CN116747243A - 一种治疗心肌梗死的细胞制剂和细胞外基质类似物和应用 - Google Patents
一种治疗心肌梗死的细胞制剂和细胞外基质类似物和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种治疗心肌梗死的细胞制剂和细胞外基质类似物和应用。本发明的细胞制剂主要成分为人心房细胞外基质，实验证实了人心房三月龄的细胞外基质(3M‑ECM)在体内体外均能促进心肌细胞增殖，保护小鼠心脏免于心肌梗死造成的损伤，以及人心房3M‑ECM类似物能够促进心肌细胞增殖，主要诱导免疫耐受。本发明的细胞直接和细胞外基质类似物不仅提供了治疗心梗的新方法，还加快啮齿类动物研究成果的临床转化。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是关于一种治疗心肌梗死的细胞制剂和细胞外基质类似物和应用。
背景技术
心肌梗死(myocardial infarction，MI)简称心梗，是一种常见的急性心血管系统疾病，主要由于供应心脏血液流动的主要血管闭塞，血流中断，从而导致心肌的缺血性坏死，属于急性冠状动脉综合征范畴。心肌梗死是成年人心衰的主要病因。心衰的关键原因在于有正常收缩功能的心肌细胞的大量减少。因此，促进内源性心肌细胞的增殖再生以取代收缩功能受损的心肌细胞可以有效缓解或逆转心力衰竭的症状。但人和啮齿类动物心肌细胞存在较大的差异，因而啮齿类动物有效的治疗心肌梗死或心衰的方法在人身上大多无效，人和啮齿类动物在心脏再生中存在鸿沟。
人心肌细胞和啮齿类动物在许多方面均存在不同。例如，啮齿类动物心肌细胞多为双核，而人心肌细胞则为单核；啮齿类动物肌节成分为MYH6，而人为MYH6；在病理条件下(如心梗或者肥厚)，人心肌细胞并不改变细胞核数量，啮齿类动物则进行核分裂并增加数量。此外，人心肌成纤维细胞较啮齿类动物更加难以进行基因操纵和修饰。最重要的是众多在啮齿类动物中有效的治疗心梗或者心衰的方法并不能改善人心脏的功能表现。所以，人和动物的心脏再生存在一鸿沟。啮齿类动物的研究表明，只有来自心房的细胞外基质可以促进心肌细胞增殖。人心房细胞外基质是否能促进心肌细胞增殖并不清楚。
中文专利CN106606512A，公开日2017.05.03，公开了一种用于治疗心肌梗死的混合细胞制剂及制备方法与应用。该混合细胞制剂由活性成分和溶剂组成；活性成分主要为CTs和CSCs。对急性心肌梗死心脏的缺血区和缺血边缘区实施该混合细胞制剂移植，能有效促进经移植的CSCs或心肌内源性CSCs，及其它来源干细胞在心梗边缘区存活、分化与增值，有效修复与再生缺血心肌缺血区严重受损的由CTs构成的细胞网络，从而有利于梗死心肌的再生。该混合细胞制剂对急性心肌梗死实施移植治疗后，在减小梗死面积，改善心梗心脏心功能等疗效要优于单独使用CSCs，BMSCs和CTs的疗效。因此，可将其制备成用于治疗心肌梗死的药物或医疗器械进行应用。另一中文专利CN110302212A，公开日2019.10.08，公开了一种用于治疗急性心肌梗死的细胞制剂及制备方法，所述制剂的制备方法包括以下步骤：(1)从健康成人骨髓中通过密度梯度离心的方法获得单个核细胞；(2)免疫磁珠筛选骨髓单个核细胞以获得BMSC；(3)对步骤(2)中获得BMSC进行流式分选，获得RCN1+CD271+的细胞亚群；(4)对获得的细胞亚群进行处理，制成制剂。本发明在现有的BMSC提取技术的基础上，发明了一种利用细胞表面抗原标记，阶梯式特异性分离具有高心肌分化能力的细胞亚群的方法，处理后获得了用于治疗急性心肌梗死的RCN1+CD271+的细胞亚群制剂，克服了现阶段干细胞治疗的有效成分少，疗效不佳等问题。
而目前关于本申请的一种治疗心肌梗死的细胞制剂和细胞外基质类似物和应用还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种治疗心肌梗死的细胞制剂和细胞外基质类似物和应用。
本发明的第二个目的是，提供一种治疗心肌梗死细胞外基质类似物。
