CN116782946A - 使用btk抑制剂治疗慢性活动性抗体介导的排斥的方法 - Google Patents

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CN116782946A CN202280012330.5A CN202280012330A CN116782946A CN 116782946 A CN116782946 A CN 116782946A CN 202280012330 A CN202280012330 A CN 202280012330A CN 116782946 A CN116782946 A CN 116782946A
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Abstract

本披露提供了用于在受试者中治疗慢性活动性抗体介导的排斥(CAMR)的方法，这些方法包括向该受试者施用治疗有效量的BTK抑制剂，特别是(S)‑7‑(1‑丙烯酰基哌啶‑4‑基)‑2‑(4‑苯氧基苯基)‑4,5,6,7‑四氢吡唑并‑[1,5‑a]嘧啶‑3‑甲酰胺或其药学上可接受的盐。

Description

使用BTK抑制剂治疗慢性活动性抗体介导的排斥的方法
技术领域
本文披露了一种用于在经过器官移植的受试者中治疗或预防慢性活动性抗体介导的排斥(CAMR)的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的BTK抑制剂，特别是(S)-7-(1-丙烯酰基哌啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氢吡唑并-[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
背景技术
抗体介导的排斥(AMR)是保护移植物功能和改善受体长期存活率的瓶颈，AMR包括慢性活动性抗体介导的排斥(慢性活动性AMR，CAMR)，其为慢性同种异体排斥(如肾移植和肺移植中的慢性同种异体排斥)的主要原因。尽管开发了一些一致的诊断标准，但治疗方案的数据有限，并且长期结果仍然理想。
肾移植是终末期肾病最具治疗性的方法。随着免疫抑制剂的发展，肾脏移植后T细胞介导的急性排斥已得到有效预防。然而，由于慢性排斥，同种异体移植物和同种异体受体的存活率仍然不能令人满意。慢性排斥的主要原因是同种抗体介导的体液免疫。目前，AMR的诊断已经变得更加普遍，并且是肾脏移植物损失的主要原因，而且没有获批的疗法，并且治疗指南是基于低水平的证据。CAMR主要由体液免疫介导，是同种异体移植物失效的主要原因。CAMR的治疗包括静脉内人免疫球蛋白、血浆去除术/免疫吸附(PE/IA)、利妥昔单抗和硼替佐米。许多回顾性研究已证实静脉内免疫球蛋白(IVIG)在治疗抗体介导的排斥(ABMR)中的功效不确定[Ius F等人American journal of transplantation:official journalof the American Society of Transplantation and the American Society ofTransplant Surgeons.[美国移植杂志：美国移植学会和美国移植外科医生学会的官方期刊]2018；18:2295-304；Matignon M等人PloS one.[公共科学图书馆：综合]2017；12:e0178572.]。PE/IA不是病因治疗。目前利妥昔单抗用于治疗CAMR的研究仅为病例报告。使用的治疗方案不同，并且其有效性仍有待通过随机对照的试验来证实[Pineiro GJ等人BMCnephrology[BMC肾脏病学].2018；19:261；Parajuli S等人2017；3:e227.；Oblak T等人2017；88:91-6.]。硼替佐米是高选择性的蛋白酶体抑制剂，据报告其能够预防同种抗体的产生以治疗CAMR。遗憾的是，由于硼替佐米的广泛不良副作用，硼替佐米在临床治疗中的应用仍然严重受限[De Sousa-Amorim E等人Nephrology[肾脏病学](维多利亚州卡尔顿(Carlton,Vic)).2016；21:700-4.；Eskandary F等人Journal of the American Societyof Nephrology:JASN[美国肾脏病学会杂志：JASN].2018；29:591-605.]。因此，用于设计治疗AMR(包括CAMR)患者的合理策略的必需靶标的鉴定具有巨大的需求，并且在肾脏移植中迫切需要有效的治疗CAMR并靶向体液同种异体反应的方法。
发明内容
