CN116731840A - 离心式生物反应芯片及生物检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种离心式生物反应芯片及生物检测方法，其中，离心式生物反应芯片包括芯片本体和密封结构，芯片本体设有反应结构和通气结构，通气结构与反应结构连通以使反应结构自通气。反应结构包括样本存储腔、反应液存储腔、混匀腔、预扩增腔和检测腔；样本存储腔上设有加样口，反应液存储腔设有加液口，样本存储腔的远心端出口与预扩增腔进口连接，反应液存储腔远心端出口通过混匀腔与预扩增腔进口连接，预扩增腔出口与检测腔连接；样本存储腔、混匀腔和分配腔均与通气结构连通。离心式生物反应芯片中，第一步扩增和第二步扩增均在同一个反应芯片中进行，无需进行液体转移，解决了两步法核酸扩增所需的体系密封和实现操作自动化。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断设备技术领域，特别涉及一种离心式生物反应芯片。本发明还涉及一种生物检测方法。
背景技术
核酸扩增是当前病原体检测的关键技术。一些传染性疾病的临床诊断比较复杂，需要对同一样本进行多指标并行检测分析。RPA技术是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的技术，且操作简单、扩增快速。但是获得适合多重检测用的、高特异性的RPA扩增引物的难度非常大。
为了同时检测多个指标，需要将同一种样本分配到用于分析不同靶标的多个反应体系中，每个反应体系中的样本含量较少，导致检测灵敏度较低。两步法核酸扩增技术，如两步RPA扩增、巢式PCR等，从第一轮反应产物中取出部分作为反应模板进行第二次扩增，从而极大的提高了检测灵敏度。其两步操作涉及到液体转移，，涉及第一步核酸扩增产物的暴露，容易产生产物污染，整体操作较为繁琐。
因此，如何解决两步法核酸扩增所需的体系密封和操作繁琐的问题，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种离心式生物反应芯片，以解决两步法核酸扩增所需的体系密封，同时实现操作自动化。本发明的另一目的是提供一种生物检测方法。
为实现上述目的，本发明提供一种离心式生物反应芯片，包括：
芯片本体，所述芯片本体设有反应结构和通气结构，所述通气结构与所述反应结构连通以使所述反应结构自通气，所述反应结构包括样本存储腔、反应液存储腔、混匀腔、预扩增腔和检测腔；所述样本存储腔上设有加样口，所述反应液存储腔上设有加液口，所述样本存储腔的远心端出口与所述预扩增腔进口连接，所述反应液存储腔远心端出口通过所述混匀腔与所述预扩增腔进口连接，所述预扩增腔出口与所述检测腔连接；所述样本存储腔用于预置第一步核酸反应需要的酶，所述预扩增腔用于预置有进行第一步核酸扩增反应所需要的引物，所述混匀腔用于预置有第二步核酸扩增反应所需要的酶，所述检测腔用于预置有进行第二步核酸扩增反应所需要的引物；及
密封所述反应结构和所述通气结构的密封结构。
可选地，在上述离心式生物反应芯片中，所述反应结构还包括分配腔，所述预扩增腔和所述检测腔均为多个，所述样本存储腔和所述混匀腔均通过所述分配腔与所述预扩增腔连接，所述样本存储腔远心端的出口与所述分配腔近心端的进口通过第一通道连接，所述反应液存储腔远心端的出口通过所述混匀腔与所述分配腔近心端的进口连接；所述分配腔远心端的出口通过所述预扩增腔与所述检测腔连接。
可选地，在上述离心式生物反应芯片中，所述反应结构还包括缓冲腔，所述反应液存储腔通过所述缓冲腔与所述混匀腔连接，所述反应液存储腔与所述缓冲腔通过第二通道连接，所述缓冲腔通过第三通道与所述混匀腔连接。
可选地，在上述离心式生物反应芯片中，所述混匀腔通过第四通道与所述分配腔连接，所述第一通道上设有第一界面阀，所述第二通道上设有第二界面阀，所述第四通道上设有第三界面阀。
