CN116745619A - 靶向pacs1的化合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了减轻或预防受试者淋巴增生的组合物和方法。该受试者可能患有、疑似患有或有风险患有淋巴增生性疾病。本文的方法包括向受试者施用有效降低磷酸弗林酸性簇分选蛋白1(Pacs1)表达和/或活性的组合物。

Description

靶向PACS1的化合物及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年12月3日提交的美国临时申请号63/121,002的权益，该申请的内容通过引用被全部并入。

对政府支持的认可

本发明是在由美国国立卫生研究院授予的AI125581号拨款的政府支持下做出的。政府对该发明拥有某些权利。

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背景技术

1.领域

本发明构思涉及靶向磷酸弗林酸性簇分选蛋白1(Pacs1)的组合物和其用于治疗受试者的疾病如淋巴增生性疾病的给药方法。

2.对相关技术的讨论

淋巴增生性疾病(LPD)是由受试者免疫系统内的一种或多种缺陷导致淋巴细胞产生过量而造成的。淋巴细胞的两个亚群，即T细胞和B细胞，在LPD中不受控制地分裂，产生免疫增殖性疾病，这些疾病容易出现免疫缺陷、免疫系统功能紊乱和淋巴细胞失调。若干基因突变被认为是导致LPD的原因，这些基因突变可能是医源性的，也可能是获得性的。LPD也被认为是原发性免疫缺陷(PID)和免疫失调综合征的并发症，患者的预后历来非常差。因此，本领域需要针对LPD的治疗的新靶点。

发明概述

本公开至少部分基于确定Pacs1为受试者免疫系统内的治疗靶点，其中受试者中Pacs1的抑制和/或缺失可以阻断淋巴增殖，这种缺陷与淋巴增生性疾病(LPD)有关。

本公开的一些实施方案提供了治疗、减轻和/或预防受试者的淋巴增生的方法。在一些实施方案中，本文的方法可以包括向受试者施用有效调节磷酸弗林酸性簇分选蛋白1(Pacs1)的组合物。在一些实施方案中，调节Pacs1可以包括降低Pacs1基因表达、降低Pacs1蛋白表达、降低Pacs1活性，或其任何组合。

在一些实施方案中，本文的方法可以包括施用有效调节Pacs1的组合物。在一些实施方案中，本文的方法可以包括施用有效调节Pacs1的组合物，其中本文的组合物可以包括肽、抗体、化学品、化合物、寡聚物、核酸分子或其任何组合中的至少一种。在一些实施方案中，本文的核酸分子可以是有效抑制和/或减少Pacs1的表达(例如，Pacs1的基因表达，Pacs1的蛋白表达)的双链RNA。在一些实施方案中，本文的双链RNA可以是小时序RNA、小核RNA、小核仁RNA、短发夹RNA、微小RNA(microRNA)或其任何组合。在一些实施方案中，本文的双链RNA可以是小干扰RNA。

在一些实施方案中，本文的方法可以包括施用有效调节Pacs1的组合物，其中该组合物可以包括至少一种药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，本文的方法可以包括向受试者局部地、全身地、皮下地、静脉地、鼻内地或其任何组合地施用本文公开的组合物。

在一些实施方案中，本文的方法可以包括向患有、疑似患有或有风险患有至少一种淋巴增生性疾病、至少一种淋巴恶性肿瘤或其任何组合的受试者施用本文公开的有效调节Pacs1的组合物。根据这样的实施方案，患有、疑似患有或有风险患有至少一种淋巴增生性疾病的受试者可以是具有淋巴增生性疾病的一种或多种遗传标记的人类受试者。在一些实施方案中，具有淋巴增生性疾病的一种或多种遗传标记的人类受试者可以是已被诊断为患有或疑似患有自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、卡斯尔曼病(CD)、罗赛-道夫曼病(RDD)、EB病毒相关淋巴增生性疾病(ELD)、X连锁淋巴增生综合征(XLP)、血管免疫性母细胞淋巴结病、半胱天冬酶-8缺陷综合征(CEDS)、Dianzani自身免疫性淋巴增生性疾病、Kikuchi-Fujimoto综合征、淋巴瘤样肉芽肿病、淋巴瘤样丘疹病、眼部附件淋巴增生、RAS相关白细胞增生性疾病(RALD)、p110δ激活突变引起的衰老性T细胞淋巴结病和免疫缺陷(PASLI)、CTLA-4单倍体功能不全伴自身免疫性浸润(CHAI)、LRBA缺陷伴自身抗体、调节性T细胞缺陷、自身免疫浸润和肠病(LATAIE)、X连锁免疫缺陷伴镁缺陷、EB病毒感染和肿瘤(X-MEN)、白细胞介素-2诱导性T细胞激酶(ITK)缺陷，或其组合。在一些实施方案中，给予本文中有效调节Pacs1的组合物的受试者可以是免疫受损的受试者。在一些实施方案中，本文的免疫受损的受试者可以是已被诊断为患有或疑似患有普通变异型免疫缺陷(CVID)、严重联合免疫缺陷(SCID)、Wiskott-Aldrich综合征、共济失调性毛细血管扩张症、Chediak-Higashi综合征、一种或多种病毒感染、一种或多种真菌感染或其组合的人类免疫受损的受试者。根据这样的实施方案，本文的人类免疫受损的受试者可以被诊断为患有或疑似患有人类免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸系统综合症冠状病毒1(SARS-CoV-1)、严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)、中东呼吸系统综合症(MERS)、人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)、人冠状病毒229E(HCoV-229E)、人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)，或其任何组合。在一些实施方案中，施用本文中有效调节Pacs1的组合物的受试者可以是患有、疑似患有或有风险患有至少一种淋巴恶性肿瘤的受试者，包括患有至少一种淋巴恶性肿瘤的人类受试者，所述淋巴恶性肿瘤选自霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、成熟B细胞肿瘤、成熟T细胞和自然杀伤(NK)细胞肿瘤和前体淋巴瘤。在一些实施方案中，施用本文中有效调节Pacs1的组合物的受试者可能已经或正在接受用于淋巴增生的至少一种其他疗法。根据这样的实施方案，本文的用于淋巴增生的其他疗法可以包括给予化疗、利妥昔单抗、奥比妥珠单抗、硼替佐米、卡非佐米、阿扎胞苷、地西他滨、维奈托克、依鲁替尼、艾代拉西布、舒尼替尼、迪那西利布、考比替尼、伊达沙努林、奥利默森钠、丁酸钠、缩酚肽、芬维A胺、夫拉平度、棉子酚、ABT-737、ABT-263、GX15-070、HA14-1、抗霉素A、阿卡拉布替尼、扎鲁替尼、替拉替尼、硼替佐米、来那度胺、替西莫司，或其组合。

本公开的一些实施方案提供了具有至少一种磷酸弗林酸性簇分选蛋白1(Pacs1)的抑制剂和至少一种药学上可接受的载体的组合物。在一些实施方案中，本文的组合物可进一步包括至少一种药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，本文所用的Pacs1的抑制剂可以抑制Pacs1的直接活性，抑制Pacs1的间接活性，抑制Pacs1和WD重复域蛋白37(Wdr37)之间形成复合物，减少Pacs1基因的表达，减少Pacs1蛋白的表达，或其任何组合。在一些实施方案中，本文公开的Pacs1的抑制剂可以是肽、抗体、化学品、化合物、寡聚物、核酸分子，或其组合。在一些实施方案中，本文公开的Pacs1的抑制剂可以是有效抑制Pacs1活性或降低Pacs1表达的具有双链RNA的核酸分子。在一些实施方案中，本文所公开的Pacs1的抑制剂可以是双链RNA，所述双链RNA选自小时序RNA、小核RNA、小核仁RNA、短发夹RNA和微小RNA。在一些实施方案中，本文所公开的Pacs1的抑制剂可以是小干扰RNA。

本公开的一些实施方案提供了通过施用和有效量的本公开的组合物治疗受试者的至少一种淋巴增生性疾病、至少一种淋巴恶性肿瘤或其任何组合的方法。

本公开的一些实施方案提供了具有本文公开的组合物和至少一个容器的试剂盒。

上述内容旨在是说明性的，并不意味着限制性的意义。本发明构思的许多特征和子组合可以被实现，并且在研究了下面的说明书和包括其一部分的附图后将变得显而易见。可以在不参考其他特征和子组合的情况下使用这些特征和子组合。

附图说明

通过示例的方式说明本发明构思的实施方案，其中相同的附图标记表示相似的元素，并且其中：

图1A-1J描述了说明Pacs1对于循环淋巴细胞的正常数量是必需的的图像。图1A显示了与外周B细胞缺乏有关的Pacs1的两个突变的超谱系图谱。插图显示了苦苣(endive)和菊苣(chicory)谱系中的外周B细胞缺乏。蛋白质结构域模型显示了ENU等位基因的编码位置。非配对t检验，ns＝不显著，**P＜0.01，***P＜0.001。图1B显示使用CRISPR/Cas9在Pacs1中插入1个碱基对(bp)导致Pacs1蛋白丢失。图1C显示了来自Pacs1^+/+和Pacs1^-/-小鼠的外周血免疫细胞计数。非配对t检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图1D-1F显示了骨髓(图1D)、胸腺(图1E)和脾脏(图1F)中淋巴细胞亚群的绝对数量。通过FACS分析对骨髓中的B细胞发育：B220⁺CD43⁺CD19^-IgM^-IgD^-(前体B细胞原)；B220⁺CD43⁺CD19⁺IgM^-IgD^-(B细胞原)；B220⁺CD43^-CD19⁺IgM^-IgD^-(前体B细胞)；CD19⁺IgM⁺IgD^-(未成熟)；CD19⁺IgM⁺IgD⁺(成熟)的表面表达进行评估。通过FACS分析对胸腺中的T细胞发育：CD4^-CD8^-(双阴性，DN)；CD4⁺CD8⁺(双阳性，DP)；CD4⁺CD8^-(CD4单阳性，SP)；CD4^-CD8⁺(CD8SP)的表面表达进行评估。通过FACS分析对脾脏B细胞群：B220⁺CD21⁺CD23⁺(滤泡B细胞，FOB)；B220⁺CD21⁺CD23^低(边缘区B细胞，MZB)的表面表达进行评估。每个符号代表一只个体小鼠。Mann-WhitneyU检验，ns＝不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图1G-1I显示了在骨髓(图1G)、胸腺(图1H)和脾脏(图1I)的竞争性骨髓重建过程中，源自Pacs1^+/+；CD45.1和Pacs1^-/-；CD45.2供体的细胞群的比例。群体的确定是基于与图1C相同的标志物，其中同源性标志物CD45.1和CD45.2增加。每个符号代表一个单独的受体。结果代表两个独立的移植实验。图1J显示了用膜联蛋白V染色测量来自Pacs1^+/+和Pacs1^-/-小鼠脾脏的FOB和MZB细胞的死亡情况。结果代表两个独立实验。非配对t检验，ns＝不显著，**P<0.01。

图2A-2J描述了说明Pacs1缺失导致抗原受体刺激后胞质Ca²⁺通量缺陷的图像。图2A-2F显示了Pacs1^+/+和Pacs1^-/-脾细胞用Indo-1标记，并对B220、CD21和CD23进行染色，以识别FOB(图2A-2C)和MZB(图2D-2E)细胞。测量荧光30秒以建立基线，然后用指定量的抗IgM刺激细胞(箭头)。通过测量Indo-1的紫色：蓝色荧光发射比，用FACS分析监测胞质Ca²⁺通量。显示了五个独立的Pacs1^+/+和Pacs1^-/-对的动力学轨迹，并对基线归一化(Pacs1^+/+灰色轨迹，Pacs1^-/-粉色轨迹)。每个基因型的平均Ca²⁺通量以黑体叠加显示(Pacs1^+/+黑色，Pacs1^-/-红色)。图2G-2H显示FOB(图2G)和MZB(图2H)细胞在每个抗IgM浓度下的最大Ca²⁺通量(峰高)。配对t检验，ns＝不显著，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。图2I显示了用Indo-1标记并在含有5mcg/ml抗IgM且无Ca²⁺的缓冲液中刺激的Pacs1^+/+和Pacs1^-/-FOB细胞，用来评估ERCa²⁺外流。然后，重新添加2mM Ca²⁺来评估SOCE。显示了来自三个独立的Pacs1^+/+和Pacs1^-/-对的对基线归一化的动力学轨迹，平均Ca²⁺通量以黑体叠加显示。图2J显示了在无Ca²⁺条件下刺激后和重新添加Ca²⁺后的最大Ca²⁺通量。配对t检验，ns＝不显著，*P<0.05。

图3A-3K描述了说明Wdr37与Pacs1形成相互稳定的复合物的图像。图3A显示了与外周B细胞缺乏有关的Wdr37的两个突变的超谱系图谱。插图显示了基础型和深度型谱系中的外周B细胞缺乏。非配对t检验，ns＝不显著，***P<0.001。图3B和3C显示了在共转染的293T细胞中，FLAG-Wdr37对HA标记的Pacs1的免疫共沉淀(图3B)和FLAG-Pacs1对HA-Wdr37的免疫共沉淀(图3C)。图3D显示了WT、Pacs1^-/-和Wdr37^-/-小鼠的外周血细胞中Pacs1和Wdr37表达的蛋白印迹。图3E显示了Wdr37^-/-小鼠的B和T细胞外周血计数。非配对t检验，***P<0.001。图3F-3H显示了用Indo-1标记的、对细胞表面标志物进行染色以识别FOB细胞并用指定量的抗IgM进行刺激的Wdr37^+/+和Wdr37^-/-脾细胞。显示了三个(2.5mcg/ml抗IgM)或四个独立实验(10mcg/ml和5mcg/ml抗IgM)的归一化轨迹(Wdr37^+/+灰色，Wdr37^-/-粉色)。每个基因型的平均Ca²⁺通量以黑体叠加显示(Wdr37^+/+黑色，Wdr37^-/-红色)。图3I显示了每个抗IgM浓度下的最大Ca²⁺通量。配对t检验，*P＜0.05，**P＜0.01。图3J显示了用Indo-1标记的、在无Ca²⁺的缓冲液中用5mcg/ml抗IgM刺激，然后加入2mM Ca²⁺的Wdr37^+/+和Wdr37^-/-FOB细胞。显示了四个独立实验的归一化轨迹，其中平均Ca²⁺通量以黑体叠加显示。图3K显示了在无Ca²⁺条件下刺激后和重新添加Ca²⁺后的最大Ca²⁺通量。配对t检验，ns＝不显著，*P<0.05。

图4A-4G描述了说明Pacs1缺失诱发ER应激、ROS和对氧化应激的高度敏感性的图像。图4A显示了未受刺激或用5mcg/ml IgM刺激过夜的Pacs1^+/+和Pacs1^-/-脾脏B细胞中ER质量、ER应激和自噬标志物的免疫印迹。图4B显示了从Pacs1^+/+和Pacs1^-/-脾脏中纯化的B细胞，在未刺激的细胞和用5mcg/ml抗IgM刺激过夜的细胞中测量OCR。显示的数据是三个(未刺激的)或四个(经刺激的)独立实验中5-10个技术重复的平均值。非配对t检验，*P<0.05。图4C-4D显示了来自Pacs1^+/+和Pacs1^-/-脾脏的FOB细胞中CellRoxGreen染色的代表性直方图，其MFI来自三对单独的小鼠。配对t检验，**P<0.01。图4E-4G显示了来自Pacs1^+/+和Pacs1^-/-小鼠的脾细胞用细胞表面抗体染色以识别FOB细胞，并用100mcM H₂O₂处理35分钟。然后用TMRE标记细胞，通过FACS分析监测MMP。低TMRE荧光表示对H₂O₂处理的敏感性。数据以平均值±SD表示。结果是在不同的Pacs1^+/+和Pacs1^-/-对上进行的三个独立实验的代表。