在一方面，本文披露了一种用于在经过器官移植的受试者中治疗或预防抗体介导的排斥(AMR)的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的BTK抑制剂或其药学上可接受的盐。
在一方面，受试者已经历器官移植并且表现出移植器官的AMR症状。
在一方面，器官是心脏、肝脏、肺、胰腺或肠中的一种或多种。
在一方面，器官是肾脏。
在一方面，抗体介导的排斥包括移植后AMR、慢性活动性ABMR(CAMR)。
在一方面，抗体介导的排斥是慢性活动性抗体介导的排斥(CAMR)。在本披露的一些实施例中，AMR或CAMR与慢性同种异体排斥(如在选自肾移植和肺移植的同种异体移植中的慢性同种异体排斥)相关。在本披露的一些实施例中，同种异体移植是初次移植。
在一方面，器官是肾脏，并且CAMR症状包括以下临床和组织学特征中的一个或多个：(i)慢性移植肾小球病(cg评分>0)，伴有或不伴有管周毛细血管中的C4d沉积，并由当地免疫学实验室确定存在抗HLA DSA；或(ii)肾功能的稳定性，其定义为在诊断性活检与入选到试验中的时间之间的eGFR的降低<15％；以及(iii)Src和BTK的磷酸化增加。在一些实施例中，AMR的症状包括所有以上临床和组织学特征。
在一方面，BTK抑制剂或其药学上可接受的盐与治疗有效量的免疫抑制剂组合施用。
在一方面，BTK抑制剂或其药学上可接受的盐与治疗有效量的免疫抑制剂组合施用。在本披露的一些实施例中，免疫抑制剂靶向T细胞介导的途径。在一些实施例中，免疫抑制剂选自环孢霉素、他克莫司、霉酚酸酯或mTOR抑制剂。
在一方面，BTK抑制剂为(S)-7-(1-丙烯酰基哌啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氢吡唑并-[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(化合物1)、依鲁替尼、阿卡替尼或奥布替尼，或其药学上可接受的盐。
本披露描述了BTK抑制剂，特别是(S)-7-(1-丙烯酰哌啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四-氢吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(化合物1)或其药学上可接受的盐，其在一些患有CAMR的受试者中显示出敏感性反应，并且BTK可以是治疗CAMR的新靶标。BTK抑制剂(特别是化合物1)可以用作慢性同种异体排斥(如在肾移植和肺移植肾脏移植中的慢性同种异体排斥)的脱敏剂。
在本披露中，发明人发现在患有慢性排斥的患者中，Src和BTK的磷酸化明显增加，并且化合物1显示出效果，包括缓解CAMR；遏制肾脏移植后B细胞和浆细胞的升高；防止同种异体肾脏中炎性细胞的浸润、经由防止BTK的磷酸化来防止B细胞的激活；减少促炎性细胞因子的分泌，并增加抗炎性细胞因子的分泌，以及保护同种异体移植物功能，例如肾功能，并且改善同种异体受体的长期存活率。
附图说明
图1：慢性排斥患者中的BTK磷酸化明显增加。(1A-1C)根据HE染色和Masson染色的结果，与稳定组相比，CR组中的患者显示出显著的肾间质纤维化、肾小管萎缩和纤维内膜增厚的严重程度。条＝10μm；C4d(1C)和磷酸化BTK(1E)的代表性免疫荧光染色。
图2：用化合物1治疗抑制了肾脏移植后BTK的磷酸化。在不同剂量的化合物1治疗4周后，2mg/kg和4mg/kg剂量的化合物1显著抑制了同种异体移植肾脏中磷酸化BTK的表达和活性。(2A)用媒介物和不同剂量(0.2mg/kg、2mg/kg和4mg/kg)的化合物1治疗的同种异体受体中磷酸化BTK的代表性免疫荧光染色。条＝50μm。(2C)在用媒介物和不同剂量(0.2mg/kg、2mg/kg和4mg/kg)的化合物1治疗4周后，通过用针对磷酸化BTK、BTK、GAPDH的抗体进行的蛋白质印迹分析等量的来自同种异体移植肾脏的蛋白质。数据是蛋白质的相对丰度，或者表示为每只动物单个斑点，其中数据为来自3个单独实验的每组(n＝5)的平均值。**P<0.01相比于用媒介物治疗的同种异体受体。
图3：化合物1缓解了肾同种异体移植物中的慢性活动性抗体介导的排斥(CAMR)并减少了IgG沉积。移植8周后，同种异体移植肾脏发生CAMR。自第二周经化合物1治疗6周显著缓解了CAMR。(3A)供体特异性抗体由Lewis大鼠在移植后2周产生，并在移植后8周达峰。在移植后8周、12周、16周，化合物1显著减少了DSA的产生。MESF的数据表示为来自3个单独实验的每组(n＝3)的平均值±SEM。aP>0.05相比于用媒介物治疗的同基因受体。bP>0.05相比于用化合物1治疗的同种异体受体。cP>0.05相比于用化合物1治疗的同基因受体。dP<0.01相比于用媒介物治疗的同基因受体。eP<0.01相比于用化合物1治疗的同种异体受体。