可选地，在上述离心式生物反应芯片中，所述通气结构的通气管道包括第一通气管道、第二通气管道和第三通气管道，第一通气管道连接所述通气结构的通气孔和所述分配腔，所述第三通气管道连接所述通气孔和所述样本存储腔，所述第二通气管道连接所述通气孔和所述混匀腔，第一通气管道上设有第四界面阀，所述第二通气管道上设有第五界面阀。
可选地，在上述离心式生物反应芯片中，所述分配腔近心端的进口包括与所述样本存储腔连接的第一进口及与所述混匀腔连接的第二进口，且所述第一进口相对于第二进口靠近转动中心。
可选地，在上述离心式生物反应芯片中，所述反应结构还包括定量腔，所述预扩增腔和所述检测腔通过第六通道连接；所述定量腔通过第七通道与所述第六通道连接，所述定量腔的体积小于所述预扩增腔的体积，所述第七通道的流通截面大于所述第六通道的流通截面。
可选地，在上述离心式生物反应芯片中，所述第六通道包括沿流体流动方向连接的上游管道和下游管道，所述第七通道与所述上游管道和所述下游管道衔接处连接，所述下游管道中间位置向靠近转动中心位置凸出设置，所述下游管道为虹吸管道。
可选地，在上述离心式生物反应芯片中，所述密封结构与所述芯片本体一一对应连接，所述密封结构包括第一密封件和第二密封件，所述第一密封件用于密封所述反应结构及所述通气结构的通气管道，所述通气管道连接所述通气结构的通气孔，以使所述反应结构自通气；所述第二密封件用于密封所述加样口、所述通气孔和所述加液口。
可选地，在上述离心式生物反应芯片中，还包括承载部件，所述承载部件上设有圆周方向依次分布的多个所述芯片本体。
一种生物检测方法，用于上述任一项所述的离心式生物反应芯片，包括步骤：
S1、注入样本存储腔内的样本与所述样本存储腔内预置的第一步核酸反应需要的酶混匀形成第一液体；
S2、在离心力下，第一液体进入所述预扩增腔，与所述预扩增腔预置的进行第一步核酸扩增反应所需要的引物进行第一步扩增反应，反应结束形成第一反应液；
S3、在离心力下，第一反应液进入所述检测腔，同时，注入所述反应液存储腔的反应液进入所述混匀腔，所述反应液与所述混匀腔预置的第二步核酸扩增反应所需要的酶混匀形成第二液体；
S4、在离心力下，所述第二液体进入所述预扩增腔；
S5、在离心力下，所述第二液体进入所述检测腔与所述第一反应液混合形成第二反应液。
在上述技术方案中，本发明提供的离心式生物反应芯片包括芯片本体和密封结构，芯片本体设有反应结构和通气结构，通气结构与反应结构连通以使反应结构自通气。反应结构包括样本存储腔、反应液存储腔、混匀腔、预扩增腔和检测腔；样本存储腔上设有加样口，反应液存储腔上设有加液口，样本存储腔的远心端出口与预扩增腔进口连接，反应液存储腔远心端出口通过混匀腔与预扩增腔进口连接，预扩增腔出口与检测腔连接。样本存储腔用于预置第一步核酸反应需要的酶，预扩增腔用于预置有进行第一步核酸扩增反应所需要的引物，混匀腔用于预置有第二步核酸扩增反应所需要的酶，检测腔用于预置有进行第二步核酸扩增反应所需要的引物；密封结构密封反应结构和通气结构的通气孔。当需要进行反应操作时，注入样本存储腔内的样本与样本存储腔内预置的第一步核酸反应需要的酶混匀形成第一液体。在离心力下，第一液体进入预扩增腔与预扩增腔预置的进行第一步核酸扩增反应所需要的引物进行第一步扩增反应，反应结束形成第一反应液。在离心力下，第一反应液进入检测腔。在离心力下，注入反应液存储腔的反应液进入混匀腔，反应液与混匀腔预置的第二步核酸扩增反应所需要的酶混匀形成第二液体。在离心力下，第二液体进入预扩增腔。在离心力下，第二液体进入检测腔与第一反应液混合形成第二反应液。
通过上述描述可知，在本申请提供的离心式生物反应芯片中，第一步扩增和第二步扩增均在同一个反应芯片中进行，无需进行液体转移，满足两步法核酸扩增所需的体系密封，进而减少两步核酸扩增中产物的污染，同时实现操作自动化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例所提供的离心式生物反应芯片的分解图；
