所述第三ISVD结合所述抗原的不同表位。
实施方案67.根据实施方案66所述的多肽，其中所述第三ISVD和所述第二ISVD能够同时结合同一抗原分子上的两个不同表位。
实施方案68.根据实施方案61至67中任一项所述的多肽，其中靶细胞上的所述第二抗原是肿瘤抗原，优选肿瘤相关抗原(TAA)。
实施方案69.根据实施方案62至68中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原和所述第二抗原存在于相同的靶细胞上。
实施方案70.根据实施方案62至69中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原和所述第二抗原存在于不同的靶细胞上。
实施方案71.根据实施方案61至70中任一项所述的多肽，其中所述TAA独立地选自黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、MART-1、癌胚抗原(CEA)、gp100、MAGE-1、HER-2、路易斯Y抗原、CD123、CD44、CLL-1、CD96、CD47、CD32、CXCR4、Tim-3、CD25、TAG-72、Ep-CAM、PSMA、PSA、GD2、GD3、CD4、CD5、CD19、CD20、CD22、CD36、CD45、CD52、CD147、生长因子受体(包括ErbB3和ErbB4)、细胞因子受体(包括白介素-2受体γ链(CD132抗原)、白介素-10受体α链(IL-10R-A)、白介素-10受体β链(IL-10R-B)、白介素-12受体β-1链(IL-12R-βl)、白介素-12受体β-2链(IL-12受体β-2)、白介素-13受体α-1链(IL-13-α-l)(CD213al抗原)、白介素-13受体α-2链(白介素-13结合蛋白)、白介素-17受体(IL-17受体)、白介素-17B受体(IL-17B受体)、白介素21受体前体(IL-21R)、白介素-1受体I型(IL-lR-1)(CD121a)、白介素-1受体II型(IL-1R-β)(CDwl21b)、白介素-1受体拮抗蛋白(IL-lra)、白介素-2受体α链(CD25抗原)、白介素-2受体β链(CD122抗原)、白介素-3受体α链(IL-3R-α)(CD123抗原))、CD30、IL23R、IGF-1R、IL5R、IgE、CD248(内皮唾液酸蛋白)、CD44v6、gpA33、Ron、Trop2、PSCA、密封蛋白6、密封蛋白18.2、CLEC12A、CD38、ephA2、c-Met、CD56、MUC16、EGFRvlll、AGS-16、CD27L、连接蛋白-4、SLITRK6、间皮素、叶酸受体、组织因子、axl、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、CA9、Cripto、CD138、CD37、MUCl、CD70、胃泌素释放肽受体、PAP、CEACAM5、CEACAM6、CXCR7、N-钙粘素、FXYD2γa、CD21、CD133、Na/K-ATPase、mlgM(膜结合IgM)、mlgA(膜结合IgA)、Mer、Tyro2、CD120、CD95、CA 195、DR5、DR6、DcR3和CAIX、以及相关多态变体和同种型。
实施方案72.根据实施方案61所述的多肽，其中所述TAA是CD123或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3。
实施方案73.根据实施方案64至70中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原和所述第二抗原是CD123或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3。
实施方案74.根据实施方案62至71或73中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD位于所述第二ISVD和所述第三ISVD的N末端，其中所述第一ISVD任选地位于所述多肽的N末端。
实施方案75.根据实施方案62至71或73中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD位于所述第二ISVD和所述第三ISVD的C末端。
实施方案76.根据实施方案62至71或73中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD位于所述第二ISVD与所述第三ISVD之间。
实施方案77.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含任选地经由一个或多个肽接头连接的一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元，其中与没有所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元的相应多肽相比，所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为所述多肽提供增加的半衰期。
实施方案78.根据实施方案77所述的多肽，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可与血清蛋白结合的结合单元、Fc部分和可与血清蛋白结合的小蛋白质或肽。
实施方案79.根据实施方案77或78所述的多肽，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自可与血清白蛋白(如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(如IgG)结合的结合单元。
实施方案80.根据实施方案77至79中任一项所述的多肽，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是可以结合人血清白蛋白的结合单元。
实施方案81.根据实施方案77至80中任一项所述的多肽，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是可以结合人血清白蛋白的ISVD。
实施方案82.根据实施方案81所述的多肽，其中所述可以结合人血清白蛋白的ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR1的氨基酸序列是GFTFRSFGMS(SEQ ID NO:357)或GFTFSSFGMS(SEQ ID
NO:358)，CDR2的氨基酸序列是SISGSGSDTL(SEQ ID NO:359)，并且CDR3的氨基酸序列是GGSLSR(SEQ ID NO:360)。
实施方案83.根据实施方案82所述的多肽，其中所述结合血清白蛋白的ISVD选自SEQ
ID NO:361至378。
实施方案84.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中所述ISVD彼此直接连接或经由接头连接。
实施方案85.根据实施方案1至84中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD和/或所述第二ISVD和/或可能的所述第三ISVD和/或可能的所述结合(人)血清白蛋白的ISVD经由接头连接。
实施方案86.根据实施方案85所述的多肽，其中所述接头选自3A、5GS、7GS、8GS、
9GS、10GS、15GS、18GS、20GS、25GS、30GS、35GS、40GS、G1铰链、9GS-G1铰链、美洲驼上长铰链区、和G3铰链(SEQ ID NO:322至338)的接头。
实施方案87.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中所述ISVD是VHH、人源化VHH或驼源化VH。
实施方案88.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD选自SEQID
NO:46至50、147、150至152、261和262，并且其中所述第二ISVD是SEQ ID NO:263的氨基酸序列。
实施方案89.根据实施方案88所述的多肽，其中所述第一ISVD选自SEQ ID NO:46、150至152、261和262，并且其中所述第二ISVD由SEQ ID NO:263的氨基酸序列组成。
实施方案90.根据实施方案89所述的多肽，所述多肽选自SEQ ID NO:275和276的氨基酸序列的组。
实施方案91.根据实施方案88至90所述的多肽，所述多肽还包含由SEQ ID NO:265的氨基酸序列组成的第三ISVD。
实施方案92.根据实施方案91所述的多肽，所述多肽选自SEQ ID NO:283、284、288、
289和290的氨基酸序列的组。
实施方案93.根据前述实施方案中任一项所述的多肽，所述多肽还包含C末端延伸(X)n，其中n是1至5，如1、2、3、4或5，并且其中X是天然存在的氨基酸，优选无半胱氨酸。实施方案94.一种编码根据实施方案1至93中任一项所述的多肽的核酸。
实施方案95.一种包含根据实施方案94所述的核酸的载体。
实施方案96.一种用根据实施方案94所述的核酸或根据实施方案95所述的载体转化或转染的宿主细胞。
实施方案97.一种产生根据实施方案1至93中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括在允许表达根据实施方案1至93中任一项所述的多肽的条件下培养根据实施方案96所述的宿主细胞，并且回收从培养物产生的多肽。
实施方案98.一种组合物，所述组合物包含根据实施方案1至93中任一项所述的多肽或根据实施方案97所述的方法产生的多肽。
实施方案99.根据实施方案98所述的组合物，所述组合物是药物组合物。
实施方案100.根据实施方案99所述的药物组合物，所述药物组合物还可以包含至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，以及任选地一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。
实施方案101.根据实施方案1至93中任一项所述的多肽或根据实施方案98至100中任一项所述的组合物，用作药物。
实施方案102.根据实施方案1至93中任一项所述的多肽或根据实施方案98至100中任一项所述的组合物，用于治疗有需要的受试者。
实施方案103.根据实施方案1至93中任一项所述的多肽或根据实施方案98至100中任一项所述的组合物，用于预防、治疗或改善选自增殖性疾病、炎性疾病、感染性疾病和自身免疫病的疾病。
实施方案104.一种用于将预防性或治疗性多肽递送至体内特定位置、组织或细胞类型的方法，所述方法包括向受试者施用根据实施方案1至93中任一项所述的多肽或根据任何实施方案98至100中任一项所述的组合物的步骤。
实施方案105.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用根据实施
方案1至93中任一项所述的多肽或根据实施方案98至100中任一项所述的组合物的步骤。实施方案106.一种治疗或改善选自增殖性疾病、炎性疾病、感染性疾病和自身免疫病的疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据实施方案1至93中任一项所述的多肽或根据实施方案98至100中任一项所述的组合物的步骤。
实施方案107.根据实施方案103所述的用于所述用途的多肽或组合物或根据实施方案106所述的方法，其中所述增殖性疾病是癌症。
实施方案108.根据实施方案107所述的用于所述用途的多肽或组合物或根据实施方案107所述的方法，其中所述癌症选自：癌、神经胶质瘤、间皮瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病(包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性B成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病和毛细胞白血病)、骨髓增生异常综合征、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、系统性肥大细胞增多症、腺癌：乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤、多发性骨髓瘤(包括意义未明的单克隆丙种球蛋白病、无症状性和有症状性骨髓瘤)、前列腺癌和伯基特淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝胆管癌、胆囊癌、小肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、尿道癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、胰腺内分泌癌、类癌、骨癌、皮肤癌、视网膜母细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、卡波西肉瘤、多中心型卡斯尔曼病或艾滋病相关原发性渗出性淋巴瘤、神经外胚瘤、横纹肌肉瘤；以及上述任何癌症的任何转移。
实施方案109.根据实施方案103所述的用于所述用途的多肽或组合物或根据实施方案106所述的方法，其中所述炎性疾病选自自身免疫性狼疮(SLE)、变态反应、哮喘和类风湿性关节炎。
实施方案110.根据实施方案107至109中任一项所述的用于所述用途的多肽或组合物，或根据实施方案107至109中任一项所述的方法，其中所述治疗是组合治疗。
实施方案111.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据实施方案1至93中任一项所述的多肽、根据实施方案94所述的核酸、根据实施方案95所述的载体、或根据实施方案96所述的宿主细胞。
4附图说明
图1：ISVD T0170056G05的序列，指示出框架区(FR)和互补决定区(CDR)。序列编号根据Kabat，CDR根据AbM定义确定(参见Kontermann和Dübel(编)的Antibody Engineering,第2卷,柏林海德堡施普林格出版社,2010)。
图2：第二波ISVD变体与食蟹猴原代T细胞的剂量依赖性结合。MFI(平均荧光强度)值相对于ISVD的浓度绘图。
图3：T017000624(菱形)、T0170056G05(点)和cAbLys3(正方形)与人和食蟹猴TCR/CD3转染细胞的剂量依赖性结合。MFI(平均荧光强度)值相对于ISVD的浓度绘图。
图4：T017000624(菱形)、T0170056G05(点)和cAbLys3(正方形)与人和食蟹猴原代T细胞的剂量依赖性结合。MFI(平均荧光强度)值相对于ISVD的浓度绘图。
图5：使用10:1E:T比率，在基于流式细胞术的MOLM-13和KG-1a杀伤测定中，按CD123/TCR ISVD形式关于人和食蟹猴T细胞介导的杀伤的剂量反应曲线。细胞死亡％(TOPRO阳性细胞％)相对于ISVD形式的浓度绘图。
图6：使用15:1的E:T比率，在基于阻抗(xCELLigence)的T细胞介导的CHO Flp-InhuCD123细胞杀伤测定中，按CD123/TCR ISVD形式关于人和食蟹猴T细胞介导的杀伤的剂量反应曲线。细胞指数(CI)相对于ISVD形式的浓度绘图。
图7：通过流式细胞术得出的按三价CD123/TCR双特异性ISVD形式的剂量依赖性T细胞介导的靶细胞系杀伤。MOLM-13和KG-1a的E:T比率为10:1。细胞死亡％(TOPRO阳性细胞％)相对于ISVD形式的浓度绘图。
图8：在基于阻抗的测定(xCELLigence)中，使用15比1的效应物与靶标比率，剂量依赖性人和食蟹猴T细胞介导的CHO Flp-In huCD123靶细胞或亲本CHO Flp-In细胞系杀伤。细胞指数(CI)相对于ISVD形式的浓度绘图。
图9：T017000679(空心圆圈，虚线)、T017000681(空心三角形，虚线)、T017000680(实心圆圈，实线)对人原代T细胞和HSC-F食蟹猴T细胞系的剂量依赖性竞争。MFI(中值或平均荧光强度)值相对于ISVD的浓度绘图。
图10：随着时间的推移，所处理食蟹猴的外周血的PBMC部分中的CD123hi细胞计数。对于以下不同的处理组，在给定的测试日每μL PBMC的CD123hi细胞的绝对数量表示为占预处理日(给药前TD-7、-6、-4和TD1)期间每μL PBMC的CD123hi细胞平均绝对数量的百分比±SEM：媒介物(空心菱形，n＝4)，参考DART分子(实心菱形，n＝2)，TCR/CD123 ISVD形式T017000139(黑色三角形，n＝4)无关/TCR ISVD形式T017000674(空心正方形，n＝4)，TCR/无关ISVD形式T017000672(空心圆圈，n＝4)，CD123/TCR ISVD形式T017000675(黑色正方形，n＝4)和TCR/CD123 ISVD形式T017000670(黑色圆圈，n＝6)。竖直线反映了4天连续输注处理期的开始。水平线反映了CD123hi细胞的基线水平(CD123hi细胞在给药前TD-7、-6、-4和TD1的平均数量)。
图11：随着时间的推移，所处理食蟹猴的外周血的PBMC部分中的CD123int细胞计数。对于以下不同的处理组，在给定的测试日每μL PBMC的CD123int细胞的绝对数量表示为占预处理日(给药前TD-7、-6、-4和TD1)期间每μL PBMC的CD123int细胞平均绝对数量的百分比±SEM：媒介物(空心菱形，n＝4)，参考DART分子(实心菱形，n＝2)，无关/TCR ISVD形式T017000674(空心正方形，n＝4)，TCR/无关ISVD形式T017000672(空心圆圈，n＝4)，CD123/TCR ISVD形式T017000675(黑色正方形，n＝4)和TCR/CD123ISVD形式T017000139(黑色三角形，n＝4)TCR/CD123 ISVD形式T017000670(黑色圆圈，n＝6)。竖直线反映了4天连续输注处理期的开始。水平线反映了CD123hi细胞的基线水平(CD123hi细胞在给药前TD-7、-6、-4和TD1的平均数量)。
图12：随着时间的推移，所处理食蟹猴的外周血的PBMC部分中的辅助T细胞(Th；CD4+CD3+细胞)计数。对于以下不同的处理组，在给定的测试日每μL PBMC的Th细胞的绝对数量表示为相对于预处理日(给药前TD-7、-6、-4和TD1)期间每μL PBMC的Th细胞平均绝对数量±SEM：媒介物(空心菱形，n＝4)，参考DART分子(实心菱形，n＝2)，TCR/CD123 ISVD形式T017000139(黑色三角形，n＝4)无关/TCR ISVD形式T017000674(空心正方形，n＝4)，TCR/无关ISVD形式T017000672(空心圆圈，n＝4)，CD123/TCR ISVD形式T017000675(黑色正方形，n＝4)和TCR/CD123ISVD形式T017000670(黑色圆圈，n＝6)。竖直线反映了4天连续输注处理期的开始。在100处的水平线反映了Th细胞的基线水平(Th细胞在给药前TD-7、-6、-4和TD1的平均数量)。
图13：随着时间的推移，所处理食蟹猴的外周血的PBMC部分中的细胞毒性T细胞(Tc；CD8+CD3+细胞)计数。对于以下不同的处理组，在给定的测试日每μL PBMC的Tc细胞的绝对数量表示为相对于预处理日(给药前TD-7、-6、-4和TD1)期间每μL PBMC的Tc细胞平均绝对数量±SEM：媒介物(空心菱形，n＝4)，参考DART分子(实心菱形，n＝2)，TCR/CD123 ISVD形式T017000139(黑色三角形，n＝4)无关/TCR ISVD形式T017000674(空心正方形，n＝4)，TCR/无关ISVD形式T017000672(空心圆圈，n＝4)，CD123/TCR ISVD形式T017000675(黑色正方形，n＝4)和TCR/CD123 ISVD形式T017000670(黑色圆圈，n＝6)。竖直线反映了4天连续输注处理期的开始。在100处的水平线反映了Tc细胞的基线水平(Tc细胞在给药前TD-7、-6、-4和TD1的平均数量)。
图14：随着时间的推移，所处理食蟹猴的外周血的PBMC部分中PD-1+Th(CD4+CD3+)细胞的百分比。对于以下不同的处理组，在给定的测试日PD-1+细胞的平均百分比显示为±SEM：媒介物(空心菱形，n＝4)，参考DART分子(实心菱形，n＝2)，TCR/CD123ISVD形式T017000139(黑色三角形，n＝4)无关/TCR ISVD形式T017000674(空心正方形，n＝4)，TCR/无关ISVD形式T017000672(空心圆圈，n＝4)，CD123/TCR ISVD形式T017000675(黑色正方形，n＝4)和TCR/CD123 ISVD形式T017000670(黑色圆圈，n＝6)。竖直线反映了4天连续输注处理期的开始。
图15：随着时间的推移，所处理食蟹猴的外周血的PBMC部分中PD-1+Tc(CD8+CD3+)细胞的百分比。对于以下不同的处理组，在给定的测试日PD-1+细胞的平均百分比显示为±SEM：媒介物(空心菱形，n＝4)，参考DART分子(实心菱形，n＝2)，TCR/CD123ISVD形式T017000139(黑色三角形，n＝4)无关/TCR ISVD形式T017000674(空心正方形，n＝4)，TCR/无关ISVD形式T017000672(空心圆圈，n＝4)，CD123/TCR ISVD形式T017000675(黑色正方形，n＝4)和TCR/CD123 ISVD形式T017000670(黑色圆圈，n＝6)。竖直线反映了4天连续输注处理期的开始。
图16：在基于Incucyte的人TDC HepG2-Nuclight green测定中，使用15:1的效应物与靶标比率，在接种后72h分析的三特异性GPC3 ISVD T细胞接合器的剂量依赖性杀伤作用。对照(左)是：无化合物(空心正方形)和100％杀伤参考(空心圆圈)。
图17：在基于Incucyte的人TDC HepG2-Nuclight green测定中，使用15:1的效应物与靶标比率，在接种后60h分析的三特异性GPC3 ISVD T细胞接合器的剂量依赖性杀伤作用。对照(左)是：无化合物(空心正方形)和100％杀伤参考(空心圆圈)。
图18：在基于Incucyte的人TDC HepG2-Nuclight green测定(图18A)和基于xCELLigence的人TDC Huh7测定(图18B)中，使用15:1的效应物与靶标比率，在接种后60h分析的三特异性GPC3 ISVD T细胞接合器的剂量依赖性杀伤作用。对照(左)是：无化合物(空心正方形)和100％杀伤参考(空心圆圈)。
图19：在基于Incucyte的人TDC HepG2-Nuclight green测定(图19A)和基于xCELLigence的人TDC Huh7测定(图19B)中，使用15:1的效应物与靶标比率，在接种后60h分析的三特异性GPC3 ISVD T细胞接合器的剂量依赖性杀伤作用。对照(左)是：(空心正方形)无化合物和(空心圆圈)100％杀伤参考。
图20：在基于Incucyte的人TDC HepG2-Nuclight green测定(图20A)和基于xCELLigence的人TDC Huh7测定(图20B)中，使用15:1的效应物与靶标比率，在接种后60h分析的三特异性GPC3 ISVD T细胞接合器的剂量依赖性杀伤作用。对照(左)是：(空心正方形)无化合物和(空心圆圈)100％杀伤参考。
图21：在基于xCELLigence的人TDC测定中，使用15:1的效应物与靶标比率，三特异性GPC3 T细胞接合器对表达降低的GPC3表达水平的以下不同肿瘤细胞系的剂量依赖性杀伤作用：在60h分析的HepG2(图21A)、在75h分析的NCI-H661(图21B)、在60h分析的Huh-7(图21C)、在65h分析的MKN-45(图21D)、在65h分析的BxPC-3(图21E)、在60h分析的NCI-H292(图21F)。对照(左)是：(空心正方形)无化合物(仅效应物和T细胞)。
图22：在基于xCELLigence的人TDC测定中，使用15:1的效应物与靶标比率并在60h分析的基于五种所选择三特异性GPC3 ISVD的T细胞接合器对两种肿瘤细胞系NCI-H661(图22A)和BxPC-3(图22B)的剂量依赖性杀伤作用。对照(左)是：无化合物(空心正方形，仅效应物和T细胞)和30nM的T017000698(空心菱形)。
图23：功效模型的研究设计。将Huh-7肿瘤细胞皮下注射到NOG小鼠中。肿瘤生长直至达到大约150mm3的平均肿瘤体积。此时，将体外扩增的T细胞腹膜内注射到每只小鼠体内(D0)。静脉内注射A022600424的处理在D0在T细胞注射后3h开始，并在D3、D6、D9和D12(q3d)继续。测试了A022600424的四个剂量水平(0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.7mg/kg和2mg/kg)。在D0、D3、D6、D9和D12(q3d)以2mg/kg的剂量将对照T017000698注射到对照组中。在施用测试化合物之前D6和D12进行存活血液取样。在D15处死所有小鼠，收集血液和肿瘤样品。
图24：功效模型的结果。测试了A022600424的四个剂量水平(0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.7mg/kg和2mg/kg)。将对照T017000698以2mg/kg注射到对照组中。
图25：根据本发明的多特异性ISVD构建体的示意性表示，从N末端到C末端显示经由接头连接的单价构建块/ISVD TCRαβ、CD33、CD123和Alb。
图26：单价CD33(左)和CD123结合BB(右)分别与人(顶部)或食蟹猴(底部)转染的CD33、CD123细胞的结合。
图27：A025001562与人CD33和/或人CD123表达细胞的结合。
图28：在竞争测定中在原代T细胞上，在不存在(虚线曲线)或存在(实线曲线)临床级HSA的情况下，A025001562(蓝点)和(灰点)的剂量依赖性抑制。
图29：在基于阻抗的测定(xCELLigence)中，在50μM HSA的存在下，使用15比1的效应物与靶标比率，剂量依赖性人(顶部)或食蟹猴(底部)T细胞介导的对相应物种CD33(左)或CD123(右)转染细胞的杀伤。
图30：在基于流式细胞术的测定中，使用10:1的效应物与靶标比率，剂量依赖性人(左)或食蟹猴(右)T细胞介导的MOLM-13细胞杀伤。阳性靶细胞％相对于ISVD的浓度绘图。
图31：在基于阻抗的测定(xCELLigence)中，使用15比1的效应物与靶标比率，剂量依赖性人T细胞介导的细胞杀伤。孵育的32-35h后的细胞指数(CI)相对于ISVD的浓度绘图。
图32：通过体内生物发光成像得出的A025001562对Molm13-luc AML肿瘤生长的抑制。
图33：通过离体生物发光成像得出的A025001562对Molm13-luc AML肿瘤生长的抑制。
图34：在基于流式细胞术的测定中，使用10:1的效应物与靶标比率，剂量依赖性人T细胞介导的U937或KG1a细胞杀伤。+靶细胞％相对于ISVD的浓度绘图。
5具体实施方式
5.1某些定义
除非另有说明或定义，否则使用的所有术语都具有其在本领域中对技术人员来说清楚的通常含义。例如参考标准手册，如Sambrook等人(1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第2版)卷1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press)，F.Ausubel等人(1987,Current protocols in molecular biology,Green Publishing and WileyInterscience,纽约)，Lewin(1985,Genes II,John Wiley&Sons,纽约,纽约州)，Old等人(1981,Principles of Gene Manipulation:An Introduction to Genetic Engineering(第2版)University of California Press,伯克利,加利福尼亚州)，Roitt等人(2001,Immunology(第6版)Mosby/Elsevier,Edinburgh)，Roitt等人(2001,Roitt’s EssentialImmunology(第10版)Blackwell Publishing,英国)，以及Janeway等人(2005,Immunobiology(第6版)Garland Science Publishing/Churchill Livingstone,纽约)，以及参考本文引用的一般背景技术。
除非另外指明，否则没有详细地具体描述的所有方法、步骤、技术和操作可以并且已经按照本身已知的方式进行，这对技术人员来说将是清楚的。例如再参考标准手册和本文提及的一般背景技术以及其中引用的其他参考；以及参考例如以下综述；Presta(2006,Adv.Drug Deliv.Rev.58(5-6):640-56)，Levin和Weiss(2006,Mol.Biosyst.2(1):49-57)，Irving等人(2001,J.Immunol.Methods 248(1-2):31-45)，Schmitz等人(2000,Placenta21增刊A:S106-12)，Gonzales等人(2005,Tumour Biol.26(1):31-43)，它们描述了蛋白质工程技术，如亲和力成熟和其他用于改进蛋白质(如免疫球蛋白)的特异性和其他所需特性的技术。
如本文所用的术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白质序列”等术语中)通常应理解为包括相关的氨基酸序列以及编码所述氨基酸序列的核酸或核苷酸序列，除非上下文需要更限制的解释。
“氨基酸序列”应解释为是指单个氨基酸或两个或更多个氨基酸的无分支序列，这取决于上下文。核苷酸序列应解释为意指3个或更多个核苷酸的无分支序列。
氨基酸是天然存在的蛋白质中常见的那些L-氨基酸，并列于下表B-1中。那些含有D-氨基酸的氨基酸序列不旨在包含在该定义中。任何含有翻译后修饰的氨基酸的氨基酸序列都可以描述为最初使用下表中所示符号翻译的具有修饰位置(例如，羟基化或糖基化)的氨基酸序列；但这些修饰不在氨基酸序列中明确示出。该定义包括任何可以表达为序列修饰的连接、交联和端帽、非肽基键等的肽或蛋白质。
术语“蛋白质”、“肽”、“蛋白质/肽”和“多肽”在整个公开文本中可互换使用，并且各自具有用于本公开文本目的的相同含义。每个术语是指由两个或更多个氨基酸的直链构成的有机化合物。所述化合物可以具有十个或更多个氨基酸；二十五个或更多个氨基酸；五十个或更多个氨基酸；一百个或更多个氨基酸，两百个或更多个氨基酸，以及甚至三百个或更多个氨基酸。熟练技术人员将理解，尽管不存在本领域公认的区分多肽与蛋白质的氨基酸数量的分界点，但多肽通常比蛋白质包含更少的氨基酸；可以通过化学合成或重组方法制备多肽；并且通常通过本领域已知的重组方法在体外或体内制备蛋白质。
在本文中将根据如下表B-1中所提及的标准三字母或一字母氨基酸代码可互换地指示氨基酸残基。
表B-1：常见氨基酸
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当氨基酸残基指示为“X”或“Xaa”时，意味着所述氨基酸残基是未指定的，除非上下文需要更限制的解释。例如，如果描述提供了CDR的氨基酸序列，其中氨基酸残基中的一个(或多个)用Xaa指示，则描述可以进一步指定哪个(些)氨基酸残基是(可以)存在于CDR的该特定位置。例如，当氨基酸序列如CDR被称为由Gly Xaa Val His Xaa(SEQ ID NO:429)组成时，其中位置2的Xaa是Asp或Glu，并且位置5的Xaa是Lys或Gln，所述CDR将在其从左侧开始的第二个位置为氨基酸残基Asp或Glu，并且在其从左侧开始的第五个位置为Lys或Gln。在该例子中，所述CDR因此将是以下4种序列之一(SEQ ID NO:430-433)：Gly Asp Val HisLys；Gly Glu Val His Lys；Gly Asp Val His Gln；或Gly Glu Val His Gln。基于本文的公开内容，技术人员将清楚另外的例子。
出于比较两个或更多个ISVD或其他氨基酸序列(例如本发明技术的多肽等)的目的，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分比可以如下进行计算：([第一氨基酸序列中氨基酸残基与第二氨基酸序列中相应位置处的氨基酸残基相同的数量]/[第一氨基酸序列中氨基酸残基的总数量])×100％，其中与第一氨基酸序列相比在第二氨基酸序列中氨基酸残基的每个缺失、插入、取代或添加被视为单个氨基酸残基处(即单个位置处)的差异。
通常，为了根据上文概述的计算方法确定两个氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分比，将具有最大氨基酸残基数量的氨基酸序列作为“第一”氨基酸序列，并且另一个氨基酸序列作为“第二”氨基酸序列。
如本文所用，“氨基酸差异”是指单个氨基酸残基相对于参考序列的缺失、插入或取代，并且优选地是取代。与给定参考序列的较少氨基酸差异通常是优选的。例如，当CDR与给定的SEQ ID NO具有2或1个氨基酸差异时，优选1个氨基酸差异。
在一个实施方案中，氨基酸取代是保守取代。此类保守取代优选是指这样的取代，其中下组(a)-(e)中的一个氨基酸被同一组中的另一个氨基酸残基取代：(a)小脂肪族、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性、带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性、带正电荷的残基：His、Arg和Lys；(d)大脂肪族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；和(e)芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。
在一个实施方案中，保守取代如下：Ala取代为Gly或取代为Ser；Arg取代为Lys；Asn取代为Gln或取代为His；Asp取代为Glu；Cys取代为Ser；Gln取代为Asn；Glu取代为Asp；Gly取代为Ala或取代为Pro；His取代为Asn或取代为Gln；Ile取代为Leu或取代为Val；Leu取代为Ile或取代为Val；Lys取代为Arg、取代为Gln或取代为Glu；Met取代为Leu、取代为Tyr或取代为Ile；Phe取代为Met、取代为Leu或取代为Tyr；Ser取代为Thr；Thr取代为Ser；Trp取代为Tyr；Tyr取代为Trp；和/或Phe取代为Val、取代为Ile或取代为Leu。
除非上下文另有明确要求，否则在整个说明书和权利要求中，词语“包括”、“包含”等应被解释为包括性的意义，而不是排他性或穷举性的意义；也就是说，是“包括但不限于”的意义。
例如，当称一个核苷酸序列、氨基酸序列或多肽分别“包含”另一个核苷酸序列、氨基酸序列或多肽，或“基本上由”另一个核苷酸序列、氨基酸序列或多肽“组成”时，这可以意味着后一种核苷酸序列、氨基酸序列或多肽已分别并入第一个提及的核苷酸序列、氨基酸序列或多肽中，但更通常这一般意味着第一个提及的核苷酸序列、氨基酸序列或多肽在其序列内分别包含一段分别与后一个序列具有相同核苷酸序列或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸残基，而不论第一个提及的序列是如何实际产生或获得的(例如，可能是通过本文所述的任何合适的方法)。通过非限制性示例方式，当本发明技术的多肽被称为包含免疫球蛋白单可变结构域时，这可意味着所述免疫球蛋白单可变结构域序列已并入本发明技术的多肽的序列中，但更通常这一般意味着本发明技术的多肽在其序列内含有免疫球蛋白单可变结构域的序列，而不论本发明技术的所述多肽是如何产生或获得的。此外，当一个核酸或核苷酸序列被称为包含另一个核苷酸序列时，第一个提及的核酸或核苷酸序列优选地使得当其表达为表达产物(例如多肽)时，由后一个核苷酸序列编码的氨基酸序列形成所述表达产物的一部分(换言之，后一个核苷酸序列与第一个提及的较大核酸或核苷酸序列在相同阅读框中)。
当氨基酸序列或多肽被称为“基本上由”免疫球蛋白单可变结构域“组成”时，意味着所述氨基酸序列或多肽与免疫球蛋白单可变结构域完全相同或对应于如下多肽或氨基酸序列，所述多肽或氨基酸序列在免疫球蛋白单可变结构域的氨基末端、羧基末端、或氨基末端和羧基末端二者处添加有有限数量的氨基酸残基，如1-20个氨基酸残基，例如1-10个氨基酸残基并且优选1-6个氨基酸残基，如1、2、3、4、5或6个氨基酸残基。当使用“由……组成”时，意味着氨基酸序列或多肽与免疫球蛋白单可变结构域完全相同。
必须注意，如本文所用，单数形式“一个/一种”(“a”、“an”)和“所述”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指明。因此，例如，对“一种试剂”的提及包括一种或多种此类不同的试剂，并且对“所述方法”的提及包括对本领域普通技术人员已知的可以修改或取代本文所述方法的等效步骤和方法的提及。
除非另外指明，否则在一系列要素前面的术语“至少”应被理解为指该系列中的每一个要素。本领域的技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明技术的具体实施方案的许多等同方案。此类等同方案旨在被本发明技术涵盖。
术语“和/或”无论在本文哪里使用时均包括“和”、“或”和“由所述术语连接的要素的所有或任何其他组合”的含义。
如本文所用，术语“约”或“大约”意指给定值或范围的20％以内，优选15％以内，更优选10％以内，并且最优选5％以内。
5.2本发明技术的多肽
多特异性多价多肽
本发明技术涉及多特异性多价多肽，所述多特异性多价多肽包含特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的至少一种ISVD(如下文详述(第5.3节：“免疫球蛋白单可变结构域”))以及特异性结合靶细胞上的抗原的一种或多种ISVD。
在一方面，本发明技术的多特异性多价多肽至少是双特异性的，但也可以是例如三特异性、四特异性、五特异性的，等等。此外，多特异性多价多肽至少是二价的，但也可以是例如三价、四价、五价、六价的，等等。
术语“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”、“五特异性”等全部属于术语“多特异性”，并且是指分别与两种、三种、四种、五种等不同的靶分子结合。术语“多特异性”是指结合多个不同的靶分子。
术语“二价”、“三价”、“四价”、“五价”、“六价”等全部属于术语“多价”，并且分别指示存在两个、三个、四个、五个、六个等结合单元/构建块，如ISVD。术语“多价”指示存在多个结合单元/构建块。
例如，多肽可以是双特异性二价的，如包含至少两个ISVD或由至少两个ISVD组成的多肽，其中一个ISVD特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域，并且一个ISVD特异性结合靶细胞上的第一抗原。在另一个例子中，所述多肽可以是双特异性三价的，这种多肽包含三个ISVD或由三个ISVD组成，其中一个ISVD特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域，一个ISVD特异性结合靶细胞上的第一抗原，并且一个ISVD特异性结合靶细胞上的第二抗原，其中所述第二抗原与所述第一抗原相同。在又另一个例子中，三特异性三价多肽包含与特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的一个ISVD和特异性结合靶细胞上的第一抗原的一个ISVD相邻的特异性结合人血清白蛋白的一个ISVD。基于本文的公开内容，技术人员将清楚多特异性多价多肽的其他例子。
从以上和本文的进一步描述中将清楚，本发明技术的ISVD可以作为“构建块”用以形成本发明技术的多肽，例如，通过将所述ISVD与其他基团、残基、部分或结合单元适当地组合，以形成如本文所述的化合物或构建体(例如而不限于本文所述的本发明技术的二价/三价/四价/多价和双特异性/三特异性/四特异性/多特异性多肽)，其将一种或多种所需特性或生物学功能组合在一个分子内。具有多种ISVD的多肽在本文中也称为“构建体”或“ISVD形式”。
诸位发明人发现，在ISVD T0170056G05(在WO 2016180969中披露为SEQ ID NO:50)的CDR中引入某些氨基酸突变及其组合导致改善的与人TCR和/或非人灵长类动物TCR的恒定结构域的结合。
在一个实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含第一免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和第二免疫球蛋白单可变结构域，其中
-所述第一ISVD特异性结合T细胞上存在的人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域；
-所述第二ISVD特异性结合靶细胞上的第一抗原；
其中所述第一抗原不同于所述TCR；
其中所述靶细胞不同于所述T细胞；并且
其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1的氨基酸序列是Xaa Xaa Val His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa(SEQ IDNO:295)，其中
位置1处的Xaa是Gly、Trp、Gln或Tyr，
位置2处的Xaa是Asp、Glu、Tyr、Ser或Ala，
位置5处的Xaa是Lys或Gln，
位置6处的Xaa是Ile或Leu，
位置7处的Xaa是Asn或Phe，
位置8处的Xaa是Phe、Val或Tyr，
位置9处的Xaa是Leu、Tyr或Phe，
位置10处的Xaa是Gly、Thr或Arg；
(ii)CDR2的氨基酸序列是Xaa Ile Ser Ile Xaa Asp Xaa Xaa Asp(SEQ ID NO:296)，其中
位置1处的Xaa是His或Val，
位置5处的Xaa是Gly或Ala，
位置7处的Xaa是Gln、Val或Glu，
位置8处的Xaa是Thr、Ser或Val；并且
(iii)CDR3的氨基酸序列是Xaa Ser Xaa Ile Xaa Pro Tyr Xaa Xaa(SEQ ID NO:297)，其中
位置1处的Xaa是Phe、Leu或Met，
位置3处的Xaa是Arg、Lys或Ser，
位置5处的Xaa是Tyr或Trp，
位置8处的Xaa是Asp或Gln，
位置9处的Xaa是Tyr或Trp，
其中CDR1的位置1、2、5、6、7、8、9和10处的Xaa不同时分别是Gly、Asp、Lys、Ile、Asn、Phe、Leu和Gly；
其中CDR2的位置1、5、7和8处的Xaa不同时分别是His、Gly、Gln和Thr；并且
其中CDR3的位置1、3、5、8和9处的Xaa不同时分别是Phe、Arg、Tyr、Asp和Tyr。
如本文进一步提供的实施例4和表2、3和4所示，在CDR中的这些特定位置处引入这些特定氨基酸残基导致与ISVD T0170000141的结合相比，ISVD与人和/或非人灵长类动物TCR的恒定结构域的改善的结合。T0170000141包含T01700056G05的CDR序列，即SEQ ID NO:153的CDR1、SEQ ID NO:209的CDR2和SEQ ID NO:223的CDR3。
当在本发明技术的多特异性多价多肽中包含的第一ISVD被称为包含以下时：SEQID NO:295的CDR1，其中位置1、2、5、6、7、8、9和10处的Xaa不同时分别是Gly、Asp、Lys、Ile、Asn、Phe、Leu和Gly；SEQ ID NO:296的CDR2，其中位置1、5、7和8处的Xaa不同时分别是His、Gly、Gln和Thr；以及SEQ ID NO:297的CDR3，其中CDR3的位置1、3、5、8和9处的Xaa不同时分别是Phe、Arg、Tyr、Asp和Tyr；这意味着在所述第一ISVD中，CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ ID NO:153、209、223的氨基酸序列。本发明技术的多特异性多价多肽中包含的第一ISVD因此包含与ISVD T0170056G05或T017000141中包含的CDR不同的CDR。为了清楚起见，本发明技术的多特异性多价多肽中的第一ISVD既不包含与T0170056G05(其在WO2016180969中披露为SEQ ID NO:50)中相同的CDR，也不包含与T017000141(其在本文公开为SEQ ID NO:2)中相同的CDR。
因此，在一个实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含第一免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和第二免疫球蛋白单可变结构域，其中
-所述第一ISVD特异性结合T细胞上的人TCR的恒定结构域和T细胞上存在的非人灵长类动物TCR的恒定结构域二者；
-所述第二ISVD特异性结合靶细胞上的第一抗原；
其中所述第一抗原不同于所述TCR；
其中所述靶细胞不同于所述T细胞；并且
其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1的氨基酸序列是Xaa Xaa Val His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa(SEQ IDNO:295)，其中
位置1处的Xaa是Gly、Trp、Gln或Tyr，
位置2处的Xaa是Asp、Glu、Tyr、Ser或Ala，
位置5处的Xaa是Lys或Gln，
位置6处的Xaa是Ile或Leu，
位置7处的Xaa是Asn或Phe，
位置8处的Xaa是Phe、Val或Tyr，
位置9处的Xaa是Leu、Tyr或Phe，
位置10处的Xaa是Gly、Thr或Arg；
(ii)CDR2的氨基酸序列是Xaa Ile Ser Ile Xaa Asp Xaa Xaa Asp(SEQ ID NO:296)，其中
位置1处的Xaa是His或Val，
位置5处的Xaa是Gly或Ala，
位置7处的Xaa是Gln、Val或Glu，
位置8处的Xaa是Thr、Ser或Val；并且
(iii)CDR3的氨基酸序列是Xaa Ser Xaa Ile Xaa Pro Tyr Xaa Xaa(SEQ ID NO:297)，其中
位置1处的Xaa是Phe、Leu或Met，
位置3处的Xaa是Arg、Lys或Ser，
位置5处的Xaa是Tyr或Trp，
位置8处的Xaa是Asp或Gln，
位置9处的Xaa是Tyr或Trp，并且
其中所述第一ISVD的CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ ID NO:153、209和223的氨基酸序列。
本发明技术的多特异性多价多肽中包含的第一ISVD特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域。
在一个实施方案中，所述第一ISVD特异性结合人T细胞受体α(TCR-α)的恒定结构域(SEQ ID NO:291)和/或人T细胞受体β(TCR-β)的恒定结构域(SEQ ID NO:292)，或其多态变体或同种型。
由在本发明技术的多特异性多价多肽中包含的第一ISVD结合的非人灵长类动物TCR可以是例如来自猕猴来源的TCR或来自恒河猴来源的TCR。在一个实施方案中，因此非人灵长类动物TCR是猕猴或恒河猴TCR。在一个实施方案中，所述猕猴或恒河猴TCR包含SEQ IDNO:293的TCR-α的恒定结构域和/或SEQ ID NO:294的TCR-β的恒定结构域，或其多态变体或同种型。
在一个实施方案中，本发明技术的多肽包含第一ISVD，所述第一ISVD与包含T0170056G05的CDR序列(即SEQ ID NO:153的CDR1、SEQ ID NO:209的CDR2、以及SEQ ID NO:223的CDR3)的相应ISVD(如具有SEQ ID NO:2的ISVD T017000141)相比具有改善的结合特征。本发明技术的多肽的ISVD部分的结合特征在下文和第5.4节“特异性”中更详细地讨论。
与具有SEQ ID NO:2的ISVD T017000141相比，诸位发明人鉴定了CDR中导致改善的在人和/或非人灵长类动物TCR上的解离速率的氨基酸突变。因此，在一些实施方案中，所述第一ISVD因此以与SEQ ID NO:2的ISVD相比相同或更低的解离速率常数(koff)特异性结合人TCR。在一些实施方案中，所述第一ISVD以与SEQ ID NO:2的ISVD相比相同或更低的koff特异性结合非人灵长类动物TCR。
在一些实施方案中，所述第一ISVD关于结合人TCR的恒定结构域具有选自至多约10-3s-1、至多约10-4s-1和至多约10-5s-1的koff，优选如通过表面等离子体共振(SPR)测量的。在一些实施方案中，所述第一ISVD关于结合非人灵长类动物TCR的恒定结构域具有选自至多约10-2s-1、至多约10-3s-1和至多约10-4s-1的koff，优选如通过SPR测量的。
诸位发明人还鉴定出CDR中的特定位置处的特定氨基酸残基，这些特定氨基酸残基促成改善与人和非人灵长类动物TCR结合的交叉反应性。因此，在一个实施方案中，所述第一ISVD具有关于结合人TCR的koff的5倍范围内的关于结合非人灵长类动物TCR的koff，优选如通过SPR测量的。
特别地，诸位发明人鉴定出特定CDR序列，所述特定CDR序列与T017000141的CDR序列相比导致结合特征改善并且与T017000141的CDR序列相比仅包含一个氨基酸差异。将T017000141中包含的SEQ ID NO:153的CDR1、SEQ ID NO:209的CDR2或SEQ ID NO:223的CDR3替代为选自SEQ ID NO:154至169的CDR1、选自SEQ ID NO:210至215的CDR2或选自SEQID NO:224至230的CDR3改善了与人和/或非人灵长类动物TCR的结合。
因此，在本发明技术的多特异性多价多肽中，在一个实施方案中，在第一ISVD中，CDR1选自SEQ ID NO:154至169的氨基酸序列的组。在一个实施方案中，在第一ISVD中，CDR2选自SEQ ID NO:210至215的氨基酸序列的组。在一个实施方案中，在第一ISVD中，CDR3选自SEQ ID NO:224至230的氨基酸序列的组。
在一个特定实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含第一ISVD，其中：
(i)CDR1选自SEQ ID NO:153至169的氨基酸序列的组；
(ii)CDR2选自SEQ ID NO:209至215的氨基酸序列的组；并且
(iii)CDR3选自SEQ ID NO:223至230的氨基酸序列的组，并且
其中所述第一ISVD的CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ ID NO:153、209和223的氨基酸序列。
在一个特定实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含第一ISVD，其中：
(i)CDR1选自SEQ ID NO:154至169的氨基酸序列的组；
(ii)CDR2由氨基酸序列HISIGDQTD(SEQ ID NO:209)组成；以及
(iii)CDR3由氨基酸序列FSRIYPYDY(SEQ ID NO:223)组成。
在另一个特定实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含第一ISVD，其中：
(i)CDR1由氨基酸序列GDVHKINFLG(SEQ ID NO:153)组成；
(ii)CDR2选自SEQ ID NO:210至215的氨基酸序列的组；并且
(iii)CDR3由氨基酸序列FSRIYPYDY(SEQ ID NO:223)组成。
在又另一个特定实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含第一ISVD，其中：
(i)CDR1由氨基酸序列GDVHKINFLG(SEQ ID NO:153)组成；
(ii)CDR2由氨基酸序列HISIGDQTD(SEQ ID NO:209)组成；以及
(iii)CDR3选自SEQ ID NO:224至230的氨基酸序列的组。
如实施例4的第二部分所述并且基于表2、3和4中描述的筛选数据，被划分在CDR1和CDR3中的9个位置上的一组12个单突变(如表5所指示)由诸位发明人选择用于组合。随后筛选在其CDR中具有这些突变组合的ISVD变体，以评估这些突变对ISVD与人和/或非人灵长类动物TCR的结合的影响。选择用于组合的突变是与TO17000141的CDR1相比存在于具有SEQID NO:154至163的氨基酸序列的CDR1中的那些，以及与TO17000141的CDR3相比存在于具有SEQ ID NO:224至228的氨基酸序列的CDR3中的突变。本发明技术还涉及在其CDR中包含这些特定氨基酸突变或包含上文提及的特定CDR1和/或CDR3序列的多肽。
因此，在另外的实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含第一ISVD，其中：
(i)CDR1的氨基酸序列是Xaa Xaa Val His Xaa Xaa Asn Phe Xaa Xaa(SEQ IDNO:298)，其中
位置1处的Xaa是Gly、Trp或Tyr，
位置2处的Xaa是Asp、Glu、Tyr、Ser或Ala，
位置5处的Xaa是Lys或Gln，
位置6处的Xaa是Ile或Leu，
位置9处的Xaa是Leu或Tyr，
位置10处的Xaa是Gly或Thr，
(ii)CDR2的氨基酸序列是His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp(SEQ ID NO:209)，并且
(iii)CDR3的氨基酸序列是Xaa Ser Xaa Ile Xaa Pro Tyr Asp Xaa(SEQ ID NO:299)，其中
位置1处的Xaa是Phe、Leu或Met，
位置3处的Xaa是Arg或Lys，
位置5处的Xaa是Tyr或Trp，并且
位置9处的Xaa是Tyr或Trp，
其中所述第一ISVD的CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ ID NO:153、209和223的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明技术的多肽包含第一ISVD，其中CDR1选自SEQ ID NO:154至163的氨基酸序列的组。
在一个实施方案中，本发明技术的多肽包含第一ISVD，其中CDR3选自SEQ ID NO:224至228的氨基酸序列的组。
在一个特定实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含第一ISVD，其中：
(i)CDR1选自SEQ ID NO:153至163的氨基酸序列的组；
(ii)CDR2是SEQ ID NO:209的氨基酸序列；并且
(iii)CDR3选自SEQ ID NO:223至228的氨基酸序列的组，
其中所述第一ISVD的CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ ID NO:153、209和223的氨基酸序列。
CDR中的设想突变位置包括在ISVD T017000624中突变的那些CDR位置，即CDR1的位置2和9以及CDR3的位置1或5。本发明技术还涉及在其CDR中在那些特定位置处包含氨基酸突变的多肽。
因此，在一个具体实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含第一ISVD，其中CDR1选自SEQ ID NO:154至158的氨基酸序列的组。在另一个具体实施方案中，所述多肽包含第一ISVD，其中CDR3选自SEQ ID NO:224至226的氨基酸序列的组。
在一个特定实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含第一ISVD，其中：
(i)CDR1选自SEQ ID NO:153至158的氨基酸序列的组；
(ii)CDR2是SEQ ID NO:209的氨基酸序列；并且
(iii)CDR3选自SEQ ID NO:223至226的氨基酸序列的组，
其中所述第一ISVD的CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ ID NO:153、209和223的氨基酸序列。
CDR中的设想氨基酸突变包括在T017000624的CDR序列中包含的那些，即CDR1的位置2处的Tyr、CDR1的位置9处的Tyr、CDR3的位置1处的Leu或CDR3的位置5处的Trp。
因此，在一个具体实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含第一ISVD，其中CDR1选自SEQ ID NO:154和155的氨基酸序列的组。在另一个具体实施方案中，所述多肽包含第一ISVD，其中CDR3选自SEQ ID NO:224和225的氨基酸序列的组。
在一个特定实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含第一ISVD，其中：
(i)CDR1选自SEQ ID NO:153至155的氨基酸序列的组；
(ii)CDR2是SEQ ID NO:209的氨基酸序列；并且
(iii)CDR3选自SEQ ID NO:223至225的氨基酸序列的组，
其中所述第一ISVD的CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ ID NO:153、209和223的氨基酸序列。
如实施例4和5中所述以及如表6和表7中所述，被划分在CDR1和CDR3中的9个位置上的12个单突变组的随机组合导致鉴定出具有多于一个突变的CDR1和CDR3序列，它们组合起来赋予所得ISVD与具有非突变CDR的参考ISVD T017000141相比改善的结合特性。这些改善的ISVD中包含的CDR1和CDR3序列是具有SEQ ID NO:171至207中任一个的CDR1序列和具有SEQ ID NO:235至247中任一个的CDR3序列。
因此，在一个具体实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含第一ISVD，其中CDR1选自SEQ ID NO:171至207的氨基酸序列的组。在另一个具体实施方案中，所述多肽包含第一ISVD，其中CDR3选自SEQ ID NO:235至247的氨基酸序列的组。
在一个特定实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含第一ISVD，其中：
(i)CDR1选自SEQ ID NO:153和171至207的氨基酸序列的组；
(ii)CDR2是SEQ ID NO:209的氨基酸序列；并且
(iii)CDR3选自SEQ ID NO:223和235至247的氨基酸序列的组，
其中所述第一ISVD的CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ ID NO:153、209和223的氨基酸序列。
优越的CDR序列包括与T017000141相比，为ISVD提供改善的与人和非人灵长类动物TCR结合的交叉反应性的那些。特别有利的CDR序列包括为ISVD提供关于结合人TCR的koff的5倍范围内的关于结合非人灵长类动物TCR的koff的那些，即SEQ ID NO:154、161、171至175、和177至191的CDR1以及SEQ ID NO:226、227、和235至243的CDR3序列。
因此，在一个具体实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含第一ISVD，其中CDR1选自SEQ ID NO:154、161、171至175、和177至191的氨基酸序列的组。在又另一个具体实施方案中，所述多肽包含第一ISVD，其中CDR3选自SEQ ID NO:226、227、和235至243的氨基酸序列的组。
在一个特定实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含第一ISVD，其中：
(i)CDR1选自SEQ ID NO:153、154、161、171至175、和177至191的氨基酸序列的组；
(ii)CDR2是SEQ ID NO:209的氨基酸序列；并且
(iii)CDR3选自SEQ ID NO:223、226、227、和235至243的氨基酸序列的组，
其中所述第一ISVD的CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ ID NO:153、209和223的氨基酸序列。
基于它们的结合特征，选择一组6个TCR结合ISVD，即T017000623、T017000624、T017000625、T017000635、T017000638和T017000641，以进一步表征本发明技术的多特异性多价多肽的形式。如实施例6中所述，产生双特异性CD123/TCR结合多肽，一些在N末端具有TCR结合ISVD，以及其他在C末端具有TCR结合ISVD。诸位发明人发现，在人T细胞介导的细胞杀伤测定中，在N末端位置具有所选择的TCR结合ISVD变体之一的所有形式的效力至少与其中所选择的TCR结合ISVD变体被T0170056G05替代的相同形式一样。在食蟹猴T细胞介导的细胞杀伤测定中，对于在N末端位置具有所选择的TCR结合ISVD变体的所有形式可以观察到与其中所选择的TCR结合ISVD变体被T0170056G05替代的相同形式相比改善的效力。在这些改善的ISVD中包含的CDR1和CDR3序列，即具有SEQ ID NO:171至175的CDR1序列和具有SEQID NO:235和236的CDR3序列，是对于本发明技术的多特异性多价多肽中的第一ISVD所设想的CDR。
因此，在一个具体实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含第一ISVD，其中CDR1选自SEQ ID NO:171至175的氨基酸序列的组。在另一个具体实施方案中，本发明技术的多肽包含第一ISVD，其中CDR3选自SEQ ID NO:235和236的氨基酸序列的组。
在一个特定实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含第一ISVD，其中：
(i)CDR1选自SEQ ID NO:153和171至175的氨基酸序列的组；
(ii)CDR2是SEQ ID NO:209的氨基酸序列；并且
(iii)CDR3选自SEQ ID NO:223、235和236的氨基酸序列的组，
其中所述第一ISVD的CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ ID NO:153、209和223的氨基酸序列。
