CN116732104A - 一种使用游离氨基酸增强聚乙烯亚胺递送核酸效率的方法 - Google Patents
一种使用游离氨基酸增强聚乙烯亚胺递送核酸效率的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域,涉及一种使用游离氨基酸增强聚乙烯亚胺递送核酸效率的方法。所述的核酸递送方法是在存在游离氨基酸的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触进行转染,递送核酸到细胞中。利用本发明改进的基于聚乙烯亚胺的核酸递送方法,能够在不增加细胞毒性的前提下显著提高聚乙烯亚胺的转染效率。该方法简单易行,安全性高,成本低。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,涉及一种使用游离氨基酸增强聚乙烯亚胺递送核酸效率的方法。
背景技术
核酸递送作为常见的技术手段,已经广泛地应用于基因治疗、生物制剂生产及研究等场景中。核酸递送载体主要分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体在基因递送方面表现较好,但也存在一些缺点,如DNA包装能力有限,载体生产困难,以及病毒插入引起的突变、免疫原性失控和炎症反应等安全问题,这些缺点严重限制了其应用。非病毒载体是利用脂质体或阳离子多聚复合物封装核酸(DNA和/或RNA分子)形成纳米复合物,它们可以自发地压缩核酸分子,保护不被DNase/RNase降解,并且产生的纳米复合物可以通过内吞/吞噬途径或直接融合/穿透细胞质膜进入细胞。非病毒载体具有较低的免疫原性,有可能克服病毒载体的许多限制,特别是安全性问题。
目前最为常见的核酸递送载体主要有一下几类:脂质体(包括普通双层阳离子脂质、脂质体DOTAP、Polyplus、Lipofectamine、Lipofectine等)、阳离子多聚复合物[如聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰胺-胺(PAMAM)等)]、树枝状高聚物(DEN)和各类多聚物的微粒体(如聚氰基丙烯酸酯纳米粒、聚乳酸纳米粒等)、基于特异性受体的配体介导的核酸分子靶向递送系统和多肽蛋白类递送载体以及利用唾液酸蛋白、多糖、表皮生长因子、叶酸、转铁蛋白、甾体激素、单克隆抗体等靶向分子修饰而具有主动靶向作用的纳米粒。
阳离子脂质体有着很好的转染效率,但是价格非常昂贵,且具有高度的细胞毒性;而与阳离子脂质体相比,阳离子聚合物的转染效率高,价格更低,但细胞毒性较强。自1995年以来,聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)成为体内外递送核酸应用最广泛的阳离子聚合物,其分子量,聚合度,分子大小,以及配置方法等均可影响转染效率,其中25kDa的PEI溶液是使用最广泛的阳离子聚合物转染试剂。
PEI递送核酸的优点是能够结合和保护核酸分子,并为核内体逃逸提供质子缓冲能力。然而,当利用PEI的高分子量或高N/P比(N为PEI中游离的氨基,P为DNA/RNA中的磷酸基团,N/P指两者的摩尔数之比)将核酸传递到哺乳动物细胞时,由于其阳离子性质和质子海绵效应,能够避免被内体降解,使PEI具有较高的细胞毒性。为了解决这一问题,一般采用的方法包括:使用相对低分子量的PEI,如分子量在25kDa左右的PEI,或修饰PEI(如偶联PEG)。前者仍具一定毒性,后者合成难度增加,成本更高。
发明内容
除非另有定义,本文所用的技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的含义。本发明中未作具体说明的实验方法,均根据《分子克隆实验指南》(第四版)J.萨姆布鲁克一书中具体方法进行,或者按照相关产品说明书进行。本发明中所用生物试剂,无特殊说明,均可以从商业途径获得。本领域技术人员在不偏离本发明精神的范围内可以进行多种变化、改变和替代。
本发明提供了一种使用游离氨基酸增强聚乙烯亚胺递送核酸效率的方法,能够在不增加细胞毒性的前提下显著提高聚乙烯亚胺的转染效率。该方法简单易行,安全性高,成本低。
在一个方面,本发明提供了一种向细胞递送核酸的方法,包括:在存在游离氨基酸的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触,其中所述氨基酸选自组氨酸、赖氨酸、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、色氨酸和苏氨酸中的一或多种,优选组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸中的一或多种。
如本文所用,“游离氨基酸”是指在PEI、要递送的核酸和细胞进行接触的介质中,所述氨基酸以游离状态存在。本文提及氨基酸时,除非明确排除或者根据上下文可以排除,否则包括酸及其在介质中可溶的盐的形式,例如包括但不限于钠、钾、镁盐。在一些实施方案中,本文所述介质是水性介质,例如用于细胞核酸转染的溶液或培养基。
在一个实施方案中,所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸和其水可溶性盐中的一或多种,优选组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。
所述氨基酸在所述介质中的浓度可以由本领域技术人员容易地确定。在一个实施方案中,所述氨基酸在所述介质中的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,例如为约2.5-20或5-10mmol/L,如为约5、10或20mmol/L。
如本文所用,“核酸”是指通过3’-5’-磷酸二酯键连接而成的核苷酸聚合物,其中所述核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。所述核酸包括单链或双链形式的、线形或环形的由核糖核苷酸(腺嘌呤核糖核苷酸(A)、鸟嘌呤核糖核苷酸(G)、胞嘧啶核糖核苷酸(C)、尿嘧啶核糖核苷酸(U))组成的核糖核酸(RNA)和由脱氧核糖核苷酸(脱氧腺嘌呤核糖核苷酸(A)、脱氧鸟嘌呤核糖核苷酸(G)、脱氧胞嘧啶核糖核苷酸(C)、脱氧胸腺嘧啶核糖核苷酸(T))组成的脱氧核糖核酸(DNA)。所述核酸可以包括任何所需的修饰,例如甲基化、硫代、糖基化等。
本文中,所述要递送的核酸是指需要转移进入靶细胞的核酸,例如包含转基因的构建体例如表达载体或用于基因重组的转移载体等。
在一个实施方案中,所述核酸包括DNA和/或RNA。在一个实施方案中,当所述核酸是DNA时,所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸和赖氨酸中的一或多种,优选选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸中的一或多种。在一个实施方案中,当所述核酸是RNA时,所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸中的一或多种。在一个实施方案中,所述DNA包括质粒DNA。在一个实施方案中,所述RNA包括mRNA。
如本文所用,“递送”是指以PEI作为递送载体,使所需核酸通过细胞膜进入细胞质或者进入细胞核的过程。本领域已知使用PEI作为递送载体向细胞递送核酸的条件、步骤和所需常规试剂。
在一个实施方案中,所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。
在一个实施方案中,当在水性介质中进行递送且所述核酸是DNA时,所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。
在一个实施方案中,当在水性介质中进行递送且所述核酸是RNA时,所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。