图2为本发明实施例所提供的多个芯片本体排布图；
图3为本发明实施例所提供的芯片本体的正面视图；
图4为本发明实施例所提供的芯片本体的背面视图；
图5为本发明实施例所提供的芯片本体处于步骤S1时的流体示意图；
图6为本发明实施例所提供的芯片本体处于步骤S2时流体反应液进入预扩增腔的结构示意图；
图7为本发明实施例所提供的芯片本体处于步骤S3时注入反应液存储腔的反应液进入混匀腔，第一反应液进入所述检测腔的流体示意图；
图8为本发明实施例所提供的芯片本体处于步骤S4时的流体示意图；
图9为本发明实施例所提供的芯片本体处于步骤S5时的流体示意图。
其中图1-9中：
芯片本体100；加样口101；样本存储腔102；加液口103；反应液存储腔104；缓冲腔105；混匀腔106；分配腔107；预扩增腔108；定量腔109；检测腔110；第一通道111；第二通道112；第三通道113；第四通道114；第五通道115；第六通道116；上游管道1161；下游管道1162；第七通道117；第一界面阀118；第二界面阀119；第三界面阀120；第一通气管道121；第二通气管道122；通气孔123；第四界面阀124；第五界面阀125；第三通气管道126；
第一密封件200；
第二密封件300；
承载部件400。
具体实施方式
本发明的核心是提供一种离心式生物反应芯片，以解决两步法核酸扩增所需的体系密封，同时实现操作自动化。本发明的另一核心是提供一种生物检测方法。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细说明。
请参考图1至图9。
在一种具体实施方式中，本发明具体实施例提供的离心式生物反应芯片包括芯片本体100和密封结构，芯片本体100设有反应结构和通气结构，通气结构与反应结构连通以使反应结构自通气。
反应结构包括样本存储腔102、反应液存储腔104、混匀腔106、预扩增腔108和检测腔110，其中，样本存储腔102、反应液存储腔104、混匀腔106、预扩增腔108和检测腔110的腔室形状，根据需要而定。在一种具体实施方式中，样本存储腔102和反应液存储腔104可以为结构相同的腔室，且距离转动中心距离相等。
样本存储腔102上设有加样口101，反应液存储腔104设有加液口103，具体的，加样口101优选设置在样本存储腔102侧壁靠近近心端位置，加液口103优选设置在反应液存储腔104侧壁靠近近心端位置。
样本存储腔102的远心端出口与预扩增腔108进口连接，反应液存储腔104远心端出口通过混匀腔106与预扩增腔108进口连接。
样本存储腔102用于预置第一步核酸反应需要的酶，预扩增腔108用于预置有进行第一步核酸扩增反应所需要的引物，混匀腔106用于预置有第二步核酸扩增反应所需要的酶，检测腔110用于预置有进行第二步核酸扩增反应所需要的引物。具体的，每个对应腔室所需要的酶和引物根据实际需要而定，本申请不做具体限定，本申请提前在芯片本体上放置两步反应所需要的试剂可以实现连续两步的核酸扩增反应，中间不需要进行人员进行液体转移，满足两步法核酸扩增所需的体系密封，进而减少两步核酸扩增中产物的污染，同时实现操作自动化。
具体的，密封结构密封反应结构和通气结构。密封结构可以为一个结构，位于芯片本体100的一侧。
当设置多个芯片本体100时，优选，密封结构与芯片本体100一一对应连接。
密封结构包括第一密封件200和第二密封件300，第一密封件200用于密封反应结构和通气结构的通气管道，第二密封件300用于密封加样口101、通气孔123和加液口103。
具体的，第一密封件200用于密封芯片本体100正面，第三密封体用于密封芯片本体100反面的加样口101、加液口103及通气孔123。第一密封件200和第二密封件300可以可为盖板，芯片本体100、第一密封件200和第二密封件300可以通过粘接、热封、热压焊接、超声焊接、激光焊接等方式密封连接。
