CN116769650A - 一种油藏二氧化碳生物转化产甲烷的弗氏柠檬酸杆菌及其应用 - Google Patents
一种油藏二氧化碳生物转化产甲烷的弗氏柠檬酸杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种油藏二氧化碳生物转化产甲烷的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，于2022年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.25749。同时，本发明还提供所述弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)在油藏CO2生物转化产甲烷的应用。本发明提供的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，是一种可提高CO2生物转化甲烷的菌株，其在油藏环境中仍然能活跃的生长，将CO2转化为CH4，在油藏CO2埋存和生物转化产CH4等技术领域具有很好的应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于油田微生物技术领域，具体涉及一种油藏二氧化碳生物转化产甲烷的弗氏柠檬酸杆菌及其在提高油藏CO2生物转化产甲烷的应用。
背景技术
碳捕集、利用与封存技术( carbon capture，utilization and storage，CCUS)是一项渴望实现化石能源深度减排的关键性措施之一，预计到2050年该技术可贡献全球1/3的CO2减排量。目前CO2的大规模封存方式主要有地质封存和矿化封存等。适合CO2地质封存的场所主要包括深部咸水层、枯竭油气藏、煤层及开采中的油气藏。油藏作为一个天然的地质厌氧生物反应器，其中多种微生物可以相互协同将注入封存的 CO2通过生物途径转化为CH4，而CH4是目前所有环境中最清洁的碳氢化合物能源，是最受关注的潜在转化产物。
油藏是进行大规模CO2地质封存的天然场所，CO2封存后油藏中的CO2在被彻底化学圈闭前的数千年内其C元素均处于非稳定状态，因此可以通过微生物技术转化为CH4等高附加值产物，这一技术可大大提升枯竭油气藏开采价值和生命周期。
前人研究证明油藏固定CO2生物转化CH4技术有一定的可行性，并且具有很大的应用潜力。目前，已有试验证明可通过向油藏中注入无机营养物，激活产甲烷菌从而将CO2转化为CH4，实现CO2资源化利用。这一技术不仅能转化油藏中残余的CO2，提高其经济附加值，同时也可以提升枯竭油气藏的开采生命周期。产甲烷菌在自然界的碳循环中扮演了重要角色，其包括甲烷杆菌目、甲烷球菌目、甲烷微菌目、甲烷八叠球菌目、甲烷火球菌目、甲烷胞菌目，涉及 10 余科和 30 余属。
对于油藏环境中封存CO2生物转化CH4技术未来的研究与发展重点主要集中在以下方面：（1）开展相关优势菌株的筛选，优化和激活以及产甲烷菌竞争菌群的抑制；（2）明确该技术设计的主要菌株和菌群间相互关系以构建和控制合理菌群结构；（3）明确产甲烷菌产甲烷机智的主要限制因素，及其限速反应以提高反应速率CO2转化率。
发明内容
本发明提供一种油藏二氧化碳生物转化产甲烷的弗氏柠檬酸杆菌及其在提高油藏CO2生物转化产甲烷的应用。
一种油藏二氧化碳生物转化产甲烷的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)，为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii) 菌株YGgY-138，于2022年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 25749。
所述弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)在油藏CO2生物转化产甲烷的应用，所述油藏能进行CO2驱油或封存。
优选地，所述应用为在CO2驱油或封存过程中，向油藏注入CO2的同时，将所述弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)的种子液用注入水稀释至5-10wt%后注入油藏。
优选地，在稀释后，还需向其中加入营养剂，再注入油藏；其中，每升注入水含有的营养剂包括K2HPO4﹒3H2O 0.3-0.5g，KH2PO40.1-0.3g，NH4Cl0.8-1.2g，MgCl2﹒6H2O 0.08-0.12g，乙酸钠1.5-2.5g，甲酸钠1.5-2.5g，酵母膏0.8-1.2g，胰蛋白胨0.8-1.2g，L-盐酸半胱氨酸0.4-0.6g，0.1%刃天青0.8-1.2mL，微量元素浓缩液0.8-1.2mL，复合维生素浓缩液0.8-1.2mL，1%的Na2S﹒9H2O 18-22mL以及10%NaHCO38-12mL。
