CN116763992A

CN116763992A - 一种促内皮化多肽修饰的仿生心脏瓣膜及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN116763992A
Application number: CN202310812465.6A
Authority: CN
Inventors: 王云兵; 胡成; 杨立; 梁旭月
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2023-07-04
Filing date: 2023-07-04
Publication date: 2023-09-19

Abstract

本发明提供了一种促内皮化多肽修饰的仿生心脏瓣膜及其制备方法和用途，属于生物医用材料技术领域。本发明仿生心脏瓣膜是表面接枝2‑甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和半胱氨酸‑丙氨酸‑甘氨酸三肽的心包。本发明仿生心脏瓣膜材料采用2‑甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)和半胱氨酸‑丙氨酸‑甘氨酸(CAG)三肽共同修饰心包。本发明制备得到的仿生心脏瓣膜材料保持了戊二醛交联的心包优异的结构稳定性和力学性能的同时，具有良好的抗血栓能力和内皮化潜能，并且具有良好的抗炎和抗钙化的作用。本发明为制备性能更好的人工生物心脏瓣膜提供了新的思路和解决方案，具有良好的应用前景。

Description

一种促内皮化多肽修饰的仿生心脏瓣膜及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种促内皮化多肽修饰的仿生心脏瓣膜及其制备方法和用途。

背景技术

心脏瓣膜疾病是心血管疾病死亡的常见原因，影响着全球超过7400万患者，而且由于人口老龄化，这一数字还在增加。由于缺乏特异性药物，对于严重心脏瓣膜疾病患者来说，瓣膜植入和置换术是最佳的治疗方法。目前用于治疗心脏瓣膜疾病的商业化心脏瓣膜假体有机械心脏瓣膜(mhv)和生物心脏瓣膜(bhv)。自2015年以来，全球每年有30万人接受瓣膜置换术，到2050年，接受瓣膜置换术的患者人数可能高达80万。与mhv相比，bhv以其更高的血流动力学和更低的血栓发生率受到患者的青睐。bhv可通过经导管主动脉瓣植入术(transcatheter aortic valve implantation,TAVI)进行微创植入，具有不需要开胸、侵入最小、术后恢复快、风险较低的优点。基于以上优点，bhv越来越受到人们的青睐。

目前，大多数商业上可用的bhv是由戊二醛(Glut)交联的异种组织制备的，例如牛心包或猪心包(PP)。PP的主要成分是胶原蛋白和糖胺聚糖。Glut的处理可以稳定异种移植物的胶原蛋白，降低其免疫原性，改善bhv材料的力学性能。由于具有良好的血液相容性，bhv不需要终身抗凝治疗。然而，由于结构性瓣膜退行性变(SVD)，其使用寿命有限，这是由Glut引起的假体衰退的渐进和不可避免的进展，这会导致通过开胸干预重新更换bhv。SVD主要由Glut交联引起的细胞毒性、炎症、血栓形成和钙化引起。并且bhv置换引起的血栓事件是难以避免的。Heras发现，TAVI治疗后栓塞的发生率很高。据悉，TAVI和手术置换可因血栓形成而降低瓣膜活动性，这说明bhv血栓形成在临床上也是一个不可忽视的问题。血栓形成可能引起瓣膜小叶功能障碍和流体力学恶化，引起中风。

Glut的细胞毒性和异种组织的免疫原性可能引起炎症反应的激活。一旦植入人体，由于这些装置的化学性质较差，血浆蛋白和血小板在几分钟内吸附在植入的装置上，引起吸附的血浆蛋白从纤维蛋白原向纤维蛋白的构象转化，同时活化血小板。纤维蛋白和活化的血小板形成稳定的血栓，并引发炎症反应和钙化。bhv作为接触血液的医疗器械，其表面的物理化学性质直接影响其血液相容性。为了克服供过于求交联带来的缺陷，如血栓形成、内皮化不良和钙化，已经开发了几种策略。一些研究人员开发了一系列新颖的交联剂来替代Glut，如格尼平、碳二亚胺、多酚等，在一定程度上降低了瓣膜材料的细胞毒性，提高了瓣膜材料的生物相容性和抗钙化性能。然而，bhv材料在稳定性和力学性能方面仍存在一些不足，这限制了新型药剂交联bhv材料的临床使用。

与Glut交联的bhv材料已经在临床中使用了几十年。Glut的交联与胶原蛋白的活性氨基相互作用，降低了胶原蛋白酶的作用位点，从而提高了胶原蛋白的稳定性。由Glut交联的BHV材料的结构稳定性和力学性能已经得到了很好的验证。因此，目前有研究基于Glut交联对bhv材料进行改性，提高bhv材料的抗血栓形成和内皮化性能，延长bhv材料的使用寿命。有研究人员将聚乙二醇(PEG)、透明质酸(HA)等亲水聚合物引入bhv材料中，显著提高了bhv材料的细胞相容性和抗血栓形成性能。然而，亲水表面限制了植入bhv材料表面内皮细胞的生长，不利于bhv材料的内皮化。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种促内皮化多肽修饰的仿生心脏瓣膜及其制备方法和用途。

本发明提供了一种仿生心脏瓣膜材料，它是表面接枝2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸三肽的心包。