诸位发明人出人意料地发现ISVD T017000624不仅展现出改善的与人和非人灵长类动物TCR的结合，还展现出改善的与来自人和非人灵长类动物来源的TCR结合的交叉反应性(实施例5)。在编排为双特异性CD123/TCR结合多肽后，这些多特异性多价多肽与取而代之包含亲本ISVD T0170056G05的相同多特异性多价多肽相比，在食蟹猴和人T细胞介导的细胞杀伤测定中均显示出改善的效力。然而，与其他表征的TCR结合ISVD变体相反，当T017000624位于C末端位置时，也可以观察到这种效应。包含SEQ ID NO:171的CDR1序列和SEQ ID NO:235的CDR3序列的TCR结合ISVD T017000624因此与其他表征的TCR结合ISVD相比具有更好的编排特性。T017000624中包含的CDR1和CDR3序列，即SEQ ID NO:171的CDR1序列和SEQ ID NO:235的CDR3序列，是本发明技术的多特异性多价多肽中第一ISVD的有利CDR。
因此，在一个具体实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含第一ISVD，其中CDR1由GYVHKINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:171)组成。在另一个具体实施方案中，本发明技术的多肽包含第一ISVD，其中CDR3由LSRIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:235)组成。
具有改善的与人和/或非人灵长类动物TCR的结合的TCR结合ISVD包括T017000623、T017000624、T017000625、T017000635、T017000638和T017000641。这些ISVD及其CDR的序列列于表A-2中。在本发明技术的一个实施方案中，所述多特异性多价多肽因此包含第一ISVD，其中：
a)CDR1由GYVHKINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:171)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及CDR3由LSRIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:235)组成；或
b)CDR1由WDVHKINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:172)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及CDR3由LSKIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:236)组成；或
c)CDR1由YDVHKINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:173)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及CDR3由LSKIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:236)组成；或
d)CDR1由WDVHQINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:174)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及CDR3由LSRIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:235)组成；或
e)CDR1由WDVHKINFYT的氨基酸序列(SEQ ID NO:175)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及CDR3由LSRIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:235)组成；或
f)CDR1由WDVHKINFYT的氨基酸序列(SEQ ID NO:175)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及CDR3由LSKIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:236)组成。
在本发明技术的一个具体实施方案中，所述多特异性多价多肽包含第一ISVD，所述第一ISVD包含T017000624的CDR序列。因此，在一个具体实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含第一ISVD，其中CDR1由GYVHKINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:171)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，并且CDR3由LSRIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:235)组成。
如下文更详细描述的(第5.3节：“免疫球蛋白单可变结构域”)，本发明技术的多特异性多价多肽中包含的第一ISVD可以具有框架序列，所述框架序列是免疫球蛋白框架序列或源自免疫球蛋白框架序列(例如，通过人源化或驼源化)的框架序列的合适组合。例如，所述框架序列可以是源自轻链可变结构域(例如VL序列)和/或重链可变结构域(例如VH序列或VHH序列)的框架序列。在一方面，所述框架序列是已源自VHH序列的框架序列(其中所述框架序列可以任选地已部分或完全人源化)或已驼源化的常规VH序列(如本文所定义)。
特别地，本发明技术中使用的ISVD序列中存在的框架序列可以含有一个或多个标志残基(如本文所定义)以使得ISVD序列是如VHH，包括人源化VHH或驼源化VH。此类框架序列的合适组合的一些非限制性例子将从本文的进一步公开中变得清楚。
更具体地，本发明技术提供多特异性多价多肽，所述多特异性多价多肽包含特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的第一ISVD，所述第一ISVD是具有如下(一般)结构的氨基酸序列
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别是指框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3，并且这些互补决定区：
i)与SEQ ID NO:1至152、261或262的氨基酸序列(参见表A-1)中的至少一个具有至少80％、更优选90％的氨基酸同一性，其中出于确定氨基酸同一性程度的目的，形成所述CDR序列的氨基酸残基被忽略。在这方面，还参考表A-2，列出了SEQ ID NO:1至152、261或262(参见表A-1)的ISVD的框架1序列(SEQ ID NO:248-250)、框架2序列(SEQ ID NO:251)、框架3序列(SEQ ID NO:252-259)和框架4序列(SEQ ID NO:260)；
并且其中：
ii)优选地，根据Kabat编号，在位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108处的氨基酸残基中的一个或多个选自WO 08/020079的表A-3至表A-8中提及的标志残基。
在一个实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽因此包含与SEQ ID NO:1至152、261或262的氨基酸序列中的至少一个具有至少80％、更优选90％序列同一性的第一ISVD，其中出于确定序列同一性程度的目的，形成所述CDR序列的氨基酸残基被忽略。
在本发明技术的一个具体实施方案中，所述多肽包含第一ISVD，其中根据Kabat编号在位置73处的氨基酸残基不是天冬酰胺。在一个具体实施方案中，根据Kabat编号在位置73处的氨基酸残基是谷氨酸。
在一个实施方案中，如本文所述的本发明技术的多特异性多价多肽包含第一ISVD，其中
(i)FR1选自SEQ ID NO:248至250的氨基酸序列的组，
(ii)FR2是SEQ ID NO:251的氨基酸序列，
(iii)FR3选自SEQ ID NO:252至259的氨基酸序列的组，并且
(iv)FR4是SEQ ID NO:260的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明技术提供了如本文所述的多肽，其中与T0170056G05相比，所述第一ISVD展现出改善的与人和/或非人灵长类动物TCR的结合。在一个实施方案中，本发明技术的多肽中包含的第一ISVD选自SEQ ID NO:1至20、22至27、35至41、46至147、150至152、和261至262的氨基酸序列的组。
在一个实施方案中，与T017000141或T0170056G05的CDR序列相比，在如本文所述的多特异性多价多肽中具有改善的结合特性的第一ISVD在其CDR之一中可以包含仅一个氨基酸差异。在一个实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽因此包含选自SEQ ID NO:1至20、22至27、和35至41的氨基酸序列的组的第一ISVD。
在另一个实施方案中，与T017000141或T0170056G05的CDR序列相比时，具有改善的结合特性的第一ISVD在其CDR中包含多于一个氨基酸差异。因此，在一个实施方案中，本文所述的多特异性多价多肽包含选自SEQ ID NO:46至147、150至152、261和262的氨基酸序列的组的第一ISVD。
诸位发明人发现，当位于本发明技术的多肽的N末端位置时，具有SEQ ID NO:46至50、147和150至152、261和262的氨基酸序列的ISVD导致在食蟹猴T细胞介导的细胞杀伤测定中，与其中第一ISVD被T0170056G05替代的相同形式的效力相比增加的效力。在一个实施方案中，本文所述的多肽因此包含选自SEQ ID NO:46至50、147和150至152、261和262的氨基酸序列的组的第一ISVD。
用于本发明技术的多肽的ISVD包括包含T017000624的CDR序列的那些。如上所述，与其他表征的TCR结合ISVD相比，包含SEQ ID NO:171的CDR1序列、SEQ ID NO:209的CDR2序列和SEQ ID NO:235的CDR3序列的ISVD T017000624具有更好的编排特性。因此，在一个具体实施方案中，本文所述的多肽因此包含选自SEQ ID NO:46、150至152、261和262的氨基酸序列的组的第一ISVD。
通常，本发明技术的多特异性多价多肽将靶细胞上的高亲和力抗原识别与T细胞激活相结合，导致不依赖于T细胞天然特异性的激活。本发明技术的多肽的第一ISVD对/与效应细胞(优选所述效应细胞的TCR，并且甚至更优选所述TCR的恒定结构域)具有高亲和力/特异性结合。
效应细胞是包含TCR复合物的细胞，优选免疫细胞，如T细胞，优选CD4+T辅助细胞(也称为CD4细胞、T辅助细胞或T4细胞)，更优选细胞毒性T细胞(也称为TC细胞、CTL或CD8+T细胞)或自然杀伤T细胞(NKT细胞)。在一些实施方案中，细胞在体内存在。在一些实施方案中，细胞在体外存在。本发明技术的效应细胞特别涉及哺乳动物细胞，优选灵长类动物细胞，并且甚至更优选人细胞。
与靶细胞上的细胞表面分子如肿瘤抗原和T细胞TCR二者结合的结合分子的作用模式是公知的。使T细胞紧密接近靶细胞，即接合所述T细胞并簇集TCR复合物导致T细胞杀伤靶细胞。在本发明技术中，该过程被用于对抗增殖性疾病、炎性疾病、感染性疾病和自身免疫病。通常，T细胞配备有颗粒，所述颗粒含有成孔蛋白(称为穿孔素)和细胞死亡诱导蛋白酶(称为颗粒酶)的致命组合。优选地，这些蛋白质通过溶细胞突触被递送至靶细胞中，如果T细胞与被针对杀伤的靶细胞紧密接近，则形成所述溶细胞突触。正常地，T细胞和靶细胞之间的紧密接近是通过T细胞与使用其匹配的T细胞受体的MHC/肽复合物结合来实现的。在不存在T细胞受体/MHC相互作用的情况下，本发明技术的多特异性多价多肽使T细胞与靶细胞如此紧密接近。
因此，本发明技术提供了如本文所述的多特异性多价多肽，其中所述多肽将T细胞定向至靶细胞。
采用一个臂(第一ISVD)，所述多特异性多肽对/与TCR亚基的恒定结构域具有高亲和力/特异性结合，所述TCR亚基是T细胞上T细胞受体的信号转导复合物的蛋白质组分。采用另一臂(第二ISVD和/或第三ISVD等)，所述多特异性多肽识别靶细胞上的一种或多种抗原，对/与靶细胞上的一种或多种抗原具有高亲和力/特异性结合。优选地，仅当所述多特异性多肽呈递给靶细胞表面上的T细胞时才观察到T细胞激活。激活的靶细胞抗原依赖性导致有利的安全性特征。在一个实施方案中，所述多特异性多价多肽瞬时拴系T细胞和靶细胞。优选地，所述多特异性多价多肽可以诱导静息多克隆T细胞如CD4+和/或CD8+T细胞激活，以用于靶细胞的高效重定向裂解。优选地，T细胞在第一个靶细胞裂解后被定向至下一个靶细胞。
如本文所用，“T细胞激活”是指T细胞(例如细胞毒性T细胞)的一种或多种细胞应答，所述细胞应答例如选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性、激活标记物的表达、和重定向的靶细胞裂解。本发明技术的多特异性多价多肽能够诱导T细胞激活。测量T细胞激活的合适测定在本文所述的领域中是已知的，例如如WO 99/54440或Schlereth等人2005(Cancer Immunol.Immunother.20:1-12)所述或如在实施例或下文中例示的。
在一个实施方案中，本发明技术涉及如本文所述的多特异性多价多肽，其中所述多肽诱导T细胞激活。优选地，仅当所述第二个和/或另外的ISVD与靶细胞上的抗原结合时，本发明技术的多肽才诱导T细胞激活。
在一个实施方案中，本发明技术涉及如本文所述的多特异性多价多肽，其中所述T细胞激活依赖于将与靶细胞上的所述第一抗原结合的所述多肽呈递给T细胞。
本发明技术的多肽对T细胞的激活可以通过以下来监测：CD69、CD25和各种细胞粘附分子的上调，细胞因子(例如，IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-2、IL-4和IL-10)的从头表达和/或释放，颗粒酶和穿孔素表达的上调，和/或细胞增殖，膜起泡，半胱天冬酶原3和/或7的激活，核DNA的片段化和/或半胱天冬酶底物聚(ADP核糖)聚合酶的切割。优选地，多特异性多价多肽对靶细胞的重定向裂解不依赖于T细胞受体特异性、MHC I类和/或β2微球蛋白的存在、和/或任何共刺激性刺激。
在一个实施方案中，本发明技术涉及如本文所述的多特异性多价多肽，其中所述T细胞激活不依赖于MHC识别。
本发明技术的多特异性多价多肽在体外显示用先前未刺激的外周多克隆CD8+和CD4+阳性T细胞的重定向裂解。通过本发明技术的多肽募集T细胞对靶细胞的重定向裂解涉及溶细胞突触形成以及穿孔素和颗粒酶的递送。已经描述了T细胞造成的细胞裂解，例如Atkinson和Bleackley 1995(Crit.Rev.Immunol 15(3-4):359-384)所述。优选地，接合的T细胞能够进行连续靶细胞裂解，并且不受干扰肽抗原加工和呈递或克隆T细胞分化的免疫逃逸机制的影响(参见例如WO 2007/042261)。在体外，在低皮摩尔浓度下观察到重定向裂解，这表明非常少数量的本发明技术的多肽需要与靶细胞结合以触发T细胞。如例子中所展示，低效应物与靶标的比率可能表明连续靶细胞裂解。因此，本发明技术涉及强效多肽。优选地，本发明技术的多特异性多价多肽介导靶细胞(例如癌细胞)的杀伤，如刺激T细胞形成孔并递送细胞毒性T细胞颗粒的促凋亡组分。
在一个实施方案中，本发明技术涉及如本文所述的多特异性多价多肽，其中所述T细胞激活引起所述T细胞的一种或多种细胞应答，其中所述细胞应答选自增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性、激活标记物的表达和重定向的靶细胞裂解。
如本文所用，术语“效力”是药剂如多肽或ISVD的生物活性的量度。药剂的效力可以通过本领域已知的任何合适的方法来确定，例如在实验部分中描述的。基于细胞培养的效力测定通常是确定生物活性的优选形式，因为它们测量由药剂引发的生理反应并且可以在相对较短的时间段内产生结果。可以使用基于产品作用机制的各种类型的基于细胞的测定，包括但不限于增殖测定、细胞毒性测定、细胞杀伤测定、报告基因测定、细胞表面受体结合测定、和测量功能必需蛋白质或其他信号分子(如磷酸化蛋白质、酶、细胞因子、cAMP等)的诱导/抑制的测定、Ramos B细胞耗尽模型、T细胞介导的肿瘤细胞杀伤测定(例如，如实施例部分所述)，在本领域中都是熟知的。来自基于细胞的效力测定的结果可以表示为“相对效力”，如通过比较本发明技术的多特异性多价多肽与对于相应参考单价ISVD(例如仅包含一个ISVD、任选地还包含不相关ISVD的多肽)获得的反应而确定的(参见实验部分)。
在一个实施方案中，与其中第一ISVD被T0170056G05替代的相同形式相比，本发明技术的多特异性多价多肽在人和食蟹猴T细胞介导的杀伤测定中显示出改善的效力和功效(实施例11)。
(本发明技术的多肽的)“功效”测量在饱和多肽浓度下作用本身的最大强度。功效指示本发明技术的多肽可实现的最大反应。它是指多肽产生所需(治疗)作用的能力。
因此，在一个实施方案中，本发明技术涉及如本文所述的多特异性多价多肽，其中所述T细胞激活引起所述靶细胞活性的抑制，例如从而延迟或最小化靶细胞的扩散、抑制或延迟靶细胞的生长和/或增殖、和/或杀伤靶细胞(例如，引起障碍和/或症状消退)超过约10％，如20％、30％、或40％，或甚至超过50％，如超过60％，如70％、80％或者甚至超过90％，如100％。在一个特定实施方案中，所述T细胞激活引起所述靶细胞裂解超过约10％，如20％、30％或40％，或甚至超过50％，如超过60％。
在一个实施方案中，如本文所述的多特异性多价多肽引起人T细胞以选自至多约10-9M、至多约10-10M、和至多约10-11M的EC50值裂解靶细胞，所述EC50值如在T细胞介导的杀伤测定中确定的。例如，EC50是在如实施例11或13中所述的基于流式细胞术的测定中确定的。
在一个实施方案中，如本文所述的多特异性多价多肽引起非人灵长类动物T细胞以选自至多约10-9M、和至多约10-10M、和至多约10-11M的EC50值裂解靶细胞，所述EC50值如在T细胞介导的杀伤测定中确定的。例如，EC50是在如实施例11中所述的基于流式细胞术的测定中确定的。
半最大抑制浓度(IC50)是化合物在抑制生物或生化功能(例如药理作用)方面的有效性的量度。这种定量测量表明需要多少ISVD能将给定的生物过程(或过程的组分，即酶、细胞、细胞受体、趋化性、间变性、转移、侵袭性等)抑制一半。换言之，它是物质的半最大(50％)抑制浓度(IC)(50％ IC，或IC50)。药物的IC50可以通过构建剂量-反应曲线并检查不同浓度的拮抗剂(如本发明技术的ISVD)对逆转激动剂活性的作用来确定。可以通过确定抑制激动剂的最大生物学反应的一半的浓度来计算给定拮抗剂(如本发明技术的ISVD)的IC50值。
术语半最大有效浓度(EC50)是指在指定的暴露时间后在基线与最大值中间诱导反应的化合物浓度。在本文背景下，它被用作多肽或ISVD效力的量度。分级剂量反应曲线的EC50表示观察到50％最大效应的化合物浓度。浓度优选以摩尔单位表示。
在生物系统中，配体浓度的微小变化通常会遵循S形函数导致反应的快速变化。随着渐增的配体浓度而反应增加开始减慢的拐点是EC50。这可以通过推导最佳拟合线以数学方式确定。在大多数情况下，依靠图表进行估计是便利的。在实施例部分中提供EC50的情况下，实验旨在尽可能准确地反映KD。换言之，EC50值可进而被视为KD值。术语“平均KD”涉及在至少1次，但优选大于1次，如至少2次实验中获得的平均KD值。术语“平均值”是指数学术语“平均值”(数据项的总和除以数据中的项个数)。
还涉及IC50，是化合物抑制(50％抑制)的量度。对于竞争结合测定和功能性拮抗剂测定，IC50是剂量反应曲线最常见的汇总量度。对于激动剂/刺激剂测定，最常见的汇总量度是EC50。
诸位发明人鉴定了如本文所述的多特异性多价多肽，其包含与其中第一ISVD被SEQ ID NO:1的ISVD替代的相同多肽相比具有改善的功能的第一ISVD。在一个实施方案中，如本文所例示的(参见实施例6)，包含本发明技术的ISVD的本发明技术的多特异性多价多肽能够激活人和/或非人灵长类动物T细胞，从而以与其中第一ISVD被T0170056G05的ISVD(即SEQ ID NO:1的ISVD)替代的相同多肽相比改善的EC50值裂解靶细胞。
在一个实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽导致人T细胞以比其中所述第一ISVD被SEQ ID NO:1的ISVD替代的相同多肽更低的EC50值裂解所述靶细胞，所述EC50值是如在T细胞介导的杀伤测定中测定的。例如，EC50是如实施例部分所述来确定的。
在一个实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽导致非人灵长类动物T细胞以比其中所述第一ISVD被SEQ ID NO:1的ISVD替代的相同多肽更低的EC50值裂解所述靶细胞，所述EC50值是如在T细胞介导的杀伤测定中测定的。例如，EC50是如实施例部分所述来确定的。
在一个实施方案中，如本文所述的包含本发明技术的第一ISVD的多特异性多价多肽与其中所述第一ISVD被SEQ ID NO:1的ISVD替代的相同多肽(即包含作为第一ISVD和具有T0170056G05的CDR序列的ISVD的多肽)相比显示出改善的与人和/或非人灵长类动物TCR的恒定结构域的结合。
本发明技术的多特异性多价多肽的结合特征在下文更详细地讨论(第5.4节；“特异性”)。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽关于结合人TCR具有选自至少约103M-1s-1、至少约104M-1s-1、和至少约105M-1s-1的结合速率常数(kon)。
在一些实施方案中，如本文所述的多特异性多价多肽关于结合非人灵长类动物TCR具有选自至少约103M-1s-1、至少约104M-1s-1、至少约105M-1s-1和至少约106M-1s-1的kon。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽关于结合人TCR具有选自至多约10-2s-1、至多约10-3s-1和至多约10-4s-1的解离速率常数(koff)。
在一些实施方案中，如本文所述的多特异性多价多肽关于结合非人灵长类动物TCR具有选自至多约10-1s-1、至多约10-2s-1、至多约10-3s-1和至多约10-4s-1的koff。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽关于结合人TCR具有选自至多约10-6M、至多约10-7M、至多约10-8M和至多约10-9M的亲和力(KD)。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽关于结合非人灵长类动物TCR具有选自至多约10-6M、至多约10-7M和至多约10-8M的KD。
在一个实施方案中，kon、koff或KD是通过表面等离子体共振(SPR)来测量的。例如，kon、koff或KD是如实施例部分所述来确定的。在另一个实施方案中，kon、koff或KD是通过生物层干涉测量法(BLI)来测量的。
在一个实施方案中，与包含SEQ ID NO:1的T0170056G05的CDR序列(即SEQ ID NO:153的CDR1，SEQ ID NO:209的CDR2，以及SEQ ID NO:223的CDR3)的相应ISVD相比，特异性结合TCR的恒定结构域的并且在本发明技术的多肽中包含的本发明技术的ISVD具有改善的结合特征。作为结果并且如本文所例示的，在一个实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽显示出改善的与人和/或非人灵长类动物TCR的恒定结构域的结合。
在一个实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽与其中所述第一ISVD被SEQID NO:1的ISVD替代的相同多肽相比以更低的KD结合人TCR。在一个实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽与其中所述第一ISVD被SEQ ID NO:1的ISVD替代的相同多肽相比以更低的KD结合非人灵长类动物TCR。
应理解(如实施例部分中也展示的)，结合TCR的第一ISVD和结合靶细胞上的抗原的第二ISVD可以以任何顺序位于本发明技术的多肽中。在这方面，术语“第一ISVD”、“第二ISVD”、“第三ISVD”等并不指示ISVD彼此的相对位置。也不排除多肽中可存在其他结合单元/构建块，如与靶细胞上的其他抗原结合或与另一靶标结合的其他ISVD。此外，不排除可以在其间放置其他结合单元/构建块(如ISVD)的可能性。例如，如下文进一步描述的(具体参见，下文第5.5节“(体内)半衰期延长”)，所述多肽还可以包含甚至可被定位在例如所述“第一ISVD”与“第二ISVD”之间的另一个与人血清白蛋白结合的ISVD。
如实施例6和7中所述，诸位发明人出人意料地发现，对于在C末端或N末端位置包含ISVD T017000624的两种多特异性多肽，可以观察到在T细胞介导的杀伤测定中改善的效力，以及与人和非人灵长类动物TCR结合的改善的交叉反应性。
因此，在一个实施方案中，结合TCR的第一ISVD位于结合靶细胞上的抗原的第二ISVD的N末端。在另一个实施方案中，所述第一ISVD位于所述多肽的N末端。在另一个实施方案中，结合TCR的第一ISVD位于结合靶细胞上的抗原的第二ISVD的C末端。在一个具体实施方案中，所述第一ISVD位于所述多肽的C末端。在另一个具体实施方案中，所述第一ISVD不是位于所述多肽的C末端。
在一个实施方案中，本发明技术的多肽包含至少第一、至少第二和至少第三ISVD，其中所述至少第一ISVD特异性结合T细胞受体(TCR)的恒定结构域，所述至少第二ISVD特异性结合靶细胞上的第一抗原，并且所述至少第三ISVD特异性结合靶细胞上的第二抗原。通过同时靶向多种肿瘤相关抗原，可以改善T细胞接合多肽的治疗活性。在一个实施方案中，所述第二抗原不同于所述第一抗原。在另一个实施方案中，所述第二抗原与所述第一抗原相同。
在本发明技术的这种多特异性多价多肽中，包含特异性结合TCR恒定结构域的至少第一ISVD、以及特异性结合相同抗原的至少第二和第三ISVD，所述至少第二和第三ISVD可以结合相同或不同的抗原表位。在一个实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽的第二ISVD和第三ISVD结合抗原的相同表位。在另一个实施方案中，所述第二ISVD和所述第三ISVD因此结合抗原的不同表位。结合单个抗原上的多个表位可以增加与抗原结合的亲和力(亲合力效应)，尤其是在不同的ISVD能够同时结合不同的表位时。在一个具体实施方案中，所述第二ISVD和所述第三ISVD能够同时结合相同抗原分子上的两个不同表位。
应理解(如实施例部分中也展示的)结合TCR的ISVD和结合靶细胞上的第一和第二抗原的ISVD可以以任何顺序位于本发明技术的多特异性多价多肽中。
更特定地，在一个实施方案中，特异性结合TCR的第一ISVD位于第二ISVD和第三ISVD的N末端。在一个具体实施方案中，所述第一ISVD位于所述多肽的N末端。在另一个具体实施方案中，特异性结合TCR的第一ISVD位于N末端，特异性结合靶细胞上的第二抗原的ISVD位于中间，以及特异性结合靶细胞上的第一抗原的ISVD位于C末端。在又另一个具体实施方案中，特异性结合TCR的第一ISVD位于N末端，特异性结合靶细胞上的第一抗原的ISVD位于中间，以及特异性结合靶细胞上的第二抗原的ISVD位于C末端。
在另一个实施方案中，特异性结合TCR的第一ISVD位于所述第二ISVD和第三ISVD的C末端。在一个具体实施方案中，所述第一ISVD位于所述多肽的C末端。在另一个具体实施方案中，特异性结合TCR的第一ISVD位于C末端，特异性结合靶细胞上的第二抗原的ISVD位于中间，以及特异性结合靶细胞上的第一抗原的ISVD位于N末端。在又另一个具体实施方案中，特异性结合TCR的第一ISVD位于C末端，特异性结合靶细胞上的第一抗原的ISVD位于中间，以及特异性结合靶细胞上的第二抗原的ISVD位于N末端。
在又另一个实施方案中，特异性结合TCR的第一ISVD位于第二ISVD与第三ISVD之间。在一个具体实施方案中，特异性结合TCR的第一ISVD位于中间，特异性结合靶细胞上的第二抗原的ISVD位于N末端，以及特异性结合靶细胞上的第一抗原的ISVD位于C末端。在又另一个具体实施方案中，特异性结合TCR的第一ISVD位于中间，特异性结合靶细胞上的第一抗原的ISVD位于N末端，以及特异性结合靶细胞上的第二抗原的ISVD位于C末端。
再者，不排除多肽中可存在其他结合单元/构建块，如与靶细胞上的其他抗原结合或与另一靶标结合的其他ISVD。此外，不排除在其间放置其他结合单元/构建块(如ISVD)的可能性。例如，如下文进一步描述的(具体参见，下文第5.5节“(体内)半衰期延长”)，所述多肽还可以包含甚至可被定位在例如所述“第一ISVD”与“第二ISVD”之间、“第一ISVD”与“第三ISVD”之间、或“第二ISVD”与“第三ISVD”之间的另一个与人血清白蛋白特异性结合的ISVD。
本发明技术的多肽的第二ISVD特异性结合靶细胞(优选癌细胞)上的抗原。如本文所提及的“靶细胞”是在其表面上呈递特定抗原的细胞。在一个实施方案中，“靶细胞”是癌细胞。
膜(也称为质膜或磷脂双层)围绕细胞的胞质，是细胞的外边界，即膜是细胞的表面。该膜用于将细胞与其周围环境分离并保护细胞免受周围环境的影响，并且主要由磷脂双层构成。嵌入该膜内的是各种蛋白质分子，如通道、泵和细胞受体。由于膜是流体，蛋白质分子可以在膜内移动。如本文所用，术语“靶细胞上的抗原”表示在细胞表面上展示的分子。在大多数情况下，该分子将位于细胞的质膜中或细胞的质膜上，以使该分子的至少一部分保持以三级形式可从细胞外可及。位于质膜中的细胞表面分子的非限制性例子是跨膜蛋白，所述跨膜蛋白在其三级构象中包含亲水性和疏水性区域。在这里，至少一个疏水性区域允许细胞表面分子嵌入或插入细胞的疏水性质膜中，而亲水性区域在质膜的任一侧分别延伸到胞质和胞外间隙中。
所述抗原可以是细胞上的任何靶标，例如肿瘤抗原。在一个实施方案中，所述抗原是所述靶细胞(例如癌细胞)特有的，如所述癌细胞上的肿瘤相关抗原(TAA)。
如本文所用，术语“肿瘤抗原”可以理解为呈递在肿瘤细胞上的那些抗原。这些抗原可以以胞外部分呈递在细胞表面，所述胞外部分与通常与该分子的跨膜和胞质部分组合。这些抗原有时只可由肿瘤细胞呈递，而不可由正常或健康细胞呈递。肿瘤抗原可以仅在肿瘤细胞上表达，或者可能代表与正常细胞相比的肿瘤特异性突变。在这种情况下，它们被称为肿瘤特异性抗原。但是，通常情况并非如此。更常见的是由肿瘤细胞和正常细胞呈递的抗原，并且它们被称为“肿瘤相关抗原(TAA)”。与正常细胞相比，这些肿瘤相关抗原可以在肿瘤细胞上过表达，或者与正常组织相比，肿瘤组织的结构不太紧凑，因此更容易在肿瘤细胞中与抗体结合。TAA优选是在特定肿瘤细胞上表达但优选不在正常细胞中表达的抗原。通常，TAA是仅在生物发育的特定点(如胎儿发育期间)在细胞中正常表达并且在当前发育点在生物中不适当表达的抗原，或者是在现在表达抗原的器官的正常组织或细胞中不表达的抗原。
在一个实施方案中，所述抗原在癌细胞上比在正常细胞上更丰富地存在。靶细胞上的抗原优选是肿瘤相关抗原(TAA)。
在一个实施方案中，靶细胞上的所述第一抗原是肿瘤抗原，优选肿瘤相关抗原(TAA)。
在一个实施方案中，靶细胞上的所述第二抗原是肿瘤抗原，优选肿瘤相关抗原(TAA)。
在一个实施方案中，所述第一抗原和所述第二抗原存在于相同的靶细胞上。在另一个实施方案中，所述第一抗原和所述第二抗原存在于不同的靶细胞上。
设想的TAA包括MART-1、癌胚抗原(“CEA”)、gp100、MAGE-1、HER-2、CD20、路易斯Y抗原、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞激活蛋白(FAP)和CD19。
与正常造血干细胞相比，在AML LSC上优先表达并因此被视为TAA的细胞表面抗原包括CD123、CD44、CLL-1、CD96、CD47、CD32、CXCR4、Tim-3和CD25。
适合作为靶细胞上的抗原以通过本发明技术的多肽内的第二ISVD结合的其他肿瘤相关抗原包括：TAG-72、Ep-CAM、PSMA、PSA、糖脂类(如GD2和GD3)。
由本发明技术的多肽的第二ISVD结合的TAA还包括造血分化抗原，即通常与簇分化(CD)分组相关的糖蛋白，如CD4、CD5、CD19、CD20、CD22、CD36、CD45、CD52、CD69和CD147；生长因子受体，包括HER2、ErbB3和ErbB4；细胞因子受体，包括白介素-2受体γ链(CD132抗原)、白介素-10受体α链(IL-10R-A)、白介素-10受体β链(IL-10R-B)、白介素-12受体β-1链(IL-12R-β1)、白介素-12受体β-2链(IL-12受体β-2)、白介素-13受体α-1链(IL-13R-α-1)(CD213a1抗原)、白介素-13受体α-2链(白介素-13结合蛋白)、白介素-17受体(IL-17受体)、白介素-17B受体(IL-17B受体)、白介素21受体前体(IL-21R)、白介素-1受体I型(IL-1R-1)(CD121a)、白介素-1受体II型(IL-1R-β)(CDw121b)、白介素-1受体拮抗蛋白(IL-1ra)、白介素-2受体α链(CD25抗原)、白介素-2受体β链(CD122抗原)、白介素-3受体α链(IL-3R-α)(CD123抗原)；以及其他，如CD30、IL23R、IGF-1R、IL5R、IgE、CD248(内皮唾液酸蛋白)、CD44v6、gpA33、Ron、Trop2、PSCA、密封蛋白6、密封蛋白18.2、CLEC12A、CD38、ephA2、c-Met、CD56、MUC16、EGFRvIII、AGS-16、CD27L、连接蛋白-4、SLITRK6、间皮素、叶酸受体、组织因子、axl、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、CA9、Cripto、CD138、CD37、MUC1、CD70、胃泌素释放肽受体、PAP、CEACAM5、CEACAM6、CXCR7、N-钙粘素、FXYD2γa、CD21、CD133、Na/K-ATPase、mIgM(膜结合IgM)、mIgA(膜结合IgA)、Mer、Tyro2、CD120、CD95、CA 195、DR5、DR6、DcR3和CAIX。
因此，本发明技术涉及如本文所述的多肽，其中所述一种或多种TAA(独立地)选自黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、MART-1、癌胚抗原(“CEA”)、gp100、MAGE-1、HER-2、路易斯Y抗原、CD123、CD44、CLL-1、CD96、CD47、CD32、CXCR4、Tim-3、CD25、TAG-72、Ep-CAM、PSMA、PSA、GD2、GD3、CD4、CD5、CD19、CD20、CD22、CD36、CD45、CD52、CD147；生长因子受体，包括ErbB3和ErbB4；细胞因子受体，包括白介素-2受体γ链(CD132抗原)、白介素-10受体α链(IL-10R-A)、白介素-10受体β链(IL-10R-B)、白介素-12受体β-1链(IL-12R-β1)、白介素-12受体β-2链(IL-12受体β-2)、白介素-13受体α-1链(IL-13R-α-1)(CD213a1抗原)、白介素-13受体α-2链(白介素-13结合蛋白)、白介素-17受体(IL-17受体)、白介素-17B受体(IL-17B受体)、白介素21受体前体(IL-21R)、白介素-1受体I型(IL-1R-1)(CD121a)、白介素-1受体II型(IL-1R-β)(CDw121b)、白介素-1受体拮抗蛋白(IL-1ra)、白介素-2受体α链(CD25抗原)、白介素-2受体β链(CD122抗原)、白介素-3受体α链(IL-3R-α)(CD123抗原)；CD30、IL23R、IGF-1R、IL5R、IgE、CD248(内皮唾液酸蛋白)、CD44v6、gpA33、Ron、Trop2、PSCA、密封蛋白6、密封蛋白18.2、CLEC12A、CD38、ephA2、c-Met、CD56、MUC16、EGFRvIII、AGS-16、CD27L、连接蛋白-4、SLITRK6、间皮素、叶酸受体、组织因子、axl、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、CA9、Cripto、CD138、CD37、MUC1、CD70、胃泌素释放肽受体、PAP、CEACAM5、CEACAM6、CXCR7、N-钙粘素、FXYD2γa、CD21、CD133、Na/K-ATPase、mIgM(膜结合IgM)、mIgA(膜结合IgA)、Mer、Tyro2、CD120、CD95、CA 195、DR5、DR6、DcR3和CAIX、以及相关多态变体和同种型，优选所述TAA是CD20(UniProt 11836)、HER2(Uniprot P04626)、EGFR或CEACAM、其多态变体和/或同种型。
在一个实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含特异性结合CD123或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的第二ISVD。
实施例6中提供了本发明技术的特定多特异性多价多肽，其包含特异性结合CD123的第二ISVD。它们的表征描述于实施例7中。因此，在一个具体实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含选自SEQ ID NO:46至50、147、150至152、261和262的第一ISVD，并且第二ISVD是SEQ ID NO:263的氨基酸序列。在更具体的实施方案中，所述第一ISVD选自SEQ IDNO:46、150至152、261和262，并且所述第二ISVD由SEQ ID NO:263的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，所述多特异性多价多肽选自SEQ ID NO:275和276的氨基酸序列的组。
在另一个实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽包含特异性结合CD123或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的第二ISVD和第三ISVD。
实施例12中提供了本发明技术的特定多特异性多价多肽，其包含特异性结合CD123的第二ISVD和第三ISVD。它们的表征描述于实施例13和14中。因此，在一个具体实施方案中，本发明技术涉及多特异性多价多肽，其包含选自SEQ ID NO:46、150至152、261和262的第一ISVD，具有SEQ ID NO:263的氨基酸序列的第二ISVD，以及由SEQ ID NO:265的氨基酸序列组成的第三ISVD。在一个实施方案中，所述多特异性多价多肽选自SEQ ID NO:283、284、288、289和290的氨基酸序列的组。
本发明技术的多肽中的第二构建块或ISVD对其抗原具有高亲和力。例如，第二构建块或ISVD可以针对靶细胞上所述抗原的抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象(如果适用)。
本发明技术的靶细胞特别涉及哺乳动物细胞，优选灵长类动物细胞，并且甚至更优选人细胞。靶细胞优选是过度增殖性细胞，例如癌细胞。
在一个实施方案中，本发明技术提供了包含上述多特异性多价多肽和一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元的多肽，所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为所述多肽提供了增加的半衰期，如下文详细描述的(第5.5节；“(体内)半衰期延长”)。在一个实施方案中，为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是可以结合人血清白蛋白的ISVD。
在本发明技术的多肽中，两个或更多个ISVD以及任选的为所述多肽提供增加的半衰期的一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元，可以彼此直接连接(如例如在WO 99/23221中所述)和/或可以经由一个或多个合适的间隔物或接头或其任何组合彼此连接。在一个实施方案中，本发明技术的多肽的ISVD部分彼此直接连接或经由接头连接。
用于多价多特异性多肽中的合适的间隔物或接头对技术人员来说是清楚的，并且通常可以是本领域中用于连接氨基酸序列的任何接头或间隔物。优选地，所述接头或间隔物适合用于构建旨在用于药物用途的蛋白质或多肽。
一些特别优选的间隔物包括本领域中用于连接抗体片段或抗体结构域的间隔物和接头。这些包括上文引用的一般背景技术中提及的接头，以及例如在本领域中用于构建双抗体或ScFv片段的接头(然而，在这方面，应注意，在双抗体和ScFv片段中，所使用的接头序列应具有使相关的VH和VL结构域聚集在一起形成完整抗原结合位点的一定长度、一定的柔性程度和其他特性，对本发明技术的多肽中使用的接头的长度或柔性没有特别限制，因为每个ISVD本身形成一个完整的抗原结合位点)。
例如，接头可以是合适的氨基酸序列，并且特别是具有1个与50个之间，优选1个与30个之间，如1个与10个之间的氨基酸残基的氨基酸序列。表A-5中示出示例性肽接头。接头可以是铰链样区域，如天然存在的重链抗体的铰链区或类似序列(如在WO 94/04678中所述)。一类常用的肽接头称为“Gly-Ser”或“GS”接头。这些是基本上由甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基组成的接头，并且通常包含肽基序的一个或多个重复，所述肽基序如GGGGS(SEQ IDNO:323)基序(例如，具有式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n可以是1、2、3、4、5、6、7或更大)。此类GS接头的一些经常使用的例子是9GS接头(GGGGSGGGS，SEQ ID NO:326)、15GS接头(n＝3)和35GS接头(n＝7)。参见例如Chen等人,Adv.Drug Deliv.Rev.2013年10月15日；65(10):1357–1369；和Klein等人,Protein Eng.Des.Sel.(2014)27(10):325-330。
其他合适的接头通常包括有机化合物或聚合物，特别是适合用于药物用途的蛋白质中的那些。例如，聚(乙二醇)部分用于连接抗体结构域，参见例如WO 04/081026。
涵盖在本发明技术的范围内的是，所使用的一个或多个接头的长度、柔性程度和/或其他特性(但不是关键的，因为它通常用于在ScFv片段中使用的接头)可能对本发明技术的最终多肽的特性具有某些影响，所述最终多肽的特性包括但不限于对TCR或一种或多种其他抗原的亲和力、特异性或亲合力。基于本文的公开内容，技术人员将能够任选地在一些有限的常规实验之后确定用于本发明技术的具体多肽中的一个或多个最佳接头。
例如，在包含针对第一和第二靶标的构建块或ISVD的本发明技术的多价多特异性多肽中，接头的长度和柔性优选使其允许所述多肽中存在的每个构建块或ISVD结合其同源靶标(例如每个靶标上的抗原决定簇)。同样，基于本文的公开内容，技术人员将能够任选地在一些有限的常规实验之后确定用于本发明技术的具体多肽中的一个或多个最佳接头。
以下也在本发明技术的范围内：使用的一个或多个接头赋予本发明技术的多肽一种或多种其他有利的特性或功能，和/或提供一个或多个用于形成衍生物和/或用于附接官能团的位点(例如，如本文针对本发明技术的ISVD或多肽的衍生物所描述的)。例如，含有一个或多个带电氨基酸残基的接头可以提供改善的亲水特性，而形成或含有小表位或标签的接头可以用于检测、鉴定和/或纯化的目的。同样，基于本文的公开内容，技术人员将能够任选地在一些有限的常规实验之后确定用于本发明技术的具体多肽中的最佳接头。
最后，当在本发明技术的多肽中使用两个或更多个接头时，这些接头可以相同或不同。同样，基于本文的公开内容，技术人员将能够任选地在一些有限的常规实验之后确定用于本发明技术的具体多肽中的最佳接头。
因此，本发明技术涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISVD和/或所述第二ISVD和/或可能的所述第三ISVD和/或可能的结合(人)血清白蛋白的所述第四ISVD经由接头连接。
在一个实施方案中，所述接头选自3A、5GS、7GS、8GS、9GS、10GS、15GS、18GS、20GS、25GS、30GS、35GS、40GS、G1铰链、9GS-G1铰链、美洲驼上长铰链区、和G3铰链(SEQ ID NO:322至338)的接头。
优选地，本发明技术的多特异性多价多肽展现出与人血清中预先存在的抗体降低的结合。为此，在一个实施方案中，所述多肽在至少一个ISVD中，但优选地在每个ISVD中具有氨基酸位置11处的缬氨酸(V)以及氨基酸位置89处的亮氨酸(L)、丙氨酸(A)或苏氨酸(T)(根据Kabat编号)。在一个具体实施方案中，特异性结合TCR恒定结构域的本发明技术的第一ISVD具有氨基酸位置11处的缬氨酸(V)以及氨基酸位置89处的亮氨酸(L)(根据Kabat编号)。在另一个具体实施方案中，特异性结合TCR恒定结构域的本发明技术的第一ISVD具有氨基酸位置11处的缬氨酸(V)以及氨基酸位置89处的丙氨酸(A)(根据Kabat编号)。
在另一个实施方案中，本发明技术的多肽包含C末端延伸(X)n，其中n是1至5，如1、2、3、4或5，并且其中X是天然存在的氨基酸，优选无半胱氨酸。在一个实施方案中，所述多肽在C末端ISVD的C末端具有1至5个(优选天然存在的)氨基酸的延伸，如单个丙氨酸(A)延伸。ISVD的C末端通常是VTVSS(SEQ ID NO:339)。在另一个实施方案中，所述多肽在至少一个ISVD中具有位置110处的赖氨酸(K)或谷氨酰胺(Q)(根据Kabat编号)。在另一个实施方案中，所述ISVD在至少一个ISVD中具有位置112处的赖氨酸(K)或谷氨酰胺(Q)(根据Kabat编号)。在这些实施方案中，所述ISVD的C末端是VKVSS(SEQ ID NO:340)、VQVSS(SEQ ID NO:341)、VTVKS(SEQ ID NO:342)、VTVQS(SEQ ID NO:343)、VKVKS(SEQ ID NO:344)、VKVQS(SEQID NO:345)、VQVKS(SEQ ID NO:346)、或VQVQS(SEQ ID NO:347)，使得在添加单个丙氨酸后，所述多肽的C末端例如具有序列VTVSSA(SEQ ID NO:348)、VKVSSA(SEQ ID NO:349)、VQVSSA(SEQ ID NO:350)、VTVKSA(SEQ ID NO:351)、VTVQSA(SEQ ID NO:352)、VKVKSA(SEQID NO:353)、VKVQSA(SEQ ID NO:354)、VQVKSA(SEQ ID NO:355)、或VQVQSA(SEQ ID NO:356)，优选VTVSSA。在另一个实施方案中，所述多肽在每个ISVD中具有氨基酸位置11处的缬氨酸(V)和氨基酸位置89处的亮氨酸(L)(根据Kabat编号)，任选地在至少一个ISVD中具有位置110处的赖氨酸(K)或谷氨酰胺(Q)(根据Kabat编号)，并且在C末端ISVD的C末端具有1至5个(优选天然存在的)氨基酸的延伸，如单个丙氨酸(A)延伸(使得所述多肽的C末端例如具有序列VTVSSA、VKVSSA或VQVSSA，优选VTVSSA)。关于这一方面的更多信息，参见例如WO2012/175741和WO 2015/173325。
5.3免疫球蛋白单可变结构域
术语“免疫球蛋白单可变结构域”(ISVD)可与“单可变结构域”互换使用，定义了其中抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域上并由其形成的免疫球蛋白分子。这使免疫球蛋白单可变结构域与“常规”免疫球蛋白(例如单克隆抗体)或其片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、二scFv)区分开来，其中两个免疫球蛋白结构域、特别是两个可变结构域相互作用形成抗原结合位点。通常，在常规的免疫球蛋白中，重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)相互作用形成抗原结合位点。在这种情况下，VH和VL二者的互补决定区(CDR)将促成抗原结合位点，即总共6个CDR将参与抗原结合位点的形成。
鉴于以上定义，常规4链抗体(如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；本领域已知的)的抗原结合结构域或者源自这种常规4链抗体的Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段(如二硫化物连接的Fv或scFv片段)或双抗体(本领域中全部已知的)将通常不被视为免疫球蛋白单可变结构域，因为在这些情况下，不是一个(单个)免疫球蛋白结构域发生与相应抗原表位的结合，而是一对(缔合的)免疫球蛋白结构域(如轻链和重链可变结构域)即免疫球蛋白结构域的VH-VL对发生与相应抗原表位的结合，其共同地与相应抗原表位结合。
相比之下，免疫球蛋白单可变结构域能够在不与另外的免疫球蛋白可变结构域配对的情况下与抗原表位特异性地结合。免疫球蛋白单可变结构域的结合位点由单个VH、单个VHH或单个VL结构域形成。
因此，所述单可变结构域可以是轻链可变结构域序列(例如，VL序列)或其合适的片段；或者重链可变结构域序列(例如，VH序列或VHH序列)或其合适的片段；只要它能够形成单个抗原结合单元(即，基本上由单可变结构域组成的功能性抗原结合单元，使得单个抗原结合结构域不需要与另一个可变结构域相互作用以形成功能性抗原结合单元)。
免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)可以是例如重链ISVD，如VH、VHH，包括驼源化VH或人源化VHH。优选地，其是VHH，包括驼源化VH或人源化VHH。重链ISVD可以源自常规四链抗体或重链抗体。
例如，免疫球蛋白单可变结构域可以是单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列)、“dAb”或dAb(或适合用作dAb的氨基酸序列)；其他单可变结构域，或其任一种的任何合适片段。
特别地，免疫球蛋白单可变结构域可以是免疫球蛋白单可变结构域(如VHH，包括人源化VHH或驼源化VH)或其合适片段。/>和是Ablynx N.V.的注册商标。
“VHH结构域”也称为VHH、VHH抗体片段和VHH抗体，最初已被描述为“重链抗体”的(即“无轻链抗体”的；Hamers-Casterman等人Nature 363:446-448,1993)抗原结合免疫球蛋白可变结构域。已选择术语“VHH结构域”以将这些可变结构域与常规4链抗体中存在的重链可变结构域(其在本文中称为“VH结构域”)以及与常规4链抗体中存在的轻链可变结构域(其在本文中称为“VL结构域”)区分开来。有关VHH的另外描述请参见Muyldermans的综述文章(综述，Molecular Biotechnology 74:277-302,2001)。
通常，免疫球蛋白的生成涉及对实验动物的免疫、免疫球蛋白产生细胞的融合以产生杂交瘤、以及筛选所需的特异性。可替代地，可以通过筛选天然或合成文库(例如通过噬菌体展示)生成免疫球蛋白。
免疫球蛋白序列的生成已经在各种出版物(其中WO 94/04678、Hamers-Casterman等人1993和Muyldermans等人2001可以作为例示)中被广泛地描述。在这些方法中，用靶抗原免疫骆驼科动物以诱导针对所述靶抗原的免疫应答。将从所述免疫获得的VHH库针对结合所述靶抗原的VHH进行进一步筛选。
在这些情况下，抗体的生成需要纯化的抗原用于免疫和/或筛选。可以从天然来源或在重组产生过程中纯化抗原。
免疫球蛋白序列的免疫和/或筛选可以使用此类抗原的肽片段进行。
本发明技术可以使用不同来源的免疫球蛋白序列，包括小鼠、大鼠、兔、驴、人和骆驼科动物免疫球蛋白序列。本发明技术还包括完全人、人源化或嵌合序列。例如，本发明技术包括骆驼科动物免疫球蛋白序列和人源化骆驼科动物免疫球蛋白序列或驼源化结构域抗体，例如Ward等人(参见例如WO 94/04678和Davies和Riechmann(1994和1996))所述的驼源化dAb。此外，本发明技术还使用融合的免疫球蛋白序列，例如从而形成多价和/或多特异性构建体(对于含有一个或多个VHH结构域的多价和多特异性多肽及其制备，还参见Conrath等人,J.Biol.Chem.,第276卷,10.7346-7350,2001，以及参见例如WO 96/34103和WO 99/23221)；以及可从本发明技术的免疫球蛋白序列衍生的包含标签或其他功能性部分(例如毒素、标记、放射性化学物质等)的免疫球蛋白序列。
“人源化VHH”包含与天然存在的VHH结构域的氨基酸序列对应但是已经被“人源化”的氨基酸序列，即通过将所述天然存在的VHH序列(并且特别是框架序列)的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基用来自人类的常规4链抗体(例如，上文所示)的VH结构域中的一个或多个相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基替代而人源化。这能以本身已知的方式进行，这对于本领域技术人员来说是清楚的，例如基于本文的进一步描述和现有技术(例如WO2008/020079)。此外，应注意，可以以任何本身已知的合适方式获得此类人源化VHH，并因此并不严格限于已经使用包含天然存在的VHH结构域作为起始材料的多肽获得的多肽。
“驼源化VH”包含与天然存在的VH结构域的氨基酸序列对应但是已经被“驼源化”的氨基酸序列，即通过将来自常规4链抗体的天然存在的VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基用重链抗体的VHH结构域中的一个或多个相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基替代而驼源化。这能以本身已知的方式进行，这对于本领域技术人员来说是清楚的，例如基于本文的进一步描述和现有技术(例如WO 2008/020079)。如本文所定义，此类“驼源化”取代优选地在VH-VL接合处形成和/或存在的氨基酸位置处插入和/或在所谓的骆驼科动物标志残基处插入，如本文所定义(参见例如WO 94/04678和Davies和Riechmann(1994和1996)，同上)。优选地，用作用于生成或设计驼源化VH的起始材料或起点的VH序列优选地是来自哺乳动物的VH序列，更优选人的VH序列，如VH3序列。然而应注意，可以以任何本身已知的合适方式获得此类驼源化VH，并因此并不严格限于已经使用包含天然存在的VH结构域作为起始材料的多肽获得的多肽。
应注意，一个或多个免疫球蛋白序列可以彼此连接和/或与其他氨基酸序列连接(例如经由二硫桥)，以提供也可以用于本发明技术的肽构建体(例如Fab'片段、F(ab')2片段、scFv构建体、“双抗体”和其他多特异性构建体)。例如，参考Holliger和Hudson的综述,Nat Biotechnol.2005年9月；23(9):1126-36。通常，在多肽旨在用于施用至受试者(例如用于预防性、治疗性和/或诊断性目的)时，其优选地包含在所述受试者中并非天然存在的免疫球蛋白序列。
免疫球蛋白单可变结构域序列的优选结构可以认为是由四个框架区(“FR”)构成，其在本领域和本文中分别称为“框架区1”(“FR1”)、“框架区2”(“FR2”)、“框架区3”(“FR3”)和“框架区4”(“FR4”)，所述框架区被三个互补决定区(“CDR”)打断，所述三个互补决定区在本领域和本文中分别称为“互补决定区1”(“CDR1”)、“互补决定区2”(“CDR2”)和“互补决定区3”(“CDR3”)。
如WO 08/020079的第58页和第59页的段落q)中进一步描述的，免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸残基可以根据由Kabat等人(“Sequence of proteins of immunologicalinterest”,US Public Health Services,NIH贝塞斯达,马里兰州,出版号91)给出的用于VH结构域的通用编号来编号，如在Riechmann和Muyldermans,2000(J.Immunol.Methods240(1-2):185-195；参见例如该出版物的图2)的文章中应用于来自骆驼科动物的VHH结构域。应注意，如本领域中对于VH结构域和VHH结构域所熟知的，每个CDR中氨基酸残基的总数可以变化，并且可以不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(也就是说，根据Kabat编号的一个或多个位置可能不会在实际序列中被占用，或者实际序列可能含有比Kabat编号所允许的数量更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，根据Kabat的编号可以对应于或可以不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。VH结构域和VHH结构域中的氨基酸残基总数通常在110至120，常常在112与115之间的范围内。然而应注意，较小和较长的序列也可能适合于本文中描述的目的。
在本申请中，CDR序列是根据Kontermann和Dübel(编辑2010,AntibodyEngineering,第2卷,Springer Verlag Heidelberg Berlin,Martin，第3章，第33-51页)中描述的AbM定义来确定的。根据此方法，FR1包含位置1-25处的氨基酸残基，CDR1包含位置26-35处的氨基酸残基，FR2包含位置36-49处的氨基酸，CDR2包含位置50-58处的氨基酸残基，FR3包含位置59-94处的氨基酸残基，CDR3包含位置95-102处的氨基酸残基，并且FR4包含位置103-113处的氨基酸残基。
在这种免疫球蛋白序列中，所述框架序列可以是任何合适的框架序列，并且例如基于标准手册以及本文中提及的另外的披露内容和现有技术，合适的框架序列的例子对于技术人员将是清楚的。
所述框架序列是免疫球蛋白框架序列或例如通过人源化或驼源化衍生自免疫球蛋白框架序列的框架序列的合适组合。例如，所述框架序列可以是源自轻链可变结构域(例如VL序列)和/或重链可变结构域(例如VH序列或VHH序列)的框架序列。在一方面，所述框架序列是已源自VHH序列的框架序列(其中所述框架序列可以任选地已部分或完全人源化)或已驼源化的常规VH序列(如本文所定义)。
特别地，本发明技术中使用的ISVD序列中存在的框架序列可以含有一个或多个标志残基(如本文所定义)，以使得ISVD序列是VHH，包括人源化VHH或驼源化VH。此类框架序列的合适组合的一些非限制性例子将从本文的进一步公开中变得清楚。
同样，如本文针对免疫球蛋白序列的一般描述，也可以使用任何前述的合适片段或片段的组合，诸如含有一个或多个CDR序列的片段，其适当地侧接一个或多个框架序列和/或经由一个或多个框架序列连接；例如，以与这些CDR和框架序列相同的顺序可以出现在衍生所述片段的全尺寸免疫球蛋白序列中。
然而应注意，本发明技术在ISVD序列(或用于表达它的核苷酸序列)的来源方面不受限制，在生成或获得(或已经生成或获得)ISVD序列或核苷酸序列的方式方面也不受限制。因此，所述ISVD序列可以是天然存在的序列(来自任何合适的物种)或合成或半合成序列。在特定但非限制性的方面，所述ISVD序列是天然存在的序列(来自任何合适的物种)或合成或半合成序列，包括但不限于“人源化”(如本文所定义)免疫球蛋白序列(如部分或完全人源化小鼠或兔免疫球蛋白序列，并且特别是部分或完全人源化VHH序列)，“驼源化”(如本文所定义)免疫球蛋白序列，以及已经通过技术(如亲和力成熟(例如从合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列开始)、CDR移植、镶饰、组合源自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR组装、以及技术人员熟知的工程化免疫球蛋白序列的类似技术)获得的免疫球蛋白序列；或前述任何一种的任何合适组合。
类似地，核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或合成或半合成序列，并且可以例如是通过PCR从合适的天然存在的模板(例如，从细胞分离的DNA或RNA)分离的序列、已经从文库(并且特别是表达文库)分离的核苷酸序列、已经通过将突变引入天然存在的核苷酸序列中而制备(使用本身已知的任何合适技术，如错配PCR)的核苷酸序列、已经使用重叠引物通过PCR制备的核苷酸序列或已经使用本身已知的DNA合成技术制备的核苷酸序列。
如上所述，ISVD可以是或其合适片段。对于纳米抗体的一般性描述，参见下文的进一步描述以及本文引用的现有技术。然而在这一方面应注意，本说明书和现有技术主要描述了所谓的“VH3类”的纳米抗体(即与VH3类(如DP-47、DP-51或DP-29)的人种系序列具有高度序列同源性的纳米抗体)。然而应注意，本发明技术在其最广泛的意义上通常可以使用任何类型的纳米抗体，并且例如还使用属于所谓的“VH4类”的纳米抗体(即与VH4类(如DP-78)的人种系序列具有高度序列同源性的纳米抗体)，例如像WO 2007/118670中所述的。
通常，纳米抗体(特别是VHH序列，包括(部分)人源化VHH序列和驼源化VH序列)的特征可以在于一个或多个框架序列(再次如本文进一步所述)中的一个或多个“标志残基”(如本文所述)的存在。因此，通常可以将纳米抗体定义为具有以下(一般)结构的免疫球蛋白序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别是指框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3，并且其中标志残基中的一个或多个是如本文进一步所定义的。
特别地，纳米抗体可以是具有以下(一般)结构的免疫球蛋白序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别是指框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3，并且其中所述框架序列是如本文进一步所定义的。
更特别地，纳米抗体可以是具有以下(一般)结构的免疫球蛋白序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别是指框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3，并且其中：
根据Kabat编号，在位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108处的氨基酸残基中的一个或多个选自下表B-2中提及的标志残基。
表B-2：纳米抗体中的标志残基
本发明技术尤其使用可特异性结合存在于T细胞上的人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD。
