CN116732073A - 羊毛硫抗生素高通量筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种羊毛硫抗生素高通量筛选方法，该方法包括：构建羊毛硫肽定点饱和突变文库，并提取质粒转化表达菌株，获得突变体；利用自动化平台对所有突变体进行抑菌活性表征及样品检测；其中，所述进行抑菌活性表征包括通过抑菌法获得各突变体抑菌活性而实现高通量自动化羊毛硫抗生素活性筛选，所述样品检测包括高通量自动化MALDI‑TOF检测目的产物。本发明利用自动化工作站，实现了高通量自动化的羊毛硫抗生素定点饱和突变文库构建和筛选。

Description

羊毛硫抗生素高通量筛选方法
技术领域
本发明是关于一种羊毛硫抗生素高通量筛选方法，具体是关于一种基于自动化平台的筛选羊毛硫抗生素的方法。
背景技术
当前，多重耐药菌的快速增长严重威胁着人类的健康，在过去十年，抗生素耐药菌在英国、冰岛、挪威等国家造成的直接经济损失已经达到每年1.5亿欧元。而目前常用的抗生素对于治疗细菌感染效果越来越差，因此，发现和开发一些能够抵抗多重耐药菌的新型抗生素药物对改善人类健康具有重要意义。
羊毛硫肽属于核糖体合成后翻译肽(Ribosomally synthesized andposttranslationally modified peptides，RiPPs)中的一大类，随着下一代测序技术和生物信息学的快速发展，RiPPs在不同物种中被广泛发现。RiPPs的前体肽(precursorpeptide)由核糖体翻译合成，经翻译后修饰酶修饰获得特殊结构和生物活性。具有抗菌活性的羊毛硫肽称为羊毛硫抗生素(或羊毛硫肽抗生素)。羊毛硫抗生素由于具有较好的抗菌活性且不易产生药物耐受性，作为一种新药候选者引起人们的广泛关注。例如：Nisin已经被用于商业的食品保鲜剂70余年，仍然没有产生多重耐药。羊毛硫抗生素的共同特点是分子结构中包含一个或多个硫醚键连接的羊毛硫氨酸(Lan)和/或甲基化羊毛硫氨酸(MeLan)。这些Lan和MeLan结构通过两步翻译后修饰引入：首先，前体肽中Ser/Thr残基经由含羟基侧链的脱水反应，转变为脱氢丙氨酸/脱氢酪氨酸(2,3-dehydroalanine/(Z)-2,3-dehydrobutyrine，Dha/Dhb)；随后，前体肽中Cys残基的侧链巯基通过分子内迈克尔加成反应(Michael addition)进攻Dha/Dhb残基的侧链双键，成环形成Lan或MeLan结构。
基于羊毛硫肽合成酶的不同结构域组成，羊毛硫肽通常被分为4个主要亚型。其中，I型羊毛硫肽的合成酶由脱水酶LanB和环化酶LanC分别行使脱水和环化功能；而II型羊毛硫肽的合成酶LanM是双功能酶，同时具有脱水和环化两个功能结构域。LanM的N端脱水区与其它羊毛硫肽合成酶没有同源性，而C端的环化结构域与I型羊毛硫肽合成酶LanC和Ⅳ型羊毛硫肽合成酶LanL的C端环化结构域具有同源性，都含有保守的锌离子结合位点。III型羊毛硫肽的合成酶LanKC和Ⅳ型羊毛硫肽的合成酶LanL两种类型的羊毛硫肽合成酶具有三个功能结构域，N端包含裂解酶(lyase)和激酶(kinase)两个结构功能域，共同作用于Ser和Thr的脱水反应，其中III型羊毛硫肽的合成酶LanKC的C端环化酶与其他三种类型环化结构域具有同源性，但不含有保守的锌离子结合位点。I型羊毛硫肽合成酶利用谷氨酰化的tRNA活化Ser/Thr的羟基进行脱水，而II型、III型和Ⅳ型羊毛硫肽合成酶的脱水作用是基于磷酸化修饰。
在羊毛硫肽的生物合成过程中，羊毛硫肽基因通过转录翻译形成前体肽，然后，羊毛硫肽合成酶识别前体肽的N端前导肽(leader peptide)/或C端跟随肽(followerpeptide)，并在核心肽(core peptide)中引入脱水和环化修饰；随后，前导肽被蛋白酶或转运蛋白的蛋白酶结构域移除，释放出具有功能活性的成熟羊毛硫肽。在一些羊毛硫肽的生物合成基因簇中，也存在其他类型的修饰酶，可以引入羟基化、甲基化、糖基化、卤化、酰化和差向异构化等类型的化学修饰。这些修饰可以提高羊毛硫肽在高温、非生理pH、蛋白酶水解等条件下的稳定性，或者影响其生物活性。
羊毛硫抗生素(lantibiotics)主要抗菌机理是与细菌细胞壁合成前体Lipid II结合，一方面阻止细胞壁的生物合成，另一方面使细胞膜穿孔导致细胞成分流出达到抗菌效果。羊毛硫抗生素对革兰氏阳性菌展现出较强活性，对一些多重耐药菌也具有很好的抑制效果，如抗药性金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA)、抗万古霉素肠道链球菌(vancomycin resistant enterococci，VRE)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)等。
针对羊毛硫肽生物合成的工程改造及基因组挖掘，有望为新型抗生素的发现和开发提供来源。羊毛硫肽生物合成通路的特点有利于其衍生物文库的高通量建立和筛选。首先，羊毛硫肽的前体肽由基因编码，可以通过引入突变快速产生结构多样性的产物。同时，羊毛硫肽前体肽具有模块化组成。例如，原绿球藻(Prochlorococcus)的羊毛硫肽生物合成基因簇中，包含一个羊毛硫肽合成酶ProcM和约30个前体肽编码基因procA，其前导肽序列高度保守，而核心肽序列高度可变。另外，将其他羊毛硫肽核心肽与nisin前导肽融合，得到的人工嵌合前体肽也能被nisin合成酶NisBC识别和修饰。这些研究结果同时也表明包括NisBC、ProcM在内的羊毛硫肽合成酶具有较高的底物杂泛性(promiscuity)。综合这些特点，研究者基于模块化、“即插即用(plug and play)”等原理开发了各种新的手段，针对羊毛硫肽抗生素生物合成开展大规模工程改造及挖掘。在深入理解其构效关系、生物合成过程、活性靶点和机理的同时，可以提高羊毛硫肽抗生素的药学性质，甚至开发新的活性和应用。
然而，绝大多数羊毛硫肽抗生素原生菌体的遗传操作非常困难，为了便于对羊毛硫肽抗生素进行研究，工程化改造遗传操作通常在大肠杆菌或乳酸杆菌中进行。同时，为了避免羊毛硫抗生素对宿主菌潜在的毒性，羊毛硫肽的表达修饰和核心肽释被分开进行，且多种商用酶切位点的引入也使引导肽的移除不具有挑战性。目前，微流控系统、微滴阵列系统、无细胞体系、微纳反应器等筛选平台已经被用于羊毛硫肽抗生素突变体的高通量筛选，但羊毛硫抗生素的表达修饰和引导肽移除的分步进行，在一定程度上阻碍了突变体筛选的尺度和通量。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种羊毛硫抗生素高通量自动化筛选方法。
本发明的另一目的在于提供所筛选得到的羊毛硫抗生素。
本发明的另一目的在于提供所述筛选方法在研究羊毛硫抗生素的活性结构关系中的应用，便于后续理性设计活性更好的羊毛硫抗生素。
一方面，本发明提供了一种羊毛硫抗生素高通量筛选方法，该方法包括：
构建羊毛硫肽定点饱和突变文库，并提取质粒转化表达菌株，获得突变体；
利用自动化平台对所有突变体进行抑菌活性表征及样品检测；其中，所述进行抑菌活性表征包括通过抑菌法获得各突变体抑菌活性而实现高通量自动化羊毛硫抗生素活性筛选，所述样品检测包括高通量自动化MALDI-TOF检测目的产物。
根据本发明的具体实施方案，本发明的羊毛硫抗生素高通量筛选方法中，构建羊毛硫肽定点饱和突变文库的过程包括：
利用自动化移液工作站和自动化PCR仪，以含有羊毛硫肽基因序列的重组质粒为模板，通过引入简并密码子NNK产生突变设计饱和突变引物，进行定点饱和突变PCR；
利用自动化移液工作站和自动化PCR仪对PCR产物进行Gibson组装，获得饱和突变质粒文库。
定点饱和突变文库自动化高通量构建及筛选流程能够避免实验人员高强度的筛选过程，同时避免了人为操作带来的人为错误，能够准确高效的完成定点饱和突变文库的构建、转化、克隆挑取及文库筛选后重排保种。
根据本发明的具体实施方案，本发明的羊毛硫抗生素高通量筛选方法中，进行定点饱和突变PCR的过程包括：
将PCR反应体系的试剂分别放在自动化移液工作站的试剂槽内，工作站按照自动化PCR扩增反应程序将反应体系中的各组分混合到PCR反应板中，通过自动化移液臂转移至自动化PCR仪中，进行PCR反应；反应结束后再由自动化机械臂运回自动化移液工作站，添加DpnI酶，再于自动化PCR仪中进行反应以消化模板质粒；
优选地，PCR扩增出来2个片段，片段1由突变正向引物和载体上卡那霉素抗性反向引物经过反应体系1扩增获得，片段2由突变反向引物和卡那霉素抗性正向引物pRSF-Kana-F经过反应体系2扩增得到。
根据本发明的具体实施方案，本发明的羊毛硫抗生素高通量筛选方法中，进行Gibson组装的过程包括：
将Gibson组装反应所需组分放置到自动化移液工作站的试剂槽中，自动化移液工作站根据自动化Gibson组装程序将Gibson组装反应中的各组混合并通过自动化机械臂送至PCR仪中进行反应，组装获得饱和突变质粒文库；
其中，每一个基因编号位点饱和突变文库由以重组质粒为模板扩增出来的2个片段进行Gbsion组装获得。
根据本发明的具体实施方案，本发明的羊毛硫抗生素高通量筛选方法中，提取质粒转化表达菌株的过程包括：
使用自动化移液工作站将上述饱和突变质粒转化至大肠杆菌感受态细胞中；
优选地，大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌Dh5a感受态细胞；转化过程包括：