如本文所用,“细胞”是可以向其中递送核酸的任何细胞,包括原代细胞或细胞系。本领域已知众多可以进行核酸递送的细胞,例如包括但不限于真核细胞,如动物(如非人哺乳动物)、昆虫细胞。
在一个实施方案中,所述细胞是人类细胞或细胞系,包括例如所述细胞选自真核细胞,如动物(如非人哺乳动物)、昆虫细胞、人类细胞或细胞系,例如HEK-293细胞(ATCC编号:CCL-1573)及其衍生株,如HEK-293T细胞(ATCC编号:CRL-3216)、N2a细胞(Neuro-2a,ATCC编号:CCL-131)和CHO细胞(ATCC编号:CCL-61)及其衍生株。
在一个实施方案中,所述细胞在所述游离氨基酸的存在下,用所述PEI和要递送的核酸转染不超过48小时,例如不超过36小时,不超过24小时,不超过12小时,优选不超过24小时。
用于核酸递送的细胞在进行核酸递送前,培养细胞至适当的铺满密度,例如铺满密度为70%-80%。用于特定细胞的培养条件、培养基以及添加剂等是本领域熟知的。
如本文所用,“聚乙烯亚胺”(PEI,CAS:9002-98-6)是本领域已知用于核酸递送的阳离子聚合物。PEI分子结构中含有伯胺、仲胺、叔胺等基因,具有较高的化学反应性。
在一个实施方案中,本文所述的PEI的平均分子量(重均分子量)为约20-30kDa,例如约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30kDa,优选约25kDa。特别地,所述重均分子量例如是通过LS方法测量的。
在一个实施方案中,本文所述的PEI的平均分子量(数均分子量)为约8-12kDa,例如约8、9、10、11或12kDa,优选约10kDa。特别地,所述数均分子量例如是通过GPC方法测量的。
如本文所用,“接触”是指提及的物质的物理性接触,例如所述游离氨基酸、PEI、要递送的核酸和细胞处于同一介质如水性溶液或培养基中,从而可以互相接触。
本文中,在核酸递送体系中,要递送的核酸与PEI的比例可以根据本领域技术知识调整,例如重量比可以为约1:5至约5:1,如约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1或约5:1,优选为约1:1。
本文中,在核酸递送体系中,所述游离氨基酸以约1-25mmol/L的浓度存在,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,例如为约2.5-20或5-10mmol/L,如为约5、10或20mmol/L。
在一个实施方案中,用于递送核酸的溶液中,要递送的核酸:存在的游离氨基酸:PEI的比例为1μg的核酸:0.5-2×10-2mmol的氨基酸:1-3μg的PEI。
在一个实施方案中,本发明提供了一种向细胞递送核酸的方法,包括:将PEI、要递送的核酸和本发明所述的游离氨基酸混合,之后加入细胞,以将所述核酸递送到所述细胞中。
在一个实施方案中,本发明提供了一种使用游离氨基酸增强PEI递送核酸的方法,包括在PEI和要递送的核酸混合液中添加一定浓度的氨基酸(如递送DNA时,优选氨基酸为组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、和/或苏氨酸;递送RNA时,优选组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和/或苏氨酸),优选预混20-40分钟后,加入细胞培养液进行转染以将核酸递送到细胞中。
在进一步的实施方案中,本发明提供一种使用游离氨基酸提高PEI递送核酸效率的方法,包括:
(1)将细胞(如HEK-293T细胞、N2a细胞或CHO细胞)培养细胞至适当的铺满密度,例如铺满密度为70%-80%和/或贴壁后24小时内进行如下操作;
(2)将氨基酸、PEI、要递送的核酸混匀,室温静置一段时间,例如20-40分钟;
(3)移除细胞培养基,然后加入等体积新鲜培养基以及步骤(2)得到的混匀的溶液,继续培养24小时或48小时。
在一个方面,本发明提供了一种向细胞递送DNA的方法,包括:在存在游离氨基酸的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的DNA与所述细胞接触,其中所述氨基酸选自组氨酸、赖氨酸、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、色氨酸和苏氨酸中的一或多种,优选选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸中的一或多种,更优选选自甘氨酸、丙氨酸和苏氨酸中的一或多种。
在一个实施方案中,所述氨基酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,例如为约2.5-20或5-10mmol/L,如为约5、10或20mmol/L。
在一个实施方案中,所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中,当在水性介质中进行递送且所述核酸是DNA时,所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。
在一个实施方案中,所述组氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约2.5-20mmol/L,更优选为约10mmol/L。
在一个实施方案中,所述甘氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约2.5-20mmol/L,更优选为约10或20mmol/L,最优选为约20mmol/L。
在一个实施方案中,所述丙氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约10-25mmol/L,更优选为约20mmol/L。
在一个实施方案中,所述脯氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约10-25mmol/L,更优选为约20mmol/L。
在一个实施方案中,所述丝氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约10-25mmol/L,更优选为约10或20mmol/L,最优选为约10mmol/L。
在一个实施方案中,所述苏氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约10-25mmol/L,更优选为约10或20mmol/L,最优选为约10mmol/L。
在一个实施方案中,所述精氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约10-25mmol/L,更优选为约10或20mmol/L,最优选为约20mmol/L。
在一个实施方案中,所述赖氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约5-25mmol/L,更优选为约20mmol/L。
在一个实施方案中,所述细胞是HEK-293T细胞。在一个实施方案中,所述细胞在选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸和赖氨酸中的一或多种游离氨基酸的存在下,用所述PEI和要递送的DNA进行转染。
在一个实施方案中,所述细胞是N2a细胞及其衍生株,并且其中所述游离氨基酸是组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸和赖氨酸中的一或多种,优选苏氨酸。优选地,所述苏氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约10-25mmol/L,更优选为约10或20mmol/L,最优选为约10mmol/L。