在本发明技术的情境中，与特定靶分子“结合”在本领域中具有与在抗体及其相应抗原的情境中所理解的通常含义。
如上文详细描述的本发明技术的单价单特异性多肽(第5.2节：“单价单特异性多肽”)包含以下或(基本上)由以下组成：特异性结合T细胞上存在的人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD。如上文详细描述的本发明技术的多价多特异性多肽(第5.2节：“多特异性多价多肽”)包含特异性结合T细胞上存在的人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD，以及特异性结合靶细胞上的抗原的一个或多个ISVD。
在一个实施方案中，本发明技术的多肽中使用的ISVD特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域，基本上由4个框架区和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1的氨基酸序列是Xaa Xaa Val His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa(SEQ IDNO:295)，其中
位置1处的Xaa是Gly、Trp、Gln或Tyr，
位置2处的Xaa是Asp、Glu、Tyr、Ser或Ala，
位置5处的Xaa是Lys或Gln，
位置6处的Xaa是Ile或Leu，
位置7处的Xaa是Asn或Phe，
位置8处的Xaa是Phe、Val或Tyr，
位置9处的Xaa是Leu、Tyr或Phe，
位置10处的Xaa是Gly、Thr或Arg；
(ii)CDR2的氨基酸序列是Xaa Ile Ser Ile Xaa Asp Xaa Xaa Asp(SEQ ID NO:296)，其中
位置1处的Xaa是His或Val，
位置5处的Xaa是Gly或Ala，
位置7处的Xaa是Gln、Val或Glu，
位置8处的Xaa是Thr、Ser或Val；并且
(iii)CDR3的氨基酸序列是Xaa Ser Xaa Ile Xaa Pro Tyr Xaa Xaa(SEQ ID NO:297)，其中
位置1处的Xaa是Phe、Leu或Met，
位置3处的Xaa是Arg、Lys或Ser，
位置5处的Xaa是Tyr或Trp，
位置8处的Xaa是Asp或Gln，
位置9处的Xaa是Tyr或Trp，
其中CDR1的位置1、2、5、6、7、8、9和10处的Xaa不同时分别是Gly、Asp、Lys、Ile、Asn、Phe、Leu和Gly；
其中CDR2的位置1、5、7和8处的Xaa不同时分别是His、Gly、Gln和Thr；并且
其中CDR3的位置1、3、5、8和9处的Xaa不同时分别是Phe、Arg、Tyr、Asp和Tyr。
当在本发明技术的多肽中包含的第一ISVD被称为包含以下时：SEQ ID NO:295的CDR1，其中位置1、2、5、6、7、8、9和10处的Xaa不同时分别是Gly、Asp、Lys、Ile、Asn、Phe、Leu和Gly；SEQ ID NO:296的CDR2，其中位置1、5、7和8处的Xaa不同时分别是His、Gly、Gln和Thr；以及SEQ ID NO:297的CDR3，其中CDR3的位置1、3、5、8和9处的Xaa不同时分别是Phe、Arg、Tyr、Asp和Tyr；这意味着在所述第一ISVD中，CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ IDNO:153、209、223的氨基酸序列。
如本文进一步例示的，在CDR中的这些特定位置处引入这些特定氨基酸残基导致与ISVD T01700056G05的结合相比，ISVD与人和/或非人灵长类动物TCR的恒定结构域的改善的结合。诸位发明人已经修饰了ISVD T0170056G05的CDR，以获得与包含T0170056G05的未修饰CDR的相应ISVD相比具有改善的结合特征的ISVD。在一个特定实施方案中，在与包含SEQ ID NO:153的CDR1、SEQ ID NO:209的CDR2和SEQ ID NO:223的CDR3(即T0170056G05的CDR序列)的ISVD(如SEQ ID NO:2的ISVD)相比时，在本发明技术的多肽中含有的ISVD的CDR中的突变导致改善的与人和/或非人灵长类动物TCR的恒定结构域的结合。
T0170056G05先前在公开号为WO 2016180969A1的国际申请中开发和描述。基于CDR2和CDR3中的序列相似性和差异，该ISVD与103种其他ISVD聚簇，称为簇A。属于簇A的这些ISVD的氨基酸序列比对提供于WO 2016180969的表A-1中。这些簇A ISVD在其CDR1的位置5处均不具有Lys或Gln，同时在其CDR2的位置3处均不具有Ser以及在位置5处均不具有Gly或Ala。因此，与WO 2016180969中所述的序列相比，本发明技术的多肽中包含的ISVD是新颖的。
在本发明技术的多肽中包含的本发明技术的ISVD特异性结合T细胞上存在的人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域。
如本文所用，术语“TCR复合物”或“αβTCR-CD3复合物”是指在T细胞表面上呈递的T细胞受体复合物(参见Kuhns等人2006,Immunity 24:133-139)。TCR复合物由六个不同的I型单次跨膜蛋白构成：形成负责配体识别的TCR异二聚体的TCR-α和TCR-β链；以及非共价缔合的CD3γ、CD3δ、CD3ε和ζ链，它们带有胞质序列基序，这些基序在受体激活时被磷酸化并募集大量信号传导组分。T细胞受体的α链和β链均由恒定结构域和可变结构域组成。
来自人和食蟹猴(cyno)来源的CD3链的序列提供于表A-6中(对于人来源的CD3链为SEQ ID NO:300-303，以及对于食蟹猴来源的CD3链为SEQ ID NO:312至315)。人和食蟹猴来源的TCR-α/β恒定结构域的序列也提供于表A-6中(对于来自人和食蟹猴来源的TCRα的恒定结构域分别为SEQ ID NO:291和293；对于来自人和食蟹猴来源的TCRβ的恒定结构域分别为SEQ ID NO:292和294)。对于前述序列中的每一个，由UniProt或Genbank文件标识符表示的这些序列中的每一个的来源列出于表A-6中。内部测序证实最初源自恒河猴来源的氨基酸序列与来自食蟹猴来源的氨基酸序列相同。
在一个实施方案中，在本发明技术的多肽中包含的ISVD特异性结合活T细胞上存在的人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域。活T细胞是能够发挥诸如细胞应答等生物活性的T细胞，所述细胞应答选自增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性、激活标记物的表达和重定向的靶细胞裂解。
在一个实施方案中，在本发明技术的多肽中包含的ISVD特异性结合人T细胞受体α(TCR-α)的恒定结构域(SEQ ID NO:291)和/或人T细胞受体β(TCR-β)的恒定结构域(SEQ IDNO:292)，或其多态变体或同种型。
在一个实施方案中，所述非人灵长类动物TCR是猕猴或恒河猴TCR。在一个实施方案中，所述猕猴或恒河猴TCR包含SEQ ID NO:293的TCR-α的恒定结构域和/或SEQ ID NO:294的TCR-β的恒定结构域，或其多态变体或同种型。
同种型是可以从相同基因通过单个生物学事件或通过生物学事件的组合产生的替代蛋白质序列，所述生物学事件如替代性启动子使用、选择性剪接、替代性起始和核糖体移码，所有这些都是本领域已知的。
本发明技术的多肽的ISVD部分的结合特征在本文中更详细地讨论(第5.2节：“本发明技术的多肽”和第5.4节：“特异性”)。在一些实施方案中，所述ISVD以与SEQ ID NO:2的ISVD相比相同或更低的解离速率常数(koff)结合人TCR。在一些实施方案中，所述ISVD以与SEQ ID NO:2的ISVD相比相同或更低的koff结合非人灵长类动物TCR。在一个实施方案中，所述ISVD具有改善的与人和非人灵长类动物TCR结合的交叉反应性。因此，在一个特定实施方案中，本发明技术的多肽的ISVD部分具有关于结合人TCR的koff的5倍范围内的关于结合非人灵长类动物TCR的koff。
与T01700056G05的CDR序列相比，包含仅具有一个突变的CDR序列的ISVD的例子及其结合特征描述于表2、表3和表4中。具有导致改善的在人或食蟹猴TCR上的解离速率的突变的ISVD已在列出作用的列中以加号指示。参考表A-2，其中列出了这些ISVD的FR和CDR序列。赋予ISVD改善的结合特征的此类CDR序列可用于本发明技术的ISVD中。可用于本发明技术的多肽中的此类ISVD的具体实施例如以下实施方案中所述。
在一个实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含选自SEQ ID NO:154至169的氨基酸序列的组的CDR1。
在一个实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含选自SEQ ID NO:210至215的氨基酸序列的组的CDR2。
在一个实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含选自SEQ ID NO:224至230的氨基酸序列的组的CDR3。
在一个特定实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含
(i)CDR1，选自SEQ ID NO:153至169的氨基酸序列的组；
(ii)CDR2，选自SEQ ID NO:209至215的氨基酸序列的组；以及
(iii)CDR3，选自SEQ ID NO:223至230的氨基酸序列的组，并且
其中所述ISVD的CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ ID NO:153、209和223的氨基酸序列。
在一个实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含
(i)选自SEQ ID NO:154至169的氨基酸序列的组的CDR1；
(ii)由氨基酸序列HISIGDQTD(SEQ ID NO:209)组成的CDR2；以及
(iii)由氨基酸序列FSRIYPYDY(SEQ ID NO:223)组成的CDR3。
在一个实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含
(i)由氨基酸序列GDVHKINFLG(SEQ ID NO:153)组成的CDR1；
(ii)选自SEQ ID NO:210至215的氨基酸序列的组的CDR2；以及
(iii)由氨基酸序列FSRIYPYDY(SEQ ID NO:223)组成的CDR3。
在一个实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含
(i)由氨基酸序列GDVHKINFLG(SEQ ID NO:153)组成的CDR1；
(ii)由氨基酸序列HISIGDQTD(SEQ ID NO:209)组成的CDR2；以及
(iii)选自SEQ ID NO:224至230的氨基酸序列的组的CDR3。
在一个具体实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD选自SEQ ID NO:1至20、22至27、和35至41的氨基酸序列的组。
如实施例4的第二部分所述并且基于表2、3和4中描述的筛选数据，诸位发明人选择被划分在CDR1和CDR3中的9个位置上的一组12个单突变(如表5所指示)用于组合，以便进一步改善ISVD与人和/或非人灵长类动物TCR的结合。具有此类突变组合的CDR序列可用于在本发明技术的多肽中包含的ISVD中。
因此，在一个更具体的实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)，其中：
(i)CDR1的氨基酸序列是Xaa Xaa Val His Xaa Xaa Asn Phe Xaa Xaa(SEQ IDNO:298)，其中
位置1处的Xaa是Gly、Trp或Tyr，
位置2处的Xaa是Asp、Glu、Tyr、Ser或Ala，
位置5处的Xaa是Lys或Gln，
位置6处的Xaa是Ile或Leu，
位置9处的Xaa是Leu或Tyr，
位置10处的Xaa是Gly或Thr，
(ii)CDR2的氨基酸序列是His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp(SEQ ID NO:209)，并且
(iii)CDR3的氨基酸序列是Xaa Ser Xaa Ile Xaa Pro Tyr Asp Xaa(SEQ ID NO:299)，其中
位置1处的Xaa是Phe、Leu或Met，
位置3处的Xaa是Arg或Lys，
位置5处的Xaa是Tyr或Trp，并且
位置9处的Xaa是Tyr或Trp，并且
其中所述ISVD的CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ ID NO:153、209和223的氨基酸序列。
诸位发明人选择用于另外的组合的突变是与TO17000141的CDR1相比存在于具有SEQ ID NO:154至163的氨基酸序列的CDR1中的那些突变，以及与TO17000141的CDR3相比存在于具有SEQ ID NO:224至228的氨基酸序列的CDR3中的突变。赋予ISVD改善的结合特征的这些特定CDR1和/或CDR3序列可用于本发明技术的ISVD中。可用于本发明技术的多肽中的此类ISVD的具体实施例如以下实施方案中所述。
在一个实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含选自SEQ ID NO:154至163的氨基酸序列的组的CDR1。在一个具体实施方案中，CDR1选自SEQ ID NO:154至158的氨基酸序列的组。在又另一个具体实施方案中，CDR1选自SEQ IDNO:154和155的氨基酸序列的组。
在一个实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含选自SEQ ID NO:224至228的氨基酸序列的组的CDR3。在一个具体实施方案中，CDR3选自SEQ ID NO:224至226的氨基酸序列的组。在又另一个具体实施方案中，CDR3选自SEQ IDNO:224和225的氨基酸序列的组。
在一个特定实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含：
(i)选自SEQ ID NO:153至163的氨基酸序列的组的CDR1；
(ii)具有SEQ ID NO:209的氨基酸序列的CDR2；并且
(iii)选自SEQ ID NO:223至228的氨基酸序列的组的CDR3，
其中所述ISVD的CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ ID NO:153、209和223的氨基酸序列。
在另一个特定实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含：
(i)选自SEQ ID NO:153至158的氨基酸序列的组的CDR1；
(ii)具有SEQ ID NO:209的氨基酸序列的CDR2；并且
(iii)选自SEQ ID NO:223至226的氨基酸序列的组的CDR3，
其中所述ISVD的CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ ID NO:153、209和223的氨基酸序列。
在又另一个特定实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含：
(i)选自SEQ ID NO:153至155的氨基酸序列的组的CDR1；
(ii)具有SEQ ID NO:209的氨基酸序列的CDR2；并且
(iii)选自SEQ ID NO:223至225的氨基酸序列的组的CDR3，
其中所述ISVD的CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ ID NO:153、209和223的氨基酸序列。
被划分在CDR1和CDR3中的9个位置上的12个单突变组的随机组合导致鉴定出具有多于一个突变的CDR1和CDR3序列，它们组合起来赋予所得ISVD与具有非突变CDR的参考ISVD T017000141相比改善的结合特性。这些改善的ISVD中包含的CDR1和CDR3序列是具有SEQ ID NO:171至207中任一个的CDR1序列和具有SEQ ID NO:235至247中任一个的CDR3序列。具有此类突变组合的CDR序列可用于在本发明技术的多肽中包含的ISVD中。可用于本发明技术的多肽中的此类ISVD的具体实施例如以下实施方案中所述。
在一个实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含选自SEQ ID NO:171至207的氨基酸序列的组的CDR1。
在一个实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含选自SEQ ID NO:235至247的氨基酸序列的组的CDR3。
在一个特定实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含：
(i)选自SEQ ID NO:153和171至207的氨基酸序列的组的CDR1；
(ii)具有SEQ ID NO:209的氨基酸序列的CDR2；并且
(iii)选自SEQ ID NO:223和235至247的氨基酸序列的组的CDR3，
其中所述ISVD的CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ ID NO:153、209和223的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD选自SEQ ID NO:46至147、150至152、261和262的氨基酸序列的组。
用于本发明技术的ISVD的设想CDR序列包括赋予ISVD改善的与人和非人灵长类动物TCR结合的交叉反应性的CDR序列。特别有利的CDR序列是为ISVD提供关于结合人TCR的koff的5倍范围内的关于结合非人灵长类动物TCR的koff的CDR序列。
因此，在一个特定实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含选自SEQ ID NO:154、161、171至175、和177至191的氨基酸序列的组的CDR1。
在另一个特定实施方案中，CDR3选自SEQ ID NO:226、227和235至243的氨基酸序列的组。
在一个特定实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含：
(i)选自SEQ ID NO:153、154、161、171至175、和177至191的氨基酸序列的组的CDR1；
(ii)具有SEQ ID NO:209的氨基酸序列的CDR2；和
(iii)选自SEQ ID NO:223、226、227和235至243的氨基酸序列的组的CDR3，
其中所述ISVD的CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ ID NO:153、209和223的氨基酸序列。
用于本发明技术的ISVD的设想CDR序列包括T017000623、T017000624、T017000625、T017000635、T017000638和T017000641的CDR序列。参考表A-2，其中列出了这些ISVD的FR和CDR序列。包含这些CDR序列并且可用于本发明技术的多肽中的ISVD的具体例子如下文实施方案中所述。
在一个实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含选自SEQ ID NO:171至175的氨基酸序列的组的CDR1。
在一个实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含选自SEQ ID NO:235和236的氨基酸序列的组的CDR3。
在一个特定实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含：
(i)选自SEQ ID NO:153和171至175的氨基酸序列的组的CDR1；
(ii)具有SEQ ID NO:209的氨基酸序列的CDR2；和
(iii)选自SEQ ID NO:223、235和236的氨基酸序列的组的CDR3，
其中所述ISVD的CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ ID NO:153、209和223的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD选自SEQ ID NO:46至50、147和150至152、261和262的氨基酸序列的组。
用于本发明技术的ISVD中的设想CDR序列是T017000624的CDR序列。
因此，在一个特定实施方案中，在本发明技术的多肽中包含的ISVD包含由GYVHKINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:171)组成的CDR1。
在另一个特定实施方案中，在本发明技术的多肽中包含的ISVD包含由LSRIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:235)组成的CDR3。
用于本发明技术的ISVD中的CDR序列的设想组合包括如表A-2中对T017000623、T017000624、T017000625、T017000635、T017000638和T017000641所指示的CDR的那些组合。包含这些CDR序列组合并且可用于本发明技术的多肽中的ISVD的具体例子如下文所述。
在一个实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD包含3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)，其中：
a)CDR1由GYVHKINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:171)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及CDR3由LSRIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:235)组成；或
b)CDR1由WDVHKINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:172)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及CDR3由LSKIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:236)组成；或
c)CDR1由YDVHKINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:173)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及CDR3由LSKIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:236)组成；或
d)CDR1由WDVHQINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:174)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及CDR3由LSRIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:235)组成；或
e)CDR1由WDVHKINFYT的氨基酸序列(SEQ ID NO:175)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及CDR3由LSRIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:235)组成；或
f)CDR1由WDVHKINFYT的氨基酸序列(SEQ ID NO:175)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及CDR3由LSKIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:236)组成。
用于本发明技术的ISVD中的CDR序列的特定组合是T017000624的那些。因此，在一个特定实施方案中，在本发明技术的多肽中包含的ISVD包含3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)，其中：CDR1由GYVHKINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:171)组成，CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，并且CDR3由LSRIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:235)组成。
特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD的特定例子具有如表A-2中对ISVD所指示的一个或多个(优选全部)框架区(除如上文定义的CDR之外)。特定的ISVD具有SEQ ID NO:1至152、261或262的完整氨基酸序列(参见表-1)。
在一个具体实施方案中，特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的ISVD因此选自SEQ ID NO:46、150至152、261和262的氨基酸序列的组。
在一个实施方案中，用于本发明技术的多肽中的ISVD与SEQ ID NO:1至152、261或262的氨基酸序列中的至少一个具有至少80％、更优选90％、甚至更优选95％的序列同一性，其中出于确定序列同一性程度的目的，形成所述CDR序列的氨基酸残基被忽略。
在一个具体实施方案中，根据Kabat编号在位置73处的氨基酸残基不是天冬酰胺。在一个具体实施方案中，根据Kabat编号在位置73处的氨基酸残基是谷氨酸。
在一个实施方案中，用于本发明技术的多肽中的ISVD包含4个框架区(分别为FR1至FR4)，其中
(i)FR1选自SEQ ID NO:248至250的氨基酸序列的组，
(ii)FR2是SEQ ID NO:251的氨基酸序列，
(iii)FR3选自SEQ ID NO:252至259的氨基酸序列的组，并且
(v)FR4是SEQ ID NO:260的氨基酸序列。
特别地，在用于本发明技术的多肽中的第一ISVD中存在的框架序列可以是ISVDT0170056G05的框架序列。因此，用于本发明技术的多肽中的ISVD包含4个框架区(分别为FR1至FR4)，其中FR1是SEQ ID NO:248的氨基酸序列，FR2是SEQ ID NO:251的氨基酸序列，FR3是SEQ ID NO:252的氨基酸序列，并且FR4是SEQ ID NO:260的氨基酸序列。
可替代地，本发明技术的多肽中使用的第一ISVD中存在的框架序列可源自T0170056G05，但已被进一步优化，如部分或完全人源化或驼源化。可替代地，框架序列可已被优化以避免在多肽生产过程中发生翻译后修饰，或降低所述第一ISVD的免疫原性谱。因此，在一个实施方案中，用于本发明技术的多肽中的ISVD包含4个框架区(分别为FR1至FR4)，其中FR1选自SEQ ID NO:249和250的氨基酸序列的组，FR2是SEQ ID NO:251的氨基酸序列，FR3选自SEQ ID NO:253-259的氨基酸序列的组，并且FR4是SEQ ID NO:260的氨基酸序列。
在一个特定实施方案中，第一ISVD的FR3是SEQ ID NO:258的氨基酸序列。如实施例18中所公开的，包含SEQ ID NO:258的FR3的ISVD T017000680(对此参考表A-2)在树突状细胞-T细胞增殖测定中展现出最好的免疫原性谱。
在第一ISVD放置于本发明技术的多特异性多价多肽的N末端位置的情况下，优选地，所述第一ISVD中根据Kabat编号在位置1处的氨基酸残基是天冬氨酸，以避免潜在的焦谷氨酸形成。
在一个实施方案中，用于本发明技术的多肽中的ISVD因此包含4个框架区(分别为FR1至FR4)，其中FR1是SEQ ID NO:249的氨基酸序列，FR2是SEQ ID NO:251的氨基酸序列，FR3是SEQ ID NO:258的氨基酸序列，并且FR4是SEQ ID NO:260的氨基酸序列。在另一个实施方案中，ISVD包含具有SEQ ID NO:250的氨基酸序列的FR1、具有SEQ ID NO:251的氨基酸序列的FR2、具有SEQ ID NO:258的氨基酸序列的FR3、和具有SEQ ID NO:260的氨基酸序列的FR4。
特异性结合人和非人灵长类动物TCR的恒定结构域的并可用于本发明技术的多肽中的ISVD的具体例子是具有SEQ ID NO:1至20、22至27、35至41、46至147、150至152和261至262的ISVD。在一个实施方案中，用于本发明技术的多肽中的ISVD因此选自SEQ ID NO:1至20、22至27、35至41、46至147、150至152、和261至262的氨基酸序列的组。
用于本发明技术的多肽中的特定ISVD是具有T017000680或T017000697的完整氨基酸序列的ISVD。因此，在一个特定实施方案中，用于本发明技术的多肽的ISVD因此选自SEQ ID NO:151和261的氨基酸序列的组。
5.4特异性
术语“特异性”、“特异性地结合”、“特异地结合”或“特异性结合”是指特定结合单元(如ISVD)可以以足够高的亲和力结合的来自相同生物的不同靶分子(如抗原或TCR的恒定结构域)的数量(参见下文)。结合单元如ISVD优选地与其指定靶标特异性地结合。
与来自特定物种的特定靶标的特异性结合并不排除结合单元也可以与来自不同物种的类似靶标特异性地结合。例如，与人TCR的恒定结构域的特异性结合不排除结合单元(或包含所述结合单元的多肽)也可以特异性地结合来自非人灵长类动物的TCR的恒定结构域。同样，例如，与靶细胞上的抗原(如人CD123)的特异性结合不排除结合单元或包含所述结合单元的多肽也可以与来自食蟹猴(“cyno”)的CD123特异性地结合。
氨基酸序列(例如根据本发明技术的ISVD或多肽)如果对于不同的抗原或抗原决定簇均是特异性的(如本文所定义)，则被称为对于这些两种不同的抗原或抗原决定簇(如来自两种不同哺乳动物物种的TCR，如人TCR和食蟹猴TCR)具有“交叉反应性”。
可以基于亲和力确定结合单元或多肽的特异性/选择性。亲和力表示分子相互作用的强度或稳定性。亲和力通常通过KD或解离常数指示出，单位为摩尔/升(或M)。亲和力也可以表示为缔合常数KA，其等于1/KD并且单位为(mol/L)-1(或M-1)。亲和力是部分与靶分子上的结合位点之间的结合强度的量度：KD值越低，靶分子与靶向部分之间的结合强度越强。
KD也可以表示为复合物的解离速率常数(表示为koff)与其缔合速率常数(表示为kon)的比率(因此KD＝koff/kon，以及KA＝kon/koff)。“koff”在本文也称为“解离速率常数”，具有单位s-1(其中s是秒的SI单位表示)。“kon”在本文也称为“结合速率常数”，具有单位M-1s-1。结合速率常数可以在102M-1s-1至约107M-1s-1之间变化，接近生物分子相互作用的扩散限制缔合速率常数。解离速率常数通过关系式t1/2＝ln(2)/koff与给定分子相互作用的半衰期相关。解离速率常数可以在10-6s-1(近不可逆复合物，t1/2为多天)至1s-1(t1/2＝0.69s)之间变化。koff的值越低，靶向部分从靶分子解离花费的时间越长。
可替代地，可以基于解离速率常数koff确定结合单元或多肽的特异性/选择性。与未修饰的氨基序列相比，导致关于结合靶分子的解离速率降低的在氨基序列中的突变将从其靶分子更慢地解离。
当具有CDR突变的ISVD或多肽被称为具有改善的结合特征或特性时，这表明与具有非突变的CDR的参考ISVD或多肽相比，具有突变的CDR的ISVD或多肽具有更低的KD或更低的koff。换言之，在多肽的ISVD中引入的CDR突变导致改善的结合特征，如KD或koff的降低。
因此，改善的结合可意味着，通过使用相同的测量方法(例如SPR或BLI)，ISVD(或包含所述ISVD的多肽)与由SEQ ID NO:2的氨基酸组成的ISVD(或包含所述ISVD的多肽)相比以更低的KD值或koff结合TCR的恒定结构域。
如本文进一步例示的，在一个实施方案中，本发明技术的多肽中包含的ISVD与包含T0170056G05的CDR序列(即SEQ ID NO:153的CDR1、SEQ ID NO:209的CDR2、以及SEQ IDNO:223的CDR3)的相应ISVD(如具有SEQ ID NO:2的ISVD T017000141)相比具有改善的结合特征。
在一些实施方案中，本发明技术的多肽包含与SEQ ID NO:2的ISVD相比以相同或更低的解离速率常数(koff)特异性结合人TCR的恒定结构域的ISVD。在一个实施方案中，将ISVD的结合亲和力与SEQ ID NO:2的ISVD的结合亲和力进行比较，其中结合亲和力使用相同的方法如SPR或BLI测量。
在一些其他实施方案中，在所述多肽中包含的ISVD与SEQ ID NO:2的ISVD相比以相同或更低的koff结合非人灵长类动物TCR的恒定结构域。在一个实施方案中，将ISVD的结合亲和力与SEQ ID NO:2的ISVD的结合亲和力进行比较，其中结合亲和力使用相同的方法如SPR或BLI测量。
在一个实施方案中，在本发明技术的多肽中包含的ISVD关于结合人TCR的恒定结构域具有选自至多约10-3s-1、至多约10-4s-1和至多约10-5s-1的koff。在一个实施方案中，koff是通过表面等离子体共振(SPR)来测量的。例如，koff是如实施例部分所述来确定的。在另一个实施方案中，koff是通过生物层干涉测量法(BLI)来测量的。
在一个实施方案中，在本发明技术的多肽中包含的ISVD关于结合非人灵长类动物TCR的恒定结构域具有选自至多约10-2s-1、至多约10-3s-1和至多约10-4s-1的koff。在一个实施方案中，koff是通过SPR测量的。例如，koff是如实施例部分所述来确定的。在另一个实施方案中，koff是通过BLI测量的。
如本文进一步例示的，诸位发明人还鉴定出CDR中的特定位置处的特定氨基酸残基，这些特定氨基酸残基促成改善与人和非人灵长类动物TCR结合的交叉反应性。
当一个ISVD与另一个ISVD相比被称为具有“改善的与人和非人灵长类动物TCR结合的交叉反应性”或“改善的人/非人灵长类动物交叉反应性”时，这意味着在同一测定中，对于所述ISVD，关于人TCR和关于非人灵长类动物TCR的结合活性(例如依照KD或koff表示)的比率低于对于另一个ISVD计算的比率。
在一个实施方案中，本发明技术的多肽的ISVD部分具有关于结合人TCR的koff的5倍范围内的关于结合非人灵长类动物TCR的koff。
当ISVD或多肽被称为具有关于结合另一抗原(如人TCR)的koff的5倍范围内的关于结合第一抗原(如非人灵长类动物TCR)的koff时，这意味着所述ISVD或多肽结合第一抗原的koff与所述ISVD或多肽结合第二抗原的koff的差异不超过5倍。换言之，结合第一抗原的koff与结合第二抗原的koff的比率在0.2与5之间。例如，当ISVD具有关于结合人TCR的koff的5倍范围内的关于结合非人灵长类动物TCR的koff时，关于结合非人灵长类动物TCR的koff与关于结合人TCR的koff的比率在0.2与5之间。因此，在一个实施方案中，本发明技术的多肽的ISVD部分具有在0.2与5之间的koff(非人灵长类动物TCR)/koff(人TCR)，其定义为关于结合非人灵长类动物TCR的koff与关于结合人TCR的koff的比率。
可替代地，如在实施例4和5中，关于结合第一抗原(如非人灵长类动物TCR)和第二抗原(如人TCR)的koff的差异可以通过将最高koff值除以最低koff值来计算。例如，当ISVD或多肽关于结合非人灵长类动物TCR的koff低于其关于结合人灵长类动物TCR的koff时，关于结合人TCR的koff除以关于结合非人灵长类动物TCR的koff。在相反的情况下，当ISVD或多肽关于结合非人灵长类动物TCR的koff高于其关于结合人灵长类动物TCR的koff时，关于结合非人灵长类动物TCR的koff除以关于结合人TCR的koff。这种计算方法将得到一个等于或大于1的值。高值反映了关于结合人和非人灵长类动物TCR的koff的差异较大，而低值表明关于结合人和非人灵长类动物TCR的koff的差异较小。当对于ISVD或多肽的计算值在1与5之间时，这意味着ISVD或多肽具有其关于结合人TCR的koff的5倍范围内的关于结合非人灵长类动物TCR的koff。通过该计算获得的值在实施例中指示为“人与食蟹猴相比的解离速率差距”。
这种替代计算方法使得可以轻松比较不同ISVD变体的物种交叉反应性。当在CDR中引入一个或多个突变时，对于ISVD的计算值低于对于其CDR中没有任何这些突变的参考ISVD计算的值，这表明突变的ISVD具有改善的与人和非人灵长类动物TCR结合的交叉反应性，在本文中也可互换地称为“改善的人/非人灵长类动物交叉反应性”或“人/非人灵长类动物交叉反应性的差距较小”，或更特别是“改善的人/食蟹猴交叉反应性”或“人/食蟹猴交叉反应性的差距较小”。在这种情况下，在ISVD的CDR中引入的突变促成改善人/食蟹猴交叉反应性。此类突变和所得CDR特别有利于用于本发明技术的ISVD和多肽中。特别有利的是在如下ISVD或多肽中包含的那些CDR序列，所述ISVD或多肽具有其关于结合人TCR的koff的5倍范围内的关于结合非人灵长类动物TCR的koff。此类ISVD或多肽在本文中还称为具有5倍或更低的人/食蟹猴交叉反应性差距。
结合单元与其指定靶标的特异性结合可以通过本身已知的任何合适方式(包括例如斯卡查德(Scatchard)分析和/或竞争性结合测定(如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心式竞争测定)和本领域本身已知的其不同变体)；以及本文提及的其他技术来确定。
解离常数可以是实际或表观解离常数，正如技术人员所清楚的。确定解离常数的方法对技术人员是清楚的，并且例如包括以下提及的技术。在这一方面，还将清楚的是，可能无法测量大于10-4mol/L或10-3mol/L(例如为10-2mol/L)的解离常数。任选地，如技术人员也清楚的，(实际或表观)解离常数可以基于(实际或表观)缔合常数(KA)通过关系[KD＝1/KA]来计算。
可以经由本身已知的不同技术(如熟知的表面等离子体共振(SPR)生物传感器技术(参见例如，Ober等人2001,Intern.Immunology 13:1551-1559))来测量两个分子之间的分子相互作用的亲和力。如本文所用，术语“表面等离子体共振”(“SPR”)是指光学现象，其允许通过检测生物传感器基质中蛋白质浓度的改变来分析实时生物特异性相互作用，其中一个分子被固定在生物传感器芯片上，并且另一个分子在流动条件下通过所固定的分子，从而产生kon、koff测量值，并因此产生KD(或KA)值。例如，这可以使用熟知的系统(BIAcore International AB，一家GE Healthcare公司，乌普萨拉，瑞典和皮斯卡塔韦，新泽西州)进行。有关进一步描述，参见Jonsson等人(1993,Ann.Biol.Clin.51:19-26)、Jonsson等人(1991Biotechniques 11:620-627)、Johnsson等人(1995,J.Mol.Recognit.8:125-131)和Johnnson等人(1991,Anal.Biochem.198:268-277)。可替代地，可以使用熟知的ProteOnTM系统(Bio-Rad Laboratories Inc)进行SPR。
另一种确定生物分子相互作用的亲和力的熟知的生物传感器技术是生物层干涉测量法(BLI)(参见例如，Abdiche等人2008,Anal.Biochem.377:209-217)。如本文所用，术语“生物层干涉法”或“BLI”是指无标签光学技术，其分析从两个表面反射的光的干涉图案：内部参考层(参考光束)和生物传感器尖端上的固定蛋白质的层(信号光束)。与生物传感器尖端结合的分子的数量变化导致干涉图案的偏移，报告为波长偏移(nm)，其大小是与生物传感器尖端表面结合的分子的数量的直接量度。由于可以实时测量相互作用，因此可以确定缔合和解离速率以及亲和力。例如，BLI可以使用熟知的系统(ForteBio,PallLife Sciences的部门,门洛帕克,美国)进行。
可替代地，可以在动力学排斥测定(KinExA)(参见例如Drake等人2004,Anal.Biochem.,328:35-43)中使用平台(Sapidyne Instruments Inc,博伊西,美国)测量亲和力。如本文所用，术语“KinExA”是指用于测量未修饰分子的真实平衡结合亲和力和动力学的基于溶液的方法。使抗体/抗原复合物的平衡溶液通过具有用抗原(或抗体)预包被的珠的柱，从而允许游离的抗体(或抗原)与被包被的分子结合。用结合抗体(或抗原)的荧光标记的蛋白完成了对如此捕获的抗体(或抗原)的检测。
免疫测定系统为自动化生物分析和快速样品周转提供了平台(Fraley等人2013,Bioanalysis 5:1765-74)。
通常认为任何大于10-4mol/L的KD值(或任何小于104L/mol的KA值)指示非特异性结合。
被认为具有特异性的生物学相互作用(诸如免疫球蛋白序列与抗原的结合)的KD通常在10-5摩尔/升(10000nM或10μM)至10-12摩尔/升(0.001nM或1pM)或更低的范围内。
ISVD或多肽在以比所述ISVD或多肽结合第二靶标或多肽的亲和力高至少10倍如至少100倍、并且优选至少1000倍、并且高至10.000倍或更高的亲和力/亲合力(如上所述，并适当表示为KD值、KA值、koff率和/或kon率)结合第一抗原时，被称为对第一靶标或抗原(与第二靶标或抗原相比)具有“特异性”。例如，ISVD或多肽可以以比所述ISVD或多肽结合第二靶标或多肽的KD低至少10倍如低至少100倍、并且优选低至少1000倍如低10.000倍或甚至更低的KD值结合靶标或抗原。优选地，当与第二靶标或抗原相比，免疫球蛋白单可变结构域或多肽对第一靶标或抗原具有“特异性”时，它针对(如本文所定义的)所述第一靶标或抗原而不针对所述第二靶标或抗原。
如实施例7中所述，已经测试了本发明技术的多特异性多价多肽的结合亲和力。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽关于结合人TCR具有选自至少约103M-1s-1、至少约104M-1s-1、和至少约105M-1s-1的结合速率常数(kon)。在一个实施方案中，kon是至少约104M-1s-1。在另一个实施方案中，kon在104M-1s-1与105M-1s-1之间。
在一些实施方案中，如本文所述的多特异性多价多肽关于结合非人灵长类动物TCR具有选自至少约103M-1s-1、至少约104M-1s-1、和至少约105M-1s-1的kon。在一个实施方案中，kon是至少约104M-1s-1。在另一个实施方案中，kon在104M-1s-1与105M-1s-1之间。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽关于结合人TCR具有选自至多约10-2s-1、至多约10-3s-1和至多约10-4s-1的koff。在一个实施方案中，koff是至多约10-3s-1。在另一个实施方案中，koff在10-3s-1与10-4s-1之间。
在一些实施方案中，如本文所述的多特异性多价多肽关于结合非人灵长类动物TCR具有选自至多约10-1s-1、至多约10-2s-1、至多约10-3s-1和至多约10-4s-1的koff。在一个实施方案中，koff是至多约10-2s-1。在另一个实施方案中，koff在10-2s-1与10-3s-1之间。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽关于结合人TCR具有选自至多约10-6M、至多约10-7M、至多约10-8M和至多约10-9M的亲和力(KD)。在一个实施方案中，KD是至多约10-8M。在另一个实施方案中，KD在10-9M与10-8M之间。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽关于结合非人灵长类动物TCR具有选自至多约10-6M、至多约10-7M和至多约10-8M的KD。在一个实施方案中，KD是至多约10-7M。在另一个实施方案中，KD在10-8M与10-7M之间。
在一个实施方案中，与包含SEQ ID NO:1的T0170056G05的CDR序列(即SEQ ID NO:153的CDR1，SEQ ID NO:209的CDR2，以及SEQ ID NO:223的CDR3)的相应ISVD相比，结合TCR的恒定结构域的并且在本发明技术的多肽中包含的本发明技术的ISVD具有改善的结合特征。作为结果并且如本文所例示的，本发明技术的多特异性多价多肽在一个实施方案中显示出改善的与人和/或非人灵长类动物TCR的恒定结构域的结合。
在一个实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽与其中所述第一ISVD被SEQID NO:1的ISVD替代的相同多肽相比以更低的KD结合人TCR。在一个实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽与其中所述第一ISVD被SEQ ID NO:1的ISVD替代的相同多肽相比以更低的KD结合非人灵长类动物TCR。本发明技术的多特异性多价多肽和其中第一ISVD被SEQID NO:1的ISVD替代的相同多肽的KD可以用相同的方法测量。在一个实施方案中，结合TCR的本发明技术的多特异性多价多肽的KD因此与其中第一ISVD被SEQ ID NO:1的ISVD替代的相同多肽的KD进行比较，其中使用相同的方法测量KD。
本发明技术的多特异性多价多肽的亲和力可以通过如上文所述的不同技术来测量。在一个实施方案中，本发明技术的多特异性多价多肽的kon、koff或KD是通过SPR测量的。例如，kon是如实施例部分所述来确定的。在另一个实施方案中，所述多肽的kon、koff或KD是通过BLI测量的。
5.5(体内)半衰期延长
本发明技术的多肽还可以包含任选地经由一个或多个肽接头连接的一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元，其中与没有所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元的相应多肽相比，所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为所述多肽提供了增加的(体内)半衰期。体内半衰期延长意指例如所述多肽在施用后在哺乳动物如人受试者中具有增加的半衰期。半衰期可以表示为例如t1/2β。
基团、残基、部分或结合单元的类型通常不受限制并且可以例如选自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可与血清蛋白结合的结合单元、Fc部分和可与血清蛋白结合的小蛋白质或肽。
更具体地，为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元可以选自可与血清白蛋白(如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(如IgG)结合的结合单元。在一个实施方案中，为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是可以特异性结合人血清白蛋白的结合单元。在一个实施方案中，所述结合单元是ISVD。
例如，WO 04/041865描述了与血清白蛋白结合(并且特别是针对人血清白蛋白)的其可以与其他蛋白质(如与所需靶标结合的一种或多种其他纳米抗体)连接以增加所述蛋白质的半衰期。
国际申请WO 06/122787描述了许多针对(人)血清白蛋白的这些包括称为Alb-1(WO 06/122787中的SEQ ID NO:52)的/>及其人源化变体，如Alb-8(WO 06/122787中的SEQ ID NO:62)。此外，这些可用于延长治疗性蛋白质和多肽以及其他治疗性实体或部分的半衰期。
此外，WO 2012/175400描述了Alb-1的另外的改善形式，称为Alb-23(WO2012/175400中的SEQ ID NO:1)。
在一个实施方案中，所述多肽包含可以结合人血清白蛋白的选自以下的ISVD：Alb-1、Alb-3、Alb-4、Alb-5、Alb-6、Alb-7、Alb-8、Alb-9、Alb-10(分别为WO 06/122787中的SEQ ID NO:52、50、57-64)和Alb-23。在一个实施方案中，可结合人血清白蛋白的ISVD是Alb-8或Alb-23或其变体，如WO 2012/175400的第7-9页中所示，并且白蛋白结合剂描述在WO 2012/175741、WO 2015/173325、WO 2017/080850、WO 2017/085172、WO 2018/104444、WO2018/134235、WO 2018/134234中。
在一个实施方案中，可结合人血清白蛋白的ISVD选自表A-4中SEQ ID NO:361至378所示的ISVD。
在一个实施方案中，为所述多肽提供增加的(体内)半衰期的结合单元是可结合人血清白蛋白的ISVD，其基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
i.CDR1的氨基酸序列是GFTFRSFGMS(SEQ ID NO:357)、GFTFSSFGMS(SEQ ID NO:358)、与SEQ ID NO:357相比具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列、或与SEQ ID NO 358相比具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
ii.CDR2的氨基酸序列是SISGSGSDTL(SEQ ID NO:359)、或与SEQ ID NO 359相比具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；以及
iii.CDR3的氨基酸序列是GGSLSR(SEQ ID NO:360)、或与SEQ ID NO 360相比具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
当这种结合人血清白蛋白的ISVD在至少一个CDR中相对于相应参考CDR序列具有2或1个氨基酸差异时，与SEQ ID NO:375的结合亲和力相比，所述ISVD对人血清白蛋白具有至少一半的结合亲和力，或至少相同的结合亲和力，其中结合亲和力是使用相同的方法(如SPR)测量的。
在一个实施方案中，所述结合人血清白蛋白的ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR1的氨基酸序列是GFTFRSFGMS(SEQ ID NO:357)或GFTFSSFGMS(SEQ ID NO:358)，CDR2的氨基酸序列是SISGSGSDTL(SEQ ID NO:359)，并且CDR3的氨基酸序列是GGSLSR(SEQ ID NO:360)。
此外，在一个实施方案中，结合人血清白蛋白的ISVD的氨基酸序列可以分别与SEQID NO:375或SEQ ID NO:361具有大于90％(如大于95％或大于99％)的序列同一性，其中出于确定序列同一性程度的目的，形成所述CDR序列的氨基酸残基被忽略。在一个实施方案中，所述结合人血清白蛋白的ISVD具有SEQ ID NO:375的氨基酸序列。
在一个实施方案中，当这种结合人血清白蛋白的ISVD具有C末端位置时，其表现出C末端延伸，如C末端丙氨酸(A)或甘氨酸(G)延伸。在一个实施方案中，这种ISVD选自SEQ IDNO:362、364、366、368、370、372、374、376和378(参见下表A-4)。在另一个实施方案中，所述结合人血清白蛋白的ISVD具有不同于C末端位置的另一个位置(即不是本发明技术的多肽的C末端ISVD)。在一个实施方案中，这种ISVD选自SEQ ID NO:361、363、365、367、369、371、373、375和377(参见下表A-4)。
5.6核酸分子
还提供了编码本发明技术的多肽的核酸分子。
“核酸分子”(与“核酸”可互换使用)是经由磷酸骨架彼此连接以形成核苷酸序列的核苷酸单体链。核酸可以用于转化/转染宿主细胞或宿主生物，例如以表达和/或产生多肽。用于产生目的的合适宿主或宿主细胞对本领域技术人员将是清楚的，并且可以是例如任何合适的真菌、原核或真核细胞或细胞系或任何合适的真菌、原核或真核生物。用编码本发明技术的多肽的核酸转化或转染的宿主或宿主细胞也由本发明技术涵盖。
核酸可以是例如DNA、RNA或其杂合体，并且还可以包含(例如化学地)修饰的核苷酸，像PNA。它可以是单链或双链。在一个实施方案中，它是双链DNA的形式。例如，本发明技术的核苷酸序列可以是基因组DNA、cDNA。
本发明技术的核酸可以以本身已知的方式制备或获得，和/或可以从合适的天然来源分离。编码天然存在的(多)肽的核苷酸序列可以例如经受定点诱变，以提供编码具有序列变异的多肽的核酸分子。另外，对于本领域技术人员来说清楚的是，为了制备核酸，还可以将若干种核苷酸序列(如编码靶向部分的至少一种核苷酸序列)和例如编码一种或多种接头的核酸以合适的方式连接在一起。
生成核酸的技术对于技术人员将是清楚的，并且可以例如包括但不限于自动化DNA合成；定点诱变；将两个或更多个天然存在的和/或合成序列(或其两个或更多个部分)组合，引入可导致截短的表达产物的表达的突变；引入一个或多个限制位点(例如，以使用合适的限制酶产生容易被消化和/或连接的盒和/或区域)，和/或使用一种或多种“错配”引物通过PCR反应引入突变。
5.7载体
还提供了包含编码本发明技术的多肽的核酸分子的载体。如本文所用的载体是适合于将遗传物质携带至细胞中的运载体。载体包括裸核酸(如质粒或mRNA)或嵌入更大结构(如脂质体或病毒载体)中的核酸。
在一些实施方案中，载体通常包含至少一种核酸，其任选地连接到一个或多个调节元件，例如像一个或多个合适的启动子、增强子、终止子等。在一个实施方案中，所述载体是表达载体，即适合于在合适条件下(例如当所述载体被引入(例如人)细胞中时)表达编码的多肽或构建体的载体。对于基于DNA的载体，这通常包括用于转录(例如启动子和聚A信号)和翻译(例如Kozak序列)的元件的存在。
在一个实施方案中，在所述载体中，所述至少一种核酸和所述调节元件彼此“可操作地连接”，这通常意指它们彼此处于功能关系。例如，如果启动子能够启动或以其他方式控制/调节编码序列的转录和/或表达，则所述启动子被认为与编码序列“可操作地连接”(其中所述编码序列应理解为在所述启动子的“控制下”)。通常，当两个核苷酸序列可操作地连接时，它们将在相同的方向上并且通常也在相同的阅读框中。它们通常也基本上是连续的，尽管这也可能不是必需的。
在一个实施方案中，所述载体的任何调节元件使得它们能够在预期的宿主细胞或宿主生物中提供其预期的生物学功能。
例如，启动子、增强子或终止子在预期的宿主细胞或宿主生物中应是“可操作的”，这意味着例如所述启动子应能够启动或以其他方式控制/调节与其可操作地连接的核苷酸序列(例如编码序列)的转录和/或表达。
用于特定宿主细胞的一些优选但非限制性的启动子包括：
-对于在大肠杆菌中表达：lac启动子(及其衍生物，如lacUV5启动子)；阿拉伯糖启动子；λ噬菌体的左向(PL)和右向(PR)启动子；trp操纵子的启动子；杂合lac/trp启动子(tac和trc)；T7-启动子(更具体地为T7-噬菌体基因10的启动子)
和其他T-噬菌体启动子；Tn10四环素抗性基因的启动子；上述启动子的工程化变体，
其包括一个或多个拷贝的外来调节操纵子序列；
-对于在酿酒酵母中表达：组成型：ADH1(醇脱氢酶1)，ENO(烯醇化酶)，
CYC1(细胞色素c iso-1)，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)，PGK1(磷酸甘油酸激酶)，PYK1(丙酮酸激酶)；调节型：GAL1、10、7(半乳糖代谢酶)，ADH2
(醇脱氢酶2)，PHO5(酸性磷酸酶)，CUP1(铜金属硫蛋白)；异源型：CaMV
(花椰菜花叶病毒35S启动子)；
-对于在巴斯德毕赤酵母中表达：AOX1启动子(醇氧化酶I)；
-对于在哺乳动物细胞中表达：人巨细胞病毒(hCMV)即刻早期增强子/启动子；
人巨细胞病毒(hCMV)即刻早期启动子变体，其含有两个四环素操纵子序列以使得该启动子可以由Tet阻遏物调节；单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)启动子；劳斯肉瘤病毒长末端重复(RSV LTR)增强子/启动子；来自人、黑猩猩、小鼠或大鼠的延伸因子1α(hEF-1α)启动子；SV40早期启动子；HIV-1长末端重复启动子；β-肌动蛋白启动子。
用于特定宿主细胞的一些优选但非限制性的载体包括：
-用于在哺乳动物细胞中表达的载体：pMAMneo(Clontech)、pcDNA3(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2-neo(ATCC 37593)、pBPV-1(8-2)(ATCC 37110)、pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC 37224)、pRSVgpt(ATCC37199)、pRSVneo(ATCC37198)、pSV2-dhfr(ATCC 37146)、pUCTag(ATCC 37460)和1ZD35(ATCC 37565)，以及基于病毒的表达系统，如
基于腺病毒的表达系统；
-用于在细菌细胞中表达的载体：pET载体(Novagen)和pQE载体(Qiagen)；
-用于在酵母或其他真菌细胞中表达的载体：pYES2(Invitrogen)和毕赤酵母表
达载体(Invitrogen)；
-用于在昆虫细胞中表达的载体：pBlueBacII(Invitrogen)和其他杆状病毒载体；
-用于在植物或植物细胞中表达的载体：例如基于花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒的载体、基于合适土壤杆菌属菌株或Ti质粒的载体。
用于特定宿主细胞的一些优选但非限制性的分泌序列包括：
-对于在细菌细胞如大肠杆菌中使用：PelB、Bla、OmpA、OmpC、OmpF、OmpT、StII、PhoA、PhoE、MalE、Lpp、LamB等；TAT信号肽、溶血素C末端分泌信号；
-对于在酵母中使用：α-交配因子前原序列、磷酸酶(pho1)、转化酶(Suc)
等；
-对于在哺乳动物细胞中使用：在靶蛋白是真核来源的情况下则为固有信号；鼠Igκ-链V-J2-C信号肽；等。
5.8宿主生物
本发明技术还涉及包含本发明技术的多肽的宿主细胞或宿主生物。在一个实施方案中，将宿主细胞用编码本发明技术的多肽的核酸或包含编码本发明技术的多肽的核酸分子的载体转化或转染。
宿主优选地是非人宿主。合适的宿主或宿主细胞对本领域技术人员将是清楚的，并且可以是例如任何合适的真菌、原核或真核细胞或细胞系或任何合适的真菌、原核或真核生物，例如：
-细菌菌株，包括但不限于革兰氏阴性菌株，如大肠杆菌(Escherichia coli)；
变形杆菌属(Proteus)，例如奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的菌株；以及革兰氏阳性菌株，如芽孢杆菌属(Bacillus)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
或短芽孢杆菌(Bacillus brevis)；链霉菌属(Streptomyces)，例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)；葡萄球菌属，例如肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)；
和乳球菌属(Lactococcus)，例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的菌株；
-真菌细胞，包括但不限于来自以下物种的细胞：木霉属(Trichoderma)物种，例如里氏木霉(Trichoderma reesei)；脉孢菌属(Neurospora)物种，例如粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；粪壳菌属(Sordaria)物种，例如大孢粪壳菌(Sordariamacrospora)；曲霉属(Aspergillus)物种，例如黑曲霉(Aspergillus niger)或酱油曲霉(Aspergillus sojae)；或其他丝状真菌；
-酵母细胞，包括但不限于来自以下物种的细胞：酵母属(Saccharomyces)，
例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；毕赤酵母属(Pichia)，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)；汉逊酵母属(Hansenula)，例如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)；阿氏酵母属(Arxula)，例如食腺嘌呤阿氏酵母(Arxula adeninivorans)；耶氏酵母属(Yarrowia)，
例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；
-两栖动物细胞或细胞系，如非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)；
-昆虫来源的细胞或细胞系，如源自鳞翅目(lepidoptera)的细胞/细胞系，包括但不限于贪夜蛾属(Spodoptera)SF9和Sf21细胞或源自果蝇属(Drosophila)的细胞/细胞系，如Schneider和Kc细胞；
-植物或植物细胞，例如烟草植物；和/或
-哺乳动物细胞或细胞系，例如源自人的细胞或细胞系、源自哺乳动物的细胞或细胞系，包括但不限于CHO细胞、BHK细胞(例如BHK-21细胞)和人细胞或细胞系，如HeLa、COS(例如COS-7)和PER.C6细胞；
以及所有其他本身已知的用于表达和产生抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的宿主或宿主细胞，这对于技术人员来说将是清楚的。还参考上文引用的一般背景技术以及例如WO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken等人1998(Res.Immunol.149:589-99)；Riechmann和Muyldermans 1999(J.Immunol.Met.231:25-38)；van der Linden 2000(J.Biotechnol.80:261-70)；Joosten等人2003(Microb.CellFact.2:1)；Joosten等人2005(Appl.Microbiol.Biotechnol.66:384-92)；以及其中引用的其他参考文献。