当然，在具体组装时，可以选择第一密封件200和第二密封件300为具有单面胶的部件，需要密封时，第一密封件200和第二密封件300直接粘贴在芯片本体100上。
当需要进行反应操作时，注入样本存储腔102内的样本与样本存储腔102内预置的第一步核酸反应需要的酶混匀形成第一液体。在离心力下，第一液体进入预扩增腔108与预扩增腔108预置的进行第一步核酸扩增反应所需要的引物进行第一步扩增反应，反应结束形成第一反应液。在离心力下，第一反应液进入检测腔110。在离心力下，注入反应液存储腔104的反应液进入混匀腔106，反应液与混匀腔106预置的第二步核酸扩增反应所需要的酶混匀形成第二液体。在离心力下，第二液体进入预扩增腔108。在离心力下，第二液体进入检测腔110与第一反应液混合形成第二反应液。
通过上述描述可知，在本申请具体实施例所提供的离心式生物反应芯片中，第一步扩增和第二步扩增均在同一个离心式生物反应芯片中进行，无需进行液体转移，进而减少两步核酸扩增中产物的污染。
在一种具体实施方式中，反应结构还包括分配腔107，预扩增腔108和检测腔110均为多个，样本存储腔102和混匀腔106均通过分配腔107与预扩增腔108连接。样本存储腔102的远心端出口与分配腔107近心端的进口通过第一通道111连接，即样本存储腔102通过第一通道111与分配腔107连通，第一通道111与样本存储腔102的连接位置在样本存储腔102距离芯片本体100做离心运动的圆心最远端，以便将样本存储腔102中所有样本排出至第一通道111，避免样本存储腔102内有样本残留。样本存储腔102、混匀腔106和分配腔107均与通气孔123连接连通。
使用时，第一密封件200密封芯片本体100正面，将样本由加样口101注入样本存储腔102，反应液由加液口103注入反应液存储腔104，如图4所示，使用第二密封件300将加样口101、加液口103、通气孔123密封。随后将生物反应芯片放在可以进行加热控温及离心旋转的设备上。
反应液存储腔104的远心端出口通过混匀腔106与分配腔107近心端的进口连接；分配腔107的远心端出口通过预扩增腔108与检测腔110连接。本申请设置多个预扩增腔108时，预扩增腔108平行设置(即预扩增腔108沿分配腔107内流体运动方向一次设置)，多个预扩增腔108可以进行多个指标的单重扩增反应，每个指标的扩增反应互不干扰；在第二步核酸扩增反应中，平行设置的多个预扩增腔108可以定量分配第二步核酸扩增需要的反应混合液，定量后的反应混合液转移到与预扩增腔108一一对应的检测腔110中，与检测腔110中的预扩增液(第一液体)混合，进行第二步核酸扩增反应。
具体的，本实施例中进行的两步扩增反应为多个指标的单重扩增。反应所需要的缓冲液、酶、引物等生物试剂可以采用热烘干或者冻干等方式预置在对应腔体中，预扩增所需要的引物可以预固定在各个预扩增腔108中。第二步扩增反应所需要的引物可以预固定在各个检测腔110中。本申请缓冲液、酶、引物等生物试剂的预固定大大简化了芯片使用者的操作。
反应结构还包括缓冲腔105，反应液存储腔104通过缓冲腔105与混匀腔106连接，反应液存储腔104与缓冲腔105通过第二通道112连接，缓冲腔105通过第三通道113与混匀腔106连接。具体的，第二通道112与反应液存储腔104的连接位置在反应液存储腔104距离芯片本体100做离心运动的圆心最远端，以便将反应液存储腔104中所有反应液排出至第二通道112，避免反应液存储腔104中有反应液残留。
第三通道113与缓冲腔105的连接位置在缓冲腔105距离芯片本体100做离心运动的圆心最远端，以便于将缓冲腔105中所有反应液排出至第三通道113内，避免缓冲腔105中有液体残留。
在一种具体实施方式中，缓冲腔105为偏心圆的一段弧形通道，且缓冲腔105靠近第二通道112的一端逐渐向靠近芯片本体100做离心运动的圆心的方向倾斜。