进一步地，所述心包为使用戊二醛交联后的脱细胞心包；

优选地，所述心包为使用戊二醛交联后的脱细胞猪心包。

进一步地，所述戊二醛交联后的脱细胞心包的制备方法包括如下步骤：

1)将心包浸泡在脱细胞溶液中进行脱细胞，得到脱细胞心包；

2)将脱细胞心包浸泡在戊二醛溶液中交联，得到戊二醛交联后的脱细胞心包；

优选地，

步骤1)中，所述脱细胞溶液为含有0.5％脱氧胆酸钠、0.5％十二烷基磺酸钠和1％青霉素-链霉素的混合水溶液；

和/或，步骤1)中，所述脱细胞的温度为25～40℃，脱细胞的时间为10～20小时；

和/或，步骤2)中，所述戊二醛溶液为戊二醛水溶液；

和/或，步骤2)中，所述交联的温度为25～40℃，交联的时间为7～10天；

更优选地，所述戊二醛水溶液的浓度为0.5～0.7wt％。

本发明还提供了一种制备前述的仿生心脏瓣膜材料的方法，它包括如下步骤：

(1)戊二醛交联后的脱细胞猪心包，对其表面进行氨基化处理，得到表面氨基化的心包；

(2)将氨基功能化的心包浸没在含降冰片烯二酸酐的溶液中反应，得到双键功能化的心包材料；

(3)将双键功能化的心包材料浸没在含2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的溶液中，加入过硫酸铵和亚硫酸氢钠，反应后得到表面接枝2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的心包；

(4)将表面接枝2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的心包浸没在含半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸三肽的溶液中反应，最终得到表面接枝2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸三肽的心包。

进一步地，步骤(1)中，所述氨基化处理是将心包浸没在含己二酸二酰肼的溶液中，于30～40℃下反应20～30小时。

进一步地，

步骤(1)中，所述含己二酸二酰肼的溶液还包含1-乙基-3-(3-三甲氨基丙基)卡二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺；

和/或，步骤(1)中，所述溶液的溶剂为MES缓冲液，MES缓冲液的pH值为4.0～7.4；

和/或，步骤(1)中，所述己二酸二酰肼在溶液中的浓度为0.02M～0.15M；

和/或，步骤(2)中，所述溶液的溶剂为PBS；

和/或，步骤(2)中，所述降冰片烯二酸酐溶液的浓度为2-5wt％；

和/或，步骤(2)中，所述反应时维持pH值为8～10；

和/或，步骤(2)中，所述反应为于30～40℃下反应20～30小时；

和/或，步骤(3)中，所述溶液的溶剂为水；

和/或，步骤(3)中，所述2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的浓度为0.5～2wt％；

和/或，步骤(3)中，将双键功能化的心包材料浸没在含2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的溶液中，于30～40℃下反应1～5小时后，加入过硫酸铵和亚硫酸氢钠，于30～40℃下反应20～30小时；

和/或，步骤(4)中，所述含半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸三肽溶液中还包含1-乙基-3-(3-三甲氨基丙基)卡二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺；

和/或，步骤(4)中，所述溶液的溶剂为MES缓冲液，MES缓冲液的pH值为4.0～7.4；

和/或，步骤(4)中，所述半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸三肽溶液的浓度为2～8mM；

和/或，步骤(4)中，所述反应为于30～40℃下反应20～30小时。

进一步地，

步骤(1)中，所述己二酸二肼、1-乙基-3-(3-三甲氨基丙基)卡二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:(1～4):(1～4)；

和/或，步骤(1)中，所述己二酸二酰肼在溶液中的浓度为0.05M；

和/或，步骤(2)中，所述降冰片烯二酸酐溶液的浓度为3wt％；

和/或，步骤(3)中，所述2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱溶液的浓度为1～2wt％；

和/或，步骤(3)中，所述过硫酸铵的浓度为40～50mM；

和/或，步骤(3)中，所述亚硫酸氢钠的浓度为40～50mM；

和/或，步骤(4)中，所述半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸三肽溶液的浓度为3mM；

和/或，步骤(4)中，所述半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸三肽、1-乙基-3-(3-三甲氨基丙基)卡二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为(0.2～0.8):1:2。

进一步地，

步骤(1)中，所述己二酸二肼、1-乙基-3-(3-三甲氨基丙基)卡二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:2:2；

和/或，步骤(2)中，所述调解pH采用氢氧化钠；

和/或，步骤(3)中，所述2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱溶液的浓度为1wt％；

和/或，步骤(3)中，所述过硫酸铵的浓度为40mM；

和/或，步骤(3)中，所述亚硫酸氢钠的浓度为40mM；

和/或，步骤(4)中，所述半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸三肽、1-乙基-3-(3-三甲氨基丙基)卡二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为0.3:1:2。