使用自动化移液工作站根据编辑好的自动化质粒转化至大肠杆菌感受态细胞程序脚本将感受态细胞添加到饱和突变质粒中，并在自动化移液工作站的低温控制模块上孵育，通过工作站机械抓手转移到加热控制模块上热激，转移至低温控制模块上孵育，使用96通道MCA将转化后的感受态添加到培养基，再转移至培养箱孵育，离心去除部分上清液，剩下菌液吹打重悬后均匀滴加至含有抗生素的平皿中，放在微生物培养箱中倒置培养过液。
根据本发明的具体实施方案，本发明的羊毛硫抗生素高通量筛选方法，还包括：
使用Qpix自动挑克隆仪将转化后的平皿进行挑取到96孔板进行培养，每个文库转化的平板挑取2个96孔板，过夜培养后，使用自动化移液工作站从每个孔中取样品测序；
依据测序结果挑选出不同位点的不同氨基酸突变体，进行重排，抽取突变体培养液使用封膜仪封膜保种。
根据本发明的具体实施方案，本发明的羊毛硫抗生素高通量筛选方法中，提取质粒转化表达菌株的过程还包括：
使用自动化移液工作站将上述饱和突变质粒转化至表达菌株BL21(DE3)；
优选地，转化至表达菌株BL21(DE3)的过程包括：提供含有pBAD18-SpompA-LicP-25-433/SRRz的BL21(DE3)感受态，利用移液工作站将感受态分装到放置在4℃板上的96孔PCR管中；将突变体文库质粒添加到96孔板感受态中，孵育，利用机械臂将96孔板转移到加热模块热激，利用96通道MCA转移感受态到添加培养基的96孔深孔板，利用机械臂将96深孔板转移到培养箱培养；利用机械臂再次将培养好的96孔板转移到移液工作站，利用96通量MCA抽取转化后的菌液滴加到培养皿上，过夜培养。
根据本发明的具体实施方案，本发明的羊毛硫抗生素高通量筛选方法，还可包括对饱和突变文库进行测序验证的过程。
根据本发明的具体实施方案，本发明的羊毛硫抗生素高通量筛选方法中，利用自动化平台对所有突变体进行抑菌活性表征及样品检测的过程包括：
使用自动化移液工作站进行质粒高通量提取；
优选地，具体操作为：将保种的突变体菌株放入移液工作站，利用自动化功能岛的机械臂将菌种抓取放置到撕膜仪中，将保种的96孔板上单封口膜揭除，然后使用MCA96通道在96孔保种板中蘸取菌落，接种到添加LB的96孔板中，通过功能岛的机械臂将接种后的96孔板过夜培养；然后，机械臂从培养箱取出培养好的突变体文库放置到移液工作站，同时将质粒提取相关试剂补充到移液工作站相应的试剂槽中，运行自动化质粒提取相关脚本，进行磁珠法高通量质粒提取。
根据本发明的具体实施方案，本发明的羊毛硫抗生素高通量筛选方法中，利用自动化平台对所有突变体进行抑菌活性表征的过程包括：
构建自裂解羊毛硫抗生素表达系统，表达菌体自裂解后进行抑菌实验表征活性。优选地，利用自动化平台对所有突变体进行抑菌活性表征的过程包括：
将突变文库的质粒高通量转化到BL21(DE3)感受态中，经培养、诱导表达后，进行自裂解；
利用Lactococcus lactis HP作为活性测试的敏感指示菌，进行抑菌实验表征活性。
可选择性地，还可使用基质辅助激光脱附电离时间飞行质谱鉴定表达情况。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明是利用移液工作站将突变文库的质粒自动化高通量转化到含有pBAD18duet-OmpA-LicP-SRRz质粒的BL21(DE3)感受态中，利用Qpix挑取单克隆到96孔深孔板，转移到自动化培养箱中过夜培养，然后利用Tecan移液工作站保种。同时利用移液工作站接种再次培养，利用移液工作站和酶标仪测定OD600在0.6-0.8之间时，添加IPTG和Arabinose在自动化培养箱中诱导。然后利用功能岛上单移液工作站和高速离心机对样品进行清洗，最终溶解到LB培养基中培养箱裂解。将裂解后的深孔板转移到水浴锅将没有裂解的E.coli灭活，防止或者的E.coli影响实验结果。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中利用双质粒表达系统构建自裂解系统。将双质粒转化到E.coli BL21(DE3)在相应的温度条件下进行培养、诱导表达、引导肽移除获得成熟羊毛硫肽。利用Lactococcus lactis HP作为活性测试的敏感指示菌，通过比较羊毛硫肽各突变体抑菌圈大小评估抗菌活性强弱。
本发明基于大肠杆菌细胞自裂解系统，能够将羊毛硫抗生素的表达修饰以及引导肽移除释放成熟肽在同一细胞中完成，解决了成熟羊毛硫抗生素释放的关键实验步骤，更便捷高效的获得成熟羊毛硫肽。
根据本发明的具体实施方案，本发明的羊毛硫抗生素高通量筛选方法中，利用自动化平台对所有突变体进行样品检测的过程包括羊毛硫肽生素高通量活性筛选：
突变体表达文库放置到自动化平台的载物架上，通过机械臂将突变文库转移到撕膜仪中，取出封口膜；机械臂将突变文库种子液转移到移液工作站接种，然后转移到培养箱过夜培养，使每个突变体都培养到饱和期；
培养后的突变体文库利用移液工作站接种二次扩培，OD在0.6-0.8之间，诱导表达；
表达后的突变体文库利用机械臂转移到离心机离心，去上清；
利用移液工作站添加培养基，使用枪头混匀清洗抗生素，再次离心去除上清；
清洗后的菌体添加培养基，震荡混匀，然后置于培养箱孵育，使菌体充分裂解；
裂解后的菌体加热，将残余存活的E.coli完全杀死；
加热后的突变体文库离心，使用96通道MCA抽取上清，加入到制作好的琼脂抑菌板中，然后利用机械臂将抑菌板转移到培养箱中正置过夜培养；
优选地，进一步，根据文库琼脂抑菌结果，将每个突变位点的野生型抑菌圈的直径为标准，测量突变体抑菌圈的长度与野生型比较获得完整的抑菌活性图谱，进行活性筛选。
根据本发明的具体实施方案，本发明的羊毛硫抗生素高通量筛选方法中，利用自动化平台对所有突变体进行样品检测的过程包括羊毛硫抗生素高通量MALDI-TOF MS鉴定。高通量自动化MALDI-TOF MS检测羊毛硫抗生素方法的建立实现了超高通量的样品分析，与传统的色谱-质谱联用质谱检测方法相比，从每个样品30min左右，缩短到每个样品5s，极大的提高实验通量。同时，该实验从培养表达到样品的检测都是通过自动化工作站，减少人为错误，加快实验进程。
具体地，高通量MALDI-TOF MS鉴定过程包括：
工程化改造加入LicP酶切割位点的羊毛硫抗生素突变表达文库过夜培养，利用96通道MCA抽取样品，接种到在含有抗生素的固体LB的方形培培养皿上放置的聚偏二氟乙烯(Poly(vinylidene fluoride)，PVDF)膜上，过夜培养；
菌落长起来后将长有菌落的PVDF膜转移到含有IPTG和阿拉伯糖的固体LB方形培养皿上，诱导；
诱导表达后的菌落连同培养板转移到培养箱孵育，菌落充分裂解使LicP酶与修饰的突变体相互接触释放成熟的突变体；
将产生突变体的菌落平板转移到移液工作站，利用移液工作站的LiHa8通道移液器蘸取菌落点到384抛光的MALDI-TOF金属板上，然后再使用mosquito添加CHCA基质吹干；使用Bruker UltrafleXtreme MALDI-TOF MS进行鉴定。
根据本发明的具体实施方案，本发明的羊毛硫抗生素高通量筛选方法，适用于多种羊毛硫抗生素的表达和活性检测，例如，所述羊毛硫肽可包括haloduracinα链、Nisin中的一种或多种。
另一方面，本发明还提供了一种羊毛硫抗生素，其是按照本发明所述方法筛选得到的。优选地，所述羊毛硫抗生素包括：halA1-A4H、A15H等中的一种或多种。
另一方面，本发明还提供了所述的筛选方法在haloduracinα结构活性研究中的应用。优选地，所述haloduracinα结构活性研究包括研究羊毛硫肽的氨基酸位点与该羊毛硫肽的活性关系，例如，在本发明的一些具体实施方案中，研究了haloduracinα的G11、N12、G14、E22、24M和/或P25等氨基酸位点与该羊毛硫肽的活性关系。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明通过双组分羊毛硫肽抗生素haloduracinα链进行实验测试，通过高通量自动化平台成功获得halA1非结构关键位点的多个定点饱和突变文库，并利用自动化平台对所有突变体进行抑菌活性表征及样品检测。通过高通量MALDI-TOF MS成功检测出各个突变体的表达，并且同步通过琼脂板抑菌法获得各突变体抑菌活性，获得了稳定性高、无人为实验误差的高质量数据，成功揭示了halα结构活性关系，为后续新型羊毛硫肽抗生素的设计提供可靠的数据支撑。
本发明中，巧妙利用细胞区间化，将引导肽切割蛋白酶LicP定位到细胞周质空间，而羊毛硫肽前体和其修饰酶共表达到细胞质，获得修饰的羊毛硫肽。随后通过温度控制噬菌体裂解基因表达，在时间上控制引导肽切割酶与修饰的羊毛硫肽接触，释放成熟羊毛硫肽。最终该方案使成熟羊毛硫肽能够在单个克隆中产生。高通量自动化筛选平台是将整合了不同功能组件的功能岛，针对实验设计利用机械臂将各个组件串联形成自动化工作流程，实现文库构建、转化、克隆挑取、保种、接种培养、质粒提取、活性表征和质谱鉴定等流程机械自动化。在自动化工作流程中的每一环节都是已有开发方案的基础进行调整，基于单个步骤的不同流程组合，获得相应实验目的结果。
综上所述，本发明利用自动化工作站，实现了高通量自动化的羊毛硫肽抗生素定点饱和突变文库构建和筛选，然后基于大肠杆菌自裂解系统异源表达成熟的羊毛硫肽抗生素，最后通过自动化工作站自动化高通量的对产物进行鉴定及活性表征。该系统既适用于现有羊毛硫肽抗生素的工程改造，获得其结构活性关系，对于改造获得高活羊毛硫肽抗生素具有指导意义；同时，又能对现有基因组中挖掘出的新型羊毛硫肽抗生素进行活性筛选，挖掘新型羊毛硫肽抗生素。因此，该自动化高通量活性筛选平台应用于高活性羊毛硫肽抗生素的改造和挖掘对于解决全球耐药菌问题具有深远意义。
附图说明
图1为本发明的羊毛硫肽抗生素高通量抑菌活性筛选及质谱检测流程示意图。
图2为本发明的突变文库分选流程示意图。
图3显示本发明实施例1中的定点饱和突变文库测序结果。