混匀腔106通过第四通道114与分配腔107连接，第一通道111上设有第一界面阀118，通过设置第一界面阀118，防止样本提前进入分配腔107内。第二通道112上设有第二界面阀119，通过设置第二界面阀119，防止反应液提前进入缓冲腔105。第四通道114上设有第三界面阀120，通过设置第三界面阀120，防止混匀腔106内的液体提前进入分配腔107。具体的，第四通道114与混匀腔106的连接位置在混匀腔106距离芯片本体100做离心运动的圆心最远端，以便于将混匀腔106中所有液体排出至第四通道114内，避免混匀腔106中有液体残留。
在一种具体实施方式中，混匀腔106为偏心圆的一段弧形通道，且混匀腔106靠近第三通道113的一端逐渐向靠近芯片本体100做离心运动的圆心的方向倾斜。
混匀腔106的内端较第四通道114的内端靠近芯片本体100做离心运动的圆心，此时，若混合完成后，需要增大或降低离心式生物反应芯片的离心速度，使得离心式生物反应芯片具有较大的加速度，从而使得混匀腔106中的液体在欧拉力的作用下填充满第四通道114，随后进入混匀腔106。此时，第四通道114无需具有亲液性，简化了离心式生物反应芯片操作。
分配腔107远离芯片本体100做离心运动的圆心方向设置有多个第五通道115，第五通道115分别与预扩增腔108一一对应并连通，分配腔107进口一端相较于另一端靠近离心运动的圆心，各个预扩增腔108到分配腔107的距离均不相等。具体的，各个预扩增腔108到分配腔107的距离由靠近分配腔107进液口方向至远离分配腔107进液口方向依次减小，当第五通道115为直条型通道时，与预扩增腔108连接的第五通道115的长度由靠近分配腔107进液口方向至远离分配腔107进液口方向依次减小，使得样本和反应液能够更好地分配填充到各个预扩增腔108。
通气结构包括第一通气管道121、第二通气管道122和第三通气管道126，第一通气管道121连接通气孔123和分配腔107，第三通气管道连接通气孔123和样本存储腔102，第二通气管道122连接通气孔123和混匀腔106，第一通气管道121上设有第四界面阀124，避免分配腔107中液体进入第一通气管道121内，第二通气管道122上设有第五界面阀125，避免混匀腔106内的液体进入第二通气管道122内。
具体的，第三通气管道126一端连通样本存储腔102上背离分配腔107的近心端，避免样本存储腔102内的样本进入第三通气管道126内。
第一通气管道121连通分配腔107面向反应液存储腔104的近心端，避免分配腔107中的液体进入第一通气管道121内。
第二通气管道122一端连通混匀腔106背离分配腔107的近心端，避免混匀腔106中的液体进入第二通气管道122内。第二通气管道122的另一端通过通气通孔123连通第一通气管道121和第三通气管道126。
分配腔107近心端的进口包括与样本存储腔102连接的第一进口及与混匀腔106连接的第二进口，且第一进口相对于第二进口靠近转动中心。
反应结构还包括定量腔109，预扩增腔108和检测腔110通过第六通道116连接；定量腔109通过第七通道117连接与第六通道116连接，定量腔109的体积小于预扩增腔108的体积。由于预扩增腔108的体积比定量腔109大，保证第一次充满预扩增腔108的第一轮扩增获得的扩增液被定量的转移到检测腔110中，而第二轮扩增所需的反应混合液进入预扩增腔108会被全部转移到检测腔110中，由此，第一扩增的反应混合液就跟第二轮反应所需的反应混合液发生特定体积比例的混合，而两者的混合比例由预扩增腔108和定量腔109的体积确定。该方法以简单的结构实现了需要特定稀释比例的两步法反应，具有显著的技术优势。
本发明提供的生物反应芯片通过各腔体(样本存储腔102、反应液存储腔104、缓冲腔105、混匀腔106、分配腔107、预扩增腔108；定量腔109和检测腔110)、连接各腔体的毛细管道(第一通道111、第二通道112、第三通道113、第四通道114、第六通道116和第七通道)及通气管道(第一通气管道121、第二通气管道122和第三通气管道126)的协同配合，实现了各反应区的液体逐级释放，顺次反应。
