CN116724221A

CN116724221A - 用于激光捕获显微切割的uv涂层和染料

Info

Publication number: CN116724221A
Application number: CN202180088971.4A
Authority: CN
Inventors: 兰斯·A·利奥塔; 亚历山德拉·卢奇尼·昆克尔; 玛丽莎·阿什顿·霍华德; 阿曼达·海蒙德·斯蒂尔; 哈里尼·索曼奇; 菲利普·安德鲁·帕帕拉多
Original assignee: George Mason Research Foundation Inc
Current assignee: George Mason Research Foundation Inc
Priority date: 2020-11-10
Filing date: 2021-11-09
Publication date: 2023-09-08
Also published as: US20230417637A1; CA3197983A1; EP4244595A1; WO2022103754A1

Abstract

本发明提供了激光捕获显微切割装置和方法。激光捕获显微切割装置含有透射膜和转移膜。所述透射膜包括第一材料，所述第一材料被配置为透射激光能量。所述转移膜包括第二材料，所述第二材料被配置为吸收UV激光能量。所述转移膜含有吸收性物质，以吸收UV激光能量并且将其转化为热量。

Description

用于激光捕获显微切割的UV涂层和染料

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年11月10日提交的美国临时申请号63/111,955的优先权，其全部内容通过引用结合于此。

技术领域

本发明涉及与UV辐射兼容的LCM系统，与红外辐射相比，该UV辐射具有更短的波长。本发明更具体地涉及使LCM机器和消耗品适于与UV辐射兼容。

背景技术

细胞材料的分子分析是诊断病理学的重要方面，其补充了由病理学家或科学家进行的光学组织学分析。待分析的细胞包含组织活检样品、哺乳动物或细菌细胞培养物或大量植物材料，对于这些细胞，可以使用显微切割方法(如激光捕获显微切割(“LCM”))从样品中分离出选择细胞亚群。

激光捕获显微切割(“LCM”)是用于在直接显微镜可视化下从异质组织块中分离出肿瘤细胞或其他类型细胞的成熟技术。这一点很重要，因为特定细胞群可能具有与组织样品不同的性质。例如，仅将同一样品中的肿瘤细胞与其他免疫细胞分离开来允许更精确地表征肿瘤细胞的分子特征。所分离的细胞被制药公司和学术机构用于商业诊断测定分析、临床试验和调研研究。LCM被全世界成千上万的科学家使用。

最流行和最有用的LCM形式采用激光束或辐射源来加热热聚合物帽，该热聚合物帽被紧贴安装在载玻片上的组织的切片上。LCM机器利用一束IR辐射来软化捕获元件的捕获表面，该表面熔化到下面的组织上，并且允许将某些细胞从组织的其余部分中分离出来并且对其单独地进行分析。然而，IR辐射的波长很长，这意味着它只能聚焦到含有许多细胞的显微切割区域。

美国专利公开号2017/0176301(“'301公开”)的图1A示出了由与组织接触的热塑性膜组成的典型LCM系统。塑料膜均匀地浸渍有吸收激光能量的染料。定位在感兴趣的组织区域或细胞上的塑料膜的区域被辐射选择性地加热，从而导致这个区域熔化并且将其自身嵌入紧接在下面的组织切片中('301公开的图1B)。当将膜从组织上脱落时，粘附到膜的下表面的组织的部分被从组织切片上撕下(参见，例如，Espina V.等人的(2006)《自然保护(Nature Prot.)》1(2):586-603)。

除了301公开中描述的仪器和方法之外，还有其他不太流行的用于LCM的方法和仪器可用，如来自莱卡或蔡司(PALM)的那些方法和仪器。为了简化讨论，LCM的机械细节将使用301公开中给出的最流行的仪器设计来描述。然而，“LCM”应从广义上理解为涵括来自不同制造商的全部可商购LCM系统。

现有的LCM技术(如301公开中所述)利用IR辐射来软化捕获装置(也称为捕获元件)的热聚合物层，称为LCM帽。帽上的这个热聚合物层浸渍有IR吸收染料，使得当IR穿过帽时，其被吸收并且转化为热量，从而仅在被辐照的区域熔化热聚合物。这允许在帽被按压到组织的表面的同时，通过仅利用通过帽的IR辐照特定区域来捕获所选择的组织切片区域。虽然这种系统非常有效，但它受到这样的事实的限制，即IR辐射的波长较长，因此对IR光束的可能光斑大小设置了下限。这个下限决定了要进行显微切割的区域的大小；小于光束的光斑大小的特征无法单独地分离。目前可用的LCM帽不能透射过紫外(UV)。过去，将UV应用于激光捕获受到了严重限制，因为用于组分的塑料材料不允许透过UV辐射。