在一个实施方案中,所述细胞是CHO细胞及其衍生株,并且其中所述游离氨基酸是组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸和赖氨酸中的一或多种,优选甘氨酸、丙氨酸和苏氨酸中的一或多种。优选地,所述甘氨酸、丙氨酸和/或苏氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约10-25mmol/L,更优选为约10或20mmol/L,最优选为约10mmol/L。
在一个方面,本发明提供了一种向细胞递送RNA的方法,包括:在存在游离氨基酸的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的RNA与所述细胞接触,其中所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸和赖氨酸中的一或多种,优选选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸中的一或多种,更优选选自甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸中的一或多种。
在一个实施方案中,所述氨基酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,例如为约2.5-20或5-10mmol/L,如为约5、10或20mmol/L。
在一个实施方案中,所述组氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约5-10mmol/L,更优选为约5mmol/L。
在一个实施方案中,所述甘氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-10、1.25-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约1.25或5mmol/L。
在一个实施方案中,所述丙氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-10、1.25-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约5-20mmol/L,更优选为约5或20mmol/L,最优选为约5mmol/L。
在一个实施方案中,所述脯氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-10、1.25-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约2.5-20mmol/L,更优选为约5或10mmol/L,最优选为约10mmol/L。
在一个实施方案中,所述苏氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-10、1.25-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约1-20或2.5-10mmol/L,更优选为约2.5或5mmol/L。
在一个实施方案中,所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中,当在水性介质中进行递送且所述核酸是RNA时,优选地,所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。
在一个实施方案中,所述细胞选自真核细胞,如动物(如非人哺乳动物)、昆虫细胞、人类细胞或细胞系,例如HEK-293细胞(ATCC编号:CCL-1573)及其衍生株,如HEK-293T细胞(ATCC编号:CRL-3216)、N2a细胞(Neuro-2a,ATCC编号:CCL-131)和CHO细胞(ATCC编号:CCL-61)及其衍生株。
在一个实施方案中,所述细胞是HEK-293T细胞。在一个实施方案中,所述细胞在选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸中的一或多种游离氨基酸的存在下,用所述PEI和要递送的RNA进行转染。优选地,所述氨基酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约10-25mmol/L,更优选为约1.25、2.5、5、10或20mmol/L,最优选为约10mmol/L。
在一个实施方案中,所述细胞是N2a细胞及其衍生株,并且其中所述游离氨基酸是组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸和赖氨酸中的一或多种,优选组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸。优选地,所述氨基酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约10-25mmol/L,更优选为约10或20mmol/L,最优选为约10mmol/L。
在一个实施方案中,所述细胞是CHO细胞及其衍生株,并且其中所述游离氨基酸是组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸中的一或多种,优选甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸中的一或多种。优选地,所述甘氨酸、丙氨酸和/或脯氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约10-25mmol/L,更优选为约10或20mmol/L,最优选为约10mmol/L。
在一个实施方案中,本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如DNA或RNA)的方法,包括:在存在游离氨基酸组氨酸的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。
在一个实施方案中,所述组氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,例如为约2.5-20或5-10mmol/L,如为约5、10或20mmol/L。
在一个实施方案中,所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中,当在水性介质中递送所述核酸时,所述氨基酸选自组氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。
在一个实施方案中,当所述核酸是DNA时,所述组氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约2.5-20mmol/L,更优选为约10mmol/L。
在一个实施方案中,当所述核酸是RNA时,所述组氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约5-10mmol/L,更优选为约5mmol/L。
在一个实施方案中,本发明提供了一种向细胞递送核酸DNA的方法,包括:在存在游离氨基酸赖氨酸的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的DNA与所述细胞接触。
在一个实施方案中,所述赖氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约5-25mmol/L,更优选为约20mmol/L。