优选地，所述微量元素浓缩液如下：将氨基三乙酸10.0-14.0g, FeCl3﹒6H2O1.2-1.5g，CoCl2﹒6H2O0.020-0.026g，CaCl2﹒2H2O0.08-0.12g，MnCl2﹒4H2O0.08-0.12g，ZnCl20.08-0.12g，CuCl2﹒2H2O0.020-0.030g，H3BO30.08-0.12g，Na2MoO4﹒2H2O0.022-0.026,NaCl 0.8-1.2g，NiCl2﹒6H2O 0.10-0.14g，Na2SeO40.003-0.005g，Na2WO40.003-0.005g，依次溶解于1L去离子水中，4-6℃保存。
优选地，所述复合维生素浓缩液如下：将生物素1.0-3.0mg，叶酸1.0-3.0mg，维生素B68.0-12.0mg，维生素B14.0-6.0mg，维生素B120.008-0.012mg，核黄素4.0-6.0mg，烟酸4.0-6.0mg，泛酸钙4.0-6.0mg，对氨基苯甲酸0.8-1.2mg依次溶解于1L去离子水中，4-6℃保存。
本发明中弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)YGgY-138的生物保藏信息：
保藏日期：2022年9月16日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所保藏编号：CGMCC No.25749；
分类命名：弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)。
本发明的优点：
本发明提供的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)，是一种可提高CO2生物转化甲烷的菌株，其在油藏环境中仍然能活跃的生长，将CO2转化为CH4，在油藏CO2埋存和生物转化产CH4等技术领域具有很好的应用潜力。
附图说明
图1为菌株YGgY-138的16S rDNA的进化树；
图2为菌株YGgY-138的生物量与产CH4生物活性的关系；
图3为模拟油藏环境下反应体系中微生物的生物量随时间变化情况；
图4为模拟油藏环境下反应体系中CO2随时间变化情况；
图5为模拟油藏环境下反应体系中CH4随时间变化情况。
具体实施方式
实施例1
一. 本发明采用的培养基
1、富集培养基：取 K2HPO4﹒3H2O 0.4g，KH2PO40.2g，NH4Cl 1.0g，MgCl2﹒6H2O 0.1g，乙酸钠2.0g，甲酸钠2.0g，酵母膏1.0g，胰蛋白胨1.0g，L-盐酸半胱氨酸0.5g，0.1%刃天青1ml，将以上试剂依次加入1L去离子水中充分溶解后，用1mol/L盐酸调pH值到7.0，煮沸除氧，于121℃高压蒸汽灭菌15分钟；使用前再加入微量元素浓缩液1.0mL，复合维生素浓缩1.0mL，1%的Na2S﹒9H2O 20mL以及10%NaHCO310mL，以上4种溶液加入前均需用无菌滤器过滤除菌。
2、固体分离培养基：取 K2HPO4﹒3H2O 0.4g，KH2PO40.2g，NH4Cl 1.0g，MgCl2﹒6H2O0.1g，乙酸钠2.0g，甲酸钠2.0g，酵母膏1.0g，胰蛋白胨1.0g，L-盐酸半胱氨酸0.5g，0.1%刃天青1mL，琼脂15g，将以上试剂依次加入1L去离子水中充分溶解后，用1mol/L盐酸调pH值到7.0，煮沸除氧，于121℃高压蒸汽灭菌15分钟，待温度降至60℃以下时，用无菌滤器直接将微量元素浓缩液1.0mL，复合维生素浓缩1.0mL，1%的Na2S﹒9H2O 20mL以及10%NaHCO310mL依次加入后混匀，分装至厌氧管中。
3、微量元素浓缩液：将氨基三乙酸(NTA) 12.0g，FeCl3﹒6H2O1.25g，CoCl2﹒6H2O0.024g，CaCl2﹒2H2O0.1g，MnCl2﹒4H2O0.1g,ZnCl20.1g，CuCl2﹒2H2O0.025g，H3BO30.1g，Na2MoO4﹒2H2O 0.024g, NaCl 1.0g，NiCl2﹒6H2O 0.12g，Na2SeO40.004g，Na2WO40.004g依次溶解于1L去离子水中，4℃冰箱保存备用。
4、复合维生素浓缩液：将生物素2.0mg, 叶酸2.0mg，维生素B610.0mg，维生素B15.0mg，维生素B120.01mg，核黄素5.0mg，烟酸5.0mg，泛酸钙5.0mg，对氨基苯甲酸1.0mg依次溶解于1L去离子水中，4℃冰箱保存备用。
二. 弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)菌株的筛选
1、菌株的富集
将采自延长油田杏子川采油厂4℃保存的油井采出液10mL用无菌注射器在无菌厌氧操作箱中接菌入装有90mL富集培养基的厌氧培养瓶中，补加混合气体（N2:H2:CO2=85%:10%:5%），迅速封口，至于30℃厌氧培养箱中富集培养7天；然后取培养液10mL重新接菌入新的装有90mL富集培养基的厌氧培养瓶中继续培养7天，重复以上操作3次。