本发明还提供了前述的仿生心脏瓣膜材料在制备人工生物瓣膜中的用途。

进一步地，所述人工生物瓣膜为人工心脏瓣膜、人工肺瓣膜或人工静脉瓣膜。

为了解决现有技术中生物心脏瓣膜(bhv)存在的问题，本发明提供了一种仿生心脏瓣膜材料，本发明仿生心脏瓣膜材料采用2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)和半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸(CAG)三肽共同修饰心包。本发明制备得到的仿生心脏瓣膜材料保持了戊二醛交联的心包优异的结构稳定性和力学性能的同时，具有良好的抗血栓能力和内皮化潜能，并且具有良好的抗炎和抗钙化的作用。本发明为制备性能更好的人工生物心脏瓣膜提供了新的思路和解决方案，具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明仿生心脏瓣膜(MPC-CAG-PP)的制备示意图。

图2为MPC-PP和MPC-CAG-PP的制备与表征：A为不同材料的ATR-FTIR光谱；B为不同材料表面血小板的相对数量(mean±SD,n＝6)，**P＜0.01，***P＜0.001；C为不同材料经胶原酶处理24h后的失重率(mean±SD,n＝6)，****P＜0.0001；D为不同材料的热变性温度(mean±SD,n＝6)，*P＜0.05，***P＜0.001；E为力学参数描述；F为不同材料的极限抗拉强度(mean±SD,n＝6)，ns表示无显著差异；G为不同材料的伸长率(mean±SD,n＝6)，ns表示无显著差异；H为不同材料的切向模量(mean±SD,n＝6)，ns表示无显著差异。

图3为HUVECs与不同材料共同孵育1天后FDA荧光染色结果以及细胞增殖活性：A为FDA荧光染色结果；B为细胞增殖活性(平均值±SD，n＝6)，***P＜0.001。

图4为bhv材料的血液相容性结果：A为吸附的FITC-BSA和FITC-FBG的荧光显微镜图像；B为各样品吸附血小板后的SEM图像；C为吸附在各样品上的血小板的相对含量(mean±SD,n＝6)，P＜0.001***；D为溶血观察结果；E为不同材料的溶血率(平均值±SD,n＝6)，ns表示无显著差异。

图5为体外动静脉分流术(AV-shunt)实验结果：A为AV-shunt实验示意图；B为循环1小时后血液在不同材料表面的粘附情况；C为循环1小时后血液在不同材料表面的粘附情况的SEM图像。

图6为细胞毒性和内皮化分析结果：A为不同提取液培养的L929细胞活力(mean±SD,n＝6)，*P＜0.05，***P＜0.001；B为不同材料培养的HUVECs的相对增殖率(mean±SD,n＝6)，***P＜0.001；C为孵育1天和3天后，FDA对HUVECs细胞的染色情况；D为培养3天后VEGF浓度(mean±SD,n＝6)，***P＜0.001。

图7为RAW264.7在不同材料表面培养3天后炎症因子的表达情况和大鼠皮下植入7天和14天后的炎症反应结果：A为RAW264.7在不同材料表面培养3天后炎症因子IL-6的浓度(ean±SD，n＝6，***P＜0.001)；B为RAW264.7在不同材料表面培养3天后炎症因子IL-10的浓度(ean±SD，n＝6，***P＜0.001)；C为大鼠皮下植入7天和14天后的HE染色结果。

图8为大鼠皮下植入7天和14天后iNOS和CD206检测结果：A为iNOS免疫荧光图像；B为CD206免疫荧光图像；C为iNOS免疫荧光图像的定量统计；D为CD206免疫荧光图像的定量统计；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

图9为大鼠皮下植入30天和60天后bhv材料的钙化情况：A为钙化观察图像；B为ICP-OES定量测定钙离子含量(mean±SD,n＝6)，***P＜0.001；C为茜素红染色结果。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

材料：新鲜猪心包(PP)购自Venus Medtech,Inc.(杭州，中国)。戊二醛(Glut)和胶原酶I购自华夏试剂有限公司(中国成都)。半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸(CAG)购自ChinaPeptides Co.，Ltd.(苏州，中国)。己二酸二酰肼(ADH)和降冰片烯二酸酐(CA)购自EnergyChemicalCo,Ltd(Shanghai,China)。ELISA试剂盒、FITC-BSA和FITC-FBG购自北京Solarbio科技有限公司(北京，中国)。DMEM培养基、胎牛血清(FBS)和青霉素-链霉素组合购自赛默飞世尔科技有限公司(中国上海)。LDH试剂盒购自Beyotime生物技术有限公司(中国上海)。Aliza red和L929小鼠成纤维细胞购自ServiceBio Co.，Ltd.(中国武汉)。人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和巨噬细胞购于中国科学院细胞库。

本发明具体实施方式中的统计分析：所有统计分析结果均以均数±标准差表示。统计分析采用非配对t检验和单因素方差分析。通过计算最小显著性差异来确定组间差异，P<0.05认为具有统计学意义。

实施例1、本发明仿生心脏瓣膜(MPC-CAG-PP)的制备

本发明仿生心脏瓣膜(MPC-CAG-PP)的制备示意图如图1所示，首先，通过Glut-PP的羧基与己二酸二酰肼(ADH)的氨基之间的酰胺化反应，将ADH引入Glut-PP中，制得氨基功能化bhv材料(ADH-PP)。通过降冰片烯二酸酐(CA)与ADH-PP氨基之间的亲核加成-消除反应，进一步将降冰片烯二酸酐(CA)引入到ADH-PP中，制得双键功能化的bhv材料(CA-PP)。再将2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)引入CA-PP中，通过双键间自由基聚合得到MPC修饰的bhv材料(MPC-PP)。最后，将半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸(CAG)三肽通过CAG的羧基与MPC-PP的剩余氨基之间的酰胺化反应引入MPC-PP中，制备得到MPC和CAG共改性的BHV材料(MPC-CAG-PP)。