fP<0.01相比于用化合物1治疗的同基因受体。gP<0.05相比于用媒介物治疗的同基因受体。hP<0.05相比于用化合物1治疗的同种异体受体。iP<0.05相比于用化合物1治疗的同基因受体。(3B)肾移植物的代表性HE、PAS、Masson染色显示肾小球硬化、间质纤维化、肾小管萎缩和动脉硬化。条＝10μm。(3D-3E)C4d和IgG沉积的代表性免疫荧光染色。条＝50μm。数据是代表性图像，或者表示为每只动物单个斑点，其中数据为来自3个单独实验的每组(n＝5)的平均值。将间质纤维化、肾小球硬化、肾小管萎缩、纤维内膜增厚的百分比呈现为三个独立实验的平均值±S.D.值。**P<0.05相比于用媒介物治疗的同基因受体。#P<0.05相比于用化合物1治疗的同种异体受体。##P<0.05相比于用化合物1治疗的同种异体受体。++P<0.05相比于用化合物1治疗的同基因受体。黑色箭头确定了由内弹性膜限定的区域。
图4：化合物1明显减少大鼠外周血中B细胞和浆细胞的量。(4A-4D)移植后8周，大鼠外周血中T细胞、B细胞和浆细胞显著增加。移植后第二周开始用化合物1(2mg/kg)治疗同种异体受体持续6周，这显著抑制了B细胞和浆细胞的增加，但仅对T细胞表现出视觉效果。数据表示为每只动物单个斑点，其中数据为来自3个单独实验的每组(n＝5)的平均值。*P<0.05相比于用媒介物治疗的同基因受体。**P<0.01相比于用媒介物治疗的同基因受体。##P<0.01相比于用化合物1治疗的同种异体受体。+P<0.05相比于用化合物1治疗的同基因受体。
图5：化合物1遏制同种异体肾脏中的炎性细胞浸润。肾脏移植后12周，同种异体肾脏内浸润了T细胞、B细胞和巨噬细胞。化合物1明显减少了T细胞、B细胞和巨噬细胞的浸润。(5A-5E)T细胞、B细胞和巨噬细胞的代表性免疫荧光染色。条＝50μm。数据是代表性图像，或者表示为每只动物单个斑点，其中数据为来自3个单独实验的每组(n＝5)的平均值。**P<0.01相比于用媒介物治疗的同基因受体。#P<0.05相比于用化合物1治疗的同种异体受体。##P<0.01相比于用化合物1治疗的同种异体受体。+P<0.05相比于用化合物1治疗的同基因受体。++P<0.01相比于用化合物1治疗的同基因受体。
图6：化合物1经由抑制BTK的磷酸化来防止B细胞的激活。肾脏移植后8周，同种异体肾脏中p-BTK+CD19+细胞的比率明显增加。化合物1治疗6周明显抑制了BTK磷酸化。(6A)p-BTK和CD19的代表性免疫荧光染色。条＝50μm。(6C)磷酸化BTK、BTK、GAPDH的代表性蛋白质印迹。数据是代表性图像，或者表示为每只动物单个斑点，其中数据为来自3个单独测定的每组(n＝5)的平均值。**P<0.01相比于用媒介物治疗的同基因受体。##P<0.01相比于用化合物1治疗的同种异体受体。+P<0.05相比于用化合物1治疗的同基因受体。++P<0.01相比于用BGB-3111治疗的同基因受体。
图7：化合物1保护同种异体受体的肾功能并延长这些受体的存活。左肾脏移植后10天切除受体大鼠的自身右肾脏。(7A-7B)在用媒介物治疗的同种异体受体中，血肌酐和尿素氮持续增加。化合物1的治疗明显抑制了血肌酐和尿素氮的增加。(7C)存活率曲线显示化合物1显著增加了同种异体受体的长期存活。数据表示为来自3个单独实验的每组的平均值±SEM。*P<0.05相比于用媒介物治疗的同种异体受体。**P<0.01相比于用媒介物治疗的同种异体受体。对数-秩检验显示化合物1显著增加了同种异体受体的存活率。P<0.05相比于用媒介物治疗的同种异体受体。
图5S：化合物1减少了促炎细胞因子TNF-α和IL-17A的分泌，并增加了抗炎性细胞因子像IL-10、IL-35和TGF-β的分泌。移植后12周，细胞因子(无论其抗炎性或促炎效果)在同种异体受体中明显增加。化合物1的治疗可以减少促炎细胞因子TNF-α和IL-17A的分泌，但进一步增加了抗炎性细胞因子像IL-10、IL-35和TGF-β的分泌。数据呈现为三个独立实验的平均值±S.D.值。**P<0.01相比于用媒介物治疗的同基因受体。#P<0.05相比于用化合物1治疗的同种异体受体。##P<0.01相比于用化合物1治疗的同种异体受体。+P<0.05相比于用化合物1治疗的同基因受体。++P<0.01相比于用化合物1治疗的同基因受体。
具体实施方式
定义
除非在本文件的其他地方特别定义，否则本文所用的所有其他技术和科学术语具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。
如本文(包括所附权利要求)所用，除非上下文另外明确说明，否则例如“一个/一种(a，an)”和“该”的单数形式的词语包括它们对应的复数指代。