图4显示本发明的Halα工程改造后的生物合成通路。
图5为E.coli生产成熟羊毛硫肽示意图。其中，左上图片示意LicP酶表达在周质空间，LanA和LanM表达到细胞质中形成修饰后的羊毛硫肽mLanA；右上图片示意E.coli裂解后LicP酶识别切割序列释放成熟的羊毛硫肽。
图6为利用琼脂抑菌实验和MALDI-TOF MS分析大肠杆菌自裂解产生成熟halα表达结果。
图7为HalA1-12、16、19号文库抑菌筛选结果及质谱鉴定结果。
图8为halα突变体活性筛选热图。
图9为高通量MALDI-TOF MS鉴定工作流程示意图。
图10为本发明的自动化功能岛的结构示意图。
图11A至图11C为本发明的nisin生物合成通路改造、活性测定及质谱检测结果示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明实质的前提下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
各实施例中，若未特别说明，所用的仪器设备、材料、生物化学试剂均为常规市售试剂，所用的技术手段为本领域技术人员熟知常规手段，或按照仪器制造商所建议的条件操作。
实施例1
请参见图1所示，本实施例提供了一种高通量自动化筛选羊毛硫抗生素的方法，该方法主要流程包括：定点饱和突变文库的自动化构建筛选，之后自动化提取质粒并转化表达菌株，然后进行自动化高通量抑菌活性表征和高通量的产物鉴定。
具体地，本实施例的高通量自动化活性筛选羊毛硫抗生素是对双组分羊毛硫肽抗生素haloduracinα链进行活性筛选，具体方法包括步骤：
1.自动化构建饱和突变文库
(1)定点饱和突变PCR
该步骤中，以含有羊毛硫肽基因序列的重组质粒pRSFDuet-halA1-halM1为模板，通过引入简并密码子NNK(N代表A、T、C、G中的任意一种碱基，K代表T、G中的任意一种碱基)产生突变，设计饱和突变引物(见表一)，每一个基因编号位点饱和突变文库由以重组质粒为模板扩增出来的2个片段进行Gbsion组装获得，片段1(PCR-1)由突变正向引物(halA1-F)和载体上卡那霉素抗性反向引物(pRSF-Kana-R)经过反应体系1扩增获得，片段2(PCR-2)由突变反向引物(halA1-R)和卡那霉素抗性正向引物pRSF-Kana-F经过反应体系2扩增得到。对基因halA1序列中编号2-6、9-16、19、21-22、24-26及28号位点，共计20个位点的序列进行饱和突变文库的构建，片段1共有20个，片段2也有20个，与片段一一对应进行两片段组装。片段扩增反应体系1为pRSFDuet-halA1-halM1质粒1μl(浓度1ng/μl)，正向突变引物2μl(10mM)，反向引物2μl(10mM)，PrimeSTAR预混高保真聚合酶25μl(购自Takara)，双蒸水20μl，反应总体积为50μl。其中，重组质粒pRSFDuet-halA1-halM1是将haloduracinA1(halA1，长度210bp，序列如SEQ ID No.1所示)和其修饰酶haloduracin M1(halM1，长度3180bp，序列如SEQ ID No.2所示)构建到pRSFDuet载体上中而获得的总长度为7202bp的重组质粒。
具体操作可按照以下进行：将上述PCR反应体系的试剂分别放在自动化移液工作站的试剂槽内，工作站按照编辑好的自动化PCR扩增反应程序脚本将反应体系中的各组分混合到PCR反应板中，通过自动化移液臂转移至自动化PCR仪中，反应程序为98℃预变性5min后，进行30个循环反应，每个循环包括：98℃变性15s，53℃退火15s，72℃延伸10s，之后在于72℃延伸5min，最后于4℃保存。反应结束后再由自动化机械臂运回自动化移液工作站，向每一个反应中添加10U DpnI酶(购自美国NEB公司)，再于自动化PCR仪中进行37℃反应1h，以消化模板质粒进行纯化。
HalodurcinA1基因序列(SEQ ID No.1)：
ATGacaaatcttttaaaagaatggaaaatgcctcttgagcgtactcataataattctaatccagcaggggatattttccaagagttagaagaccaagatattctaaatgacgtcaatcctgaatgcgcatggtacaacatcagctgccgtctaggtaacaaaggtgcttactgcacacttacagttgagtgcatgccttcttgcaactaa
HaloduracinM1修饰酶基因序列(SEQ ID No.2)：
ATGagagaattacaaaatgctctttacttttcagaagtagtgttcgggccaaatttggagaaaatagttggtgagaaacggttgaatttttggctgaagttgatcggggaggatcctgaaaaccttaaggagtttctctcgcgaaaagggaattcttttgaagaacaaacgctcccggaaaaagaagcgatcgtaccgaacagattaggagaagaggcactagaaaaagtaagagaagaattggaatttcttaatacatattcaacgaagcatgtaagaagagtaaaagaactcggtgtccaaattccatttgaaggcattcttctgccgttcatatccatgtatatagagaaatttcaacaacaacaattgaggaaaaaaattggtccaatacatgaagagatttggactcagatagtgcaagatattaccagcaaacttaatgctattctacaccgtacacttatcctggaactgaacgttgcaagagtcacctctcagttgaagggagataccccggaagaacgatttgcttattactcaaaaacctatttagggaaaagggaggtcacccatcgtctttattctgaatatccagttgtcctacgattactatttaccacgattagtcatcatattagctttataacggaaattctcgaacgagttgccaacgatcgagaagcgatagaaacagagttttcaccatgctcaccgatcggtactttggcctcactccacctaaattcaggtgacgctcatcataaacaacgcacggtcactattctagagttttcttcgtcgttaaaacttgtttataaaccgcgttctcttaaggttgacggggtatttaatggcctgcttgcatttttaaatgacagaacaggtgaagtgataaaagatcaatattgtcctaaagtgctacaacgagacggatatggatacgtagaattcgttacccatcaaagctgtcaatcgctagaagaggtatctgatttttatgaaagactcggttcacttatgagcctttcgtatgtcctcaattcatccgactttcactttgaaaatattattgctcatggtccataccctgttttaattgatttagagacgattattcataatacggccgattcatcagaagagacatccacagcgatggatagagcttttcggatgttaaatgattctgtcctttcaacaggtatgctaccttcgtctatctactatcgagatcaaccgaatatgaaagggttaaacgtaggtggtgtcagcaagagcgagggacagaaaacaccatttaaagtcaatcaaattgcaaacagaaatacggatgaaatgagaatagagaaagaccatgtgacgctttctagtcaaaagaacttgccaatttttcaatcggcagcaatggagtctgttcactttctcgaccaaattcaaaagggctttacttcaatgtatcaatggattgaaaaaaacaagcaggaatttaaggaacaggtgcggaagtttgaaggtgtccccgtccgggcggtcctccgttccacgacacgttatacggaacttttaaaaagtagttatcatccagatttactaaggtcagcacttgatcgtgaagttctcttaaacaggttgacggtagattctgtcatgaccccatatttgaaggaaattattcctctcgaagtggaagatttacttaatggggatgttccatatttctatactttgccggaagaacgcgccttatatcaagaggcttccgctatcaattcaacgttttttaccacatctatttttcataaaatcgatcaaaaaatagataaattagggatagaggatcatactcagcaaatgaaaattttgcatatgtcgatgcttgcaagtaacgcgaatcattatgcagatgttgcagaccttgatattcaaaaaggtcatacgatcaaaaatgagcagtatgtagagatggcaaaagatattggagattacttgatggaattatctgtggaaggagaaaatcagggtgaacctgatctttgttggatcagtacggttttagaaggctctagcgaaattatatgggatatttccccggtaggtgaagatctatataatggttcagcaggggtcgccctattttatgcttacttgtttaaaataacaggggagaagcgatatcaagagatcgcctataaagcgttagtccctgttcggagatctgttgctcaattccaacaccaccctaactggagcataggtgcatttaatggagcgagtggttatctttacgcaatgggaacaatcgctgctttatttaatgacgagcgtcttaaacatgaggtaactagaagcatccctcatatagagcctatgatccacgaagataaaatctatgatttcattgggggttcagcaggggcgttgaaagtatttttatctctttccggcctttttgatgagcctaagttcttggaattggcgattgcttgtagtgaacatttaatgaaaaatgcgatcaagactgaccaggggataggatggaaaccaccatgggaggtaactccattaacgggtttttctcatggcgtatcaggcgtaatggcttcgttcattgaactctatcaacagactggagatgaacggctgttatcctatattgatcaatctcttgcgtatgagcgaagtttcttttcagaacaggaggaaaactggctaactccaaacaaagaaacgccagttgttgcgtggtgccatggggcgccagggatacttgtaagtcgcttactattaaagaaatgtggatatcttgatgagaaggtagaaaaagagattgaagtggccttgtctacaacgataagaaaaggtcttggtaacaatcgttccctttgccacggtgactttggccaattggagattttacgatttgcggccgaggttttaggcgattcgtatttacaggaagtagtaaacaatctcagtggtgagttgtacaatcttttcaaaacagaagggtatcagtcgggaacctctagaggaacggaatccgttggtttaatggtggggctgtctggatttggttatggacttttaagtgctgcttatccatctgccgttccttctatactaacgctagacggcgaaattcaaaaataccgtgaaccgcatgaggcgaatcattaa
表一：饱和突变体引物设计
(2)自动化Gibson组装
该步骤中，是利用自动化移液工作站和自动化PCR仪对上一步的PCR产物(纯化过的核酸片段)进行Gibson组装，每个反应将一个PCR-1和一个PCR-2组装成完整的质粒(即为饱和突变质粒)，按照PCR引物的设计，每一对不同的PCR-1可分别于相应的PCR-2进行组装，最后共组装获得20个饱和突变质粒文库，该工艺流程可以同时进行96个组装反应。实验前预先配置好Gibson组装反应液，包含320μl 5X ISO缓冲液、0.64μl T5核酸外切酶(10U/μl，购自美国NEB公司)、20μl Phusion聚合酶(2U/μl，购自美国NEB公司)、160μl Taq连接酶(40U/μl，购自美国NEB公司)、双蒸水补足至1.2mL后置于-20℃保存。
具体操作可按照以下进行：将Gibson组装反应所需组分放置到自动化移液工作站的试剂槽中，反应体系为：Gibson组装反应液7.5μl、纯化后的核酸片段1：1.25μl、纯化后的核酸片段2：1.25μl，总反应体系10μl。自动化移液工作站根据编辑好的自动化Gibson组装程序脚本将Gibson组装反应中的各组混合并通过自动化机械臂送至PCR仪中进行反应，50℃反应1h。组装获得20个饱和突变质粒文库(halA1突变体文库质粒)。
2.自动化转化大肠杆菌
该步骤中，可使用自动化移液工作站将上述饱和突变质粒转化至大肠杆菌感受态细胞中，该工艺可同时进行96个转化实验。本实施例中进行大肠杆菌Dh5a感受态细胞和表达菌株BL21(DE3)的转化。具体操作可按照以下进行：
大肠杆菌Dh5a感受态细胞(购自康体生物)转化：使用自动化移液工作站根据编辑好的自动化质粒转化至大肠杆菌感受态细胞程序脚本将50μl感受态细胞添加到饱和突变质粒中，并在自动化移液工作站的4℃低温控制模块上孵育30min，通过工作站机械抓手转移到45℃加热控制模块上热激60s，转移至4℃低温控制模块上孵育2min，使用96通道MCA将转化后的感受态添加到500μl无抗生素的LB培养基，再转移至37℃培养箱孵育1h，离心去除上清液300μl，剩下200μl菌液吹打重悬后均匀滴加至含有抗生素的平皿中，放在37℃微生物培养箱中倒置培养过液。
表达菌株BL21(DE3)转化：提供含有pBAD18-SpompA-LicP-25-433/SRRz的BL21(DE3)感受态，利用移液工作站将感受态分装到放置在4℃加热板上的96孔PCR管中，每孔30μl。将提取好并均一化到50ng/μl的halA1突变体文库质粒抽取1μl添加到96孔板感受态中，4℃孵育30min，利用机械臂将96孔板转移到45℃加热模块热激60s，利用96通道MCA转移感受态到添加500μl无抗LB培养基的96孔深孔板，利用机械臂将96深孔板转移到培养箱30℃培养2h。利用机械臂再次将培养好的96孔板转移到移液工作站，利用96通量MCA抽取3μl转化后的菌液滴加到方形LB培养皿上，30℃过夜培养。
3.自动化克隆挑取
构建DH5α文库菌克隆挑取(分选流程如图2)：使用Qpix自动挑克隆仪将转化后的平皿进行挑取到96孔板进行培养，每个文库转化的DH5α平板挑取2个96孔板，过夜培养后，使用自动化移液工作站从每个孔中去100μl送测序。依据测序结果挑选出不同位点的不同氨基酸突变体，按照氨基酸缩写的字母顺序在96孔板中进行重排，抽取700μl突变体培养液添加50％的甘油300μl，最后使用封膜仪封膜置于-80保存进行保种。
表达菌株BL21(DE3)克隆挑取：由于表达菌株的转化是验证过的单一突变体质粒，因此转化后的菌落都是一样，即便无法挑取单菌落也没有关系，直接使用移液工作站对每个突变体的菌落进行挑取，于96孔深孔板30℃过夜培养，然后进行保种-80℃保存。
4.饱和突变文库测序验证
该步骤中，通过对转化后的饱和突变文库进行测序评价构建是否成功，测序结果显示在目标编号位置存在NNK套峰即判定文库构建成功。该步骤也可在前述步骤“自动化克隆挑取”之前进行，或是与前述步骤“自动化克隆挑取”同步进行。
具体操作可按照以下进行：将上一步培养过夜的平皿取出，在平皿上滴加3mL LB培养基，使用涂布棒将平皿中所有菌落刮下，收集到新的Ep管中，从中吸取500μl菌液和500μl 40％甘油溶液混匀后置于-80℃冰箱冻存，剩余菌液利用测序仪测序(或送至上海生工生物有限公司测序)，测序结果如图3所示：相应突变位点NNK突变都成功获得突变文库。
5.自动化高通量文库质粒提取
该步骤中，使用自动化移液工作站进行质粒高通量提取，具体操作为：
将保种halA1的突变体菌株放入移液工作站，利用自动化功能岛的机械臂将菌种抓取放置到撕膜仪中，将保种的96孔板上单封口膜揭除，然后使用MCA96通道在96孔保种板中蘸取菌落，接种到添加LB的96孔板中，通过功能岛的机械臂将接种后的96孔板在30℃过夜培养。然后，机械臂从培养箱取出培养好的突变体文库放置到移液工作站，同时将质粒提取相关试剂补充到移液工作站相应的试剂槽中，运行自动化质粒提取相关脚本，进行磁珠法高通量质粒提取。自动化高通量质粒提取的工作流程为：首先过夜培养好的菌液离心去上清，加入质粒提取试剂盒中的P1进行重悬，加入P2混合后裂解3min，加入P3终止反应，离心10min取上清加入磁珠，震荡后取上清，加入清洗液震荡去上清，重复清洗三次，然后加入50μl去离子水洗下质粒，抽取溶解好的质粒转移到96孔板封闭保存。
6.自裂解羊毛硫抗生素表达系统
工作流程介绍：利用移液工作站将突变文库的质粒自动化高通量转化到含有pBAD18duet-OmpA-LicP-SRRz质粒的BL21(DE3)感受态中，利用Qpix挑取单克隆到96孔深孔板，转移到自动化培养箱中30℃过夜培养，然后利用Tecan移液工作站保种。同时利用移液工作站1％接种再次培养6h左右，利用移液工作站和酶标仪测定OD600在0.6-0.8之间后，添加终浓度为1mM和10mM的IPTG和Arabinose在自动化培养箱中18℃诱导20h。然后利用功能岛上单移液工作站和高速离心机对样品进行3次清洗，最终溶解到50ul LB培养基中38℃培养箱裂解4h。将裂解后的深孔板转移到水浴锅80℃10min将没有裂解的E.coli灭活，防止或者的E.coli影响实验结果。
工作原理介绍：羊毛硫肽抗生素表征的工作流程基本都是一个连续的步骤，包括羊毛硫多肽生产和修饰、引导肽移除、生物活性筛选、质谱分析。其中羊毛硫肽的生产、修饰和引导肽移除都已经相当成熟。为了获得成熟的halA1，将halA1引导肽的C末端后6位氨基酸替换成LicP识别序列(NDVNPE)(图4)，这个来自于Lichenicidin生物合成中的丝氨酸蛋白酶已经被证明(Repka,Lindsay,M,et al.Applications of the class IIlanthipeptide protease LicP for sequence-sp ecific,traceless peptide bondcleavage[J].Chemical science,2015,6(11):6270-6279)能够在大肠感觉中可溶性表达，并应用于特异性的、无痕的肽键切割。同时，licP酶的N末端天然分泌信号被替换成大肠杆菌的OmpA信号肽，它将LicP酶定位到细胞周质空间。在halA2的N末端添加组氨酸标签一定程度上避免大肠杆菌内源多肽酶对工程化halA2的降解，同时组氨酸标签的添加也便于后续突变体的纯化。