1、MPC-PP的制备

脱细胞猪心包(DPP)的制备：新鲜猪心包膜(由杭州启明医疗器械股份有限公司提供，运输全程保持在冰浴条件下)，用生理盐水清洗三次，并用镊子去除肉眼可见的结缔组织。然后将新鲜的猪心包膜浸泡在含有0.5％脱氧胆酸钠、0.5％十二烷基磺酸钠和1％青霉素-链霉素的混合水溶液中。在室温下置于摇床上持续震荡反应过夜后，用生理盐水洗去细胞碎片等杂质，得到脱细胞猪心包膜(DPP)，存放于4C冰箱中。

戊二醛交联猪心包(Glut-PP)的制备：将脱细胞猪心包膜裁剪成110mm x 110mm大小后固定在方形铁框上防止皱缩。然后，脱细胞猪心包膜置于0.625％(wt％)戊二醛水溶液中以100rpm的速度室温下持续摇晃反应7天，得到戊二醛交联猪心包(Glut-PP)。

将ADH(0.871g,5mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCHCl)(1.917g,10mmol)、n-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(0.5755g,10mmol)溶解于100mL 2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(MES)缓冲液(pH＝5.0)中，得到混合型MES缓冲液。将Glut-PP浸入上述混合型MES缓冲液中，37℃振荡24小时，得到氨基功能化bhv材料(ADH-PP)。

将ADH-PP浸泡在3％ CA(wt％)的PBS中，每隔2小时用氢氧化钠溶液调整pH值，保持在8，并在37℃下振荡24小时，得到双键功能化的bhv材料(CA-PP)。

CA-PP分别浸泡在0.5％、1％和2％(wt％)2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)水溶液中，37℃摇匀3小时，MPC水溶液中加入40mM过硫酸铵和40mM亚硫酸氢钠(SHS)，37℃摇匀24小时，得到MPC-PP，分别标记为MPC-PP0.5、MPC-PP1和MPC-PP2。

通过MPC与CA-PP的双键自由基聚合，将MPC引入到bhv材料中。红外光谱检测结果如图2A所示，Glut-PP中醛基在1734cm^-1处的C＝O拉伸振动和2919cm^-1、2849cm^-1处的C-H拉伸振动消失，在MPC-PP表面出现了1041cm^-1处的C-N拉伸振动，说明MPC被成功引入到CA-PP中。

从兔子的耳缘静脉抽取全血，放到枸橼酸钠采血管中，然后离心，1500rpm离心20分钟，从上层收集富血小板血浆(PRP)。将Glut-PP、MPC-PP0.5、MPC-PP1和MPC-PP2切成圆形块(n＝6)，置于96孔板中，用PBS洗涤3次。每孔加入100μL PRP，37℃孵育。孵育1小时后，将样品用PBS彻底洗净，置于新的96孔板上。使用LDH试剂盒检测材料表面的血小板相对含量，并使用微孔板读取器(Synergy H1,Biotek Instruments,Inc.，Vermont)获得490nm处的吸光度值。通过血小板吸附实验选择合适的MPC浓度进行进一步研究。

如图2B所示，与Glut-PP相比，MPC-PP表面吸附的血小板含量明显减少，且随着MPC浓度的增加，其抗血小板粘附性能进一步提高。当MPC浓度达到1％后，抗血小板粘附性能不再随着MPC的增加而提高，因此，本发明选择1％作为MPC的最终浓度进行进一步的研究。

2、MPC-CAG-PP的制备

将MPC-PP1分别浸入1mM、3mM和5mM的CAG MES缓冲液(pH＝5.0)中，在MES缓冲液中加入10mM EDCHCl和20mM NHS，在37℃下振荡24小时，得到MPC-CAG-PP，分别标记为MPC-CAG-PP1、MPC-CAG-PP3和MPC-CAG-PP5。

以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。

下述试验例中除特别说明外：MPC-PP均为实施例1制备的MPC-PP1，MPC-CAG-PP均为实施例1制备的MPC-CAG-PP3；同一试验例中各样品大小相同。

试验例1、内皮细胞在MPC-CAG-PP表面的增殖和粘附

1、实验方法

将实施例1制备的MPC-CAG-PP1、MPC-CAG-PP3和MPC-CAG-PP5(n＝6)在75％乙醇溶液中灭菌12小时，用无菌PBS洗涤。将样品加入48孔板中，每孔加入500μL含有20000个人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的DMEM完全培养液。另外，空白孔中加入等量的HUVECs作为阳性对照。培养1d后，丢弃培养基上清，向孔中加入200μL含10％ CCK-8的DMEM培养基，将板置于CO₂培养箱中培养1小时。用微孔板仪测定490nm处的吸光度值。此外，在孔板中加入含有0.1％(v/v)FDA(荧光素双醋酸酯)的DMEM全培养基，对HUVECs进行染色，染色1分钟后，用荧光显微镜观察粘附在样品上的HUVECs。