本发明的第三个目的是，提供一种应用
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：一种治疗心肌梗死的细胞制剂，所述细胞制剂的制备方法包括以下步骤：
1)人心房细胞外基质(ECM)先剪成小块，经SDS脱细胞处理后，制备成冻干粉；
2)称重后经胰酶和木瓜蛋白酶消化后，制备成ECM溶液；
3)用氢氧化钠调节pH值至7.4后得细胞制剂。
作为一个优选例，所述步骤1)中的人心房细胞外基质选自三月龄，SDS浓度为1％；所述步骤2)中的消化条件为4℃；所述步骤3)中细胞制剂的终浓度为1mg/mL。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种治疗心肌梗死的细胞外基质类似物，一种治疗心肌梗死的细胞外基质类似物，其特征在于，所述的细胞外基质为人心房三月龄细胞外基质。
更优选地，所述的细胞外基质类似物包含7个已知的在心肌细胞增殖过程中有重要作用的蛋白以及3个氧化还原相关蛋白。
作为一个优选例，所述的蛋白为FBN2、CSPG2、CAV1、BRP44、ARGN、FIS1和MEF2A；所述的氧化还原相关蛋白为COX5A、NDUFA11和NDUFB4。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：上述的细胞制剂以及的细胞外基质类似物在制备治疗心肌梗死的药物或医疗器械中的应用。
本发明优点在于：
1.首次揭示了人心肌细胞增殖转化期的转录组图谱和蛋白质图谱。
2.首次揭示人心房3M-ECM在体内体外均能促进心肌细胞增殖，保护小鼠心脏免于心肌梗死造成的损伤。
3.人心房3M-ECM类似物能够促进心肌细胞增殖，主要诱导免疫耐受。
附图说明
附图1为3M心房中具有丰富的细胞周期活性的心肌细胞(CM)。(A)Ki67阳性CMs的代表图。Ki67(绿色)、DAPI(蓝色)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)(红色)。星号表示Ki67阳性非CMs，箭头表示Ki67阴性CMs。(B)Ki67阳性CM的数量。p<0.0001，n＝10名患者，每个患者检查50个切片。(C)pHH3阳性CMs的代表图。pH H3(绿色)、DAPI(蓝色)和cTnT(红色)。(D)pHH3阳性CMs的定量。p<0.0001，n＝10名患者，每个患者检查50个切片。(E)3M心房中AuroraB阳性CM的代表图。AuroraB(绿色)、DAPI(蓝色)和cTnT(红色)。(F)Aurora B阳性CMs的定量。p＝0.0095，n＝10名患者，每个患者检查50个切片。(G)流式细胞仪显示约99％的纯化细胞为cTnT-阳性。(H)CMs中Ki67 mRNA的相对表达。p＝0.0002，n＝10名患者。(I)CMs中cyclin D2mRNA的相对表达。p＝0.0013，n＝10名患者。(J)CMs中Aurkb mRNA的相对表达。p＝0.0001，n＝10名患者。
附图2为3M-ECM在体外和体内促进CM增殖。(A)人心房心肌切片，用1％十二烷基硫酸钠(SDS)脱细胞，BD：脱细胞前；AD：脱细胞后。(B)随后将脱细胞细胞外基质(ECM)研磨成细粉末。(C)用ECM处理的Ki67阳性iPSC-CM的代表性图像。Ki67(绿色)、DAPI(蓝色)和cTnT(红色)。箭头表示Ki67阳性iPSC CM。(D)来自(A)的Ki67阳性iPSC CM的定量。p<0.0001，n＝10场，3个独立实验。(E)CMs中Ki67 mRNA的相对表达。p<0.0001，n＝3。(F)使用人ECM治疗MI的程序。P42：出生后第42天；AS：心房ECM溶液(0.01mg/mL)。(G)心肌梗死结扎示意图和TTC染色剖面图。BF：明场。(H)TTC染色的代表图。红色显示存活心肌；白色代表坏死。(I)ECM治疗小鼠梗死面积的量化。(J)梗死区代表性TUNEL阳性细胞。