第六通道116包括沿流体流动方向连接的上游管道1161和下游管道1162，第七通道与上游管道1161和下游管道1162衔接处连接，下游管道1162中间位置向靠近转动中心位置凸出设置。下游管道1162为一段虹吸管道，虹吸管道的最内端到芯片本体100做离心运动的圆心距离大于预扩增腔108最外端到芯片本体100做离心运动的圆心距离，以便于将预扩增腔108中所有液体排出至第六通道116内。
第七通道117的流通截面大于第六通道116的流通截面，因此，从预扩增腔108中排出的预扩增液经过第六通道116的上游管道1161优先填充第七通道117进入定量腔109内，定量后剩余的预扩增液经过第六通道116的下游管道1162进入检测腔110内，预扩增腔108中排出的反应混合液全部进入检测腔110内。
在一种具体工作过程中，自加样口101向样本存储腔102中加入样本，自加液口103向反应液存储腔104中加入反应液，样本经分配腔107分配到每个预扩增腔108中，在预扩增腔108中完成第一步扩增反应形成预扩增液，预扩增液经过定量腔109定量后，剩余的预扩增液进入检测腔110中。同时反应液自反应液存储腔104经缓冲腔105进入到混匀腔106，反应液在混匀腔106中与第二步扩增反应所需要的试剂混合，形成反应混合液，反应混合液经分配腔107定量分配到预扩增腔108中，后转移到检测腔110中与第一步的预扩增液混合，进行第二步扩增反应。即当样本分配到预扩增腔108进行预扩增时，反应液始终待在反应液存储腔104中，当预扩增液转移至定量腔109和检测腔110时，反应液经缓冲腔105进入混匀腔106与第二步扩增反应所需要的试剂混合。
在具体工作时，当预扩增腔108中的反应结束后，再次高速离心，预扩增腔108中的扩增液首先流入第六通道116的上游管道1161和第七通道117进而填充定量腔109，定量腔109填充完成后，剩余的预扩增液经第六通道116的下游管道1162进入检测腔110中。同时，反应液存储腔104中的反应液经第二连接管道112、缓冲腔105、第三连接管道113进入混匀腔106中。
反应液与提前固定在混匀腔106中的生物试剂进行离心混匀形成反应混合液，同时混合液填充满第四连接管道114，再次离心芯片，反应混合液离心分配到预扩增腔108。
再次离心芯片，反应混合液经由第六通道116全部转移至检测腔110中，与预扩增液混合，进行第二步扩增反应，同时进行荧光信号采集。
离心式生物反应芯片还包括承载部件400，承载部件400上设有圆周方向依次分布的多个芯片本体100。
具体的，可以在注入样本于样本存储腔102时，同时将反应液注入反应液存储腔104。对生物反应芯片进行离心操作，样本存储腔102内的样本经第一通道111和分配腔107进入预扩增腔108内，各个预扩增腔108独立进行各指标的第一步扩增反应。同时，反应液停留在反应液存储腔104中，第二步扩增反应需要的生物试剂不被反应液提前溶解，保持了试剂生物活性。
本实施例提供的生物反应芯片单独设置加样口101、样本存储腔102、加液口103、反应液存储腔104，各反应区之间液体逐级释放，顺次反应。样本和反应液同时加入芯片，芯片在全封闭的状态下全自动地进行连续的两步扩增反应，避免在反应过程中样本和扩增产物泄露风险；预扩增腔108与检测腔110均设置有平行的多个腔体，每个腔体中可以进行不同指标的单重核酸扩增反应，克服了常规多指标检测所用的多重扩增方法中存在的不同扩增靶标的引物或探针之间的交叉干扰等问题，又避免了直接分腔体进行多指标扩增导致灵敏度下降的问题。因此，本发明提供的生物反应芯片在扩增体系构建难度和检测灵敏度之间达到了一个很好的平衡，在实现多指标检测的同时，通过巢式扩增提高了扩增的特异性和灵敏度。