2、实验结果

如图3A所示：与Glut-PP相比，MPC-CAG-PP1、MPC-CAG-PP3和MPC-CAG-PP5表面粘附的HUVECs更多，细胞形态呈纺锤状。而Glut-PP表面的HUVECs则呈圆形，这主要是残醛基团的细胞毒性所致。MPC-CAG-PP3表面的HUVECs数量与MPC-CAG-PP5相似，高于MPC-CAG-PP1。如图3B所示，CCK8试剂盒的定量检测结果与荧光染色结果一致。这些结果表明，CAG的引入促进了bhv材料表面内皮细胞的粘附和增殖。当CAG浓度在1～3mM之间时，内皮细胞的相对增殖率随CAG浓度的增加而增加。当CAG浓度达到5mM时，内皮细胞的增殖率没有明显增加。因此，本发明以3mM作为最终反应浓度制备MPC-CAG-PP(MPC-CAG-PP3)。

试验例2、胶原酶降解试验

1、实验方法

实施例1中的脱细胞PP(DPP)以及实施例1制备的Glut-PP、MPC-PP和MPC-CAG-PP(1cm*1cm,n＝6)冷冻干燥，称量，质量记为w₀。将上述样品浸泡在含有125U/mL胶原酶(0.1M,CaCl₂ 0.05M,pH＝7.4)的Tris缓冲液中，37℃孵育24小时。孵育后，酶处理过的样品用超纯水冲洗3次，冷冻干燥后再次称重，质量记为w₁，计算样品失重率的公式如下：

2、实验结果

通过胶原酶消化法直接评价胶原稳定性。如图2C所示，经胶原酶处理后的Glut-PP、MPC-PP和MPC-CAG-PP的失重率明显低于DPP，失重率均低于5％，而DPP的失重率达到85％。说明戊二醛的交联对于维持心包材料胶原蛋白的稳定性至关重要，而MPC和CAG的修饰不会破坏戊二醛交联后的稳定性，这保证了心脏瓣膜在体内使用的稳定性。

试验例3、热变性温度测试

1、实验方法

将实施例1制备的Glut-PP、MPC-PP和MPC-CAG-PP(1cm*1cm,n＝6)用超纯水洗涤3次，压平，冷冻干燥，密封在铝坩埚中。通过差示扫描量热法(DSC)在N₂气氛下研究样品的热变性温度(TA Instruments,Newcastle,DE)。在仪器运行过程中，温度范围为40℃～100℃，升温速率为每分钟10℃。记录温度曲线出现最高值的位置。

2、实验结果

通过差示量热法测量材料的热变性温度，进一步检测bhv材料的热稳定性。如图2D所示，Glut-PP、MPC-PP和MPC-CAG-PP的热变性温度分别为84.0℃、86.3℃和86.7℃。与Glut-PP相比，MPC-PP和MPC-CAG-PP的热变性温度升高，说明MPC-PP和MPC-CAG-PP的热稳定性有所提高。

结果说明：MPC和CAG对戊二醛交联的PP进行改性后，不仅保持了bhv材料抵抗胶原酶降解的能力，并提高了bhv材料的热稳定性。

试验例4、单轴拉伸试验

1、实验方法

将实施例1制备的Glut-PP、MPC-PP和MPC-CAG-PP(1cm*5cm,n＝6)浸泡在PBS中。检测前测量样品在三个不同位置的厚度，并计算厚度的平均值。将这些样品固定在两端的样品钳上。样品夹两端的初始距离设置为2cm。样品以每分钟18毫米的速度拉伸，直到用单轴拉力测试仪(BioTester,100N称重传感器，Waterloo,Ontario,Canada)拉断。最终的切向模量、极限抗拉强度和伸长率按照文献(F.Yang,H.He,L.Xu,L.Jin,G.Guo,Y.Wang,Inorganic-polymerization crosslinked tissue-siloxane hybrid as potentialbiomaterial for bioprosthetic heart valves,J Biomed Mater Res A 109(5)(2021)754-765.)所述方法计算。

2、实验结果

bhv在体内经历了复杂的流体动力环境，遭受剪切应力、弯曲变形和瓣叶张力。bhv材料应具有良好的力学性能，才能在体内保持长期稳定和正常的生理功能。单轴拉伸试验参数如图2E所示。通过单轴拉伸试验对改性bhv材料的力学性能进行评价。极限抗拉强度和切向模量分别揭示了bhv材料所能承受的最大拉应力和bhv的柔韧性，伸长率很好地反映了bhv材料在极限拉伸下的延性。如图2F、2G、2H所示，Glut-PP和MPC-CAG-PP的极限抗拉强度、伸长率和切向模量均无差异。这些结果表明，MPC和CAG共同改性保持了Glut-PP良好的力学性能。