2、单菌株的分离
单菌株的分离采用Hungate滚管法。先用Hungate无氧操作把菌液稀释10000倍，并用注射器接种到装有融化后的固体分离培养基的厌氧试管中，该试管用密封性极好的丁基橡胶塞严密塞住后平放，置冰浴中均匀滚动，使含菌培养基布满在试管内表面上，然后于30℃恒温培养箱中培养7天，待菌落长出后，再次进行分离培养，直到完全分离出单菌株，命名YGgY-138；在4℃下、厌氧管中保存备用。
三. 单菌株YGgY-138的鉴定
分离的菌株通过比对16S rDNA序列来确定种属。使用PowerSoil DNA Isolationkit试剂盒提取菌株YGgY-138的基因组，并以此为模板，使用下列引物对16S rDNA序列进行PCR扩增：
上游引物（F27）：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，
下游引物（R1492）：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，
PCR反应体系如下：
2×Pfu Master Mix25μL，
上游引物2μL，
下游引物2μL，
模板，2μL
ddH2O至50μL；
PCR反应条件：预变性94℃ 3min；30次循环：变性94℃ 30s，退火57℃ 30s，延伸72℃ 2min；后续延伸72℃ 5min，4℃停止反应并保温；
得到的PCR产物经回收纯化后，送至上海美吉生物工程技术服务有限公司进行Sanger测序。所得序列经BLAST(NCBI)后，使用MEGA软件绘制进化树(图1)。最终确定菌株YGgY-138属于弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)属，命名为CitrobacterfreundiiYGgY-138。
所述菌株YGgY-138已于2022年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.25749，分类命名为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)。
四. 菌株YGgY-138的产CH4生物活性
采用厌氧培养箱进行厌氧操作，厌氧培养箱先用99.999%的高纯N2进行3次空气置换，再用H2/CO2(V/V=4 : 1)混合气进行空气置换，并一直保持H2/CO2状态；从厌氧管中(4℃保藏的YGgY-138)挑取单菌，接种于装有100mL富集培养基的体积为250mL的三角瓶中，盖紧瓶盖，于30℃厌氧培养箱中培养至对数生长期，得到弗氏柠檬酸杆菌的种子液，按0%、5%、10%、15%（v/v）接种量接种至新的富集培养基中，继续以H2/CO2(V/V=4 : 1)混合气为反应底物，30℃厌氧培养箱中培养10天，培养结束后，利用集气管采集反应瓶中气体，利用气相色谱测定甲烷含量；相当于每100mL培养基对应的H2/ CO2(V/V=4 : 1)为150mL；
通过考察弗氏柠檬酸杆菌接种量分别为0%、5%、10%、15%时的CH4产量（图2），发现随着弗氏柠檬酸杆菌接种量的增加，体系最终产甲烷量逐渐增加，尤其是在10%接种量的时候，体系产甲烷量迅速提高，反应结束CH4产量可达5.22mL, 而当体系生物接种量为15%时，反应体系CH4产量仍然继续增加，可达6.15mL，不过增加的幅度不大，说明当接种量大于或等于15%时，由于体系中营养物质浓度有限，体系中弗氏柠檬酸杆菌增殖到一定浓度后增加缓慢，即达到了稳定期，因此，反应体系最佳接种量为10%~15%v/v时，反应体系可得到较高的CH4产量。
五. 弗氏柠檬酸杆菌介导的油藏CO2生物转化产CH4高压物模试验
原料：
将油井采出液过滤并经过油水分离以后的水样与脱水后的原油按照体积比3:1重新混合后，得到油水混合样；
岩石矿物：取自延长油田杏子川采油厂长2储层，经打碎过筛，选取粒径为1~2mm的岩样作为岩石矿物；
每升油水混合样含有的营养剂包括K2HPO4﹒3H2O 0.4g，KH2PO40.2g，NH4Cl1.0g，MgCl2﹒6H2O 0.1g，乙酸钠2.0g，甲酸钠1.0g，酵母膏1.0g，胰蛋白胨1.0g，L-盐酸半胱氨酸0.5g，0.1%刃天青1.0mL，微量元素浓缩液1.0mL，复合维生素浓缩液1.0mL，1%的Na2S﹒9H2O20mL以及10%NaHCO310mL。
实验如下：
