CN116763759A - 一种复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合材料及其制备方法和应用，该复合材料包括：涂层以及包封在所述涂层内部的铁掺杂碳点。本发明提供的复合材料(多功能纳米粒子(Fe/CPP NPs))具有肿瘤微环境(TME)刺激响应特性，可以靶向到达肿瘤的位置释放Fe³⁺，增强肿瘤细胞中的铁死亡效应，实现协同治疗相关疾病。

Description

一种复合材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于靶向肿瘤治疗技术领域，具体涉及一种复合材料及其制备方法和应用。

背景技术

目前，化学/光热疗法(CT/PTT)、光热/光动力疗法(PTT/PDT)和化学/光热/化学动力学疗法(CT/PTT/CDT)等多种组合已显示出优异的抗肿瘤效果。尽管多模式疗法对肿瘤细胞具有杀伤作用，但由于肿瘤微环境(TME)中固有的生理障碍，例如缺氧、过氧化氢(H₂O₂)和谷胱甘肽(GSH)的过度表达，导致其疗效仍然有限。

碳点(Carbon nanodots，CDs)是在21世纪初发现的一种小于10nm的碳质纳米材料，通常由碳、氢和氧组成。由于具备制备成本低、尺寸小、水溶性好、药用活性、生物相容性高等特点，碳点在生物医疗领域展现了独有的优势和应用前景。

当前，碳点应用于肿瘤诊疗领域的研究仍处于探索阶段。有研究人员用凝胶包覆碳点及阿霉素，用来进行成像和肿瘤治疗，其中碳点作为荧光成像的中心，仅仅起到成像的作用，肿瘤治疗主要依靠阿霉素的化疗作用。即，现有的碳点技术，无法满足针对复杂肿瘤微环境进行有效治疗的需求，拓展治疗模式的方式仍局限于共载抗癌药物(例如阿霉素)等。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明提供了一种复合材料及其制备方法和应用。

根据本发明的一个方面，提供了一种复合材料，包括：涂层以及包封在所述涂层内部的铁掺杂碳点。

优选地，所述涂层含有PAE-PEG。

优选地，谷胱甘肽可触发所述铁掺杂碳点的解离。

根据本发明的另一个方面，提供了一种制备上述复合材料的方法，包括：制备铁掺杂碳点；包封所述铁掺杂碳点。

优选地，制备铁掺杂碳点，包括：向含有氨基酸和硝酸铁的水溶液A中加入苯胺和过硫酸铵，获得沉淀；将所述沉淀溶解后进行水热反应、过滤、透析、干燥，获得所述铁掺杂碳点，其中氨基酸为组氨酸。

优选地，包封所述铁掺杂碳点，包括：将含有所述铁掺杂碳点的水溶液B和含有PAE-PEG的氯仿溶液C混合，获得混合溶液；将所述混合溶液与PVA水溶液混合后进行均质化处理、蒸发、离心，获得包封所述铁掺杂碳点的涂层。

优选地，在搅拌下，将所述苯胺和所述过硫酸铵按先后顺序加入所述溶液A中。

优选地，水热反应的条件包括：温度为260℃，时间为12h。

优选地，透析选用800-1000Da透析袋进行。

根据本发明的又一个方面，提供了以上复合材料在制备治疗肿瘤药物中的应用。

优选地，所述肿瘤为黑色素瘤。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：根据本发明提供的复合材料，一方面有效解决了肿瘤微环境(TME)中固有生理障碍(例如缺氧和过氧化氢(H₂O₂)和谷胱甘肽(GSH)的过度表达)对治疗手段的限制，另一方面，还同时促进细胞内抗氧化能力下降和脂质活性氧(ROS)积累，促进细胞铁死亡。

本实验构建的Fe/CPP NPs，外面包裹的PAE-PEG是酸触发降解材料，在肿瘤微环境的低pH下会释放出FeCDs。FeCDs具有双重GSH消耗能力，首先以组氨酸为碳源制备的碳点本身具有GSH消耗能力，Fe³⁺的引入可以放大碳点的GSH消耗能力。