试验例5、蛋白质吸附试验

1、实验方法

将实施例1制备的Glut-PP、MPC-PP和MPC-CAG-PP(1cm*1cm,n＝12)置于48孔板中，PBS洗涤3次。取200μL异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA，1mg/mL)或异硫氰酸荧光素标记的人纤维蛋白原(FITC-FBG，0.1mg/mL)加入孔板中，37℃放置孵育2小时。孵育后，用PBS洗涤3次，去除未吸收的蛋白。用激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM 800,DE)观察吸附蛋白。

2、实验结果

控制材料表面的蛋白质吸附是预防小叶血栓形成的关键措施。采用FITC-BSA和FITC-FBG对改性bhv材料的蛋白质抗性进行评价。如图4A所示，与Glut-PP相比，MPC-PP和MPC-CAG-PP表面吸附的蛋白质荧光强度明显下降，说明MPC的引入降低了蛋白质的吸附，而CAG的引入对抗蛋白质吸附没有不利影响。

试验例6、血小板吸附试验

1、实验方法

从兔子的耳缘静脉抽取全血，放到枸橼酸钠采血管中，然后离心，1500rpm离心20分钟，从上层收集富血小板血浆(PRP)。将实施例1制备的Glut-PP、MPC-PP和MPC-CAG-PP(h＝0.5cm,n＝6)置于96孔板中，用PBS洗涤3次。在孔中加入100μL PRP，37℃静置孵育，孵育1小时后，用PBS彻底洗涤样品，置于干净的96孔板上。使用LDH试剂盒，利用微孔板读取器定量检测一半样品的吸附血小板。另一半样品用2.5％(wt％)Glut生理盐水溶液处理1小时，用梯度乙醇脱水。通过扫描电镜(SEM)观察血小板在样品表面的吸附情况。

2、实验结果

血小板吸附实验结果如图4B和4C所示：与Glut-PP相比，MPC-PP和MPC-CAG-PP表面吸附的血小板数量明显减少，SEM分析结果与LDH实验结果一致。说明MPC的引入降低了血小板的吸附，而CAG的引入对抗血小板吸附没有不利影响。

试验例7、溶血试验

1、实验方法

从兔子的耳缘静脉抽取全血，放到枸橼酸钠采血管中，然后离心，1500rpm离心20分钟，收集下层红细胞，用PBS(红细胞和PBS的体积比1:10)稀释。将实施例1制备的Glut-PP、MPC-PP和MPC-CAG-PP(h＝1cm,n＝6)用PBS彻底洗涤，加入2ml离心管中。每个离心管中分别加入稀释后的血细胞200μL和PBS 800μL。PBS和超纯水分别作为阴性对照和阳性对照。各组37℃孵育，孵育2小时后，将上清液轻轻加入1.5mL离心管中，3000rpm离心，离心5分钟后，在541nm处测定血红蛋白吸光度值(OD)。溶血率计算如下:

2、实验结果

低水平溶血(<2％)是评价血液接触装置血液相容性的重要标准。如图4D和4E所示，Glut-PP、MPC-PP和MPC-CAG-PP的溶血率均低于2％的标准，说明MPC-CAG-PP具有优异的血液相容性。

试验例8、体外动静脉分流试验(A-V分流)

1、实验方法

将实施例1制备的Glut-PP、MPC-PP和MPC-CAG-PP(1cm*1cm,n＝4)紧贴导管内壁置入。新西兰兔用1％戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，静脉注射肝素(300U/kg)抗凝。术中采用1％利多卡因皮下注射局部麻醉。血液通过体外循环从主动脉流向对面颈外静脉，与导管内的碎片充分接触。循环1小时后，取下导管，用生理盐水冲洗，清除未凝固的血液。将标本固定在2.5％(w/v)Glut生理盐水溶液中1小时，用乙醇脱水。扫描电镜(SEM)观察片上血栓形成情况。

2、实验结果

如图5B所示，循环1小时后，许多红细胞粘附在Glut-PP表面并形成轻微血栓形成，而MPC-PP和MPC-CAG-PP未见明显变化。如图5C所示，SEM显示Glut-PP表面吸附了大量红细胞，而MPC-PP和MPC-CAG-PP表面则只出现了少量红细胞。

试验例5～8的结果共同说明：MPC和CAG的共修饰策略显著提高了bhv材料的抗血栓形成性能。

试验例9、细胞毒性试验

1、实验方法

将实施例1制备的Glut-PP、MPC-PP和MPC-CAG-PP(1cm*1cm,n＝6)用75％乙醇消毒过夜，用无菌PBS洗去残留乙醇。将这些样品浸泡在DMEM完全培养液中，置于CO₂培养箱中72小时，获得用于细胞毒性试验的提取液。将小鼠成纤维细胞(L929)细胞按每孔20000个细胞的数量接种于96孔板中，在CO₂培养箱中孵育。孵育12小时后，用200μL提取液替代原完整培养基，分别培养24小时和72小时。选择在DMEM完全培养基中培养的细胞作为对照。培养后，用CCK-8kit检测活细胞。

2、实验结果

如图6A所示，与Glut-PP提取液培养的L929细胞相比，MPC-PP和MPC-CAG-PP提取液培养的L929细胞活力显著提高，说明MPC和CAG修饰瓣膜比Glut-PP具有更好的细胞相容性。