在一个实施方案中,所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中,当在水性介质中递送所述核酸DNA时,所述氨基酸选自赖氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。
在一个实施方案中,本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如DNA或RNA)的方法,包括:在存在游离氨基酸甘氨酸的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。
在一个实施方案中,所述甘氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,例如为约2.5-20或5-10mmol/L,优选为约5、10或20mmol/L。
在一个实施方案中,所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中,当在水性介质中递送所述核酸时,所述氨基酸选自甘氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。
在一个实施方案中,当所述核酸是DNA时,所述甘氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约2.5-20mmol/L,更优选为约10或20mmol/L,最优选为约20mmol/L。
在一个实施方案中,当所述核酸是RNA时,所述甘氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-10、1.25-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约5mmol/L。
在一个实施方案中,本发明提供了一种向细胞递送核酸DNA的方法,包括:在存在游离氨基酸精氨酸的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的DNA与所述细胞接触。
在一个实施方案中,所述精氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约10-25mmol/L,更优选为约10或20mmol/L,最优选为约20mmol/L。
在一个实施方案中,所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中,当在水性介质中递送所述核酸DNA时,所述氨基酸选自精氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。
在一个实施方案中,本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如DNA或RNA)的方法,包括:在存在游离氨基酸丙氨酸的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。
在一个实施方案中,所述丙氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,例如为约2.5-20或5-10mmol/L,优选为约5、10或20mmol/L。
在一个实施方案中,所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中,当在水性介质中递送所述核酸时,所述氨基酸选自丙氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。
在一个实施方案中,当所述核酸是DNA时,所述丙氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约10-25mmol/L,更优选为约20mmol/L。
在一个实施方案中,当所述核酸是RNA时,所述丙氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-10、1.25-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约5-20mmol/L,更优选为约5或20mmol/L,最优选为约5mmol/L。
在一个实施方案中,本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如DNA或RNA)的方法,包括:在存在游离氨基酸脯氨酸的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。
在一个实施方案中,所述脯氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,例如为约2.5-20或5-10mmol/L,优选为约5、10或20mmol/L。
在一个实施方案中,所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中,当在水性介质中递送所述核酸时,所述氨基酸选自脯氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。
在一个实施方案中,当所述核酸是DNA时,所述脯氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约10-25mmol/L,更优选为约20mmol/L。
在一个实施方案中,当所述核酸是RNA时,所述脯氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-10、1.25-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约2.5-20mmol/L,更优选为约5或10mmol/L,最优选为约10mmol/L。
在一个实施方案中,本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如DNA或RNA)的方法,包括:在存在游离氨基酸亮氨酸的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。
在一个实施方案中,所述亮氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,例如为约2.5-20或5-10mmol/L,如为约5、10或20mmol/L。
在一个实施方案中,所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中,当在水性介质中递送所述核酸时,所述氨基酸选自亮氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。
在一个实施方案中,本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如DNA或RNA)的方法,包括:在存在游离氨基酸谷氨酰胺的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。
在一个实施方案中,所述谷氨酰胺存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,例如为约2.5-20或5-10mmol/L,如为约5、10或20mmol/L。
在一个实施方案中,所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中,当在水性介质中递送所述核酸时,所述氨基酸选自谷氨酰胺和其水可溶性盐中的一或多种。
在一个实施方案中,本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如DNA或RNA)的方法,包括:在存在游离氨基酸异亮氨酸的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。
