CN116769747A - Arf1基因或蛋白在调控早期胚胎成腔中的应用 - Google Patents

Arf1基因或蛋白在调控早期胚胎成腔中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了Arf1基因或蛋白在调控早期胚胎成腔中的应用。本发明提供了Arf1蛋白或基因或其他生物材料在制备具有如下任一功能产品中的应用：1)调控胚胎或类胚胎成腔；2)调控胚胎或类胚胎发育中细胞发生极化；3)作为标志物筛查或辅助筛查成腔异常胚胎或类胚胎。本发明证明EXE‑类胚胎或ETX‑类胚胎为挖掘前羊膜腔形成等发育事件中的关键调控因子提供了良好的筛选平台，发现Arf1是调控胚胎极化成腔的关键基因,Arf1的敲除导致体内胚胎及类胚胎均发生成腔缺陷。为试管婴儿优势胚胎选取、胎儿流产及生殖发育等临床应用提供了理论依据,也为构建具有更复杂组织结构的类胚胎模型提供了借鉴及技术支持。

Description

Arf1基因或蛋白在调控早期胚胎成腔中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种Arf1基因或蛋白在调控早期胚胎成腔中的应用。
背景技术
哺乳动物早期胚胎前羊膜腔的形成对胚胎发育具有重要意义,如促进胚轴建立、各胚层间信号交流及物质传递等。附植后胚胎的前羊膜腔形成对早期胚胎发育至关重要,胚胎前羊膜腔的形成缺陷导致胚胎出现发育异常、结构混乱,最终导致胎儿流产。虽然胚胎植入子宫前的发育过程已被广泛研究,但附植后胚胎的发育事件及背后机制在很大程度上仍然未知。这是由于该过程发生在子宫内部,胚胎被母体组织完全包裹,不易取材且不能直接观察,因此体外胚胎模型的出现使解析附植后胚胎发育“黑匣子”成为可能。
早期胚胎前羊膜腔的形成具有两种假说,凋亡成腔和极化成腔。凋亡成腔指通过内部细胞发生凋亡从而形成中空的腔。而极化成腔指细胞接收到细胞外基质的极化信号，通过极化蛋白转运及细胞骨架牵拉等过程共同调控形成腔。小鼠早期胚胎成腔过程一直被认为是由于凋亡成腔,直至2014年Magdalena课题组发现敲除凋亡基因P53后胚胎仍能正常发育并发生成腔,证明了前羊膜腔的形成不依赖于凋亡而是通过极化成腔。虽然对前羊膜腔形成有了初步了解,但仍有许多未知尚待解析,且目前所知的大部分成腔机制仍借鉴于MDCK极化模型，而MDCK模型并不具备模拟体内胚胎发育的能力，因此仍缺乏模拟前羊膜腔形成的类胚胎模型。
目前建立的由囊胚来源干细胞自组织重构形成的ETX-类胚胎和EXE-类胚胎,是模拟附植后胚胎发育的良好模型,在空间结构及发育事件上均与体内胚胎保持一致且可起始细胞极化形成类前羊膜腔,为研究早期胚胎前羊膜腔形成提供了良好基础。其中仅由两种细胞类型构成的EXE-类胚胎,结构简单、重复率高,且成腔率为100％,是研究早期胚胎前羊膜腔形成的优势模型。
Arf1(ADP-ribosylation factor 1)为小GTP酶,是ARF基因家族成员,主要参与调控膜蛋白的运输和细胞器结构组装(Donaldson and Jackson,2011)。和其它小GTP酶一样,Arf1有两种分子形式并可相互转化:当与GTP结合(Arf1-GTP)时,Arf1定位在高尔基体膜上,呈活性状态并发挥功能；当与GTP解离和GDP结合(Arf1-GDP)时,Arf1呈非活性状态并从高尔基体膜上释放到细胞质中(Cherfils,2014；Muccini et al.,2022)。这种GDP和GTP间的解离及结合循环由高尔基体相关的鸟嘌呤核苷酸交换因子(Guanine nucleotideexchange factors,GEFs)和GTP酶激活蛋白(GTPase activating proteins,GAPs)调控,GEFs促进了Arf1与GTP结合,而GAPs催化了Arf1与GTP的解离以及与GDP的结合(Christisand Munro,2012；Gillingham and Munro,2007；Manolea et al.,2008)。因此,Arf1的活性调控主要受特定的GEFs和GAPs调控。
发明内容
本发明的目的是提供Arf1基因或蛋白在调控早期胚胎成腔中的应用。
第一方面，本发明提供了Arf1蛋白或基因或其他生物材料在制备具有如下任一功能产品中的应用：
1)调控胚胎或类胚胎成腔；
2)调控胚胎或类胚胎发育中细胞发生极化；
3)作为标志物筛查或辅助筛查成腔异常胚胎或类胚胎。
上文中所述调控胚胎或类胚胎成腔为促进胚胎或类胚胎成腔；
上述促进胚胎成腔为促进胚胎前羊膜腔形成或促进类胚胎类前羊膜腔形成。
上文中胚胎成腔进一步为胚胎极化成腔；
上文中所述极化为从头极化。
上文中作为标志物筛查或辅助筛查成腔异常胚胎，应用于试管婴儿优势胚胎筛选，如试管婴儿胚胎移植前的基因筛查，Arf1缺陷的胚胎不作为优势胚胎移植。
上文所述应用中，所述成腔异常胚胎为前羊膜腔发育异常胚胎。
上文所述应用中，所述胚胎或类胚胎为人源或动物源。
上文所述动物进一步为哺乳动物，在本发明的实施例中具体为小鼠。
所述Arf1蛋白为活化形式Arf1，具体为Arf1-GTP。
第二方面，本发明提供了抑制Arf1基因表达或降低Arf1蛋白活性的物质在如下任一种的应用：
1)制备Arf1基因表达或降低Arf1蛋白活性的ESC细胞系；
2)制备抑制胚胎或类胚胎成腔产品；
3)制备抑制胚胎或类胚胎发育中细胞发生极化产品；
4)制备模拟体内胚胎成腔缺陷的类胚胎模型。
第三方面，本发明提供了Arf1蛋白或基因作为靶点在制备模拟体内成腔缺陷的类胚胎模型中的应用。
第四方面，本发明提供了一种模拟体内成腔缺陷的类胚胎模型的构建方法，包括如下步骤：
1)敲除或抑制胚胎干细胞中Arf1基因的表达，得到敲除Arf1基因的胚胎干细胞；
2)将所述敲除Arf1基因的胚胎干细胞和胚外内胚层干细胞悬浮培养，重构得到EXE-类胚胎，所述EXE-类胚胎为成腔缺陷EXE-类胚胎；
或将所述敲除Arf1基因的ESC细胞、滋养层干细胞和胚外内胚层干细胞悬浮培养，重构得到ETX-类胚胎，所述ETX-类胚胎为成腔缺陷ETX-类胚胎。
上文中，所述成腔缺陷为胚胎前羊膜腔或类胚胎类前羊膜腔发育异常。
第五方面，本发明提供了EXE-类胚胎或ETX-类胚胎在筛选极化成腔基因中的应用；
或本发明提供了EXE-类胚胎或ETX-类胚胎在制备筛选极化成腔基因产品中的应用。
第六方面，本发明提供了一种利用类胚胎筛选极化成腔基因的方法，包括如下步骤：
1)对EXE-类胚胎或ETX-类胚胎构建中不同悬浮培养时间收集的类胚胎进行形态学检测，确定起始出现极化成腔表型对应的候选悬浮培养时间点；再对所述起始出现极化成腔表型对应的候选悬浮培养时间点收集的类胚胎进行单细胞测序，若该候选时间点的类胚胎中可富集到已知极化基因,则该候选时间点为极化成腔对应的悬浮培养时间点；上文中，所述已知极化基因包括Stx3和、Cdc42、Exoc5、Cldn6、Cldn7、Rab8a和Rab11a等；
所述不同悬浮培养时间间隔12小时；
2)将所述EXE-类胚胎或ETX-类胚胎构建中极化成腔对应的悬浮培养时间点和其前期间隔12小时的时间点的收集的类胚胎的单细胞测序结果(各个基因的表达量)进行分析，选取与所述前期间隔12小时的时间点的测序结果相比，在所述极化成腔对应的悬浮培养时间点的测序结果中显著高表达的基因作为候选基因；
上文中，显著高表达为DESeq2软件计算，p值小于0.05。
再从所述候选基因中选取在EB拟胚体中显著低表达或不表达的基因作为极化候选基因；
上文中，显著低表达为DESeq2软件计算，p值为小于0.05。
所述EB拟胚体为仅具备分化的能力且不能极化成腔；
3)从所述极化候选基因中确定未报道与极化成腔相关且与胚胎疾病相关的基因，命名为成腔候选基因，将所述成腔候选基因进行如下验证：
所述验证包括如下步骤：
3)-1)、敲除或抑制ESC细胞中成腔候选基因的表达，得到敲除成腔候选基因的ESC细胞；
3)-2)、将所述敲除成腔候选基因的ESC细胞和XENC细胞悬浮培养，重构得到EXE-类胚胎，检测所述EXE-类胚胎是否为成腔缺陷，若发生成腔缺陷，则所述成腔候选基因为或候选为成腔相关基因；若未发生成腔缺陷，则所述成腔候选基因不为或候选不为成腔相关基因；
或将所述敲除成腔候选基因的ESC细胞、TSC细胞和XENC细胞悬浮培养，重构得到ETX-类胚胎，所述ETX-类胚胎为成腔缺陷ETX-类胚胎，若发生成腔缺陷，则所述成腔候选基因为或候选为成腔相关基因；若未发生成腔缺陷，则所述成腔候选基因不为或候选不为成腔相关基因。
上文中，所述检测为免疫荧光染色检测胚层标志蛋白Oct4或Gata4和/或极化蛋白PCX。
在本发明的实施例中，利用类胚胎筛选极化成腔基因为Arf1基因。