将360mL油水混合样，营养剂，40mL弗氏柠檬酸杆菌种子液，40g岩石矿物加入容积为500mL的高压反应釜中（固液比1:10）；同时，设置空白对照1如下：400mL油水混合样、40g岩石矿物，加入容积为500mL的高压反应釜中；空白对照2如下：400mL油水混合样+营养剂+40g岩石矿物，加入容积为500mL的高压反应釜中；随后将140mL 99.9%的CO2流体通过增压泵加压至8MPa导入反应釜，并通过外加的有磁力搅拌的加热装置调节反应釜的温度28~30℃，反应时间最少为30天，反应期间分别在第7天、14天、21天和30天取反应液5mL检测其OD600值来反映反应液中细菌的生物量（图3），同时取顶空气体测定气体中CO2和CH4含量，计算体系消耗的CO2量和产生的CH4量（图4、图5）。
由图3可知，本发明提供的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii) 菌株YGgY-138通过与岩石矿物、油水混合液、CO2流体等进行高压物模试验，结果显示：当反应体系中加入一定量的营养剂时，弗氏柠檬酸杆菌的生物量随着时间的延长迅速增加，在第30天时OD600可达0.75，而未加入营养剂和弗氏柠檬酸杆菌种子液的空白对照1和只加入了营养剂的空白对照2的生物量则上升的比较缓慢，空白对照1 OD600只有0.32，而空白对照2因为加入了营养剂，激活了水样中原有的产甲烷菌，因此OD600达到了0.5，但相对于加入了弗氏柠檬酸杆菌种子液的实验组，两个对照组的生物量的增加量都远远低于实验组。
由图4和图5可知，本发明提供的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii) 菌株YGgY-138通过与岩石矿物、油水混合液、CO2流体等进行高压物模试验，结果显示：在弗氏柠檬酸杆菌介导下，反应体系在第30天共消耗CO2为95.71mL，CO2消耗速率平均为3.19mL/d，同时，反应体系在第30天产CH4的总量为8.68mL，产甲烷速率为0.289mL/d，相对于空白对照1，体系内CO2消耗速率提高了3.1倍，产甲烷速率提高了4.5倍。
由此可知，本发明的弗氏柠檬酸杆菌，在油藏环境中仍然能活跃的生长，并通过一系列生化反应和油藏化学反应，将CO2转化为CH4，在油藏环境下可显著提高CO2转化为甲烷的速率，在油藏CO2埋存和生物转化产CH4等技术领域具有很好的应用潜力。
实施例2
弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)在油藏CO2生物转化产甲烷的应用，所述油藏能进行CO2驱油或封存：
由上述实施例1中高压物模试验可知，弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)在油藏环境下可显著提高CO2转化为甲烷的速率。因此，将所述弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)应用与油藏CO2生物转化产甲烷，所述应用具体如下：在CO2驱油或封存过程中，向油藏注入CO2的同时，将所述弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)的种子液用注入水稀释至5-10wt%后注入油藏。
所述弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)的种子液如下：采用厌氧培养箱进行厌氧操作，厌氧培养箱先用99.999%的高纯N2进行3次空气置换，再用H2/CO2(V/V=4 : 1)混合气进行空气置换，并一直保持H2/CO2状态；从厌氧管中(4-6℃保藏的YGgY-138)挑取单菌，接种于装有100mL富集培养基的体积为250mL的三角瓶中，盖紧瓶盖，以H2+CO2(V/V=4/1)混合气为电子供体和能源底物，于28-32℃厌氧培养箱中培养至对数生长期，得到弗氏柠檬酸杆菌的种子液。
其中，富集培养基每升反应液配方为：K2HPO4﹒3H2O0.3-0.5 g，KH2PO40.1-0.3g，NH4Cl 0.8-1.2g，MgCl2﹒6H2O 0.08-0.12g，乙酸钠1.5-2.5g，甲酸钠1.5-2.5g，酵母膏0.8-1.2g，胰蛋白胨0.8-1.2g，L-盐酸半胱氨酸0.4-0.6 g，0.1%刃天青0.8-1.2mL，去离子水1L，此溶液煮沸除氧，121℃高压蒸汽灭菌15分钟。使用前再加入微量元素浓缩液0.8-1.2mL，复合维生素浓缩液0.8-1.2mL，1%的Na2S﹒9H2O 18-22mL以及10%NaHCO38-12mL，以上4种溶液加入前均需用无菌滤器过滤除菌。
优选地，在稀释后，还需向其中加入营养剂，再注入油藏；其中，每升注入水含有的营养剂包括K2HPO4﹒3H2O 0.3-0.5g，KH2PO40.1-0.3g，NH4Cl0.8-1.2g，MgCl2﹒6H2O 0.08-0.12g，乙酸钠1.5-2.5g，甲酸钠1.5-2.5g，酵母膏0.8-1.2g，胰蛋白胨0.8-1.2g，L-盐酸半胱氨酸0.4-0.6g，0.1%刃天青0.8-1.2mL，微量元素浓缩液0.8-1.2mL，复合维生素浓缩液0.8-1.2mL，1%的Na2S﹒9H2O 18-22mL以及10%NaHCO38-12mL；