图5A-5E描述了说明Pacs1^-/-B细胞的IP3R表达和ERCa²⁺储存减少的图像。图5A显示了来自Pacs1^+/+和Pacs1^-/-小鼠原代脾脏B细胞中所有三种IP3R亚型和SERCA2的表达的免疫印迹。图5B显示了来自三个独立的Pacs1^+/+和Pacs1^-/-对小鼠的IP3R和SERCA2转录本的实时定量PCR。数据以平均值±SD表示。图5C显示了Pacs1^-/-FOB细胞在无Ca²⁺条件下用0.625mcM毒胡萝卜素刺激以测量细胞内Ca²⁺储存。显示了四个独立实验的动力学轨迹(Pacs1^+/+灰色，Pacs1^-/-粉色)，其平均值以黑体叠加显示(Pacs1^+/+黑色，Pacs1^-/-红色)。图5D显示了图5C中由分析的最后30秒的平均值计算的来自细胞内Ca²⁺储存的胞质Ca²⁺通量的平台期。配对t检验，*P<0.05。图5E显示了图5C中来自细胞内Ca²⁺储存的胞质Ca²⁺通量的AUC。双尾配对t检验，ns＝不显著。

图6A-6J描述了说明Pacs1缺失改变ERCa²⁺处理的图像。图6A显示了Pacs1、Wdr37、IP3R1和IP3R3在亲本NIH-3T3细胞系和三个独立的Pacs1^-/-克隆中的免疫印迹。图6B显示了IP3R亚型WT和Pacs1^-/-3T3细胞的表达的实时定量PCR。Pacs1^-/-细胞中的表达是在三个独立的克隆中测量的。数据以平均值±SD表示。图6C显示了用胞质水母发光蛋白转染的Pacs1^+/+和Pacs1^-/-NIH-3T3细胞，用1mcM缓激肽处理后测量了Ca²⁺通量。图6D显示了基于图6A中水母发光蛋白测量的胞质Ca²⁺浓度峰值。非配对t检验，**P<0.01。图6E显示了用ER-CamP6转染的Pacs1^+/+和Pacs1^-/-NIH-3T3细胞(图6A的C1和C2)。在用10mcMATP处理之前和之后测量ERCa^{2 +}。动力学曲线显示每个细胞系的平均488/405激发率，误差条表示SEM。数据来自2个独立的实验。图6F显示了图6E中反映的NIH-3T3细胞系的ERCa²⁺的释放。单向方差分析，**P<0.01，***P<0.001。图6G显示了图6E中反映的NIH-3T3细胞的基础ERCa²⁺水平。单向方差分析，ns＝不显著，***P<0.001。图6H显示了用erAEQ转染、然后用tBHQ处理的Pacs1^+/+和Pacs1^-/-3T3细胞，以测量ER Ca²⁺渗漏。图6I显示了图6H中ER Ca²⁺渗漏率的量化。经Welch校正的非配对t检验，*P<0.05。图6J显示ER Ca²⁺渗漏的线性回归。

图7A-7P描述了在淋巴细胞丰富的条件下体内Pacs1^-/-B细胞的自发增殖和细胞死亡增加的图像。图7A显示了经纯化的、用CTV染料标记并用指定的促有丝分裂剂刺激的Pacs1^+/+和Pacs1^-/-B细胞。72小时后，使用基于CTV稀释的FACS分析评估细胞增殖。图7B和7C显示了用明矾-ova免疫且一周后用NP-聚蔗糖免疫的Pacs1^+/+和Pacs1^-/-小鼠。分别在免疫后14天和7天测量抗ova IgG和抗NPIgM滴度。每个符号代表一只个体小鼠。图7D-7E显示了用NP-KLH免疫的Pacs1^+/+和Pacs1^ccy/ccy小鼠。免疫后14天测量低亲和力(抗NP30；图7D)和高亲和力(抗NP2；图7E)抗体。图7F-7L显示了从Pacs1^+/+和Pacs1^-/-小鼠纯化并分别用CTFR和CTV染料标记的B细胞。将标记的B细胞以～1:1的比例注射到未受辐照的CD45.1受体。移植后8天测量过继移植的B细胞的增殖和存活情况。图7M显示了使用三个不同的Pacs1^+/+和Pacs1^-/-供体对的独立实验中过继移植后增殖的供体B细胞的比例。非配对t检验，**P＜0.01，***P＜0.001。图7N显示了使用两个不同的Pacs1^+/+和Pacs1^-/-供体对的两个独立实验中过继移植后膜联蛋白V阳性的供体B细胞的比例。非配对t检验，**P＜0.01，***P＜0.001。图7O和7P显示了注射EdU的Pacs1^+/+和Pacs1^-/-小鼠，在注射后1、4和7天测量脾脏中EdU+FOB和MZB细胞的比例。数据来自一个独立的实验。

图8A-8V描述了说明Pacs1缺失在淋巴细胞增殖模型中抑制异常淋巴细胞积累的图像。图8A显示了Pacs1^+/-；Bcl2^TG和Pacs1^-/-；Bcl2^TG小鼠的脾脏大小和对异常扩增的B220⁺CD23⁺CD21⁺/^低FOB细胞的FACS分析。图8B-8D显示了Pacs1^+/-；Bcl2^TG和Pacs1^-/-；Bcl2^TG小鼠血液中循环B细胞和脾脏中FOB细胞的数量。Mann-WhitneyU检验，*P<0.05，**P<0.01。图8E-K显示了从Pacs1^+/-；Bcl2^TG和Pacs1^-/-；Bcl2^TG小鼠(CD45.2)脾脏中纯化的B细胞，分别用CTFR和CTV增殖染料标记，并移植到未受辐照的CD45.1受体。在B细胞移植后7天，基于CD45.2表达和增殖染料荧光，在受体小鼠的脾脏中测量供体B细胞。图8L和8M显示了来自图8E-8K实验中增殖的(图8L)和恢复的(图8M)供体细胞的比例。符号代表单个受体小鼠，数据来自两个独立的过继移植实验。图8N显示了在图8E-8K的实验中过继移植的B细胞群中凋亡B细胞的比例。符号代表单个受体小鼠，数据来自一个过继移植实验。图8O-8Q显示来自Pacs1^+/-；Bcl2^TG和Pacs1^-/-；Bcl2^TG小鼠的脾细胞，用细胞表面抗体染色以识别FOB细胞，并用100mcMH₂O₂处理35分钟。然后用TMRE标记细胞以监测MMP。通过FACS分析测量TMRE的荧光。数据以平均值±SD表示。结果来自一个独立的实验。图8R-8T显示了Pacs1^+/+；Fas^lpr/lpr和Pacs1^-/-；Fas^lpr/lpr小鼠的淋巴结大小和淋巴增生性CD3⁺B220⁺细胞的流式细胞计数。图8U-8V显示了依赖Pacs1表达的Fas^lpr/lpr的外周血和淋巴结中CD3⁺B220⁺细胞的计数。Mann-WhitneyU检验，**P<0.01。

图9A和9B描述了在一些实施例中使用的小鼠的创建图像。图9A显示在Pacs1^+/+和Pacs1^ccy/ccy小鼠脾细胞中Pacs1表达。图9B显示了使用CRISPR/Cas9将1bp插入Pacs1的外显子4的基因模型，以产生Pacs1^-/-小鼠。

图10A-10J描述了说明抗原受体刺激后Pacs1^-/-淋巴细胞中ERCa²⁺外流的图像。图10A和10B显示了来自Pacs1^+/+和Pacs1^-/-小鼠的脾细胞，这些脾细胞的CD8和CD4被染色并被Indo-1标记。然后用10mcg抗CD3刺激细胞。通过FACS分析监测胞质Ca²⁺通量。显示了来自三个独立的Pacs1^+/+和Pacs1^-/-对的对基线归一化的动力学轨迹(Pacs1^+/+灰色轨迹，Pacs1^-/-粉色轨迹)。每个基因型的平均Ca²⁺通量以黑体叠加显示(Pacs1^+/+黑色，Pacs1^-/-红色)。图10C和10D显示抗CD3刺激后CD8和CD4T细胞的最大Ca²⁺通量。配对t检验，*P<0.05。图10E和10F显示在无Ca²⁺-条件下用10mcg抗CD3刺激CD8和CD4T细胞，然后加入2mM Ca²⁺。图10G-10J显示在无Ca²⁺条件下和加入2mM Ca²⁺后，CD8和CD4T细胞的Ca²⁺通量的峰值。配对t检验，*P＜0.05，**P＜0.01。

图11A-11J描述了说明Pacs1^-/-B细胞缺陷和Ca²⁺通量表型的图像。图11A-11B显示了携带B-18i重链转基因的Pacs1^+/+和Pacs1^-/-小鼠的B细胞亚群的总数。非配对t检验，ns＝不显著，*P＜0.05，**P＜0.01。图11C-11D显示用NP-PE鉴定来自Pacs1^+/+；IgH^B-18i/+和Pacs1^-/-；IgH^B-18i/+小鼠脾脏中的NP特异性FOB细胞。图11E-11F显示来自三个独立实验的在NP+和NP-门内用NP-PE处理后，然后用抗IgM处理后的Ca²⁺通量动力学轨迹(Pacs1^+/+；IgH^{B -18i/+}为灰色痕迹，Pacs1^-/-；IgH^B-18i/+为红色/粉红色痕迹)。轨迹对基线归一化。图11G-11J显示在NP+和NP-门内每次刺激后的最大Ca²⁺通量峰值高度。配对t检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图12描述了Pacs1^-/-B细胞中ERCa²⁺释放的上游信号传导的图像。从Pacs1^+/+和Pacs1^-/-小鼠的脾脏中纯化B细胞，用5mcg/ml的抗IgM刺激指定时间。通过蛋白印迹测量Plcγ2、ERK和AKT的磷酸化量和总量。

图13A-13C描述了说明Wdr37与Pacs1形成相互稳定的复合物的图像。图13A显示了来自Pacs1^+/+和Pacs1^-/-小鼠的淋巴组织中测量Pacs1依赖性Wdr37表达。图13B显示了CXH处理后293T细胞中表位标记的Pacs1和Wdr37的相互稳定的测量。图13C显示了使用CRISPR/Cas9从Wdr37的外显子4缺失2bp的基因模型，以产生Wdr37^-/-小鼠。

图14A-14E描述了说明Pacs2^-/-小鼠中循环B细胞比例的图像。图14A-14B显示了使用CRISPR/Cas9进行Pacs2缺失的基因模型。Pacs2的外显子3被作为靶标，产生了20bp的缺失(图14A)和1bp的插入(图14B)移码等位基因。这些等位基因预计会导致Pacs2的早期截短。图14C显示了对Pacs2^-/-小鼠外周血中B220⁺B细胞比例的测量结果。红色符号代表携带20bp缺失等位基因的小鼠，蓝色符号代表携带1bp插入等位基因的小鼠。图14D显示在WT、Pacs1^-/-和Pacs2^-/-小鼠原代脾细胞中Pacs1和Wdr37的表达。图14E显示了Pacs2^+/+和Pacs2^-/-小鼠的脾细胞，这些细胞被Indo-1加载并被染色以识别FOB细胞。用5mcg抗IgM刺激细胞，通过FACS分析监测胞质Ca²⁺通量。结果代表两个独立实验。

图15A-15H描述了Pacs1缺失对线粒体Ca²⁺稳态的影响的图像。图15A显示了用erAEQ转染然后用1mcM缓激肽处理以测量ERCa²⁺的释放的Pacs1^+/+和Pacs1^-/-3T3细胞。图15B显示了来自(A)的ERCa²⁺释放率的定量。非配对t检验，***P<0.001。图15C显示了用MSCV-Mito-Pericam感染的Pacs1^+/+和Pacs1^-/-NIH-3T3细胞。使用488/405激发比通过活细胞成像测量用10mcMATP处理前后的线粒体Ca²⁺通量。每条轨迹显示单个细胞的动力学(Pacs1^+/+灰色，Pacs1^-/-粉色)，其平均值以黑体叠加(Pacs1^+/+黑色，Pacs1^-/-红色)。结果代表两个独立实验。图15D显示了(C)中测量的来自细胞的最大线粒体Ca²⁺通量。Mann-WhitneyU检验，***P<0.001。图15E显示了用mt2-GCamP转染的Pacs1^+/+和Pacs1^-/-NIH-3T3细胞并测量了线粒体Ca²⁺的基础含量。Mann-WhitneyU检验，ns＝不显著。结果是两个独立实验的合并结果。图15F-15G显示了Pacs1^+/+和Pacs1^-/-脾细胞，其被染色以识别FOB细胞，然后用MitoTrackerGreen标记。直方图显示了FOB细胞中MitoTracker荧光的代表性强度(图15F)。定量显示了两对Pacs1^+/+和Pacs1^-/-小鼠的结果(图15G)。每个符号代表三个技术重复的平均值。横杠表示来自合并实验的平均值。图15H显示了纯化的Pacs1^+/+和Pacs1^-/-B细胞的线粒体应激测试。符号代表三个独立实验的平均值，每个实验有7-10个技术重复。误差线显示合并实验之间的SD。双尾非配对t检验。*P<0.05，ns＝不显著。

图16描述了Pacs1^+/+和Pacs1^-/-脾脏B细胞的图像，这些细胞用CTV标记并且未刺激或用指定的稳态细胞因子和促有丝分裂剂刺激。

附图并不将本发明构思限制在本文所公开和描述的具体实施方案中。附图不一定是按比例绘制的，而是强调清楚地说明本发明构思的一些实施例的原理。

详细描述

下面的详细描述参考了说明本发明构思各种实施方案的附图。附图和描述旨在充分详细地描述本发明构思的各个方面和实施方式，以使本领域的技术人员能够实践本发明构思。在不偏离本发明构思的范围的情况下，可以利用其他组件，也可以做出改变。因此，下面的描述不应被视为具有限制性意义。本发明构思的范围仅由所附的权利要求书以及这些权利要求书中的全部等价物来界定。

本公开部分基于Pacs1在免疫调节中很重要，并调节外周血B细胞、IgD+B细胞和IgM+B细胞的频率的抑制性发现。在本公开之前，Pacs1没有已知的生理功能。本文的示例性方法显示，Pacs1缺失导致在受到抗原受体刺激后B细胞和T细胞中内质网(ER)钙(Ca²⁺)外流的缺陷。本文的示例性方法还显示，Pacs1缺失并不损害正常的体液反应，但它强烈地阻断由Fas^lpr突变和Bcl2过表达导致的淋巴细胞增殖。因此，本公开提供了一个新的靶点，Pacs1，用于旨在抑制LPD同时保留有益的免疫功能的疗法。在一些实施方案中，本公开提供了靶向Pacs1的组合物。在一些实施方案中，本公开提供了向有需要的对象施用靶向Pacs1的组合物的方法。在一些实施方案中，本公开提供了预防、治疗和/或减轻由Pacs1-Wdr37复合体控制淋巴细胞导致的疾病(例如LPD)的方法。

I.术语

本文采用的词组和术语是为了描述的目的，不应视为限制性的。例如，使用单数术语，例如"一"，并不意味着对项目数量的限制。另外，使用关系术语，例如但不限于"顶部"、"底部"、"左"、"右"、"上"、"下"、“向下”、"向上"和"侧"，是为了在具体参考附图的描述中清楚，而不是为了限制本发明构思或所附权利要求的范围。