第七个方面，本发明提供了一种筛查或辅助筛查成腔异常胚胎或成腔异常类胚胎的方法，通过检测待测样品中Arf1基因或蛋白的表达筛查或辅助筛查成腔异常胚胎或成腔异常类胚胎。
上述方法可以包括如下步骤：检测待测样品中Arf1基因或蛋白的表达，若Arf1基因或蛋白的表达量与健康样本差异或显著差异，则该待测样品来源于成腔异常胚胎或成腔异常类胚胎。
上述待测样品为非胚胎组织，具体可以为羊水。
上述健康样本可以为健康人或鼠的羊水。
本发明采用的胚胎干细胞为非人胚胎干细胞，例如鼠胚胎干细胞，例如野生型ESCs(G4 cell line)、DsRED-ESCs(G4-DsRed-MST ESCs)或BVSC ESCs(Blimp1-mVenus andStella-ECFP[BVSC]double-transgenic ESC line)。滋养层干细胞为非人滋养层干细胞，例如鼠滋养层干细胞，例如野生型TSCs(从CD1雌鼠体内的囊胚中分离获得的TSCs)或EGFP-TSCs。胚外内胚层干细胞为非人胚外内胚层干细胞，例如鼠胚外内胚层干细胞，例如野生型XENCs(129雌鼠体内的囊胚中分离获得的XENCs)、EGFP-XENCs(从Actin-EGFP雌鼠体内的囊胚中分离获得的XENCs)或Lefty1-mCherry XENCs。类胚胎具体可来源于鼠的类胚胎或来源于人的类胚胎。
现有构建的ETX-和EXE-类胚胎是模拟植入后早期胚胎前羊膜腔形成的良好模型,本研究通过对ETX-和EXE-类胚胎进行连续时间点的单细胞测序,测序样品涵盖了类胚胎从聚合形成至成腔整个发育过程,为研究类胚胎及早期胚胎发育提供了丰富的数据资源。通过对数据进行分析和挖掘,揭示了类胚胎极化成腔时的基因表达模式,发现类胚胎成腔受细胞多能性退出和极化蛋白共同调控。利用EXE-类胚胎对成腔候选基因进行表型筛选,发现Arf1是调控胚胎极化成腔的关键基因,Arf1的敲除导致体内胚胎及类胚胎均发生成腔缺陷。对Arf1敲除类胚胎回补Arf1结果显示,仅过表达Arf1WT和活化形式的Arf1-GTP可回补成腔缺陷表型,说明类胚胎的极化成腔依赖于活化形式的Arf1。对其机制进行解析证明了Arf1受Formative多能性转录因子Otx2和Zic2调控。本研究发现了Arf1在极化成腔过程中的新功能,解析了早期胚胎前羊膜腔的形成的原因,为哺乳动物早期胚胎发育研究提供了理论借鉴。Arf1功能及作用机制的发现为研究植入后胚胎前羊膜腔形成过程提供了新思路,也为人早期胚胎发育研究提供了理论借鉴。ETX-和EXE-类胚胎单细胞转录组数据也为研究细胞间识别及自组织、细胞多能性调控及分化、极化成腔等发育过程提供了丰富资源,可用于挖掘潜在的调控因子及信号通路,也为挖掘前羊膜腔形成等发育事件中的关键调控因子提供了良好的筛选平台。
具体结论如下：
(1)本研究对0-72 h ETX-和EXE-类胚胎进行单细胞转录组测序,通过与早期胚胎数据比对,证明了类胚胎可模拟E3.5-6.0时期早期胚胎的发育过程。
(2)ETX-和EXE-类胚胎成腔依赖于细胞多能性从退出至Formative阶段及细胞极化的共同调控。
(3)Arf1是调控ETX-和EXE-类胚胎以及植入后早期胚胎极化成腔的关键基因,Arf1的敲除导致类胚胎和植入后胚胎均不能成腔。Arf1有两种分子形式,即活化形式的Arf1-GTP和非活化形式的Arf1-GDP,而类胚胎的极化成腔依赖于活化形式的Arf1-GTP。
(4)Arf1的表达受Formative多能性转录因子Otx2和Zic2共同调控,Otx2和Zic2的敲除导致Arf1表达显著下调并导致类胚胎极化成腔发生时间显著推迟。
本研究揭示了早期胚胎前羊膜腔形成的原因,为了解早期胚胎前羊膜腔形成过程提供了新思路,为试管婴儿优势胚胎选取、胎儿流产及生殖发育等临床应用提供了理论依据,为利用类胚胎研究早期胚胎发育提供了理论基础,也为构建具有更复杂组织结构的类胚胎模型提供了借鉴及技术支持。
附图说明
图1为不同类型类胚胎发育形态图。
图2为胚胎发育聚类分析和拟时分析。
图3为EXE-类胚胎成腔过程观察，EXE-类胚胎极化成腔过程观察及免疫荧光染色极化蛋白PCX。极化蛋白PCX指示成腔(红色),DAPI染色细胞核(蓝色)。标尺,20μm。
图4为差异基因分析。
图5为ETX-和EXE-类胚胎及EB拟胚胎成腔方式检测。
图6为成腔候选基因分析及筛选；(A)EXE、ETX、EB三种类胚胎差异基因分析。(B)EXE、ETX、EB三种类胚胎体系ESCs中Nono、Jpt2、Arf1、Ppp2r1a单细胞平均表达量。(C-F)利用Crispr/Cas9体系构建Arf1、Jpt2、Nono、Ppp2r1a敲除ESCs细胞系。*指示sgRNA位点。第一行为野生型ESCs原始基因组序列,第二行为敲除细胞系基因组序列,红色指示敲除区域及敲除片段大小。蓝色为sgRNA序列,下划线指示PAM位点。序列方向均为5’端至3’端。
图7为候选基因表型检测。
图8为Arf1-ko EXE-类胚胎成腔表型检测。
图9为Arf1-ko ETX-类胚胎成腔表型检测。
图10为EXE-类胚胎从头极化过程观察；(A-B)EXE-类胚胎免疫荧光染色PCX和aPKC蛋白。PCX(红色),aPKC(绿色)。标尺,20μm。(A)野生型EXE-类胚胎。(B)Arf1-ko EXE-类胚胎。
图11为利用4-8细胞注射法产生嵌合胚胎示意图。
图12为E3.5嵌合胚胎囊胚发育能力检测；(A)E3.5嵌合胚胎免疫荧光染色。GFP(绿色)。Sox2(红色)。E-cad(浅灰色)。DAPI染色细胞核(蓝色)。标尺,20μm。(B)囊胚形成率统计。数字代表胚胎数量,对照组n＝128,实验组n＝170,误差线表示±SD(4次独立实验),n.s.,P≥0.05；*,P<0.05；**,P<0.01,***,P<0.001。
图13为嵌合胚胎前羊膜腔形成情况检测。
图14为过表达细胞系构建及定量检测；(A)Arf1不同分子形式的突变碱基序列。第一行为野生型Arf1原始(Arf1WT)CDS序列,第二行为Arf1Q71L序列,第三行为Arf1T31N序列。下划线指示突变位点。红色指示突变碱基。序列方向均为5’端至3’端。(B)Arf1WT、Arf1Q71L、Arf1T31N过表达ESCs细胞系定量检测Arf1表达量。Control为Arf1-ko ESCs。左图,总Arf1表达量检测,其中Arf1WT、Arf1Q71L、Arf1T31N过表达ESCs均显著高表达Arf1。右图,外源Arf1表达量检测,control不表达外源Arf1,仅Arf1WT、Arf1Q71L、Arf1T31N过表达ESCs显著特异高表达外源Arf1,证明过表达细胞系构建成功。误差线表示±SD(n＝3次独立实验),n.s.,P≥0.05；*,P<0.05；**,P<0.01,***,P<0.001。
图15为不同分子形式Arf1回补能力检测。
图16为ChIP-seq分析。
图17为敲除细胞系构建；(A-B)利用Crispr/Cas9体系构建Otx2,Zic2单基因敲除ESCs细胞系。(C)利用Crispr/Cas9体系构建Otx2/Zic2双基因敲除ESCs细胞系。(A-C)*指示sgRNA位点。第一行为野生型ESCs原始基因组序列,第二行为敲除细胞系基因组序列,红色指示敲除区域及敲除片段大小。蓝色为sgRNA序列,下划线指示PAM位点。序列方向均为5’端至3’端。
图18为96.96单细胞表达芯片检测Arf1表达。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中类胚胎培养基配方如下：
表1为类胚胎培养基配方
具体为每1L类胚胎培养基的组成：RPMI 1640培养基417.045mL、DMEM培养基417.045mL、胎牛血清125mL、谷氨酰胺10mL、丙酮酸钠10mL、MEM非必需氨基酸10mL、β-巯基乙醇0.91ml、青霉素-链霉素10mL。RPMI 1640培养基采用Advanced RPMI 1640 Medium，Thermo Fisher Scientific，货号11875-093。DMEM培养基采用高糖无谷氨酰胺的DMEM培养基，即“DMEM,High Glucose,no Glutamine”，Thermo Fisher Scientific，货号11960-069。胎牛血清(FBS)，Gibco，货号为100999-141。谷氨酰胺采用GlutaMAXTMSupplement，规格100×(200mM)，Thermo Fisher Scientific，货号35050-061。丙酮酸钠采用Sodium PyruvateSolution，规格100×(100mM)，Thermo Fisher Scientific，货号11360-070。MEM非必需氨基酸采用MEM Non-Essential Amino Acids Solution，规格100×，Thermo FisherScientific，货号11140-050。β-巯基乙醇采用2-Mercaptoethanol，规格55mM，ThermoFisher Scientific，货号21985-023。青霉素-链霉素采用Penicillin-StreptomycinLiquid，规格100×，含10000units/mL penicillin和10000μg/mL streptomycin，ThermoFisher Scientific，货号15140-122。