用于转化本发明技术的宿主或宿主细胞的合适技术对于技术人员来说是清楚的，并且可取决于预期的宿主细胞/宿主生物和要使用的核酸或载体。再次参考上述手册和专利申请。
在转化之后，可以进行检测和选择那些已经已成功地用本发明技术的核酸/载体转化的宿主细胞或宿主生物的步骤。这可以例如是基于本发明技术的载体中存在的选择性标记物的选择步骤或涉及例如使用特异性抗体检测本发明技术的多肽的步骤。
转化的宿主细胞(可以是稳定细胞系的形式)或宿主生物(可以是稳定的突变系或菌株的形式)形成本发明技术的其他方面。
优选地，这些宿主细胞或宿主生物使得它们表达或(至少)能够表达(例如在合适的条件下)本发明技术的ISVD或多肽(并且在宿主生物的情况下：在其至少一种细胞、部分、组织或器官中表达)。本发明技术还包括本发明技术的宿主细胞或宿主生物的另外的世代、后代和/或子代，例如通过细胞分裂或通过有性或无性繁殖获得的。
因此，在另一方面，本技术涉及表达(或在合适的情况下能够表达)本发明技术的ISVD或多肽的宿主或宿主细胞；和/或含有核酸或编码所述核酸的载体的宿主或宿主细胞。此类宿主或宿主细胞的一些优选但非限制性的例子可以总体上如WO 04/041867、WO 04/041865或WO 09/068627中描述的。例如，本发明技术的ISVD和多肽可以有利地在酵母菌株(如巴斯德毕赤酵母的菌株)中表达、产生或制造。还参考了WO 04/25591、WO 10/125187、WO11/003622和WO 12/056000，这些文献还描述了在毕赤酵母和其他宿主/宿主细胞中表达/产生免疫球蛋白单可变结构域和包含所述免疫球蛋白单可变结构域的多肽。
5.9方法
本发明技术还提供了用于产生本发明技术的多肽的方法。所述方法可以包括用编码所述多肽的核酸或用包含编码所述多肽的核酸的载体转化/转染宿主细胞或宿主生物、在所述宿主中表达所述多肽、任选地随后进行一个或多个分离和/或纯化步骤。在一个实施方案中，所述方法包括在允许所述多肽表达的条件下培养用编码所述多肽的核酸或用包含编码所述多肽的核酸的载体转化或转染的宿主细胞，并从培养物中回收产生的多肽。
用于产生目的的合适的宿主细胞或宿主生物对本领域技术人员将是清楚的，并且可以是例如任何合适的真菌、原核或真核细胞或细胞系或任何合适的真菌、原核或真核生物。具体例子包括HEK293细胞、CHO细胞、大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母。最优选的宿主是巴斯德毕赤酵母。
为了产生/获得本发明技术的多肽的表达，转化的宿主细胞或转化的宿主生物通常可以在使得表达/产生本发明技术的(期望的)ISVD或多肽的条件下保持、维持和/或培养。合适的条件对于技术人员而言将是清楚的，并且通常将取决于所使用的宿主细胞/宿主生物、以及控制本发明技术的(相关)核苷酸序列的表达的调节元件。
通常，合适的条件可以包括使用合适的培养基、存在合适的食物来源和/或合适的营养物、使用合适的温度、以及任选地存在合适的诱导因子或化合物(例如，当本发明技术的核苷酸序列在诱导型启动子的控制下时)；所有这些都可以由技术人员选择。同样，在此类条件下，本发明技术的ISVD或多肽可以以组成型方式、以瞬时方式或仅在适当诱导时表达。
技术人员还将清楚，本发明技术的多肽可以(首先)以未成熟形式产生(如上所述)，然后可根据使用的宿主细胞/宿主生物进行翻译后修饰。此外，本发明技术的多肽可以被糖基化，这同样取决于所使用的宿主细胞/宿主生物。
然后可以使用本身已知的蛋白质分离和/或纯化技术，如(制备)色谱和/或电泳技术、差异沉淀技术、亲和技术(例如，使用与本发明技术的ISVD或多肽融合的特异性可切割氨基酸序列)和/或制备免疫学技术(即使用针对要分离的多肽或构建体的抗体)，从宿主细胞/宿主生物和/或从其中培育所述宿主细胞或宿主生物的培养基分离本发明技术的多肽。
5.10组合物
本发明技术还提供了一种组合物，所述组合物包含本发明技术的多肽、编码本发明技术的多肽的核酸、或包含这种核酸的载体。所述组合物可以是药物组合物。所述组合物还可以包含至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，并且任选地包含一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。
短语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断的范围内，适用于与人和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、变态反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用的短语“药学上可接受的载剂”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料，它们参与将主题化合物从身体的一个器官或部分携带或运输到身体的另一个器官或部分。在与配制品的其他成分相容并且对患者无害的意义上，每种载剂必须是“可接受的”。
通常，本发明技术中的ISVD或多肽可以以本身已知的任何合适方式配制和施用。参考例如上文引用的一般背景技术(并且特别是WO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、WO 04/041867和WO 08/020079)以及标准手册，如Remington’s PharmaceuticalSciences,18版,Mack Publishing Company,美国(1990),Remington,the Science andPractice of Pharmacy,21版,Lippincott Williams and Wilkins(2005)；或Handbook ofTherapeutic Antibodies(S.Dubel编),Wiley,Weinheim,2007(参见例如第252-255页)。
可以与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的化合物的量。通常，此量的范围将是约1％至约99％活性成分，优选约5％至约70％，最优选约10％至约30％。
在另一个实施方案中，提供了包含本发明技术的多肽、本发明技术的核酸分子、本发明技术的载体或本发明技术的宿主细胞的试剂盒。所述试剂盒可以包含一个或多个含有结合分子的小瓶和使用说明书。所述试剂盒还可以含有用于施用本发明技术的结合分子的工具，如注射器、泵、输注器等。
5.11多肽的用途
本发明技术进一步涉及本文所述的多肽和组合物的应用和用途，以及用于预防和/或治疗疾病的方法。一些优选但非限制性的应用和用途将从本文的进一步描述中变得清楚。
本发明技术的多特异性多价多肽和组合物通常可用于激活抗原表达靶细胞(部位)处的T细胞；例如以裂解这些表达抗原的靶细胞。本发明技术的多特异性多价多肽与T细胞上的TCR和靶细胞上的抗原同时结合诱导细胞的激活和随后表达抗原的靶细胞的裂解(杀伤)。当不与表达抗原的靶细胞结合时，本发明技术的多肽几乎不显示任何T细胞激活。因此，本发明技术的多肽的非靶标依赖性裂解(即，没有抗原表达的情况下细胞的裂解)是最小的。
对表达抗原的靶细胞的这种杀伤在大量存在和/或不希望存在这些表达抗原的靶细胞的疾病或病症中可能是有利的。
因此，在一个实施方案中，本发明技术提供了用作药物的本发明技术的多肽或本发明技术的组合物。
在另一个实施方案中，本发明技术提供了用于治疗有需要的受试者的本发明技术的多肽或本发明技术的组合物。
在另外的实施方案中，本发明技术涉及用于预防、治疗或改善选自增殖性疾病、炎性疾病、感染性疾病和自身免疫病的疾病的本发明技术的多肽或本发明技术的组合物。
在一个实施方案中，本发明技术提供了用于将预防性或治疗性多肽递送至体内特定位置、组织或细胞类型的方法，所述方法包括向受试者施用本发明技术的多肽或本发明技术的组合物的步骤。
在一个实施方案中，本发明技术还涉及一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用本发明技术的多肽或本发明技术的组合物的步骤。
本发明技术还涉及一种用于治疗或改善选自增殖性疾病、炎性疾病、感染性疾病和自身免疫病的疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本发明技术的多肽或本发明技术的组合物。
本发明技术还涉及本发明技术的多肽或本发明技术的组合物在制造药物中的用途。
在另外的实施方案中，本发明技术涉及本发明技术的多肽或本发明技术的组合物在制造用于预防、治疗或改善选自增殖性疾病、炎性疾病、感染性疾病和自身免疫病的疾病的药物中的用途。
在本发明技术的一个实施方案中，所述治疗是组合治疗。
增殖性疾病可以是通过杀伤表达抗原的靶细胞来预防、治疗和/或改善的任何增殖性疾病。在一个实施方案中，所述增殖性疾病是癌症。
在一个实施方案中，所述癌症选自：癌、神经胶质瘤、间皮瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、腺癌：乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤、多发性骨髓瘤(包括意义未明的单克隆丙种球蛋白病、无症状性和有症状性骨髓瘤)、前列腺癌和伯基特淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝胆管癌、胆囊癌、小肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、尿道癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、胰腺内分泌癌、类癌、骨癌、皮肤癌、视网膜母细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、卡波西肉瘤、多中心型卡斯尔曼病或艾滋病相关原发性渗出性淋巴瘤、神经外胚瘤、横纹肌肉瘤；以及上述任何癌症的任何转移。
在一个具体实施方案中，增殖性疾病是可以通过杀伤表达CD123的细胞来预防、治疗和/或改善的增殖性疾病。在一个具体实施方案中，所述增殖性疾病是癌症。基于本文的公开内容，与CD123过表达相关的癌症的例子对于技术人员来说将是清楚的，并且例如包括(而不限于)以下癌症：淋巴瘤(包括伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、白血病(包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性B成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病和毛细胞白血病)、骨髓增生异常综合征、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、系统性肥大细胞增多症和多发性骨髓瘤。
因此，在一个具体实施方案中，所述癌症选自淋巴瘤(包括伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、白血病(包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性B成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病和毛细胞白血病)、骨髓增生异常综合征、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、系统性肥大细胞增多症和多发性骨髓瘤。
炎性疾病可以是通过杀伤表达抗原的靶细胞来预防、治疗和/或改善的任何炎性疾病。
在一个具体实施方案中，炎性疾病是可以通过杀伤表达CD123的细胞来预防、治疗和/或改善的炎性疾病。在一个具体实施方案中，炎性病症选自自身免疫性狼疮(SLE)、变态反应、哮喘和类风湿性关节炎。
如在本发明技术的上下文中所提及的“受试者”可以是任何动物，优选哺乳动物。在哺乳动物中，可以将人和非人哺乳动物区分开。非人动物可以是例如伴侣动物(例如狗、猫)、家畜(例如牛、马、绵羊、山羊或猪动物)或通常用于研究目的和/或用于产生抗体的动物(例如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、山羊、绵羊、马、猪、非人灵长类动物(如食蟹猴)或骆驼科动物(如美洲驼或羊驼))。
在预防性和/或治疗性目的的情境下，受试者可以是任何动物，并且更具体地是任何哺乳动物，但优选地是人受试者。
如对于技术人员将清楚的，待治疗的受试者将特别是患有本文提及的疾病和病症或处于本文提及的疾病和病症风险中的人。
如本文所用，在向受试者施用一种或多种疗法的上下文中，术语“治疗”(“treat”、“treatment”和“treating”)是指减少或改善与过度增殖性细胞障碍相关的障碍(例如癌症)的进展、严重性和/或持续时间，和/或改善所述障碍的由施用一种或多种疗法(包括但不限于施用一种或多种预防剂或治疗剂)导致的一种或多种症状。在具体实施方案中，在向受试者施用一种或多种疗法的上下文中，术语“治疗”(“treat”、“treatment”和“treating”)是指减少或改善过度增殖性细胞障碍(例如癌症)的进展、严重性和/或持续时间，是指相对于对照(例如阴性对照，如磷酸盐缓冲盐水)将癌细胞减少至少5％，优选至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。在其他实施方案中，在向受试者施用一种或多种疗法的上下文中，术语“治疗”(“treat”、“treatment”和“treating”)是指减少或改善过度增殖性细胞障碍(例如癌症)的进展、严重性和/或持续时间，是指癌症受试者的癌细胞数量没有变化、住院治疗时间减少、死亡率降低或存活时间增加。
如本文所用，术语“疗法”是指可用于治疗、预防和/或管理过度增殖性细胞障碍(例如癌症)的任何方案、方法和/或药剂。在某些实施方案中，术语“疗法”(“therapies”和“therapy”)是指可用于治疗、预防和/或管理过度增殖性细胞障碍(例如癌症)或其一种或多种为本领域技术人员如医务人员所知的症状的生物疗法、支持疗法和/或其他疗法。
当两种或更多种物质或主成分(principle)用作组合治疗方案的一部分时，它们可以通过相同的施用途径或通过不同的施用途径基本上同时或在不同时间(例如，基本上同时地、连续地或根据交替方式)施用。当物质或主成分通过相同的施用途径同时施用时，它们可以作为不同的药物配制品或组合物来施用，或者作为组合的药物配制品或组合物的一部分来施用，如技术人员将清楚的。
通常，在上述方法中，将使用本发明技术的单个ISVD或多肽。然而，组合使用两种或更多种本发明技术的ISVD或多肽在本发明技术的范围内。
本发明技术的多肽还可以与一种或多种其他药学活性化合物或主成分组合使用，即作为组合治疗方案，这可能会或可能不会导致协同效应。基于上述因素和专家判断，临床医生将能够选择此类另外的化合物或主成分，以及合适的组合治疗方案。
特别地，本发明技术的多肽可以与用于或可用于预防和/或治疗过度增殖性细胞障碍(例如癌症)、本文引用的疾病和/或障碍的其他药物活性化合物或主成分组合使用，其结果为可能会或可能不会获得协同效应。此类化合物和主成分的例子以及用于施用它们的途径、方法和药物配制品或组合物对临床医生来说是清楚的。
本发明技术的多肽和组合物可用于预防和/或治疗本发明技术的疾病和障碍(本文也为“本发明技术的疾病和障碍”)，包括但不限于癌症。术语“癌症”是指哺乳动物中通常表征为失调的细胞增殖或存活的病理状况。癌症的例子包括但不限于癌、神经胶质瘤、间皮瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、腺癌：乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤、多发性骨髓瘤(包括意义未明的单克隆丙种球蛋白病、无症状性和有症状性骨髓瘤)、前列腺癌和伯基特淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝胆管癌、胆囊癌、小肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、尿道癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、胰腺内分泌癌、类癌、骨癌、皮肤癌、视网膜母细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、卡波西肉瘤、多中心型卡斯尔曼病或艾滋病相关原发性渗出性淋巴瘤、神经外胚瘤、横纹肌肉瘤(另外的癌症参见例如Cancer,Principles andpractice(DeVita等人编1997))；以及上述任何癌症的任何转移。
可以将物质(包括多肽、核酸分子和载体)或组合物通过任何合适的施用途径施用于受试者，所述合适的施用途径例如通过肠内(如口服或直肠)或肠胃外(如表皮、舌下、颊、鼻、关节内、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、经皮、或经粘膜)施用。肠胃外施用，如肌内、皮下或皮内施用是优选的。
可将有效量的多肽、如本文所述的核酸分子或载体或包含所述多肽、核酸分子或载体的组合物施用于受试者，以提供预期的治疗结果。
可以施用一个或多个剂量。如果施用多于一个剂量，则可以以合适的间隔施用剂量，以使所述多肽、组合物、核酸分子或载体的作用最大化。
当两种或更多种物质或主成分(principle)用作组合治疗方案的一部分时，它们可以通过相同的施用途径或通过不同的施用途径基本上同时或在不同时间(例如，基本上同时地、连续地或根据交替方式)施用。当物质或主成分通过相同的施用途径同时施用时，它们可以作为不同的药物配制品或组合物来施用，或者作为组合的药物配制品或组合物的一部分来施用，如技术人员将清楚的。
通常，在上述方法中，将使用本发明技术的单个ISVD或多肽。然而，组合使用两种或更多种本发明技术的ISVD或多肽在本发明技术的范围内。
本发明技术的多肽还可以与一种或多种其他药学活性化合物或主成分组合使用，即作为组合治疗方案，这可能会或可能不会导致协同效应。基于上述因素和专家判断，临床医生将能够选择此类另外的化合物或主成分，以及合适的组合治疗方案。
特别地，本发明技术的多肽可以与用于或可用于预防和/或治疗过度增殖性细胞障碍(例如癌症)、本文引用的疾病和/或障碍的其他药物活性化合物或主成分组合使用，其结果为可能会或可能不会获得协同效应。此类化合物和主成分的例子以及用于施用它们的途径、方法和药物配制品或组合物对临床医生来说是清楚的。
表A-1：结合TCR恒定结构域的单价ISVD的序列(“ID”是指本文所用的SEQ ID NO)
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*()指示引入ISVD中的氨基酸取代(例如：T017000681(D1E)意为ISVD T017000681(SEQ ID NO:152)含有D1E取代)。
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表A-4：结合血清白蛋白的ISVD序列(“ID”是指如本文所用的SEQ ID NO)
表A-5：接头序列(“ID”是指如本文所用的SEQ ID NO)
表A-6：与CD3、TCR和CD123相关的氨基酸序列(“ID”是指如本文所用的给定SEQ IDNO)
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表A-7：C末端和C末端延伸(“ID”指如本文所用的给定SEQ ID NO)
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表A-8：其他单价ISVD的氨基酸序列
表A-9：选择的多价多肽的氨基酸序列(“ID”是指给定的SEQ ID NO)
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6实施例
6.1实施例1：用于序列优化的亲本TCR结合ISVD
对与T细胞受体的恒定结构域结合的免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)T0170056G05进行了序列优化。T0170056G05的序列描绘于图1中。
免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)T0170056G05先前在公开号为WO 2016180969A1的国际申请中开发并描述。前述申请在其实施例中描述了能够与T细胞上存在的T细胞受体的恒定结构域结合的ISVD的产生。在将这种结合TCR的ISVD与结合靶细胞上表达的抗原的第二(和/或第三)ISVD编排在一起后，展现出那些多特异性形式杀伤表达抗原的靶细胞的能力。因此，这种多特异性形式能够将T细胞重定向至靶细胞并随后诱导T细胞激活，从而导致靶细胞裂解。
如申请WO 2016180969中所例示，生成ISVD文库并在结合测定中筛选以鉴定能够与T细胞受体(TCR)的恒定结构域结合的ISVD。对经鉴定命中物的序列分析导致鉴定出3种不同的ISVD簇。从这些ISVD中，属于簇A的代表物如ISVD T0170056G05通常展现出关于结合人TCR恒定结构域的最佳EC50值。另外，可以观察到关于结合食蟹猴TCR恒定结构域的一些交叉反应性。然而，如WO 2016180969中的实施例18.4所示，在生化测定中，发现表征的簇A代表物与食蟹猴TCR结合的亲和力比与人TCR的结合的亲和力低10倍。
鉴于猴子通常被认为是最适合进行临床前研究(包括功效和毒性研究)的动物物种这一事实，因此开始努力优化簇A ISVD T0170056G05的序列，旨在改善关于结合来自人和非人灵长类动物(如食蟹猴或恒河猴)来源的TCR的交叉反应性。
另外，出于人源化、翻译后修饰位点的敲除、去免疫、提高稳定性和减少潜在的预先存在的抗体的结合的目的，对序列进行了优化。
6.2实施例2：工具
人TCR(2XN9)-拉链蛋白和食蟹猴TCR(AEA41865/AEA41866)-拉链蛋白
可溶性人和食蟹猴TCRα/β蛋白在内部产生。
人TCRα/β恒定结构域的胞外部分的序列源自UniProtKB P01848(TCRα)和P01850(TCRβ)。人TCRα/β可变结构域源自PDB代码为2XN9的晶体结构序列。
食蟹猴TCRα/β恒定结构域的胞外部分的序列分别源自GenBank文件AEA41865(α链)和AEA41868(β链)。TCRα/β可变结构域的序列分别源自AEA41865(α链)和AEA41866(β链)。内部测序证实，最初源自恒河猴的前述恒定结构域序列与来自食蟹猴的那些序列相同。
人TCRα/β(2XN9)或食蟹猴TCRα/β的胞外结构域与拉链蛋白编码序列融合(O'Shea等人1993Curr.Biol.3(10):658-667)。出于纯化目的，添加His标签或Flag标签。拉链蛋白的所得氨基酸序列分别为具有SEQ ID NO:318(人α链)、319(人β链)、320(食蟹猴α链)和321(食蟹猴β链)的那些序列。
拉链蛋白由CHOK1SV细胞(Lonza)使用Lonza的GS Gene Expression SystemTM产生，并随后纯化。
TCRαβ/CD3转染的细胞系
产生了稳定的CHO-K1(ATCC：CCL-61)和HEK293H(Life Technologies 11631-017)细胞系，在这些细胞系中重组过表达全人或食蟹猴T细胞受体复合物的所有6条链(CHO-K1huTCR(2XN9)/huCD3、CHO-K1 huTCR(3TOE)/huCD3、HEK293H huTCR(2IAN)/huCD3、CHO-K1cyTCR/cyCD3)。为此，将TCRα(α)和TCRβ(β)链的编码序列克隆到pcDNA3.1衍生的载体中CMV启动子的下游，并且将2A样病毒肽序列插入两条链之间以在多蛋白的翻译过程中诱导核糖体跳跃。在同一载体中，也在各个链之间使用2A样病毒肽序列，将CD3复合物的ε、δ、γ和ζ链的编码序列克隆到另一个CMV启动子的下游。
对于人CD3和人TCRα/β恒定结构域使用的序列源自UniProtKB(CD3δ：P04234，CD3γ：P09693，CD3ε：P07766，CD3ζ：P20963，TCRα：P01848，以及TCRβ：P01850；分别为SEQ IDNO:300至305)。人TCRα/β可变结构域的序列源自晶体结构序列(PDB代码：2IAN、2XN9和3TOE)(人TCRα可变结构域源自分别具有SEQ ID NO:306至308的2IAN、2XN9和3TOE；人TCRβ可变结构域源自分别具有SEQ ID NO:309至311的2IAN、2XN9和3TOE)。
对于过表达食蟹猴TCR/CD3复合物的细胞系，使用以下序列。CD3结构域的序列源自食蟹猴，UniProtKB为CD3δ：NP_001274617，CD3γ：BAJ16168，CD3ε：Q95LI5，CD3ζ：XP_005539936(分别为SEQ ID NO:312至315)。TCRα/β链(恒定和可变结构域)的序列源自恒河猴，GenBank文件号为AEA41863(TCRα)和AEA41864(TCRβ)(分别为SEQ ID NO:316和317)。如上所述，内部已证实恒河猴TCRα/β恒定结构域的氨基酸序列与来自食蟹猴的TCRα/β恒定结构域相同。
人和食蟹猴原代T细胞
使用RosetteSep(StemCell Technologies，15061)从健康志愿者血液(Bloodbank Gent)的血沉棕黄层部分收集人T细胞，随后根据制造商的说明在Ficoll-PaqueTMPLUS(GE Healthcare，17-1440-03)上富集。在流式细胞术测定中，将经纯化人T细胞的品质和纯度用抗CD3(eBioscience，12-0037-73)、抗CD8(BD Biosciences，555367)、抗CD4(BDBiosciences，345771)、抗CD45RO(BD Biosciences，555493)、抗CD45RA(BD Biosciences，550855)、抗CD19(BD Biosciences，555413)、抗CD25(BD Biosciences，557138)和抗CD69(BD Biosciences，557050)荧光标记抗体检查。将细胞在液氮中冷冻。食蟹猴T细胞由LPTLaboratory of Pharmacology and Toxicology GmbH&Co.KG使用全T细胞分离试剂盒(MACS，130-091-993)分离。
CHO Flp-In细胞和CHO FLP-In huCD123细胞
使用Flp-InTM定点重组技术(用于通过Flp重组酶介导的整合产生稳定哺乳动物表达细胞系的Flp-InTM系统(Invitrogen，K601001，K601002))产生重组过表达了CD123的稳定CHO Flp-In(Invitrogen，R758-07)细胞系。特此，由源自酿酒酵母的Flp重组酶(pOG44)在FRT(Flp重组靶标)位点的特定基因组位置发生DNA整合。Flp-InTM宿主细胞系和表达质粒(pcDNA5)均含有该FRT位点，由此允许进行单一同源DNA重组。人CD123的序列源自NCBIRefSeq NP_002174(SEQ ID NO:379)。
6.3实施例3：序列优化
序列优化是亲本ISVD序列发生突变的过程。这个过程涵盖ISVD的人源化并敲除用于翻译后修饰的位点以及针对潜在的预先存在的抗体的表位。
人源化是如下过程，其中亲本ISVD序列被突变为使其与人IGHV3-IGHJ种系共有序列更同源。在ISVD与人IGHV3-IGHJ种系共有序列之间不同的在框架区中的特定氨基酸以这样的方式改变为人对应物，即使得蛋白质结构、活性和稳定性保持完好。
此外，存在于CDR中且有实验证据表明它们对翻译后修饰(PTM)敏感的氨基酸以这样的方式改变，即使得PTM位点失活而蛋白质结构、活性和稳定性则保持完好。
产生了亲本ISVD T0170056G05的基本序列优化变体，所述变体在其框架区中含有三个突变(L11V、K83R和V89L)。His标记的基本变体(即T0170056G05(L11V、K83R、V89L)-His6)在本文中命名为T0170000351，而带Flag3-His6标签的基本变体(即T0170056G05(L11V、K83R、V89L)-Flag3-His6)在本文称为T017000141。产生了两种另外的变体，每个变体在其框架区中都含有一个另外的突变，即M77T(对于变体T017000343)或F91Y(对于变体T017000345)。所有变体均表示为带His6标签的蛋白质。
对变体进行表征并与亲本ISVD(T0170056G05)和/或基本序列优化变体(T017000351)进行比较。在几种测定中进行了表征，所述测定包括评估与CHO-K1 huTCR(2XN9)/huCD3和人原代T细胞的结合，对食蟹猴TCR(AEA41865/AEA41866)-拉链蛋白和人TCR(2XN9)-拉链蛋白的解离速率分析(Proteon)，以及在热位移测定(TSA)中对熔解温度(Tm)的确定。下文更详细地描述了这些测定。
通过流式细胞术评价纯化的单价ISVD变体与CHO-K1 huTCR(2XN9)/huCD3过表达细胞或人原代T细胞的剂量依赖性结合。简而言之，将细胞收获并转移至V型底96孔板(Greiner Bio-one，651 180；5x 105个细胞/孔)，并在FACS缓冲液(来自Gibco的D-PBS，具有来自Sigma的2％ FBS和来自Merck的0.05％叠氮化钠)中在4℃下与ISVD的系列稀释物一起孵育30min。接下来，将细胞用FACS缓冲液洗涤3次，并与1μg/ml THETM His标签抗体小鼠mAb(Genscript，A00186)一起孵育并再次洗涤。在4℃下与R-藻红蛋白-AffiniPure F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG(Fcγ片段特异性)(Jackson Immunoresearch，115-116-07)孵育30min后检测结合。随后，将细胞重悬浮在补充有5nM碘化物的FACS缓冲液中，以区分活细胞和死细胞，这些死细胞在门控程序期间被去除。使用FACS阵列流式细胞仪(BDBiosciences)和Flowing软件分析细胞。首先，基于FSC-SSC分布选择占总细胞群体超过80％的P1群体。在这个门中，在采集过程中计数10000个细胞。从该群体中排除/>+细胞(死细胞)，并计算平均荧光强度(MFI)PE值。/>
在ProteOn XPR36仪器上通过SPR测定带标签的纯化单价ISVD对重组TCR的解离速率。通过胺偶联化学使用EDC/NHS(以激活芯片表面上的羧基)将HuTCR-拉链或cyTCR拉链蛋白固定在GLC传感器芯片(100-200RU之间)上(运行缓冲液：HBS-EP+，pH 7.4)。以不同浓度(4.1nM与1000nM之间)注射纯化的ISVD持续2min(流速为45μL/min)，随后解离900s。通过减去参考配体泳道和空白缓冲液注射物来对数据进行双重参比。使用ProteOn Manager3.1.0(3.1.0.6版)软件将处理后的传感图用朗缪尔(Langmuir)模型(1:1相互作用)拟合。
热位移测定(TSA)在LightCycler 480II机器(Roche)上的96孔板中进行。每行中，在以下pH下分析一种ISVD：3.5/4/4.5/5/5.5/6/6.5/7/7.5/8/8.5/9。每孔中，将5μL ISVD样品(0.8mg/mL于PBS中)添加至5μL Sypro Orange(40x于MilliQ水中；Invitrogen目录号S6551)和10μL缓冲液(100mM磷酸盐、100mM硼酸盐、100mM柠檬酸盐和115mM NaCl，pH范围为3.5至9)中。应用的温度梯度(37℃至99℃，速率为0.03℃/s)诱导ISVD展开，从而暴露疏水性补丁(patch)。Sypro Orange与那些疏水性补丁结合，导致荧光强度增加(Ex/Em＝465/580nm)。在pH 7时荧光强度曲线的一阶导数的拐点用作熔解温度(Tm)的量度。
引入的突变对蛋白质结构、活性和稳定性没有负面影响(见表1)。
表1：抗TCR ISVD T01700056G05的表征数据和产生的变体。根据Kabat编号，突变由其对应位置的氨基酸一字母代码指示。圆点反映在某个位置的氨基酸与亲本ISVDT01700056G05的CDR中相同位置的氨基酸相同。
6.4实施例4：亲和力成熟
选择含有三个突变L11V、K83R和V89L的T0170056G05(即T017000141)的基本序列优化变体用于亲和力成熟。
亲和力成熟分两个步骤进行。在第一个步骤中，为每种CDR构建所有CDR位置(CDR1为10个，CDR2为9个，CDR3为9个)的合并单一位点饱和文库。每个单一位点饱和文库都使用根据22c-trick方法设计的引物来构建(Kille等人ACS Synth.Biol.,2013,2(2),第83-92页)。通过对cyTCR-拉链蛋白和huTCR-拉链蛋白的ELISA和解离速率分析(Proteon)筛选导致改善结合的单独突变。
ELISA如下进行。将Maxisorp 96孔ELISA板直接用PBS中的huTCR-拉链或cynoTCR-拉链蛋白包被，并在4℃下孵育过夜。将板用PBS+0.05％ Tween20洗涤并用PBS+1％酪蛋白封闭1小时。将含有ISVD的周质提取物(1/10稀释于PBS+0.1％酪蛋白+0.05％Tween20中)添加至板中，并在室温下孵育1小时。洗涤后，使用1/5000稀释的单克隆M2-过氧化物酶(HRP)抗体(Sigma，A8592)和esTMB(SDT，esTMB)底物检测ISVD的结合。使用1M HCl孵育25min后停止反应，并在450nm处测量OD信号。/>
对ELISA中具有最高结合信号的克隆进行测序。随后选择并筛选独特的ISVD克隆，即具有独特序列的克隆，以确定它们的解离速率。出于此目的，在ProteOn XPR36仪器上通过SPR在huTCR-拉链和cyTCR-拉链蛋白上筛选含有ISVD的周质提取物。通过胺偶联化学使用EDC/磺基-NHS(以激活芯片表面上的羧基)将拉链蛋白固定在GLC传感器芯片(4300与5100RU之间)上(运行缓冲液：HBS-EP+，pH 7.4)。将周质提取物以1/10稀释度注射2min(流速为45μL/min)，并随后解离900s。以45μL/min使用100s的3M MgCl2脉冲进行再生。通过减去参考配体泳道和空白缓冲液注射物来对数据进行双重参比。使用ProteOn Manager3.1.0(3.1.0.6版)软件将处理后的传感图用朗缪尔(Langmuir)模型(1:1相互作用)拟合。
筛选导致鉴定出29种独特克隆，这些克隆显示出改善的在人TCR-拉链蛋白和/或食蟹猴TCR-拉链蛋白上的解离速率。表2、3和4分别描述了针对CDR1、CDR2和CDR3变体的所有鉴定的克隆、其CDR中的相应突变、解离速率数据和观察到的作用。
表2：CDR1变体的解离速率分析。突变由其在CDR中对应位置的氨基酸一字母代码指示(根据Kabat编号)。圆点反映在某个位置的氨基酸与基本序列优化变体T017000141的CDR中相同位置的氨基酸相同。如果突变导致改善的在人或食蟹猴TCR上的解离速率，则在列出作用的列中指示为加号。
表3：CDR2变体的解离速率分析。突变由其在CDR中对应位置的氨基酸一字母代码指示(根据Kabat编号)。圆点反映在某个位置的氨基酸与基本序列优化变体T017000141的CDR中相同位置的氨基酸相同。如果突变导致改善的在人或食蟹猴TCR上的解离速率，则在列出作用的列中指示为加号。
表4：CDR3变体的解离速率分析。突变由其在CDR中对应位置的氨基酸一字母代码指示(根据Kabat编号)。圆点反映在某个位置的氨基酸与基本序列优化变体T017000141的CDR中相同位置的氨基酸相同。如果突变导致改善的在人或食蟹猴TCR上的解离速率，则在列出作用的列中指示为加号。
在第二个步骤中，划分在CDR1和CDR3中的9个位置上的12个单突变被组合在组合文库中。该文库还包括所有9个位置的亲本氨基酸，从而产生具有1536个变体的理论多样性的文库(设计见表5)。该文库含有这些突变的所有可能组合，从而产生没有突变和多达9个突变的变体。该文库是通过使用编码每个位置的不同所需氨基酸的引物进行重叠延伸PCR产生的。
表5：组合文库设计
如上所述，通过ELISA筛选具有导致改善的结合的多个突变的变体。随后对具有最高结合信号的克隆进行测序，并对具有独特序列的克隆进行在cyTCR-拉链蛋白和人TCR-拉链蛋白上的解离速率分析(Proteon)，同样如上所述。在稍后阶段，产生并筛选了在位置95处具有亮氨酸的其他变体。
筛选工作导致鉴定出91种独特克隆，这些克隆与T017000141相比显示出改善的在huTCR-拉链蛋白和/或cyTCR-拉链蛋白上的解离速率。表6中描述了所有鉴定的ISVD变体及其在CDR1和/或CDR3中的相应突变以及解离速率数据。
57种变体与基本变体T017000141相比在人/食蟹猴交叉反应性方面的相对差异更低。共鉴定出34种ISVD变体，其中人/食蟹猴交叉反应性的差距为5倍或更低。这种差距可能有利于人TCR或食蟹猴TCR结合。
表6：来自组合文库的ISVD变体的解离速率分析。突变由其在CDR中对应位置的氨基酸一字母代码指示(根据Kabat编号)。圆点反映在某个位置的氨基酸与基本序列优化变体T017000141的CDR中相同位置的氨基酸相同。如果突变导致改善的在人或食蟹猴TCR上的解离速率(即更慢的解离，如更低的值所反映的)，则在列出作用的列中指示为加号。作用栏另外描述了关于与人和食蟹猴TCR的结合的相对差异。
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*ISVD的人/食蟹猴交叉反应性的解离速率差距是基于测量的ISVD在人TCR和食蟹猴TCR拉链蛋白上的解离速率，通过将较高的解离速率值除以较低的解离速率值计算的。
6.5实施例5：进一步的亲和力成熟和序列优化
在第二波中，产生了另一组序列优化变体，其中在框架中具有另外的突变M77T和F91Y从而产生一组变体，这些变体在框架区中含有以下突变：L11V、M77T、K83R、V89L和F91Y。除了框架区中的这5个突变之外，CDR区中关于亲和力成熟的突变是以下中的一些：在CDR1中的G26W、G26Y、D27Y、D27E、D27A、D27S、K30Q、L34Y、G35T，以及在CDR3中的F95L、R97K和Y99W。对于亲本ISVD T0170056G05和基本序列优化变体T017000141的第二波ISVD变体及其CDR突变描述于表7和表8中。
将ISVD变体关于与CHO-K1 huTCR(2XN9)/huCD3或与人和食蟹猴原代T细胞的结合进行表征。简而言之，通过流式细胞术评价纯化的单价ISVD(带Flag3-His6标签)与细胞上表达的人或食蟹猴TCR/CD3的剂量依赖性结合。简而言之，将细胞收获并转移至V型底96孔板(Greiner Bio-one，651 180；5x 105个细胞/孔)，并在FACS缓冲液(来自Gibco的D-PBS，具有来自Sigma的2％ FBS和来自Merck的0.05％叠氮化钠)中在4℃下与ISVD的系列稀释物一起孵育30min。接下来，将细胞用FACS缓冲液洗涤3次，并与1μg/mlM2Ab(Sigma，F1804)一起孵育并再次洗涤。在4℃下与R-藻红蛋白-AffiniPure F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG(Fcγ片段特异性)(Jackson Immunoresearch，115-116-07)孵育30min后检测细胞结合。随后，将细胞重悬浮在补充有5nM/>碘化物的FACS缓冲液中，以区分活细胞和死细胞，这些死细胞在门控程序期间被去除。使用FACS阵列流式细胞仪(BDBiosciences)和Flowing软件分析细胞。首先，基于FSC-SSC分布选择占总细胞群体超过80％的P1群体。在这个门中，在采集过程中计数10000个细胞。从该群体中排除/>+细胞(死细胞)，并计算平均荧光强度(MFI)PE值。
通过以下进一步表征ISVD变体：在人TCR-和食蟹猴TCR-拉链蛋白上的解离速率分析，以及熔解温度(Tm)的确定，如实施例4中所述。
产生的变体和获得的结果可以在表7和表8中找到。在食蟹猴原代T细胞上获得的结合数据描绘于图2中。
表7：第二波ISVD变体的解离速率数据。CDR突变由其在CDR中对应位置的氨基酸一字母代码指示(根据Kabat编号)。圆点反映在某个位置的氨基酸与基本序列优化变体T017000141的CDR中相同位置的氨基酸相同。如果突变导致改善的在人或食蟹猴TCR上的解离速率，则在列出作用的列中指示为加号。作用栏另外描述了关于与人和食蟹猴TCR的结合的相对差异。
*ISVD的人/食蟹猴交叉反应性的解离速率差距是基于测量的ISVD在人TCR和食蟹猴TCR拉链蛋白上的解离速率，通过将较高的解离速率值除以较低的解离速率值计算的。
对于人TCR-和食蟹猴TCR-拉链蛋白二者，所有变体均显示出较慢的解离速率。四种第二波变体，即T017000623、T017000624、T017000625和T017000641，被鉴定为具有5倍或更低的人/食蟹猴交叉反应性差距。所述差距可能有利于人TCR或食蟹猴TCR结合。变体T017000635、T017000638、T017000690和T017000691显示出最低的在人TCR-拉链蛋白上的解离速率。
表8：第二波ISVD变体的流式细胞术结合数据和熔解温度。ND：未确定
6.6实施例6：二价CD123/TCR双特异性ISVD形式的构建和表征
为了探索TCR构建块的亲和力成熟和序列优化对T细胞接合器形式的亲和力和效力的影响，产生了CD123/TCR双特异性ISVD形式。使用35GS接头将不同的TCR ISVD变体与作为靶结合部分的抗CD123 ISVD(A0110056A10)在两个取向上融合。出于比较目的，使用亲本ISVD T0170056G05产生类似的形式。
产生的形式列于表9中。
表9：CD123/TCR双特异性ISVD形式和对照的形式ID和描述
在基于流式细胞术的细胞毒性测定中，使用人或食蟹猴原代T细胞作为效应细胞以及MOLM-13(DSMZ ACC 554)(即表达CD123的细胞系)作为靶细胞，针对重定向T细胞介导的杀伤来表征CD123/TCR双特异性ISVD形式。根据制造商的说明，使用PKH26红色荧光细胞接头试剂盒(Sigma，PKH26GL-1KT)用4μM PKH-26膜染料标记靶细胞。将效应细胞(2.5x 105个细胞/孔)和PKH标记的靶细胞(2.5x 104个细胞/孔)在96孔V型底板(Greiner Bio-one，#651 180)中在靶细胞系的测定培养基(不具有抗生素的靶标生长培养基)中共同孵育(效应物与靶标比率为10:1)。为了分析浓度依赖性细胞裂解，将靶标测定培养基中ISVD形式的系列稀释物添加到细胞中，并在37℃在5％ CO2气氛中孵育18h。孵育后，通过离心使细胞沉淀并用FACS缓冲液(来自Gibco的D-PBS，具有来自Sigma的10％ FBS和来自Merck的0.05％叠氮化钠)洗涤。随后，将细胞重悬浮在补充有5nM碘化物(642/661)(ThermoFisher Scientific，T3605)的FACS缓冲液中，以区分活细胞和死细胞。使用FACS阵列流式细胞仪(BD Biosciences)分析细胞。每个样品采集的总样品体积为80μL。对PKH26阳性细胞设置门控，并在该群体中测定/>阳性细胞。特异性裂解百分比＝((％+无ISVD–％/>+有ISVD)/(％/>+无ISVD))x100。
在用人T细胞的MOLM-13杀伤测定中获得的EC50值和裂解％总结在表10中。用食蟹猴T细胞获得的数据如表11中所述。
表10：在以10:1的E:T比率使用人原代T细胞的基于流式细胞术的T细胞介导的MOLM-13细胞杀伤测定中CD123/TCR ISVD形式的EC50(M)和裂解％。
表11：在以10:1的E:T比率使用食蟹猴原代T细胞的基于流式细胞术的T细胞介导的MOLM-13细胞杀伤测定中CD123/TCR ISVD形式的EC50(M)和裂解％。
在人T细胞介导的MOLM-13细胞杀伤测定中，在N末端位置含有不同TCR ISVD变体的所有形式至少与含有T0170056G05作为TCR构建块的形式的效力一样。与在N末端具有亲本ISVD T01700056G05的T017000128形式相比，在用食蟹猴T细胞的测定中，在N末端位置具有抗TCR ISVD变体的所有形式都可以观察到改善的效力。
在C末端位置含有不同抗TCR ISVD变体的一组形式中，在T细胞介导的MOLM-13细胞杀伤测定中效力最强的形式是T017000634，其包含抗TCR ISVD变体T017000624。与T017000131(其在C末端包含亲本ISVD T0170056G05)相比，在用人和食蟹猴原代T细胞的测定中，效力显著改善。
6.7实施例7：通过SPR得出的CD123/TCR双特异性ISVD形式与TCR蛋白的结合
CD123/TCR双特异性ISVD形式对重组可溶性人和食蟹猴TCR的结合亲和力是通过SPR在ProteOn XPR36仪器上在25℃测定的。通过胺偶联化学使用EDC/NHS(以激活芯片表面上的羧基)将HuTCR-拉链或cyTCR拉链蛋白固定在GLC传感器芯片(100-200RU之间)上(运行缓冲液：HBS-EP+，pH 7.4)。以不同浓度(4.1nM与1000nM之间)注射纯化的ISVD形式持续2min(流速为45μL/min)，随后解离900s。通过减去参考配体泳道和空白缓冲液注射物来对数据进行双重参比。使用ProteOn Manager 3.1.0(3.1.0.6版)软件将处理后的传感图用朗缪尔(Langmuir)模型(1:1相互作用)拟合。
在N末端具有抗TCR ISVD的形式的数据示出在表12中。在C末端具有抗TCR ISVD的形式的数据描述于表13中。
表12：如通过SPR在ProteOn XPR36仪器上在25℃测定的ISVD形式对人TCR-拉链蛋白的结合亲和力。
表13：如通过SPR在ProteOn XPR36仪器上在25℃测定的ISVD形式对食蟹猴TCR-拉链蛋白的结合亲和力。
在N末端位置含有不同TCR ISVD变体的所有形式具有至少与含有T0170056G05作为TCR构建块的形式相似的对人TCR的结合亲和力。与在N末端具有亲本ISVD T01700056G05的形式T017000128相比，对于在N末端位置具有抗TCR ISVD变体的所有形式可以观察到改善的对食蟹猴TCR的结合亲和力。
与含有亲本ISVD T0170056G05的参考形式相比，当位于双特异性ISVD形式的C末端或N末端位置时，T017000624是唯一一种对人和食蟹猴重组蛋白都可以观察到改善的亲和力的变体。
因此，以单价并在CD123/TCR双特异性ISVD形式的背景下进一步深入表征这种ISVD变体。
6.8实施例8：通过SPR在ProteOn SPR36上分析与TCR蛋白的结合
以纯化的单价ISVD表征与亲本ISVD T0170056G05相比序列优化的亲和力成熟的抗TCR ISVD T017000624，以评价亲和力和稳定性。
表14：亲本抗TCR ISVD(T0170056G05)、基本序列优化变体(T017000141)和序列优化的亲和力成熟的变体T017000624的氨基酸差异列表。
T017000624和T0170056G05与直接固定的huTCR-拉链和cyTCR-拉链蛋白的结合动力学分析在25℃进行。
T0170056G05对重组可溶性人和食蟹猴TCR的亲和力是使用生物层干涉测量法(BLI)在Octet RED384仪器(Pall ForteBio Corp.)上测定的。HuTCR-拉链或cyTCR-拉链蛋白通过NHS/EDC偶联化学共价固定在胺反应性传感器上。对于动力学分析，首先将传感器浸入运行缓冲液(10mM Hepes、150mM NaCl、0.05％p20、pH 7.4，来自GE Healthcare LifeSciences)中以确定基线设置。随后，将传感器浸入含有不同浓度的纯化ISVD(范围为1.4nM至1mM)的孔中以用于缔合步骤(180s)，并转移至含有运行缓冲液的孔中以用于解离步骤(15min)。使用ForteBio数据分析软件应用1:1相互作用模型计算亲和力常数(KD)。
T017000624对重组可溶性人和食蟹猴TCR的亲和力是通过SPR在ProteOn XPR36仪器上测定的。通过胺偶联化学使用EDC/NHS(以激活芯片表面上的羧基)将HuTCR-拉链或cyTCR拉链蛋白固定在GLC传感器芯片(100-200RU之间)上(运行缓冲液：HBS-EP+，pH 7.4)。以不同浓度(4.1nM与1000nM之间)注射纯化的ISVD持续2min(流速为45μL/min)，随后解离900s。通过减去参考配体泳道和空白缓冲液注射物来对数据进行双重参比。使用ProteOnManager 3.1.0(3.1.0.6版)软件将处理后的传感图用朗缪尔(Langmuir)模型(1:1相互作用)拟合。
结合特征列于表15中。
表15：如通过表面等离子体共振使用Proteon XPR36测定的ISVD对huTCR-拉链和cyTCR-拉链蛋白的结合亲和力。
与T0170056G05相比，T017000624对huTCR-拉链蛋白的结合速率和解离速率分别提高了约3至约5倍，从而导致高15倍的亲和力(KD)。与T0170056G05相比，T017000624对cyTCR-拉链蛋白的解离速率提高了8倍，结合3倍提高的结合速率，导致高26倍的亲和力(KD)。基于KD，对于T017000624的人-食蟹猴交叉反应性差异为2.6倍，相比之下对于亲本ISVD为4.5倍。
6.9实施例9：通过流式细胞术得出的ISVD与TCR/CD3转染细胞的结合
在流式细胞术测定中针对与细胞上表达的TCR的结合来表征序列优化的亲和力成熟的抗TCR ISVD T017000624，并与亲本ISVD T0170056G05和不相关的抗卵溶菌酶ISVDcAbLys3进行比较，后者作为阴性对照。
通过流式细胞术评价纯化的单价ISVD(带Flag3-His6标签)与细胞上表达的人或食蟹猴TCR/CD3的剂量依赖性结合。简而言之，将细胞收获并转移至V型底96孔板(GreinerBio-one，651 180；5x 105个细胞/孔)，并在FACS缓冲液(来自Gibco的D-PBS，具有来自Sigma的2％ FBS和来自Merck的0.05％叠氮化钠)中在4℃下与ISVD的系列稀释物一起孵育30min。接下来，将细胞用FACS缓冲液洗涤3次，并与1μg/mlM2Ab(Sigma，F1804)一起孵育并再次洗涤。在4℃下与R-藻红蛋白-AffiniPure F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG(Fcγ片段特异性)(Jackson Immunoresearch，115-116-07)孵育30min后检测细胞结合。随后，将细胞重悬浮在补充有5nM/>碘化物的FACS缓冲液中，以区分活细胞和死细胞，这些死细胞在门控程序期间被去除。使用FACS阵列流式细胞仪(BD Biosciences)和Flowing软件分析细胞。首先，基于FSC-SSC分布选择占总细胞群体超过80％的P1群体。在这个门中，在采集过程中计数10000个细胞。从该群体中排除/>+细胞(死细胞)，并计算平均荧光强度(MFI)PE值。
剂量滴定曲线示于图3中。从剂量反应曲线获得的EC50值总结于表16和表17中。
表16：通过流式细胞术测定的T0170056G05和T017000624与人TCR/CD3转染细胞结合的EC50(M)和MFI(在1μM ISVD浓度下)。LCI：下置信区间，UCI：上置信区间
表17：通过流式细胞术测定的T0170056G05和T017000624与人和食蟹猴TCR/CD3转染细胞结合的EC50(M)和MFI(在1μM ISVD浓度下)。LCI：下置信区间，UCI：上置信区间
EC50值表明与在CHO-K1 huTCR(3TOE)/huCD3上具有略高MFI的T01700056G05相比，T017000624对CHO-K1 huTCR(2XN9)/huCD3的亲和力为1.7倍，对CHO-K1huTCR(3TOE)/huCD3为1.7倍，以及对HEK293H huTCR(2IAN)/CD3细胞为2倍。与T01700056G05相比，T017000624与cyTCR/cyCD3转染细胞系的结合更强，但由于滴定曲线不完整，无法确定EC50值。
6.10实施例10：通过流式细胞术得出的ISVD与原代T细胞的结合
在流式细胞术测定中针对与原代T细胞上表达的TCR的结合来表征序列优化的亲和力成熟的抗TCR ISVD T017000624，并与亲本ISVD T0170056G05和不相关的抗卵溶菌酶ISVD cAbLys3进行比较，后者作为阴性对照。
如实施例5中所述，通过流式细胞术评价纯化的单价ISVD(带Flag3-His6标签)与人和食蟹猴原代T细胞的剂量依赖性结合。
剂量滴定曲线示于图4中。从剂量反应曲线获得的EC50值总结于表18中。
表18：通过流式细胞术测定的T0170056G05和T017000624与人和食蟹猴原代T细胞结合的EC50(M)和MFI(在1μM ISVD浓度下)。LCI：下置信区间，UCI：上置信区间
剂量滴定曲线表明与TCR/CD3转染的细胞系相比，T017000624与人和食蟹猴原代T细胞的结合模式非常相似(实施例9)。如EC50值所指示，T017000624对人原代T细胞的亲和力是T0170056G05对人原代T细胞的亲和力的1.8倍；并且对食蟹猴原代T细胞的亲和力明显改善，由于滴定曲线不完整无法量化。
6.11实施例11：在T细胞介导的杀伤测定中CD123/TCR双特异性ISVD形式的功能表征
为了在T细胞接合器形式的背景下进一步比较序列优化的亲和力成熟的抗TCRISVD T017000624与亲本ISVD T017056G05，在两种不同的T细胞介导的杀伤测定中进一步表征其中T017000624和T0170056G05抗TCR ISVD与抗CD123 ISVD A0110056A10融合的双特异性形式。形式列于表19中。
表19：CD123/TCR双特异性形式的形式ID和描述
在基于流式细胞术的细胞毒性测定中，使用人或食蟹猴原代T细胞作为效应细胞以及非粘附性靶细胞，首先针对重定向T细胞介导的杀伤来表征CD123/TCR双特异性ISVD形式。根据制造商的说明，使用PKH26红色荧光细胞接头试剂盒(Sigma，PKH26GL-1KT)用4μMPKH-26膜染料标记CD123阳性靶细胞(MOLM-13、DSMZ ACC 554或KG-1a，CCL246.1TM)。将效应细胞(2.5x 105个细胞/孔)和PKH标记的靶细胞(2.5x 104个细胞/孔)在96孔V型底板(Greiner Bio-one，#651 180)中在靶细胞系的测定培养基(不具有抗生素的靶标生长培养基)中共同孵育(效应物与靶标比率为10:1)。为了分析浓度依赖性细胞裂解，将靶标测定培养基中ISVD形式的系列稀释物添加到细胞中，并在37℃在5％CO2气氛中孵育18h。孵育后，通过离心使细胞沉淀并用FACS缓冲液(来自Gibco的D-PBS，具有来自Sigma的10％ FBS和来自Merck的0.05％叠氮化钠)洗涤。随后，将细胞重悬浮在补充有5nM碘化物(642/661)(ThermoFisher Scientific，T3605)的FACS缓冲液中，以区分活细胞和死细胞。使用FACS阵列流式细胞仪(BD Biosciences)分析细胞。每个样品采集的总样品体积为80μL。对PKH26阳性细胞设置门控，并在该群体中测定/>阳性细胞。特异性裂解百分比＝((％/>+无ISVD–％/>+有ISVD)/(％+无ISVD))x100。
剂量滴定曲线示于图5中，并且IC50值总结在表20和表21中。
表20：使用10:1的E:T比率，在基于流式细胞术的T细胞介导的MOLM-13细胞杀伤测定中CD123/TCR ISVD形式的EC50(M)和裂解％。LCI：下置信区间，UCI：上置信区间
表21：使用10:1的E:T比率，在基于流式细胞术的T细胞介导的KG-1a细胞杀伤测定中CD123/TCR ISVD形式的EC50(M)和裂解％。LCI：下置信区间，UCI：上置信区间
随后，在基于阻抗的细胞毒性测定中，使用人或食蟹猴原代效应T细胞和粘附性CHO Flp-In huCD123靶细胞，针对重定向T细胞介导的杀伤来进一步表征CD123/TCR双特异性ISVD形式。使用xCELLigence仪器(Roche)测量由靶细胞粘附到电极表面引发的阻抗变化。T细胞是非粘附性的，因此不会影响阻抗测量。xCELLigence仪器(Roche)量化电阻抗的变化，将其显示为称为细胞指数(CI)的无量纲参数，该参数与细胞覆盖的组织培养孔的总面积成正比。向96E-板(ACEA Biosciences；05 232 368 001)的每个孔中添加50μL靶标测定培养基(不具有抗生素的靶标生长培养基)。将96E-板放置在xCELLigence站中(在37℃、5％ CO2的培养箱中)，并在xCELLigence系统上进行空白读数以测量不存在细胞时的背景阻抗。随后，将靶标测定培养基中的50μL靶细胞(2x 104个细胞/孔)接种到96E-板上，并添加50μl在靶标测定培养基中的系列稀释ISVD溶液。在室温下30min后，每孔添加在靶标测定培养基中的50μL原代T细胞(3x 105个细胞/孔)，以实现15:1的效应物与靶标比率。将板放置在xCELLigence站中，并每15min测量阻抗，持续3天。使用结果中指示的固定时间点分析数据。
剂量滴定曲线示于图6中，并且IC50值总结在表22中。
表22：使用15:1的E:T比率，在基于阻抗(xCELLigence)的T细胞介导的CHO Flp-InhuCD123细胞杀伤测定中CD123/TCR ISVD形式的IC50和抑制％。LCI：下置信区间，UCI：上置信区间
总体上，将T0170056G05替代为T017000624导致在所有T细胞介导的细胞杀伤测定中改善的效力和功效。食蟹猴相比人T细胞设置以及具有T017000624ISVD的C末端相比N末端定位的形式的改善更为明显。TCR ISVD的N末端定位导致更高的效力和功效。对于含有T0170056G05的CD123/TCR双特异性ISVD形式(T017000128和T017000131)，当TCR ISVD位于C末端位置时(T017000131)观察到低2-4倍的效力，以及除了一种设置(xCELLigence，hu T细胞)外显著更低的功效(细胞裂解％)。对于T017000633和T017000634(含有T017000624ISVD的CD123/TCR双特异性ISVD形式)的效力和功效，这些位置差异稍微不那么明显。效力最强和最有效的双特异性化合物是T017000633，其在N末端位置含有T017000624。然而，另外在C末端位置含有T017000624的形式T017000634比在N末端位置具有T0170056G05 ISVD的ISVD T017000128的效力更强。
6.12实施例12：三价CD123/TCR双特异性ISVD形式的构建
为了评价在多价T细胞接合器ISVD形式中TCR ISVD的亲和力成熟和序列优化的影响，产生了另外的形式，这些形式含有不同位置的TCR ISVD，以及使用35GS接头连接的2个不同的CD123效应ISVD。
为了评价T017000624在体外和体内的功效和安全性，产生了三价CD123/TCR双特异性ISVD形式(表23)。通过用不相关的抗RSV ISVD替代肿瘤抗原结合ISVD产生不相关的形式。将含有T0170056G05作为TCR构建块的形式T017000139即T0170056G05(E1D)-35GS-A0110055F03-35GS-A0110056A10-A用于比较目的。
表23：三价CD123/TCR双特异性ISVD形式和对照的形式ID和描述
6.13实施例13：在基于流式细胞术的T细胞介导的杀伤测定中三价CD123/TCR双特异性ISVD形式的功能表征
为了评估T017000624在三价ISVD形式中的位置是否对功能有影响，使用MOLM-13或KG-1a作为靶细胞以及人或食蟹猴T细胞作为效应细胞进行了基于流式细胞术的细胞毒性测定，如实施例11中所述。基于ISVD浓度依赖性靶细胞杀伤的剂量反应曲线示于图7中，并且数据总结在表24和表25中。
表24：在T细胞介导的MOLM-13细胞杀伤测定中，使用10比1的效应物与靶标比率，CD123/TCR三价双特异性ISVD形式的平均EC50(M)和裂解％(n＝独立实验的数量)。LCI：下置信区间，UCI：上置信区间
表25：在T细胞介导的KG-1a细胞杀伤测定中，使用10比1的效应物与靶标比率，CD123/TCR三价双特异性ISVD形式的平均EC50(M)和裂解％(n＝独立实验的数量)。LCI：下置信区间，UCI：上置信区间
所有缺乏CD123特异性的阴性对照形式(T017000672、T017000673、T017000674)都如预期的那样无活性。对于所有三价CD123/TCR双特异性形式(T017000670、T017000675、T017000676)，仅观察到很小的差异，其中在C末端位置含有抗TCR ISVD的形式与其N末端对应物相比效力相同且同样有效。至少对于N末端TCR形式T017000139，用T017000624ISVD替代T0170056G05对效力和功效几乎没有影响(T017000670相比T017000139)。
6.14实施例14：在基于阻抗的人和食蟹猴T细胞介导的CHO-K1细胞杀伤测定中三价CD123/TCR双特异性ISVD形式的功能表征
使用人或食蟹猴原代效应T细胞和粘附性CHO Flp-In huCD123或CHO Flp-In亲本靶细胞，在基于阻抗的细胞毒性测定(xCELLigence)中进一步表征CD123/TCR双特异性三价ISVD形式，如实施例11中所述。剂量反应曲线示于图8中，并且结果总结在表26中。
表26：使用15:1的E:T比率，在基于xCELLigence读出的T细胞介导的细胞杀伤测定中CD123/TCR三价双特异性ISVD形式的IC50和抑制％。LCI：下置信区间，UCI：上置信区间
基于阻抗的细胞杀伤结果与基于流式细胞术的细胞杀伤测定获得的结果一致。在C末端位置含有TCR ISVD的形式与其N末端对应物相比效力相同并同样有效。三价CD123/TCR双特异性ISVD形式未显示出对亲本CHO Flp-In细胞的杀伤。
6.15实施例15：去免疫
T017000624变体经历称为“去免疫”的过程。该过程包括鉴定潜在的T细胞表位，以及在不影响分子的结合特性和生物物理特性的情况下通过引入突变去除此类表位。鉴定出一个潜在的表位，其中L89作为P1锚定物并包含CDR3的一部分。根据计算机分析，突变为A或T是去除T细胞表位的预测方案。因此，在巴斯德毕赤酵母中产生了具有V89L、V89A、V89T的三种抗TCR ISVD变体(T017000679、T017000680、T017000681)(表27)，并进一步表征。
表27：在DC-T测定中评价的TCR变体的ISVD ID和描述。
| ISVD ID | 描述 |
| T017000679 | T0170056G05(E1D,L11V,D27Y,L34Y,M77T,K83R,V89L,F91Y,F95L,Y99W) |
| T017000680 | T0170056G05(E1D,L11V,D27Y,L34Y,M77T,K83R,V89A,F91Y,F95L,Y99W) |
| T017000681 | T0170056G05(E1D,L11V,D27Y,L34Y,M77T,K83R,V89T,F91Y,F95L,Y99W) |
6.16实施例16：通过SPR在ProteOn XPR36上得出的T017000680与TCR蛋白的结合