此外，由于本发明构思易于采用许多不同形式的实施方案，本公开旨在被视为本发明构思原理的示例，并且不旨在将本发明构思限制在所示和所述的具体实施方案中。本发明构思的任何一个特征都可以单独使用或与任何其他特征组合使用。在描述中提到术语"实施方案"和/或类似的引用，意味着所提到的一个和/或多个特征至少包括在说明书的一个方面。在说明书中对术语"实施方案"和/或类似术语的单独引用不一定是指同一实施方案，也不相互排斥，除非如此说明和/或本领域技术人员从描述中很容易看出。例如，一个实施方案中描述的特征、结构、过程、步骤、动作等也可以包括、但不一定包括在其他实施方案中。因此，本发明构思可以包括本文所述实施方案的各种组合和/或整合。此外，本文所描述的本公开的所有方面，对其实践来说并非必不可少。同样，本发明构思的其他系统、方法、特征和优点对于本领域的技术人员来说，在研究这些图和描述时将是或变得显而易见。所有这些额外的系统、方法、特征和优点都将包括在本说明书中，并在本发明构思的范围内，并且包含在权利要求中。

说明书和所附权利要求书中使用的任何程度术语，例如但不限于"基本上"，应理解为包括精确的，或近似的但不精确的配置。例如，"基本上平面"是指精确的平面或近似但不精确的平面。同样，如在说明书和所附权利要求中使用的术语"约"或"大约"应理解为包括所列举的数值或为所列举数值的三倍或三分之一的数值。例如，大约3毫米包括从1毫米到9毫米的所有数值，大约50度包括从16.6度到150度的所有数值。例如，它们可以指小于或等于±5％，如小于或等于±2％，如小于或等于±1％，如小于或等于±0.5％，如小于或等于±0.2％，如小于或等于±0.1％，如小于或等于±0.05％。

术语"包含"、"包括"和"具有"在本公开中可互换使用。术语"包含"、"包括"和"具有"是指包括，但不一定限于如此描述的事物。

最后，本文使用的术语"或"和"和/或"应被解释为包含性的或意味着任何一个或任何组合。因此，"A、B或C"或"A、B和/或C"是指以下任何一种情况："A"、"B"或"C"；"A和B"；"A和C"；"B和C"；"A、B和C"。只有当元素、功能、步骤或动作的组合在某种程度上本质上相互排斥时，才会出现这一定义的例外。

II.组合物

(a)Pacs1

在一些实施方案中，本文的组合物可以调节Pacs1(磷酸弗林酸性簇分选蛋白1)。如本文所用，"调节"Pacs1的组合物可以包括能够降低Wdr37基因表达、降低Pacs1蛋白表达、降低Pacs1活性、防止形成Wdr37-Pacs1复合物或其组合的任何生物分子。在一些实施方案中，能够调节Pacs1的生物分子可以是肽和抗体、化学品、化合物、寡聚物、核酸分子或其组合。在一些实施方案中，本文能够调节Pacs1的生物分子可以是Pacs1的抑制剂。如本文所用，Pacs1的抑制剂可以抑制Pacs1的直接活性、抑制Pacs1的间接活性、抑制Wdr37-Pacs1复合物的形成、减少Pacs1基因的表达、减少Pacs1蛋白的表达，或其组合。

Pacs1是一种高度保守的961氨基酸胞质蛋白，通过磷酸化酸性簇基序的结合促进膜结合区室之间的货物运输。Pacs1最初被确定为弗林转运到转运高尔基体网络的关键介质，但此后与多种内源性和病毒蛋白的正确定位有关。因此，本文的一些实施方案可以包括Pacs1信号传导级联的上游或下游靶点的调节剂和/或抑制剂，将有效地抑制Pacs1抑制的生理结果。

Pacs1有四个主要的结构域:(i)初始萎缩蛋白相关区(ARR)；(ii)弗林结合区(FBR)，其结合货物上的磷酸化酸性簇基序；(iii)具有自动调节功能的中间区域(MR)；以及(iv)大的C端区域(CTR)。因此，本文的一些实施方案可以包括靶向至少一个Pacs1结构域的调节剂和/或抑制剂。

在一些实施方案中，本文的组合物可以包括Pacs1的调节剂和/或抑制剂。在一些实施方案中，Pacs1的调节剂和/或抑制剂可以是肽、抗体、化学品、化合物、寡聚物、核酸分子，或其组合。

在一些实施方案中，本文公开的Pacs1的调节剂和/或抑制剂可用于治疗、减轻或预防淋巴增生性疾病。在一些实施方案中，本文公开的Pacs1的调节剂和/或抑制剂可用于治疗、减轻或预防淋巴性恶性肿瘤。在一些实施方案中，本文公开的Pacs1的调节剂和/或抑制剂可用于减轻淋巴细胞的过度增殖。在一些实施方案中，本文公开的Pacs1的调节剂和/或抑制剂可用于减弱B细胞、T细胞或其任何组合的过度增殖。

在一些实施方案中，本文的组合物可以包括核酸分子。本文所用的术语"核酸分子"是指具有核苷酸的分子。核酸可以是单链、双链或多链的，可以包括经修饰或未经修饰的核苷酸或非核苷酸或其各种混合物和组合。在一些实施方案中，用于本文的核酸分子可以是双链RNA。在一些实施方案中，适合在本文使用的双链RNA可以是小时序RNA、小核RNA、小核仁RNA、短发夹RNA、微小RNA等。在一些实施方案中，适合在本文使用的双链RNA可以是小干扰RNA。

根据本公开，针对受影响细胞中产生的特定mRNA的小干扰RNA可防止靶细胞中疾病相关蛋白(如Pacs1)的产生。在一些实施方案中，本文的组合物可以包括使用旨在将小干扰RNA传递给靶细胞的一种或多种专门定制的载体。在一些实施方案中，本文设计的小干扰RNA的成功可能以其成功递送到靶细胞以治疗淋巴增生性疾病为前提。在一些实施方案中，本文的小干扰RNA可能能够靶向人类细胞中的特定mRNA分子。在一些实施方案中，本文的小干扰RNA载体可以被构建成转染细胞并产生小干扰RNA，导致靶RNA的剪切从而中断编码蛋白的产生。在一些实施方案中，本公开的小干扰RNA载体可通过抑制蛋白质本身的产生，通过抑制参与靶蛋白产生或加工的蛋白质的产生，或其组合，来阻止靶蛋白(例如Pacs1)的产生。

在一些实施方案中，本公开的小干扰RNA载体可以防止细胞中Pacs1的产生。在一些实施方案中，本公开的小干扰RNA载体可以减弱细胞中Pacs1的产生。在一些实施方案中，使用本公开的小干扰RNA载体可以使细胞中的Pacs1的产生减弱至少25％。在一些实施方案中，使用本文公开的小干扰RNA载体可使细胞中Pacs1的产生减弱约10％至约99％(例如，约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约99％)。

本文公开的抗Pacs1小干扰RNA，以及用于治疗、减轻和预防淋巴增生的其他小干扰RNA，只是本公开实施方案的一些示例。在一些实施方案中，使用本文公开的筛选平台进行的筛选可用于确定一种或多种用于本文的另外的候选小干扰RNA。

在一些实施方案中，本文公开的核酸分子可用于对靶细胞中Pacs1的基因表达进行遗传调节。如本文所用，术语"基因调节"是指使用基因工程技术对免疫细胞基因组进行操作。可用于调节靶细胞中Pacs1基因表达的基因工程技术的非限制性实例可以包括化学诱变、X射线诱变、重组DNA技术、病毒介导的DNA传递、基因编辑等。基因编辑方法的实例包括但不限于CRISPR、TALEN、锌指核酸酶等。在一些实施方案中，CRISPR可用于调节靶细胞中Pacs1的基因表达。

在一些实施方案中，本文公开的Pacs1的调节剂和/或抑制剂可以被包装在载体中，以递送到靶细胞。在一些实施方案中，本文使用的载体可以是腺相关病毒(AAV)。在一些实施方案中，本文使用的AAV可以是重组腺相关病毒血清型2和/或重组腺相关病毒血清型5。或者，其他病毒载体，如单纯疱疹病毒，在本文中可用于将外源DNA递送到中枢神经系统神经元。在一些实施方案中，非病毒载体，例如但不限于单独递送或与脂质体化合物或聚乙烯胺复合的质粒DNA，在本文中可用于将本文所公开的Pacs1的调节剂和/或抑制剂递送到靶细胞或组织。

在一些实施方案中，本文公开的Pacs1的调节剂和/或抑制剂可以直接施用，或者可以与阳离子脂质复合，包装在脂质体内，包装在病毒载体内，或以其他方式递送到靶细胞或组织。在一些实施方案中，包含本文的Pacs1的调节剂和/或抑制剂的复合物可以通过注射、输液泵或支架在体内或体外局部施用到相关组织，无论是否将其纳入生物聚合物中。

在一些实施方案中，本公开提供了含有一种或多种本文所公开的核酸分子和/或表达载体的哺乳动物细胞。该一种或多种核酸分子可以独立地靶向相同或不同的位点。

在一些实施方案中，本公开的Pacs1的调节剂和/或抑制剂可以单独地或组合地或与其他药物联合用于治疗一种或多种病症和/或疾病。在一些实施方案中，本文的Pacs1的调节剂和/或抑制剂可以单独地或组合地或与其他药物联合用于治疗一种或多种遗传性淋巴增殖性疾病。此类疾病的实例包括但不限于：自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、卡斯尔曼病(CD)、罗赛-道夫曼病(RDD)、EB病毒相关的淋巴增生性疾病(ELD)、X连锁淋巴增生综合征(XLP)、血管免疫性母细胞淋巴结病、半胱天冬酶-8缺陷综合征(CEDS)、Dianzani自身免疫性淋巴增生性疾病、Kikuchi-Fujimoto综合征、淋巴瘤样肉芽肿病、淋巴瘤样丘疹病、眼部附件淋巴增生、RAS相关的白细胞增生性疾病(RALD)、p110δ激活突变引起的衰老性T细胞淋巴结病和免疫缺陷(PASLI)、CTLA-4单倍体不全伴自身免疫性浸润(CHAI),LRBA缺陷伴自身抗体、调节性T细胞缺陷、自身免疫浸润和肠病(LATAIE)、X-连锁免疫缺陷伴镁缺陷、EB病毒感染和肿瘤(X-MEN)、白细胞介素-2诱导的T细胞激酶(ITK)缺陷，等等。

在一些实施方案中，本文的Pacs1的调节剂和/或抑制剂，可以单独地、组合地或与其他药物联合用于治疗免疫受损的受试者。在一些实施方案中，要用本文公开的组合物治疗的免疫受损的受试者可被诊断为患有或疑似患有普通变异型免疫缺陷(CVID)、严重联合免疫缺陷(SCID)、Wiskott-Aldrich综合征、共济失调性毛细血管扩张症、Chediak-Higashi综合征、一种或多种病毒感染、一种或多种真菌感染，或其任何组合。这种病毒感染的实例包括，但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸系统综合症冠状病毒1(SARS-CoV-1)、严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)、中东呼吸综合征(MERS)、人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)、人冠状病毒229E(HCoV-229E)、人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)，或其任何组合。

在一些实施方案中，本文的Pacs1的调节剂和/或抑制剂，可以单独地或组合地或与其他药物联合用于治疗患有、疑似患有或有风险患有至少一种恶性肿瘤的受试者。在一些实施方案中，本文的Pacs1的调节剂和/或抑制剂，可以单独地或组合地或与其他药物联合或用于治疗患有、疑似患有或有风险患有至少一种淋巴恶性肿瘤的受试者。这种淋巴恶性肿瘤的实例包括但不限于霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、成熟B细胞肿瘤、成熟T细胞和自然杀伤(NK)细胞肿瘤、前体淋巴肿瘤等。在一些实施方案中，本公开的Pacs1的调节剂和/或抑制剂，可以单独地或组合地或与其他药物联合用于治疗患有、疑似患有或有风险患有至少一种B细胞淋巴瘤的受试者。

在一些实施方案中，本公开的Pacs1的调节剂和/或抑制剂，可以单独地或组合地或与其他药物联合用于治疗患有、疑似患有或有风险患有至少一种白血病的受试者。在一些实施方案中，适合于本文治疗的受试者可以患有急性白血病或慢性白血病。在一些实施方案中，适合于本文治疗的受试者可以患有淋巴细胞性白血病或髓性白血病。在一些实施方案中，适合于本文治疗的受试者可以患有急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、毛细胞白血病或罕见的未命名的白血病类型。在一些实施方案中，适合于本文治疗的受试者可以患有B细胞白血病。

(b)药物制剂和治疗方案

在一些实施方案中，本文所公开的Pacs1的调节剂和/或抑制剂可以本身或作为药物组合物的一部分提供，其中Pacs1调节剂和/或抑制剂可以与合适的载体或赋形剂混合。

本文所用的"药物组合物"是指一种或多种本文所述的活性成分与其他化学组分如生理学上合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是为了便于向生物体施用化合物。

本文的术语"活性成分"是指用于调节和/或抑制Pacs1的生物效应的肽和抗体、化学品、化合物、寡聚物、核酸分子或其组合。本文所用的术语"活性成分"也可以包括本文所公开的遗传修饰细胞(如干细胞、CAR T细胞)。

(i)药学上可接受的载体和赋形剂

在下文中，短语"生理学上可接受的载体"和"药学上可接受的载体"在本文可以互换使用，指的是不会对生物体造成明显刺激且不会消除所施用化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。这些短语下也包括佐剂。

在一些实施方案中，本文公开的组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。如本文所用，药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体是指适合于向受试者施用而不引起不期望的生物效应或以有害的方式与包含它的组合物中的任何组分相互作用的材料。药学上可接受的稀释剂、载体和赋形剂可以包括但不限于生理盐水、林格氏溶液、磷酸盐溶液或缓冲液、缓冲盐水和本领域已知的其他载体。

在一些实施方案中，本文的药物组合物还可以包含稳定剂、抗氧化剂、着色剂、其他药用或制药剂、载体、佐剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、溶液促进剂、盐、增溶剂、消泡剂、抗氧化剂、分散剂、表面活性剂或其任何组合。本文中，术语"赋形剂"是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分的施用的惰性物质。赋形剂的实例，包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖类和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。药物的配制和给药技术可以在"Remington's Pharmaceutical Sciences"(雷明顿药物科学)，MackPublishing Co.(麦克出版公司),Easton,Pa.，最新版中找到，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体(包括赋形剂和辅助剂)以常规方式配制，以促进将遗传修饰的内皮祖细胞加工成可药用的制剂。在一些实施方案中，可以适当地和/或如本领域所理解的使用任何众所周知的技术、载体和赋形剂。

在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可以是包含一种或多种聚合物作为悬浮剂的水性混悬剂。在一些实施方案中，可构成本文所述药物组合物的聚合物包括：水溶性聚合物，如纤维素聚合物，例如羟丙基甲基纤维素；不溶于水的聚合物，如交联的含羧基的聚合物；粘性聚合物，选自例如羧甲基纤维素、卡波姆(丙烯酸聚合物)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚丙烯酰胺、聚卡波非、丙烯酸/丙烯酸丁酯共聚物、海藻酸钠和葡聚糖；或其组合。在一些实施方案中，，本文公开的药物组合物可以包括总量占组合物总重量的至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％的作为悬浮剂的聚合物。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包括总量占组合物总重量的约5％至约99％、约10％、约95％、或约15％至约90％的作为悬浮剂的聚合物。