下述实施例中IF免疫荧光染色
(1)细胞染色
1.将待染色细胞使用DPBS清洗后,加入4％ PFA,室温固定10min。
2.吸去4％ PFA,使用DPBS清洗细胞3次,每次5min。
3.加入0.5％ TritonX-100,室温通透10min。
4.吸去0.5％ TritonX-100,加入抗体稀释液稀释的一抗,室温孵育2h。
5.吸去一抗,使用DPBS清洗细胞3次,每次5min。
6.加入抗体稀释液稀释的二抗,室温孵育30min。
7.吸去二抗,使用DPBS清洗细胞3次,每次5min。
8.加入DAPI,室温孵育5min。
9.吸去DAPI,使用DPBS清洗细胞即可拍照。
(2)胚胎染色
1.处理待染色的胚胎。植入前胚胎可不需处理直接进行染色,植入后胚胎需提前用镊子去除Reichert氏膜。
2.将胚胎转移至4％ PFA中,室温固定。E0.5-E4.5胚胎需固定10min,E5.0-E5.5胚胎需固定15min,E6.5-E7.5固定20min。
3.使用含0.1％ BSA的DPBS清洗胚胎3次,每次5min。
4.将胚胎转移至0.5％ TritonX-100中,室温通透。E0.5-E4.5胚胎通透5min,E5.0-E6.5胚胎通透10min,E7.5胚胎通透15min。
5.将胚胎转移至抗体稀释液稀释的一抗中,4℃孵育过夜。
6.使用含0.1％ BSA的DPBS清洗胚胎3次,每次5min。
7.将胚胎转移至抗体稀释液稀释的二抗中,室温孵育2h或4℃孵育过夜。
8.使用含0.1％ BSA的DPBS清洗胚胎3次,每次5min。
9.加入DAPI,室温孵育15min。
10.使用Mounting medium封片剂封片,4℃保存或直接用于confocal拍照。
(3)Exocytotic vesicles染色
Exocytotic vesicles染色方法和上述步骤相同,但需将通透液更换为0.1％Saponin通透液,且由于Saponin对样品的通透是可逆的,因此后续步骤中使用的所有试剂均需加入0.01％的Saponin。
下述实施例中数据与统计：本研究主要使用GraphPad Prism9对数据进行分析,包括所有定量数据、96.96单细胞数据和重构胚胎统计数据,使用Two-way ANOVA多重比较检验分析不同样品间的差异显著性。每组实验至少进行3次技术重复和生物学重复,误差使用SEM或SD表示,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。
Gata4是XENC细胞的标志物，Oct4是ESC细胞的标志物，Cdx2和Eomes均为TSC细胞的标志物。Cripto是中胚层的标志物。Gata4抗体、Oct4抗体、Cdx2抗体、Eomes抗体、E-cadherin抗体、PCX抗体、Laminins抗体、caspase-3抗体、Cripto抗体、CK抗体等均为市售抗体。
E3.5-6.75胚胎均是CD-1小鼠的自然胚胎。
下述实施例中涉及的胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)ESCs：
野生型ESCs记载在如下文献Zhang,S.,Chen,T.,Chen,N.,Gao,D.,Shi,B.,Kong,S.,West,R.C.,Yuan,Y.,Zhi,M.,Wei,Q.,et al.(2019).Implantation initiation ofself-assembled embryo-like structures generated using three types of mouseblastocyst-derived stem cells.Nat.Commun.10,496,在该文献中的名称为G4 ESC细胞。
RFP-ESCs记载在如下文献Zhang,S.,Chen,T.,Chen,N.,Gao,D.,Shi,B.,Kong,S.,West,R.C.,Yuan,Y.,Zhi,M.,Wei,Q.,et al.(2019).Implantation initiation of self-assembled embryo-like structures generated using three types of mouseblastocyst-derived stem cells.Nat.Commun.10,496,在该文献中的名称为G4-ACTB-DsRed-MST ESCs细胞。
实施例中涉及的滋养层干细胞(trophoblast stem cells,TSCs)TSCs：
野生型TSCs记载在如下文献中Zhang,S.,Chen,T.,Chen,N.,Gao,D.,Shi,B.,Kong,S.,West,R.C.,Yuan,Y.,Zhi,M.,Wei,Q.,et al.(2019).Implantation initiationof self-assembled embryo-like structures generated using three types of mouseblastocyst-derived stem cells.Nat.Commun.10,496,在该文献中的名称为TSC细胞。
NLS-GFP-TSCs：为将PB-CMV-EF1A GFP-NLS质粒(记载在如下文献中Zhi,M.,Zhang,J.,Tang,Q.,Yu,D.,Gao,S.,Gao,D.,Liu,P.,Guo,J.,Hai,T.,Gao,J.,et al.(2022).Generation and characterization of stable pig pregastrulation epiblaststem cell lines.Cell research 32,383-400，在该文献中名称为PB-CMV-EF1A GFP-NLS)导入野生型TSCs中得到细胞。
下述实施例中涉及的胚外内胚层干细胞(extra-embryonic endodermstemcells,XENCs)XENCs：
野生型XENCs记载在如下文献中Zhang,S.,Chen,T.,Chen,N.,Gao,D.,Shi,B.,Kong,S.,West,R.C.,Yuan,Y.,Zhi,M.,Wei,Q.,et al.(2019).Implantation initiationof self-assembled embryo-like structures generated using three types of mouseblastocyst-derived stem cells.Nat.Commun.10,496,在该文献中的名称为XENC细胞。
下述实施例中Arf1蛋白的氨基酸序列为序列1。
实施例1、Arf1作为成腔候选基因的发现及获得
一、EXE-类胚胎、ETX-类胚胎和EB拟胚胎的制备
胚胎干细胞ESCs来源于表胚层。滋养层干细胞TSCs来源于滋养层。胚外内胚层干细胞XENCs来源于原始内胚层。
1、EXE-类胚胎
EXE-类胚胎制备需ESCs和XENCs两种细胞,也可以为带有不同荧光标记的ESCs和TSCs细胞，具体方法如下:
1).将ESCs和XENCs两种细胞分别消化为单细胞,1000×g离心5min。
2).吸去上清,加入适量表1所示的类胚胎培养基重悬细胞,使用自动细胞计数仪进行计数。
3).分别加入1.5×105个ESCs细胞和1.5×105个XENCs细胞至35mm非粘附细胞培养皿中,每皿添加2mL类胚胎培养基。
4).将培养皿放置到37℃培养箱中的水平摇床上,以70rpm水平悬浮培养,即可形成EXE-类胚胎。
EXE-胚胎样结构具有如下特定空间结构：XEN细胞来源的组织位于外层，ES细胞来源的组织位于内部，XEN细胞来源的组织包裹ES细胞来源的组织。
2、ETX-类胚胎
ETX-类胚胎制备需ESCs,TSCs和XENCs三种细胞，也可以为带有不同荧光标记的ESCs,TSCs和XENCs细胞,具体方法如下:
1).将ESCs,TSCs和XENCs三种细胞分别消化为单细胞,1000×g离心5min。
2).吸去上清,加入适量类胚胎培养基重悬细胞,使用自动细胞计数仪进行计数。