为了控制引导肽的切割，一个来自于λ噬菌体的大肠杆菌裂解基因SRRz被利用，在这个系统中SRRz基因被两个热诱导启动子λcI857/pR控制。含有自裂解质粒的大肠杆菌能够在30℃正常生长，转移到38℃大约4h时，大于90％的细胞被裂解。细胞的裂解活性是由于裂解基因的产物能够在细胞内膜形成孔洞、降解肽聚糖，已及破坏细胞的外膜。细胞的裂解使细胞周质空间中的LicP释放与修饰的halA1接触，移除引导肽，释放出成熟的halα(图5)。
自裂解系统的实施依靠于双质粒表达系统。his-halA1和halM1被组装到pRSFDuet双元质粒中，被IPTG诱导控制；而SPOmpA-licP和SRRz被组装到pBAD18duet质粒中，分别被阿拉伯糖和温度转化诱导。将双质粒转化到E.coli BL21(DE3)在相应的温度条件下进行培养、诱导表达、引导肽移除获得成熟的halα。利用Lactococcus lactis HP作为活性测试的敏感指示菌，表达的halα与从B,halodurans纯化出的halβ协同抑制指示菌生长，通过比较halα各突变体抑菌圈大小评估抗菌活性强弱，并使用基质辅助激光脱附电离时间飞行质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight massspectrometry，MALDI-TOF MS)鉴定halα表达情况(如图6)。从图6，可以看到双质粒转化情况下仅有通过转换温度裂解细胞释放出成熟halα时，才有抑菌圈出现。当仅有Licp酶和大肠自裂解基因时不具有活性，也不能检测出halα；且halα表达质粒存在且诱导表达后，如果不改变温度到38℃裂解细胞，也同样不能获得成熟的halα；因此，表明该表达系统能够稳定的表达成熟羊毛硫肽halα。
7.羊毛硫肽生素高通量活性筛选
活性筛选流程：突变体表达文库放置到自动化平台的载物架上，通过机械臂将突变文库转移到撕膜仪中，取出封口膜；机械臂将突变文库种子液转移到移液工作站接种，然后转移到培养箱30℃过夜培养，使每个halα突变体都培养到饱和期。培养后的突变体文库利用移液工作站1％接种二次扩培，4h左右，OD在0.6-0.8之间，加入终浓度1mM的IPTG和10mM的阿拉伯糖18℃诱导表达20h。表达后的突变体文库利用机械臂转移到离心机8000xg离心10min，去上清。利用移液工作站添加1mlLB培养基，使用枪头混匀清洗抗生素，再次离心去除上清；该清洗重复三次，完全除去抗生素，并对后续活性筛选工作造成影响。清洗后的菌体添加50μl LB培养基，震荡混匀，然后置于38℃培养箱孵育4h，使菌体充分裂解。由于羊毛硫抗生素具有羊毛硫环，具有很强的耐高温性，因此裂解后的菌体在80℃加热10min，将残余存活的E.coli完全杀死，以免对后续实验造成影响。加热后的突变体文库8000g离心10min，使用96通道MCA抽取上清10μl，加入到制作好的琼脂抑菌板中，同时添加纯化的3μl200nM halα作为阳性对照，然后利用机械臂将抑菌板转移到30℃培养箱中正置过夜培养。文库琼脂抑菌结果如图7中的图片A所示，将每个突变位点的野生型抑菌圈的直径为标准，测量突变体抑菌圈的长度与野生型比较获得完整的抑菌活性图谱如图8。从活性筛选结果可以发现，A环中G11、N12和G14为保守序列，突变成任意其他氨基酸后，活性显著降低；B环中的E22、24M和P25也同样为保守序列，突变后活性较野生型显著变差；本发明也发现A环中的R9位点在突变成阳离子氨基酸情况下才有抑菌圈出现，而与它相邻的I6和L10在也仅在突变成几种非极性氨基酸时才具有与野生型相当的抑菌活性；5号位点突变成Cys残存抑菌活性，而其他位点突变成Cys都会造成halA1活性丧失，推测可能是Cys的引入导致halA1不能正确成环，以致失活。
8.羊毛硫肽抗生素高通量MALDI-TOF MS鉴定
工程化改造加入LicP酶切割位点的羊毛硫抗生素突变表达文库过夜培养，利用Tecan的96通道MCA抽取3μl，接种到在含有抗生素的固体LB的方形培培养皿上放置的聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，30℃过夜培养。菌落长起来后人工将长有菌落的PVDF膜转移到含有IPTG和阿拉伯糖的固体LB方形培养皿上，18℃诱导20h。诱导表达后的菌落连同培养板利用机械臂转移到38℃培养箱孵育4h，菌落充分裂解使LicP酶与修饰的halA1突变体相互接触释放成熟的halα。将产生halα突变体的菌落平板转移到移液工作站，利用移液工作站的LiHa8通道移液器蘸取菌落点到384抛光的MALDI-TOF金属板上，然后再使用mosquito添加α-cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA)基质(10mg/ml,乙腈：水：三氟乙酸＝50:47.5:2.5)0.5μl吹干。使用Bruker UltrafleXtreme MALDI-TOF MS进行鉴定，工作流程如图9，实验结果如图7中的图片B和图片C所示。实验结果可以看出每个突变体都能够被成功表达，证明E.coli自裂解系统能够稳定用于羊毛硫肽的表达。
本实施例的上述方法，优选使用一种自动化功能岛完成，其结构请参见图10所示，岛内仪器设备有自动化机械臂、自动化移液工作站、自动化PCR仪、自动化离心机、耗材堆栈、封膜机、撕膜机、酶标仪以及自动化振荡培养箱，其中自动化移液工作站操作系统Evoware由生产商提供，功能岛的操作系统Momentum由赛默飞提供。自动化移液工作站配备了灵活八通道移液吸头、高通量96通道移液吸头、多功能抓手机械臂、低温控制模块、加热控制模块、振荡模块、孔板板位、吸头板位和耗材载架若干。该功能岛与其他自动化设备，如：自动化挑克隆仪、自动化核酸提取仪等，为本发明涉及的蛋白质饱和突变文库高通量、自动化构建流程；饱和突变文库的自动化分选流程；自动化接种培养；自动化菌体处理及抑菌活性表征，以及自动化质谱表征等流程提供了有力支持，将相关工艺流程编辑成自动化程序脚本来实现相应的自动化实验流程。
实施例2
为了验证羊毛硫肽高通量筛选平台中自裂解生产羊毛硫肽的普遍性，本实施例参照实施例1的方法，对nisin进行相应的工程改造，在nisin引导肽前融合绿色荧光蛋白GFP，便于观察目的蛋白的表达情况(图11A)，同时，在nisin引导肽和核心肽中插入LicP酶切位点NDVDPE(如图11B)。利用同样的区室化原理，将Licp酶定位到细胞周质空间，Nisin和其对应的修饰酶NisinB/C表达到细胞质内，当Nisin被修饰后，转换温度到38℃裂解E.coli，使LicP酶与修饰的nisin接触，水解释放nisin成熟肽。利用实施例1中的琼脂抑菌实验验证出了nisin的抑菌活性，同时也利用MALDI-TOF MS检测出nisin产物(图11C)。该实验证明羊毛硫肽高通量筛选平台适用于多种羊毛硫肽抗生素的表达和活性检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院深圳理工大学（筹）
深圳先进技术研究院
<120> 羊毛硫抗生素高通量筛选方法
<130> GAI21CN6336
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 210
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HalodurcinA1基因序列
<400> 1
atgacaaatc ttttaaaaga atggaaaatg cctcttgagc gtactcataa taattctaat 60
ccagcagggg atattttcca agagttagaa gaccaagata ttctaaatga cgtcaatcct 120
gaatgcgcat ggtacaacat cagctgccgt ctaggtaaca aaggtgctta ctgcacactt 180
acagttgagt gcatgccttc ttgcaactaa 210
<210> 2
<211> 3180
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HaloduracinM1修饰酶基因序列
<400> 2
atgagagaat tacaaaatgc tctttacttt tcagaagtag tgttcgggcc aaatttggag 60
aaaatagttg gtgagaaacg gttgaatttt tggctgaagt tgatcgggga ggatcctgaa 120
aaccttaagg agtttctctc gcgaaaaggg aattcttttg aagaacaaac gctcccggaa 180
aaagaagcga tcgtaccgaa cagattagga gaagaggcac tagaaaaagt aagagaagaa 240
ttggaatttc ttaatacata ttcaacgaag catgtaagaa gagtaaaaga actcggtgtc 300
caaattccat ttgaaggcat tcttctgccg ttcatatcca tgtatataga gaaatttcaa 360
caacaacaat tgaggaaaaa aattggtcca atacatgaag agatttggac tcagatagtg 420
caagatatta ccagcaaact taatgctatt ctacaccgta cacttatcct ggaactgaac 480
gttgcaagag tcacctctca gttgaaggga gataccccgg aagaacgatt tgcttattac 540