进一步，过去，UV激光系统由于“在获得的最终细胞群体中存在具有UV诱导损伤的细胞而受到限制。这些UV损伤的细胞源自直接位于UV激光切割路径下的细胞”(例如，参见Espina V.等人的(2006)《自然保护(Nature Prot.)》1(2):586-603)。

因此，与基于红外辐射的LCM相比，长期以来一直需要具有更高精度和分辨率的LCM系统。进一步，还长期以来一直需要开发一种UV激光系统，使得UV激光切割路径正下方的细胞不被损坏。

发明内容

LCM机器和消耗品适于与UV辐射兼容，与红外辐射相比，该UV辐射具有更短的波长。

在一个实施例中，一种装置包含透射膜和转移膜，所述透射膜包含第一材料，所述第一材料被配置为透射含有约280nm至约380nm的第一波长的第一射线，并且所述转移膜包含的第二材料，所述第二材料被配置为吸收所述第一射线；其中所述装置被配置为捕获元件。

在一个实施例中，所述装置的所述第一材料被配置为透射约80％的波长为约280nm至约1100nm的射线，并且其中所述转移膜包含吸收性物质。

在一个实施例中，所述吸收性物质包含被配置为吸收所述第一射线的染料。

在一个实施例中，所述染料被配置为透射具有约380nm至约700nm的第二波长的第二射线，并且吸收所述第一射线。

在一个实施例中，所述染料包含宽带吸收性染料或频率特定的吸收性染料。

在一个实施例中，所述吸收性物质包含二苯甲酮染料、苯并三唑染料或三嗪染料。

在一个实施例中，所述转移膜包含少于约1mM或更少的所述染料。

在一个实施例中，染料被配置为透射约80％的第二射线，并且吸收约80％的第一射线。

在一个实施例中，一种方法包含：a)将样品放置在具有捕获元件的仪器的载物台上，其中所述仪器被配置为检查所述样品；b)将UV射线透射通过所述捕获元件，其中所述捕获元件中的吸收性物质被配置为吸收所述UV射线并且转化为热量；c)在所述捕获元件上捕获所述样品的一部分；并且d)分析所述样品。

在一个实施例中，所述捕获元件包含透射膜和转移膜，其中所述透射膜被配置为透射所述UV射线，并且所述转移膜包含材料和所述吸收性物质。

在一个实施例中，包含所述样品的载玻片被配置为放置在所述仪器的所述载物台上，其中所述载玻片包含被配置为在经受所述UV射线的情况下活化所述样品的导电基底。

在一个实施例中，所述样品包含被配置为对所述UV射线不稳定的标记。

在一个实施例中，所述样品还包含有包含标记的分子探针，其中到达所述样品的所述UV射线将标记从所述分子探针解离。

在一个实施例中，所述分子探针包含抗体、肽、或和小分子。

在一个实施例中，所述标记包含DNA条形码、重金属标记、肽标记、或和小分子标记。

在一个实施例中，一种系统包含捕获元件，所述捕获元件包含透射膜和转移膜，其中所述透射膜包含第一材料，所述第一材料被配置为透射含有约300nm至约1100nm的波长的射线，并且所述转移膜含有第二材料，所述第二材料被配置为吸收含有约280nm至380nm的波长的第一射线；其中所述第二材料包含吸收性材料，并且其中所述系统被配置为检查放置在所述系统的载物台上的样品。

在一个实施例中，所述转移膜还包含第三材料，所述第三材料被配置为吸收具有约700nm至1100nm的第二波长的第二射线。

在一个实施例中，所述载物台被配置为放置在含有所述样品的载玻片上，其中所述载玻片包含被配置为在经受所述第一射线的情况下活化所述样品的导电基底。

在一个实施例中，吸收性材料包含二苯甲酮染料、苯并三唑染料或三嗪染料。

附图说明

图1A示出了现有技术的激光捕获显微切割系统。

图1B示出了根据本公开的UV捕获的添加。

图2示出了Plexiglass G-UVT的透射光谱。

图3示出了适合于捕获材料主体的几种改性PMMA产品的透射光谱。

图4示出了二苯甲酮、苯并三唑和均三嗪UV吸收染料骨架的结构，所示的每一类具有一种代表性的可商购染料化合物。

图5示出了辛酚三唑(UV1)、2叔丁基-6(5-氯-2H-苯并三唑-2-基)-4-甲基苯酚(UV2)和2-(2-羟基-5-甲基苯酚)苯并三唑(UV3)(三唑类染料的代表)的吸光度光谱。全部在280nm至380nm之间有很强的吸光度。所有描绘的光谱是在0.1mM下在乙酸乙酯中测量的。