T017000680与直接固定的huTCR-拉链和cyTCR-拉链蛋白的结合动力学分析在基于SPR的测定中在ProteOn XPR36上在37℃进行。
简而言之，通过胺偶联化学使用EDC/NHS(以激活芯片表面上的羧基)将huTCR-拉链或cyTCR拉链蛋白固定在GLC传感器芯片(100-200RU之间)上(运行缓冲液：HBS-EP+，pH7.4)。以不同浓度(4.1nM与1000nM之间)注射纯化的ISVD持续2min(流速为45μL/min)，随后解离900s。通过减去参考配体泳道和空白缓冲液注射物来对数据进行双重参比。使用ProteOn Manager 3.1.0(3.1.0.6版)软件将处理后的传感图用朗缪尔(Langmuir)模型(1:1相互作用)拟合。
数据显示于表28中。
表28：抗TCR ISVD对huTCR-拉链和cyTCR-拉链蛋白的亲和力的测定，如通过SPR在ProteOn XPR36上在37℃测定的。
T017000680对huTCR-拉链和cyTCR-拉链蛋白的KD与T017000624的KD相似。结合速率和解离速率的差异是由于用于测定T017000680的结合动力学的较高温度。基于KD，T017000680的人-食蟹猴交叉反应性变化为1.8倍。总之，与T017000624相比，V89A突变(T017000680)对结合动力学没有影响。
6.17实施例17：通过流式细胞术得出的TCR ISVD变体与T细胞的结合
无标签TCR ISVD变体对人原代T细胞和HSC-F食蟹猴T细胞系(NIBIO JCRB1164)的亲和力是在使用带Flag3-His6标签的抗TCR ISVD作为配体的竞争设置中使用流式细胞术进行评价的。
简而言之，将细胞收获并转移到V型底96孔板(100μL中每孔7.5x 104个细胞)，并在4℃下在FACS缓冲液中与ISVD形式的系列稀释物和固定浓度的配体一起孵育30min。测定中使用的配体浓度低于其结合EC50(数据未显示)。在4℃下孵育90min的时间段后，通过流式细胞术测定配体结合水平。为此，将细胞洗涤3次，并与1μg/mlM2Ab(Sigma，F1804)一起在4℃下孵育30min，再次洗涤，并在4℃下与5μg/ml R-藻红蛋白-AffiniPure F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG(Fcγ片段特异性)(Jackson Immunoresearch，115-116-07)一起孵育30min。随后，将细胞重悬浮在补充有1μg/ml碘化丙啶(PI，Sigma，P4170)的FACS缓冲液中，以区分活细胞和死细胞。使用FACS阵列流式细胞仪(BDBiosciences)使用Flowing软件分析细胞。首先，基于FSC-SSC分布选择占总细胞群体超过80％的P1群体。在这个门中，在采集过程中计数10000个细胞。从该群体中排除碘化丙啶或碘化物阳性细胞(死细胞)，并计算中值或平均PE值。
剂量滴定曲线示于图9中。从剂量反应曲线获得的IC50值总结于表29中。
表29：通过流式细胞术测定的在使用人原代T细胞和HSC-F食蟹猴T细胞的竞争测定中TCR ISVD变体的IC50(M)。LCI：下置信区间，UCI：上置信区间
TCR ISVD变体对人原代T细胞和食蟹猴HSC-F T细胞系的亲和力在相同范围内。
6.18实施例18：树突状细胞-T细胞(DC-T细胞)测定中的免疫原性概况分析
在树突状细胞-T细胞增殖测定中测定抗TCR ISVD变体T017000679、T017000680、T017000681的相对免疫原性。
本质上，针对一组47个健康供体细胞样品测试ISVD，所述样品含有最丰富的HLAII类等位基因，因为它们代表了全球群体的大多数。使用T细胞增殖作为抗药抗体形成的替代标记物来评估免疫应答。钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)用作阳性对照。阳性对照KLH在所有47名供体中都产生了阳性应答。所有3种ISVD的总体免疫原性潜力均低。在所有供体样品中均未观察到对ISVD的显著应答(p<0.05)。根据应答供体的数量和应答强度，T017000680的免疫原性最低，其次是T017000681，最不优选的是T017000679。
具有确认的低免疫原性概况的所鉴定的序列优化的亲和力成熟的变体的序列描述于表30中。
在抗TCR ISVD变体被放置于ISVD形式的N末端位置的情况下，优选在位置1处具有D的T017000679、T017000680和T017000681的序列，以避免潜在的焦谷氨酸形成。当不位于N末端位置时，优先使用在位置1处具有E的相应变体，即分别为T01700624、T017000697和T017000681(D1E)。
表30：优化的抗TCR变体的序列。
*()指示引入ISVD中的氨基酸取代(例如：T017000681(D1E)意为ISVD T017000681(SEQ ID NO:152)含有D1E取代)。
6.19实施例19：CD123/TCR双特异性ISVD形式的体内功效和安全性
在非人灵长类动物模型中评价了两种多特异性CD123/TCR结合ISVD形式T017000670(具有N末端抗TCR ISVD T017000697)和T017000675(具有C末端抗TCR ISVDT017000624)的体内功效和安全性。将双亲和重靶向抗体(DART)作为实验中的参考。
在N末端具有非序列优化且亲和力成熟的抗TCR构建块T01700056G05的ISVD形式T017000139用作参考分子。
用不相关/TCR结合ISVD形式T017000672(具有N末端抗TCR ISVD T017000697)和T017000674(具有C末端抗TCR ISVD T017000624)的处理用作多特异性ISVD形式的CD123靶向部分的特异性对照。
这些形式的描述可以在表23中找到。
在食蟹猴的7天NaCl输注“预处理”后，将所有化合物均通过24h连续i.v.输注来施用，持续4周。每周，按照Chichili等人(Sci Transl Med,2015,PMID:26019218)所述的每周剂量递增方案应用4天使用/3天停用周期。施用的剂量描述于表31中。
表31：体内研究的剂量递增方案
CD123+细胞的循环数量以药效学终点被探索，以通过在以下时间使用流式细胞术定量外周血样品PBMC部分中的CD123hi数量和CD123int细胞数量来评估体内功效：测试日(TD)-6或-7、-4、1(给药前和给药后4小时开始)、4、8(给药前和给药后4小时开始)、11、15(给药前和给药后4小时开始)、18、22(给药前和给药后4小时开始)、25、29、36和45。
结果描绘于图10和图11中。
CD123hi细胞在用化合物T017000670和T017000139(具有N末端TCR结合构建块)和化合物T017000675(具有C末端TCR结合构建块)处理的动物中被耗尽。从第一个给药周期开始观察到作用，并且对于序列优化且亲和力成熟的变体T017000670和T017000675，处理在所有给药周期中保持有效。然而，T017000139从第3个给药周期开始显示出一些功效损失。
在用具有C末端抗TCR构建块的化合物T017000675处理的动物中以及在用T017000139和T017000670处理的动物中均未耗尽CD123int细胞。
通过在以下时间使用流式细胞术定量外周血样品PBMC部分内的T细胞亚组来监测来自血液的T细胞重分布：测试日(TD)-7或-6、-4、1(给药前+给药后4小时开始)、4、8(给药前+给药后4小时开始)、11、15(给药前+给药后4小时开始)、18、22(给药前+给药后4小时开始)、25、29、36和45。
结果描绘于图12和图13中。
在使用所有CD123/TCR ISVD形式处理期间，T辅助细胞(Th，CD4+CD3+)和细胞毒性T细胞(Tc，CD8+CD3+)数量会短暂随着时间的推移而减少。在用T0170000670处理的组中，Th和Tc细胞数量在每个给药周期的3天停用时间段期间恢复至基线水平。对于用化合物T017000675处理的动物中的Tc细胞和用化合物T017000139和T017000675处理的动物中的Th细胞观察到类似的趋势，但细胞数量仅在第3次给药周期后恢复至基线。在所有处理组中在恢复时间段期间，Th和Tc细胞数量恢复至基线附近的稳定值。对于测试的DART参考分子，重分布的迹象要少得多。短暂的随时间推移而减少可表明T细胞的运输，但不证明T细胞的耗尽。
接下来，探索了循环Th(CD4+CD3+)细胞和Tc(CD8+CD3+)细胞上PD-1的表达作为替代表型标记物，以评估体内T细胞耗竭。为此，在以下时间使用流式细胞术测量经处理动物的外周血样品PBMC部分中的PD-1表达：测试日(TD)-7或-6、-4、1(给药前和给药后4小时开始)、4、8(给药前和给药后4小时开始)、11、15(给药前和给药后4小时开始)、18、22(给药前和给药后4小时开始)、25、29、36和45。
结果描绘于图14和图15中。
在用靶向CD123的化合物T017000670或T017000675处理的动物中PD-1阳性CD4 T细胞或CD8 T细胞的百分比与在用相应非靶向对照处理的动物中的相似。小部分PD-1阳性细胞远少于实施例中采用的参考DART分子的那些。
通过在测试日(TD)-7、-4、1(给药后4小时开始)、4、8(给药后4小时开始)、11、15(给药后4小时开始)、18、22(给药后4小时开始)、25、29、36和45评价血清中的以下细胞因子来评估安全性：IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12(p40)、TNF-α、TNF-β和IFN-γ。
在所有动物中，IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12(p40)、TNF-α、TNF-β和IFN-γ水平在所有时间点保持低于检测限，表明没有观察到细胞因子释放综合征的迹象。
观察到IL-6和IL-8的血清浓度有些短暂增加到基线之上。然而，这些增加与任何化合物的药理作用均无关，如基于治疗方案期间血液学和凝血参数以及神经学检查、以及尸检期间的观察结果所确定的。
6.20实施例20：三价和四价GPC3/TCR三特异性ISVD形式的产生和表征
产生了含有TCR ISVD T017000679、T017000624、T017000680和T017000681、一种或多种靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)的ISVD(即A0226018C08和A0226015A08)、以及结合人血清白蛋白的ISVD(即ALB23002)的其他形式。使用了不同的接头长度和ISVD的取向。产生的形式列于表32中。氨基酸序列示于表A-9中。
表32：三价和四价GPC3/TCR三特异性ISVD形式和对照的形式ID和描述
在T细胞依赖性细胞毒性(TDC)测定中表征产生的形式。HepG2(ATCC，克隆HB8065)是一种高表达GPC3的肝癌细胞系，将其用Nuclight Green(Essen Bioscience，目录号4624)标记，并在三特异性GPC3/TCR T细胞接合器构建体的存在下用作T细胞杀伤的靶标。为此，将板(96孔F型底，Greiner，目录号655180)用200μL/孔测定培养基预封闭(2h，37℃)。以200μL/孔的总体积同时添加每种测定组分：(1)50μL稀释的/滴定的化合物(Nbs；布雷菲德菌素A(Sigma-Aldrich，目录号B7651)；(2)25μL稀释的HSA(Sigma-Aldrich，目录号A8763-10G)(最终浓度：30μM)；(3)25μL稀释的Cytotox Red(Essen Bioscience，目录号4632)(最终浓度：250nM)；(4)50μL人T细胞(T细胞是使用RosetteSep T细胞富集混合物(StemCell，目录号15061)从血沉棕黄层分离)，和50μL HepG2 Nuclight green(新鲜的，在DNEM-高葡萄糖、GlutaMAX、丙酮酸盐中，Life Technologies-Gibco，目录号31966)(比率为15:1)。将板放置在IncuCyte ZOOM中以在所有三个通道(相差、绿色和红色)中以4或6小时的间隔进行读出，持续总计72h。
接头、抗TCR ISVD、GPC3的双互补位靶向和取向的影响分析以5个步骤进行。
步骤1-抗TCR ISVD与抗GPC3 ISVD(三特异性三价形式)之间的接头长度的影响；步骤2-GPC3 ISVD(三特异性四价形式)的双互补位靶向和两个GPC3结合ISVD之间的接头长度的优化的影响。
在步骤1中，三特异性GPC3 ISVD T细胞接合器显示，随着抗TCR ISVD与抗GPC3ISVD之间的接头长度渐减，功效增加(最大杀伤增加)的细胞肿瘤杀伤：从72％(35GS接头)到94％(AAA接头)(图16)。在步骤2中，比较了GPC3双互补位T细胞接合器，其中抗GPC3 ISVDA0226018C08和A0226015A08组合在同一构建体中并以不同的取向放置，并且在两个构建块之间具有不同的接头长度。在这里，没有观察到测试变量对功效的影响(图17)。
表33和表34分别示出在TDC HepG2 Nuclight green测定中，在步骤1和步骤2中比较的不同形式的IC50值和最大杀伤％。
表33：在基于Incucyte的人TDC HepG2-Nuclight green测定中，使用15:1的效应物与靶标比率，在接种后72h分析的三特异性GPC3 ISVD T细胞接合器的IC50(M)和最大杀伤百分比(％)
表34：在基于Incucyte的人TDC HepG2-Nuclight green测定中，使用15:1的效应物与靶标比率，在接种后72h分析的三特异性GPC3 ISVD T细胞接合器的IC50(M)和最大杀伤百分比(％)
为了能够评价与高水平HepG2相比杀伤表达中等水平GPC3的肝癌细胞系的能力，建立了TDC Huh7测定。在该测定中，使用(Acea)系统。首先，将含有50μL测定培养基的具有4x浓度(120μM)的Alburex 20人血清白蛋白(CSL Behring，目录号2160-979)(最终测定浓度30μM)的96孔E-板(Acea，目录号5232368001)放置于/>内部以用于背景测量。在背景测量后，同时添加每种测定组分至总体积为200μL/孔：(1)50μL稀释的/滴定的化合物；(2)50μL的Huh7单细胞悬浮液(HSRRB，克隆JCRB0403)；(3)50μL效应细胞(人T细胞，如实施例3中所述获得)的单一悬浮液，以匹配15:1的效应物:靶标比率。将板放置于/>中，以15分钟间隔扫描400次。在适当的时间点(约60h)，分析细胞指数(CI)，其中0的CI表示100％的杀伤。
步骤3-具有抗TCR ISVD T017000679和去免疫变体T017000680的三价和四价形式的GPC3 T细胞接合器形式的比较。
如上所述，在HepG2和Huh7 TDC测定中评估了这些形式的效力和功效。这些形式、它们的描述和功能总结于表35中。数据描绘于图18中。与含有ISVD T017000679的形式相比，可以观察到含有T017000680ISVD的形式的功效有小的增加。
表35：在基于Incucyte的人TDC HepG2-Nuclight green测定中以及在基于xCELLigence的人TDC Huh7测定中，使用15:1的效应物与靶标比率，在接种后60h分析的三特异性GPC3 ISVD T细胞接合器的IC50(M)和最大杀伤百分比(％)
步骤4–GPC3 T细胞接合器形式内抗TCR ISVD位置的影响。
在GPC3 T细胞接合器形式的背景下，抗TCR ISVD的位置对效力对功效有影响(表36，图19)。对于三价形式，杀伤功效丧失。仍然可以观察到四价形式的功能，效力和功效降低；对HepG2 Nuclight green的杀伤功效降低20％，并且对Huh7的杀伤功效降低40％。此外，与抗HSA ISVD改变抗GPC3 ISVD的取向也对杀伤功效有影响。
表36：在基于Incucyte的人TDC HepG2-Nuclight green测定中以及在基于xCELLigence的人TDC Huh7测定中，使用15:1的效应物与靶标比率，在接种后60h分析的三特异性GPC3 ISVD T细胞接合器的IC50(M)和最大杀伤百分比(％)
步骤5-抗GPC3 ISVD与抗HSA ISVD之间的接头长度的影响。
减少三价形式中的抗HSA ISVD之前的接头长度导致功效降低(表37，图20)。这在四价形式中未观察到，因此在这种情况下，在9GS和35GS接头长度之间没有偏好。
从一组GPC3 T细胞接合器形式中，A022600167和A022600168代表在TDC测定中具有最高效力和功效的三特异性三价和四价形式。虽然功效是可比的，但三价形式A022600167和四价形式A022600168的效力不同。在HepG2 TDC测定中，A022600167的效力比A022600168低5倍，而在Huh7 TDC测定中，差异增加到50倍。
表37：在基于Incucyte的人TDC HepG2-Nuclight green测定中以及在基于xCELLigence的人TDC Huh7测定中，使用15:1的效应物与靶标比率，在接种后60h分析的三特异性GPC3 ISVD T细胞接合器的IC50(M)和最大杀伤百分比(％)
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6.21实施例21：癌细胞系的GPC3表达谱和与GPC3 T细胞接合器功能的相关性
根据制造商的说明，通过免疫细胞化学(ICC)并使用(Dako，目录号K0078)测定一组癌细胞系的GPC3蛋白表达水平。另外，对肝细胞癌和正常肾脏样品进行了免疫组织化学(IHC)。
使用Ventana discovery XT机器人(Ventana medical system，罗氏)进行ICC和IHC。首先将细胞系和组织样品用4％福尔马林固定，随后石蜡包埋。脱石蜡后，将细胞用缓冲液CC1标准品(Ventana，目录号950-124)在95℃的温度下调节48分钟，随后用封闭液A和B(Ventana，目录号760-104)的每一种进行4分钟的封闭步骤。在室温下施加小鼠单克隆IgG2a抗GPC3抗体(Ventana，目录号790-4564)保持60分钟，随后用在5M NaCl中的0.05％戊二醛(Prolabo，目录号20879-238)固定4分钟。将生物素化的山羊抗小鼠IgG2a抗体(Southern Biotech，目录号1080-080)在抗体稀释剂(Ventana；目录号760-108)中以1/200稀释，在室温下施加保持32分钟。用DABMap试剂盒(Ventana；目录号760-124)进行检测。将切片用苏木精II(Ventana，目录号790-2208)复染4分钟，并用上蓝剂(Ventana，目录号760-2037)后复染4分钟，随后脱水并用Cytoseal XYL(Richard-Allan Scientific，目录号8312-4)封片。通过对细胞染色强度(分级为0：无染色，1(或+)：弱，2(或++)：中度；3(或+++)：强)和每个强度类别中阳性细胞百分比二者的半定量评估来评价免疫组织化学染色。Histoscore(H得分)按以下公式计算：
H得分＝3x(具有等级3的细胞％)+2x(具有等级2的细胞％)+1x(具有等级1的细胞％)。
如文献(Detre等人,J Clin Pathol 1995；48:876-878和Lui等人,Journal ofLatex Class filed,2015年8月,第14卷,第8期)所述，可能得分的范围为0至300。HCC中H得分的确定是基于GPC3膜表达的评价。
在如用测定的一组测试细胞系中，Hep-G2(ATCC，克隆HB-8065；5.2E5个受体/细胞)显示出最高水平的GPC3表达，其次为NCI-H661(ATCC，克隆HTB-183；3.4E5个受体/细胞)和Huh-7(HSRRB，克隆JCRB0403；6.8E4个受体/细胞)，后者被认为是中等表达细胞系。这些细胞系来源于肝癌和肺癌，这些癌症是相关的表达GPC3的实体瘤。在ICC中未显示任何染色的低或极低GPC3表达细胞系是MKN-45(DSMZ，克隆ACC409；1.5E4个受体/细胞)、NCI-H23(ATCC，克隆CRL-5800；2.6E3个受体/细胞)、BxPC-3(ATCC，克隆CRL-1687；1.5E3个受体/细胞)和NCI-H292(ATCC，克隆CRL-1848；6E2个受体/细胞)(表38)。
为了比较癌细胞系和患者肿瘤样品，确定了两者的H得分。ICC中的GPC3阳性癌细胞系即Huh-7、NCI-H661和HepG2显示出高于80的H得分(表38)，对应于在IHC中对GPC3阳性肝细胞癌(HCC)样品确定的平均H得分80,75(表39)。正常肾脏GPC3阳性样品显示平均H得分为0,75(表39)，而癌细胞系MKN-45、NCI-H23、BxPC-3和NCI-H292对GPC3染色呈阴性(表38)。这些细胞系被视为GPC3正常样表达水平细胞的代表。
为了评估三特异性GPC3 T细胞接合器对同一组癌细胞系的功能，使用xCELLigence系统进行TDC测定，如实施例5中所述；结果示于表40和图21中。对于GPC3高表达细胞系Hep-G2和NCI-H661，三特异性GPC3 ISVDT细胞接合器A022600167和A022600168与双特异性T细胞接合器基准抗体相比显示出相似的效力(NCI-H661)和低10倍的效力(Hep-G2)。对于中等表达细胞系Huh-7，A022600168作为具有结合GPC3的双互补位的四价形式显示出与Ab2相同的效力，而三价形式A022600167的效力低10倍。对于GPC3低表达细胞系MKN-45和BxPC-3，Ab2显示出nM范围内的效力，而三特异性GPC3 ISVD T细胞接合器没有显示出杀伤作用。对于极低GPC3表达细胞系NCI-H292，没有一种化合物显示出作用。缺乏GPC3结合ISVD的T细胞接合器T017000698对任何细胞系均未显示任何杀伤作用，证实了三特异性GPC3 T细胞接合器的GPC3特异性作用。
总之，Ab2是一种有效的T细胞接合器，能够杀伤GPC3表达水平低至每个细胞一千个受体且H得分为0的癌细胞系。相比之下，三特异性T细胞接合器形式可有效杀伤高和中等GPC3表达癌细胞系(其H得分与HCC和大细胞肺癌样品的相似)，同时不伤害表达GPC3水平低于一万个受体/细胞且H得分低于正常肾脏样品平均值的细胞系。
表38：不同癌细胞系的GPC3表达水平。
表39：通过对肝细胞癌和正常肾脏样品的免疫组织化学确定的GPC3 H得分(基于对GPC3膜表达的评价)。
| 总案例数 | H得分 | 总GPC3+案例数 | H得分 | |
| HCC | 288 | 52,22 | 187 | 80,75 |
| 正常肾脏 | 35 | 0,17 | 8 | 0,75 |
表40：在基于xCELLigence的人TDC测定中，使用15∶1的效应物与靶标比率，GPC3 T细胞接合器对表达降低的GPC3表达水平的以下不同肿瘤细胞系的IC50(M)：在60h分析的HepG2、在75h分析的NCI-H661、在60h分析的Huh-7、在65h分析的MKN-45、在65h分析的BxPC-3、在60h分析的NCI-H292。n.a.＝不可用
6.22实施例22：三特异性序列优化的GPC3 ISVD T细胞接合器的产生
序列优化的GPC3 ISVD A022600314(A0226015A08的优化变体)、A022600345和A022600351(A0226018C08的优化变体)用于产生如表41中所述的五种三特异性GPC3 T细胞接合器形式，以用于评估构建块和接头长度的最佳组合。
表41：评价的不同三特异性GPC3 ISVD T细胞接合器形式的选择
如实施例21中所述，在基于xCELLingence的TDC测定中用不同的癌细胞系测试了五种所选择形式的功能。结果描述于表42中。对于高和中等GPC3表达细胞系HepG2、NCI-H661和Huh-7，与三价形式相比，四价形式获得了更高的效力。对于高GPC3表达细胞系NCI-H661，四价形式A022600424和A022600427比A022600425和A022600426更有效。对于GPC3低表达细胞系NCI-H23和BxPC-3，确认了所有三特异性GPC3 ISVD T细胞接合器形式都缺乏杀伤作用。
图22示出基于xCELLingence的TDC测定的剂量依赖性杀伤曲线，其以细胞系NCI-H661和BxPC-3为例，对五种所选择的ISVD形式使用三种不同的T细胞供体。
表42：在基于xCELLigence的人TDC测定中GPC3 T细胞接合器对不同肿瘤细胞系的IC50(M)，其中使用15:1的效应物与靶标比率并在60h分析。na＝不可用；未拟合＝未获得曲线拟合，IC50估计为>1E-7M
6.23实施例23：A022600424与GPC3、TCR拉链蛋白和血清白蛋白的结合和亲和力通过表面等离子体共振(SPR)使用ProteOn XPR36定量A022600424对人和食蟹猴GPC3(分别为R&D Systems目录号2119-GP和内部产生的(登录号P51654、Q3-R358、S359-H559))、huTCR-拉链和cyTCR-拉链蛋白、以及人、食蟹猴和小鼠血清白蛋白(分别为Sigma目录号A8763、内部从动物组织产生的、DivBioScience目录号IMSA)的亲和力，表示为平衡解离常数(KD)。
使用EDC和NHS化学，通过胺偶联将重组GPC3蛋白捕获在固定有抗His抗体(Genscript，目录号ABIN387699)的GLC传感器芯片(Biorad)上(运行缓冲液：HBS-EP+，pH7.4)。以不同浓度(0.3nM与1000nM之间)注射纯化的ISVD持续2分钟(流速45μL/min)，随后解离900s。通过注射10mM甘氨酸-HCl(pH 1.5)持续1分钟(流速45μL/min)进行再生。通过减去参考配体泳道和空白缓冲液注射物来对数据进行双重参比。使用ProteOn Manager3.1.0(3.1.0.6版)软件将处理后的传感图基于1:1相互作用模型(朗缪尔结合模型)进行分析。
使用EDC和NHS化学，通过胺偶联将重组TCR蛋白固定在GLC传感器芯片(Biorad)上(运行缓冲液：HBS-EP+，pH 7.4)。以不同浓度(0.2nM与200nM之间)注射纯化的ISVD持续2分钟(流速45μL/min)，随后解离900s。通过注射3M MgCl2持续3分钟(流速90μL/min)进行再生。通过减去参考配体泳道和空白缓冲液注射物来对数据进行双重参比。使用ProteOnManager 3.1.0(3.1.0.6版)软件将处理后的传感图基于1:1相互作用模型(朗缪尔结合模型)进行分析。
结果(表43)证明A022600424以高亲和力结合人和食蟹猴GPC3。
表43：对人和食蟹猴GPC3、人和食蟹猴TCR-拉链、以及人、食蟹猴和小鼠血清白蛋白的结合亲和力。n.a.＝不可用
对于过表达人和食蟹猴GPC3的CHO-Flp-In细胞以及Huh-7细胞，通过流式细胞术评估A022600424与细胞表达的人和食蟹猴GPC3的结合，得到1与2nM之间的EC50值(表44)。
评价了A022600424在EC30浓度下与人和食蟹猴T细胞的结合，分别与结合TCRab的单价ISVD T017000624和T017000623(T0170056G05变体)竞争。将T细胞(如实施例3所述获得的人T细胞和购自德国LPT实验室的食蟹猴T细胞)在测定当天解冻并计数，并稀释至1E+06个细胞/mL的浓度，之后将75μL添加至V型底96孔板(Greiner，目录号651180)的孔中。将细胞用冷FACS缓冲液洗涤一次，之后向孔中添加25μL Nb和25μL竞争物。将T017000624稀释至4E-08M的2x浓度(孔中2E-08M)，T017000623稀释至1E-07M的2x浓度(孔中5E-08M)，以及A022600424稀释至在孔中最终浓度范围在8μM与7.8nM之间。将细胞重悬浮，并将板在4℃下孵育90分钟，之后将板在冷FACS缓冲液中洗涤两次。将细胞重悬浮于在FACS缓冲液中的50μL 1/1000稀释的单克隆M2(Sigma Aldrich，目录号F1804)中，并在4℃下孵育30分钟。将板在冷FACS缓冲液中洗涤两次。将细胞重悬浮于在FACS缓冲液中的50μL 1/100稀释的别藻蓝蛋白缀合AffiniPure山羊抗小鼠IgG(亚类1+2a+2b+3)(Fc片段特异性)(Jackson Immunoresearch，目录号115-135-164)中，并在4℃下孵育30分钟。将板在冷FACS缓冲液中洗涤两次。将细胞重悬浮于在FACS缓冲液中的55μL 1/1000稀释的碘化丙啶(Sigma-Aldrich，目录号P4170)中，之后在MACSQuant X(Miltenyi biotec)上采集数据。
结果显示于表44中。A022600424以大约200nM亲和力结合人和食蟹猴T细胞二者。
表44：A022600424与细胞表达的人和食蟹猴GPC3以及人和食蟹猴TCR的结合评估。
为了评估A022600424对食蟹猴T细胞的功能，使用食蟹猴T细胞(LPT实验室，德国)对Huh-7进行基于xCELLigence的TDC测定，如实施例21中所述。发现关于食蟹猴和人T细胞的IC50值是可比的(表45)。
表45：在对Huh-7的基于xCELLigence的TDC测定中使用食蟹猴T细胞得出的A022600424功能，其中效应物与靶标比率为15∶1并在60h分析。
| 样品ID | 原代hu T细胞IC50(M) | 原代cy T细胞IC50(M) |
| A022600424 | 7.59E-11 | 2.29E-10 |
| Ab2 | 7.88E-11 | 3.57E-11 |
6.24实施例24：A022600424在移植有体外扩增T细胞的荷载Huh-7肿瘤的NOG小鼠中的体内概念验证
在对荷瘤NOG小鼠进行的体内功效研究中，皮下注射肝细胞癌Huh-7肿瘤细胞，并允许肿瘤生长直至达到约150mm3的平均肿瘤体积。此时，将体外扩增的T细胞腹膜内注射到小鼠体内。通过测量肿瘤体积和分析肿瘤生长动力学来评价ISVD介导的T细胞募集对肿瘤细胞的杀伤。评价了A022600424对肿瘤细胞杀伤的体内功效，并与缺乏GPC3特异性的对照T细胞接合器T017000698(SEQ ID NO：454，表A-9)进行比较。
详细地，将重悬浮于100μL HBSS中的2x106个Huh-7肿瘤细胞皮下注射到NOG小鼠中。肿瘤生长直至达到大约150mm3的平均肿瘤体积。此时，将重悬浮于200μL PBS中的107个体外扩增的T细胞腹膜内注射到每个小鼠中(D0)。将小鼠随机分成不同组后24小时进行T细胞的该注射。静脉内注射A022600424的处理在D0在T细胞注射后3h开始，并在D3、D6、D9和D12(q3d；图23)继续。测试了TCR/GPC3结合多肽的四个剂量水平(0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.7mg/kg和2mg/kg)。在D0、D3、D6、D9和D12(q3d)以2mg/kg的剂量将T017000698注射到对照组中。含肝素管中的存活血液取样在D6和D12进行，以测量抗体暴露。在D15处死小鼠，并收集血液和肿瘤组织。血液用于抗体暴露测量，肿瘤组织用于靶标(GPC3)表达分析和T细胞浸润分析。
肿瘤生长动力学的结果示于图24中。用T017000698处理的小鼠用作对照组，当所有对照小鼠都活着，在它们没有达到终点标准(2000mm3肿瘤体积)时，用于在D24分析。对于A022600424与对照T017000698，在肿瘤生长曲线中可见关于诱导肿瘤停滞的剂量反应模式。A022600424的0.7mg/kg(**，p＝0.0016)和2mg/kg(*，p＝0.0415)剂量水平显著不同于对照T017000698。0.1mg/kg、0.2mg/kg剂量对控制肿瘤生长的影响较低，并且与对照组没有显著差异。以单因素方差分析进行统计分析，其使用邓尼特多重比较检验用于分析。
总之，结果证明，在该模型中A022600424可以以剂量依赖性方式诱导统计学上显著的肿瘤停滞。这证实了通过经由GPC3 ISVDT细胞接合器将T细胞与Huh-7肿瘤细胞上的GPC3交联进行多肽诱导的T细胞介导杀伤的概念。
6.25实施例25：多特异性TCRαβ-CD33-CD123 ISVD构建体的产生，以及对TCRαβ、CD33、CD123和血清白蛋白的结合亲和力
产生如SEQ ID NO：460所示的TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体。
6.25.1对人和食蟹猴CD33和CD123蛋白的亲和力的测定
通过基于表面等离子体共振(SPR)的测定在ProteOnXPR36仪器(BioRadLaboratories，Inc.)上在37℃测量TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体(SEQ ID NO：460)对huCD33L-Fc、cyCD33L-Fc(经由捕获设置)或huCD123(经由捕获设置)蛋白的亲和力，表示为缔合速率常数(Ka)、解离速率常数(kd)和平衡解离常数(KD)。
用于测量对CD33的结合亲和力的设置
使用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺酯)化学，通过胺偶联将抗huIgG(Fc)固定在GLH(长矩阵，高容量)传感器芯片上。接下来，捕获huCD33L-Fc和cyCD33L-Fc(缔合：120s，25μL/min)。以不同浓度(0.4至625nM)注射如SEQ IDNO:460所示的纯化的TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体持续120s，随后解离900s。
用于测量对CD123的结合亲和力的设置
使用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺酯)化学，通过胺偶联将抗huIgG(Fc)固定在GLH(长矩阵，高容量)传感器芯片上。接下来，捕获huCD123-Fc和cyCD123-Fc(缔合：120s，25μL/min)。以不同浓度(1.2至300nM)注射如SEQ IDNO:460所示的纯化的TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体持续120s，随后解离900s，按45μl/min。
通过减去参考分析物泳道和空白缓冲液注射物来对数据进行双重参比。使用ProteOn Manager 3.1.0(3.1.0.6版)软件应用朗缪尔1:1相互作用模型计算亲和力常数(ka、kd、KD)。
如SEQ ID NO:460所示的TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体对人和食蟹猴CD33以及人和食蟹猴CD123的亲和力的测量结果总结在下表46和表47中。
表46：基于SPR对于TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体对人和食蟹猴CD33蛋白的亲和力的测定
TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体对食蟹猴CD33的反应性(KD＝6.9nM)与对人CD33的反应性(KD＝7.6nM)是可比的。
表47：基于SPR对于TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体对人和食蟹猴CD123蛋白的动力学的测定
TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体对人CD123的反应性(KD＝0.59nM)是对食蟹猴CD123的反应性(KD＝2nM)的3.3倍。
结果(表46和表47)证明多特异性ISVD构建体以高亲和力结合人/食蟹猴CD33和人/食蟹猴CD123。
6.25.2对人和食蟹猴TCRαβ蛋白的亲和力的测定
通过基于SPR的测定在ProteOn XPR36仪器(BioRad Laboratories,Inc.)上在37℃评价TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体(SEQ ID NO:460)对重组huTCR(2XN9)-拉链蛋白、cyTCR(AEA41865)-拉链蛋白(经由包被设置)的亲和力，表示为缔合速率常数(Ka)、解离速率常数(kd)和平衡解离常数(KD)。
用于测量对TCRαβ的结合亲和力的设置
huTCR(2XN9)-拉链、cyTCR(AEA41865)-拉链蛋白包被在GLC(短矩阵，正常容量)传感器芯片上。以不同浓度(0.4至625nM)注射如SEQ ID NO:460所示的纯化的TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体持续120s，随后解离900s。
通过减去参考分析物泳道和空白缓冲液注射物来对数据进行双重参比。使用ProteOn Manager 3.1.0(3.1.0.6版)软件应用朗缪尔1:1相互作用模型计算亲和力常数(ka、kd、KD)。
如SEQ ID NO:460所示的TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体对人和食蟹猴TCRαβ的亲和力的测量结果总结在下表48中。采用仅由与ALB23002(SEQ ID NO:464)连接的TCRαβ构建块(SEQ ID NO:461)组成的ISVD作为参考。
表48：基于SPR对于TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体和参考TCR-ISVD构建体对人和食蟹猴TCRαβ的动力学的测定
TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体对食蟹猴TCRαβ的反应性(KD＝6.7nM)是对人TCRαβ的反应性(KD＝21nM)的3倍。
结果(表48)证明多特异性ISVD构建体以高亲和力结合人/食蟹猴TCRαβ。
6.25.3对人、小鼠和食蟹猴血清白蛋白的亲和力的测定
通过基于SPR的测定在ProteOn XPR36仪器(BioRad Laboratories,Inc.)上在37℃评价TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体(SEQ ID NO:460)经由C末端ALB23002半衰期延长部(经由包被设置)对重组人、食蟹猴和小鼠血清白蛋白的结合亲和力，表示为缔合速率常数(Ka)、解离速率常数(kd)和平衡解离常数(KD)。
用于测量对血清白蛋白的结合亲和力的设置
通过使用EDC和NHS化学使用胺偶联将人、食蟹猴和小鼠血清白蛋白固定在ProteOn GLC传感器芯片上(使用的运行缓冲液：HBS-EP+，pH 7.4)。将白蛋白以在pH 4.5乙酸盐缓冲液中2.5μg/mL(HSA和MSA)和5μg/mL(CSA)两种浓度固定，使CSA的固定水平升高至高达220RU，MSA为150RU，以及HSA为110RU。以不同浓度(4.3nM与416nM之间)注射纯化的多价VHH持续2分钟(流速45μL/min)，随后解离900s。循环之间的再生由以下组成：以100μL/min注射10mM甘氨酸-HCL(pH 1.5)持续47s。
通过减去参考配体泳道和缓冲液注射物来对数据进行双重参比。使用ProteOnManager3.1.0(3.1.0.6版)软件模型通过用朗缪尔1:1相互作用模型拟合来评价经处理的曲线，并计算亲和力常数(ka、kd、KD)。
如SEQ ID NO:460所示的TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体对人、小鼠和食蟹猴血清白蛋白的亲和力的测量结果总结在下表49中。
表49：基于SPR对于TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体对血清白蛋白的亲和力的测定
确认了对CSA的交叉反应性。此外，虽然没有报道动力学参数，但对MSA的亲和力良好，足以获得半衰期延长并采用血清白蛋白的半衰期。
结果(表49)证明多特异性ISVD构建体以高亲和力结合人/小鼠/食蟹猴TCRαβ。
6.26实施例26：多特异性ISVD构建体与膜结合CD33和/或CD123的结合亲和力用于 测量与靶细胞系上的CD33/CD123的结合亲和力的设置
使用流式细胞术评价TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体对表达CD33和/或CD123的靶细胞系的结合亲和力。表达CD123的靶细胞系详细描述于WO2018/091606A1中。
如下产生转染的CD33细胞。使用Flp-InTM定点重组技术(用于通过Flp重组酶介导的整合产生稳定哺乳动物表达细胞系的Flp-InTM系统(Invitrogen，K601001，K601002))产生重组过表达了CD33的稳定CHO Flp-In(Invitrogen，R758-07)细胞系。特此，由源自酿酒酵母的Flp重组酶(pOG44)在FRT(Flp重组靶标)位点的特定基因组位置发生DNA整合。Flp-InTM宿主细胞系和表达质粒(pcDNA5)均含有该FRT位点，由此允许进行单一同源DNA重组。人CD33的序列源自NCBI RefSeq NP_001763，食蟹猴CD123的序列源自NCBI genbank号XP_005590138。
简而言之，将细胞收获并转移到V型底96孔板(5x104个细胞/孔)，并在30μM临床级HSA(CSL Behring，2160-679)的存在下，在FACS缓冲液(D-PBS(Gibco，14190)，具有10％FBS(Sigma，F7524)和0.05％叠氮化钠(Acros organics，19038))中与TCRαβ-CD123-CD33多特异性ISVD构建体的系列稀释物以100μL的最终体积在4℃下孵育30min。接下来，将细胞用FACS缓冲液洗涤三次，并与1μg/mL小鼠单克隆抗M2抗体(Sigma-Aldrich，F1804)在4℃下孵育30min以检测带FLAG3His6标签的CD123-CD33-TCR多特异性ISVD构建体，或与3μg/mL mAb抗VHH抗体(ABH0077)(APS+内部，A-0006-00_ABH0077_SF_AB1891)孵育以检测具有ALB BB的/>ISVD。接下来，将细胞用FACS缓冲液洗涤3次，并与5μg/mL别藻蓝蛋白(APC)AffiniPure山羊抗小鼠IgG(亚类1+2a+2b+3)(Fcγ片段特异性)(JacksonImmunoresearch，115-136-071)以100μL的最终体积在4℃下孵育30min。随后，将细胞重悬浮于补充有1μg/mL碘化丙啶(PI，Sigma P4170)的50μL冷FACS缓冲液中，以区分活细胞和死细胞。染色后，使用MACSQuant X流式细胞仪(Miltenyi Biotec)采集细胞，并使用FlowLogic(Miltenyi Biotec)进行分析。首先，基于FSC-SSC分布选择占总事件超过80％的P1群体，以区分细胞和碎片。从该群体(P1)中排除PI阳性(死)细胞，并评价PI阴性细胞的中值APC荧光强度。
用于测量与原代T细胞的结合亲和力的设置
使用带FLAG3His6标签的单价TCR ISVD作为配体，使用流式细胞术在竞争设置中评价TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体对原代T细胞的结合亲和力。
简而言之，将人或食蟹猴原代T细胞解冻并转移到V型底96孔板(100μL中，7.5x104个细胞/孔)，并在30μM临床级HSA(CSL Behring，2160-679)的存在下，在FACS缓冲液(D-PBS(Gibco，14190)，具有10％ FBS(Sigma，F7524)和0.05％叠氮化钠(Acros organics，19038))中与TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体的系列稀释物和固定浓度的配体以100μL的最终体积在4℃下孵育30min。测定中使用的配体浓度低于其结合EC50。在4℃下孵育90min的时间段后，通过流式细胞术测定配体结合水平。随之，将细胞洗涤3次，并与1μg/ml小鼠单克隆抗M2抗体(Sigma-Aldrich，F1804)在4℃下孵育30min，再次洗涤，并与5μg/ml别藻蓝蛋白(APC)AffiniPure山羊抗小鼠IgG(亚类1+2a+2b+3)(FCγ片段特异性)(Jackson Immunoresearch,115-136-071)以100μL的最终体积在4℃下孵育30min。随后，将细胞重悬浮在补充有1μg/ml碘化丙啶(PI，Sigma，P4170)的FACS缓冲液中，以区分活细胞和死细胞。染色后，使用MACSQuant X流式细胞仪(Miltenyi Biotec)采集细胞，并使用FlowLogic(Miltenyi Biotec)进行分析。首先，基于FSC-SSC分布选择占总事件超过80％的P1群体，以区分细胞和碎片。从该群体(P1)中排除PI阳性(死)细胞，并评价PI阴性细胞的中值APC荧光强度。
人-食蟹猴交叉反应性是通过如下方式评价：如上所述使用流式细胞术测试单价CD33构建块(SEQ ID NO:463)和单价CD123构建块(SEQ ID NO:462)与人或食蟹猴CD33转染的细胞系或与人或食蟹猴CD123转染的细胞系的结合。结果以图形表示于图26中。不同实验的EC50值总结于表50(CD33转染的靶细胞)和表51(CD123转染的靶细胞)中。
表50：CD33构建块(SEQ ID NO:463)与表达huCD33或cyCD33的细胞的结合的EC50值。
表51：CD123构建块(SEQ ID NO:462)与表达huCD123或cyCD123的细胞的结合的EC50值。
确认了单价CD33和CD123构建块与人和食蟹猴膜靶标的结合。关于结合CD33，在人与食蟹猴之间EC50的差异为降低小于2倍，以及关于结合CD123细胞为降低3倍(表51)。
总之，除了对重组人和食蟹猴CD33和CD123蛋白的结合亲和力外，还确认了TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体与人和食蟹猴细胞表达的CD33和CD123的剂量依赖性结合(n＝1)。
在竞争设置中，如上所述使用流式细胞术评价CD123-CD33-TCR多特异性ISVD构建体和参考TCR-ISVD构建体(仅由与ALB23002(SEQ ID NO:464)连接的TCRαβ构建块(SEQ IDNO:461)组成)与人和食蟹猴T细胞的结合(图27)。
DRC的示例性例子描绘于图28中。在多种健康供体T细胞上测试ISVD构建体。总体IC50示于表52中。
表52：在人和食蟹猴T细胞竞争测定中如流式细胞术测定的TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体和参考TCR-ISVD构建体的总体IC50(M)
*总体IC50(加权)
总之，确认了TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体对食蟹猴原代T细胞的交叉反应性。原代食蟹猴T细胞上的EC50(＝729nM)是在人原代T细胞上的EC50(＝218M)的约3倍
6.27实施例27：多特异性ISVD构建体诱导的T细胞介导的靶细胞杀伤
6.27.1基于阻抗的细胞毒性测定
在基于阻抗的细胞毒性测定(例如，如WO 2018091606A1中所述)中，使用人或食蟹猴原代效应T细胞和粘附性靶细胞，针对重定向T细胞介导的杀伤表征ISVD构建体。使用xCELLigence仪器(Roche)测量由靶细胞粘附到电极表面引发的阻抗变化。T细胞是非粘附性的，因此不会影响阻抗测量。RTCA MP仪器量化电阻抗的变化，将其显示为称为细胞指数的无量纲参数，该参数与细胞覆盖的组织培养孔的总面积成正比。向96E-板(ACEA Biosciences；05 232 368 001)的每个孔中，添加在测定培养基(靶细胞生长培养基(不具有选择抗生素)+1％青霉素/链霉素(Life technologies目录号15140))中的50μL 4X浓度的HSA溶液(在一些测定中，使用200μM以具有50μM的最终浓度，在其他测定中使用120μM以具有30μM的最终浓度)。外孔不使用，并填充200μL培养基或D-PBS。将96E-板放置在站中(在37℃、5％ CO2培养箱中)，并在不存在细胞的情况下进行单次测量以测量测定培养基的背景阻抗。随后，将测定培养基中的50μL靶细胞(2x 104个细胞/孔)接种到96E-板上，并添加50μL在测定培养基中的系列稀释ISVD构建体溶液(4X浓度)。(最终体积＝200μL)。在室温下30min后，每孔添加在测定培养基中的50μL原代T细胞(3x 105个细胞/孔)，以实现15:1的效应物与靶标比率。将板放置在/>站中，并每15min测量阻抗，持续4天。以结果中指示的固定时间点分析数据。
6.27.2基于流式细胞术的细胞毒性测定
在基于流式细胞术的细胞毒性测定中，使用人或食蟹猴原代T细胞作为效应细胞以及非粘附性靶细胞，针对重定向T细胞介导的杀伤来表征ISVD构建体。根据制造商的说明，使用PKH26红色荧光细胞接头试剂盒(Sigma，PKH26GL-1KT)用4μM PKH26膜染料标记靶细胞。将效应细胞(2.5x 105个细胞/孔)和PKH标记的靶细胞(2.5x 104个细胞/孔)在96孔V型底板(Greiner Bio-one，#651 180)中在靶细胞系的测定培养基(具有1％青霉素/链霉素(Life Technologies，15140)和50μM Alburex HSA(CSL Behring，2160-679)的靶标生长培养基)中共同孵育(效应物与靶标比率为10:1)。为了分析浓度依赖性细胞裂解，将靶标测定培养基中ISVD构建体的系列稀释物添加到细胞中，并在37℃在5％CO2气氛中孵育18h。孵育后，通过离心使细胞沉淀并用FACS缓冲液(D-PBS(Gibco，14190)，具有10％ FBS(Sigma，F7524)和0.05％叠氮化钠(Acros organics，19038))洗涤。随后，将细胞重悬浮在补充有5nM碘化物(642/661)(ThermoFisher Scientific，T3605)的100μL FACS缓冲液中，以区分活细胞和死细胞。使用MACSQuant X流式细胞仪(Miltenyi Biotec)分析细胞。每个样品采集的总样品体积为70μL。对PKH26阳性细胞设置门控，并在该群体中测定阳性细胞。特异性裂解百分比＝((％TO-PRO-3+无构建体–％TO-PRO-3+有构建体)/％TO-PRO-3+无构建体))x100。
TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体对CD33、CD123和TCR的功能交叉反应性分析是在基于阻抗的细胞毒性测定(xCELLigence)中使用人或食蟹猴原代T细胞和粘附性人或食蟹猴转染的CD33或CD123细胞确定的。
如上文在6.27.1和6.27.2中所述，所有测定均在存在过量HSA的情况下进行，以使ISVD如上所述被HSA完全饱和。参考TCR-ISVD用作阴性对照。结果示于图29和图30以及表53中。
6.27.3结果
图29和图31中以图形方式展示了比较人与食蟹猴原代T细胞的测定结果。使用来自不同人供体的T细胞对人T细胞介导的对人CD33和人CD123转染细胞的细胞杀伤进行评价，从而可以计算总体IC50值(表53)。使用来自1只食蟹猴的T细胞对食蟹猴T细胞介导的对人CD33和人CD123转染细胞的杀伤进行评价。IC50值总结在表54中。
表53：在基于阻抗(xCELLigence)的人T细胞介导的CD33+或CD123+细胞杀伤测定中，使用15比1的效应物与靶标比率，在50μM HSA的存在下，TCRαβ-CD33-CD123的总体IC50(M)。
关于CD33和CD123，对人靶标表达细胞的总体IC50分别为5,4.10-11M和2,5.10-11M。
表54：在基于阻抗(xCELLigence)的食蟹猴T细胞介导的CD33+或CD123+细胞杀伤测定中，使用15比1的效应物与靶标比率，在50μM HSA的存在下，TCRαβ-CD33-CD123的IC50(M)。
为了确认TCRαβ-CD33-CD123 ISVD构建体对TCR的人食蟹猴交叉反应性，如上所述在基于流式细胞术的T细胞介导的MOLM-13细胞杀伤中，使用人或原代T细胞与CD33、CD123双重表达人MOLM-13靶细胞系相组合，在50μM HSA的存在下，评价ISVD构建体。这些结果的图形展示示于图30中。可获得使用不同供体在人T细胞介导的杀伤测定中测试的TCRαβ-CD33-CD123 ISVD构建体的其他数据，从而计算总体EC50值(表55)。食蟹猴T细胞介导的杀伤测定的EC50值显示在表56中。
表55：在用流式细胞术的人T细胞介导的MOLM-13细胞杀伤测定中，使用10比1的效应物与靶标比率，在50μM HSA的存在下，A025001562的总体EC50(M)。
表56：在食蟹猴T细胞介导的MOLM-13细胞杀伤测定中，使用10比1的效应物与靶标比率，TCRαβ-CD33-CD123 ISVD构建体的EC50(M)。
总之，TCRαβ-CD33-CD123 ISVD构建体在人和食蟹猴人靶细胞介导的杀伤测定中均具有功能。所述ISVD对CD33/CD123双重阳性AML细胞系的总体杀伤效力为1,8.10-11M。
6.28实施例28：在植入T细胞人源化NSG小鼠中的CD123+Molm-13-luc播散性AML模型中TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体的临床前体内功效
6.28.1材料和方法
细胞系和人材料
表达CD123 Molm-13的人AML衍生细胞系获自Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen(布伦瑞克(Braunschweig)，德国)。Molm-13细胞在RPMI1640 Glutamax培养基(用20％胎牛血清补足)中以培养物生长(37℃，5％ CO2，95％湿度)。用非复制性慢病毒携带的萤光素酶载体(SV40-PGL4-Puro)感染细胞；使用2μg/ml嘌呤霉素选择多克隆Molm-13-luc。
用于体内施用的人T细胞纯化和扩增
EFS(Etablissementdu Sang，法兰西岛/>法国)提供来自健康供体的新鲜人外周血。
将新鲜人外周血单个核细胞(PBMC)通过在室温下200g持续40min的Ficoll梯度离心(无需制动)进行分离。将沉淀进行洗涤并重悬浮于由磷酸盐缓冲盐水(PBS)补足的50ml最终体积中。通过Vi-CELL计数器(Beckman Coulter Life Sciences，布雷亚(Brea)，加利福尼亚州，美国)定义总活PBMC数量。将沉淀回收在autoMACS运行缓冲液(MiltenyiBiotec)中。根据制造商的说明，使用泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)和autoMACS从PBMC中分离T细胞。使用基于CD3和CD28共刺激的T细胞TRANSACT基质激活/扩增试剂盒(Miltenyi Biotec)在体外经14天激活和扩增纯化的T细胞。根据Miltenyi程序，激活方案涉及在补充有20 000IU可溶性IL-2和1％青霉素-链霉素(Gibco)的TexMACS培养基(Miltenyi Biotec)中在TRANSACT基质的存在下将T细胞培养2周。在扩增的第14天，收获T细胞并以5x 107个细胞/ml的最终浓度重悬浮在PBS中，通过腹膜内(IP)注射向每只动物施用107个细胞。经测试，动物注射前的T细胞活力高于85％。
体内表征
所有体内实验均经Sanofi伦理委员会批准，并在AAALAC认可的设施中按照当地和机构法律、伦理和指南进行。
在未辐照的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠(Charles RiverLaboratories，Saint-Germain-Nuelles，法国)中在Molm13-luc AML植入后，评价TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体(SEQ ID NO:460)抗肿瘤活性。在第0天，将6-8周龄的雌性动物静脉内(IV)对每只小鼠植入106/0.2ml Molm-13-luc细胞。在第1天，对相同动物，每只小鼠腹膜内植入107/0.2ml人T细胞。
基于通过第3天长骨信号分段评价的全身生物发光成像(BLI)信号均匀性和肿瘤骨髓移植，将动物分布在各组中。用TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体(SEQ ID NO:460)从第4天至第12天以12、1.2、0.12和0.012nmol/kg Q2D，或者用不具有CD33或CD123结合ISVD的参考物(与Alb-ISVD(SEQ ID NO:464)连接的TCRαβ-ISVD(SEQ ID NO:461))以1.2nmol/kg QD(第4-13天)，或用MGD006(伏妥珠单抗，识别CD3和CD123的人源化DART)以1.3nmol/kg QD(第4-13天)IV处理小鼠，见表57。进行纵向体内生物发光成像(BLI)以监测播散性肿瘤的生长。在第14天处死小鼠并在BLI下进行尸检，以评估在诸如肝脏、脾脏、卵巢和腹部脂肪等深层软组织中的影响。
表57：化合物评价研究设计
a)：由于缺乏T细胞植入而导致一只无反应的动物不包括在分析中
数据收集和功效标准
从第3天到测定结束监测动物体重以跟踪疗法的影响。连续3天产生20％体重减轻或15％体重减轻或者10％或更多药物性死亡的剂量被认为是过度毒性剂量。动物体重包括肿瘤重量。
通过以下方式评估肿瘤生长：在肿瘤注射后第3、7、10和14天，通过体内BLI使用具有Living Image 4.5.2采集软件(PerkinElmer)的IVIS Lumina XRMS成像仪(PerkinElmer，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)通过体内萤光素酶活性测量，使用甲虫萤光素钾盐160mg/kg Ip注射，15分钟之后，对成像前5分钟用(120mg/kg；6mg/kg IM，5ml/kg)麻醉的动物进行图像处理。肿瘤生长是基于生物发光信号曲线(以光子/秒表示)。
在肿瘤植入后第7、10和14天，通过BLI信号测量，跟踪全身和后腿长骨中的肿瘤生长。主要功效终点是处理组和对照组(T/C)、部分消退(PR)和完全消退(CR)之间肿瘤信号相对于基线变化的变化比率。
为每个处理组的每只动物按时间绘制基于生物发光信号曲线(以光子/秒表示)的肿瘤生长，并表示为全身(线性标度)和骨分段信号(对数标度)的中值曲线±MAD。通过从指定观察日的肿瘤信号中减去第一次处理那天(筹划(staging)日)的肿瘤信号，计算每个处理(T)组和对照(C)在每天每个动物的肿瘤生物发光信号变化。计算处理组的中值T，并且计算对照组的中值C。然后计算比率T/C并且以百分比表示：
dT/dC＝[(结束时中值T-第3天中值T)/(结束时中值C–第3天中值C)]x 100
当dT/dC低于42％时，剂量被认为是有治疗活性的，并且当dT/dC低于10％时，剂量被认为是非常有活性的。如果dT/dC低于0，则剂量被认为是有高度活性的，并且消退的百分比被记录上日期：
肿瘤消退百分比被定义为与处理第一天的信号相比，在特定观察日在处理组中肿瘤信号减少的％。
对于每只动物，在特定时间点计算消退％。考虑到由于萤光素动力学因错过ip注射所致的可变性而导致的信号可变性的风险，当每只动物的至少两个连续时间点观察到消退时，才视为真正的消退。
部分消退(PR)：如果在连续两个时间点处的肿瘤信号(其中一个时间点处的信号低于起始信号的50％)降低到低于处理开始时的肿瘤信号，则将消退定义为部分消退。完全消退(CR)：如果肿瘤信号降低到低于起始信号的80％，则定义完全消退。
生物统计分析
针对每个处理组的每只动物，测量基于生物发光信号曲线(随时间推移)的肿瘤生长。对于纵向体内BLI数据，按天以重复测量进行两个非参数双因素方差分析型(ANOVA型)、随后为针对多重性用Bonferroni-Holm调整的两个对比分析：p>0.05:NS，0.05<p>0.01:*，p<0.01:**。对于末端离体BLI数据，对秩转换的生物发光信号以因子群进行单因素方差分析。采用中值±中值绝对偏差的描述性统计按组和测量日提供：p>0.05:NS，0.05<p>0.01:*，p<0.01:**。
6.28.2结果
在Molm-13-luc AML异种移植模型中，TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体在体内诱导抗白血病作用(图32A)。
在Molm-13-luc异种移植模型中，在人效应T细胞(T细胞/肿瘤比率R＝10)的存在下，每2天静脉内施用的TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体在所有剂量下被良好耐受。在处理下没有观察到不良事件或体重改变的证据。TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体在所有测试剂量下以相同活性(在0,012；0,12；12和12nmol/kg下，对应地dT/dC为2％(p<0.0001)与2％(p<0.0001)、2％(p<0.0001)和3％(p<0.0001))抑制全身肿瘤生长(图32A、32B)。
所有靶标病变的最长直径(LD)的总和为基线LD总和。基线LD总和用作表征目标肿瘤反应的参考。
在长骨中，在0.012nmol/kg下观察到3/8完全反应(CR；所有病变消失)和1/8部分反应(PR；靶标病变的LD总和减少至少30％，将基线LD总和作为参考)。
在0.12nmol/kg下观察到3/8CR和1/8PR，在1.2nmol/kg下观察到4/8CR和3/8PR，并且在12nmol/kg下观察到3/7CR和3/7PR(图32C)。参考TCR-ISVD构建体在1.2nmol/kg下对Molm13-luc肿瘤生长是总体无活性的(dT/dC为80％)。MGD006 1,3nmol/kg抑制肿瘤生长，其中dT/dC为8％(NS相比于A025001562处理)，与长骨中的4/8CR相关(图32A、图32B)。
基于末端离体生物发光成像，当参考ISVD TCR-HLE在所有组织中均无活性时，TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体在所有测试剂量下均显著抑制肝脏(p<0.0001)、脾脏(p<0.0001)和卵巢(p<0.0001)中的肿瘤生长，但在腹部脂肪中并非如此，并且MGD006显著抑制肝脏(p<0.0001)和脾脏(p<0.0001)中的肿瘤负荷，但在卵巢(NS)或腹部脂肪组织中并非如此。(图33)
6.29实施例29：KG-1a或U-937细胞杀伤
还使用单靶标表达细胞系KG-1a(CD33-CD123+)和U-937(CD33+CD123-)表征了多特异性TCRαβ-CD33-CD123 ISVD构建体和相应的构建体(其中CD33结合ISVD或CD123结合ISVD被不相关的ISVD IRR(不与CD33结合且不与CD123结合；表58)替代)(图34)。59中描述了杀伤效力和裂解百分比。
表58：样品ID以及ISVD和接头的组成
| 样品ID | 靶标ISVD1 | 接头 | 靶标ISVD2 | 接头 | 靶标ISVD3 |
| A | TCR | 9GS | CD33 | 9GS | CD123 |
| B | TCR | 9GS | CD33 | 9GS | IRR |
| C | TCR | 9GS | IRR | 9GS | CD123 |