试验例10、内皮细胞的粘附和增殖

1、实验方法

实施例1制备的Glut-PP、MPC-PP和MPC-CAG-PP(1cm*1cm,n＝6)在75％乙醇中灭菌12小时，用无菌PBS洗涤去除残留乙醇，置于48孔板中。在每个样品孔中加入含有HUVECs(20000个)的DMEM全培养基，将HUVECs加入空白孔中作为阳性对照，分别在CO₂培养箱中培养1天和3天。孵育后，收集3天上清液，-80℃冷冻。随后，在每个样品孔中加入200μL含10％CCK-8试剂的DMEM全培养基，在CO₂培养箱中孵育。孵育1小时后，将100μL混合溶液加入干净的96孔板中，在450nm处测量吸光度值。吸光度强度与活细胞数成正比。此外，将含有0.1％双醋酸荧光素(FDA)的DMEM全培养液加入样品孔中，对活细胞进行1分钟的染色。用荧光显微镜观察活细胞的数量和形态。相对增殖率(RPR)计算如下：

PRP＝OD_sample/OD_positive×100％

如图6B所示，与Glut-PP相比，MPC-PP组和MPC-CAG-PP组内皮细胞的PRP在培养1天和3天后均显著升高，而MPC-CAG-PP组的升高更为显著。如图6C所示，荧光染色结果与CCK8试剂盒结果一致。

试验例11、内皮细胞分泌VEGF

1、实验方法

按照试验例10所述方法，取出-80℃冷冻培养3天的上清液，用ELISA Kit测定VEGF浓度。在450nm处测定吸光度。

2、实验结果

如图6D所示，Glut-PP的上清液中VEGF含量极低，说明HUVECs在增殖过程中无活性，而MPC-CAG-PP组的培养基上清液中VEGF浓度显著高于Glut-PP和MPC-PP，说明MPC-CAG-PP表面的HUVECs具有增殖活性。

上述细胞毒性和内皮细胞增殖实验表明，MPC和CAG的引入减轻了bhv材料的细胞毒性，CAG还提高了其内皮化性能，这有利于增强bhv材料在体内的生物相容性和血液相容性。

试验例12、体外炎症试验

1、实验方法

体外炎症实验采用小鼠单核巨噬细胞(RAW 264.7)。实施例1制备的Glut-PP、MPC-PP和MPC-CAG-PP(1cm*1cm,n＝6)用75％乙醇消毒12小时，用无菌PBS洗去残留乙醇，加入48孔板。每个样品孔中加入500μL DMEM全培养液(含细胞20000个)，置于CO₂培养箱中培养12小时，直至细胞贴壁。培养基中加入无菌脂多糖(LPS)溶液，使终浓度保持在1μg/mL，激活RAW 264.7。孵育1小时后，加入DMEM完全培养液替代原培养基，在CO₂培养箱中培养。培养72小时后，收集上清液，用ELISA试剂盒测定IL-6、IL-10的浓度。

2、实验结果

RAW 264.7用LPS激活，通过炎症因子的表达类型和含量研究不同bhv的抗炎性能。IL-6是一种促炎因子，在急性炎症反应中诱导淀粉样蛋白，降解周围的ECM。此外，IL-6还能诱导间质细胞分泌骨形态发生蛋白，促进钙化的形成。而IL-10作为一种抗炎因子，可以下调炎症反应，减轻炎症对组织造成的损伤。如图7A和7B所示，RAW 264.7在Glut-PP表面分泌的IL-6浓度明显高于MPC-PP和MPC-CAG-PP，而IL-10在Glut-PP表面的表达明显低于MPC-PP和MPC-CAG-PP。体外炎症实验结果显示，引入MPC和CAG通过调节巨噬细胞分泌的免疫因子类型，促进IL-10的表达，抑制IL-6的表达，从而抑制炎症反应。

试验例13、皮下植入

1、实验方法

实施例1制备的Glut-PP、MPC-PP和MPC-CAG-PP(1cm*1cm,n＝12)用75％乙醇消毒过夜，植入前用PBS洗涤3次，去除残留乙醇。4％戊巴比妥钠(wt％)按1mL/100g腹腔注射，麻醉Sprague Dawley(SD)大鼠。将麻醉大鼠背部的大鼠皮毛剃光，并切开1.5-2cm的切口。将样品碎片植入切口，压平，缝合切口。皮下植入7天和14天后，将样品与周围组织一起取出，用4％多聚甲醛固定液固定，并用石蜡包埋。制备切片，进行HE染色。

2、实验结果

如图7C所示，苏木精-伊红(HE)染色结果显示，在皮下植入7天和14天后，Glut-PP周围组织中出现了许多炎症细胞，MPC-PP和MPC-CAG-PP周围组织中的浸润性炎症细胞低于Glut-PP。说明MPC-PP和MPC-CAG-PP具有良好的抗炎作用。

试验例14、免疫荧光染色法

1、实验方法

按照试验例13所述方法在SD大鼠皮下植入材料7d和14d后，收集标本及附着组织，生理盐水洗涤，4％多聚甲醛固定液固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋。采用5μM切片进行组织学分析。采用免疫荧光染色法进一步研究体内免疫应答。首先用抗原修复液修复抗原，并与1％ BSA溶液孵育30分钟。然后加入荧光标记的一抗，4℃孵育过夜。染色中使用的第一抗体为小鼠抗大鼠CD206抗体和兔抗大鼠iNOS抗体，分别标记M2巨噬细胞和M1巨噬细胞。采用激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM 800,DE)观察免疫组化结果。

