CN116746482A - 一种高胡萝卜素小麦品种的选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高胡萝卜素小麦品种的选育方法，采用高产优质小麦品种作为亲本，与高胡萝卜素小麦杂交，后代与轮回亲本多代回交，并利用分子标记跟踪目标基因，选育出株叶形态、农艺和产量性状与轮回亲本相近，具有高胡萝卜素含量的小麦品系。该高胡萝卜素小麦品种种植后株叶形态和农艺性状好，产量高。
Description
技术领域
本发明属于遗传育种领域，具体涉及一种高胡萝卜素小麦新品种选育的方法。
背景技术
小麦是世界上总产量第二的粮食作物，提高其营养品质是小麦遗传育种研究的重要目标之一。类胡萝卜素作为人类饮食结构中不可或缺的重要成分，不同种类的类胡萝卜素在人类健康中起着不同的生理作用。由于人体及动物体内无法合成类胡萝卜素，必须通过外界摄入膳食来供给，但普通小麦中类胡萝卜素的含量相对较低，所以如何提高小麦中类胡萝卜素的含量显得尤为重要。类胡萝卜素具有抗氧化活性，有助于预防机体衰老引发的心血管硬化、冠心病和肿瘤疾病。它无毒、安全，具有优异的生理功效，常常作为食品添加剂使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种高胡萝卜素小麦品种的选育方法，利用遗传原理和杂交育种方法，采用高产优质小麦品种作为亲本，与高胡萝卜素小麦杂交，后代与轮回亲本多代回交，并利用分子标记跟踪目标基因，选育出株叶形态、农艺和产量性状与轮回亲本相近，具有高胡萝卜素含量的小麦品系。该高胡萝卜素小麦品种种植后株叶形态和农艺性状好，产量高。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种高胡萝卜素小麦品种的选育方法，包括以下步骤：
1)选高产优质小麦品种R做轮回亲本，与含高胡萝卜素小麦(P)杂交，其中R作母本，P作父本，杂交得杂交F1代；
2)种植杂交F1代种子，利用分子标记检测技术筛选含有目标基因的株系，开花期从中选优异单株与轮回亲本R(作母本)，回交得回交1代BC1F1；
3)种植回交1代BC1F1种子，利用分子标记检测技术筛选含有目标基因的株系，成熟期收获其种子(BC1F2品系)；
4)种植筛选得到的BC1F2品系的种子，开花期考察各品系并选择农艺和产量性状与轮回亲本R相近且开花性状好的优异单株与轮回亲本R(作母本)分别继续回交得回交2代BC2F1；
5)种植回交2代BC2F1种子，利用分子标记检测技术筛选含有目标基因的株系，成熟期收获其种子(BC2F2品系)；
6)种植筛选得到的BC2F2品系的种子，开花期考察各品系并选择农艺和产量性状与轮回亲本R相近且开花性状好的单株与轮回亲本R(作母本)分别继续回交得回交3代BC3F1；
7)重复步骤5)、6)至回交4代BC4F1代，种植BC4F1代，利用分子标记检测技术筛选含有目标基因的株系，成熟期收获种子(BC4F2品系)；
8)种植步骤7)筛选所得的BC4F2种子，开花期考察各品系并在每个品系中选择农艺性状与轮回亲本R最为接近、开花性状好、产量性状优异的单株30～50个；
9)种植筛选出的BC4F3单株，每个单株种成株行，用分子标记检测技术筛选含有目标基因的单株，成熟期收获含有目标基因的单株，并且每个株行的单株混合收种，分别取每个株行的100克种子，进行磨面，并对面粉的黄色素含量进行测定；
10)选择黄色素含量大于6.0ug/g的株系，即育成产量高且含有高胡萝卜素的小麦品系。
进一步地，高产优质小麦品种为济麦22或济麦44，高胡萝卜素小麦品种为济麦8044号。目标基因Psy-A1s。
本发明的有益效果在于：