(K)TUNEL阳性细胞的定量。(L)P84处Ki67阳性CM的代表性图像。DAPI(蓝色)、Ki67(绿色)和SAA(红色，肌聚α-肌动蛋白)。(M)P84处Ki67阳性CM的定量。AA：邻近区域；RA：偏远地区**与对照AA相比，p<0.01；##与对照组RA相比，p<0.01；@@p<0.01，与1年AA相比；$$与1年RA相比，p<0.01。(N)在P124时，3M-ECM处理的心脏MI区域出现了新肌肉的代表。(O)P124时MI区域的纤维化代表。(P)MI心脏纤维化的量化。C：MI控制；1Y：1Y-ECM；3M：3M-ECM。(Q)ECM治疗小鼠的代表性M型超声心动图。显示舒张末期(长箭头)和收缩末期(短箭头)。(R)通过超声心动图测量心脏功能，FS：射血分数。
附图3为人类心房CM增殖转变的转录组图。(A)差异表达基因(DEG)的火山图。在3M和1Y心房之间观察到约344个DEG，由119个上调基因和225个下调基因组成。(B)DEG的Venn图。两组中约有14674个基因表达，其中519个基因仅在3M心房中表达，342个基因在1Y心房中表达。(C)DEG聚类图。使用log10(FPKM)值进行聚类。红色表示上调的基因，蓝色表示下调的基因。红色表示log10(FPKM)值高，蓝色表示log10值低。(D)通过qRT-PCR验证了前20个上调基因。
附图4为人类心房CM增殖转变转录组图的生物信息学分析。(A)最重要的30个GO术语(Biological_Process，BP)。纵坐标代表GO术语，而横坐标表示GO术语富集的显著性水平。(B)30个最重要的GO项(摩尔函数，MF)。纵坐标代表GO术语，横坐标表示GO术语富集的显著性水平。(C)30个最重要的GO项(Cellular_Component，CC)。纵坐标代表GO术语，横坐标表示GO术语富集的显著性水平。(D)30条最重要的KEGG途径。纵坐标描述GO术语，横坐标表示GO术语富集的显著性水平。
附图5为CM增殖过渡期间人心房ECM的蛋白质组图。(A)差异表达蛋白(DEP)的火山图。3M-ECM和Y ECM之间有167个DEP，其中88个蛋白上调，79个蛋白下调。(B)DEP的聚类图。每组有三个合并样本。同一组内每个合并样本中的蛋白质簇彼此相似，但与其他组不同。(C)DEP的主成分分析表明3M-ECM不同于1Y-ECM。(D)蛋白质组图的GO注释。(E)DEP主要介导氧化还原过程，囊泡介导的转运是前10个富含BP的术语。BP：生物过程；CC：细胞成分；MF：分子功能。(F)DEPs的亚细胞定位表明，22.61％的蛋白质是线粒体蛋白，21.74％的蛋白质是细胞核蛋白，18.26％的蛋白质是质膜蛋白。(G)在88个上调蛋白中，7个先前报道的促进CM增殖的蛋白的表达水平。(H)先前报道的促进CM增殖的7种蛋白质的亚细胞位置和分子功能。
附图6为3M-ECM模拟物有助于小鼠从MI中恢复心脏。(A)3M-ECM模型的公式。(B)使用3M-ECM模拟物治疗MI的程序。P：产后一天。(C)Ki67阳性CMs的代表性图像。AA：相邻区域；RA：偏远地区；DAPI(蓝色)、Ki67(绿色)和SAA(红色，肌色素α肌动蛋白)。(D)Ki67阳性CMsAA的量化：邻近区域；RA：偏远地区*p<0.05，与ShamAA相比；#与Sham RA相比，p<0.05；@与MIAA相比，p<0.05；$与MI RA相比，p<0.05。(E)pHH3阳性CMs的代表性图像。AA：相邻区域；RA：偏远地区；DAPI(蓝色)、pHH3(绿色)和SAA(红色，肌聚α肌动蛋白)。(F)pHH3阳性CMsAA的定量：邻近区域；RA：偏远地区*p<0.05，与ShamAA相比；#与Sham RA相比，p<0.05；@与MIAA相比，p<0.05；$与MI RA相比，p<0.05。(G)极光B阳性CMs的代表性图像。AA：相邻区域；RA：偏远地区；DAPI(蓝色)、极光B(绿色)和SAA(红色，肌色素α肌动蛋白)。(H)极光B阳性CMs AA的量化：邻近区域；RA：偏远地区*p<0.05，与ShamAA相比；#与Sham RA相比，p<0.05；@与MIAA相比，p<0.05；$与MI RA相比，p<0.05。(I)用3M-ECM模拟物治疗3个月后，小鼠的代表性M型超声心动图图像。(J)用3M-ECM模拟物治疗3个月后MI小鼠的缩短分数(FS％)的量化。P：产后一天。(K)用3M Mito治疗3个月后MI小鼠的存活率。