本申请提供的一种生物检测方法，用于上述任一种离心式生物反应芯片，包括步骤：
S1、注入样本存储腔102内的样本与样本存储腔102内预置的第一步核酸反应需要的酶混匀形成第一液体。在具体使用时，在样本存储腔102中预置有第一步核酸扩增反应所需要的酶，预扩增腔108中预置有各指标进行第一步核酸扩增反应所需要的引物，混匀腔106中预置有第二步核酸扩增反应所需要的酶，检测腔110中预置有各指标进行第二步核酸扩增反应所需要的引物。使用第一密封件200密封芯片本体100正面，将样本由加样口101注入样本存储腔102，反应液由加液口103注入反应液存储腔104，如图4所示，使用第二密封件300将加样口101、加液口103、通气孔123密封。随后将生物反应芯片放在可以进行加热控温及离心旋转的设备上。
S2、在离心力下，第一液体进入预扩增腔108，与预扩增腔108预置的进行第一步核酸扩增反应所需要的引物进行第一步扩增反应，反应结束形成第一反应液。具体的，此时第一界面阀118打开，第二界面阀119关闭。
S3、在离心力下，第一反应液进入检测腔110。检测腔110可以为一个或者多个。注入反应液存储腔104的反应液进入混匀腔106，反应液与混匀腔106预置的第二步核酸扩增反应所需要的酶混匀形成第二液体。此时第二界面阀119打开，第三界面阀120关闭。
S4、在离心力下，第二液体进入预扩增腔108。此时第三界面阀120打开。
S5、在离心力下，第二液体进入检测腔110与第一反应液反应形成第二反应液。
在具体工作过程中，第四界面阀124和第五界面阀125也可以为通气不通液的阀体，避免液体由第四界面阀124和第五界面阀125排出。
第一界面阀118、第二界面阀119、第三界面阀120在各自对应的离心力作用下流体可以通过，在达不到各自对应的离心力下流体无法通过。
在本申请提供的工作过程中，流体运动对应的转速根据实际需要而定，本申请不做具体限定，只要可以实现上述操作即可。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (11)
1.一种离心式生物反应芯片，其特征在于，包括：
芯片本体(100)，所述芯片本体(100)设有反应结构和通气结构，所述通气结构与所述反应结构连通以使所述反应结构自通气，所述反应结构包括样本存储腔(102)、反应液存储腔(104)、混匀腔(106)、预扩增腔(108)和检测腔(110)；所述样本存储腔(102)上设有加样口(101)，所述反应液存储腔(104)上设有加液口(103)，所述样本存储腔(102)的远心端出口与所述预扩增腔(108)进口连接，所述反应液存储腔(104)远心端出口通过所述混匀腔(106)与所述预扩增腔(108)进口连接，所述预扩增腔(108)出口与所述检测腔(110)连接；所述样本存储腔(102)用于预置第一步核酸反应需要的酶，所述预扩增腔(108)用于预置有进行第一步核酸扩增反应所需要的引物，所述混匀腔(106)用于预置有第二步核酸扩增反应所需要的酶，所述检测腔(110)用于预置有进行第二步核酸扩增反应所需要的引物；及
密封所述反应结构和所述通气结构的密封结构。
2.根据权利要求1所述的离心式生物反应芯片，其特征在于，所述反应结构还包括分配腔(107)，所述预扩增腔(108)和所述检测腔(110)均为多个，所述样本存储腔(102)和所述混匀腔(106)均通过所述分配腔(107)与所述预扩增腔(108)连接，所述样本存储腔(102)远心端的出口与所述分配腔(107)近心端的进口通过第一通道(111)连接，所述反应液存储腔(104)远心端的出口通过所述混匀腔(106)与所述分配腔(107)近心端的进口连接；所述分配腔(107)远心端的出口通过所述预扩增腔(108)与所述检测腔(110)连接。