除非上下文另外明确说明，否则术语“或”用于意指术语“和/或”并且与之互换使用。
本文中的术语“施用(administration，administering)”和“治疗(treating，treatment)”，当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，意指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与该动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体接触。细胞的处理涵盖试剂与该细胞的接触以及试剂与流体的接触，其中该流体与该细胞接触。术语“施用”和“治疗”也意指体外和离体处理，例如，通过试剂、诊断剂、结合化合物或通过另一种细胞对细胞进行处理。本文的术语“受试者”包括任何生物，优选动物，更优选哺乳动物(例如大鼠、小鼠、狗、猫、兔)，并且最优选人。在一个方面，治疗任何疾病或障碍是指缓和该疾病或障碍(即，减缓或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一方面，“治疗(treat，treating或treatment)”是指缓解或缓和至少一个身体参数，包括患者可能无法辨别的那些。在又另一方面，“治疗(treat，treating或treatment)”是指在身体上(例如，可辨别症状的稳定化)、在生理上(例如，身体参数的稳定化)或两者上调节疾病或障碍。在另一个方面，“治疗(treat，treating或treatment)”是指预防或延迟疾病或障碍的发作或发展或进展，特别是抑制器官移植物的抗体介导的排斥和/或降低其严重程度。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指当施用于受试者以治疗疾病、或疾病或障碍的至少一种临床症状时，足以实现该疾病、障碍或症状的这样的治疗的Bcl-2抑制剂的量。“治疗有效量”可以随药剂，疾病，障碍，和/或疾病或障碍的症状，疾病、障碍、和/或疾病或障碍的症状的严重程度，待治疗的受试者的年龄，和/或待治疗的受试者的体重而变化。在任何给定情况下的适当量对于本领域技术人员而言可以是显而易见的，或者可以通过常规实验确定。在组合疗法的情况下，“治疗有效量”是指用于有效治疗疾病、障碍或病症的组合对象的总量。在本披露的一些实施例中，受试者是人。
本披露提供了一种在受试者中治疗抗体介导的排斥(AMR)的方法，该方法包括向有需要的受试者施用化合物1或其药学上可接受的盐。
本披露还提供了一种在受试者中治疗慢性活动性抗体介导的排斥(CAMR)的方法，该方法包括向有需要的受试者施用化合物1或其药学上可接受的盐。
在本披露的一些实施例中，AMR或CAMR与慢性同种异体排斥(如在选自肾移植和肺移植的同种异体移植中的慢性同种异体排斥)相关。在本披露的一些实施例中，同种异体移植是初次移植。
治疗方法
在一个方面，本披露提供了一种在受试者中治疗AMR或CAMR的方法。
在某些方面，该方法包括向有需要的受试者施用化合物1或其药学上可接受的盐。
在本披露的一些实施例中，AMR或CAMR与慢性同种异体排斥(如在肾移植和肺移植肾脏移植中的慢性同种异体排斥)相关。
BTK抑制剂
BTK抑制剂为(S)-7-(1-丙烯酰基哌啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氢吡唑并-[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(化合物1)、依鲁替尼、阿卡替尼、或奥布替尼，或其药学上可接受的盐。
(S)-7-(1-丙烯酰基哌啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四-氢吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(化合物1)披露于国际公布号WO 2014/173289 A中。
化合物1可以通过任何合适的方式施用，包括口服、肠胃外、肺内、以及鼻内施用，如果希望用于局部治疗，也可以通过病灶内施用。可以通过任何合适的途径给药。本文考虑了多种给药方案，包括但不限于单次施用或在不同时间点的多次施用、推注施用、和脉冲输注。
化合物1将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在该上下文中考虑的因素包括治疗的特定障碍、治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、障碍的原因、药剂的递送位点、施用方法、施用方案、和医疗从业者已知的其他因素。
实例
通过说明本发明的以下实例进一步示例说明本发明，但不限于这些实例。