附图7为3M ECM类似物治疗后Th1/Th2细胞因子的变化。(A)3M-ECM类似物治疗后Th1/Th2细胞因子的浓度。(B)TH1/Th2细胞因子相对于Sham的倍数变化。
需要说明的是，因格式问题本申请说明书附图部分都经灰度处理，上述有关颜色的部分是原实验中处理所得。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1细胞制剂和细胞外基质类似物的制备
1材料
试剂：磷酸盐缓冲液(PBS)、1％十二烷基硫酸钠(SDS)、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、氢氧化钠。
仪器：磁力搅拌器、恒温水浴锅、pH计、研磨仪。
2方法
人心房3M-ECM的制备：人心房细胞外基质(ECM)先剪成小块，经过1％SDS脱细胞处理后，制备成冻干粉，称重后，4℃条件下经胰酶和木瓜蛋白酶消化后，制备成ECM溶液，用氢氧化钠调节pH值至7.4，ECM溶液的终浓度为1mg/mL。
细胞外基质类似物(ECM mimics)的配方如图6(A)表中所示。
实施例2细胞制剂和细胞外基质类似物的应用
1对室间隔缺损患儿心房组织的检测
取室间隔缺损患儿在手术过程中需要切除的心房组织(取组织前获伦理批准和签患者知情同意书)，按照年龄分组：3个月之内(3M)，1岁以上(1Y)。采用免疫荧光法检测增殖标志物Ki67/pHH3/Aurora B，结果显示3M以内心房组织这些增殖标志物显著升高；分离心肌细胞，采用PCR方法，检测增殖基因Ki67/cyclinD2/Aurora B的mRNA水平，结果显示3M以内心房组织这些增殖基因mRNA水平显著升高(图1)。
23M-ECM溶液对心肌梗死小鼠的治疗效果
2.1心肌梗死小鼠模型的建立
(1)麻醉和固定：将新生小鼠用纱布包裹，放在冰盒内麻醉约2分钟，新生鼠皮肤变苍白，失去呼吸运动时代表麻醉完成，此时将新生鼠仰卧位固定至冰床上，碘伏棉球涂抹胸口消毒，铺上无菌洞巾；
(2)手术入路：手术时从第3-4肋间隙左侧开始，先用显微剪剪断皮肤和肋间肌肉，切口长度约0.3cm；用棉条吸去多余出血；
(3)结扎冠状动脉左前降支：用显微拉钩拉开上下端肋骨，暴露胸腔，剪开心包膜，用棉条吸去心包液，找到沿左室走行的冠状动脉左前降支，用11-0的缝线透壁性结扎血管；
(4)关闭胸腔：清理胸腔内多余棉条和明胶海绵，确认无活动性出血后用9-0的缝线封闭胸腔，先缝合肋间隙肋骨，再缝合肋间肌肉层和皮肤层，胸腔关闭后用剪脚趾的方法对新生鼠进行标记。
2.2治疗效果
结果表明3M-ECM溶液可以明显促进体外培养的HiPSC-CMs的增殖以及在体内减少心肌梗死小鼠心肌细胞的凋亡坏死，促进心肌细胞增殖，减少纤维化，促进心功能的改善(图2)
3转录组测序技术分析心房组织
转录组测序技术分析3M和1Y的心房组织
使用UltraTM RNA文库准备试剂盒生成测序文库，并在每个样本的特定序列中添加索引代码。使用TruSeq PE聚类试剂盒在cBbot聚类生成系统上对索引编码样本进行聚类。随后，在Illumina Novaseq平台上对文库进行150bp的双端测序。从原始数据中筛选后获得干净数据，同时我们计算了干净数据的Q20、Q30和GC含量。所有后续的分析都采用了高质量的干净数据。采用特征计数v1.5.0-p3来确定每个基因对应的reads数。利用每个基因的长度和可定位到该基因的reads数，计算出每个基因的每千碱基的转录本序列的片段(FPKM)。