在一个实施方案中,所述异亮氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,例如为约2.5-20或5-10mmol/L,如为约5、10或20mmol/L。
在一个实施方案中,所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中,当在水性介质中递送所述核酸时,所述氨基酸选自异亮氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。
在一个实施方案中,本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如DNA或RNA)的方法,包括:在存在游离氨基酸苯丙氨酸的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。
在一个实施方案中,所述苯丙氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,例如为约2.5-20或5-10mmol/L,如为约5、10或20mmol/L。
在一个实施方案中,所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中,当在水性介质中递送所述核酸时,所述氨基酸选自苯丙氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。
在一个实施方案中,本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如DNA或RNA)的方法,包括:在存在游离氨基酸甲硫氨酸的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。
在一个实施方案中,所述甲硫氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,例如为约2.5-20或5-10mmol/L,如为约5、10或20mmol/L。
在一个实施方案中,所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中,当在水性介质中递送所述核酸时,所述氨基酸选自甲硫氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。
在一个实施方案中,本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如DNA或RNA)的方法,包括:在存在游离氨基酸酪氨酸的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。
在一个实施方案中,所述酪氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,例如为约2.5-20或5-10mmol/L,如为约5、10或20mmol/L。
在一个实施方案中,所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中,当在水性介质中递送所述核酸时,所述氨基酸选自酪氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。
在一个实施方案中,本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如DNA或RNA)的方法,包括:在存在游离氨基酸半胱氨酸的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。
在一个实施方案中,所述半胱氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,例如为约2.5-20或5-10mmol/L,如为约5、10或20mmol/L。
在一个实施方案中,所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中,当在水性介质中递送所述核酸时,所述氨基酸选自半胱氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。
在一个实施方案中,本发明提供了一种向细胞递送核酸DNA的方法,包括:在存在游离氨基酸丝氨酸的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的DNA与所述细胞接触。
在一个实施方案中,所述丝氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约10-25mmol/L,更优选为约10或20mmol/L,最优选为约10mmol/L。
在一个实施方案中,所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中,当在水性介质中递送所述核酸DNA时,所述氨基酸选自丝氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。
在一个实施方案中,本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如DNA或RNA)的方法,包括:在存在游离氨基酸色氨酸的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。
在一个实施方案中,所述色氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,例如为约2.5-20或5-10mmol/L,如为约5、10或20mmol/L。
在一个实施方案中,所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中,当在水性介质中递送所述核酸时,所述氨基酸选自色氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。
在一个实施方案中,本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如DNA或RNA)的方法,包括:在存在游离氨基酸苏氨酸的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。
在一个实施方案中,所述苏氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,例如为约2.5-20或5-10mmol/L,优选为约5、10或20mmol/L。
在一个实施方案中,所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中,当在水性介质中递送所述核酸时,所述氨基酸选自苏氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。
在一个实施方案中,当所述核酸是DNA时,所述苏氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约10-25mmol/L,更优选为约10或20mmol/L,最优选为约10mmol/L。
在一个实施方案中,当所述核酸是RNA时,所述苏氨酸存在的浓度为约1-25mmol/L,例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-10、1.25-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/L,优选为约1-20或2.5-10mmol/L,更优选为约2.5或5mmol/L。
本发明的方法使用的氨基酸是一种天然存在的生物安全性较好的物质,且带有电荷,其通过参与PEI与核酸的结合,可降低转染过程中PEI的使用量和N/P(N为PEI中游离的氨基,P为DNA/RNA中的磷酸基团,N/P指两者的摩尔数之比),并明显增强PEI的转染效果。