材料与方法
样品采集
这是对经受初次肾移植的成年患者的研究。排除多器官移植物或重复肾移植的受体。CAMR组中采集了共10个接受过肾脏移植的同种异体移植物区段。将具有以下临床和组织学特征的患者分类到CR组：慢性移植肾小球病(cg评分>0)，伴有或不伴有管周毛细血管中的C4d沉积，并由当地免疫学实验室确定存在抗HLA DSA。其他入选标准是年龄≥18岁、肾功能的稳定性(其定义为在诊断性活检与入选到试验中的时间之间的eGFR的降低<15％)。此外，还采集了来自经历过肾脏移植、同种异体移植物功能稳定的患者的10个肾脏样品。排除标准为入选时的eGFR<20mL/min/1.73m2、活动性瘤形成或过去5年期间具有瘤形成史，但非黑素瘤皮肤癌，活动性细菌、病毒或真菌感染性疾病，以及对任何研究性产品具有超敏性反应史除外。稳定组定义为肾脏移植后至少3个月血清肌酐(SCr)水平低于120μmol/L。CR组、稳定组和对照组中患者的基线特征、临床和组织学特征在表1中给出。
表1.CAMR组和稳定组的基线、临床和血清学特征
CAMR：慢性活动性抗体介导的排斥；TAC+MMF+P，他克莫司和霉酚酸酯(mycohenolate mofetil)及泼尼松；CsA+MMF+P，环孢霉素和霉酚酸酯及泼尼松；mTOR抑制剂+MMF+P，雷帕霉素抑制剂和霉酚酸酯及泼尼松的哺乳动物靶标；PRA：群体反应性抗体；eGFR，估计的肾小球滤过率；DSA，供体特异性抗体；MFI：平均荧光强度；iDSA：MFI水平最高的DSA；BUN：血尿素氮；NS：不显著
动物
近交雄性F344和Lewis大鼠(200g至250g)购自查士利华公司(Charles River)(中国北京)。动物处理程序按照美国国立卫生研究院(U.S.National Institutes of Health)公布的实验动物护理和使用指南进行，并且所有动物实验方案均由南京医科大学(NanjingMedical University)批准。
肾脏移植
在雄性F344与Lewis大鼠之间进行左肾脏移植[Vogelbacher R等人Nephrology,dialysis,transplantation:official publication of the European Dialysis andTransplant Association-European Renal Association.[肾脏病学、透析、移植：欧洲透析和移植协会-欧洲肾协会的官方出版物]2010；25:3764-73.]。冷缺血时间和热缺血时间的平均时间分别为25和40分钟。为了使得同种抗体的产生，在肾脏移植后的前2周内没有使用免疫抑制剂。
药物治疗和组织收获
自移植后第二周通过尾静脉每天两次静脉内注射在磷酸盐缓冲盐水中的不同剂量(0.2mg/kg、2mg/kg和4mg/kg)的化合物1。将使用单独的磷酸盐缓冲盐水的受体视为媒介物对照。在第4、8、12和16周，收获器官并将其分为两部分，将这两部分固定在石蜡中或在N2中快速冷冻，并在储存在-80℃下。从大鼠外周血中分离外周血单核细胞(PBMC)用于流式细胞术。
供体特异性同种抗体分析
使用淋巴细胞分离培养基提取正常F344大鼠的脾脏淋巴细胞。将同种异体大鼠的血清样品与脾脏淋巴细胞在室温下一起孵育30分钟。将脾脏淋巴细胞洗涤三次，然后将其与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗大鼠IgG抗体(BD生物科学公司(BD Biosciences))在室温下一起孵育30min。确定平均荧光强度(MFI)以通过流式细胞术(贝克曼DxFLEX(BeckmanDxFLEX)，贝克曼公司(Beckman)，加利福尼亚州布雷亚(Brea,CA))评估DSA水平[Zhao D等人American journal of transplantation:official journal of the AmericanSociety of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons.[美国移植杂志：美国移植学会和美国移植外科医生学会的官方期刊]2018；18:1083-95.；Liao T等人Frontiers in immunology.[免疫学前沿]2017；8:1334.；Djamali A等人American journal of transplantation:official journal of the American Societyof Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons.[美国移植杂志：美国移植学会和美国移植外科医生学会的官方期刊]2014；14:255-71.]。根据试剂盒制造商的说明书，使用了QuantumTM MESF试剂盒(Bangs实验室(Bangs Laboratories)，加利福尼亚州旧金山)。通过使用从www.bangslabs.com下载的数据分析程序，将MFI转换为MESF单位，这相当于向MFI添加内部参数并使结果更加可靠。