本发明公开的复合材料可以在肿瘤微环境(TME)中释放铁掺杂碳点，谷胱甘肽(GSH)进一步诱导铁掺杂碳点的有效解离和还原，还原后的Fe²⁺有效催化H₂O₂产生羟基自由基(·OH)，该复合材料在实现以上化学动力学疗法(CDT)和细胞内氧化应激放大治疗效果的同时，还显著提高了脂质活性氧(ROS)的积累，促进了细胞铁死亡。即，本发明提供了一种靶向肿瘤协同治疗的技术方案，有效解决了现有技术中无法满足针对复杂肿瘤微环境进行有效治疗的问题。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:

图1示出了本发明实施例1中铁掺杂碳点(FeCDs)的形态特征图；

图2示出了本发明实施例1中铁掺杂碳点FeCDs以及复合材料(Fe/CPP NPs)的刺激反应特性结果；

图3示出了本发明实施例2中体外实验的细胞筛选过程、细胞内化方式和细胞ROS水平的测定结果；

图4示出了本发明实施例3中复合材料对细胞溶血实验的检测结果；

图5示出了本发明实施例3中体内实验结果，包括对肿瘤生长的测定、小鼠体重的检测和肿瘤大小重量的测定结果；以及

图6示出了本发明实施例3中器官组织和肿瘤的H&E染色结果。

具体实施方式

以下列举的实施例是为了让本领域的技术人员更清楚去理解本发明。需要说明的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用，仅作为说明性的实施例。以下实施例中所提及的原料、试剂或装置，如无特殊说明，均可从商业途径得到，或通过已知现有的方式获得。

本发明提供了一种复合材料及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用，该复合材料(多功能纳米粒子(Fe/CPP NPs))具有肿瘤微环境(TME)刺激响应特性，可以靶向到达肿瘤的位置释放Fe³⁺，增强肿瘤细胞中的铁死亡效应。

铁死亡(Ferroptosis)是一种铁依赖性的，区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型的细胞程序性死亡方式。铁死亡的主要机制是，在二价铁或酯氧合酶的作用下，催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化，从而诱导细胞死亡；此外，还表现为抗氧化体系(谷胱甘肽系统)的调控核心酶GPX4的降低。触发铁死亡可用于肿瘤治疗，特别是根除对常规疗法有抵抗力的侵袭性恶性肿瘤。

本发明提供的复合材料，包括：涂层以及包封在涂层内部的铁掺杂碳点。制备复合材料的方法，包括：制备铁掺杂碳点；以及包封铁掺杂碳点。考虑到Fe³⁺与CDs表面丰富的官能团的配位能力，通过组装Fe³⁺修饰的CDs和PAE-PEG(FeCDs@PAE-PEG)，制备了具有TME刺激响应的多功能纳米粒子(命名为Fe/CPP NPs)。

具体来说，制备复合材料(多功能纳米粒子(命名为Fe/CPP NPs))包括以下步骤。

(1)将氨基酸和硝酸铁溶于水，再加入苯胺和过硫酸铵反应4h，得到沉淀，其中，氨基酸为组氨酸，硝酸铁为Fe(NO₃)₃·9H₂O；

(2)将所得沉淀溶解于水中，水热法在空气中260℃加热12h；

(3)将所得溶液通过0.22μm滤膜过滤之后，使用透析膜(MWCO：500-1000)将溶液透析；

(4)将透析液真空干燥得到粉末(棕色粉末)，制得铁掺杂碳点；

(5)将铁掺杂碳点溶解于水中，添加到溶解在氯仿的聚缩醛-聚乙二醇(PAE-PEG)中，得到混合物；

(6)将混合物与聚乙烯醇(PVA)溶液均质化，25℃下蒸发有机溶剂后离心得到Fe/CPPNPs。

采用上述方法所制得的Fe/CPP NPs可以在肿瘤微环境(TME)中释放FeCDs，GSH的存在可以诱导Fe³⁺的有效解离和还原。GSH将Fe³⁺还原为Fe²⁺后，Fe²⁺通过芬顿反应有效催化H₂O₂并产生羟基自由基(·OH)。