1)本发明把控制胡萝卜素含量的基因通过杂交回交育种方法导入高产优质品种中，利用分子标记检测技术每代跟踪目标基因，并结合面粉颜色测定和黄色素含量测定，育成高胡萝卜素含量的高产优质小麦品系。通过本发明的育种方法获得高胡萝卜素的高产优质小麦品系，可生产高胡萝卜素的小麦。
2)该发明方法简单、高效、可行，节省工序和成本，且生产的高胡萝卜素小麦富含人体必需的营养元素胡萝卜素，常食可增进健康，保护眼睛；并且具有显著的经济效益，高胡萝卜素小麦中的胡萝卜素是纯天然的，它无毒、安全，具有优异的生理功效，种植该高胡萝卜素小麦品种每亩可比普通品种增加收入400-500元。
附图说明
图1为DNA电泳检测图；
图2为PCR电泳检测图；
图3为含量直方图，横坐标为类胡萝卜素含量；纵坐标为类萝卜素种类；图中ErrorBars为标准误差(Standard Error)。
具体实施方式
为了使技术领域的人员更好地理解本发明方案，并使本发明的上述目的、特征和优点更加明显易懂，下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一种高胡萝卜素小麦品种的选育方法，具体步骤为：
1)选高产优质小麦品种济麦22(亲本R)作轮回亲本，与高胡萝卜素小麦品种(P)济麦8044杂交，其中R作母本，P作父本杂交得杂交F1代；
2)种植杂交F1代种子500粒，利用分子标记检测技术筛选含有目标基因(Psy-A1s)的株系，选择30个单株与轮回亲本R(做母本)回交得回交1代BC1F1；
3)种植回交1代BC1F1种子，利用分子标记检测技术筛选含有目标基因(Psy-A1s)的株系，成熟期收获含有目标基因(Psy-A1s)株系的种子(BC1F2品系)；
4)种植筛选得到的BC1F2品系的种子，开花期考察各品系并选择农艺和产量性状与轮回亲本R相近且开花性状好的优异单株30株，与轮回亲本R(作母本)分别继续回交得回交2代BC2F1；
5)种植回交2代BC2F1种子，利用分子标记检测技术筛选含有目标基因(Psy-A1s)的株系，成熟期收获含有目标基因株系的种子(BC2F2品系)；
6)种植筛选得到的BC2F2品系的种子500粒，开花期考察各品系并选择农艺和产量形状与轮回亲本R相近且开花性状好的单株30株，与轮回亲本R(作母本)分别继续回交得回交3代BC3F1的种子；
7)重复步骤5)、6)至回交4代BC4 F1代，种植BC4F1代种子，用分子标记检测技术筛选含有目标基因(Psy-A1s)的株系，成熟期收获种子(BC4F2品系)。
8)种植步骤7)筛选所得的BC4F2种子，开花期考察各品系并在每个品系中选择农艺性状与轮回亲本R最为接近、开花性状好、产量性状优异的单株30～50株，测种子胡萝卜素含量，选胡萝卜素含量大于6.0ug/g的株系即育成农艺性状与轮回亲本R相近，性状表现整齐一致不分离，产量高且胡萝卜素含量高的小麦品系。
种植该高胡萝卜素小麦品种的种子即可生产含高胡萝卜素小麦，生产的高胡萝卜素小麦富含胡萝卜素，常食可增进健康，保护眼睛，提高人体免疫力。该高胡萝卜素小麦售价高，种植该高胡萝卜素小麦品种每亩可比普通品种增加收入400元。
实施例2
一种高胡萝卜素小麦品种的选育方法，具体步骤为：
1)选择绿色强筋小麦品种济麦44(亲本R)作轮回亲本，与高胡萝卜素小麦品种(P)济麦8044号杂交，其中R作母本，P做父本，杂交得杂交F1代；
2)种植杂交F1代种子500粒，利用分子标记检测技术，检测与小麦高胡萝卜素含量相关的基因(Psy-A1s)，选择含有Psy-A1s基因的单株30个与轮回亲本R(做母本)回交得回交1代BC1F1；
3)种植回交1代BC1F1种子，利用分子标记检测技术筛选含有目标基因(Psy-A1s)的株系，成熟期收获种子(BC1F2品系)；