3.根据权利要求2所述的离心式生物反应芯片，其特征在于，所述反应结构还包括缓冲腔(105)，所述反应液存储腔(104)通过所述缓冲腔(105)与所述混匀腔(106)连接，所述反应液存储腔(104)与所述缓冲腔(105)通过第二通道(112)连接，所述缓冲腔(105)通过第三通道(113)与所述混匀腔(106)连接。
4.根据权利要求3所述的离心式生物反应芯片，其特征在于，所述混匀腔(106)通过第四通道(114)与所述分配腔(107)连接，所述第一通道(111)上设有第一界面阀(118)，所述第二通道(112)上设有第二界面阀(119)，所述第四通道(114)上设有第三界面阀(120)。
5.根据权利要求2所述的离心式生物反应芯片，其特征在于，所述通气结构的通气管道包括第一通气管道(121)、第二通气管道(122)和第三通气管道(126)，第一通气管道(121)连接所述通气结构的通气孔(123)和所述分配腔(107)，所述第三通气管道(126)连接所述通气孔(123)和所述样本存储腔(102)，所述第二通气管道(122)连接所述通气孔(123)和所述混匀腔(106)，第一通气管道(121)上设有第四界面阀(124)，所述第二通气管道(122)上设有第五界面阀(125)。
6.根据权利要求2所述的离心式生物反应芯片，其特征在于，所述分配腔(107)近心端的进口包括与所述样本存储腔(102)连接的第一进口及与所述混匀腔(106)连接的第二进口，且所述第一进口相对于第二进口靠近转动中心。
7.根据权利要求1所述的离心式生物反应芯片，其特征在于，所述反应结构还包括定量腔(109)，所述预扩增腔(108)和所述检测腔(110)通过第六通道(116)连接；所述定量腔(109)通过第七通道(117)与所述第六通道(116)连接，所述定量腔(109)的体积小于所述预扩增腔(108)的体积，所述第七通道(117)的流通截面大于所述第六通道(116)的流通截面。
8.根据权利要求7所述的离心式生物反应芯片，其特征在于，所述第六通道(116)包括沿流体流动方向连接的上游管道(1161)和下游管道(1162)，所述第七通道(117)与所述上游管道(1161)和所述下游管道(1162)衔接处连接，所述下游管道(1162)中间位置向靠近转动中心位置凸出设置，所述下游管道(1162)为虹吸管道。
9.根据权利要求1所述的离心式生物反应芯片，其特征在于，所述密封结构与所述芯片本体(100)一一对应连接，所述密封结构包括第一密封件(200)和第二密封件(300)，所述第一密封件(200)用于密封所述反应结构及所述通气结构的通气管道，所述通气管道连接所述通气结构的通气孔(123)，以使所述反应结构自通气；所述第二密封件(300)用于密封所述加样口(101)、所述通气孔(123)和所述加液口(103)。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的离心式生物反应芯片，其特征在于，还包括承载部件(400)，所述承载部件(400)上设有圆周方向依次分布的多个所述芯片本体(100)。
11.一种生物检测方法，其特征在于，用于权利要求1-10中任一项所述的离心式生物反应芯片，包括步骤：
S1、注入样本存储腔(102)内的样本与所述样本存储腔(102)内预置的第一步核酸反应需要的酶混匀形成第一液体；
S2、在离心力下，第一液体进入所述预扩增腔(108)，与所述预扩增腔(108)预置的进行第一步核酸扩增反应所需要的引物进行第一步扩增反应，反应结束形成第一反应液；
S3、在离心力下，第一反应液进入所述检测腔(110)，同时，注入所述反应液存储腔(104)的反应液进入所述混匀腔(106)，所述反应液与所述混匀腔(106)预置的第二步核酸扩增反应所需要的酶混匀形成第二液体；
S4、在离心力下，所述第二液体进入所述预扩增腔(108)；
S5、在离心力下，所述第二液体进入所述检测腔(110)与所述第一反应液混合形成第二反应液。
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