本发明还提供了一种靶向协同治疗肿瘤的方法，包括以下步骤。

S1.Fe/CPP纳米粒子的检测：包括FeCDs中Fe³⁺的离解含量测定，GSH消耗量的测量，Fe/CPP NPs的弱酸刺激响应分解，和FeCDs的化学动力学治疗活性测试。

S2.体外实验，包括细胞培养以及类型的选择，细胞毒性测定，细胞摄取方式的测定，细胞中的活性氧(ROS)检测。

S3.体内实验，包括小鼠的适应性饲养、接种和给药治疗，材料的溶血试验，组织学染色试验，蛋白印迹验证。

步骤S1中为了测量GSH触发的Fe³⁺还原，将FeCDs和GSH分散在PBS溶液中。然后，将混合溶液透析后，将透析液与1,10-菲咯啉溶液混合，并在室温下孵育。

步骤S1中使用5,50-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)研究GSH活性水平。

步骤S1中为了确定pH激活的FeCDs释放，将Fe/CPP NPs溶解在相应的释放缓冲液(pH 7.4、pH 6.8和pH 5.5PBS缓冲液)中。

步骤S1中，在FeCDs存在下，以3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)为过氧化物酶底物，催化H₂O₂氧化检测CDT活性。通过测量2-羟基对苯二甲酸的产量来分析FeCDs的CDT活性。

步骤S2中选择了四株不同的细胞，包括4T1鼠乳腺癌细胞系(4T1)、B16F0鼠黑色素瘤细胞系(B16F0)、人肝癌细胞系(HepG2)细胞和人结直肠腺癌细胞系(HT-29)。

步骤S2中细胞毒性实验选择MTT比色法进行验证。

步骤S2中使用荧光探针CM-H2DCFA监测ROS的产生。

步骤S3中将悬浮在PBS中的B16F0细胞(50μL，1×10⁶个细胞/mL)皮下注射到小鼠皮下。小鼠在肿瘤生长10天后用于体内研究。

步骤S3中批准的协议指定最大肿瘤大小为100mm³或更大，持续3天且无消退迹象。

步骤S3中为了评估体内抗肿瘤作用，将B16F0荷瘤小鼠随机分为三组并接受以下治疗：(1)i.p.注射PBS，(2)仅i.p.注射CPP NPs(60μL，12.5mg mL^-1)，(3)仅i.p.注入Fe/CPPNPs(60μL，12.5mg mL^-1)。定期记录肿瘤体积和小鼠体重，直至治疗后第15天。

步骤S3中，在处理后第15天处死小鼠以收获肿瘤和主要器官。最后，将组织包埋、切片并用苏木精和伊红(H&E)染色进行观察。

本发明提供了以下具体实施例。

实施例1

本实施例提供了一种复合材料，包括：涂层以及包封在涂层内部的铁掺杂碳点。具体而言，提供了一种组装Fe³⁺修饰的CDs和PAE-PEG(FeCDs@PAE-PEG)，制备了具有TME刺激响应的多功能纳米粒子(命名为Fe/CPP NPs)，其制备方法包括以下步骤。