3).分别加入1.5×105个ESCs细胞,1.5×105个TSCs细胞,3×105个XENCs细胞至35mm非粘附细胞培养皿中,每皿添加2mL类胚胎培养基。
4).将培养皿放置到37℃培养箱中的水平摇床上,以70rpm水平悬浮培养,即可形成ETX-类胚胎。
ETX-胚胎样结构具有如下特定空间结构：XEN细胞来源的组织位于外层，ES细胞来源的组织和TS细胞来源的组织位于内部，XEN细胞来源的组织包裹ES细胞来源的组织和TS细胞来源的组织，ES细胞来源的组织和TS细胞来源的组织分别聚集于内部两端且比例相当且紧密连接。
3、EB拟胚体
EB拟胚体制备需ESCs一种细胞,具体方法如下:
1).将ESCs细胞消化为单细胞,1000×g离心5min。
2).吸去上清,加入适量类胚胎培养基重悬细胞,使用自动细胞计数仪进行计数。
3).加入3×105个ESCs细胞至35mm非粘附细胞培养皿中,每皿添加2mL类胚胎培养基。
4).将培养皿放置到37℃培养箱中的水平摇床上,以70rpm水平悬浮培养,即可形成EB拟胚体。
4、EXE-类胚胎和ETX-类胚胎的单细胞测序及质控分析
本研究使用单细胞标记的逆转录测序技术STRT-seq(Single-cell taggedreverse transcription sequencing)(Gao et al.,2018；Wang et al.,2018b)对上述获得的EXE-类胚胎和ETX-类胚胎进行了单细胞测序,收集了两种类胚胎不同发育时间点(即悬浮培养0-72h)的细胞样品,涵盖了其从细胞识别聚合、极化成腔及非对称分化等所有发育事件。同时收取了EB类胚胎(由ESCs一种细胞聚合形成的致密化拟胚体)、XB类胚胎(由XENCs一种细胞聚合形成的中空囊泡样结构)以及不能形成类胚胎的TSCs单细胞作为对照组,共送测1051枚单细胞。
不同类型类胚胎发育形态图如图1所示，(A)EXE-类胚胎发育形态图。Oct4染色ESCs(红色),Gata4染色XENCs(绿色)。标尺,20μm。(B)由RFP-ESCs、NLS-GFP-TSCs和XENCs聚合形成的ETX-类胚胎发育形态图。ESCs携带胞质定位RFP,TSCs携带核定位GFP。标尺,100μm。(C)由RFP-ESCs聚合形成的致密化EB拟胚体形态图。标尺,50μm。(D)由XENCs聚合形成的中空囊泡样聚合体形态图。Gata4染色XENCs(绿色)。标尺,20μm。(E)不能形成聚合体且维持单细胞状态的GFP-TSCs。标尺,20μm。
为了明确体外类胚胎发育轨迹与体内胚胎发育的一致性和差异性,本研究将悬浮培养0-72h EXE-类胚胎及ETX-类胚胎单细胞数据与已报道的小鼠E3.5-6.75胚胎单细胞数据进行比对(Mohammed et al.,2017)。结果显示,通过UMAP算法聚类分析,0h未聚合的ESCs与E3.5 Epi(上胚层)状态相近,6-12h ESCs处于E3.5和E4.5 Epi中间状态,24h ESCs与E4.5 Epi相近,36-48h ESCs与E5.5 Epi状态相近,60-72h ESCs与E6.75 Epi临近但并未完全比对(图2；(A-B)0-72h ETX-和EXE-类胚胎单细胞数据和E3.5-6.75胚胎单细胞数据比对分析。(A)UMAP聚类分析。(B)拟时分析)。
以上结果说明EXE-类胚胎和ETX-类胚胎中ESCs在重构和发育过程中模拟了早期胚胎Epi从E3.5至E6.5的发育轨迹。
综合以上结果,EXE-类胚胎和ETX-类胚胎中ESCs在重构过程中均可模拟早期胚胎Epi从E3.5至E6.5的发育轨迹。更具完整结构的ETX-类胚胎可起始表达早期PS标志基因，发生非对称分化,模拟了E5.5之后时期早期胚胎的发育。同时ETX-类胚胎可模拟附植后胚胎中ExE和Epi胚层间的信号交流,TSCs受Fgf和Bmp信号通路调控发生快速增殖,促进了ETX-类胚胎向类卵圆柱结构转变。以上分析也证明了EXE-类胚胎和ETX-类胚胎单细胞数据的正确性和可信度,为后续分析奠定了基础。
三、重构类胚胎成腔候选基因筛选
目前关于极化成腔的了解主要基于MDCK 3D极化模型,缺少胚胎模型。ETX-和EXE-类胚胎是可以模拟早期胚胎发育及前羊膜腔形成的良好模型,因此本研究通过分析类胚胎极化成腔时的单细胞数据,分析类胚胎成腔时的基因动态变化,筛选可能参与极化成腔事件的关键因子,并对其作用机制进行验证。
1、类胚胎极化成腔发生的时间点的确定
本研究对类胚胎极化成腔发生的时间点进行确定。携带负电荷的极化蛋白PCX是促进腔形成的关键极化蛋白,因此后续研究主要使用PCX蛋白作为成腔标志蛋白指示腔的形成。
通过对上述一构建的EXE-类胚胎发育过程进行连续观察及免疫荧光染色极化蛋白PCX指示成腔的发生。
结果显示,EXE-类胚胎构建过程中悬浮培养24h和36h时腔尚未形成,PCX蛋白呈点状分布在细胞内；48h时形成新生的小腔；60-72h腔逐渐扩张(图3)。
由于48h时EXE-类胚胎已明显成腔,说明在36h时可能就已经出现极化基因表达模式的改变,从而调控极化蛋白的转运促进腔的形成,因此在形态学上36h是分析极化成腔事件的重要时间点。
为确定36h是否是类胚胎极化起始的关键时间点,本研究分别富集了EXE-和ETX-类胚胎ESCs构建中悬浮培养24h和36h的差异基因。
结果显示,EXE-类胚胎和ETX-类胚胎ESCs构建中悬浮培养36h时显著高表达的差异基因中均富集到许多已报道的极化成腔事件关键基因,如极化标志基因Stx3,Cdc42等,紧密连接基因Cldn6,Cldn7等,胞吞作用相关基因Rab11a,Rab8a,Exoc5等；在24h显著高表达Lama1和Col4a1/2,其编码的Laminin和Collagen蛋白是BM的重要成分,而BM是起始细胞极化的重要信号来源(图4，(A)ETX-类胚胎ESCs 24h和36h差异基因富集。(B)EXE-类胚胎ESCs 24h和36h差异基因富集。(C)ETX-类胚胎ESCs 24h和36h极化相关差异基因热图。(D)EXE-类胚胎ESCs 24h和36h极化相关差异基因热图)。
以上结果说明EXE和ETX类胚胎ESCs在24h时高表达BM相关基因,调控了BM的形成并释放极化信号,使36h时ESCs特异高表达极化关键基因,起始极化成腔的发生，36h为极化成腔对应的悬浮培养时间点。
2、成腔候选基因筛选及表型检测
1)对照确定
仅使用ESCs一种细胞类型重构形成的EB拟胚体虽然可以一定程度上模拟早期胚胎的部分发育事件,但由于其缺少BM提供的极化信号,因此不能发生极化成腔,只能通过细胞凋亡成腔。不同于细胞凋亡,细胞极化依赖于E-cadherin(Ecad)和肌动球蛋白共同的调控的皮质收缩和细胞黏附,使极化细胞呈楔形并诱导了莲花状结构的形成,因此E-cad是指示细胞极化的极化标志蛋白。
为比较分析本研究中使用的EB拟胚体、EXE-类胚胎和ETX-类胚胎三种不同体系间极成腔方式的差异性,本研究通过对上述一制备的EB拟胚体、EXE-类胚胎和ETX-类胚胎免疫荧光染色极化蛋白Ecad。
结果显示,EXE-和ETX-类胚胎均可发生极化,E-cad蛋白特异积累在成腔部位,标志着黏附连接(Adheren junction,AJ)形成,且腔周围细胞由于极化作用呈楔形状；EB拟胚胎中E-cad均匀分布在细胞膜上,且细胞形态呈规则的圆形,未发生极化(图5；(A-C)免疫荧光染色E-cad。DAPI染色细胞核。标尺,20μm。白色箭头,E-cad指示的极化部位。黄色箭头,细胞形状。(A)ETX-类胚胎。E-cad(红色)。(B)EXE-类胚胎。E-cad(绿色)。(C)EB拟胚体。E-cad(绿色))。以上结果说明EXE-类胚胎和ETX-类胚胎均可通过细胞极化进行成腔,而EB拟胚体不能发生细胞极化。
基于EB拟胚体仅具备分化的能力,不能极化成腔,因此是分析类胚胎极化事件的良好对照,去除细胞自身发育上的背景影响。
2)极化的候选基因筛选
将EXE-类胚胎或ETX-类胚胎构建中极化成腔对应的悬浮培养36h和24h收集的组织的单细胞测序结果进行分析，选取与24h的测序结果相比，在36h测序结果中显著高表达的基因作为候选基因；显著高表达为DESeq2软件计算，p值小于0.05。
再从候选基因中选取在EB拟胚体中显著低表达或不表达的基因作为极化候选基因；显著低表达为DESeq2软件计算，p值为小于0.05。
因此，本研究通过富集36h时EXE-类胚胎和ETX-类胚胎ESCs特异高表达而EB拟胚体中低表达或不表达的基因作为极化候选基因,共分析得到53个极化候选基因,其中包括Capza2等细胞骨架相关基因,Cldn7等细胞连接相关基因,Dnmt3b等多能性相关基因,以及Enpp2,Ppp2r1a,Arf1等敲除后小鼠胚胎致死的功能基因(图6A)。