流式细胞术
将PBMC分别与以下双重孵育：FITC缀合的抗CD45R(2.5μg/106个细胞；电子生物科学公司(eBioscience)，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，美国)和APC缀合的抗CD19(2μg/106个细胞；博奥森公司(Bioss)，中国)、FITC缀合的抗CD45R(2.5μg/106个细胞；电子生物科学公司，赛默飞世尔科技公司，美国)和Alexa Fluor 647(缀合的抗CD138(0.1μg/106个细胞；艾博抗公司(Abcam)，美国)、APC缀合的抗CD3(3μg/106个细胞；生物传奇公司(BioLegend)，美国)和FITC缀合的抗CD4(0.5μg/106个细胞；生物传奇公司，美国)、以及APC缀合的抗CD3(3μg/106个细胞；生物传奇公司，美国)和Percp-eFluor710缀合的抗CD8(0.3μg/106个细胞；生物传奇公司，美国)。通过流式细胞术(BD Accuri C6，BD生物科学公司)确定CD45R+CD19+B细胞、CD45R-CD138+浆细胞以及CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞的百分比。
免疫组织荧光
在加湿腔中在4℃下将石蜡包埋的切片(4μm)与针对以下的初级抗体一起孵育过夜：抗磷酸BTK(1:100；圣克鲁斯公司(Santa Cruz)，美国)、C4d(1:200、生物传奇公司，美国)CD3(1:200、生物传奇公司，美国)、CD4(1:200、生物传奇公司，美国)、CD8(1:200、生物传奇公司，美国)、CD19(1:200，博奥森公司，中国)、CD138(1:100，艾博抗公司)和CD68(1:100，艾博抗公司)。使用适当的同种型匹配的IgG作为阴性对照。洗涤后，使用FITC或Cy3缀合的二级抗体(1:200；艾博抗公司)检测结合的抗体，并使用荧光显微镜获取图像。通过使用Image-Pro Plus(Media Cybernetics公司，马里兰州罗克维尔(Rockville,MD))分析阳性细胞(T细胞、B细胞、浆细胞和巨噬细胞)和IgG阳性区域的定量分析。根据两名对实验设计不知情的独立病理学家的结果对C4d阳性PTC进行定量分析。
蛋白质印迹
蛋白质印迹的实验方案如先前所述[Zhao C等人Gene.[基因]2018；642:483-90.]。初级抗体如下：抗磷酸-BTK(1:1000；圣克鲁斯公司)、抗BTK(1:1000；圣克鲁斯公司，美国)和抗GAPDH(1:1000；Cst公司，美国)
组织学检查
通过使用H&E、PAS和Masson染色进行组织学分析。如其他地方[Wang Z等人Journal of cellular and molecular medicine.[细胞与分子医学杂志]2017；21:2359-69.]所详述的进行H&E、PAS和Masson三色染色，将其用于评价CAMR的严重程度。CAMR的诊断标准是根据Banff 2017标准。CAMR的特征定义为动脉内膜纤维化、PTC中阳性C4d染色和DSA。对每条血管的管腔表面和内弹性膜包围的区域进行由内膜纤维化引起的动脉硬化的测量。将通过内弹性膜至管腔区域减去内弹性膜所确定的区域视为内膜区域。根据两名对实验设计不知情的独立病理学家的结果对肾脏切片的形态测量变化进行定量分析。
酶联免疫吸附测定
分别通过大鼠TNF-αELISA试剂盒(联科公司(MUTISCIENCES)；中国)、大鼠TGF-βELISA试剂盒(联科公司；中国)、大鼠IL-35ELISA试剂盒(联科公司；中国)、大鼠IL-17AELISA试剂盒(联科公司；中国)和大鼠IL-10ELISA试剂盒(联科公司；中国)对大鼠血清TNF-α、TGF-β、IL-17A、IL-35、IL-10的水平进行定量。如制造商说明书中所述进行测定。
肾功能评估
按照试剂盒制造商(建成公司(JianCheng)，中国)的说明书测试大鼠血肌酐和尿素氮的浓度。
统计学分析
将所有数据呈现为平均值±S.D.。数值由三个独立的实验确定。在用巴特利检验(Bartlett test)证明方差齐性后，使用单因素方差分析(ANOVA)进行组间比较。使用图基检验(Tukey’s test)比较多个平均值。通过学生t检验(Student t-test)确定两组之间的差异。P<0.05的值被认为具有统计学显著性。所有测定以一式三份进行。