(1)将组氨酸和硝酸铁溶于水，再加入苯胺和过硫酸铵反应4h，得到沉淀；

(2)将所得沉淀溶解于水中，水热法在空气中260℃加热12h；

(3)将所得溶液通过0.22μm滤膜过滤之后，使用透析膜(MWCO：500-1000)将溶液透析；

(4)将透析液真空干燥得到粉末，制得铁掺杂碳点；

(5)将铁掺杂碳点溶解于水中，添加到溶解在氯仿的PAE-PEG中，得到混合物；

(6)将混合物与PVA溶液均质化，25℃下蒸发有机溶剂后离心得到Fe/CPPNPs。

使用不同碳源制备的碳点会具备不同的活性，甚至不具备活性。以组氨酸(His)和Fe(NO₃)₃的络合物为前体，过硫酸铵为引发剂，苯胺为还原剂，通过原位聚合制备聚(His)铁络合物。然后以所制备的配合物为前驱体，通过水热法合成了FeCDs，过硫酸铵是引发剂，苯胺是还原剂，这个顺序不可改变。Fe³⁺的引入可以放大GSH的消耗能力，同时与TME中过量的H₂O₂原位反应生成高度氧化的·OH。这种用于治疗癌症的协同自放大疗法策略通过GSH的双重消耗发挥其治疗作用。TEM图像显示，合成的Fe/CPP NPs表现出明确的球形核壳形状和约50nm的均匀尺寸(图1A)。此外，DLS测量的Fe/CPP NPs的平均流体动力学直径约为50nm(图1C)。如HRTEM图像所示，FeCDs表现出独特的晶体结构，并且分散良好，平均直径为2.6nm(图1B)。由于附着在表面的羧(-COOH)数量，CDs显示负zeta电位(-11.53mV)。当与Fe³⁺结合时，FeCDs负zeta电位增加至-4.56mV。Fe/CPP NPs的zeta电位经测量为5.10mV(图1D)。

实施例2

多功能纳米粒子(命名为Fe/CPP NPs)的刺激反应特性包括以下步骤。

(1)FeCDs中Fe³⁺的离解含量测定；

(2)GSH消耗量的测量；

(3)Fe/CPP NPs的弱酸刺激响应分解；

(4)FeCDs的化学动力学治疗活性。

实施例1中，没有Fe³⁺修饰的CDs样品通过以下条件制备：将组氨酸溶解在水中，高温高压下通过水热法，得到棕色溶液。所得溶液通过0.22μm滤膜过滤，将过滤后的溶液通过透析膜(MWCO：500-1000Da)对超纯水透析后冷冻。

FeCDs中Fe³⁺的解离含量测定：Fe³⁺可以消耗GSH，将自身还原为Fe²⁺，并将GSH氧化为L(-)-谷胱甘肽(氧化形式)(GSSG)。Fe³⁺的还原通过1,10-菲咯啉进行评估，1,10-菲咯啉与Fe²⁺反应形成橙色，在512nm处具有吸光度的复合物(图2A)。可以清楚地看到溶液的颜色由透明变为橙色，紫外-可见检测在512nm处出现特征峰，证明Fe³⁺已被还原。通过紫外-可见光谱评估GSH触发的Fe³⁺释放量的准确量化。1mg mL^-1FeCDs在24小时时释放的Fe³⁺量为7.08±1.41μgmL^-1，表明GSH的存在可以诱导Fe³⁺的有效解离和还原。

GSH消耗量的测量：在巯基存在下，无色DTNB转化为黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸，在412nm处具有最大吸收。Fe³⁺和GSH之间的氧化还原反应也会导致GSH耗尽，这可以通过使用商业检测试剂盒的GSH溶液中GSSG/GSH比率的变化来证明(图2B)。由于Fe³⁺和GSH之间会发生氧化还原反应，GSH的消耗随着FeCDs浓度的不同而增加。同时，组氨酸不具有消耗GSH的能力，而CDs具有一定的消耗GSH的能力，但不如FeCDs(图2C)。该特性对于提高基于ROS的肿瘤治疗效率具有重要意义，因为GSH是生物系统中众所周知的ROS清除剂。GSH可将Fe³⁺还原为Fe²⁺，同时酸性介质中H⁺与金属离子之间的静电斥力增强，削弱Fe³⁺与CDs之间的配位能力，从而导致Fe/CPP NPs的解体。

Fe/CPP NPs的弱酸刺激响应分解：Fe/CPP NPs表现出酸性pH响应药物释放模式(图2D)。在2小时内，约23.80±1.48％的Fe/CPP NPs在pH 5.5下释放，并且在24小时内约释放约50.50±0.88％。然而，当生理pH值为7.4时，2小时内仅释放3.20±0.27％，随后在24小时内释放较慢(～13.80±0.36％)。这种现象可归因于外涂层材料PAE-PEG的pH依赖性。