tcaaaaacct atttagggaa aagggaggtc acccatcgtc tttattctga atatccagtt 600
gtcctacgat tactatttac cacgattagt catcatatta gctttataac ggaaattctc 660
gaacgagttg ccaacgatcg agaagcgata gaaacagagt tttcaccatg ctcaccgatc 720
ggtactttgg cctcactcca cctaaattca ggtgacgctc atcataaaca acgcacggtc 780
actattctag agttttcttc gtcgttaaaa cttgtttata aaccgcgttc tcttaaggtt 840
gacggggtat ttaatggcct gcttgcattt ttaaatgaca gaacaggtga agtgataaaa 900
gatcaatatt gtcctaaagt gctacaacga gacggatatg gatacgtaga attcgttacc 960
catcaaagct gtcaatcgct agaagaggta tctgattttt atgaaagact cggttcactt 1020
atgagccttt cgtatgtcct caattcatcc gactttcact ttgaaaatat tattgctcat 1080
ggtccatacc ctgttttaat tgatttagag acgattattc ataatacggc cgattcatca 1140
gaagagacat ccacagcgat ggatagagct tttcggatgt taaatgattc tgtcctttca 1200
acaggtatgc taccttcgtc tatctactat cgagatcaac cgaatatgaa agggttaaac 1260
gtaggtggtg tcagcaagag cgagggacag aaaacaccat ttaaagtcaa tcaaattgca 1320
aacagaaata cggatgaaat gagaatagag aaagaccatg tgacgctttc tagtcaaaag 1380
aacttgccaa tttttcaatc ggcagcaatg gagtctgttc actttctcga ccaaattcaa 1440
aagggcttta cttcaatgta tcaatggatt gaaaaaaaca agcaggaatt taaggaacag 1500
gtgcggaagt ttgaaggtgt ccccgtccgg gcggtcctcc gttccacgac acgttatacg 1560
gaacttttaa aaagtagtta tcatccagat ttactaaggt cagcacttga tcgtgaagtt 1620
ctcttaaaca ggttgacggt agattctgtc atgaccccat atttgaagga aattattcct 1680
ctcgaagtgg aagatttact taatggggat gttccatatt tctatacttt gccggaagaa 1740
cgcgccttat atcaagaggc ttccgctatc aattcaacgt tttttaccac atctattttt 1800
cataaaatcg atcaaaaaat agataaatta gggatagagg atcatactca gcaaatgaaa 1860
attttgcata tgtcgatgct tgcaagtaac gcgaatcatt atgcagatgt tgcagacctt 1920
gatattcaaa aaggtcatac gatcaaaaat gagcagtatg tagagatggc aaaagatatt 1980
ggagattact tgatggaatt atctgtggaa ggagaaaatc agggtgaacc tgatctttgt 2040
tggatcagta cggttttaga aggctctagc gaaattatat gggatatttc cccggtaggt 2100
gaagatctat ataatggttc agcaggggtc gccctatttt atgcttactt gtttaaaata 2160
acaggggaga agcgatatca agagatcgcc tataaagcgt tagtccctgt tcggagatct 2220
gttgctcaat tccaacacca ccctaactgg agcataggtg catttaatgg agcgagtggt 2280
tatctttacg caatgggaac aatcgctgct ttatttaatg acgagcgtct taaacatgag 2340
gtaactagaa gcatccctca tatagagcct atgatccacg aagataaaat ctatgatttc 2400
attgggggtt cagcaggggc gttgaaagta tttttatctc tttccggcct ttttgatgag 2460
cctaagttct tggaattggc gattgcttgt agtgaacatt taatgaaaaa tgcgatcaag 2520
actgaccagg ggataggatg gaaaccacca tgggaggtaa ctccattaac gggtttttct 2580
catggcgtat caggcgtaat ggcttcgttc attgaactct atcaacagac tggagatgaa 2640
cggctgttat cctatattga tcaatctctt gcgtatgagc gaagtttctt ttcagaacag 2700
gaggaaaact ggctaactcc aaacaaagaa acgccagttg ttgcgtggtg ccatggggcg 2760
ccagggatac ttgtaagtcg cttactatta aagaaatgtg gatatcttga tgagaaggta 2820
gaaaaagaga ttgaagtggc cttgtctaca acgataagaa aaggtcttgg taacaatcgt 2880
tccctttgcc acggtgactt tggccaattg gagattttac gatttgcggc cgaggtttta 2940
ggcgattcgt atttacagga agtagtaaac aatctcagtg gtgagttgta caatcttttc 3000
aaaacagaag ggtatcagtc gggaacctct agaggaacgg aatccgttgg tttaatggtg 3060
gggctgtctg gatttggtta tggactttta agtgctgctt atccatctgc cgttccttct 3120
atactaacgc tagacggcga aattcaaaaa taccgtgaac cgcatgaggc gaatcattaa 3180
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 3
ctcgtccaac atcaatacaa cc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 4
ggttgtattg atgttggacg ag 22
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> k is g, or t
<400> 5
caatcctgaa tgcnnktggt acaacatc 28
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k is g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 6
gatgttgtac caknngcatt caggattg 28
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> k is g, or t
<400> 7
tcctgaatgc gcannktaca acatcagc 28
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k is g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 8
gctgatgttg taknntgcgc attcagga 28
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> k is g, or t
<400> 9
tgaatgcgca tggnnkaaca tcagctgc 28
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k is g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 10
gcagctgatg ttknnccatg cgcattca 28
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> k is g, or t
<400> 11