3)从上述极化候选基因中确定未报道与极化成腔相关且与胚胎疾病相关的基因作为成腔候选基因，本研究具体为Nono、Jpt2、Arf1和Ppp2r1a，进行敲除实验验证表型(图6B)。其中Ppp2r1a已有研究报道其敲除后导致小鼠胚胎E6.5左右致死,且出现前羊膜腔形成缺陷(Lange et al.,2017),因此选取Ppp2r1a作为阳性对照对筛选体系进行验证。
敲除实验验证表型具体见如下步骤三中所述。
三、敲除实验验证表型成腔候选基因是否在极化成腔事件中有功能
1、CRISPR/Cas9系统基因敲除载体的构建
本研究主要以PX330-puro(购买于Addgene,货号110403)为骨架载体构建敲除质粒,对目的基因Arf1,Ppp2r1a,Nono,Jpt2,Sox2,Otx2,Zic2进行敲除。sgRNA的序列利用张峰实验室提供的网站(https://zlab.bio/guide-design-resources)设计合成,敲除位置需在外显子区域,且在目的基因CDS序列前1/2处。具体序列如表2所示。敲除细胞系验证引物表3所示。
表2为CRISPR/Cas9敲除载体sgRNA的引物
表3为CRISPR/Cas9敲除载体验证引物汇总
敲除载体的构建方法具体如下:
1)根据目的基因设计表2所示的sgRNA引物,在引物的末端添加Bbs I酶切位点后合成序列。
2)表2所示的sgRNA引物退火，得到对应的sgRNA退火产物,退火反应体系具体如下:
表4为退火反应体系
退火PCR程序:
95℃,10min
95℃梯度降温至16℃,速率0.1℃/s
16℃,1min
3)使用限制性核酸内切酶Bbs I酶切PX330-puro骨架载体使其线性化,酶切反应体系具体如下:
表5为酶切反应体系
上述酶切反应体系混合均匀后,37℃酶切6h，得到线性化骨架载体。
4)酶切产物切胶回收,具体如下:
使用Gel&PCR Clean Up Kit(OMEGA)进行胶回收,依照商家说明书进行,过程如下:
a)使用0.9％琼脂糖凝胶对酶切产物电泳,需提前清洗电泳槽,更换新鲜的电泳缓冲液,电泳时电流低于100A。
b)酶切产物电泳后,在紫外灯下切下含目的片段的凝胶,放入离心管中称重。
c)按1g/mL比例加入XP2结合缓冲液,55℃孵育7min或至凝胶完全融化,期间涡旋振荡数次。
d)将上述混合液转移至DNA吸附柱中,13,000×g离心30s,弃去废液。
e)加入300μL XP2结合缓冲液至吸附柱中,13,000×g离心30s,弃去废液。
f)加入700μL提前用无水乙醇稀释的SPW清洗液至吸附柱中,13,000×g离心30s,弃去废液。
g)重复以上步骤,再次加入700μL SPW清洗液至吸附柱中,13,000×g离心30s,弃去废液。
h)空吸附柱17,000×g离心2min,转移至新的1.5mL离心管中,开口放置5min,挥发残余乙醇。
i)向吸附柱中心膜上滴加30μL TE洗脱液,室温静置5min,17,000×g离心2min洗脱DNA,用分光光度计测浓度后-20℃保存。
5)步骤3的线性化骨架载体与步骤2的sgRNA退火产物使用T4连接酶连接,连接反应体系具体如下：
表6为连接反应体系
上述连接反应体系混合均匀后,16℃金属浴,6h。
6)连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,具体如下:
a)取感受态细胞DH5α置于冰上融化,解冻后加入10μL连接产物,冰上放置30min。
b)42℃热激90s,再冰上静置2-3min。
c)加入1mL无抗生素LB液体培养基,放入37℃摇床振荡培养50min。
d)1500×g离心1min,弃去上清,保留30μL上清液轻柔重悬沉淀,使用涂布棒将悬浮液均匀的涂至含有抗生素的LB平板上,37℃培养箱中倒置培养16-20h后挑取单菌落鉴定连接情况(表3所示的引物进行鉴定)。
7)测序
对转化涂板后的LB平板挑取单菌落,置于10μL H2O中吹打混匀,取5μL菌液重悬于1mL含有抗生素的LB液体培养基中,37℃摇床培养至液体浑浊,取700μL送至测序公司测序。
8)去内毒素质粒小量提取
使用Endo-free Plasmid Mini Kit(OMEGA)进行质粒提取,依照商家说明书进行,过程如下:
a)取15mL过夜培养的菌液,5000×g离心10min。
b)去除上清液,加入500μL 4℃保存的SolutionΙ/RNase A重悬沉淀。
c)加入500μL Solution II并轻柔上下颠倒混匀,直至液体澄清,室温静置3-5min。
d)加入4℃预冷的Buffer N3,轻轻上下颠倒混匀,直至出现白色沉淀,13000×g离心,10min。
e)将上清液转移至新的2mL离心管中,加入等体积的ETR binding buffer,上下颠倒混合均匀。
f)吸取700μL上述液体至HiBind DNA Mini Column II吸附柱中,13000×g离心,1min,去除废液。
g)重复f)步骤,直至加完液体。
h)吸取500μL HB Buffer至吸附柱中,13000×g离心,1min,去除废液。
i)吸取700μL DNA Wash Buffer至吸附柱中,13000×g离心,1min,去除废液。重复此步骤一次。
j)转移吸附柱至新的1.5mL离心管中,开盖静置5min,挥发残余酒精。向吸附柱膜上悬空滴加30-50μL Endotoxin-Free Elution Buffer,室温静置5min,16000×g离心,2min,洗脱质粒。
k)用分光光度计测浓度,-20℃保存。
上述分别得到如下CRISPR/Cas9系统基因敲除载体：
CRISPR/Cas9系统基因敲除载体Nono为将表2中Nono基因对应sgRNA插入PX330-puro骨架载体的Bbs I酶切位点间得到的载体。
CRISPR/Cas9系统基因敲除载体Jpt2为将表2中Jpt2基因对应sgRNA插入PX330-puro骨架载体的Bbs I酶切位点间得到的载体。
CRISPR/Cas9系统基因敲除载体Arf1将表2中Arf1基因对应sgRNA插入PX330-puro骨架载体的Bbs I酶切位点间得到的载体。
CRISPR/Cas9系统基因敲除载体Ppp2r1a将表2中Ppp2r1a基因对应sgRNA插入PX330-puro骨架载体的Bbs I酶切位点间得到的载体。
上述各个对应的sgRNA为用表2对应的引物退火得到sgRNA退火产物。
2、构建Nono、Jpt2、Arf1、Ppp2r1a敲除ESC细胞系
将上述1获得的各个CRISPR/Cas9系统基因敲除载体分别转入ESC细胞系中，得到Nono、Jpt2、Arf1、Ppp2r1a敲除ESC细胞系。
敲除位置如图6C-6F所示，图中wild type ESCs为ESC细胞系，Arf1-/-ESCs为Arf1敲除ESC细胞系，Nono-/-ESCs为Nono敲除ESC细胞系，Jpt2-/-ESCs为Jpt2-敲除ESC细胞系，Ppp2r1a-/-ESCs为Ppp2r1a敲除ESC细胞系。
分别提取各个Nono、Jpt2、Arf1、Ppp2r1a敲除ESC细胞系的基因组DNA，用表3所示的引物进行验证：Nono敲除ESC细胞系得到235bp为阳性(342bp为阴性)；Jpt2敲除ESC细胞系得到249bp为阳性(361bp为阴性)；Arf1敲除ESC细胞系得到314bp为阳性(342bp为阴性)；Ppp2r1a敲除ESC细胞系得到228bp为阳性(346bp为阴性)。上述阳性敲除细胞系分别命名为Nono-ko、Jpt2-ko、Arf1-ko、Ppp2r1a-ko细胞系。
将上述各个Nono-ko、Jpt2-ko、Arf1-ko、Ppp2r1a-ko细胞系与野生型XENCs按照实施例1的一的方法分别重构形成的Nono、Jpt2、Arf1、Ppp2r1a敲除的EXE-类胚胎。
针对Nono、Jpt2、Arf1、Ppp2r1a敲除的EXE-类胚胎分别进行胚层标志蛋白和极化蛋白的免疫荧光染色，检测Nono、Jpt2、Arf1、Ppp2r1a敲除的EXE-类胚胎的成腔直径。