图6示出了2,2',4,4'-四羟基二苯甲酮(UV4)和2,4-二羟基二苯甲酮(UV5)(二苯甲酮染料类别的代表)的吸光度光谱。全部在280nm至380nm之间有很强的吸光度。所有描绘的光谱都是在0.1mM下在乙醇中测量的。

图7是细胞捕获元件的描述。区域A是捕获元件主体，而区域B是捕获元件热聚合物转移膜。

图8示出了用于细胞捕获或标记解离的高低设置的使用。

具体实施方式

定义和通用技术

为了说明的简单和清楚，附图示出了构造的一般方式，并且可以省略公知特征和技术的描述和细节，以避免不必要地模糊本公开。附加地，附图中的元件不一定按比例绘制。例如，图中的元件中的一些的尺寸可能相对于其他元件被夸大，以帮助提高对本公开的实施例的理解。不同附图中相同的附图标记表示相同的元件。

说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等(如果有的话)用于在相似的元件之间进行区分，而不一定用于描述特定的次序或时间顺序。应当理解的是，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，使得本文描述的实施例例如能够以不同于本文示出或以其他方式描述的顺序操作。另外，术语“包含”和“具有”及其任何变体旨在覆盖非排他性的包含，使得包含一系列元素的过程、方法、系统、物品、装置或设备不一定限于这些元素，而是可以包含未明确列出的或这种过程、方法、系统、物品、装置或设备固有的其他元素。

说明书和权利要求书中的术语“左”、“右”、“前”、“后”、“顶”、“底”、“上”、“下”等(如果有的话)用于描述目的，而不一定用于描述永久的相对位置。应当理解的是，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，使得本文中描述的设备、方法和/或物品的实施例例如能够以除了本文中示出或以其他方式描述的那些取向之外的其他取向操作。

除非明确描述，否则本文中使用的任何元素、动作或指令不应被解释为关键或必要的。而且，如本文所用，冠词“一”和“一个”旨在包含多个项目，并且可以与“一个或多个”互换使用而且，如本文所用，术语“集”旨在包含多个项目(例如，相关项目、不相关项目、相关项目和不相关项目的组合等)，并且可以与“一个或多个”互换使用。当只预期一个项目时，使用术语“一个”或类似的语言。而且，如本文所用，术语“具有(has、have、having等)”旨在是开放式术语。进一步，短语“基于”旨在表示“至少部分地基于”，除非另有明确说明。

在不脱离本发明的精神或特征的情况下，本发明可以以其他特定形式实现。所描述的实施例应在所有方面均被视为仅是说明性的而非限制性的。因此，本发明的范围是由所附权利要求书而不是由以上说明来指明。落入权利要求的等效含义和范围内的所有变化都应包含在其范围内。

如本文所定义，“大约”和“约”在一些实施例中可以意味着在所述值的正负百分之十之内。在其他实施例中，“大约”和“约”可以意味着在所述值的正负百分之五之内。在另外的实施例中，“大约”和“约”可以意味着在所述值的正负百分之三之内。在另一些实施例中，“大约”和“约”可以意味着在所述值的正负百分之一之内。

如本文所用，术语“可选的”或“可选地”表示随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包含所述事件或情况发生的实例和不发生的实例。

如本文所用的单词“或”意味着特定列表中的任何一个成员，并且还包含该列表的成员的任何组合。

除非本文另有定义，否则与本发明相关使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包含复数，并且复数术语应包含单数。通常，与本文描述的健康监控相关使用的术语和本文描述的健康监控的技术是本领域中众所周知和常用的。

除非另有说明，本发明的方法和技术通常根据本领域众所周知的常规方法和如在整个本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述那样进行。结合本文中的实施例使用的术语、以及本文中的实施例的程序和技术以及本文描述的其他相关领域是本领域中众所周知和常用的。