2、实验结果

如图8A～8D所示，免疫荧光结果显示，M1巨噬细胞(iNOS阳性)主要出现在Glut-PP周围，而M2巨噬细胞(CD206阳性)主要出现在MPC-PP和MPC-CAG-PP的周围组织。M1巨噬细胞分泌促炎因子，在炎症早期发挥显著作用，促进炎症的发生发展。M2巨噬细胞在炎症晚期分泌抗炎因子，避免过度炎症反应造成组织损伤。

体内炎症反应的评价进一步表明，与Glut-PP相比，MPC-CAG-PP通过MPC和CAG共修饰降低MI巨噬细胞的表达，促进M2巨噬细胞的表达，有效抑制瓣膜植入后的炎症反应。且与MPC-PP相比，MPC-CAG-PP抗炎效果显著提高。

试验例15、体内钙化分析

1、实验方法

按照试验例13所述方法在SD大鼠皮下植入材料30和60天后，收集样品及其附着组织，制作切片，并用茜素红染色。另一部分样品用PBS洗涤，去除包裹在样品中的纤维组织。将样品冻干、称重，用6M盐酸在98℃下消化12小时。用超纯水稀释消化后的溶液，用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)定量测定钙离子浓度。

2、实验结果

钙化是导致Glut交联BHV材料失效的关键因素。钙化会使小叶变脆，失去其作为软组织材料所特有的弹性特性。Glut-PP中的醛、羧基等钙结合基团和炎症反应会加速钙化过程。如图9A所示，Glut-PP有明显的钙化，而MPC-PP和MPA-CAG-PP宏观上未见明显钙化。通过钙离子浓度测定可知(图9B)：皮下植入30天和60天后，Glut-PP出现严重钙化；植入60天后MPC-CAG-PP钙离子浓度显著低于MPC-PP。说明与Glut-PP相比，MPC-PP和MPC-CAG-PP可以显著抑制钙化，而MPC-CAG-PP抑制钙化的能力优于MPC-PP。茜素红染色结果(图9C)与ICP-OES结果一致。上述结果说明：MPC-CAG-PP显著提高了bhv材料的抗钙化性能，且效果优于Glut-PP和MPC-PP，同时引入MPC和CAG可以有效地减少钙化的发生。

综上，为了有效克服由Glut交联引起的易形成血栓、内皮化困难和严重钙化的问题，本发明提供了一种仿生心脏瓣膜材料，本发明仿生心脏瓣膜材料采用2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)和半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸(CAG)三肽共同修饰心包。本发明制备得到的仿生心脏瓣膜材料保持了戊二醛交联的心包优异的结构稳定性和力学性能的同时，具有良好的抗血栓能力和内皮化潜能，并且具有良好的抗炎和抗钙化的作用。本发明为制备性能更好的人工生物心脏瓣膜提供了新的思路和解决方案，具有良好的应用前景。

Claims

1.一种仿生心脏瓣膜材料，其特征在于：它是表面接枝2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸三肽的心包。

2.根据权利要求1所述的仿生心脏瓣膜材料，其特征在于：所述心包为使用戊二醛交联后的脱细胞心包；

优选地，所述心包为使用戊二醛交联后的脱细胞猪心包。

3.根据权利要求2所述的仿生心脏瓣膜材料，其特征在于：所述戊二醛交联后的脱细胞心包的制备方法包括如下步骤：

优选地，

和/或，步骤2)中，所述戊二醛溶液为戊二醛水溶液；

更优选地，所述戊二醛水溶液的浓度为0.5～0.7wt％。

4.一种制备权利要求1～3任一项所述的仿生心脏瓣膜材料的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述氨基化处理是将心包浸没在含己二酸二酰肼的溶液中，于30～40℃下反应20～30小时。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

和/或，步骤(2)中，所述溶液的溶剂为PBS；

和/或，步骤(2)中，所述反应时维持pH值为8～10；

和/或，步骤(2)中，所述反应为于30～40℃下反应20～30小时；

和/或，步骤(3)中，所述溶液的溶剂为水；

和/或，步骤(4)中，所述反应为于30～40℃下反应20～30小时。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

和/或，步骤(2)中，所述降冰片烯二酸酐溶液的浓度为3wt％；

和/或，步骤(3)中，所述过硫酸铵的浓度为40～50mM；

和/或，步骤(3)中，所述亚硫酸氢钠的浓度为40～50mM；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

和/或，步骤(2)中，所述调解pH采用氢氧化钠；

和/或，步骤(3)中，所述过硫酸铵的浓度为40mM；

和/或，步骤(3)中，所述亚硫酸氢钠的浓度为40mM；

9.权利要求1～3任一项所述的仿生心脏瓣膜材料在制备人工生物瓣膜中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述人工生物瓣膜为人工心脏瓣膜、人工肺瓣膜或人工静脉瓣膜。