FeCDs的化学动力学治疗活性：含铁材料可在弱酸性介质中通过类芬顿反应有效催化H₂O₂并产生羟基自由基(·OH)。FeCDs可促进TMB的氧化，由H₂O₂介导产生在652nm处具有紫外线吸收的蓝色物质。吸收峰的强度与FeCD的浓度成正比。随着FeCDs浓度的增加，蓝色产品也会增加(图2E)。FeCDs的·OH生成特性可以使用对苯二甲酸二钠(TA)作为特异性探针来确定。·OH的产生根据HA的荧光强度进行评估，因为TA与·OH反应会产生高荧光的2-羟基对苯二甲酸(HA)。如图2F所示，当FeCDs添加量恒定时，荧光强度随着溶液pH值的降低而增加，表明酸性催化条件有利于反应的发生，FeCDs对酸性TME有响应。结果表明，FeCDs可以在肿瘤酸性环境中催化H₂O₂分解为·OH，从而引发CDT。此外，发现来自TA、H₂O₂和FeCDs混合物的FL强度比CDs强得多，验证了对H₂O₂的高效响应生成·OH以及随之而来的FeCDs的CDT能力。

实施例3

本实施例提供一种靶向肿瘤协同治疗方案，包括黑色素瘤和实施例1制得的Fe/CPP NPs。该靶向肿瘤协同治疗方案包括以下步骤。

(1)细胞培养以及类型的选择；

(2)细胞毒性测定；

(3)细胞摄取方式的测定；

(4)细胞中的活性氧(ROS)检测。

对于体外CDT，通过MTT测定研究了与组氨酸、CDs和FeCDs孵育后的细胞活力。不同浓度的组氨酸、CDs、FeCDs对四种癌细胞系的细胞毒性如图3A-D所示。可以看出，即使组氨酸浓度达到800μgmL^-1时4种细胞的存活率仍保持在80％以上。相反，随着FeCDs和CDs浓度的增加，B16F0细胞的细胞活性迅速下降。45.55μg mL^-1的FeCDs和91.47μg mL^-1的CDs达到B16F0细胞的IC50值，表明FeCDs对B16F0细胞的细胞毒性高于其他癌细胞。因此，选择B16F0细胞作为后续实验的细胞模型。这一发现可能归因于在特定TME条件下通过芬顿反应和GSH消耗促进了·OH的产生。通过将B16F0细胞与CDs或FeCDs一起孵育4小时并使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)成像来研究细胞内化。CDs和FeCDs分布在细胞质中，在细胞膜上聚集，不进入细胞核。来自CDs或FeCDs核心的强荧光信号可以在CDs或FeCDs处理的B16F0细胞的细胞质中可视化，表明B16F0细胞中CDs或FeCDs通过能量依赖性内吞途径进行有效的细胞内吞作用(图3E)。然而，CDs显示出较差的细胞成像效果可能是因为表面上大量的-COOH阻止了CD进入细胞。FeCDs的细胞显像优于CDs，这可以归因于铁作为通道对酶中心的作用，对细胞摄取更多的FeCDs起到积极作用。此外，使用2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为FL指标进一步估计细胞ROS水平。正如预期的那样，CDs和FeCDs以剂量依赖的方式增加了ROS。空白组未观察到明显的ROS生成，但用不同浓度的FeCDs和CDs培养30min后细胞ROS明显增加，说明·OH产生。用FeCDs处理细胞后产生ROS的能力更强，表明·OH和¹O₂的组合有效提高了ROS应激。FeCDs组和CDs组(40μg·mL^-1)的ROS水平分别比空白组高约3倍和2倍。总的来说，CDs和FeCDs在体外表现出TME刺激响应FL成像和协同CDT抗肿瘤特征，具有良好的选择性。

实施例4

本实施例提供一种靶向肿瘤协同治疗方案，包括黑色素瘤和实施例1制得的Fe/CPP NPs。该靶向肿瘤协同治疗方案包括以下步骤。

(1)小鼠的适应性饲养、接种和给药治疗；

(2)材料的溶血试验；

(3)组织学染色试验；

(4)蛋白印迹验证。

通过溶血试验评估CDs、FeCDs、CPP NPs和Fe/CPP NPs的血液相容性，以确定它们在抗肿瘤应用中的安全性。即使在200μg·mL^-1的最高浓度下，CDs、FeCDs、CPP NPs和Fe/CPPNPs也表现出低溶血活性(<5％)(表1)。与阳性组相比，在CDs、FeCDs和Fe/CPP NPs中没有观察到明显的红细胞颜色，这意味着纳米组件具有高血液相容性(图4)。