在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包括粘性制剂。在一些实施方案中，本文的组合物的粘度可通过添加一种或多种胶凝剂或增稠剂来增加。在一些实施方案中，本文公开的组合物可以包含一种或多种胶凝剂或增稠剂，其用量可提供足够粘稠的制剂以保持在被处理的组织上。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含总量占组合物总重量的至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％的胶凝剂或增稠剂。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包括总量占组合物总重量的约5％至约99％、约10％、约95％、或约15％至约90％的胶凝剂或增稠剂。在一些实施方案中，适用于本文的增稠剂可以是羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、聚乙烯醇、硫酸软骨素钠、透明质酸钠。在其他方面，增粘剂可以是阿拉伯树胶(阿拉伯胶)、琼脂、硅酸铝镁、海藻酸钠、硬脂酸钠、墨角藻、膨润土、卡波姆、卡拉胶、卡波普、黄原胶、纤维素、微晶纤维素(MCC)、角豆胶、甲壳素、羧甲基化壳聚糖、角叉菜、葡萄糖、叉红藻胶、明胶、加蒂(Ghatti)胶、瓜尔胶、锂蒙脱石、乳糖、蔗糖、麦芽糊精、甘露醇、山梨醇、蜂蜜、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、刺梧桐胶、黄原胶、黄芪胶、乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、乙基甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、氧聚凝胶、果胶、聚明胶肽、聚维酮、碳酸丙烯酯、甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物(PVM/MA)、聚(甲基丙烯酸甲氧基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲氧基乙氧基乙酯)、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素钠(CMC)、二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮(PVP：povidone)、(葡萄糖、麦芽糊精和三氯蔗糖)，或其任何组合。

在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含另外的试剂或添加剂，所述试剂或添加剂选自表面活性剂、去污剂、溶剂、酸化剂、碱化剂、缓冲剂、张力调节剂、有效增加溶液离子强度的离子添加剂、抗菌剂、抗生素剂、抗真菌剂、抗氧化剂、防腐剂、电解质、消泡剂、油类、稳定剂、增强剂等。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包括总量占组合物总重量的至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％的一种或多种试剂。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包括总量占组合物总重量的约5％至约99％、约10％、约95％、或约15％至约90％的一种或多种药剂。在一些实施方案中，可添加一种或多种这些试剂以改善本公开的毒蕈碱拮抗剂组合物的性能、功效、安全性、保质期和/或其他特性。在一些实施方案中，添加剂可以是生物相容性的，而不是刺激性的、磨蚀性的和/或致敏性的。

在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含一种或多种酸化剂。如本文所用，"酸化剂"是指用于提供酸性介质的化合物。此类化合物包括例如但不限于醋酸、氨基酸、柠檬酸、富马酸和其他α-羟基酸，如盐酸、抗坏血酸和硝酸以及本领域普通技术人员已知的其他酸。在一些实施方案中，可以使用任何药学上可接受的有机或无机酸。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含总量占组合物总重量的至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％的一种或多种酸化剂。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含总量占组合物总重量的约5％至约99％、约10％、约95％、或约15％至约90％的一种或多种酸化剂。

在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含一种或多种碱化剂。如本文所用，"碱化剂"是用于提供碱性介质的化合物。此类化合物包括例如但不限于氨水溶液、碳酸铵、二乙醇胺、单乙醇胺、氢氧化钾、硼酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、三乙醇胺和三羟乙基胺以及本领域普通技术人员已知的其他化合物。在一些实施方案中，可以使用任何药学上可接受的有机或无机碱。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含总量占组合物总重量的至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％的一种或多种碱化剂。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含总量占组合物总重量的约5％至约99％、约10％、约95％、或约15％至约90％的一种或多种碱化剂。

在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含一种或多种抗氧化剂。如本文所用，"抗氧化剂"是抑制氧化的试剂，因此可用于防止制剂因氧化过程而变质。此类化合物包括例如但不限于抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、次磷酸(hypophophorous acid)、单硫甘油、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和本领域普通技术人员已知的其他材料。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含总量占组合物总重量的至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％的一种或多种抗氧剂。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含总量占组合物总重量的约5％至约99％、约10％、约95％、或约15％至约90％的一种或多种抗氧化剂。

在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含缓冲体系。如本文所用，"缓冲体系"是由一种或多种缓冲剂组成的组合物，其中"缓冲剂"是用于在稀释或加入酸或碱时抵抗pH变化的化合物。缓冲剂包括例如但不限于：六偏磷酸钾、磷酸钾、单碱式醋酸钠、无水柠檬酸钠和二水柠檬酸钠以及本领域普通技术人员已知的其他材料。在一些实施方案中，可以使用任何药学上可接受的有机或无机缓冲剂。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含总量占组合物总重量的至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％的一种或多种缓冲剂。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含总量占组合物总重量的约5％至约99％、约10％、约95％、或约15％至约90％的一种或多种缓冲剂。

在一些实施方案中，一种或多种缓冲剂的用量可取决于组合物的所需pH水平。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以具有约6至约9的pH。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以具有大于约8、大于约7.5、大于约7、大于约6.5、或大于约6的pH。

在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含一种或多种防腐剂。如本文所用，"防腐剂"是指抑制、减少或消除药物剂型中细菌生长的试剂或试剂组合。防腐剂的非限制性实例包括尼泊金、尼泊金丙酯、异丙醇和其组合。在一些实施方案中，可以使用任何药学上可接受的防腐剂。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含总量占组合物总重量的至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％的一种或多种防腐剂。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含总量占组合物总重量的约5％至约99％、约10％、约95％、或约15％至约90％的一种或多种防腐剂。

在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含一种或多种表面活性剂或去污剂。在一些实施方案中，表面活性剂或去污剂可以是合成的、天然的或半合成的。在一些实施方案中，本文公开的组合物可以包含阴离子去污剂、阳离子去污剂、两性离子去污剂、两性去污剂、两性离子去污剂、具有类固醇骨架的非离子去污剂，或其组合。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含总量占组合物总重量的至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％的一种或多种表面活性剂或去污剂。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含总量占组合物总重量的约5％至约99％、约10％、约95％、或约15％至约90％的一种或多种表面活性剂或去污剂。

在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含一种或多种稳定剂。如本文所用，"稳定剂"是指用于稳定活性剂使其免受物理、化学或生物化学过程影响的化合物，否则所述物理、化学或生物化学过程会降低活性剂的治疗活性。合适的稳定剂包括例如但不限于：琥珀酸酐、白蛋白、唾液酸、肌酐、甘氨酸和其他氨基酸、烟酰胺、乙酰色氨酸钠、氧化锌、蔗糖、葡萄糖、乳糖、山梨糖醇、甘露醇、甘油、聚乙二醇、辛酸钠和糖精钠以及本领域普通技术人员已知的其他物质。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含总量占组合物总重量的至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％的一种或多种稳定剂。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含总量占组合物总重量的约5％至约99％、约10％、约95％、或约15％至约90％的一种或多种稳定剂。

在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含一种或多种张力剂。如本文所用，"张力剂"是指可用于调节液体制剂的张力的化合物。合适的张力剂包括但不限于甘油、乳糖、甘露醇、葡萄糖、氯化钠、硫酸钠、山梨醇、海藻糖和本领域普通技术人员已知的其他物质。组合物中的渗透压可以用毫渗摩尔/升(mOsm/L)表示。渗透压可以用本领域内公知的方法来测量。在一些实施方案中，使用蒸气压降法来计算本文公开的组合物的渗透压。在一些实施方案中，构成本文公开的药物组合物的一种或多种张力剂的量可以导致组合物渗透压为约150mOsm/L至约500mOsm/L，约250mOsm/L至约500mOsm/L，约250mOsm/L至约350mOsm/L，约280mOsm/L至约370mOsm/L或约250mOsm/L至约320mOsm/L。在一些实施方案中，本文的组合物可以具有约100mOsm/kg至约1000mOsm/kg，约200mOsm/kg至约800mOsm/kg，约250mOsm/kg至约500mOsm/kg，或约250mOsm/kg至约320mOsm/kg，或约250mOsm/kg至约350mOsm/kg或约280mOsm/kg至约320mOsm/kg的渗透压。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可以具有约100mOsm/L至约1000mOsm/L、约200mOsm/L至约800mOsm/L、约250mOsm/L至约500mOsm/L、约250mOsm/L至约350mOsm/L、约250mOsm/L至约320mOsm/L，或约280mOsm/L至约320mOsm/L的渗透压。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含总量占组合物总重量的至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％的一种或多种张力剂。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含占组合物总重量的约5％至约99％、约10％、约95％、或约15％至约90％的一种或多种张力剂。

(i)剂量配方

在一些实施方案中，本公开提供了为一种或多种施用途径配制的组合物。合适的施用途径可以包括例如口服、经直肠、经粘膜、经鼻、经肠和/或肠胃外递送。在一些实施方案中，本文配制的组合物可被配制为肠胃外给药。在一些实施方案中，本文配制的组合物可以配制成肌内、皮下、髓内、静脉内、腹膜内和/或鼻内注射。

在一些实施方案中，可以以局部或全身的方式施用本文的组合物，例如，通过将药物组合物直接局部注射到患者的组织区域。在一些实施方案中，本文所公开的药物组合物可以通过肠胃外施用，例如，通过静脉注射、脑室内注射、小脑延髓池内注射、实质内注射，或其组合。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可按本文公开的方式施用于受试者。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以施用于人类患者。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可通过至少两种施用途径施用于人类患者。在一些实施方案中，施用途径的组合是脑室内注射和静脉注射；鞘内注射和静脉注射；小脑延髓池内注射和静脉注射；和/或实质内内注射和静脉注射。

在一些实施方案中，本公开的药物组合物可以通过本领域众所周知的工艺来制造，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸、磨细、乳化、封装、包埋或冻干工艺。

在一些实施方案中，根据本公开使用的药物组合物因此可以使用一种或多种生理学上可接受的载体(包括赋形剂和辅料)，以常规方式配制，其有助于将活性成分加工成可药用的制剂。适当的制剂取决于所选择的给药途径。对于注射，本文的药物组合物的活性成分可以配制成水溶液，最好是在生理学上兼容的缓冲液中，如Hank’s溶液、Ringer’s溶液、生理盐缓冲液，或其任何组合。

在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可配制成肠胃外施用，例如，通过推注或连续输注。本文的注射用制剂可以以单位剂量形式呈现，例如在安瓿或多剂量容器中，任选地添加防腐剂。在一些实施方案中，本文的组合物可以是在油性或水性载体中的混悬剂、溶液或乳剂，和/或可以包含配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

在一些实施方案中，本文配制的用于肠胃外施用的药物组合物可以包括水溶性形式的活性制剂(例如Pacs1的调节剂/抑制剂)的水溶液。在一些实施方案中，包括活性制剂的混悬剂的本文组合物可制备为油基或水基注射混悬剂。本文使用的合适的亲脂性溶剂和/或载体可以包括但不限于脂肪油，如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。在一些实施方案中，包含水基注射混悬剂的本文组合物可含有增加混悬剂粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。在一些实施方案中，包含混悬剂的本文组合物还可以包含一种或多种合适的稳定剂和/或增加活性成分(如Pacs1的调节剂/抑制剂)的溶解度的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。

在一些实施方案中，本文的组合物可以包括粉末形式的活性成分，用于在使用前与合适的载体，例如无菌、无热原的水基溶液进行重建。

适合在本公开范围内使用的药物组合物可以包括其中可以以有效实现预期目的的量包含活性成分的组合物。在一些实施方案中，治疗有效量是指有效预防、减缓、减轻或改善疾病(如淋巴增生性疾病、淋巴恶性肿瘤)的症状或延长被治疗对象的生存期的活性成分(如本文公开的Pacs1的调节剂和/或抑制剂)的量。

治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是考虑到本文提供的详细披露。

对于本公开的方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量可以从本文公开的体外和细胞培养试验和/或筛选平台中初步估计。例如，可以在动物模型中配制剂量以达到所需浓度或效价。此类信息可用于更准确地确定人体的有用剂量。

在一些实施方案中，本文公开的活性成分的毒性和疗效可通过标准制药程序在体外、细胞培养物或实验动物中确定。在一些实施方案中，从这些体外和细胞培养试验及动物研究中获得的数据可用于配制用于人类受试者的剂量范围。在一些实施方案中，本文使用的剂量可根据所采用的剂型和施用途径而变化。确切的制剂、给药途径和剂量可由个体医生根据患者的情况选择。(参见例如，Fingl等人，1975年，"治疗学的药理学基础"，第1章)。

在一些实施方案中，剂量和/或给药间隔可单独调节为足以诱导或抑制生物效应的活性成分的脑或血液水平(最小有效浓度，MEC)。在一些实施方案中，活性成分(例如本文所公开的Pacs1的调节剂和/或抑制剂)的MEC可能因每种制剂而异，但可以从体外数据中估计。在一些实施方案中，实现本文的MEC所需的剂量可以取决于个体特征和给药途径。可以使用检测分析来确定血浆浓度。

在一些实施方案中，根据待治疗疾病的严重程度和反应性，本文的组合物的剂量可以是单次或多次给药，治疗过程持续数天至数周或直到治愈或实现疾病状态的减轻。

在一些实施方案中，本文组合物的给药量将取决于被治疗的对象、病痛的严重程度、给药方式、处方医生的判断等。在一些实施方案中，有效剂量可从体外或体内测试系统得出的剂量反应曲线中推算出来。

III.使用方法

本公开提供了在有需要的受试者中治疗、减轻和预防淋巴增生的方法。本公开还提供了在有需要的受试者中治疗、减轻和预防至少一种淋巴增生性疾病、至少一种淋巴恶性肿瘤或其组合的方法。在一些实施方案中，治疗、减轻或预防淋巴增生的方法或治疗、减轻或预防受试者的淋巴增生性疾病和/或淋巴恶性肿瘤的方法可以包括向受试者，包括人类受试者施用有效量的如本文公开的Pacs1的调节剂和/或抑制剂。

在一些实施方案中，有需要的受试者可以患有、疑似患有或有限患有至少一种淋巴增生性疾病、至少一种淋巴恶性肿瘤或其任何组合。在一些实施方案中，有需要的受试者可以具有一种或多种淋巴增生性疾病的遗传标记。在一些实施方案中，有需要的受试者可以在STIM蛋白、ORAI通道或其任何组合中具有一个或多个基因突变。在一些实施方案中，有需要的对象可以具有Fas^lpr突变。在一些实施方案中，有需要的对象可以具有Bcl2过表达。在一些实施方案中，有需要的受试者可以在苦苣(en)等位基因、菊苣(ccy)等位基因、基本等位基因、深层等位基因、或其任何组合和/或生理等价物中具有一个或多个基因突变。在一些实施方案中，有需要的受试者可以在Wdr37、Pacs1或两者中具有一个或多个基因突变，其中该基因突变包括显性失活和/或功能获得突变。

在一些实施方案中，有需要的受试者可以是免疫受损的受试者。在一些实施方案中，有需要的对象可能已经或将要进行至少一次组织或器官移植。在一些实施方案中，有需要的对象可以服用一种或多种免疫抑制剂药物。免疫抑制剂的非限制性实例可以包括他克莫司、环孢素、霉酚酸酯、霉酚酸钠、硫唑嘌呤、西罗莫司、泼尼松等。

合适的受试者包括人类、家畜动物、伴侣动物、实验动物或动物园动物。在一些实施方案中，受试者可以是啮齿类动物，例如，小鼠、大鼠、豚鼠等。在一些实施方案中，受试者可以是家畜动物。合适的家畜动物的非限制性实例可以包括猪、牛、马、山羊、绵羊、美洲驼和羊驼。在一些实施方案中，受试者可以是伴侣动物。伴侣动物的非限制性实例可以包括宠物，如狗、猫、兔子和鸟。在一些实施方案中，受试者可以是动物园动物。如本文所用，"动物园动物"是指可以在动物园中发现的动物。这类动物可以包括非人灵长类动物、大型猫科动物、狼和熊。在一个具体的实施方案中，动物是实验动物。实验动物的非限制性实例可以包括啮齿动物、犬科动物、猫科动物和非人灵长类动物。在一些实施方案中，动物是啮齿动物。啮齿动物的非限制性实例可以包括小鼠、大鼠、豚鼠等。在优选的实施方案中，受试者是人类。