结果如图7所示，图中wild type、Nono-ko、Jpt2-ko、Arf1-ko、Ppp2r1a–ko分别表示野生型ESC细胞系、Nono-ko、Jpt2-ko、Arf1-ko、Ppp2r1a-ko细胞系形成的EXE-类胚胎，(A)不同敲除组悬浮培养60h形成EXE类胚胎形态学观察。第一行,明场,标尺,100μm。第二行,胚层标志蛋白免疫荧光染色检测EXE-类胚胎结构,Oct4染色ESCs(红色),Gata4染色XENCs(绿色),标尺,20μm。第三行,极化蛋白免疫荧光染色检测EXE类胚层成腔能力,PCX指示腔(红色),DAPI染色细胞核,标尺,20μm。(B)悬浮培养60h不同敲除组成腔直径统计。Nono敲除后腔直径显著减小,Arf1和Ppp2r1a敲除后不能成腔,Jpt2敲除后腔直径与野生型无差异。n.s.,P≥0.05；*,P<0.05；**,P<0.01,***,P<0.001。可以看出，免疫荧光染色胚层标志蛋白Oct4和Gata4结果显示，以上四种基因的敲除均不影响EXE-类胚胎的形成,都可形成XENCs包裹ESCs的规则结构。免疫荧光染色成腔蛋白PCX结果显示,Nono、Arf1和Ppp2r1a的敲除均导致EXE-类胚胎出现成腔缺陷。在悬浮培养60h时野生型EXE类胚胎已形成明显的扩张腔时,Nono敲除后EXE-类胚胎腔直径显著减小,而Arf1和Ppp2r1a敲除后类胚胎不能正常成腔。Jpt2敲除后对成腔无明显影响。
其中Ppp2r1a敲除后类胚胎的成腔缺陷表型与已报道的体内胚胎表型一致,证明了筛选体系的可靠性,类胚胎可以模拟体内胚胎的缺陷表型并用于成腔候选基因的筛选。而未报道与极化成腔有直接关系的Arf1,Nono的敲除导致了EXE-类胚胎成腔缺陷,证明了其可能参与极化成腔,在成腔事件中发挥一定功能。由于Arf1敲除导致的成腔表型更为显著,因此后续主要对Arf1的功能及作用机制展开研究。
上述结果表明，Arf1敲除后的ESC与XENCs重构得到EXE-类胚胎成腔缺陷,也就是说，Arf1敲除抑制EXE-类胚胎不能正常成腔。
实施例2、Arf1对成腔具有重要功能
结合以上Arf1-ko EXE-类胚胎不能正常成腔推测,Arf1可能参与调控了早期胚胎前羊膜腔形成,其敲除导致前羊膜腔形成缺陷从而导致胚胎致死,为检测以上假设,本研究对Arf1的功能及作用机制进行解析。
一、Arf1敲除导致类胚胎不能成腔
为探究Arf1在类胚胎极化成腔过程中的功能及调控机制,本研究分别对Arf1-koESCs重构形成的EXE-和ETX-类胚胎的成腔表型进行了更细致的形态学观察,进一步细化Arf1敲除导致的类胚胎极化成腔缺陷表型。
1、抑制EXE-类胚胎和ETX-类胚胎中Arf1基因的表达
实验组：
将实施例1的三获得的Arf1-ko细胞系与XENCs按照实施例1的一方法重构形成的Arf1-ko EXE-类胚胎。
将实施例1的三获得的Arf1-ko细胞系与携带GFP荧光标记的TSCs(TSCs细胞转染GFP-NLS质粒)和XENCs按照实施例1一的方法重构形成的Arf1-ko ETX-类胚胎。
对照组：
与实验组不同的仅为将Arf1-ko细胞系替换为野生型ESCs细胞系，得到未敲除Arf1的EXE-类胚胎和ETX-类胚胎。
2、Arf1敲除导致类胚胎不能成腔的表型观察
将上述Arf1-ko EXE-类胚胎和Arf1-ko ETX-类胚胎分别进行免疫荧光染色。对照组的EXE-类胚胎和ETX-类胚胎。
EXE-类胚胎免疫荧光染色极化蛋白PCX结果显示如图8所示，(A-B)48h和60hEXE-类胚胎免疫荧光染色PCX及PCX荧光强度统计。PCX(红色),DAPI染色细胞核(蓝色)。左图白色虚线指示PCX荧光强度测量位置,每图均设置2个重复测量,分别标为1和2。标尺,20μm。(A)野生型EXE-类胚胎。(B)Arf1-ko EXE-类胚胎；未敲除Arf1的EXE-类胚胎(图中记作wildtype)构建过程中悬浮培养48h时已形成新生的小腔,PCX荧光强度分析可富集到明显的双峰；随着腔的扩张以及腔直径增大,60h时PCX荧光强度分析中富集到的双峰间距增大。而Arf1-ko EXE-类胚胎(图中记作Arf1-ko)中始终未能检测到PCX蛋白的规则分布,未能形成腔,证明了Arf1的敲除导致EXE-类胚胎出现成腔缺陷。
通过使用携带GFP荧光标记的TSCs(又称为NLS-GFP-TSCs)与ESCs和XENCs重构形成ETX-类胚胎,免疫荧光染色成腔蛋白PCX结果如图9所示，(A)野生型ETX-类胚胎成腔观察。(B)Arf1-ko ETX-类胚胎成腔观察。(A-B)左图为ETX类胚胎免疫荧光染色PCX蛋白。PCX(红色),NLS-GFP-TSCs(绿色),DAPI染色细胞核(蓝色)。白色虚线指示PCX荧光强度测量位置,序号1指示TSCs部分,序号2指示ESCs部分。标尺,50μm。右图为PCX荧光强度峰图；未敲除Arf1的EXE-类胚胎(图中记作wild type)中TSCs部分和ESCs部分在悬浮培养60h时分别成腔,72h时两腔融合形成类羊膜腔；而由Arf1-ko ESCs重构形成的Arf1-ko-ETX-类胚胎中ESCs部分不能起始成腔,TSCs部分不受ESCs部分影响仍可正常发生极化成腔,在60h时形成新生的小腔,72h时腔扩张,但由于ESCs部分成腔缺陷导致不能正常形成类前羊膜腔。
综合以上结果,Arf1敲除导致EXE-和ETX-类胚胎均出现成腔缺陷,导致不能正常形成类前羊膜腔，且Arf1-ko ESCs不能起始细胞极化。
二、Arf1敲除导致极化起始位点不能形成
在MDCK 3D极化体系中,细胞从头极化(de novo polarization)依赖于极化起始位点(Apical membrane initiation site,AMIS)的形成,即极化蛋白PCX在多种极化蛋白共同作用下从细胞膜上被运输至新生的极化位点处,标志极化的发生及后续腔形成位置。AMIS是一个瞬时的结构域,由极化蛋白Par6,aPKC,PCX及紧密连接蛋白Par3,ZO-1等共定位指示(Bryant et al.,2010)。
由于前面结果显示Arf1敲除后PCX与aPKC蛋白始终呈分离状态,因此为探究Arf1是否影响AMIS的形成,本研究首先对野生型EXE-类胚胎的de novo极化过程进行验证。
将上述一获得的EXE-类胚胎进行免疫荧光染色极化蛋白aPKC和PCX结果显示,EXE-类胚胎构建过程中悬浮培养12h时未发生极化,PCX和aPKC蛋白均匀的分布在细胞膜上；随着24h时极化发生,PCX开始转运,从细胞膜转移至细胞极化处,至36h时PCX与aPKC共定位,标志着AMIS的形成。48h时,PCX与aPKC蛋白在细胞极化处积累形成PAP(Pre-apicalpatch),开始成腔。随着培养时间延长腔逐渐扩张(60-72h),PCX特异定位在腔上，aPKC定位在腔上与紧密连接处(图10A)。
综合以上,证明了EXE-类胚胎是通过AMIS及PAP阶段,细胞起始de novo极化从而形成腔。
上述一获得的Arf1-ko EXE-类胚胎进行免疫荧光染色极化蛋白aPKC和PCX，结果极化蛋白PCX虽可从细胞膜离开发生转运,但与aPKC始终分离,未出现共定位,不能正常形成AMIS(图10B),说明Arf1的敲除导致了AMIS的形成缺陷,细胞不能发生denovo极化,证明了AMIS的形成需要Arf1的参与。
三、Arf1敲除导致体内胚胎成腔缺陷
前文结果已证明EXE-及ETX-类胚胎的成腔依赖于Arf1的参与,Arf1敲除导致重构类胚胎不能成腔。为验证Arf1是否在体内早期胚胎中也发挥同样功能,本研究利用4-8细胞注射法产生嵌合胚胎,检测Arf1敲除后体内胚胎成腔表型(图11)，将携带GFP荧光标记的细胞注射至4-8细胞阶段的受体胚胎中,体外培养至桑葚胚或早期囊胚阶段,移植入同期发情的受体假孕鼠输卵管中,根据本研究需求在E5.5及E6.5将移植胚胎从子宫剥除,检测胚胎成腔情况。
1、使用4-8细胞注射法制备嵌合胚胎
为方便指示嵌合胚胎中细胞来源,注射使用的ESCs均标记有核定位的GFP荧光。
具体如下:
1.收集CD-1小鼠E1.5 2-细胞胚胎,放至KSOM培养液(Millipore，货号MR-020P-5F)中培养至8-16细胞胚胎阶段,即可用于细胞注射。
2.将2组待注射的细胞消化为单细胞,离心后使用M2操作液(MR-051,Sigma-Aldrich)重悬,放置冰上备用。
3.利用piezo辅助的显微操作系统,按照每枚胚胎注射15个细胞的标准,将细胞注射到8-16细胞期胚胎中,放置37℃培养箱中培养，得到对照组嵌合胚胎和Arf1-ko实验组嵌合胚胎。注射用的细胞可标记荧光标签,方便后续统计嵌合效率。
根据不同的待注射细胞分为如下两组：
对照组：注射GFP-ESCs细胞，具体为将野生型ESCs细胞转染PB-CMV-EF1A GFP-NLS质粒获得。
Arf1-ko实验组：注射Arf1-ko GFP-ESCs细胞，具体为将Arf1-ko ESCs细胞转染PB-CMV-EF1A GFP-NLS质粒获得。
2、胚胎移植
不同发育阶段的胚胎需移植到不同部位,桑葚胚以及桑葚胚之前阶段胚胎需移植至0.5d.p.c.假孕雌鼠(CD1小鼠，dpc指怀孕天数)的输卵管内,而囊胚之后阶段胚胎需移植至2.5d.p.c.假孕雌鼠的子宫内。具体如下:
(1)输卵管移植