在肿瘤治疗过程中，每三天测量每只小鼠的肿瘤大小和体重(图5A)。不同处理组的肿瘤生长抑制曲线如图5B所示。正如预期的那样，肿瘤生长曲线清楚地表明Fe/CPP NPs对肿瘤治疗有显着影响，并且具有统计学意义。CPP NPs组对肿瘤生长有一定的抑制作用，但远不及Fe/CPP NPs组。Fe/CPP NPs组和CPP NPs组在治疗期间没有显着减轻体重。它仅在第一次给药后略有下降，然后恢复正常生长(图5C)。通过分离每组的肿瘤组织，所有小鼠的肿瘤大小和重量如图5D、5E所示。表明，Fe/CPP NPs组的肿瘤重量和大小明显低于PBS组，暗示Fe/CPP NPs可以在体内获得抗肿瘤作用。PBS组的平均肿瘤重量为2.79±0.49g，CPP NPs组为1.55±0.31g，Fe/CPP NPs组为0.58±0.11g(表2)。

表1.CDs、FeCDs、CPP NPs和Fe/CPP NPs的溶血测定

组织学研究在检查Fe/CPP NPs和CPP NPs对小鼠器官的毒性方面更可靠。为了验证治疗效果，从小鼠获得肿瘤用于评估癌细胞凋亡。对不同组小鼠的肿瘤切片进行H&E染色，观察到PBS组肿瘤细胞增殖活跃，细胞核染蓝较多。而Fe/CPP NPs组的癌细胞细胞核出现浓缩、收缩并呈深色染色，甚至细胞间质出现红细胞，说明癌细胞发生了明显的凋亡和坏死。很明显，Fe/CPP NPs组除肿瘤外，所有小鼠器官如肝、心、肾、肺、脾与PBS组相似，无明显组织病理学异常。因此，Fe/CPP具有抗肿瘤活性，对内脏无毒性。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下。

(1)本发明通过轻松组装Fe/CPP NPs构建了智能抗癌治疗平台，该平台具有TME刺激响应和增强CDT协同治疗的显着特征。值得注意的是，Fe³⁺的引入不仅提供了CDT功能(通过与H₂O₂反应产生·OH)，而且还有效地消耗了肿瘤中的GSH，导致细胞内氧化应激放大并增强了ROS相关的治疗效率。

(2)在体外观察到ROS相关治疗的激活，仅对癌细胞具有增强的治疗效果。体内结果证实了Fe/CPP NPs在肿瘤部位的蓄积能力得到改善，并且具有优异的抗肿瘤效果，而且全身毒性很小。本发明一方面提出了解决CDs在肿瘤生物医学中应用的小尺寸限制问题的策略，另一方面通过充分利用TME，开发了靶向肿瘤协同治疗方案。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种复合材料，其特征在于，包括：涂层以及包封在所述涂层内部的铁掺杂碳点。

2.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述涂层含有PAE-PEG。

3.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于，谷胱甘肽可触发所述铁掺杂碳点的解离。

4.一种制备如权利要求1至3任一项所述复合材料的方法，其特征在于，包括：

制备铁掺杂碳点；

包封所述铁掺杂碳点。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，制备铁掺杂碳点，包括：

向含有氨基酸和硝酸铁的水溶液A中加入苯胺和过硫酸铵，获得沉淀；

将所述沉淀溶解后进行水热反应、过滤、透析、干燥，获得所述铁掺杂碳点。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包封所述铁掺杂碳点，包括：

将含有所述铁掺杂碳点的水溶液B和含有PAE-PEG的氯仿溶液C混合，获得混合溶液；

将所述混合溶液与PVA水溶液混合后进行均质化处理、蒸发、离心，获得包封所述铁掺杂碳点的涂层。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在搅拌下，将所述苯胺和所述过硫酸铵按先后顺序加入所述溶液A中。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，水热反应的条件包括：温度为260℃，时间为12h；透析选用800-1000Da透析袋进行。

9.权利要求1至3任一项所述的复合材料在制备治疗肿瘤药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为黑色素瘤。