在一些实施方案中，如本文所公开的治疗、减轻或预防淋巴增生的方法可在另一种用于淋巴增生的疗法之前立即施用。在一些实施方案中，本文所公开的治疗、减轻或预防淋巴增生的方法可以在另一种用于淋巴增生的疗法之后立即施用。在一些实施方案中，如本文所公开的治疗、减轻或预防淋巴增生的方法可作为用于淋巴增生的另一种疗法同时施用。用于淋巴增生的其他另一种疗法的非限制性实例可以包括化疗、利妥昔单抗、奥比妥珠单抗、硼替佐米、卡非佐米、阿扎胞苷、地西他滨、维奈托克、依鲁替尼、艾代拉西布、舒尼替尼、迪纳西利布、考比替尼、依达沙努林、奥利默森钠、丁酸钠、缩肽、芬维A胺、黄吡醇、棉子酚、ABT-737、ABT-263、GX15-070、HA14-1、抗霉素A、阿卡替尼、泽布替尼、替拉鲁替尼、硼替佐米、来那度胺、替西罗莫司、或其任何组合。

IV.试剂盒

本公开提供了用于治疗或缓解目标疾病，如本文所述的淋巴增生性疾病和/或淋巴恶性肿瘤的试剂盒。在一些实施方案中，本文的试剂盒可以包括根据本文所述的任何方法使用的说明书。所包含的说明书可以包括施用含有本文所公开的Pacs1的调节剂和/或抑制剂以及任选的第二治疗剂的组合物以治疗、延迟发病或缓解本文所述的目标疾病的描述。该试剂盒可进一步包括基于识别个体是否患有目标疾病，例如应用本文所述的诊断方法，来选择适合治疗的个体的描述。在另一些实施方案中，说明书可以包括对于向有目标疾病风险的个体施用抗体的描述。

涉及含有Pacs1调节剂和/或抑制剂的组合物的使用的说明书通常包括有关预期治疗的剂量、给药方案和给药途径的信息。容器可以是单位剂量、批量包装(如多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的说明书通常是标签或包装插页上的书面说明书(例如，试剂盒中包含的纸片)，但机器可读的说明书(例如，磁性或光学存储盘上携带的说明书)也是可以接受的。

标签或包装插页表明，该组合物用于治疗、延迟发病和/或缓解疾病，如癌症或免疫性疾病(例如，淋巴增生性疾病)。可以提供用于实践本文所述任何方法的说明。

本发明的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐子、软包装(例如，密封的麦拉(Mylar)或塑料袋)等。还考虑到了与特定装置，如吸入器、鼻腔给药装置(如雾化器)或输液设备，如微型泵组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌接入口(例如，容器可以是静脉内注射液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。容器也可以具有无菌接入口(例如，容器可以是静脉内注射液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。在一些实施方案中，该组合物中的至少一种活性剂可以是本文所述的Pacs1的调节剂和/或抑制剂。

试剂盒可以任选地提供额外的组分，如缓冲剂和解释性信息。通常，试剂盒包括容器和容器上或与容器相关的标签或包装插页。在一些实施方案中，本公开提供了包括上述试剂盒的内容物的制品。

已经描述了几个实施例，本领域的技术人员将认识到，在不背离本发明构思的精神的情况下，可以使用各种修改、替代结构和等价物。此外，为了避免不必要地掩盖本发明的构思，没有描述一些众所周知的过程和要素。因此，这种描述不应视为对本发明构思范围的限制。

本领域的技术人员将理解，目前公开的实施方案是以举例的方式而不是以限制的方式进行教导。因此，本说明书中包含的或附图中显示的内容应被解释为说明性的，而不是限制性的。以下权利要求旨在涵盖本文描述的所有一般和具体特征，以及对方法和组件范围的所有陈述，就语言而言，可以说是落入其中。

实施例

包括以下实施例以证明本公开的优选实施例。本领域技术人员应理解，在后面的实施例中公开的技术代表了本发明人发现的在本公开的实践中发挥良好作用的技术，因此可以被认为是构成其实践的优选模式。然而，本领域的技术人员根据本公开应理解，在不偏离本公开的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施例进行许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果。

实施例1.Pacs1对循环淋巴细胞的正常数量是必需的

亚细胞区室之间的钙离子(Ca²⁺)动态流动是细胞健康所必需的。Ca²⁺稳态在适应性免疫系统中的作用主要是通过钙库操纵性钙内流(SOCE)对淋巴细胞激活的影响来认识的。缺乏STIM(基质相互作用分子)蛋白或ORAI通道的淋巴细胞在增殖和效应子分化方面有缺陷。携带这些蛋白突变的患者具有严重联合免疫缺陷(SCID)的表型。因此，本领域需要更好地了解亚细胞Ca²⁺稳态在成熟淋巴细胞群发育和维持中的作用。

根据类似于Wang等人((2015)PNAS 112:E440-9，其公开全部纳入本文)的方法，在用N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)诱变的小鼠中进行正向遗传筛选，以确定影响循环免疫细胞群比例的基因。来自两个谱系的若干只小鼠显示外周血中B220+B细胞的比例减少。自动作图使用隐性遗传模式将两个谱系中的同型突变与Pacs1中的单独突变相联系。这两个等位基因被命名为苦苣(en)和菊苣(ccy)。en突变是Pacs1蛋白Y102处的提前终止密码子。ccy等位基因是CTR中的点突变(D757G)，导致Pacs1表达完全丧失(图1A和图9A)。

使用CRISPR/Cas9编辑在Pacs1的外显子4中产生1bp的插入，从而消除了蛋白质的表达(图1B和图9B)。Pacs1^-/-小鼠缺乏循环B细胞和CD4及CD8 T细胞，证实Pacs1突变是en和cy表型的原因(图1C)。在Pacs1^-/-小鼠的外周血中观察到CD11b+骨髓细胞的数量略微增加。

B细胞和T细胞的发育分别在骨髓和胸腺中通过有序的阶段进行。计数初级淋巴器官中正在发育的淋巴细胞群，以确定Pacs1如何影响淋巴细胞发育(图1D-1F)。Pacs1^-/-小鼠从前B阶段开始骨髓中的B细胞祖细胞数量减少。这种观察结果在成熟的再循环B细胞中最为明显。Pacs1^-/-小鼠显示胸腺中发育中的T细胞亚群数量正常。

用竞争性骨髓嵌合体更严格地评估淋巴细胞发育(图1G-1I)。简而言之，用Pacs1^+/+、CD45.1和Pacs1^-/-或CD45.2骨髓各250万个细胞移植给经致命辐照的Rag2^-/-小鼠。在移植后10周，根据同源标志物的表达，在受体小鼠的骨髓、胸腺和脾脏中测量Pacs1^+/+和Pacs1^-/-细胞对发育和成熟淋巴细胞群的贡献。在骨髓中，嵌合体小鼠显示出Pacs1^-/-前体B细胞原的比例增加，表明在这个阶段有发育障碍。Pacs1^-/-细胞发展到B细胞原、B细胞前体和未成熟阶段时失去了竞争优势。与Pacs1^+/+细胞相比，Pacs1^-/-成熟的再循环B细胞处于强烈的竞争劣势。在胸腺中，Pacs1^-/-和Pacs1^+/+发育中的T细胞在双阴性和双阳性阶段有相同的代表性。然而，CD4和CD8 Pacs1^-/-单阳性T细胞与Pacs1^+/+单阳性T细胞的竞争很差，揭示了Pacs1在成熟初始T细胞生成中的作用。

在脾脏中，Pacs1^-/-小鼠的滤泡B(FOB)细胞减少为1/5，边缘区(MZB)细胞数量正常。Pacs1^-/-小鼠的CD4细胞也减少为约1/1.5，CD8 T细胞也减少为约1/2(图1D-1F)。竞争性骨髓嵌合体的脾脏分析表明，Pacs1缺失导致FOB和MZB细胞群的竞争性缺陷(图1G-I)。此外，在Pacs1^-/-小鼠中观察到的轻度脾脏T细胞缺陷在竞争条件下加剧。脾脏中的骨髓细胞群由等比例的Pacs1^-/-和Pacs1^+/+衍生细胞组成。

根据膜联蛋白V染色，脾脏中Pacs1^-/-FOB细胞凋亡的比例增加，表明Pacs1除了促进其在骨髓中的发育外，还在维持外周细胞群中发挥作用。Pacs1^+/+和Pacs1^-/-MZB细胞之间的凋亡水平没有差异(图1J)。

实施例2.抗原受体刺激后Pacs1^-/-淋巴细胞中ER Ca²⁺外流缺陷

抗原受体信号传导机制是T细胞和B细胞所共有的，对它们的发育和维持至关重要。为了确定Pacs1^-/-小鼠的抗原受体信号传导是否有缺陷，导致其淋巴细胞减少，用胞质Ca²⁺指示染料Indo-1加载脾细胞，并对B220、CD21和CD23进行染色以分辨FOB和MZB细胞。测量响应于用来刺激B细胞受体(BCR)的滴定剂量的抗IgM的胞质Ca²⁺通量(图2A-2H)。在所有浓度的抗IgM下进行BCR刺激后，Pacs1^-/-FOB细胞显示出Ca²⁺通量受损。与Pacs1^+/+对照组相比，MZB细胞没有显示任何Ca²⁺通量缺陷。

此外，对负载Indo-1的脾细胞进行CD8(图10A和10B)和CD4(图10C和10C)染色，并用抗CD3刺激以交联T细胞受体(TCR)(图10A-10J)。来自Pacs1^-/-小鼠的CD8和CD4 T细胞在TCR刺激后均减弱了Ca²⁺通量。

接下来，用不含Ca²⁺的缓冲液中的抗IgM刺激负载Indo-1的Pacs1^-/-FOB细胞，以测量ER Ca²⁺外流。在这些条件下，Pacs1^-/-FOB细胞显示出胞质Ca²⁺通量减弱(图2I和2J)。观察到ER Ca²⁺外流的缺陷；然而，在细胞外介质中重新加入2mM Ca²⁺后，没有观察到Pacs1-/-FOB细胞中SOCE的明显下降。

脾脏CD8(图10E，10G-10H)和CD4(图10F，10I-10J)T细胞也在具有抗CD3且不含Ca²⁺的介质中刺激。与Pacs1^+/+T细胞相比，在Pacs1^-/-T细胞中观察到ER Ca²⁺延迟释放。与FOB细胞一样，T细胞中的SOCE在重新加入2mM Ca²⁺后基本保持不变。在Ca²⁺加回后，CD8 T细胞的最大Ca²⁺通量略有减少，CD4 T细胞的最大Ca²⁺通量有减少的趋势，但没有达到统计学意义。

实施例3.Pacs1^-/-B细胞缺陷和Ca²⁺通量表型与抗原受体特异性无关

为了确定Pacs1缺失是否会使淋巴细胞的发育途径发生倾斜，从而选择具有减弱Ca²⁺通量表型的成熟群体，通过在Pacs1^-/-背景中引入B1-8i免疫球蛋白重链转基因来控制B细胞区室的储库倾斜。当与λ轻链配对时，表达B1-8i重链的B细胞与4-羟基-3-硝基苯基半抗原(NP)结合。

Pacs1^-/-；IgH^B1-8/+小鼠脾脏中的总FOB细胞数量减少，而MZB细胞群得以保留(图11A-11B)。通过用NP与藻红蛋白偶联的NP(NP-PE，图11C-11D)染色来鉴定NP特异性B细胞。在NP特异性人群中，Pacs1^-/-FOB细胞比Pacs1^+/+FOB细胞少。NP特异性Pacs1^-/-MZB细胞和NP特异性Pacs1^+/+MZB细胞的数量没有明显差异。

通过用NP-PE刺激评估Indo-1标记的NP特异性FOB细胞内的诱导性Ca²⁺通量。与Pacs1^+/+NP特异性FOB细胞相比，Pacs1^-/-NP特异性FOB细胞在与NP-PE交联后Ca²⁺通量减少(图11E-11J)。随后用抗IgM刺激Pacs1^+/+NP特异性FOB细胞，以诱导胞质Ca²⁺通量出现第二个峰值。Pacs1^-/-NP特异性FOB细胞在第二次刺激后无法流通胞质Ca²⁺。两种基因型的多克隆FOB细胞群(NP-PE阴性细胞)在加入NP-PE后没有显示任何胞质Ca²⁺通量。随后加入的抗IgM显示，与Pacs1^+/+多克隆FOB细胞相比，Pacs1^-/-多克隆FOB细胞中Ca²⁺通量幅度减少。总之，这些数据表明，FOB细胞缺陷和Pacs1缺失导致的Ca²⁺通量缺陷与抗原受体特异性无关。

实施例4.Pacs1^-/-B细胞中ER Ca²⁺释放的上游信号传导是完整的

淋巴细胞中的胞质Ca²⁺通量由活化的磷脂酶Cγ-2(Plcγ-2)上游控制。抗IgM处理后未检测到Pacs1^-/-B细胞中Plcγ-2激活的缺陷(图12)。磷酸肌肽3-激酶-蛋白激酶B/Akt(Pi3K-Akt)和细胞外信号调节激酶(Erk)通路对B细胞的生存和抗原受体刺激下游的功能很重要。数据显示，这些途径在BCR交联后也被正常激活(图12)。总之，这些数据表明，Pacs1是淋巴细胞中在ER Ca²⁺释放水平上的正常Ca²⁺动员所必需的。

实施例5.Wdr37与Pacs1形成相互稳定的复合物

Pacs1是促进细胞内蛋白质运输的胞质适配体。为了确定货物蛋白的不正确定位是否导致Pacs1^-/-表型，对从细胞提取物中纯化的Pacs1相关蛋白复合物进行了免疫共沉淀(IP)质谱分析，以识别相关的候选相互作用因子。将FLAG-Pacs1转染到293T细胞并在抗FLAG树脂上亲和纯化。将磁珠固定的FLAG-Pacs1与来自纯化的野生型小鼠B细胞的胞质提取物进行孵育。将所得的蛋白复合物洗涤并从抗FLAG树脂上洗脱，并进行液相色谱串联质谱分析(LC-MS/MS)。作为阴性对照，将抗FLAG磁珠单独与B细胞提取物孵育，洗涤，洗脱，并进行LC-MS/MS。在FLAG-Pacs1样品中发现富集了104种蛋白质。

在候选相互作用因子中有WD重复域蛋白37(Wdr37)，其中鉴定出与循环B细胞的减少有关的两个ENU诱导的突变(图3A)。初始等位基因，基础型，编码早期终止密码子(L182*)。第二个等位基因，深度型，是关键剪接位点的突变，预计为无效等位基因。在淋巴组织中，在Pacs1不存在的情况下，Wdr37蛋白的量会明显减少(图13A)。

为了验证Pacs1和Wdr37之间的物理相互作用，用FLAG标记的Pacs1(氨基酸171-961)和HA标记的全长Wdr37共同转染HEK 293T细胞(图3B和3C)。在这些条件下，HA-Wdr37与FLAG-Pacs1免疫共沉淀。在以FLAG-Wdr37作为诱饵、HA-Pacs1作为靶标的相互免疫共沉淀实验中，这些蛋白也有相互作用。这些数据证明了Pacs1-Wdr37复合物的形成。