本发明的有益效果在于,利用本发明的改进的基于聚乙烯亚胺的核酸递送方法,能够在不增加细胞毒性的前提下显著提高聚乙烯亚胺的转染效率。该方法简单易行,安全性高,成本低。
附图说明
图1为实施例1的荧光显微镜下观察结果。
图2为实施例1的平均荧光强度统计结果。
图3和图4为实施例2的明场及荧光显微镜下观察结果。
图5为实施例2的平均荧光强度统计结果。
图6为实施例3的转染DNA时,转染试剂对细胞增殖的影响和细胞毒性(CCK-8)检测结果。
图7为实施例4的平均荧光强度统计结果。
图8为实施例4的转染RNA时,转染试剂对细胞增殖的影响和细胞毒性(CCK-8)检测结果。
图9为实施例5的平均荧光强度统计结果。
图10为实施例6的平均荧光强度统计结果。
图11为实施例7的平均荧光强度统计结果。
图12为实施例8的平均荧光强度统计结果。
如本文所用,“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况发生或不发生,该描述包括其中所述事件或情况发生及不发生的情况。例如,任选包括的步骤是指该步骤存在或不存在。
如本文所用,术语“约”是指包括具体数值的数值范围,本领域技术人员可以合理认为其类似于具体数值。在一些实施方案中,术语“约”是指在使用本领域通常接受的测量的标准误差内。在一些实施方案中,约是指到具体数值的+/-10%。
本文公开的范围应该认为也具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如,对范围从1到6的描述应视为已明确公开了从1到3,从1到4,从1到5,从2到4,从2到6,从3至6等的子范围,以及该范围内的单个数字,例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度均适用这点。
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明,本领域技术人员公知,在不背离本发明精神的情况下,可以对本发明做出许多修改,这样的修改也落入本发明的范围。本发明的范围应由附加的权利要求说明,任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。
下述实验方法如无特别说明,均为常规方法,所使用的实验材料如无特别说明,均可容易地从商业公司获取。
实施例
实施例1:
提前12h按照1×104细胞/孔在96孔板中接种HEK-293T细胞(ATCC编号:CRL-3216),37℃、5% CO2培养。
在PBS中预先配制好1mg/mL的25kDa的PEI(即PEI储存液)和1mg/mL的含真核表达GFP报告基因序列的质粒DNA(SEQ ID NO:1)储存液。分别在无菌管中加入含指定氨基酸的PBS溶液,向各管中分别向上述无菌管中加入0.1μg含真核表达GFP报告基因序列的质粒DNA和0.1μg的25kDa的PEI(CAS:9002-98-6,平均Mw~25,000by LS,平均Mn~10,000by GPC),各管中溶液总体积为10μL,氨基酸的浓度均为50mM,涡旋混匀,室温静置30min后加入90μLDMEM得到转染工作液,此时各管中氨基酸终浓度为5mM。弃去旧细胞培养基,96孔板每孔加入100μL上述已添加新鲜培养基的转染工作液,放回培养箱继续培养,于48h后使用荧光倒置显微镜通过488nm(激发光)/520nm(发射光)滤光片观察绿色荧光蛋白表达情况,结果如图1所示。
使用ImageJ软件处理拍摄的荧光照片,每个样品取相同位置与大小的6个随机视野图,统计视野中细胞的荧光强度值,分别拿每组和PEI对照组的荧光强度值相比,得到与对照的相对百分比(%对照(%of Control)),结果如图2所示。
由图1,2可见,与PBS相比,在加入氨基酸后,细胞的平均荧光强度都有增大,照片上的阳性比例也显著提高。可见加入5mM的一些特定氨基酸对细胞转染效果有不同程度的增强作用。其中,组氨酸、赖氨酸、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、色氨酸、苏氨酸均有一定增强转染效果的作用。后续浓度测试的实施例2中选择了组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸这8种氨基酸做进一步转染增强能力的测试。
实施例2:
提前12h按照2×104细胞/孔在96孔板中接种HEK-293T细胞(ATCC编号:CRL-3216),37℃、5% CO2培养。
在PBS中预先配制好1mg/mL的25kDa的PEI(即PEI储存液)和1mg/mL的含真核表达GFP报告基因序列的质粒DNA(SEQ ID NO:1)储存液。分别在PBS中配制好组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸的200mM溶液。分别取0.625μL、1.25μL、2.5μL、5μL、10μL氨基酸-PBS溶液放置到无菌管中,用PBS补至10μL相同体积,此时各管中溶液氨基酸的浓度为12.5mM、25mM、50mM、100mM、200mM。分别向上述无菌管中加入0.1μg含真核表达GFP报告基因序列的质粒DNA和0.1μg的25kDa的PEI(CAS:9002-98-6,平均Mw~25,000byLS,平均Mn~10,000by GPC),涡旋混匀,室温静置30min后加入90μL的DMEM得到转染工作液,此时各管中氨基酸终浓度为1.25mM、2.5mM、5mM、10mM、20mM。转染对照组使用不含氨基酸的相同比例PEI或Lipo2000(赛默飞)。
弃去旧细胞培养基,96孔板每孔加入100μL上述转染工作液。放回培养箱继续培养,于48h后使用荧光倒置显微镜通过488nm(激发光)/520nm(发射光)滤光片观察绿色荧光蛋白表达情况,结果如图3和图4所示。
使用ImageJ软件处理拍摄的荧光照片,每个荧光照片取相同位置与大小的6个随机视野图,统计视野中细胞的荧光强度值,分别拿每组和PEI对照组的荧光强度值相比,得到与对照的相对百分比(%对照),结果如图5所示。不同氨基酸随着浓度提高,都对PEI转染有显著促进作用,其中丝氨酸、苏氨酸在10mM的工作浓度下MFI(平均荧光强度)提高相对其他氨基酸在此浓度下的转染增强效果最高。虽然其他氨基酸如丙氨酸、脯氨酸、精氨酸、赖氨酸在20mM组也有转染增强效果,但是20mM的丙氨酸、脯氨酸、精氨酸、赖氨酸测试组在48h已表现出较明显的细胞毒性,能观察到相应样品的培养基明显变黄,细胞皱缩使培养表面出现空斑等现象。
实施例3:
提前12h按照2×104细胞/孔在96孔板中接种HEK-293T细胞(ATCC编号:CRL-3216),37℃、5% CO2培养。
在PBS中预先配制好1mg/mL的25k Da的PEI(即PEI储存液)和1mg/mL的含真核表达GFP报告基因序列的质粒DNA(SEQ ID NO:1)储存液。分别取配制好的100mM甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸的PBS溶液10μL,分别向上述无菌管中加入0.1μg含真核表达GFP报告基因序列的质粒DNA和0.1μg的25kDa的PEI(CAS:9002-98-6,平均Mw~25,000by LS,平均Mn~10,000by GPC),涡旋混匀,室温静置30min后加入90μL新鲜培养基(如DMEM)得到转染工作液,此时各管中氨基酸终浓度均为10mM。空白对照组只加入10μL的PBS及0.2μg的DNA,转染对照组使用不含氨基酸的相同比例PEI或Lipo2000(赛默飞)。
弃去旧细胞培养基,96孔板每孔加入100μL上述转染工作液。放回培养箱继续培养。
分别于24h、48h向每孔加入10μL CCK8溶液,将培养板在37℃培养箱内孵育1-4小时。用酶标仪测定450nm和630nm处的吸光度,检测细胞活性,计算细胞活率,结果如图6所示。