4)种植筛选得到的BC1F2品系种子，开花期考察各株系并选择农艺和产量性状与轮回亲本R相近且开花性状好的优异单株30株，与轮回亲本R(作母本)分别继续回交得回交2代BC2F1；
5)种植回交2代BC2F1种子，利用分子标记检测技术筛选含有目标基因的株系，成熟期收获种子(BC2F2品系)；
6)种植筛选得到的BC2F2品系种子，开花期考察各品系并选择农艺和产量性状与轮回亲本R相近且开花性状好的单株6个，与轮回亲本R(作母本)分别继续回交得回交3代BC3F1；
7)重复步骤5)、6)至回交4代BC4F1代，种植BC4F1代，利用分子标记检测技术筛选含有目标基因的株系，成熟期收获种子(BC4F2品系)；
8)种植步骤7)筛选所得的BC4F2种子，开花期考察各品系并在每个品系中选择农艺性状与轮回亲本R最为接近、开花性状好、产量性状优异的单株30～50株，测种子胡萝卜素含量，选胡萝卜素含量大于6.0ug/g的株系即育成农艺性状与轮回亲本R相近，性状表现整齐一致不分离，优质且含高胡萝卜素的小麦品系。
种植该高胡萝卜素小麦品种的种子即可生产高胡萝卜素小麦，生产的高叶黄色小麦富含胡萝卜素，常食可增进健康，保护眼睛，提高人体免疫力。该高胡萝卜素小麦售价高，种植该高胡萝卜素小麦品种每亩可比普通品种增加收入500元。
实施例3
一种高胡萝卜素小麦选育的分子标记辅助选择方法，具体步骤：
1.DNA的提取：利用DNA提取试剂盒，分别提取母本、父本、杂交后代及回交后代的DNA，利用Nanodrop 2000/2000C分光光度计检测DNA完整性，260/280的比值大于1.8，260/230的比值大于2.0；琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，电泳图谱清晰，无弥散条带。
2.目的基因的PCR扩增：引物序列Psy-A1s-F：(5‘-3’)AGCTAGGCCTTCTAAGTTGACCPsy-A1s-R：(5‘-3’)CACACAAAATTTCAGACAGTGCG(937bp)；Psy-A1s基因序列扩增用2×EasyTaq PCR SuperMix进行，扩增体系：
PCR扩增程序：95℃变性3min；95℃30sec，55℃30sec，72℃90sec，共反应32个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
3.电泳检测：用1.0％的琼脂糖凝胶检测PCR的扩增情况，其中目标单株在1000bp有条清晰的电泳条带。
实施例4
一种高胡萝卜素小麦选育的面粉颜色测定方法，具体步骤：
1.样品提取流程
(1)取BC4F3每个株系的种子100g，用研磨仪(MM400，Retsch)研磨(30Hz，1min)至粉末状。
(2)配置正已烷：丙酮：乙醇混合提取溶液，并加入0.01％BHT(g/ml)，称取50mg的磨碎粉末，加入适量的提取液及内标。
(3)室温下涡旋提前20min。
(4)离心，吸取上清液。
(5)重复步骤(2)、(3)、(4)进行重复提取，收集上清液，浓缩至干。
(6)配制甲醇：甲基叔丁基醚混合复溶溶液，用适量复溶溶液复溶样品，涡旋混匀，使目标物质充分溶解，离心。
(7)过0.22μm滤膜，后保存于棕色进样瓶中，用于LC-MS/MS分析。
2.色谱质谱采集条件
数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(Ultra High Performance LiquidChromatography,UHPLC)和串联质谱(Tandem mass spectrometry,MS/MS)(AppliedBiosystems 6500Quadrupole Trap。
液相条件主要包括：