使用CRISPR/Cas9编辑在Wdr37的外显子4中产生移码2bp缺失等位基因(图13C)。这些小鼠的外周血细胞缺乏可检测的Wdr37，并显示出Pacs1的表达水平降低，这表明这些蛋白在体内相互稳定(图3D)。在瞬时转染的293T细胞中，使用环己胺(CXH)脉冲试验进一步评估了Pacs1和Wdr37在共同表达期间的稳定性。与相互稳定的模型相一致，FLAG-Pacs1和HA-Wdr37在共转染期间以更高的水平表达，并且在CXH脉冲后比各自单独表达时衰减得更慢(图13B)。

与Pacs1^-/-小鼠一样，Wdr37^-/-小鼠的循环T和B细胞的绝对数量减少(图3E)。此外，Wdr37^-/-FOB细胞响应于BCR交联而显示出胞质Ca²⁺通量减弱(图3E-3I)。在不含Ca²⁺的缓冲液中刺激这些细胞显示，这种表型与Ca²⁺从ER外流的缺陷有关，而SOCE则被保留下来，正如在Pacs1^-/-小鼠中发现的那样(图3J和3K)。

实施例6.Pacs2^-/-小鼠具有正常比例的循环B细胞

通过质谱法鉴定的另一中候选相互作用因子是Pacs1的同源物Pacs2。Pacs1和Pacs2有54％的序列同一性，通常在不同的细胞内分选环中发现。使用CRISPR/Cas9在小鼠中产生Pacs2的敲除等位基因(图14A-14B)。与Pacs1^-/-小鼠相反，在Pacs2^-/-小鼠中没有观察到外周B细胞缺乏(图14C)。此外，Pacs2^-/-FOB细胞在用抗IgM刺激后具有正常的胞质Ca²⁺通量(图14E)。最后，Pacs2缺失并没有降低Pacs1或Wdr37的稳定性(图14D)。因此，Pacs1和Pacs2在适应性免疫系统中有不同的作用，其中Pacs1是维持循环淋巴细胞群所独特需要的。

实施例7.Pacs1缺失诱导ER应激、ROS和对氧化应激的敏感性增强

ER Ca²⁺稳态的变化可引起蛋白质的不当折叠。为了评估Pacs1^-/-淋巴细胞中的ERCa²⁺外流缺陷是否可能与ER应激增加有关，测定了细胞中ER应激标志物的量。虽然Pacs1^-/-B细胞的ER质量与基于钙网蛋白表达的Pacs1^+/+B细胞相当，但它们在基线时显示出ER应激标志物Grp78/BiP和CHOP的显著上调(图4A)。用5mcg/ml抗IgM刺激B细胞过夜，减少了Pacs1^+/+和Pacs1^-/-B细胞中BiP的表达，而CHOP的表达在经刺激的Pacs1^-/-B细胞中仍然升高。

ER应激和改变的细胞Ca²⁺稳态可以根据细胞环境激活或抑制自噬。在未经刺激的脾脏B细胞中以及用5mcg/ml抗IgM过夜处理后，测量Pacs1缺失对自噬诱导的影响(图4A)。在未经刺激的Pacs1^+/+或Pacs1^-/-B细胞中，未检测到自噬体标志物LC3B-II，并且自噬受体p62的基础表达相似。在抗原受体刺激下，观察到Pacs1^+/+和Pacs1^-/-B细胞之间类似水平的LC3B-I到LC3B-II的转换，表明自噬诱导完整。p62的诱导水平反映了LC3B-II的转化，并且与Pacs1的基因型无关。

一部分来自ER的Ca²⁺被线粒体吸收，其中它增强了参与氧化代谢的多种酶的活性。为了确定淋巴细胞中Pacs1的缺失如何调节线粒体功能，收获了Pacs1^+/+和Pacs1^-/-小鼠的脾脏B细胞，在基线时和用5mc/ml抗IgM刺激过夜后测量耗氧量(图4B)。Pacs1^+/+和Pacs1^-/-B细胞含有相似的线粒体数量(图15F-15G)。在来自Pacs1^+/+和Pacs1^-/-小鼠的纯化B细胞中测量耗氧率(OCR)。发现Pacs1^-/-B细胞的细胞耗氧量略微升高，其在抗原受体刺激后增加，并且Pacs1^-/-B细胞的线粒体OCR在基线时略微升高(图15H)。与氧化代谢和ER应激的升高相一致，基于CellRox Green染色，Pacs1^-/-B细胞还显示出细胞活性氧(ROS)的增加(图4C-4D)。

检查了Pacs1^-/-淋巴细胞中ER和线粒体功能障碍如何影响其对细胞死亡刺激的敏感性。对来自Pacs1^-/-小鼠的脾细胞染色以识别FOB细胞，并加载TMRE以测量线粒体膜电位(MMP)。然后用过氧化氢(H₂O₂)处理细胞以诱导氧化性细胞死亡。在基线时，TMRE低Pacs1^-/-FOB细胞的数量有少量增加。在H₂O₂处理35分钟后，约75％的Pacs1^-/-FOB细胞显示出MMP的损失，而约40％的Pacs1^+/+细胞显示出对氧化应激的敏感性增加(图4E-4G)。

实施例8.Pacs1^-/-B细胞的IP3R表达和ER Ca²⁺储存减少

Pacs1^-/-和Wdr37^-/-淋巴细胞的ER Ca²⁺外流缺陷可能是两种可能机制的结果：首先，ER Ca²⁺释放可能被阻断；其次，ER Ca²⁺含量可能因储存能力减弱或长期渗漏而减少。为了解决这些可能性，在Pacs1^+/+和Pacs1^-/-B细胞中测量了三种SERCA通道亚型(SERCA1、SERCA2和SERCA3)和IP3R亚型(IP3R1、IP3R2和IP3R3)的蛋白表达(图5A)。在Pacs1^-/-B细胞中发现所有三种IP3R受体亚型的表达量都显著减少，但观察到SERCA2水平完整。B细胞中未检测到SERCA1和SERCA3蛋白表达。

令人惊讶的是，发现IP3R表达的Pacs1依赖性调节发生在转录水平：Pacs1^-/-B细胞中IP3R1、IP3R2和IP3R3 mRNA水平都急剧下降(图5B)。还发现Pacs1-/-B细胞中SERCA2的转录水平降低，这与这些细胞中检测到的SERCA2蛋白的丰度形成对比。在Pacs1^+/+或Pacs1^-/-B细胞中均未检测到SERCA1和SERCA3的转录本。

接下来通过在不含Ca²⁺的介质中用SERCA抑制剂毒胡萝卜素刺激负载Indo-1的Pacs1^-/-FOB细胞来测量ER Ca2+储存(图5C)。与Pacs1^+/+FOB细胞相比，Pacs1^-/-FOB细胞显示出由毒胡萝卜素引起的胞质Ca²⁺的平稳性有小幅但显著的下降，表明ER Ca²⁺储存减少(图5D)。计算Indo-1信号的曲线下面积(AUC)显示两个品系之间没有大的差异，表明Pacs1^-/-B细胞中ER Ca²⁺储存基本完好(图5E)。总之，这些发现表明，Pacs1^-/-淋巴细胞中的ER Ca²⁺外流缺陷源于IP3R表达的减少和ER Ca²⁺含量的降低。

实施例9.Pacs1缺失改变了ER Ca²⁺处理

为了更好地确定Pacs1在亚细胞区室之间的Ca²⁺通量中的作用，使用CRISPR-Cas9在NIH-3T3成纤维细胞中缺失Pacs1(图6A)。Pacs1^-/-3T3细胞表现出Wdr37和IP3R表达减少，以及ER应激标志物增加。在Pacs1^-/-3T3细胞中观察到了IP3R减少和BiP与CHOP诱导程度方面的克隆变化。此外，在Pacs1^-/-3T3细胞中观察到IP3R转录本的减少(图6B)。WT和Pacs1^-/-3T3细胞转染了Ca²⁺敏感的水母发光蛋白构建体，并发现它们在用缓激肽刺激IPR3R后减弱了Ca²⁺通量(图6C和6D)。因此，Pacs1^-/-3T3细胞再现了在Pacs1^-/-原代淋巴细胞中观察到的几个关键特征。因此，Pacs1^-/-3T3细胞再现了在Pacs1^-/-原代淋巴细胞中观察到的几个关键特征。

用ER-GCaMP6转染Pacs1^-/-3T3细胞，ER-GCaMP6是靶向ER的基因编码的低亲和力比率Ca²⁺指示剂。在用ATP处理引发IP3介导的ER Ca²⁺释放之前和之后对转染的细胞进行成像(图6E)。Pacs1^-/-3T3细胞在ATP刺激后显示出ER Ca²⁺释放的大量减少，这与这些细胞中IP3R的表达减少是一致的(图6F)。刺激前的Ca²⁺水平分析也显示选择Pacs1^-/-3T3克隆的基础ERCa²⁺含量减少(图6G)。这一结果，结合Pacs1^-/-FOB细胞中ER Ca²⁺储存减少和Pacs1^-/-细胞中ER应激增加的发现，表明Pacs1缺失也可能导致慢性ER Ca²⁺渗漏。

为了精确测量ER的Ca²⁺渗漏，用靶向ER的水母发光蛋白(erAEQ)转导Pacs1^+/+和Pacs1^-/-3T3细胞。表达erAEQ的Pacs1^-/-3T3细胞在缓激肽刺激后显示出ER Ca²⁺释放的强烈减少，这证实了ER-CGamP6 Ca²⁺报告基因的结果(图15A和15B)。为了评估ER Ca²⁺渗漏，在含Ca²⁺的培养基中用可逆的SERCA抑制剂2,5-t-丁基氢醌(tBHQ)处理细胞(图6H)。Pacs1^-/-3T3细胞在tBHQ处理后显示出明显较快的ER Ca²⁺外流，表明基础ER Ca²⁺渗漏增加(图6I和6J)。总之，对3T3细胞系模型的研究表明，Pacs1的缺失通过减少IP3R的表达和增加ER Ca²⁺的渗漏来阻止Ca²⁺的释放，从而影响ER Ca²⁺的处理。

实施例10.Pacs1缺失对线粒体Ca²⁺稳态的影响

IP3R介导的ER Ca²⁺释放后，线粒体Ca²⁺浓度增加。为了确定Pacs1缺失对线粒体Ca^{2 +}处理的影响，使用类似于Bohler等人，(2018)Cell Death Dis 9:286中描述的方法(其公开内容全部并入本文)，用MSCV-Mito-Pericam感染Pacs1^+/+和Pacs1^-/-3T3细胞。然后用ATP刺激细胞(图15C和15D)。Pacs1^-/-3T3细胞在ATP刺激后显示最大线粒体Ca²⁺流入量显著减少，这与本文的数据一致，显示Pacs1缺失减弱通过IP3R的ER Ca²⁺释放。当用靶向线粒体的GCaMP6测量Pacs1^-/-和Pacs1^+/+3T3细胞中的基础线粒体Ca²⁺含量时，未检测到显著的差异(图15E)。

实施例11.Pacs1^-/-B细胞在体外正常增殖并且Pacs1^-/-小鼠在免疫后出现正常的体液反应

接下来研究Pacs1缺失对适应性免疫功能的影响。B细胞胞质Ca²⁺通量的缺陷通常会导致体外对抗原受体刺激的增殖反应减弱。从Pacs1^+/+和Pacs1^-/-小鼠中分离出B细胞，用CellTrace Violet(CTV)染料进行标记。用单独的抗IgM、抗IgM和抗CD40模拟T辅助细胞或脂多糖(LPS)来刺激被标记的细胞。在所有刺激72小时后，Pacs1^-/-B细胞显示出与Pacs1^+/+B细胞相当的体外增殖反应(图7A)。

阻断胞质Ca²⁺通量的遗传损伤导致SCID。分别用铝盐佐剂沉淀的卵清蛋白(明矾-ova)和与聚蔗糖缀合的NP(NP-聚蔗糖)免疫Pacs1^+/+和Pacs1^-/-小鼠以刺激T细胞依赖性(TD)和T细胞非依赖性(TI)产生抗体反应。Pacs1缺失并不影响明矾-ova免疫后14天的抗ova IgG滴度或NP-聚蔗糖免疫后7天的抗NP IgM滴度(图7B和7C)。使用菊苣(ccy)谱系的小鼠评估了Pacs1对产生高亲和力抗体的重要性。Pacs1^+/+和Pacs1^ccy/ccy小鼠用明矾上沉淀的NP-KLH进行免疫。免疫后14天，两个品系之间针对NP30-BSA(低亲和力IgG)和NP2-BSA(高亲和力IgG)的IgG滴度是相同的(图7D和7E)。这些数据表明，Pacs1^-/-B细胞在体外具有正常的增殖能力，在体内具有功能性。

实施例12.Pacs1^-/-B细胞在淋巴细胞丰富的环境中自发地激活和死亡

为了确定缺陷细胞内Ca²⁺稳态与ER应激和ROS增加相结合是否缩短了Pacs1^-/-淋巴细胞在体内的寿命，从Pacs1^+/+和Pacs1^-/-小鼠的脾脏中分离出B细胞，并分别用CellTraceFar Red(CTFR)和CTV染料标记它们。标记的B细胞以1:1的比例移植到未辐照的CD45.1受体中(图7F-7L)。移植后8天，通过CD45.2染色并测量CTFR和CTV荧光，在受体小鼠的脾脏中检测出过继移植的B细胞。在这种检测中，大多数移植B细胞不应该进行细胞分裂，因为如果不对受体进行淋巴毒性预处理，就不会刺激稳态扩张。因此，<25％的过继移植的Pacs1^+/+B细胞在过继移植后稀释了CTFR。引人注目的是，移植后8天，>95％的过继移植的Pacs1^-/-B细胞自发增殖(图7F-7M)。伴随着这一点，相对于受体小鼠脾脏中的Pacs1^+/+B细胞而言，过继移植的Pacs1^-/-B细胞恢复得很差。如通过膜联蛋白V染色测量的，也观察到过继移植的Pacs1^-/-B细胞有较高的凋亡率(图7N)。

用胸苷类似物5-乙炔-2′-脱氧尿苷(EdU)进行脉冲追踪分析来验证稳态条件下Pacs1缺失对B细胞更新的影响。给Pacs1^+/+和Pacs1^-/-小鼠注射一次EdU，以标记初级和次级淋巴器官中活跃的循环细胞(图7O和7P)。在EdU脉冲后1、4和7天收获脾细胞，用流式细胞仪测量EdU阳性的FOB和MZB细胞的频率。脉冲后一天，与Pacs1^+/+小鼠相比，Pacs1^-/-小鼠脾脏中EdU阳性FOB细胞的频率增加了约2倍，表明外周活跃增殖细胞的比例更高。脉冲后第4天，Pacs1^-/-小鼠脾脏中EdU阳性FOB细胞的频率增加约3至4倍，反映了未成熟B细胞向成熟FOB群体的募集。EdU标记的Pacs1^-/-FOB细胞迅速衰减，到第7天时大部分消失。相反，脉冲后第4天，EdU标记的Pacs1^+/+FOB细胞的频率增加约1.5至2倍，在第7天分析时保持稳定。MZB细胞寿命长，周转率慢，这反映在所有时间点Pacs1^+/+和Pacs1^-/-脾脏中EdU+细胞频率较低。这些数据表明，Pacs1^-/-FOB细胞具有加速的周转率，并支持本文在过继移植测试中观察到自发的B细胞增殖和凋亡。