与PBS组对照,PEI+丙氨酸组和PEI+组氨酸组在24h与48h的细胞毒性显著,PEI+甘氨酸组和PEI+赖氨酸组在24h对HEK-293T细胞有微弱的细胞毒性,在48h的PEI+精氨酸组对HEK-293T细胞有微弱的细胞毒性。此外,48h的PEI+甘氨酸组对HEK-293T细胞有较明显的促生长作用。PEI+脯氨酸组和PEI+丝氨酸组在24h对HEK-293T有微弱的促生长作用,但48h后没有明显作用。PEI+苏氨酸组在24h和48h均不表现出细胞毒性或促生长作用。
实施例4:
提前12h按照2.5×104细胞/孔在96孔板中接种HEK-293T细胞(ATCC编号:CRL-3216),37℃、5% CO2培养。
在PBS中预先配制好1mg/mL的25kDa的PEI(即PEI储存液)和1mg/mL的含真核表达NeonGreen报告基因序列的mRNA(SEQ ID NO:3)储存液。分别在PBS中配制好组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸的200mM溶液。分别取0.625μL、1.25μL、2.5μL、5μL、10μL氨基酸-PBS溶液放置到无菌管中,用PBS补至10μL相同体积,此时各管中溶液氨基酸的浓度为12.5mM、25mM、50mM、100mM、200mM。分别向上述无菌管中加入0.2μg含真核表达NeonGreen报告基因序列的mRNA和0.2μg的25kDa的PEI(CAS:9002-98-6,平均Mw~25,000by LS,平均Mn~10,000by GPC),涡旋混匀,室温静置20min后加入90μL DMEM得到转染工作液,此时各管中氨基酸终浓度为1.25mM、2.5mM、5mM、10mM、20mM。转染对照组使用不含氨基酸的相同比例PEI、Lipo RNAiMAX(赛默飞)和Zeta Life。
弃去旧细胞培养基,96孔板每孔加入100μL上述转染工作液。放回培养箱继续培养,于24h后使用荧光倒置显微镜通过488nm(激发光)/520nm(发射光)滤光片拍摄绿色荧光蛋白表达情况。使用ImageJ软件处理拍摄的荧光照片,每个荧光照片取相同位置与大小的6个随机视野图,统计视野中细胞的荧光强度值,分别拿每组和PEI对照组的荧光强度值相比,得到与对照的相对百分比(%对照),结果如图7所示。
而后向每孔加入10μL CCK8溶液,将培养板在37℃培养箱内孵育1-4小时。用酶标仪测定450nm和630nm处的吸光度,检测细胞活性,计算细胞活率,结果如图8所示。
从报告基因表达后的荧光强度看,组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸对mRNA均有显著的促转染作用。组氨酸在5mM浓度时效果最好,约是对照组的两倍。甘氨酸浓度的变化对转染的效果影响较小,整体都比对照组高40%左右。丙氨酸和脯氨酸的荧光值与浓度呈现正相关的趋势,分别在20mM和10mM达到最大值。精氨酸和赖氨酸则明显表现出了对mRNA转染的抑制作用,荧光蛋白在高浓度下基本没有表达。苏氨酸在低浓度时表现出较好的促进作用,20mM出现一定的抑制作用。丝氨酸没有明显的增强效果,并且在20mM表现出抑制作用。
CCK8的结果显示,各测试组和PBS对照组之间均没有显著的统计学差异,表明各组转染试剂转染mRNA时,对细胞均没有显著的毒性。
实施例5:
提前12h按照1×105细胞/孔在24孔板中接种N2a细胞(ATCC编号:CCL-131),37℃、5%CO2培养。
在PBS中预先配制好1mg/mL的25kDa的PEI(即PEI储存液)和1mg/mL的含真核表达NeonGreen报告基因序列的质粒DNA(SEQ ID NO:2)储存液。分别在PBS中配制好组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸的200mM溶液。取25μL氨基酸-PBS溶液放置到无菌管中,分别向上述无菌管中加入0.5μg含真核表达NeonGreen报告基因序列的质粒DNA和0.5μg的25kDa的PEI(CAS:9002-98-6,平均Mw~25,000by LS,平均Mn~10,000byGPC),涡旋混匀,室温静置30min后加入475μL DMEM得到转染工作液,此时各管中氨基酸终浓度为10mM。转染对照组使用不含氨基酸的相同比例PEI和Lipo 3000(赛默飞)。
弃去旧细胞培养基,24孔板每孔加入500μL上述转染工作液。放回培养箱继续培养,于48h后使用荧光倒置显微镜通过488nm(激发光)/520nm(发射光)滤光片拍摄绿色荧光蛋白表达情况。使用ImageJ软件处理拍摄的荧光照片,每个荧光照片取相同位置与大小的6个随机视野图,统计视野中细胞的荧光强度值,分别拿每组和PEI对照组的荧光强度值相比,得到与对照的相对百分比(%对照),结果如图9所示。
结果显示在转染N2a细胞时,与HEK-293T细胞表现不同,在10mM的浓度下苏氨酸依然具有显著的促进作用,提示不同氨基酸的促质粒DNA的PEI转染作用具有一定的细胞特异性。
实施例6:
提前12h按照1×105细胞/孔在24孔板中接种N2a细胞(ATCC编号:CCL-131),37℃、5%CO2培养。
在PBS中预先配制好1mg/mL的25kDa的PEI(即PEI储存液)和1mg/mL的含真核表达NeonGreen报告基因序列的mRNA(SEQ ID NO:3)储存液。分别在PBS中配制好组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸的200mM溶液。取25μL氨基酸-PBS溶液放置到无菌管中,分别向上述无菌管中加入0.5μg含真核表达NeonGreen报告基因序列的mRNA和0.5μg的25kDa的PEI(CAS:9002-98-6,平均Mw~25,000by LS,平均Mn~10,000byGPC),涡旋混匀,室温静置20min后加入475μL DMEM得到转染工作液,此时各管中氨基酸终浓度为10mM。转染对照组使用不含氨基酸的相同比例PEI、jetMESSENGER(Polyplus)、LipoRNAiMAX(赛默飞)和Zeta Life。
弃去旧细胞培养基,24孔板每孔加入500μL上述转染工作液。放回培养箱继续培养,于24h后使用荧光倒置显微镜通过488nm(激发光)/520nm(发射光)滤光片拍摄绿色荧光蛋白表达情况。使用ImageJ软件处理拍摄的荧光照片,每个荧光照片取相同位置与大小的6个随机视野图,统计视野中细胞的荧光强度值,分别拿每组和PEI对照组的荧光强度值相比,得到与对照的相对百分比(%对照),结果如图10所示。
在进行mRNA转染时,和HEK-293T细胞的情况基本类似,组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸仍有显著的促进作用,其中丙氨酸效果最明显,但和HEK-293T细胞中的促进幅度也有所不同,提示不同氨基酸的促RNA的PEI转染作用具有一定的细胞特异性。
实施例7:
提前12h按照1×105细胞/孔在24孔板中接种CHO细胞(ATCC编号:CCL-61),37℃、5%CO2培养。
在PBS中预先配制好1mg/mL的25kDa的PEI(即PEI储存液)和1mg/mL的含真核表达NeonGreen报告基因序列的质粒DNA(SEQ ID NO:2)储存液。分别在PBS中配制好组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸的200mM溶液。取25μL氨基酸-PBS溶液放置到无菌管中,分别向上述无菌管中加入0.5μg含真核表达NeonGreen报告基因序列的质粒DNA和0.5μg的25kDa的PEI(CAS:9002-98-6,平均Mw~25,000by LS,平均Mn~10,000byGPC),涡旋混匀,室温静置30min后加入475μL DMEM得到转染工作液,此时各管中氨基酸终浓度为10mM。转染对照组使用不含氨基酸的相同比例PEI和jetPRIME(Polyplus)。