所述微量元素浓缩液如下：将氨基三乙酸10.0-14.0g, FeCl3﹒6H2O1.2-1.5g，CoCl2﹒6H2O0.020-0.026g，CaCl2﹒2H2O0.08-0.12g，MnCl2﹒4H2O0.08-0.12g，ZnCl20.08-0.12g，CuCl2﹒2H2O0.020-0.030g，H3BO30.08-0.12g，Na2MoO4﹒2H2O0.022-0.026, NaCl 0.8-1.2g，NiCl2﹒6H2O 0.10-0.14g，Na2SeO40.003-0.005g，Na2WO40.003-0.005g，依次溶解于1L去离子水中，4-6℃保存；
所述复合维生素浓缩液如下：将生物素1.0-3.0mg，叶酸1.0-3.0mg，维生素B68.0-12.0mg，维生素B14.0-6.0mg，维生素B120.008-0.012mg，核黄素4.0-6.0mg，烟酸4.0-6.0mg，泛酸钙4.0-6.0mg，对氨基苯甲酸0.8-1.2mg依次溶解于1L去离子水中，4-6℃保存。
Claims (6)
1.一种油藏二氧化碳生物转化产甲烷的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，其特征在于：其为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii) 菌株YGgY-138，于2022年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 25749。
2.权利要求1所述弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)在油藏CO2生物转化产甲烷的应用，其特征在于：所述油藏能进行CO2驱油或封存。
3.根据权利要求2所述弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)在油藏CO2生物转化产甲烷的应用，其特征在于：所述应用为在CO2驱油或封存过程中，向油藏注入CO2的同时，将所述弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的种子液用注入水稀释至5-10wt%后注入油藏。
4.根据权利要求3所述弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)在油藏CO2生物转化产甲烷的应用，其特征在于：在稀释后，还需向其中加入营养剂，再注入油藏；其中，每升注入水含有的营养剂包括K2HPO4﹒3H2O 0.3-0.5g，KH2PO40.1-0.3g，NH4Cl0.8-1.2g，MgCl2﹒6H2O0.08-0.12g，乙酸钠1.5-2.5g，甲酸钠1.5-2.5g，酵母膏0.8-1.2g，胰蛋白胨0.8-1.2g，L-盐酸半胱氨酸0.4-0.6g，0.1%刃天青0.8-1.2mL，微量元素浓缩液0.8-1.2mL，复合维生素浓缩液0.8-1.2mL，1%的Na2S﹒9H2O 18-22mL以及10%NaHCO3 8-12mL。
5.根据权利要求4所述弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)在油藏CO2生物转化产甲烷的应用，其特征在于：所述微量元素浓缩液如下：将氨基三乙酸10.0-14.0g, FeCl3﹒6H2O1.2-1.5g，CoCl2﹒6H2O0.020-0.026g，CaCl2﹒2H2O0.08-0.12g，MnCl2﹒4H2O0.08-0.12g，ZnCl20.08-0.12g，CuCl2﹒2H2O0.020-0.030g，H3BO30.08-0.12g，Na2MoO4﹒2H2O0.022-0.026,NaCl 0.8-1.2g，NiCl2﹒6H2O 0.10-0.14g，Na2SeO40.003-0.005g，Na2WO40.003-0.005g，依次溶解于1L去离子水中，4-6℃保存。
6.根据权利要求4所述弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)在油藏CO2生物转化产甲烷的应用，其特征在于：所述复合维生素浓缩液如下：将生物素1.0-3.0mg，叶酸1.0-3.0mg，维生素B68.0-12.0mg，维生素B1 4.0-6.0mg，维生素B120.008-0.012mg，核黄素4.0-6.0mg，烟酸4.0-6.0mg，泛酸钙4.0-6.0mg，对氨基苯甲酸0.8-1.2mg依次溶解于1L去离子水中，4-6℃保存。
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