结果显示二者差异表达基因达343个，聚类分析结果亦显示3M和1Y的心房组织具有明显的差异性。最显著的20个差异基因中7个与细胞周期的调控相关，见(图2)。
4差异基因富集分析
采用DESeq2 R软件包(1.16.1)进行差异基因富集分析结果显示：生物过程主要与生长和生长调节相关；分子功能主要与生长因子的结合有关；细胞组分主要与核膜、细胞外基质(ECM)和胶原有关；信号通路主要与蛋白的消化和吸收以及ECM和受体间的交互作用有关。
5蛋白质组学分析
对制备的ECM进行蛋白质组学的分析：
对ECM进行了基于串联质量标记(TMT)的定量蛋白质组学研究。减少生物变异的影响样本的蛋白质组学分析，我们从五个不同的个体上获得等量的ECM汇集成一份，最终获得三组样本，每组包括1个3M心房和1个1Y心房。然后使用Rigol L3000 HPLC系统在C18柱(Waters BEH C184.6×，250mm，5μm)上进行分离。使用EASY-nLCTM 1200UHPLC系统(ThermoFisher)进行“鸟枪法(shotgun)”定量蛋白质组学分析来构建文库。然后使用Q Exactive高分辨质谱仪(Thermo Fisher)分析分离的多肽。使用搜索引擎Proteome Discoverer 2.2(PD 2.2,Thermo)在蛋白搜库homo_sapiens_uniprot_2020_1_8.fasta(188,386个序列)中对每次运行的结果光谱进行独立搜索。在3M组和1Y组之间表达水平有显著差异的蛋白(P<0.05和fold change>1.5)被指定为差异表达蛋白(DEPs)。
发现3M和1Y的ECM差异十分明显；差异表达蛋白主要与氧化还原过程有关，其中还包含了心房特有的小泡介导的转运。上调的差异蛋白中，有7个(FBN2/CSPG2/CAV1/BRP44/ARGN/FIS1/MEF2A)已经报道过在心肌细胞的增殖中具有重要作用。心房ECM的组分比较复杂：线粒体蛋白占22.61％，核蛋白占21.74％，浆膜蛋白占18.26％，细胞外蛋白占21.17％，见(图5)。
6细胞外基质类似物对心梗小鼠的治疗
使用3M-ECM模拟物治疗MI的程序如图6(B)所示，结果表明细胞外基质类似物能够在体内促进心肌细胞增殖，加快心梗小鼠心的恢复。
7细胞外基质类似物主要诱导免疫耐受
在MI小鼠中使用3M ECM类似物治疗后Th1/Th2细胞因子表达水平变化，主要诱导免疫耐受，见(图7)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种治疗心肌梗死的细胞制剂，其特征在于，所述细胞制剂的制备方法包括以下步骤：
1)人心房细胞外基质(ECM)先剪成小块，经SDS脱细胞处理后，制备成冻干粉；
2)称重后经胰酶和木瓜蛋白酶消化后，制备成ECM溶液；
3)用氢氧化钠调节pH值至7.4后得细胞制剂。
2.根据权利要求1所述的细胞制剂，其特征在于，所述步骤1)中的人心房细胞外基质选自三月龄，SDS浓度为1％；所述步骤2)中的消化条件为4℃；所述步骤3)中细胞制剂的终浓度为1mg/mL。
3.一种治疗心肌梗死的细胞外基质类似物，其特征在于，所述的细胞外基质为人心房三月龄细胞外基质。
4.根据权利要求3所述的细胞外基质类似物，其特征在于，所述的细胞外基质类似物包含7个已知的在心肌细胞增殖过程中有重要作用的蛋白以及3个氧化还原相关蛋白。
5.根据权利要求4所述的细胞外基质类似物，其特征在于，所述的蛋白为FBN2、CSPG2、CAV1、BRP44、ARGN、FIS1和MEF2A；所述的氧化还原相关蛋白为COX5A、NDUFA11和NDUFB4。
6.根据权利要求3-5任一所述的细胞外基质类似物，其特征在于，所述的细胞外基质类似物能够促进心肌细胞增殖。
7.权利要求1-2任一所述的细胞制剂以及权利要求3-6任一所述的细胞外基质类似物在制备治疗心肌梗死的药物或医疗器械中的应用。
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