a)胚胎移植受体鼠准备。将性成熟的雌鼠与去势雄鼠合笼,取见栓0.5d.p.c.的假孕母鼠作为胚胎移植的受体鼠。
b)将受体鼠称重后,根据体重注射适量的麻醉剂麻醉小鼠。
c)使小鼠保持侧躺,用75％酒精消毒表皮后,用剪刀在腿部和肋骨之间剪开1cm左右的切口。用钟表镊子在肌肉层扎开一个小口,固定好后,用镊子夹住卵巢脂肪垫,轻轻将拉出卵巢脂肪垫和卵巢。
d)用夹子固定住卵巢脂肪垫,向卵巢悬空滴加10μL肾上腺素,防止出血。
e)显微镜下用镊子撕开覆盖在输卵管上的卵巢囊,找到输卵管的壶腹部入口处并用钟表镊子固定,将提前吸有胚胎的口吸管插入输卵管入口,吹入胚胎及一截气柱,防止胚胎流出。
f)将移植后的输卵管用镊子轻轻放回腹腔内,使用可降解缝合线缝合切口。用相同方法移植另一侧输卵管。
g)将小鼠放到37℃恒温台上,直至苏醒后转移至鼠房。
(2)子宫移植
a)胚胎移植受体鼠准备。将性成熟的雌鼠与去势雄鼠合笼,取见栓2.5d.p.c.的假孕母鼠作为胚胎移植的受体鼠。
b)将受体鼠称重后,根据体重注射适量的麻醉剂麻醉小鼠。
c)使小鼠保持侧躺,用75％酒精消毒表皮后,用剪刀在腿部和肋骨之间剪开1cm左右的切口。用钟表镊子在肌肉层扎开一个小口,固定好后,用镊子夹住卵巢脂肪垫,轻轻将拉出卵巢脂肪垫、卵巢和子宫。
d)用夹子固定住卵巢脂肪垫,向子宫悬空滴加10μL肾上腺素,防止出血。
e)显微镜下用镊子固定子宫后,用注射器针头在子宫壁上刺入一个针口,将提前吸有胚胎的口吸管沿针口插入子宫内,吹入胚胎,不可吹入空气。
f)将移植后的一侧卵巢脂肪垫、卵巢和子宫用镊子轻轻放回腹腔内,使用可降解缝合线缝合切口。用相同方法移植另一侧子宫。
g)将小鼠放到37℃恒温台上,直至苏醒后转移至鼠房。
利用4-8细胞注射法产生嵌合胚胎示意图，如图11所示：将携带GFP荧光标记的细胞注射至4-8细胞阶段的受体胚胎中，得到嵌合胚胎,体外培养至桑葚胚或早期囊胚阶段,移植入同期发情的受体假孕鼠输卵管中,根据本研究需求在E5.5及E6.5将移植胚胎从子宫剥除,检测胚胎成腔情况。
将上述嵌合胚胎通过体外胚胎培养发育至E3.5早期囊胚阶段时,用免疫荧光染色结果如图12A显示,对照组和Arf1-ko实验组中注射的供体细胞和受体胚胎均高效嵌合,形成了E-cad蛋白指示的细胞间连接,且由Sox2指示的ICM部分均为GFP标记的供体细胞,证明了4-8细胞注射法的高嵌合效率及该实验的可行性。并且对照组和Arf1-ko实验组的嵌合胚胎均可正常发育至囊胚阶段,其中对照组嵌合胚胎囊胚发育率(发育率＝正常发育囊胚/囊胚总数*100％)为94.8％,Arf1-ko实验组嵌合胚胎囊胚发育率为95.3％,无显著性差异(图12B)。
以上结果说明Arf1的敲除不影响植入前囊胚阶段的发育。
为探究Arf1是否影响植入后胚胎发育,本研究利用荧光显微镜在荧光下肉眼挑取GFP荧光嵌合比例高的嵌合囊胚移植入受体孕鼠中,待移植胚胎发育至E5.5及E6.5时期分别解剖出以检测植入后胚胎发育情况。
免疫荧光染色极化蛋白PCX结果显示,E5.5时期对照组嵌合胚胎Epi胚层形成新生的小腔,ExE胚层尚未成腔,E6.5时期时形成融合的前羊膜腔，而E5.5和E6.5时期Arf1-ko嵌合胚胎均出现成腔缺陷,不能发育形成前羊膜腔。以上对照组及实验组嵌合胚胎中,Epi胚胎均为GFP阳性细胞,说明Epi胚层均由注射的供体细胞发育而来,证明了嵌合胚胎表型的可信性(图13；(A-B)嵌合胚胎PCX免疫荧光染色及荧光强度峰图。GFP(绿色),DAPI染色细胞核(蓝色)。白色虚线指示Epi范围,黄色虚线箭头指示PCX荧光强度测量位置。标尺,20μm。(A)E5.5时期嵌合胚胎。PCX(灰色)。(B)E6.5时期嵌合胚胎。对照组中PCX(红色)。实验组中PCX(灰色)。(C)图(A)中嵌合胚胎成腔率统计,对照组n＝5,Arf1-ko实验组n＝14。(D)图(B)中嵌合胚胎成腔率统计,对照组n＝16,Arf1-ko实验组n＝18。(C-D)n.s.,P≥0.05；*,P<0.05；**,P<0.01,***,P<0.001)。
综合以上结果,Arf1的敲除不影响植入前胚胎的发育,但导致植入后胚胎发育缺陷,不能形成前羊膜腔,和Arf1-ko ETX-及EXE-类胚胎表型一致,证明了Arf1在植入后胚胎及体外类胚层极化成腔过程中具有重要功能。
实施例3、Arf1在调节胚胎成腔的机理研究
一、Arf1表达及功能受多能性调控
1、类胚胎极化成腔依赖活性状态的Arf1-GTP
Arf1存在两种分子状态,GTP结合的活性状态和GDP结合的非活性状态,而膜蛋白活化、招募及转运等过程依赖于活性状态的Arf1-GTP。为解析不同分子形式的Arf1在极化成腔事件的功能,本研究在Arf1-ko ESC细胞系中过表达不同分子形式的Arf1,通过重构形成EXE-类胚胎检测其极化成腔表型从而验证不同分子形式Arf1的功能。
将Arf1氨基酸序列中第71位谷氨酰胺(Glutamine,Gln)突变为亮氨酸(Leucine,Leu)可模拟持续活化形式的Arf1-GTP(简称Arf1Q71L)(图14A，第一行为野生型Arf1原始(Arf1WT)CDS序列,第二行为Arf1Q71L序列,第三行为Arf1T31N序列。下划线指示突变位点。红色指示突变碱基。序列方向均为5’端至3’端。)；
将Arf1氨基酸序列中的第31位苏氨酸(Threonine,Thr)突变为天冬酰胺(Asparagine,Asn),可模拟持续非活化形式的Arf1-GDP(简称Arf1T31N)(图14A)。
1)过表达载体的获得
将Arf1-GTP(简称Arf1Q71L)的编码基因替换PB-CAG-Pruo载体(购买自Addgene，货号79009)的Mlu1和Pac1酶切位点间，得到的Arf1Q71L载体；
将Arf1-GDP(简称Arf1T31N)的编码基因替换PB-CAG-Pruo载体(购买自Addgene，货号79009)的Mlu1和Pac1酶切位点间，得到的Arf1T31N载体；
将Arf1的编码基因替换PB-CAG-Pruo载体(购买自Addgene，货号79009)的Mlu1和Pac1酶切位点间，得到的Arf1WT载体；
2)Arf1-ko ESCs中分别过表达野生型Arf1(Arf1WT)、Arf1Q71L、Arf1T31N进行回补
将上述各个载体导入Arf1-ko ESCs中，得到回补Arf1WT的ESCs细胞、回补Arf1Q71L的ESCs细胞、回补Arf1T31N的ESCs细胞。
提取各个细胞的RNA，用表3所示的引物Arf1和Arf1-外源进行扩增，检测总Arf1表达量和外源Arf1表达量。
结果如图14B所示，Arf1WT、Arf1Q71L、Arf1T31N过表达ESCs细胞系定量检测Arf1表达量。Control为Arf1-ko ESCs，Arf1WT-OE、Arf1Q71L-OE、Arf1T31N-OE分别表示回补Arf1WT的ESCs细胞、回补Arf1Q71L的ESCs细胞、回补Arf1T31N的ESCs细胞，左图,总Arf1表达量检测,其中Arf1WT、Arf1Q71L、Arf1T31N过表达ESCs均显著高表达Arf1。右图,外源Arf1表达量检测,control不表达外源Arf1,仅Arf1WT、Arf1Q71L、Arf1T31N过表达ESCs显著特异高表达外源Arf1,证明过表达细胞系构建成功。误差线表示±SD(n＝3次独立实验),n.s.,P≥0.05；*,P<0.05；**,P<0.01,***,P<0.001。可以看出，在Arf1-ko ESCs中分别过表达野生型Arf1(Arf1WT)、Arf1Q71L、Arf1T31N进行回补。
将上述回补Arf1WT的ESCs细胞(记作Arf1WT-OE)、回补Arf1Q71L的ESCs细胞(记作Arf1Q71L-OE)、回补Arf1T31N的ESCs细胞(记作Arf1T31N-OE)与野生型XENCs(记作wild type)按照前面实施例1的方法重构形成不同类型的EXE-类胚胎,通过观察极化成腔表型检测不同分子形式Arf1的功能。
结果如图15所示，(A)野生型EXE-类胚胎,Arf1WT、Arf1Q71L、Arf1T31N过表达的EXE类胚胎免疫荧光染色检测成腔能力。PCX(红色),DAPI染色细胞核(蓝色)。标尺,20μm。(B)对(A)的成腔率统计。n＝36(Wild type),42(Arf1WT),56(Arf1Q71L),30(Arf1T31N)。n.s.,P≥0.05；*,P<0.05；**,P<0.01,***,P<0.001,通过免疫荧光染色极化蛋白PCX,在Arf1-koESCs中过表达Arf1WT可完全回补Arf1敲除导致的成腔缺陷表型,在类胚胎构建中悬浮培养48h时形成新生的小腔,野生型与Arf1WT过表达EXE-类胚胎成腔率(成腔率＝有腔的类胚胎/类胚胎总数*100％)分别为68％和62％；在类胚胎构建中悬浮培养60h时腔扩张,两组成腔率均为100％,证明该成腔缺陷表型来源于Arf1的缺失。在过表达突变形式Arf1的EXE-类胚胎中,仅过表达活化形式Arf1Q71L可有效回补Arf1敲除导致的成腔缺陷,48h时回补成腔率达64％,60h时回补成腔率为99％,而过表达非活化形式的Arf1T31N在48h和60h时均不能成腔,说明类胚胎的极化成腔依赖于活化形式的Arf1-GTP。