表59：在人T细胞介导的U937或KG1a细胞杀伤测定中，使用10比1的效应物与靶标比率，三价ISVD的EC50(M)和裂解％。
TCR-CD123单靶向ISVD几乎不诱导CD123-U-937细胞的杀伤，这对于CD123/CD3DART MGD006基准也观察到。类似地，CD33单靶向ISVD仅诱导低水平的CD33-/+KG1a细胞杀伤，这对于CD33/CD3 BiTE AMG 330基准也观察到。另一方面，双重靶向TCRαβ-CD33-CD123 ISVD(构建体A)对CD33-和CD123-细胞系二者均展现出有效的肿瘤细胞杀伤，从而例证了双重靶向方法的优势。
7实用性
本文所述的多肽、编码所述多肽的核酸分子、包含所述核酸的载体、和组合物可以例如用于治疗患有增殖性疫病、炎性疫病、感染性疫病和自身免疫病的受试者。
序列表
<110> 埃博灵克斯股份有限公司
赛诺菲
<120> 基于TCRα/β反应性的T细胞募集多肽
<130> 242224
<150> EP20306608
<151> 2020-12-18
<160> 464
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单价ISVD
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<400> 32
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<220>
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<220>
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<400> 42
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<220>
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<220>
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<400> 44
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<213> 人工序列
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<223> CDR1
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Gly Tyr Val His Gln Ile Asn Phe Tyr Gly
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His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Ser Asp
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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1 5
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<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
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Phe Ser Lys Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 239
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 240
Met Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 241
Phe Ser Lys Ile Trp Pro Tyr Asp Trp
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 242
Met Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Trp
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 243
Phe Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Trp
1 5
<210> 244
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 244
Met Ser Lys Ile Trp Pro Tyr Asp Trp
1 5
<210> 245
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 245
Met Ser Lys Ile Tyr Pro Tyr Asp Trp
1 5
<210> 246
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 246
Met Ser Arg Ile Tyr Pro Tyr Asp Trp
1 5
<210> 247
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 247
Leu Ser Lys Ile Tyr Pro Tyr Asp Tyr
1 5
<210> 248
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR1
<400> 248
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
20 25
<210> 249
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR1
<400> 249
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
20 25
<210> 250
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR1
<400> 250
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
20 25
<210> 251
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR2
<400> 251
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val Ala
1 5 10
<210> 252
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 252
Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser
1 5 10 15
Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Phe Cys Arg Ala
35
<210> 253
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 253
Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser
1 5 10 15
Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Leu Tyr Phe Cys Arg Ala
35
<210> 254
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 254
Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser
1 5 10 15
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Leu Tyr Phe Cys Arg Ala
35
<210> 255
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 255
Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser
1 5 10 15
Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg Ala
35
<210> 256
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 256
Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser
1 5 10 15
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg Ala
35
<210> 257
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 257
Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser
1 5 10 15
Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Leu Tyr Phe Cys Arg Ala
35
<210> 258
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 258
Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser
1 5 10 15
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Ala Tyr Tyr Cys Arg Ala
35
<210> 259
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 259
Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser
1 5 10 15
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Thr Tyr Tyr Cys Arg Ala
35
<210> 260
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR4
<400> 260
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 261
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单价ISVD
<400> 261
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Val His Lys Ile Asn
20 25 30
Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val
35 40 45
Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys Arg
85 90 95
Ala Leu Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 262
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单价ISVD
<400> 262
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Val His Lys Ile Asn
20 25 30
Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val
35 40 45
Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Arg
85 90 95
Ala Leu Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 263
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单价ISVD
<400> 263
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ser Lys Ile Asn
20 25 30
Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Asn Tyr Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr Ala Thr Gly Thr Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Thr Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Thr Phe Pro Pro Ile Ser Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 264
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单价ISVD
<400> 264
Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Gly Pro Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Met Gly Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Ser Thr Ile Tyr Ala Ser Tyr Tyr Glu Cys Gly His Gly
100 105 110
Leu Ser Thr Gly Gly Tyr Gly Tyr Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 265
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单价ISVD
<400> 265
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Pro Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Trp Ser Asn Gly Lys Thr Gln Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ala Asp Lys Asp Glu Thr Gly Phe Arg Thr Leu Pro Ile Ala Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 266
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单价ISVD
<400> 266
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Leu Thr Ser Thr Asn Pro Gly Ser Tyr Ile Tyr Ile Trp
100 105 110
Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 267
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单价ISVD
<400> 267
Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Gly Pro Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Met Gly Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Ser Thr Ile Tyr Ala Ser Tyr Tyr Glu Cys Gly His Gly
100 105 110
Leu Ser Thr Gly Gly Tyr Gly Tyr Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 268
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 268
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Asp Val His Lys Ile Asn
20 25 30
Phe Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val
35 40 45
Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Met Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Arg
85 90 95
Ala Phe Ser Arg Ile Tyr Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
165 170 175
Ser Gly Ile Thr Ser Lys Ile Asn Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr
180 185 190
Pro Gly Asn Tyr Arg Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Ala Thr Gly Thr
195 200 205
Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
210 215 220
Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
225 230 235 240
Asp Thr Thr Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Phe Pro Pro Ile Ser Asn Phe
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
260 265
<210> 269
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 269
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ser Lys Ile Asn
20 25 30
Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Asn Tyr Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr Ala Thr Gly Thr Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Thr Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Thr Phe Pro Pro Ile Ser Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly
165 170 175
Asp Val His Lys Ile Asn Phe Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly
180 185 190
Lys Glu Arg Glu Lys Val Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp
195 200 205
Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser
210 215 220
Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
225 230 235 240
Ala Val Tyr Phe Cys Arg Ala Phe Ser Arg Ile Tyr Pro Tyr Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
260 265
<210> 270
<211> 428
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 270
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Asp Val His Lys Ile Asn
20 25 30
Phe Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val
35 40 45
Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Met Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Arg
85 90 95
Ala Phe Ser Arg Ile Tyr Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Pro Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
165 170 175
Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala
180 185 190
Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Tyr Trp Ser Asn Gly
195 200 205
Lys Thr Gln Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly
210 215 220
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro
225 230 235 240
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ala Asp Lys Asp Glu Thr Gly
245 250 255
Phe Arg Thr Leu Pro Ile Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
260 265 270
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
290 295 300
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
305 310 315 320
Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
325 330 335
Ser Gly Ile Thr Ser Lys Ile Asn Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr
340 345 350
Pro Gly Asn Tyr Arg Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Ala Thr Gly Thr
355 360 365
Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
370 375 380
Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
385 390 395 400
Asp Thr Thr Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Phe Pro Pro Ile Ser Asn Phe
405 410 415
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
420 425
<210> 271
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 271
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Trp Asp Val His Lys Ile Asn
20 25 30
Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val
35 40 45
Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg
85 90 95
Ala Leu Ser Lys Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
165 170 175
Ser Gly Ile Thr Ser Lys Ile Asn Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr
180 185 190
Pro Gly Asn Tyr Arg Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Ala Thr Gly Thr
195 200 205
Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
210 215 220
Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
225 230 235 240
Asp Thr Thr Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Phe Pro Pro Ile Ser Asn Phe
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
260 265
<210> 272
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 272
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Tyr Asp Val His Lys Ile Asn
20 25 30
Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val
35 40 45
Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg
85 90 95
Ala Leu Ser Lys Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
165 170 175
Ser Gly Ile Thr Ser Lys Ile Asn Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr
180 185 190
Pro Gly Asn Tyr Arg Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Ala Thr Gly Thr
195 200 205
Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
210 215 220
Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
225 230 235 240
Asp Thr Thr Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Phe Pro Pro Ile Ser Asn Phe
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
260 265
<210> 273
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 273
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ser Lys Ile Asn
20 25 30
Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Asn Tyr Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr Ala Thr Gly Thr Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Thr Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Thr Phe Pro Pro Ile Ser Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Trp
165 170 175
Asp Val His Lys Ile Asn Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly
180 185 190
Lys Glu Arg Glu Lys Val Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp
195 200 205
Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser
210 215 220
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
225 230 235 240
Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg Ala Leu Ser Lys Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
260 265
<210> 274
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 274
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ser Lys Ile Asn
20 25 30
Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Asn Tyr Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr Ala Thr Gly Thr Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Thr Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Thr Phe Pro Pro Ile Ser Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Tyr
165 170 175
Asp Val His Lys Ile Asn Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly
180 185 190
Lys Glu Arg Glu Lys Val Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp
195 200 205
Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser
210 215 220
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
225 230 235 240
Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg Ala Leu Ser Lys Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
260 265
<210> 275
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 275
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Val His Lys Ile Asn
20 25 30
Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val
35 40 45
Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg
85 90 95
Ala Leu Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
165 170 175
Ser Gly Ile Thr Ser Lys Ile Asn Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr
180 185 190
Pro Gly Asn Tyr Arg Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Ala Thr Gly Thr
195 200 205
Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
210 215 220
Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
225 230 235 240
Asp Thr Thr Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Phe Pro Pro Ile Ser Asn Phe
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
260 265
<210> 276
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 276
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ser Lys Ile Asn
20 25 30
Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Asn Tyr Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr Ala Thr Gly Thr Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Thr Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Thr Phe Pro Pro Ile Ser Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly
165 170 175
Tyr Val His Lys Ile Asn Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly
180 185 190
Lys Glu Arg Glu Lys Val Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp
195 200 205
Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser
210 215 220
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
225 230 235 240
Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg Ala Leu Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
260 265
<210> 277
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 277
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Trp Asp Val His Gln Ile Asn
20 25 30
Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val
35 40 45
Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg
85 90 95
Ala Leu Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
165 170 175
Ser Gly Ile Thr Ser Lys Ile Asn Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr
180 185 190
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Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
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Asp Thr Thr Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Phe Pro Pro Ile Ser Asn Phe
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
260 265
<210> 278
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 278
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ser Lys Ile Asn
20 25 30
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35 40 45
Ala Ser Ile Thr Ala Thr Gly Thr Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr Leu
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100 105 110
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115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Trp
165 170 175
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Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser
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<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 279
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Trp Asp Val His Lys Ile Asn
20 25 30
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Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
165 170 175
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Pro Gly Asn Tyr Arg Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Ala Thr Gly Thr
195 200 205
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Asp Thr Thr Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Phe Pro Pro Ile Ser Asn Phe
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
260 265
<210> 280
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 280
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ser Lys Ile Asn
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
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Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Trp
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Lys Glu Arg Glu Lys Val Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp
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<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 281
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Trp Asp Val His Lys Ile Asn
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Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
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<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 282
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ser Lys Ile Asn
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
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Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Trp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 283
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Val His Lys Ile Asn
20 25 30
Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val
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Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
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Ala Leu Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Pro Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
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Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala
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Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
305 310 315 320
Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
325 330 335
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Pro Gly Asn Tyr Arg Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Ala Thr Gly Thr
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Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
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<211> 428
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 284
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ser Lys Ile Asn
20 25 30
Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Asn Tyr Arg Glu Trp Val
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Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly
165 170 175
Tyr Val His Lys Ile Asn Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly
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Lys Glu Arg Glu Lys Val Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp
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Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg Ala Leu Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
290 295 300
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Pro Leu
305 310 315 320
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Val Met
325 330 335
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
340 345 350
Ile Tyr Trp Ser Asn Gly Lys Thr Gln Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly
355 360 365
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 285
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Val His Lys Ile Asn
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
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Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
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Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala
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Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser Asp Gly
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
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Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys
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355 360 365
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 286
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro
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Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Val
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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr
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Cys Arg Ala Leu Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
305 310 315 320
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys
325 330 335
Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg
340 345 350
Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser
355 360 365
Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
370 375 380
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
385 390 395 400
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405 410 415
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435 440
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<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 287
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
165 170 175
Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
180 185 190
Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
195 200 205
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210 215 220
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
225 230 235 240
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290 295 300
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305 310 315 320
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val
325 330 335
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Val
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His Lys Ile Asn Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu
355 360 365
Arg Glu Lys Val Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp Tyr Ala
370 375 380
Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn
385 390 395 400
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu
405 410 415
Tyr Tyr Cys Arg Ala Leu Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly
420 425 430
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
435 440
<210> 288
<211> 428
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 288
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Pro Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Trp Ser Asn Gly Lys Thr Gln Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ala Asp Lys Asp Glu Thr Gly Phe Arg Thr Leu Pro Ile Ala Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
165 170 175
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ser Lys Ile Asn
180 185 190
Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Asn Tyr Arg Glu Trp Val
195 200 205
Ala Ser Ile Thr Ala Thr Gly Thr Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys
210 215 220
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr Leu
225 230 235 240
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Thr Val Tyr Tyr Cys Asn
245 250 255
Thr Phe Pro Pro Ile Ser Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
260 265 270
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
275 280 285
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
305 310 315 320
Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly
325 330 335
Tyr Val His Lys Ile Asn Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly
340 345 350
Lys Glu Arg Glu Lys Val Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp
355 360 365
Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser
370 375 380
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
385 390 395 400
Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg Ala Leu Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr
405 410 415
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
420 425
<210> 289
<211> 428
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 289
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ser Lys Ile Asn
20 25 30
Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Asn Tyr Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr Ala Thr Gly Thr Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Thr Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Thr Phe Pro Pro Ile Ser Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Leu Val Gln Ala Gly Gly Pro Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
165 170 175
Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
180 185 190
Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Tyr Trp Ser Asn Gly Lys Thr
195 200 205
Gln Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn
210 215 220
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp
225 230 235 240
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ala Asp Lys Asp Glu Thr Gly Phe Arg
245 250 255
Thr Leu Pro Ile Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
260 265 270
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
275 280 285
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
305 310 315 320
Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly
325 330 335
Tyr Val His Lys Ile Asn Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly
340 345 350
Lys Glu Arg Glu Lys Val Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp
355 360 365
Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser
370 375 380
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
385 390 395 400
Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg Ala Leu Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr
405 410 415
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
420 425
<210> 290
<211> 428