弃去旧细胞培养基,24孔板每孔加入500μL上述转染工作液。放回培养箱继续培养,于48h后使用荧光倒置显微镜通过488nm(激发光)/520nm(发射光)滤光片拍摄绿色荧光蛋白表达情况。使用ImageJ软件处理拍摄的荧光照片,每个荧光照片取相同位置与大小的6个随机视野图,统计视野中细胞的荧光强度值,分别拿每组和PEI对照组的荧光强度值相比,得到与对照的相对百分比(%对照),结果如图11所示。
在进行质粒转染CHO时,与HEK-293T和N2a细胞中表现不同,甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸仍然有显著的促进作用,其中丙氨酸最明显,提示不同氨基酸的促质粒DNA的PEI转染作用具有一定的细胞特异性。
实施例8:
提前12h按照1×105细胞/孔在24孔板中接种CHO细胞(ATCC编号:CCL-61),37℃、5%CO2培养。
在PBS中预先配制好1mg/mL的25kDa的PEI储存液和1mg/mL的含真核表达NeonGreen报告基因序列的mRNA(SEQ ID NO:3)储存液。分别在PBS中配制好组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸的200mM溶液。取25μL氨基酸-PBS溶液放置到无菌管中,分别向上述无菌管中加入0.5μg含真核表达NeonGreen报告基因序列的mRNA和0.5μg的25kDa的PEI(CAS:9002-98-6,平均Mw~25,000by LS,平均Mn~10,000byGPC),涡旋混匀,室温静置20min后加入475μL DMEM得到转染工作液,此时各管中氨基酸终浓度为10mM。转染对照组使用不含氨基酸的相同比例PEI、jetMESSENGER(Polyplus)和ZetaLife。
弃去旧细胞培养基,24孔板每孔加入500μL上述转染工作液。放回培养箱继续培养,于24h后使用荧光倒置显微镜通过488nm(激发光)/520nm(发射光)滤光片拍摄绿色荧光蛋白表达情况。使用ImageJ软件处理拍摄的荧光照片,每个荧光照片取相同位置与大小的6个随机视野图,统计视野中细胞的荧光强度值,分别拿每组和PEI对照组的荧光强度值相比,得到与对照的相对百分比(%对照),结果如图12所示。
在进行mRNA转染时,与HEK-293T和N2a细胞中表现不同,丙氨酸仍表现出显著的促进作用,甘氨酸和脯氨酸也有一定的促进趋势,提示不同氨基酸的促RNA的PEI转染作用具有一定的细胞特异性。
序列表
SEQ ID NO:1:所用表达GFP报告基因质粒的全序列。
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SEQ ID NO:2:所用表达NeonGreen报告基因质粒的全序列。
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SEQ ID NO:3:所用表达NeonGreen报告基因mRNA的全序列。
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Claims (8)
1.一种向细胞递送核酸的方法,包括:在存在游离氨基酸的条件下,将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触,其中所述氨基酸选自组氨酸、赖氨酸、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、色氨酸和苏氨酸中的一或多种,优选选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸中的一或多种。
2.权利要求1的方法,其中所述核酸包括DNA和/或RNA,
优选地,当所述核酸是DNA时,所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸中的一或多种;或者,当所述核酸是RNA时,所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸中的一或多种。
3.权利要求1或2的方法,其中所述方法包括:
(i)将所述氨基酸、聚乙烯亚胺和要递送的核酸混合获得混合液;和
(ii)将(i)的混合液与细胞接触。
4.权利要求1-3任一项的方法,其中:
(a)聚乙烯亚胺的平均分子量(重均分子量)为约20-30kDa,优选约25kDa;和/或
(b)聚乙烯亚胺的平均分子量(数均分子量)为约8-12kDa,优选约10kDa;和/或
(c)要递送的核酸与聚乙烯亚胺的重量比例为约1:5至约5:1,优选为约1:1;和/或
(d)游离氨基酸的浓度为约1-25mmol/L,例如为约2.5-20、5-10或10-25mmol/L,如为约5、10或20mmol/L;和/或
(e)所述细胞选自真核细胞,如动物(如非人哺乳动物)细胞、昆虫细胞、人类细胞或细胞系,例如HEK-293细胞(ATCC编号:CCL-1573)及其衍生株,如HEK-293T细胞(ATCC编号:CRL-3216)、N2a细胞(Neuro-2a,ATCC编号:CCL-131)和CHO细胞(ATCC编号:CCL-61)及其衍生株。
5.权利要求1-4任一项的方法,其中要递送的核酸:存在的游离氨基酸:PEI的比例为1μg核酸:0.5-2×10-2mmol氨基酸:1-3μg聚乙烯亚胺。
6.权利要求1-5任一项的方法,其中,所述核酸是DNA时,所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸中的一或多种,
优选地,所述组氨酸的浓度为约1-25mmol/L,更优选为约2.5-20mmol/L,更优选为约10mmol/L;和/或
优选地,所述甘氨酸的浓度为约1-25mmol/L,更优选为约2.5-20mmol/L,更优选为约10或20mmol/L,最优选为约20mmol/L;和/或
优选地,所述丙氨酸的浓度为约1-25mmol/L,更优选为约10-25mmol/L,更优选为约20mmol/L;和/或
优选地,所述脯氨酸的浓度为约1-25mmol/L,更优选为约10-25mmol/L,更优选为约20mmol/L;和/或
优选地,所述苏氨酸的浓度为约1-25mmol/L,更优选为约10-25mmol/L,更优选为约10或20mmol/L,最优选为约10mmol/L。
7.权利要求1-5任一项的方法,其中,所述核酸是RNA时,所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸中的一或多种,
优选地,所述组氨酸的浓度为约1-25mmol/L,更优选为约5-10mmol/L,更优选为约5mmol/L;和/或
优选地,所述甘氨酸的浓度为约1-25mmol/L,更优选为约5mmol/L;和/或
优选地,所述丙氨酸的浓度为约1-25mmol/L,更优选为约5-20mmol/L,更优选为约5或20mmol/L,最优选为约5mmol/L;和/或
优选地,所述脯氨酸的浓度为约1-25mmol/L,更优选为约2.5-20mmol/L,更优选为约5或10mmol/L,最优选为约10mmol/L;和/或
优选地,所述苏氨酸的浓度为约1-25mmol/L,更优选为约1-20或2.5-10mmol/L,更优选为约2.5或5mmol/L。
8.权利要求1-7任一项的方法,包括:
(1)将细胞培养至适宜的密度,例如密度为70%-80%;
(2)将氨基酸、聚乙烯亚胺、核酸混匀获得混合液,室温静置,例如20-40分钟;和
(3)收集细胞,加入等体积的新鲜培养基以及步骤(2)的混合液,进行核酸转染,优选不超过24小时或48小时。
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