atgcgcatgg tacnnkatca gctgccgt 28
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k is g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 12
acggcagctg atknngtacc atgcgcat 28
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> k is g, or t
<400> 13
cgcatggtac aacnnkagct gccgtcta 28
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k is g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 14
tagacggcag ctknngttgt accatgcg 28
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> k is g, or t
<400> 15
caacatcagc tgcnnkctag gtaacaaa 28
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k is g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 16
tttgttacct agknngcagc tgatgttg 28
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> k is g, or t
<400> 17
catcagctgc cgtnnkggta acaaaggt 28
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k is g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 18
acctttgtta ccknnacggc agctgatg 28
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> k is g, or t
<400> 19
cagctgccgt ctannkaaca aaggtgct 28
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k is g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 20
agcacctttg ttknntagac ggcagctg 28
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> k is g, or t
<400> 21
ctgccgtcta ggtnnkaaag gtgcttac 28
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k is g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 22
gtaagcacct ttknnaccta gacggcag 28
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> k is g, or t
<400> 23
ccgtctaggt aacnnkggtg cttactgc 28
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k is g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 24
gcagtaagca ccknngttac ctagacgg 28
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> k is g, or t
<400> 25
tctaggtaac aaannkgctt actgcaca 28
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k is g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 26
tgtgcagtaa gcknntttgt tacctaga 28
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> k is g, or t
<400> 27
aggtaacaaa ggtnnktact gcacactt 28
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k is g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 28
aagtgtgcag taknnacctt tgttacct 28
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> k is g, or t
<400> 29
taacaaaggt gctnnktgca cacttaca 28
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k is g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 30
tgtaagtgtg caknnagcac ctttgtta 28
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> k is g, or t
<400> 31
tgcttactgc acannkacag ttgagtgc 28
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k is g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 32
gcactcaact gtknntgtgc agtaagca 28
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> k is g, or t
<400> 33
ctgcacactt acannkgagt gcatgcct 28
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k is g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 34
aggcatgcac tcknntgtaa gtgtgcag 28
<210> 35
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> k is g, or t
<400> 35
cacacttaca gttnnktgca tgccttct 28
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k is g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 36
agaaggcatg caknnaactg taagtgtg 28
<210> 37
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> k is g, or t
<400> 37
tacagttgag tgcnnkcctt cttgcaac 28
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k is g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 38
gttgcaagaa ggknngcact caactgta 28
<210> 39
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> k is g, or t
<400> 39
agttgagtgc atgnnktctt gcaactaa 28
<210> 40
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k is g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 40
ttagttgcaa gaknncatgc actcaact 28
<210> 41
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
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<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> k is g, or t
<400> 41
tgagtgcatg cctnnktgca actaacct 28
<210> 42