2、Arf1表达受多能性调控
已有研究表明,多种极化基因的表达受多能性转录因子的调控,如极化基因PCX的表达受Oct4和Otx2共同调控,Rap1的表达受Oct4和Essrb调控。而Arf1在36h特异高表达,且该时期同时特异高表达多种Formative阶段相关多能性转录因子,暗示了Arf1与多能性之间可能存在调控。
为证明以上假设,本研究汇总了在EXE-类胚胎制备中悬浮培养36h高表达的Formative相关转录因子的染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)数据,分析其是否与Arf1存在结合。
结果显示,Formative阶段多能性转录因子Otx2和Zic2均可与Arf1的启动子区域结合,且可与Gbf1、Arfgef1及Arfgef2等Arf1的调节因子GEF结合,而核心多能因子Oct4均不能与Arf1及其GEF调节因子发生结合(图16；(A-D)Otx2、Zic2、Oct4多能性转录因子ChIP-seq数据分析。其中Otx2和Zic2为Formative阶段标志基因,ESCs中不表达,仅在EpiESCs中特异表达,因此Otx2和Zic2 ChIP-seq分析选用Epi ESCs来源数据,同时使用EpiESCs input为对照。Oct4 ChIP-seq分析选用/>ESCs来源数据,同时使用/>ESCsinput为对照)。以上结果说明Arf1的表达及活性可能受Formative多能性转录因子Otx2和Zic2的调控。
为验证多能性转录因子Otx2和Zic2是否对Arf1存在调控,本研究利用Crispr/Cas9体系分别构建了Otx2-ko,Zic2-ko单基因敲除ESC细胞系,同时构建了Otx2/Zic2-ko双基因敲除ESC细胞系(Double-ko)。如图17所示，(A-B)利用Crispr/Cas9体系构建Otx2,Zic2单基因敲除ESCs细胞系。(C)利用Crispr/Cas9体系构建Otx2/Zic2双基因敲除ESCs细胞系。(A-C)*指示sgRNA位点。第一行为野生型ESCs原始基因组序列,第二行为敲除细胞系基因组序列,红色指示敲除区域及敲除片段大小。蓝色为sgRNA序列,下划线指示PAM位点。序列方向均为5’端至3’端。构建方法与前面相同，采用表2所示的sgRNA引物。
将ESC细胞系、上述各个Otx2-ko敲除ESC细胞系,Zic2-ko敲除ESC细胞系和Double-ko敲除ESC细胞系分别与野生型XENCs按照前面实施例1的方法重构形成不同类型的EXE-类胚胎，记作control EXE、Otx2-ko EXE、Zic2-ko EXE、Double-ko EXE。
为检测Otx2和Zic2是否直接调控了Arf1的表达,本研究通过96.96单细胞基因表达芯片收集了悬浮培养24h和36h EXE-类胚胎ESCs进行表达检测。
结果显示,悬浮培养36h EXE-ESCs Arf1相对于24h表达显著上调,和EXE-类胚胎ESCs单细胞数据一致。Otx2敲除后,在24h和36h均显著抑制了Arf1的表达,和野生型ESCs相比表达显著下调；Zic2敲除后,24h时Arf1表达量和野生型ESCs相比虽不显著,但下调趋势明显,在36h时Arf1表达出现显著表达下调；Otx2和Zic2共同敲除后,24h和36h对Arf1的表达调控更为显著,均显著下调,且下调趋势相对于Otx2,Zic2单独敲除更为显著(图18；96.96单细胞表达芯片检测24h,36hEXE-ESCs中Arf1表达。每组单细胞数n＝12,误差线表示±SD,n.s.,P≥0.05；*,P<0.05；**,P<0.01,***,P<0.001)。以上结果证明了Arf1的表达受Otx2和Zic2的调控。
综合以上结果,EXE-和ETX-类胚胎ESCs在36h同时起始极化并发生多能性退出,从阶段退出至Formative阶段,/>多能性相关标志基因表达下调,Formative多能性相关标志基因表达上调。其中Formative阶段多能性转录因子Otx2和Zic2调控了Arf1的表达,Otx2和Zic2的敲除使Arf1表达显著下调,同时Otx2和Zic2的敲除也导致类胚胎极化成腔发生时间显著推迟。/>

Claims (10)

1.Arf1蛋白或基因或其他生物材料在制备具有如下任一功能产品中的应用：
1)调控胚胎或类胚胎成腔；
2)调控胚胎或类胚胎发育中细胞发生极化；
3)作为标志物筛查或辅助筛查成腔异常胚胎或成腔异常类胚胎。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述成腔异常胚胎为前羊膜腔发育异常胚胎；
或所述成腔异常类胚胎为类前羊膜腔发育异常类胚胎。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述胚胎或类胚胎为人源或动物源。
4.抑制Arf1基因表达或降低Arf1蛋白活性的物质在如下任一种的应用：
1)制备Arf1基因表达或降低Arf1蛋白活性的ESC细胞系；
2)制备抑制胚胎或类胚胎成腔产品；
3)制备抑制胚胎或类胚胎发育中细胞发生极化产品；
4)制备模拟体内胚胎成腔缺陷的类胚胎模型。
5.Arf1蛋白或基因作为靶点在制备模拟体内成腔缺陷的类胚胎模型中的应用。
6.一种模拟体内成腔缺陷的类胚胎模型的构建方法，包括如下步骤：
1)敲除或抑制胚胎干细胞中Arf1基因的表达，得到敲除Arf1基因的胚胎干细胞；
2)将所述敲除Arf1基因的胚胎干细胞和胚外内胚层干细胞悬浮培养，重构得到EXE-类胚胎，所述EXE-类胚胎为成腔缺陷EXE-类胚胎；
或将所述敲除Arf1基因的ESC细胞、滋养层干细胞和胚外内胚层干细胞悬浮培养，重构得到ETX-类胚胎，所述ETX-类胚胎为成腔缺陷ETX-类胚胎。
7.根据权利要求4或5所述应用或权利要求6所述方法，其特征在于：所述成腔缺陷为胚胎或类胚胎前羊膜腔发育异常。
8.EXE-类胚胎或ETX-类胚胎在筛选极化成腔基因中的应用；
或EXE-类胚胎或ETX-类胚胎在制备筛选极化成腔基因产品中的应用。
9.一种利用类胚胎筛选极化成腔基因的方法，包括如下步骤：
1)对EXE-类胚胎或ETX-类胚胎构建中不同悬浮培养时间收集的类胚胎进行形态学检测，确定起始出现极化成腔表型对应的候选悬浮培养时间点；再对所述起始出现极化成腔表型对应的候选悬浮培养时间点收集的类胚胎进行单细胞测序，若该候选时间点的类胚胎中富集已知极化基因,则该候选时间点为极化成腔对应的悬浮培养时间点；
所述不同悬浮培养时间间隔12小时；
2)将所述EXE-类胚胎或ETX-类胚胎构建中极化成腔对应的悬浮培养时间点和其前期间隔12小时的时间点的收集的类胚胎的单细胞测序结果进行分析，选取与所述前期间隔12小时的时间点的测序结果相比，在所述极化成腔对应的悬浮培养时间点的测序结果中显著高表达的基因作为候选基因；
再从所述候选基因中选取在EB拟胚体中显著低表达或不表达的基因作为极化候选基因；
所述EB拟胚体为仅具备分化的能力且不能极化成腔；
3)从所述极化候选基因中确定未报道与极化成腔相关且与胚胎疾病相关的基因，命名为成腔候选基因，将所述成腔候选基因进行如下验证：
所述验证包括如下步骤：
3)-1)、敲除或抑制ESC细胞中成腔候选基因的表达，得到敲除成腔候选基因的ESC细胞；
3)-2)、将所述敲除成腔候选基因的ESC细胞和XENC细胞悬浮培养，重构得到EXE-类胚胎，检测所述EXE-类胚胎是否为成腔缺陷，若发生成腔缺陷，则所述成腔候选基因为或候选为成腔相关基因；若未发生成腔缺陷，则所述成腔候选基因不为或候选不为成腔相关基因；
或将所述敲除成腔候选基因的ESC细胞、TSC细胞和XENC细胞悬浮培养，重构得到ETX-类胚胎，所述ETX-类胚胎为成腔缺陷ETX-类胚胎，若发生成腔缺陷，则所述成腔候选基因为或候选为成腔相关基因；若未发生成腔缺陷，则所述成腔候选基因不为或候选不为成腔相关基因。
10.一种筛查或辅助筛查成腔异常胚胎或成腔异常类胚胎的方法，通过检测待测样品中Arf1基因或蛋白的表达筛查或辅助筛查成腔异常胚胎或成腔异常类胚胎。
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