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISVD形式
<400> 290
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Pro Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Trp Ser Asn Gly Lys Thr Gln Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ala Asp Lys Asp Glu Thr Gly Phe Arg Thr Leu Pro Ile Ala Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
165 170 175
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Val His Lys Ile Asn
180 185 190
Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val
195 200 205
Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
210 215 220
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
225 230 235 240
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg
245 250 255
Ala Leu Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
260 265 270
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
290 295 300
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
305 310 315 320
Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
325 330 335
Ser Gly Ile Thr Ser Lys Ile Asn Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr
340 345 350
Pro Gly Asn Tyr Arg Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Ala Thr Gly Thr
355 360 365
Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
370 375 380
Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
385 390 395 400
Asp Thr Thr Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Phe Pro Pro Ile Ser Asn Phe
405 410 415
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
420 425
<210> 291
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人TCRα恒定结构域 (源自P01848)
<400> 291
Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
85 90 95
<210> 292
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人TCRβ恒定结构域 (源自P01850)
<400> 292
Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
50 55 60
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu
65 70 75 80
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
85 90 95
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
100 105 110
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Ala Asp Cys
130
<210> 293
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴TCR-α恒定结构域 (源自AEA41865)
<400> 293
Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Gly Ser
1 5 10 15
Lys Ser Asn Asp Thr Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Val
20 25 30
Met Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val His Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Gly Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Thr Ser Ala Phe Lys Asp
65 70 75 80
Ser Val Ile Pro Ala Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
85 90 95
<210> 294
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴TCR-β恒定结构域 (源自AEA41868)
<400> 294
Glu Asp Leu Lys Lys Val Phe Pro Pro Lys Val Ala Val Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
50 55 60
Glu Gln Pro Ala Leu Glu Asp Ser Arg Tyr Ser Leu Ser Ser Arg Leu
65 70 75 80
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
85 90 95
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asp Asp Glu Trp Thr Glu Asp
100 105 110
Arg Asp Lys Pro Ile Thr Gln Lys Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Ala Asp Cys
130
<210> 295
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 位置1处的Xaa是Gly, Trp, Gln, 或Tyr
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> 位置2处的Xaa是Asp, Glu, Tyr, Ser, 或Ala
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> 位置5处的Xaa是Lys, 或Gln
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> 位置6处的Xaa是Ile, 或Leu
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> 位置7处的Xaa是Asn, 或Phe
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> 位置8处的Xaa是Phe, Val, 或Tyr
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> 位置9处的Xaa是Leu, Tyr, 或Phe
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> 位置10处的Xaa是Gly, Thr, 或Arg
<400> 295
Xaa Xaa Val His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 296
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 位置1处的Xaa是His, 或Val
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> 位置5处的Xaa是Gly, 或Ala
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> 位置7处的Xaa是Gln, Val, 或Glu
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> 位置8处的Xaa是Thr, Ser, 或Val
<400> 296
Xaa Ile Ser Ile Xaa Asp Xaa Xaa Asp
1 5
<210> 297
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 位置1处的Xaa是Phe, Leu或Met
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> 位置3处的Xaa是Arg, Lys, 或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> 位置5处的Xaa是Tyr, 或Trp
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> 位置8处的Xaa是Asp, 或Gln
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> 位置9处的Xaa是Tyr, 或Trp
<400> 297
Xaa Ser Xaa Ile Xaa Pro Tyr Xaa Xaa
1 5
<210> 298
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 位置1处的Xaa是Gly, Trp, 或Tyr
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> 位置2处的Xaa是Asp, Glu, Tyr, Ser, 或Ala
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> 位置5处的Xaa是Lys, 或Gln
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> 位置6处的Xaa是Ile, 或Leu
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> 位置9处的Xaa是Leu, 或Tyr
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> 位置10处的Xaa是Gly, 或Thr
<400> 298
Xaa Xaa Val His Xaa Xaa Asn Phe Xaa Xaa
1 5 10
<210> 299
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 位置1处的Xaa是Phe, Leu或Met
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> 位置3处的Xaa是Arg, 或Lys
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> 位置5处的Xaa是Tyr, 或Trp
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> 位置9处的Xaa是Tyr, 或Trp
<400> 299
Xaa Ser Xaa Ile Xaa Pro Tyr Asp Xaa
1 5
<210> 300
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD3δ (P04234)
<400> 300
Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg
20 25 30
Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val
35 40 45
Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile
50 55 60
Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys
85 90 95
Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val
100 105 110
Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His
115 120 125
Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg
130 135 140
Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr
145 150 155 160
Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys
165 170
<210> 301
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD3γ (源自P09693)
<400> 301
Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu
1 5 10 15
Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys
20 25 30
Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala
35 40 45
Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe
50 55 60
Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp
65 70 75 80
Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro
85 90 95
Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala
100 105 110
Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Val Ser Ile Phe Val
115 120 125
Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln
130 135 140
Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr
145 150 155 160
Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly
165 170 175
Asn Gln Leu Arg
180
<210> 302
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD3ε (源自P07766)
<400> 302
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg
195 200 205
<210> 303
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD3ζ (P20963)
<400> 303
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
100 105 110
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
145 150 155 160
Leu Pro Pro Arg
<210> 304
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人TCRα恒定结构域 (源自P01848)
<400> 304
Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
85 90 95
Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn
100 105 110
Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val
115 120 125
Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 305
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人TCRβ恒定结构域 (源自P01850)
<400> 305
Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
50 55 60
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu
65 70 75 80
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
85 90 95
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
100 105 110
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
130 135 140
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
145 150 155 160
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
165 170 175
Phe
<210> 306
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自2IAN的人TCRα可变结构域
<400> 306
Ile Gln Val Glu Gln Ser Pro Pro Asp Leu Ile Leu Gln Glu Gly Ala
1 5 10 15
Asn Ser Thr Leu Arg Cys Asn Phe Ser Asp Ser Val Asn Asn Leu Gln
20 25 30
Trp Phe His Gln Asn Pro Trp Gly Gln Leu Ile Asn Leu Phe Tyr Ile
35 40 45
Pro Ser Gly Thr Lys Gln Asn Gly Arg Leu Ser Ala Thr Thr Val Ala
50 55 60
Thr Glu Arg Tyr Ser Leu Leu Tyr Ile Ser Ser Ser Gln Thr Thr Asp
65 70 75 80
Ser Gly Val Tyr Phe Cys Ala Ala Leu Ile Gln Gly Ala Gln Lys Leu
85 90 95
Val Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Thr Ile Asn
100 105
<210> 307
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自2XN9的人TCRα可变结构域
<400> 307
Gln Leu Leu Glu Gln Ser Pro Gln Phe Leu Ser Ile Gln Glu Gly Glu
1 5 10 15
Asn Leu Thr Val Tyr Cys Asn Ser Ser Ser Val Phe Ser Ser Leu Gln
20 25 30
Trp Tyr Arg Gln Glu Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu Val Thr Val
35 40 45
Val Thr Gly Gly Glu Val Lys Lys Leu Lys Arg Leu Thr Phe Gln Phe
50 55 60
Gly Asp Ala Arg Lys Asp Ser Ser Leu His Ile Thr Ala Ala Gln Pro
65 70 75 80
Gly Asp Thr Gly Leu Tyr Leu Cys Ala Gly Ala Gly Ser Gln Gly Asn
85 90 95
Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Lys
100 105
<210> 308
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自3TOE的人TCRα可变结构域
<400> 308
Gly Asp Ala Lys Thr Thr Gln Pro Asn Ser Met Glu Ser Asn Glu Glu
1 5 10 15
Glu Pro Val His Leu Pro Cys Asn His Ser Thr Ile Ser Gly Thr Asp
20 25 30
Tyr Ile His Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Ser Gln Gly Pro Glu Tyr Val
35 40 45
Ile His Gly Leu Thr Ser Asn Val Asn Asn Arg Met Ala Ser Leu Ala
50 55 60
Ile Ala Glu Asp Arg Lys Ser Ser Thr Leu Ile Leu His Arg Ala Thr
65 70 75 80
Leu Arg Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Val Tyr Gly Gly Ala Thr
85 90 95
Asn Lys Leu Ile Phe Gly Thr Gly Thr Leu Leu Ala Val Gln
100 105 110
<210> 309
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自2IAN的人TCRβ可变结构域
<400> 309
Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Arg Ile Leu Lys Ile Gly
1 5 10 15
Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Thr Gln Asp Met Asn His Asn Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Lys Leu Ile Tyr Tyr
35 40 45
Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Lys Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr
50 55 60
Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Glu Leu
65 70 75 80
Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Thr Tyr His
85 90 95
Gly Thr Gly Tyr Phe Gly Glu Gly Ser Trp Leu Thr Val Val
100 105 110
<210> 310
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自2XN9的人TCRβ可变结构域
<400> 310
Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys Glu Gly
1 5 10 15
Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp Ala Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr
35 40 45
Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu Gly Tyr
50 55 60
Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val Thr Ser
65 70 75 80
Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Ser Arg
85 90 95
Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr
100 105 110
<210> 311
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自3TOE的人TCRβ可变结构域
<400> 311
Val Val Ser Gln His Pro Ser Trp Val Ile Ala Lys Ser Gly Thr Ser
1 5 10 15
Val Lys Ile Glu Cys Arg Ser Leu Asp Phe Gln Ala Thr Thr Met Phe
20 25 30
Trp Tyr Arg Gln Phe Pro Lys Gln Ser Leu Met Leu Met Ala Thr Ser
35 40 45
Asn Glu Gly Ser Lys Ala Thr Tyr Glu Gln Gly Val Glu Lys Asp Lys
50 55 60
Phe Leu Ile Asn His Ala Ser Leu Thr Leu Ser Thr Leu Thr Val Thr
65 70 75 80
Ser Ala His Pro Glu Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Cys Ser Ala Arg Gly
85 90 95
Gly Ser Tyr Asn Ser Pro Leu His Phe Gly Asn Gly Thr Arg Leu Thr
100 105 110
Val Thr
<210> 312
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴CD3δ (NP_001274617)
<400> 312
Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Val Glu Glu Leu Glu Asp Arg
20 25 30
Val Phe Val Lys Cys Asn Thr Ser Val Thr Trp Val Glu Gly Thr Val
35 40 45
Gly Thr Leu Leu Thr Asn Asn Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile
50 55 60
Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Asp Lys Glu Ser Ala Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys
85 90 95
Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Leu Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val
100 105 110
Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His
115 120 125
Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg
130 135 140
Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr
145 150 155 160
Ser Arg Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys
165 170
<210> 313
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴CD3γ (BAJ16168)
<400> 313
Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Thr Gly Phe Ile Leu Ala Ile Ile Leu
1 5 10 15
Leu Gln Gly Ser Leu Ala Gln Ser Phe Glu Glu Asn Arg Lys Leu Asn
20 25 30
Val Tyr Asn Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys His Val Lys
35 40 45
Asn Thr Asn Ile Thr Trp Phe Lys Glu Gly Lys Met Ile Asp Ile Leu
50 55 60
Thr Ala His Lys Asn Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Thr Lys Asp Pro
65 70 75 80
Arg Gly Val Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Lys Asp Lys Ser Lys Thr Leu
85 90 95
Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala Ala
100 105 110
Thr Ile Leu Gly Phe Val Phe Ala Glu Ile Ile Ser Ile Phe Phe Leu
115 120 125
Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln Ser
130 135 140
Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr Gln
145 150 155 160
Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly Asn
165 170 175
Gln Leu Arg Arg Asn
180
<210> 314
<211> 198
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴CD3ε (Q95LI5)
<400> 314
Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys
50 55 60
Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu
65 70 75 80
Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro
85 90 95
Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn
100 105 110
Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp
115 120 125
Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys
130 135 140
Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly
145 150 155 160
Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn
165 170 175
Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly
180 185 190
Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195
<210> 315
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴CD3ζ (XP_005539936)
<400> 315
Met Lys Trp Lys Glu Leu Val Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Phe
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Leu Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
100 105 110
Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Thr
145 150 155 160
Leu Pro Pro Arg
<210> 316
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 恒河猴TCRα (AEA41863)
<400> 316
Met Leu Leu Leu Leu Val Leu Val Leu Glu Val Ile Phe Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gly Thr Arg Ala Gln Ser Val Thr Gln Leu Asp Ser Gln Val Ser Val
20 25 30
Ser Glu Gly Val Pro Val Leu Leu Arg Cys Asn Tyr Ser Ser Ser Phe
35 40 45
Ser Pro Tyr Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Gln Gly Leu Gln
50 55 60
Leu Leu Leu Lys Tyr Thr Ser Gly Thr Thr Leu Val Lys Gly Ile Asn
65 70 75 80
Gly Phe Glu Ala Glu Phe Lys Lys Ser Glu Thr Ser Phe His Leu Thr
85 90 95
Lys Ala Ser Ala His Val Ser Asp Ala Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Leu
100 105 110
Ala Arg Gly Ala Leu Val Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu Ser Val Ile
115 120 125
Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Gly Ser
130 135 140
Lys Ser Asn Asp Thr Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Val
145 150 155 160
Met Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val His Ile Thr Asp Lys
165 170 175
Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Gly Ala Val
180 185 190
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Thr Ser Ala Phe Lys Asp
195 200 205
Ser Val Ile Pro Ala Asp Thr Phe Phe Pro Gly Thr Glu Ser Val Cys
210 215 220
Asp Ala Asn Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn
225 230 235 240
Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val
245 250 255
Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265 270
<210> 317
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 恒河猴TCRβ (AEA41864)
<400> 317
Met Gly Phe Trp Thr Leu Cys Cys Val Ser Phe Cys Ile Leu Val Ala
1 5 10 15
Lys His Thr Asp Ala Gly Val Ile Gln Leu Pro Arg His Glu Val Thr
20 25 30
Glu Met Gly Lys Glu Val Thr Leu Arg Cys Glu Pro Ile Ser Gly His
35 40 45
Ser Ser Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Phe
50 55 60
Leu Ile Tyr Phe Asn Asn Lys Ser Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro
65 70 75 80
Lys Asp Arg Phe Ser Ala Thr Met Pro Asp Ala Ser Phe Ser Thr Leu
85 90 95
Lys Ile Gln Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Ser Thr Pro Gly Gln Gly Arg Glu Lys Leu Phe Phe Gly Ser Gly Thr
115 120 125
Gln Leu Ser Val Leu Glu Asp Leu Lys Lys Val Phe Pro Pro Lys Val
130 135 140
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
145 150 155 160
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
165 170 175
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp
180 185 190
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Glu Asp Ser Arg Tyr Cys
195 200 205
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg
210 215 220
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asp Asp
225 230 235 240
Glu Trp Thr Glu Asp Arg Asp Lys Pro Ile Thr Gln Lys Ile Ser Ala
245 250 255
Glu Val Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln
260 265 270
Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys
275 280 285
Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Met Leu Met Ala Met
290 295 300
Val Lys Arg Lys Asp Phe
305 310
<210> 318
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人TCR-拉链: α链
<400> 318
Met Asn Met Arg Pro Val Thr Ser Ser Val Leu Val Leu Leu Leu Met
1 5 10 15
Leu Arg Arg Ser Asn Gly Gln Leu Leu Glu Gln Ser Pro Gln Phe Leu
20 25 30
Ser Ile Gln Glu Gly Glu Asn Leu Thr Val Tyr Cys Asn Ser Ser Ser
35 40 45
Val Phe Ser Ser Leu Gln Trp Tyr Arg Gln Glu Pro Gly Glu Gly Pro
50 55 60
Val Leu Leu Val Thr Val Val Thr Gly Gly Glu Val Lys Lys Leu Lys
65 70 75 80
Arg Leu Thr Phe Gln Phe Gly Asp Ala Arg Lys Asp Ser Ser Leu His
85 90 95
Ile Thr Ala Ala Gln Pro Gly Asp Thr Gly Leu Tyr Leu Cys Ala Gly
100 105 110
Ala Gly Ser Gln Gly Asn Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser
115 120 125
Val Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg
130 135 140
Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp
145 150 155 160
Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr
165 170 175
Asp Lys Ser Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser
180 185 190
Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe
195 200 205
Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser
210 215 220
Ser Cys Ser Ser Ala Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Thr Thr Ala Pro
225 230 235 240
Ser Ala Gln Leu Lys Lys Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Asn Ala
245 250 255
Gln Leu Lys Trp Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Leu Ala Gln Glu
260 265 270
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
275 280
<210> 319
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人TCR-拉链: β链
<400> 319
Met Ser Asn Thr Val Leu Ala Asp Ser Ala Trp Gly Ile Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Trp Val Thr Val Phe Leu Leu Gly Thr Ser Ser Ala Asp Gly Gly
20 25 30
Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys Glu Gly Gln Asn Val
35 40 45
Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp Ala Met Tyr Trp Tyr
50 55 60
Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr Ser Gln Ile
65 70 75 80
Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu Gly Tyr Ser Val Ser
85 90 95
Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val Thr Ser Ala Gln Lys
100 105 110
Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Ser Arg Ser Ser Tyr
115 120 125
Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu
130 135 140
Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly
165 170 175
Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu
180 185 190
Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro
195 200 205
Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ser Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser
210 215 220
Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln
225 230 235 240
Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys
245 250 255
Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys
260 265 270
Ser Ser Ala Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Thr Thr Ala Pro Ser Ala
275 280 285
Gln Leu Glu Lys Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Asn Ala Gln Leu
290 295 300
Glu Trp Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala Gln Thr Gly His
305 310 315 320
His His His His His His His His His
325
<210> 320
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴TCR-拉链: α链 (源自AEA41865)
<400> 320
Met Leu Leu Ile Thr Ser Val Leu Val Leu Trp Met Gln Leu Ser Gln
1 5 10 15
Val Asn Gly Gln Gln Ile Met Gln Ile Pro Gln Tyr Gln His Val Gln
20 25 30
Glu Gly Glu Asp Phe Thr Thr Tyr Cys Asn Ser Ser Thr Thr Leu Ser
35 40 45
Asn Ile Gln Trp Tyr Lys Gln Arg Pro Gly Gly His Pro Val Phe Leu
50 55 60
Ile Met Leu Val Lys Ser Gly Glu Val Lys Lys Gln Lys Arg Leu Ile
65 70 75 80
Phe Gln Phe Gly Glu Ala Lys Lys Asn Ser Ser Leu His Ile Thr Ala
85 90 95
Thr Gln Thr Thr Asp Val Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Thr Thr Gly Val
100 105 110
Asn Asn Leu Phe Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Pro Tyr
115 120 125
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Gly Ser Lys Ser
130 135 140
Asn Asp Thr Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Val Met Asn
145 150 155 160
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val His Ile Thr Asp Lys Thr Val
165 170 175
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Gly Ala Val Ala Trp
180 185 190
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Thr Ser Ala Phe Lys Asp Ser Val
195 200 205
Ile Pro Ala Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Ser Ser
210 215 220
Ala Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Thr Thr Ala Pro Ser Ala Gln Leu
225 230 235 240
Lys Lys Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Asn Ala Gln Leu Lys Trp
245 250 255
Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Leu Ala Gln Glu Gln Lys Leu Ile
260 265 270
Ser Glu Glu Asp Leu
275
<210> 321
<211> 321
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴TCR-拉链: β链 (源自AEA41866和AEA41868)
<400> 321
Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu
20 25 30
Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His
35 40 45
Asp Tyr Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile His Tyr Ser Val Gly Glu Gly Ser Thr Glu Lys Gly Glu Val Pro
65 70 75 80
Asp Gly Tyr Asn Val Thr Arg Ser Asn Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg
85 90 95
Leu Glu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Tyr Trp Thr Gly Arg Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Arg Leu Thr Val Ile Glu Asp Leu Lys Lys Val Phe Pro Pro Lys Val
130 135 140
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
145 150 155 160
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
165 170 175
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp
180 185 190
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Glu Asp Ser Arg Tyr Ser
195 200 205
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg
210 215 220
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asp Asp
225 230 235 240
Glu Trp Thr Glu Asp Arg Asp Lys Pro Ile Thr Gln Lys Ile Ser Ala
245 250 255
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Ser Ser Ala Asp Leu Val Pro Arg
260 265 270
Gly Ser Thr Thr Ala Pro Ser Ala Gln Leu Glu Lys Glu Leu Gln Ala
275 280 285
Leu Glu Lys Glu Asn Ala Gln Leu Glu Trp Glu Leu Gln Ala Leu Glu
290 295 300
Lys Glu Leu Ala Gln Thr Gly His His His His His His His His His
305 310 315 320
His
<210> 322
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 322
Ala Ala Ala
1
<210> 323
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 323
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 324
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 324
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 325
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 325
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 326
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 326
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 327
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 327
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 328
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 328
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 329
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 329
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 330
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 330
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 331
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 331
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 332
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 332
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 333
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 333
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 334
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 334
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 335
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 335
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 336
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 336
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
1 5 10 15
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20
<210> 337
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 337
Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 338
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 338
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
35 40 45
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 339
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端
<400> 339
Val Thr Val Ser Ser
1 5
<210> 340
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端
<400> 340
Val Lys Val Ser Ser
1 5
<210> 341
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端
<400> 341
Val Gln Val Ser Ser
1 5
<210> 342
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端
<400> 342
Val Thr Val Lys Ser
1 5
<210> 343
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端
<400> 343
Val Thr Val Gln Ser
1 5
<210> 344
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端
<400> 344
Val Lys Val Lys Ser
1 5
<210> 345
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端
<400> 345
Val Lys Val Gln Ser
1 5
<210> 346
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端
<400> 346
Val Gln Val Lys Ser
1 5
<210> 347
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端
<400> 347
Val Gln Val Gln Ser
1 5
<210> 348
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端
<400> 348
Val Thr Val Ser Ser Ala
1 5
<210> 349
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端
<400> 349
Val Lys Val Ser Ser Ala
1 5
<210> 350
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端
<400> 350