实例1来自CAMR患者的同种异体移植肾脏中BTK的磷酸化明显增加
该研究包括十名患有慢性活动性抗体介导的排斥的患者(CAMR组)。为了比较，还招募了相同数目的肾同种异体移植物功能稳定的患者(稳定组)。患者和这些健康供体的基线、临床和组织学特征在表1中给出。根据HE和Masson染色的结果(图1A-1C)，诸位发明人观察到来自CR组的同种异体移植物的间质纤维化、肾小管萎缩和纤维内膜增厚的严重程度比稳定组更大。C4d阳性管周毛细血管(PTC)的数目明显高于稳定组(图1D)。来自患有慢性排斥的患者的同种异体移植肾脏中BTK的磷酸化明显增加(图1E)。
实例2大鼠肾脏移植后BTK抑制剂减少了BTK的磷酸化。
在雄性F344和Lewis大鼠之间进行左肾脏移植。为了确定(S)-7-(1-丙烯酰基哌啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氢吡唑并-[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(化合物1)的治疗剂量，向同种异体Lewis大鼠施用化合物1。每天两次静脉内注射不同剂量(0.2mg/kg、2mg/kg或4mg/kg)的化合物1。用化合物1治疗4周后，收获移植肾脏，然后从同种异体移植物中提取蛋白质。使用免疫荧光染色和蛋白质印迹检测BTK的磷酸化。
如图2A和图2B中所示，当用剂量为2mg/kg或4mg/kg的化合物1治疗Lewis大鼠时，化合物1明显抑制了BTK的磷酸化。蛋白质印迹的结果还揭示剂量为2mg/kg的化合物1有效地抑制了BTK的磷酸化(图2C-图2D)。因此，将2mg/kg确定为在以下实例中施用的化合物1的治疗剂量。
实例3 BTK抑制剂缓解CAMR并减少肾同种异体移植物中的IgG沉积。
CAMR由动脉中的纤维内膜增厚、PTC中C4d沉积和DSA的增加定义，其通过化合物1的治疗而缓解。在肾脏移植后1周、2周、4周、8周、12周和16周测试同种异体和同基因受体中供体特异性同种抗体(DSA)的水平(图3A)。
肾脏移植后2周时，DSA的水平开始增加。在肾脏移植后8、12和16周，与用媒介物治疗的同基因受体相比，用媒介物治疗的同种异体受体的DSA水平明显增加(图3A)。相比之下，与用媒介物治疗的同种异体受体相比，移植后第二周开始用化合物1对同种异体受体的治疗防止了DSA的进一步产生。与用媒介物治疗的同种异体受体的DSA水平相比，DSA水平维持在相对低的水平直到16周时治疗结束(图3A)。
苏木精和伊红(H&E)染色的结果揭示与使用媒介物的同种异体受体的情况相比，使用化合物1的治疗显著缓和了肾小球硬化。根据过碘酸希夫(PAS)和Masson三色染色的结果，同种异体移植肾脏的肾小管萎缩和间质纤维化的病灶区域平均超过70％。同种异体移植肾脏中间质动脉狭窄的比率达70％。在化合物1治疗10周后，与同种异体移植肾脏的情况相比，间质纤维化、肾小管萎缩的病灶面积和间质动脉狭窄的比率显著缓和(图3B-图3C)。
化合物1治疗后，同种异体移植肾脏中管周毛细血管(PTC)中的C4d沉积大幅减少(图3D-图3F)。同种异体移植肾脏中IgG阳性区域为差不多30％。化合物1治疗后，IgG的病灶面积减少到小于10％(图3E-图3G)。
实例4BTK抑制剂遏制肾脏移植后B细胞和浆细胞的升高。
为了研究同基因大鼠和同种异体大鼠的免疫状态，使用流式细胞术测试T细胞、B细胞和浆细胞的量。流式细胞术的结果揭示外周血中CD3+CD4+T辅助细胞、CD3+CD8+细胞毒性T细胞、CD19+CD45R+B细胞和CD138+CD45R-浆细胞显著增加。
肾脏移植8周后，化合物1的治疗显著遏制了CD19+CD45R+B细胞和浆细胞的升高。CD19+CD45R+B细胞的比率从约20％减少到7％，同时将CD138+CD45R-浆细胞的比率从约21％遏制到7％。然而，化合物1对T细胞显示出轻微效果(图4A-图4D)。
实例5BTK抑制剂抑制肾同种异体移植物中的炎性细胞浸润并调节抗炎性和促炎性细胞因子的分泌。
使用免疫组织荧光检测化合物1对移植肾脏中的炎性细胞的影响。移植12周后，与用媒介物治疗的同基因受体相比，同种异体移植肾脏被炎性细胞(包括T细胞、B细胞、浆细胞和巨噬细胞)显著浸润。
免疫组织荧光揭示化合物1显著减少了T细胞、B细胞和浆细胞的浸润(图5A-图5D)。更有趣的发现是化合物1能够减少巨噬细胞的浸润。同种异体移植肾脏中巨噬细胞的比率从约4％减少到1.5％(图5E)。化合物1似乎对巨噬细胞产生影响。