B细胞群通过稳态细胞因子如BAFF在体内维持。为了确定这些稳态细胞因子的刺激是否可以引起Pacs1^-/-B细胞的自发增殖和周转率的增加，从Pacs1^+/+和Pacs1^-/-小鼠中收获脾脏B细胞，并在体外用BAFF和IL4分别和一起刺激72小时(图16)。用抗IgM和抗CD40的刺激作为阳性对照。虽然Pacs1^+/+和Pacs1^-/-B细胞对抗IgM和抗CD40表现出正常的增殖反应，但在BAFF、IL-4或联合处理后，两个群体都没有表现出显著的增殖。

实施例13.Pacs1缺失抑制淋巴细胞增殖模型中的异常淋巴细胞积累

有缺陷的淋巴细胞死亡途径对自身免疫、淋巴增生性疾病和血液学恶性肿瘤的发展至关重要。抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤2(Bcl2)在B细胞恶性肿瘤中经常过度表达，是肿瘤发生的关键因素。Bcl2的过表达既通过抑制线粒体外膜上的Bak和Bax寡聚化，又通过与IP3R结合来限制从ER到线粒体的促凋亡Ca²⁺信号，从而阻断线粒体凋亡途径。基于在Pacs1^-/-小鼠中观察到的B细胞强烈耗竭，接下来研究了Pacs1缺失是否可以恢复B细胞在强制Bcl2表达情况下的死亡能力。

B细胞中过表达Bcl2的小鼠谱系(Bcl2TG)出现了FOB细胞的异常扩增(图8A)。Pacs1^-/-小鼠与Bcl2TG小鼠杂交，并分析了>20周龄的后代中的B细胞数量。与Pacs1^+/-；Bcl2TG同窝小鼠相比，Pacs1^-/-；Bcl2TG小鼠的外周血中B细胞计数减少，脾脏FOB细胞计数正常(图8B-8D)，表明Pacs1缺失可以覆盖Bcl2阻断B细胞死亡的作用。

为了更好地了解Pacs1缺失如何阻断Bcl2TG B细胞的扩增，将CTFR标记的Pacs1^+/-；Bcl2TG B细胞和CTV标记的Pacs1^-/-；Bcl2TG B细胞移植到未经辐照的CD45.1受体中。在移植后7天，大约25-50％的Pacs1^+/-；Bcl2TG细胞显示出自发增殖。相反，>95％的移植Pacs1^-/-；Bcl2-TG B细胞发生了细胞分裂(图8E-8L)。此外，与来自受体脾脏的Pacs1^+/-；Bcl2TG B细胞相比，Pacs1^-/-；Bcl2TG B细胞恢复的频率要低得多，并显示出较高的凋亡率(图8M和8N)。与Pacs1^-/-细胞一样，从Pacs1^-/-；Bcl2TG小鼠脾脏中分离的B细胞在用H₂O₂处理后对氧化应激更敏感(图8O-8Q)。这些数据表明，Pacs1的缺失通过增加对细胞死亡刺激的敏感性和降低淋巴细胞的静止性，覆盖了强制Bcl2表达的效果。

据观察，Pacs1缺失在TCR刺激后引起T细胞数量减少和Ca²⁺通量缺陷。因此，使用Faslpr淋巴增殖模型评估了Pacs1缺失对T细胞谱系的淋巴增生性疾病的影响。小鼠和人类中功能丧失的Fas突变导致了异常的CD3⁺B220⁺T细胞群的年龄依赖性扩增，这些细胞在淋巴结中大量积累。Pacs1^-/-小鼠与Fas^lpr/lpr小鼠在C57BL/6J背景下进行杂交，并对老年小鼠(>24周)的外周血和淋巴结细胞数进行监测。与Pacs1^+/+；Fas^lpr/lpr小鼠相比，观察到Pacs1^-/-；Fas^lpr/lpr小鼠的CD3⁺B220⁺细胞和大淋巴结肿大有显著抑制(图8R-8V)。总之，这些数据表明，Pacs1-Wdr37的破坏可以有效地抑制B和T细胞谱系中引细胞内在和外在凋亡途径受阻引起的淋巴增生性疾病。

通过对随机诱变的小鼠进行正向遗传筛选，本文发现已知的细胞内运输蛋白、磷酸弗林酸性簇分选蛋白1(Pacs1)由于其在ER Ca²⁺处理中的作用而对于循环淋巴细胞的发育和存活是必需的。

对实施例1-13的讨论

通过正向遗传筛选和生化方法，发现Pacs1和Wdr37是正常淋巴细胞稳态所必需的。Pacs1和Wdr37小鼠的淋巴细胞缺陷与ER Ca²⁺处理的问题有关。Pacs1的缺失导致IP3R的表达减少，随后从ER排空的Ca²⁺减少。有趣的是，Pacs1的缺失还导致低水平的慢性ER Ca²⁺渗漏。Pacs1^-/-B细胞显示出ER应激、氧化代谢和ROS的升高，并对体外的氧化应激高度敏感。在过继移植到淋巴细胞丰富的受体后它们还表现出自发的静止状态丧失。令人惊讶的是，Pacs1^-/-小鼠的免疫能力没有重大缺陷。然而，它们对因细胞内或细胞外凋亡途径受阻而导致的淋巴增生性疾病有明显的抵抗力。

Pacs1^-/-细胞中IP3R的表达减少。在Pacs1^-/-B细胞中观察到所有三种IP3R亚型的表达均减少，这使抗原受体刺激后的胞质Ca²⁺通量减弱。当3T3细胞中Pacs1被缺失时，IP3R也被下调，这表明存在一个普遍保守的机制。发现原代细胞和3T3细胞中IP3R的表达在转录本水平上都有所下降。Pacs1缺失可能通过利用IPR3的下调来调节IPR3基因的表达，IPR3的下调作为对发生在Pacs1缺失后的慢性ER Ca²⁺渗漏、ER应激增加和ROS产生的适应性反应用来补偿ER Ca2+耗竭和破坏的蛋白稳态，向细胞核发出信号下调ER Ca²⁺通量机制。这个信号可以通过由典型的ER应激或ROS信号网络进行传导。

Pacs1-Wdr37和ER Ca²⁺渗漏。除了导致IP3R的下调外，Pacs1的缺失还导致ER Ca²⁺渗漏增加。不希望受理论束缚，Pacs1^-/-淋巴细胞中的慢性ER Ca²⁺渗漏可能导致其ER应激表型升高和细胞死亡率增加。Pacs1-Wdr37防止ER Ca²⁺渗漏的机制可能是Pacs1-Wdr37直接调节ER Ca²⁺通量机制。事实上，我们在Pacs1相互作用组分析中发现，SERCA2是候选相互作用蛋白。此外，在几类离子通道中，IP3R受体含有Pacs蛋白结合基序，是假定的Pacs1货物分子。因此，Pacs1-Wdr37可以通过增强SERCA泵的功能或通过减弱基础IP3R Ca²⁺渗漏特性来维持ER Ca²⁺含量。Pacs1-Wdr37破坏可能更普遍地增加ER应激，例如，通过禁用蛋白质运输的关键步骤。慢性ER应激可通过增加IP3R活性引起促凋亡性ER Ca²⁺渗漏。

Pacs1^-/-B细胞失去静止状态。Pacs1^-/-B细胞中ER应激和ROS的产生增加可能促使体内细胞凋亡的速度加快。出乎意料的是，Pacs1^-/-B细胞在被过继移植到淋巴细胞丰富的受体时也会自发增殖。Pacs1^-/-B细胞在体外对抗原受体信号传导显示出正常的增殖反应，在受到稳态细胞因子的刺激后没有自发增殖。Pacs1^-/-细胞的慢性ER Ca²⁺渗漏可能导致STIM介导的SOCE阈值降低和过早的淋巴细胞激活，导致Pacs1^-/-B细胞自发增殖。随着ER应激和ROS的升高，以及缺乏第二生存信号，如CD40或TLR刺激，预计这些细胞在激活后不会长期存活。这个模型可以解释Pacs1^-/-淋巴细胞的另一个特点。虽然在毒胡萝卜素处理后测量到ER Ca²⁺储存减少，但在有持续ER Ca²⁺渗漏的细胞中，这种差异的幅度并不像预期的那么大。然而，如果ER储存高度耗尽的淋巴细胞更容易被激活和细胞死亡，则可以预期在任何时候总淋巴细胞群中都会残留相对较小的部分。相反，该群体将主要由最适合保留ER Ca²⁺的淋巴细胞组成，例如，通过下调IP3R。

抑制淋巴增生性疾病的一种新机制。在影响B细胞(Bcl2过表达)和T细胞(Fas^lpr)的两种临床相关的淋巴增生性疾病模型中，本文的Pacs1缺失限制了淋巴细胞的扩增。本文的示例性方法表明，Pacs1-Wdr37通过支持正常细胞Ca²⁺稳态并减少ER和氧化应激来维持淋巴细胞的静止状态。超越患病淋巴细胞的静止状态以强制其消除是抑制淋巴疾病的一种新方法。因此，Pacs1-Wdr37是淋巴增生性疾病和可能的淋巴恶性肿瘤的可行治疗靶点。Pacs1-Wdr37的药理破坏可能会与现有的针对淋巴细胞生存因子如Bcl2(venetoclax)、BTK(ibrutinib)和PI3K(idelasib)的血液系统恶性肿瘤疗法产生协同作用。因此，Pacs1、Wdr37和/或Pacs1-Wdr37可以限制由其他白血病发生模式(如c-Myc过表达、p185 Bcr-Abl或组成型Notch激活)驱动的淋巴细胞扩增。

人类的Pacs1和Wdr37综合症。Pacs1 FBR(R203W)的自发性复发性常染色体显性突变被确认为具有颅面异常综合症和智力障碍儿童的致病基因病变。Pacs1R203W的致病机制尚不清楚，目前认为是一种显性失活或功能获得突变。同样，携带Wdr37变异的受试者具有与癫痫、发育迟缓和小脑发育不全有关的症状。果蝇Wdr37同源物的缺陷具有严重的神经系统缺陷，而人类的突变体不能挽救这些缺陷。Pacs1^-/-和Wdr37^-/-小鼠都没有显著的神经系统表型。测试突变体蛋白对亚细胞Ca²⁺处理、ER和氧化应激以及Pacs1、Wdr37和Pacs1-Wdr37复合物形成的影响可以阐明这些人类综合征的病理生理学，并确定Pacs1、Wdr37和Pacs1-Wdr37在神经元功能中的作用。

实施例1-13中使用的方法

小鼠品系。小鼠被安置在德克萨斯大学西南医学中心的特定无病原体条件下，所有的实验程序都是按照机构批准的方案进行的。8-10周龄的C57BL/6J雄性小鼠从杰克逊实验室购买，并用ENU诱变，类似于以前描述的方法(George等人，2008)。ENU诱变的第0代(G0)雄性的战略育种，全外显子组测序、表型筛选和G3小鼠的自动绘图与以前描述的方法类似(Wang等，2015)。B6 CD45.1、Rag2^-/-、Fasl^pr/lpr、Ightm2Cgn(IgH^B1-8i)和Tg(BCL2)22Wehi/J(Bcl2^TG)小鼠均购自杰克逊实验室。Pacs1^-/-；Faslpr/lpr、Pacs1^-/-；Bcl2TG和Pacs1^-/-；IgH^B1-8/+小鼠是通过小鼠品系杂交产生的。使用10-16周龄的雄性和雌性小鼠进行实验。为了引起淋巴细胞数量的增加，Fas^lpr/lpr和Bcl2^TG背景的小鼠年龄更长(>20周)。

使用CRISPR/Cas9系统产生基因敲除小鼠品系。为了产生单一的基因敲除小鼠品系，雌性C57BL/6J小鼠通过注射6.5单位(U)怀孕马血清促性腺激素(PMSG；Millipore)，48小时后再注射6.5U人绒毛膜促性腺激素(hCG；Sigma-Aldrich)进行超排卵。随后将超排卵小鼠与C57BL/6J雄性小鼠交配过夜。第二天，从输卵管收集受精卵，体外转录的Cas9 mRNA(50ng/mcl)和Pacs1、Pacs2或Wdr37小碱基配对指导RNA(50ng/mcl；Pacs1：5'-CATCTCGCTTAAGGAAATGA-3'(SEQ ID NO：1)；Pacs2：5'-ATGTGATCTCAAGACGCT-3'(SEQ IDNO：2)；Wdr37：5'-GTGAAGGACAAGCGATCGAT-3'(SEQ ID NO：3))被注射到胚胎的细胞质或原核。注射的胚胎在M16培养基(Sigma-Aldrich)中于37℃、5％的CO2下培养。为了生产突变体小鼠，将两细胞期的胚胎移植到假孕的Hsd:ICR(CD-1)雌性小鼠(Harlan实验室)的输卵管壶腹部(每个输卵管10-20个胚胎)。

质粒。小鼠Pacs1(氨基酸114-961)、全长小鼠Wdr37和全长小鼠SERCA2在pcDNA6载体中用N端FLAG或HA表位标记。对质粒进行了测序，以确认没有不需要的突变。质粒的详细信息可根据要求提供。

免疫和ELISA。对于TD免疫，通过腹膜内途径给小鼠注射200mcg卵清蛋白或吸附在氢氧化铝水凝胶(InvivoGen)上的100mcg NP-KLH(BioSearch)。对于TI免疫，小鼠腹膜内注射50mcg TNP-聚蔗糖(BioSearch)。在指定的时间点，用MiniCollect管(MercedesMedical)采集外周血，并在10,000rpm下离心，以分离血清用于ELISA分析。对于高亲和力和低亲和力的抗体检测，Nunc MaxiSorp平底96孔微孔板(Thermo Fisher Scientific)包被有5mcg/ml NP2-BSA或NP30-BSA(BioSearch)。用BioTek微孔板清洗机清洗四次，然后用含1％(v/v)牛血清白蛋白(BSA)的PBS在室温(25℃±3℃)下封闭1小时。将免疫小鼠的血清在准备好的ELISA板中进行连续稀释。孵育2小时后，用洗涤缓冲液洗板8次，然后用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗鼠IgG(Thermo)在室温下孵育1小时。用洗涤缓冲液清洗平板8次，然后用SureBlue TMB微孔过氧化物酶底物和TMB终止液(KPL)显影。在Synergy Neo2读板器(BioTek)上测量450nm处吸光度。

骨髓嵌合体和过继移植实验。移植前24小时，Rag2^-/-受体小鼠接受分次剂量的11Gy致死辐照(X-RAD 320,Precision X-ray)。从指定的供体品系的胫骨和腓骨中冲出骨髓。红细胞在RBC裂解液(BD Biosciences)中裂解，对骨髓细胞计数并按1:1的比例合并。将大约500-600万个细胞通过眶后途径静脉注射给Rag2^-/-受体。移植后的8周内，受体小鼠维持饮用抗生素水。移植后16周，收获初级和次级淋巴组织，根据谱系、CD45.1和CD45.2染色评估供体嵌合度。对于B细胞过继移植，从指定的供体品系的脾脏中将B细胞纯化到>90％的纯度(pan-B分离试剂盒；StemCell Technologies)。根据制造商的说明，用CTFR或CTV增殖染料(Molecular Probes)对细胞进行染色。差异标记的细胞以1:1的比例组合，将300-400万个细胞静脉注射到未受辐照的CD45.1受体中。移植后7-8天，收获受体小鼠的脾脏。根据CD45.2的阳性染色和增殖染料的荧光来评估供体细胞的频率和增殖状态。