Val Gln Val Ser Ser Ala
1 5
<210> 351
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端
<400> 351
Val Thr Val Lys Ser Ala
1 5
<210> 352
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端
<400> 352
Val Thr Val Gln Ser Ala
1 5
<210> 353
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端
<400> 353
Val Lys Val Lys Ser Ala
1 5
<210> 354
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端
<400> 354
Val Lys Val Gln Ser Ala
1 5
<210> 355
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端
<400> 355
Val Gln Val Lys Ser Ala
1 5
<210> 356
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端
<400> 356
Val Gln Val Gln Ser Ala
1 5
<210> 357
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<400> 357
Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser
1 5 10
<210> 358
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<400> 358
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser
1 5 10
<210> 359
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
<400> 359
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu
1 5 10
<210> 360
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 360
Gly Gly Ser Leu Ser Arg
1 5
<210> 361
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合血清白蛋白的ISVD
<400> 361
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 362
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合血清白蛋白的ISVD
<400> 362
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 363
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合血清白蛋白的ISVD
<400> 363
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 364
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合血清白蛋白的ISVD
<400> 364
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 365
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合血清白蛋白的ISVD
<400> 365
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 366
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合血清白蛋白的ISVD
<400> 366
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 367
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合血清白蛋白的ISVD
<400> 367
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 368
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合血清白蛋白的ISVD
<400> 368
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 369
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合血清白蛋白的ISVD
<400> 369
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Lys
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 370
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合血清白蛋白的ISVD
<400> 370
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Lys
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 371
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合血清白蛋白的ISVD
<400> 371
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 372
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合血清白蛋白的ISVD
<400> 372
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 373
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合血清白蛋白的ISVD
<400> 373
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Lys
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 374
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合血清白蛋白的ISVD
<400> 374
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Lys
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 375
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合血清白蛋白的ISVD
<400> 375
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 376
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合血清白蛋白的ISVD
<400> 376
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 377
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合血清白蛋白的ISVD
<400> 377
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Lys
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 378
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合血清白蛋白的ISVD
<400> 378
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Lys
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 379
<211> 378
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD123 (NP_002174)
<400> 379
Met Val Leu Leu Trp Leu Thr Leu Leu Leu Ile Ala Leu Pro Cys Leu
1 5 10 15
Leu Gln Thr Lys Glu Asp Pro Asn Pro Pro Ile Thr Asn Leu Arg Met
20 25 30
Lys Ala Lys Ala Gln Gln Leu Thr Trp Asp Leu Asn Arg Asn Val Thr
35 40 45
Asp Ile Glu Cys Val Lys Asp Ala Asp Tyr Ser Met Pro Ala Val Asn
50 55 60
Asn Ser Tyr Cys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Leu Cys Glu Val Thr Asn
65 70 75 80
Tyr Thr Val Arg Val Ala Asn Pro Pro Phe Ser Thr Trp Ile Leu Phe
85 90 95
Pro Glu Asn Ser Gly Lys Pro Trp Ala Gly Ala Glu Asn Leu Thr Cys
100 105 110
Trp Ile His Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Ala Val Gly Pro
115 120 125
Gly Ala Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Val Ala Asn
130 135 140
Arg Arg Gln Gln Tyr Glu Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala Gln Gly
145 150 155 160
Thr Arg Ile Gly Cys Arg Phe Asp Asp Ile Ser Arg Leu Ser Ser Gly
165 170 175
Ser Gln Ser Ser His Ile Leu Val Arg Gly Arg Ser Ala Ala Phe Gly
180 185 190
Ile Pro Cys Thr Asp Lys Phe Val Val Phe Ser Gln Ile Glu Ile Leu
195 200 205
Thr Pro Pro Asn Met Thr Ala Lys Cys Asn Lys Thr His Ser Phe Met
210 215 220
His Trp Lys Met Arg Ser His Phe Asn Arg Lys Phe Arg Tyr Glu Leu
225 230 235 240
Gln Ile Gln Lys Arg Met Gln Pro Val Ile Thr Glu Gln Val Arg Asp
245 250 255
Arg Thr Ser Phe Gln Leu Leu Asn Pro Gly Thr Tyr Thr Val Gln Ile
260 265 270
Arg Ala Arg Glu Arg Val Tyr Glu Phe Leu Ser Ala Trp Ser Thr Pro
275 280 285
Gln Arg Phe Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Ala Asn Thr Arg Ala Trp
290 295 300
Arg Thr Ser Leu Leu Ile Ala Leu Gly Thr Leu Leu Ala Leu Val Cys
305 310 315 320
Val Phe Val Ile Cys Arg Arg Tyr Leu Val Met Gln Arg Leu Phe Pro
325 330 335
Arg Ile Pro His Met Lys Asp Pro Ile Gly Asp Ser Phe Gln Asn Asp
340 345 350
Lys Leu Val Val Trp Glu Ala Gly Lys Ala Gly Leu Glu Glu Cys Leu
355 360 365
Val Thr Glu Val Gln Val Val Gln Lys Thr
370 375
<210> 380
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 380
Lys Glu Arg Glu
1
<210> 381
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 381
Lys Gln Arg Glu
1
<210> 382
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 382
Gly Leu Glu Trp
1
<210> 383
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 383
Lys Glu Arg Glu Leu
1 5
<210> 384
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 384
Lys Glu Arg Glu Phe
1 5
<210> 385
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 385
Lys Gln Arg Glu Leu
1 5
<210> 386
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 386
Lys Gln Arg Glu Phe
1 5
<210> 387
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 387
Lys Glu Arg Glu Gly
1 5
<210> 388
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 388
Lys Gln Arg Glu Trp
1 5
<210> 389
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 389
Lys Gln Arg Glu Gly
1 5
<210> 390
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 390
Thr Glu Arg Glu
1
<210> 391
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 391
Thr Glu Arg Glu Leu
1 5
<210> 392
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 392
Thr Gln Arg Glu
1
<210> 393
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 393
Thr Gln Arg Glu Leu
1 5
<210> 394
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 394
Lys Glu Cys Glu
1
<210> 395
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 395
Lys Glu Cys Glu Leu
1 5
<210> 396
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 396
Lys Glu Cys Glu Arg
1 5
<210> 397
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 397
Lys Gln Cys Glu
1
<210> 398
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 398
Lys Gln Cys Glu Leu
1 5
<210> 399
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 399
Arg Glu Arg Glu
1
<210> 400
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 400
Arg Glu Arg Glu Gly
1 5
<210> 401
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 401
Arg Gln Arg Glu
1
<210> 402
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 402
Arg Gln Arg Glu Leu
1 5
<210> 403
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 403
Arg Gln Arg Glu Phe
1 5
<210> 404
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 404
Arg Gln Arg Glu Trp
1 5
<210> 405
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 405
Gln Glu Arg Glu
1
<210> 406
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 406
Gln Glu Arg Glu Gly
1 5
<210> 407
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 407
Gln Gln Arg Glu
1
<210> 408
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 408
Gln Gln Arg Glu Trp
1 5
<210> 409
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 409
Gln Gln Arg Glu Leu
1 5
<210> 410
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 410
Gln Gln Arg Glu Phe
1 5
<210> 411
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 411
Lys Gly Arg Glu
1
<210> 412
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 412
Lys Gly Arg Glu Gly
1 5
<210> 413
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 413
Lys Asp Arg Glu
1
<210> 414
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 414
Lys Asp Arg Glu Val
1 5
<210> 415
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 415
Asp Glu Cys Lys Leu
1 5
<210> 416
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 416
Asn Val Cys Glu Leu
1 5
<210> 417
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 417
Gly Val Glu Trp
1
<210> 418
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 418
Glu Pro Glu Trp
1
<210> 419
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 419
Gly Leu Glu Arg
1
<210> 420
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 420
Asp Gln Glu Trp
1
<210> 421
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 421
Asp Leu Glu Trp
1
<210> 422
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 422
Gly Ile Glu Trp
1
<210> 423
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 423
Glu Leu Glu Trp
1
<210> 424
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 424
Gly Pro Glu Trp
1
<210> 425
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 425
Glu Trp Leu Pro
1
<210> 426
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 426
Gly Pro Glu Arg
1
<210> 427
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 427
Gly Leu Glu Arg
1
<210> 428
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自表B-2的基序
<400> 428
Glu Leu Glu Trp
1
<210> 429
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> 位置2处的Xaa是Asp或Glu
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> 位置5处的Xaa是Lys或Gln
<400> 429
Gly Xaa Val His Xaa
1 5
<210> 430
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 430
Gly Asp Val His Lys
1 5
<210> 431
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 431
Gly Glu Val His Lys
1 5
<210> 432
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 432
Gly Asp Val His Gln
1 5
<210> 433
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 433
Gly Glu Val His Gln
1 5
<210> 434
<211> 426
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多价多肽
<400> 434
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Val His Lys Ile Asn
20 25 30
Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val
35 40 45
Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg
85 90 95
Ala Leu Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala
165 170 175
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ala Met Thr Trp Val Arg Arg Pro
180 185 190
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Thr Asn Gly Gly Val
195 200 205
Thr Ser Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
210 215 220
Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Glu Met Thr Ser Leu Asn Pro Glu
225 230 235 240
Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys Ala Asn Ala Arg Arg Thr Gly Pro Arg
245 250 255
Ala Pro Thr Asp Ile Gly Ser Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
260 265 270
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
275 280 285
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
305 310 315 320
Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
325 330 335
Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
340 345 350
Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr
355 360 365
Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
370 375 380
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp
385 390 395 400
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser
405 410 415
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
420 425
<210> 435
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多价多肽
<400> 435
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Val His Lys Ile Asn
20 25 30
Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val
35 40 45
Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg
85 90 95
Ala Leu Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala
130 135 140
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ala Met Thr Trp Val Arg Arg Pro
145 150 155 160
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Thr Asn Gly Gly Val
165 170 175
Thr Ser Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
180 185 190
Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Glu Met Thr Ser Leu Asn Pro Glu
195 200 205
Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys Ala Asn Ala Arg Arg Thr Gly Pro Arg
210 215 220
Ala Pro Thr Asp Ile Gly Ser Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
275 280 285
Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
290 295 300
Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
305 310 315 320
Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr
325 330 335
Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
340 345 350
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp
355 360 365
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser
370 375 380
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
385 390
<210> 436
<211> 396
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多价多肽
<400> 436
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Val His Lys Ile Asn
20 25 30
Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val
35 40 45
Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg
85 90 95
Ala Leu Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
130 135 140
Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ala Met Thr Trp Val Arg
145 150 155 160
Arg Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Thr Asn Gly
165 170 175
Gly Val Thr Ser Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
180 185 190
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Glu Met Thr Ser Leu Asn
195 200 205
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys Ala Asn Ala Arg Arg Thr Gly
210 215 220
Pro Arg Ala Pro Thr Asp Ile Gly Ser Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
275 280 285
Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
290 295 300
Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
305 310 315 320
Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser
325 330 335
Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
340 345 350
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro
355 360 365
Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg
370 375 380
Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
385 390 395
<210> 437
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多价多肽
<400> 437
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Val His Lys Ile Asn
20 25 30
Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val
35 40 45
Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg
85 90 95
Ala Leu Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ala Met
145 150 155 160
Thr Trp Val Arg Arg Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr
165 170 175
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Thr Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys Ala Asn Ala
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Arg Arg Thr Gly Pro Arg Ala Pro Thr Asp Ile Gly Ser Tyr Arg Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
275 280 285
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Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser
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Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
340 345 350
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
355 360 365
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370 375 380
Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
385 390 395 400
<210> 438
<211> 411
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多价多肽
<400> 438
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Val His Lys Ile Asn
20 25 30
Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val
35 40 45
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
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Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val
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Arg Ala Pro Thr Asp Ile Gly Ser Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val
245 250 255
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
275 280 285
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
290 295 300
Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
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Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp
340 345 350
Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410
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<211> 550
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多价多肽
<400> 439
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Val His Lys Ile Asn
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100 105 110
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Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
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Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ala Met Thr Trp Val Arg
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
275 280 285
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala
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<212> PRT
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<220>
<223> 多价多肽
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多价多肽
<400> 441
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多价多肽
<400> 442
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Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多价多肽
<400> 443
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Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多价多肽
<400> 444
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Val His Lys Ile Asn
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Gly Val Thr Ser Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
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Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Glu Met Thr Ser Leu Asn
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Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys Ala Asn Ala Arg Arg Thr Gly
340 345 350
Pro Arg Ala Pro Thr Asp Ile Gly Ser Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu
355 360 365
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
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Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 多价多肽
<400> 446
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
275 280 285
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala
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<211> 520
<212> PRT
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<220>
<223> 多价多肽
<400> 447
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多价多肽
<400> 449
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<223> 多价多肽
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Asn Ala Arg Arg Thr Gly Pro Arg Ala Pro Thr Asp Ile Gly Ser Tyr
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Val His Lys Ile Asn
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
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<220>
<223> 多价多肽
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275 280 285
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<220>
<223> 多价多肽
<400> 454
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Ser Ala
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<212> PRT
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<220>
<223> 多价多肽
<400> 455
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多价多肽
<400> 456
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<223> 多价多肽
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<223> 多价多肽
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<223> 多价多肽
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<223> TCRαβ-CD33-CD123多特异性ISVD构建体
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Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
405 410 415
Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
420 425 430
Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser
435 440 445
Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
450 455 460
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro
465 470 475 480
Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg
485 490 495
Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
500 505
<210> 461
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCRαβ构建块
<400> 461
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Val His Lys Ile Asn
20 25 30
Phe Tyr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val
35 40 45
Ala His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys Arg
85 90 95
Ala Leu Ser Arg Ile Trp Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 462
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单价CD123构建块
<400> 462
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ile Phe Ser Gly Asn
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp
35 40 45
Val Ala Ala Ile Ala Glu Gly Gly Ser Ile Leu Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ser His Pro Pro Val Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 463
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单价CD33构建块
<400> 463
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Val Phe Arg Leu Asn
20 25 30
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ile Ile Thr Ser Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gln Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln
85 90 95
Ile Thr Tyr Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Phe Pro Ile Asn Thr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 464
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ALB23002
<400> 464
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
Claims (20)
1.一种包含第一免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和第二免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中
-所述第一ISVD特异性结合T细胞上存在的人和非人灵长类动物T细胞受体(TCR)的恒定结构域；
-所述第二ISVD特异性结合靶细胞上的第一抗原；
其中所述第一抗原不同于所述TCR；
其中所述靶细胞不同于所述T细胞；并且
其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1的氨基酸序列是Xaa Xaa Val His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa(SEQ ID NO:
295)，其中
位置1处的Xaa是Gly、Trp、Gln或Tyr，
位置2处的Xaa是Asp、Glu、Tyr、Ser或Ala，
位置5处的Xaa是Lys或Gln，
位置6处的Xaa是Ile或Leu，
位置7处的Xaa是Asn或Phe，
位置8处的Xaa是Phe、Val或Tyr，
位置9处的Xaa是Leu、Tyr或Phe，
位置10处的Xaa是Gly、Thr或Arg；
(ii)CDR2的氨基酸序列是Xaa Ile Ser Ile Xaa Asp Xaa Xaa Asp(SEQ ID NO:296)，其中
位置1处的Xaa是His或Val，
位置5处的Xaa是Gly或Ala，
位置7处的Xaa是Gln、Val或Glu，
位置8处的Xaa是Thr、Ser或Val；并且
(iii)CDR3的氨基酸序列是Xaa Ser Xaa Ile Xaa Pro Tyr Xaa Xaa(SEQ ID NO:297)，其中
位置1处的Xaa是Phe、Leu或Met，
位置3处的Xaa是Arg、Lys或Ser，
位置5处的Xaa是Tyr或Trp，
位置8处的Xaa是Asp或Gln，
位置9处的Xaa是Tyr或Trp，并且
其中所述第一ISVD的CDR1、CDR2、CDR3不同时分别是SEQ ID NO:153、209和223的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR1选自SEQ ID NO:154至169的氨基酸序列的组。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR2选自SEQ ID NO:210至215的氨基酸序列的组。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR3选自SEQ ID NO:224至230的氨基酸序列的组。
5.根据权利要求1所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
(i)CDR1的氨基酸序列是Xaa Xaa Val His Xaa Xaa Asn Phe Xaa Xaa(SEQ ID NO:
298)，其中
位置1处的Xaa是Gly、Trp或Tyr，
位置2处的Xaa是Asp、Glu、Tyr、Ser或Ala，
位置5处的Xaa是Lys或Gln，
位置6处的Xaa是Ile或Leu，
位置9处的Xaa是Leu或Tyr，
位置10处的Xaa是Gly或Thr，
(ii)CDR2的氨基酸序列是His Ile Ser Ile Gly Asp Gln Thr Asp(SEQ ID NO:209)，并且
(iii)CDR3的氨基酸序列是Xaa Ser Xaa Ile Xaa Pro Tyr Asp Xaa(SEQ ID NO:299)，其中
位置1处的Xaa是Phe、Leu或Met，
位置3处的Xaa是Arg或Lys，
位置5处的Xaa是Tyr或Trp，并且
位置9处的Xaa是Tyr或Trp。
6.根据权利要求5所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR1选自SEQ ID NO:171至207的氨基酸序列的组。
7.根据权利要求5或6所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中CDR3选自SEQ ID NO:235至247的氨基酸序列的组。
8.根据权利要求1、5、6或7中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
a)CDR1由GYVHKINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:171)组成，
CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及
CDR3由LSRIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:235)组成；或
b)CDR1由WDVHKINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:172)组成，
CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及
CDR3由LSKIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:236)组成；或
c)CDR1由YDVHKINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:173)组成，
CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及
CDR3由LSKIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:236)组成；或
d)CDR1由WDVHQINFYG的氨基酸序列(SEQ ID NO:174)组成，
CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及
CDR3由LSRIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:235)组成；或
e)CDR1由WDVHKINFYT的氨基酸序列(SEQ ID NO:175)组成，
CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及
CDR3由LSRIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:235)组成；或
f)CDR1由WDVHKINFYT的氨基酸序列(SEQ ID NO:175)组成，
CDR2由HISIGDQTD的氨基酸序列(SEQ ID NO:209)组成，以及
CDR3由LSKIWPYDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:236)组成。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD的氨基酸序列与SEQ IDNO:1至152、261或262的氨基酸序列中的至少一个具有至少80％序列同一性，其中出于确定序列同一性程度的目的，形成所述CDR序列的氨基酸残基被忽略。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD选自SEQ ID NO:46、150至152、261和262的氨基酸序列的组。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的多肽，所述多肽还包含第三ISVD，所述第三ISVD特异性结合靶细胞上的第二抗原。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含任选地经由一个或多个肽接头连接的一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元，其中与没有所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元的相应多肽相比，所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为所述多肽提供增加的半衰期，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是可以结合人血清白蛋白的ISVD。
13.一种编码根据权利要求1至12中任一项所述的多肽的核酸，或一种包含编码根据权利要求1至12中任一项所述的多肽的核酸的载体。
14.一种用根据权利要求13所述的核酸或载体转化或转染的宿主细胞。
15.一种产生根据权利要求1至12中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括在允许表达根据权利要求1至12中任一项所述的多肽的条件下培养根据权利要求14所述的宿主细胞，并且回收从培养物产生的多肽。
16.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1至12中任一项所述的多肽或根据权利要求15所述的方法产生的多肽。
17.根据权利要求1至12中任一项所述的多肽或根据权利要求16所述的组合物，用作药物。
18.根据权利要求1至12中任一项所述的多肽或根据权利要求16所述的组合物，用于预防、治疗或改善选自增殖性疾病、炎性疾病、感染性疾病和自身免疫病的疾病。
19.根据权利要求18所述的用于所述用途的多肽或组合物，其中所述增殖性疾病是选自以下的癌症：癌、神经胶质瘤、间皮瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病(包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性B成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病和毛细胞白血病)、骨髓增生异常综合征、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、系统性肥大细胞增多症、腺癌：乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤、多发性骨髓瘤(包括意义未明的单克隆丙种球蛋白病、无症状性和有症状性骨髓瘤)、前列腺癌和伯基特淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝胆管癌、胆囊癌、小肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、尿道癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、胰腺内分泌癌、类癌、骨癌、皮肤癌、视网膜母细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、卡波西肉瘤、多中心型卡斯尔曼病或艾滋病相关原发性渗出性淋巴瘤、神经外胚瘤、横纹肌肉瘤；以及上述任何癌症的任何转移。
20.根据权利要求18所述的用于所述用途的多肽或组合物，其中所述炎性疾病选自自身免疫性狼疮(SLE)、变态反应、哮喘和类风湿性关节炎。
Applications Claiming Priority (5)
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
| CN202180084333.5A Pending CN116783219A (zh) | 2020-12-18 | 2021-12-20 | 基于TCRα/β反应性的T细胞募集多肽 |
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-
2021
- 2021-12-20 CN CN202180084333.5A patent/CN116783219A/zh active Pending
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| PB01 | Publication | ||
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