在肾脏移植后12周，使用从大鼠外周血中分离的血清来检测炎性细胞因子的浓度。与用媒介物治疗的同基因受体相比，用媒介物治疗的同种异体受体中促炎性细胞因子TNF-α和IL-17A的血清水平显著增加。然而，化合物1治疗有效地降低了TNF-α和IL-17A的血清水平(图5S A-图5S B)。在由媒介物治疗的同种异体受体中，抗炎性细胞因子(如IL-10、IL-35和TGF-β)的血清水平仍然显著增加。然而，与用媒介物治疗的同种异体受体的情况相比，化合物1治疗进一步增加了IL-10、IL-35和TGF-β的分泌(图5S C-图5S E)。化合物1显示出对同种异体移植肾脏中的炎症的良好抑制性作用。
实例6BTK抑制剂经由减少BTK的磷酸化来防止CD19+B细胞的激活。
为了确定化合物1对B细胞的效果，使用免疫组织荧光来检测p-BTK+CD19+B细胞的比率。CD19阳性B细胞由红色荧光表示，而p-BTK阳性细胞由绿色荧光表示。CD19和p-BTK双阳性B细胞由黄色荧光表示。
在化合物1治疗12周后，p-BTK+CD19+B细胞的比率显著降低(图6A-图6B)。蛋白质印迹结果也证实了BTK的磷酸化显著降低的发现。(图6C)。总之，化合物1缓解CAMR的机制可能是通过抑制BTK的磷酸化来阻断B细胞受体信号传导相互作用途径(图6D)。
实例7BTK抑制剂保护同种异体移植肾功能并延长同种异体受体的存活。
为了考查化合物1在移植肾脏功能中的保护作用和同种异体受体的长期存活率，在肾脏移植后10天对Lewis大鼠的右肾脏进行了肾切除术。切除右肾脏后，肌酐和尿素氮的血浓度持续恶化，并在移植后12周达峰。然而，由于化合物1治疗，血肌酐和尿素氮持续恶化。
在用化合物1治疗的同种异体受体中，血肌酐和尿素氮保持在相对低的水平(图7A-图7B)。与用媒介物治疗的同种异体受体相比，用化合物1治疗的同种异体受体具有更高的存活率(图7C)。
前述实例和某些实施例的描述应被视为是说明性的，而非限制由权利要求书所限定的本发明。如将容易理解的，在不脱离如权利要求书所阐述的本发明的情况下，可以使用上文阐述的特征的许多变化和组合。所有这样的变化都意图包括在本发明的范围之内。引用的所有参考文献都通过引用以其全文并入本文。

Claims (13)

1.一种用于在经过器官移植的受试者中治疗或预防抗体介导的排斥(AMR)的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的BTK抑制剂或其药学上可接受的盐。
2.如权利要求1所述的方法，其中该受试者已经历器官移植并且表现出移植器官的AMR症状。
3.如权利要求1所述的方法，其中该器官是心脏、肝脏、肺、胰腺或肠中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的方法，其中该器官是肾脏。
5.如权利要求1所述的方法，其中该抗体介导的排斥包含移植后AMR、慢性活动性ABMR(CAMR)和移植肾小球病(TG)。
6.如权利要求1所述的方法，其中该抗体介导的排斥是慢性活动性抗体介导的排斥(CAMR)。
7.如权利要求1所述的方法，其中该器官是肾脏，并且CAMR症状包含以下临床和组织学特征中的一个或多个：(i)慢性移植肾小球病(cg评分>0)，伴有或不伴有管周毛细血管中的C4d沉积，并由当地免疫学实验室确定存在抗HLA DSA；(ii)肾功能的稳定性，其定义为在诊断性活检与入选到试验中的时间之间，eGFR降低<15％；以及(iii)Src和BTK的磷酸化增加。
8.如权利要求1所述的方法，其中该BTK抑制剂或其药学上可接受的盐与治疗有效量的免疫抑制剂组合施用。
9.如权利要求1所述的方法，其中该BTK抑制剂或其药学上可接受的盐与治疗有效量的免疫抑制剂组合施用。
10.如权利要求9所述的方法，其中该免疫抑制剂靶向T细胞介导的途径。
11.如权利要求10所述的方法，其中该免疫抑制剂选自环孢霉素、他克莫司、霉酚酸酯或mTOR抑制剂。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中该BTK抑制剂为(S)-7-(1-丙烯酰基哌啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氢吡唑并-[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺、依鲁替尼、阿卡替尼、或奥布替尼，或其药学上可接受的盐。
13.如权利要求12所述的方法，其中该BTK抑制剂为(S)-7-(1-丙烯酰基哌啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氢吡唑并-[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺或其药学上可接受的盐。
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