转染，免疫共沉淀和蛋白印迹。HEK293T细胞保持在含有10％ FBS的DMEM中。根据制造商的说明，在6孔板中用2mcg的指定构建体在Lipofectamine 2000的作用下转染细胞。转染后36-48小时，用冷的PBS冲洗细胞，在含有1％ NP-40和HALT蛋白酶抑制剂(Thermo)的缓冲液中裂解。通过将M2抗FLAG树脂(Sigma)与细胞裂解物在4℃下颠倒旋转孵育2小时，进行FLAG标记蛋白的免疫沉淀。将珠子在冷裂解缓冲液中洗涤四次，用150mg/ml的3×FLAG肽(Sigma)洗脱蛋白复合物。样品在2×SDS样品缓冲液中稀释，在SDS-PAGE上运行，并按照标准程序转移到硝酸纤维素膜上。对于原代细胞的蛋白印迹，将细胞沉淀在含有1％ SDS和HALT蛋白酶抑制剂的缓冲液中裂解。蛋白质水平用二辛可宁酸(BCA)测定法(Pierce)进行归一化处理，10-15mcg的蛋白质在2×SDS样品缓冲液中稀释并跑SDS-PAGE。

Pacs1敲除的NIH-3T3细胞系的产生。用pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)转染NIH-3T3细胞(ATCC)，该pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)编码靶向小鼠Pacs1的基因座的小碱基配对指导RNA(5'-CATCTCGCTTAAGGAAATGA-3'(SEQ ID NO:1))。转染48小时后，用流式细胞仪对GFP+细胞进行分选，并通过有限稀释法选择单菌落。通过免疫印迹法筛选出Pacs1缺失的克隆细胞系。

淋巴细胞Ca²⁺通量测量。从所述品系中收获脾细胞，并裂解RBC。根据制造商的说明，在含有2％ FBS(R2)的RPMI中，用Indo-1,AM(Molecular Probes)在37℃下对细胞加载30分钟。染料加载后，在冰上用荧光缀合抗体进行细胞表面染色20分钟以分辨T和B细胞亚群。细胞在冷的PBS中洗涤一次，并以1000万细胞/ml的重悬于冷R2中。为了测量Ca²⁺通量，将100mcl细胞稀释到900mcl的温热R2中，并在37℃下孵育2分钟。然后用流式细胞仪测量抗IgM(Invitrogen)处理后的Indo-1荧光。对于Ca²⁺储存动员，将100mcl标记的脾细胞稀释到含有1mM EGTA和10mM HEPES的900mcl温热HBSS中，并在37℃下孵育2分钟。

亚细胞Ca²⁺测量。对于细胞膜AEQ(cytAEQ)，将含有转染细胞的盖玻片与5mcM腔肠素在KRB(Krebs-Ringer改良缓冲液：125mM NaCl,5mM KCl,1mM Na3PO4,1mM MgSO4,5.5mM葡萄糖,20mM Hepes,pH 7.4,37℃)中孵育1-2小时，补充1％FCS，然后转移到灌注室。为了高效重建针对ER的AEQ嵌合体(erAEQ)，首先必须减少管腔内的Ca²⁺。这是通过将细胞在补充有5mcM腔肠素、离子霉素和600mcM EGTA的KRB中于4℃孵育1小时来实现的。孵育后，用补充有2％BSA和1mM EGTA的KRB彻底洗涤细胞。所有AEQ的测量都在KRB中进行，所有激动剂和其他药物也都溶解在KRB中。通过在含有10mM CaCl2的低渗溶液中用100mcM洋地黄皂苷裂解细胞来终止实验，从而排出剩余的AEQ池。与之前描述的方法类似(Bonora等人，2013)，收集光信号并校准为[Ca²⁺]值。

与之前描述的方法(Filippin等人，2003；Patron等人，2014)类似地进行Ca²⁺成像实验。简单地说，用2mtGCaMP6m或ER-GCaMP6-210编码质粒转染细胞，转染后24小时转移到玻璃盖玻片上。在指定的情况下，用编码Mito-Pericam的生态逆转录病毒(pMSCVpuro-Mito-Pericam)感染细胞。在补充有1mM CaCl₂、1％FCS和20mM HEPES、pH7.4的HBSS中，在37℃下进行成像。图像在带有高倍率油浸镜头(40×或60×，n.a.1.4)的广域荧光显微镜上获得。细胞在474nm和410nm处交替辐照，通过515/30nm带通滤波器收集荧光。用Fiji开源软件进行分析。两幅图像都通过滚球算法逐帧进行背景校正，然后手动阈值化以选择正像素。数据以所有时间点的平均比率的平均值表示。

蛋白质组学。将FLAG-Pacs1转染到HEK 293T细胞中。在转染后48小时，用含有1％NP-40的缓冲液裂解细胞，用M2抗FLAG树脂纯化FLAG-Pacs1。磁珠结合的FLAG-Pacs1在裂解缓冲液中洗涤四次，并与原代B细胞提取物在1％NP-40裂解缓冲液中在4℃下孵育过夜。作为阴性对照，FLAG磁珠与B细胞提取物在1％ NP-40裂解缓冲液中在4℃下孵育过夜。免疫共沉淀物在裂解缓冲液中洗涤四次，用150mg/ml的3×FLAG肽洗脱，并在6×SDS样品缓冲液中稀释。样品在SDS-PAGE上运行，直到它们进入分离胶约0.5厘米。蛋白质用Gel-Code Blue(Thermo)进行可视化，从凝胶上切下，并提交给UT Southwestern Proteomics Core进行LC-MS/MS分析，类似于之前描述的方法(Zhang等人，2016)。根据肽谱匹配(PSM)对数据进行半定量，并根据FLAG-Pacs1/磁珠的PSM比率对候选结合蛋白进行排序。

体外淋巴细胞研究。为了进行增殖测定，从所述品系的脾脏中纯化B细胞(pan-B分离试剂盒；StemCell Technologies)，并用CTV进行标记。在补充有2-巯基乙醇、谷氨酰胺和抗生素的X-VIVO 15(Lonza)的24孔板中，以100万细胞/毫升的浓度孵育被标记的细胞。用指定量的抗IgM(Invitrogen)、抗CD40(Mitenyi)、LPS(Enzo)、小鼠IL4(Biolegend)或小鼠BAFF(Peprotech)处理细胞。刺激后72小时，基于CTV稀释的FACS分析测量增殖。对于氧化性细胞死亡研究，将来自Pacs1^+/+和Pacs1^-/-小鼠的脾细胞在冰上染色以识别FOB细胞，然后在PBS中洗涤并重新悬浮于培养基中。然后在37℃下用100mcM H₂O₂(Sigma)处理约100万个细胞35分钟，再用30nM TMRE染色15分钟。使用FACS分析测量TMRE荧光。对于ROS分析，大约100万个脾细胞在冰上染色以确定FOB细胞，用PBS洗涤，然后根据制造商的协议用CellRoxGreen(Molecular Probes)孵育。为了进行耗氧研究，将纯化的脾脏B细胞单独放置或用抗IgM刺激过夜，然后根据发表的协议用XFe96或XFe24机器进行代谢流分析。将耗氧率标准化为铺板的总细胞数。

统计学分析。数据的正态分布由Shapiro-Wilk正态性检验来确定。对于正态分布的数据，实验组之间差异的统计学意义由学生非配对t检验确定。配对t检验用于比较Ca²⁺通量和ROS数据，用连接配对数据点的线表示。对于非正态分布的数据，如所示采用非参数检验。使用GraphPad Prism软件进行统计分析。P值<0.05的差异被认为是显著的。P值用*P＜0.05，**P＜0.01，和***P＜0.001表示。P值≥0.05的差异被认为不显著(ns)。

实施例1-13中引用的参考文献：

Bohler等人，(2018)Cell Death Dis 9:286；

Bonora等人，(2013)Nat Protoc 8:2105-2118；

Filippin等人，(2003)J Biol Chem 278:39224-39234；

Georgel等人,(2008)Methods Mol Biol 415：1-16；

Patron等人，(2014)Mol Cell 53:726-737；

Wang等人,(2015)Proc Natl Acad Sci USA 112:E440-E449；和

Zhang等人，(2016)Proc Natl Acad Sci USA 113：E6418-E6426.

SEQUENCE LISTING

<110> 得克萨斯大学体系董事会

布鲁斯·贝特勒

埃文·D·奈尔-吉尔

<120> 靶向PACS1的化合物及其使用方法

<130> 106546-706400 (UTSD 3609)

<150> US 63/121,002

<151> 2020-12-03

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列; gRNA Pacs1

<400> 1

catctcgctt aaggaaatga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列; gRNA Pacs2

<400> 2

atgtgatctc aagacacgct 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列; gRNA Wdr37

<400> 3

gtgaaggaca agcgatcgat 20

Claims (27)

1.一种减轻或预防有需要的受试者中淋巴增生的方法，所述方法包括向受试者施用有效调节磷酸弗林酸性簇分选蛋白1(Pacs1)的组合物，

其中调节Pacs1包括降低Pacs1基因表达，降低Pacs1蛋白表达，降低Pacs1活性，或其任何组合。

2.根据权利要求1的方法，其中所述有效调节Pacs1的组合物包括肽、抗体、化学品、化合物、寡聚物、核酸分子或其组合中的至少一种。

3.根据权利要求2的方法，其中所述核酸分子包括有效抑制或降低Pacs1表达的双链RNA。

4.根据权利要求3的方法，其中所述双链RNA选自小时序RNA、小核RNA、小核仁RNA、短发夹RNA和微小RNA。

5.根据权利要求4的方法，其中所述双链RNA是小干扰RNA。

6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述有效调节Pacs1的组合物进一步包括至少一种药学上可接受的赋形剂。

7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中施用所述有效调节Pacs1的组合物的受试者是患有、疑似患有或有风险患有至少一种淋巴增生性疾病、至少一种淋巴恶性肿瘤或其组合的受试者。

8.根据权利要求7的方法，其中患有、疑似患有或有风险患有至少一种淋巴增生性疾病的受试者是具有淋巴增生性疾病的一种或多种遗传标记的人类受试者。

9.根据权利要求8的方法，其中具有淋巴增生性疾病的一种或多种遗传标记的人类受试者包括已被诊断为患有或疑似患有自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、卡斯尔曼病(CD)、罗赛-道夫曼病病(RDD)、EB病毒相关淋巴增生性疾病(ELD)、X连锁淋巴增生综合征(XLP)、血管免疫性母细胞淋巴结病、半胱天冬酶-8缺陷综合征(CEDS)、Dianzani自身免疫性淋巴增生性疾病、Kikuchi-Fujimoto综合征、淋巴瘤样肉芽肿病、淋巴瘤样丘疹病、眼部附件淋巴增生、RAS相关白细胞增生性疾病(RALD)、p110δ激活突变引起的衰老性T细胞淋巴结病和免疫缺陷(PASLI)、CTLA-4单倍体功能不全伴自身免疫性浸润(CHAI)、LRBA缺陷伴自身抗体、调节性T细胞缺陷、自身免疫浸润和肠病(LATAIE)、X连锁免疫缺陷伴镁缺陷、EB病毒感染、和肿瘤形成(X-MEN)、白细胞介素-2诱导型T细胞激酶(ITK)缺陷，或其任意组合。

10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中施用所述有效调节Pacs1的组合物的受试者是免疫受损的受试者。

11.根据权利要求10的方法，其中免疫受损受试者包括已被诊断为患有或疑似患有普通变异型免疫缺陷(CVID)、严重联合免疫缺陷(SCID)、Wiskott-Aldrich综合征、共济失调性毛细血管扩张症、Chediak-Higashi综合征、一种或多种病毒感染、一种或多种真菌感染或其任意组合的人类免疫受损的受试者。

12.根据权利要求10或权利要求11的方法，其中人类免疫受损的受试者被诊断为患有或疑似患有人类免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸系统综合症冠状病毒1(SARS-CoV-1)、严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)、中东呼吸系统综合症(MERS)、人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)、人冠状病毒229E(HCoV-229E)、人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)，或其任意组合。

13.根据权利要求7-12中任一项的方法，其中患有、疑似患有或有风险患有至少一种淋巴恶性肿瘤的受试者包括患有至少一种淋巴恶性肿瘤的人类受试者，所述淋巴恶性肿瘤选自霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、成熟B细胞肿瘤、成熟T细胞和自然杀伤(NK)细胞肿瘤，和前体淋巴肿瘤。

14.根据权利要求1-13中任一项的方法，其中所述有效调节Pacs1的组合物被局部地、系统地、皮下地、静脉地或鼻内地施用给受试者。

15.根据权利要求1-14中任一项的方法，其中受试者已经或正在接受用于淋巴增生的至少一种其他疗法。

16.根据权利要求15的方法，其中用于淋巴增生的至少一种其他疗法包括给予化疗、利妥昔单抗、奥比妥珠单抗、硼替佐米、卡非佐米、阿扎胞苷、地西他滨、维奈托克、依鲁替尼、艾代拉西布、舒尼替尼、迪那西利布、考比替尼、伊达沙努林、奥利默森钠、丁酸钠、缩酚肽、芬维A胺、夫拉平度、棉子酚、ABT-737、ABT-263、GX15-070、HA14-1、抗霉素A、阿卡拉布替尼、扎鲁替尼、替拉替尼、硼替佐米、来那度胺、替西莫司，或其任意组合。

17.一种组合物，包括至少一种磷酸弗林酸性簇分选蛋白1(Pacs1)的抑制剂和药学上可接受的载体。

18.根据权利要求17的组合物，进一步包括至少一种药学上可接受的赋形剂。

19.根据权利要求17或权利要求18的组合物，其中Pacs1的至少一种抑制剂包括肽、抗体、化学品、化合物、寡聚物、核酸分子或其组合中的至少一种，且

其中，所述Pacs1的至少一种抑制剂抑制Pacs1的直接活性、抑制Pacs1的间接活性、抑制Pacs1和WD重复域蛋白37(Wdr37)之间的复合物的形成、减少Pacs1基因的表达、减少Pacs1蛋白的表达，或其任意组合。

20.根据权利要求19的组合物，其中所述Pacs1的至少一种抑制剂包括有效抑制或降低Pacs1的表达的包含双链RNA的核酸分子。

21.根据权利要求20的组合物，其中所述双链RNA选自小时序RNA、小核RNA、小核仁RNA、短发夹RNA和微小RNA组成的组。

22.根据权利要求21的组合物，其中所述的双链RNA是小干扰RNA。

23.一种治疗受试者中至少一种淋巴增生性疾病、至少一种淋巴恶性肿瘤或其组合的方法，所述方法包括向需要的受试者施用有效量的权利要求17-22中任一项的组合物。

24.根据权利要求23的方法，其中所述受试者是患有、疑似患有或有风险患有至少一种淋巴增生性疾病、至少一种淋巴恶性肿瘤或其任意组合的人类受试者。

25.根据权利要求23或权利要求24的方法，进一步包括向受试者施用有效量的用于淋巴增生的至少一种疗法。

26.根据权利要求25的方法，其中所述的用于淋巴增生的至少一种疗法包括化疗、利妥昔单抗、奥比妥珠单抗、硼替佐米、卡非佐米、阿扎胞苷、地西他滨、维奈托克、依鲁替尼、艾代拉西布、舒尼替尼、迪那西利布、考比替尼、伊达沙努林、奥利默森钠、丁酸钠、缩酚肽、芬维A胺、夫拉平度、棉子酚、ABT-737、ABT-263、GX15-070、HA14-1、抗霉素A、阿卡拉布替尼、扎鲁替尼、替拉替尼、硼替佐米、来那度胺、替西莫司，或其任意组合。

27.一种试剂盒，包括一种有效调节磷酸弗林酸性簇分选蛋白1(Pacs1)的组合物，和至少一个容器，

其中调节Pacs1包括降低Pacs1基因表达，降低Pacs1蛋白表达，降低Pacs1活性，或其任何组合。