1)色谱柱：YMC C30柱，i.d.2×100mm,3μm；
2)流动相A：甲醛：乙腈3：1加入0.01％BHT，加入0.1％甲酸；B：甲基叔丁基醚加入0.01％BHT；甲醇；
3)洗脱梯度：0min A/B100：0(V/V)，3min为100：0(V/V),11mim为100：0
(V/V)；
4)流速0.8Ml/min；柱温28℃；进样量2μL。
大气压化学离子源(atmospheric pressure chemical iosziaa-lion,APCI)温度350℃，帘气(curtain gas,CUR)25psi。在Q-Trap 6500中，每个离子对是根据优化的去簇电压(declustering potential,DP)和碰撞能(collision energy，CE)进行扫描检测。
3.定量分析
利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据。将检测到的所有样本类胡萝卜素的积分峰面积代入标准曲线线性方程进行计算，进一步带入计算公式计算后，最终得到实际样本类胡萝卜素的绝对含量数据。样本中类胡萝卜素的含量(μg/g)＝B*C/1000/D
公式中各字母含义：
B：样本中类胡萝卜素积分峰面积代入标准曲线得到的浓度值(μg/mL)；
C：复溶时所用溶液的体积(μL)；
D：称取的样本质量(g)。
Claims (4)
1.一种高胡萝卜素小麦品种的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)选高产优质小麦品种R做轮回亲本，与含高胡萝卜素小麦P杂交，其中R作母本，P作父本，杂交得杂交F1代；
2)种植杂交F1代种子，利用分子标记检测技术筛选含有目标基因的株系，开花期从中选优异单株与轮回亲本R，回交得回交1代BC1F1；
3)种植回交1代BC1F1种子，利用分子标记检测技术筛选含有目标基因的株系，成熟期收获其种子BC1F2品系；
4)种植筛选得到的BC1F2品系的种子，开花期考察各品系并选择农艺和产量性状与轮回亲本R相近且开花性状好的优异单株与轮回亲本R分别继续回交得回交2代BC2F1；
5)种植回交2代BC2F1种子，利用分子标记检测技术筛选含有目标基因的株系，成熟期收获其种子BC2F2品系；
6)种植筛选得到的BC2F2品系的种子，开花期考察各品系并选择农艺和产量性状与轮回亲本R相近且开花性状好的单株与轮回亲本R分别继续回交得回交3代BC3F1；
7)重复步骤5)、6)至回交4代BC4F1代，种植BC4F1代，利用分子标记检测技术筛选含有目标基因的株系，成熟期收获种子BC4F2品系；
8)种植步骤7)筛选所得的BC4F2种子，开花期考察各品系并在每个品系中选择农艺性状与轮回亲本R最为接近、开花性状好、产量性状优异的单株30～50个；
9)种植筛选出的BC4F3单株，每个单株种成株行，用分子标记检测技术筛选含有目标基因的单株，成熟期收获含有目标基因的单株，并且每个株行的单株混合收种，分别取每个株行的100克种子，进行磨面，并对面粉的黄色素含量进行测定；
10)选择黄色素含量大于6.0ug/g的株系，即育成产量高且含有高胡萝卜素的小麦品系。
2.根据权利要求1所述的一种高胡萝卜素小麦品种的选育方法，其特征在于，高产优质小麦品种为济麦22或济麦44，高胡萝卜素小麦品种为济麦8044号。
3.根据权利要求1所述的一种高胡萝卜素小麦品种的选育方法，其特征在于，目标基因Psy-A1s。
4.根据权利要求1所述的一种高胡萝卜素小麦品种的选育方法，其特征在于，步骤(9)中黄色素含量采用LC-MS/MS测定。
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