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k is g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 42
aggttagttg caknnaggca tgcactca 28
<210> 43
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> k is g, or t
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catgccttct tgcnnktaac ctgcaggt 28
<210> 44
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k is g, or t
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<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 44
acctgcaggt taknngcaag aaggcatg 28

Claims (15)

1.一种羊毛硫抗生素高通量筛选方法，该方法包括：
构建羊毛硫肽定点饱和突变文库，并提取质粒转化表达菌株，获得突变体；
利用自动化平台对所有突变体进行抑菌活性表征及样品检测；其中，所述进行抑菌活性表征包括通过抑菌法获得各突变体抑菌活性而实现高通量自动化羊毛硫抗生素活性筛选，所述样品检测包括高通量自动化MALDI-TOF检测目的产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，构建羊毛硫肽定点饱和突变文库的过程包括：
利用自动化移液工作站和自动化PCR仪，以含有羊毛硫肽基因序列的重组质粒为模板，通过引入简并密码子NNK产生突变设计饱和突变引物，进行定点饱和突变PCR；
利用自动化移液工作站和自动化PCR仪对PCR产物进行Gibson组装，获得饱和突变质粒文库。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，进行定点饱和突变PCR的过程包括：
将PCR反应体系的试剂分别放在自动化移液工作站的试剂槽内，工作站按照自动化PCR扩增反应程序将反应体系中的各组分混合到PCR反应板中，通过自动化移液臂转移至自动化PCR仪中，进行PCR反应；反应结束后再由自动化机械臂运回自动化移液工作站，添加DpnI酶，再于自动化PCR仪中进行反应以消化模板质粒；
优选地，PCR扩增出来2个片段，片段1由突变正向引物和载体上卡那霉素抗性反向引物经过反应体系1扩增获得，片段2由突变反向引物和卡那霉素抗性正向引物pRSF-Kana-F经过反应体系2扩增得到。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，进行Gibson组装的过程包括：
将Gibson组装反应所需组分放置到自动化移液工作站的试剂槽中，自动化移液工作站根据自动化Gibson组装程序将Gibson组装反应中的各组混合并通过自动化机械臂送至PCR仪中进行反应，组装获得饱和突变质粒文库；
其中，每一个基因编号位点饱和突变文库由以重组质粒为模板扩增出来的2个片段进行Gbsion组装获得。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，提取质粒转化表达菌株的过程包括：
使用自动化移液工作站将上述饱和突变质粒转化至大肠杆菌感受态细胞中；
优选地，大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌Dh5a感受态细胞；转化过程包括：
使用自动化移液工作站根据编辑好的自动化质粒转化至大肠杆菌感受态细胞程序脚本将感受态细胞添加到饱和突变质粒中，并在自动化移液工作站的低温控制模块上孵育，通过工作站机械抓手转移到加热控制模块上热激，转移至低温控制模块上孵育，使用96通道MCA将转化后的感受态添加到培养基，再转移至培养箱孵育，离心去除部分上清液，剩下菌液吹打重悬后均匀滴加至含有抗生素的平皿中，放在微生物培养箱中倒置培养过液。
6.根据权利要求5所述的方法，该方法还包括：
使用Qpix自动挑克隆仪将转化后的平皿进行挑取到96孔板进行培养，每个文库转化的平板挑取2个96孔板，过夜培养后，使用自动化移液工作站从每个孔中取样品测序；
依据测序结果挑选出不同位点的不同氨基酸突变体，进行重排，抽取突变体培养液使用封膜仪封膜保种。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，提取质粒转化表达菌株的过程还包括：
使用自动化移液工作站将上述饱和突变质粒转化至表达菌株BL21(DE3)；
优选地，转化至表达菌株BL21(DE3)的过程包括：提供含有pBAD18-SpompA-LicP-25-433/SRRz的BL21(DE3)感受态，利用移液工作站将感受态分装到放置在4℃板上的96孔PCR管中；将突变体文库质粒添加到96孔板感受态中，孵育，利用机械臂将96孔板转移到加热模块热激，利用96通道MCA转移感受态到添加培养基的96孔深孔板，利用机械臂将96深孔板转移到培养箱培养；利用机械臂再次将培养好的96孔板转移到移液工作站，利用96通量MCA抽取转化后的菌液滴加到培养皿上，过夜培养。
8.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括对饱和突变文库进行测序验证的过程。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，利用自动化平台对所有突变体进行抑菌活性表征及样品检测的过程包括：
使用自动化移液工作站进行质粒高通量提取；
优选地，具体操作为：将保种的突变体菌株放入移液工作站，利用自动化功能岛的机械臂将菌种抓取放置到撕膜仪中，将保种的96孔板上单封口膜揭除，然后使用MCA96通道在96孔保种板中蘸取菌落，接种到添加LB的96孔板中，通过功能岛的机械臂将接种后的96孔板过夜培养；然后，机械臂从培养箱取出培养好的突变体文库放置到移液工作站，同时将质粒提取相关试剂补充到移液工作站相应的试剂槽中，运行自动化质粒提取相关脚本，进行磁珠法高通量质粒提取。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，利用自动化平台对所有突变体进行抑菌活性表征的过程包括：
构建自裂解羊毛硫抗生素表达系统，表达菌体自裂解后进行抑菌实验表征活性；
优选地，利用自动化平台对所有突变体进行抑菌活性表征的过程包括：
将突变文库的质粒高通量转化到BL21(DE3)感受态中，经培养、诱导表达后，进行自裂解；
利用Lactococcuslactis HP作为活性测试的敏感指示菌，进行抑菌实验表征活性；
可选择性地，使用基质辅助激光脱附电离时间飞行质谱鉴定表达情况。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，利用自动化平台对所有突变体进行样品检测的过程包括羊毛硫肽生素高通量活性筛选：
突变体表达文库放置到自动化平台的载物架上，通过机械臂将突变文库转移到撕膜仪中，取出封口膜；机械臂将突变文库种子液转移到移液工作站接种，然后转移到培养箱过夜培养，使每个突变体都培养到饱和期；
培养后的突变体文库利用移液工作站接种二次扩培，OD在0.6-0.8之间，诱导表达；
表达后的突变体文库利用机械臂转移到离心机离心，去上清；
利用移液工作站添加培养基，使用枪头混匀清洗抗生素，再次离心去除上清；
清洗后的菌体添加培养基，震荡混匀，然后置于培养箱孵育，使菌体充分裂解；
裂解后的菌体加热，将残余存活的E.coli完全杀死；
加热后的突变体文库离心，使用96通道MCA抽取上清，加入到制作好的琼脂抑菌板中，然后利用机械臂将抑菌板转移到培养箱中正置过夜培养；
优选地，进一步，根据文库琼脂抑菌结果，将每个突变位点的野生型抑菌圈的直径为标准，测量突变体抑菌圈的长度与野生型比较获得完整的抑菌活性图谱，进行活性筛选。
12.根据权利要求9所述的方法，其中，利用自动化平台对所有突变体进行样品检测的过程包括羊毛硫抗生素高通量MALDI-TOF MS鉴定：
工程化改造加入LicP酶切割位点的羊毛硫抗生素突变表达文库过夜培养，利用96通道MCA抽取样品，接种到在含有抗生素的固体LB的方形培培养皿上放置的聚偏二氟乙烯膜上，过夜培养；
菌落长起来后将长有菌落的PVDF膜转移到含有IPTG和阿拉伯糖的固体LB方形培养皿上，诱导；
诱导表达后的菌落连同培养板转移到培养箱孵育，菌落充分裂解使LicP酶与修饰的突变体相互接触释放成熟的突变体；
将产生突变体的菌落平板转移到移液工作站，利用移液工作站的LiHa8通道移液器蘸取菌落点到384抛光的MALDI-TOF金属板上，然后再使用mosquito添加CHCA基质吹干；使用Bruker UltrafleXtreme MALDI-TOF MS进行鉴定。
13.根据权利要求1-12任一项所述的方法，其中，所述羊毛硫肽包haloduracinα链、Nisin中的一种或多种。
14.一种羊毛硫抗生素，其是按照权利要求1-13任一项所述方法筛选得到的；
优选地，所述羊毛硫抗生素包括：halA1-A4H、A15H等中的一种或多种。
15.权利要求1-13任一项所述的方法在haloduracinα结构活性研究中的应用；
优选地，所述haloduracinα结构活性研究包括haloduracinα的G11、N12、G14、E22、24M和/或P25等氨基酸位点与该羊毛硫肽的活性关系。
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