激光捕获显微切割(LCM)技术是在显微镜可视化下能够实现从混合群体中分离特定细胞的样品制备技术。这种从异质混合物中分离纯样品的技术允许下游微基因组应用(如下一代测序、Sanger测序、PCR和蛋白质组学等)的更有效和准确的结果。

激光捕获操作可以简单地描述为首先将显微镜载物台或平台居中，并且将偶合到帽或捕获元件的转移膜放置在载玻片上的组织样品上方的适当位置。转移膜接触组织样品。然后，激光活化转移膜，该转移膜吸收来自激光的能量，该能量熔化帽的小区域以将帽熔合到组织中的所选择的区域，从而形成光斑。样品的所选择的部分可以用于进一步的处理和分析。

替代性地，转移膜与样品间隔开(非接触式激光微捕获)。在这种情况下，转移膜在被激光脉冲活化时的膨胀将简单地将转移膜的一部分注射到组织样品中，用于捕获目标样品细胞。

本申请中术语和短语以以下定义使用：

如本文所用的“UV或紫外光”被定义为波长为10nm(具有约30PHz的相对应的频率)至400nm(750THz)(比可见光的波长更短、但比X射线的波长更长)的电磁辐射的形式。

“UV激光器”被定义为发射UV波长的激光器，如但不限于被制造成发射紫外光射线的气体激光器、激光二极管和固态激光器。氮气激光器使用氮分子的电子激发来发射主要是UV的光束。另一种类的高功率气体激光器是准分子激光器。它们是在紫外和真空紫外波长范围内进行发射的广泛使用的激光器。目前，在193nm下操作的UV氩氟准分子激光器通常用于通过光刻法进行的集成电路生产。直接UV发射激光二极管可在375nm使用。任何已知的UV激光器可以用于本发明。

如本文所用的“捕获元件”被定义为使得能够从较小数量的细胞、组织或任何其它样品中提取和检测生物分子的装置。捕获元件也可以定义为具有类似LCM帽的功能的装置。捕获元件也被写成捕获装置。捕获元件可以从组织样品中捕获细胞，因此其也称为细胞捕获元件。

如本文所用的“捕获”被定义为从在如LCM的仪器下进行检查的样品中提取所期望的部分的过程。

如本文所用的“样品”以其最广泛的意义使用，并且包含环境和生物样品。环境样品包含来自环境的物质，如土壤和水。生物样品可以是动物，包含人、流体(例如血液、血浆、血清、尿液、唾液)、固体(例如粪便)、组织、液体食物(例如牛奶)和固体食物(例如蔬菜)。例如，可以通过支气管肺泡灌洗(BAL)来收集肺样品，其包含源自肺组织的流体和细胞。生物样品的其他实例可以包含细胞、组织提取物、体液、从细胞中分离的染色体或染色体外元件、基因组DNA、RNA、cDNA等。样品还可以包含组织样品。

如本文所用的“组织样品”是从生物体中取出的一片组织(例如活检组织)，或生物体的整个器官、或甚至整个生物体。

如本文所用的“UV允许的基部材料”被定义为允许UV光的透射的材料。

如本文所用的“分析”被定义为如本领域技术人员已知的由一种或各种技术管控用于分析和鉴定基因组和蛋白质组中的分子(如核酸、氨基酸、肽、蛋白质、聚合物或生物标记)的过程。例如但不限于蛋白质组分析(如蛋白质剖析)、遗传分析(如个体的遗传密码和它们的细胞如何将它们的基因表达为蛋白质)、RNA剖析等。在一些实施例中，分子分析可以指组织样品中的细胞类型的鉴定。分子分析也被定义为分子剖析。

如本文所用的“透射”被定义为允许电磁射线(如UV射线、IR射线、可见射线或任何其它电磁射线行进穿过介质(如但不限于玻璃或塑料)的过程。

如本文所用的“透射膜”被定义为允许所期望的波长的射线的透射的材料。例如：UV透射膜允许UV射线的透射。

如本文所用的“吸收性物质”被定义为吸收所期望的波长的射线并且将电磁射线的能量转换成热量的材料。

“光斑大小”可以广义地定义为射线的光束的半径。与可见或红外辐射相比，UV具有更短的波长，因此由UV射线形成的光斑大小将比可见和红外辐射更短。

“转移层”可以被定义为具有与从固体到液体的相变相关联的较大的体积增加的低温熔融热聚合物(例如，乙烯-乙酸乙烯酯)，其可以被染色以便与特定频率的激光的辐射耦合。当样品中的期望部分被标识用于LCM时，激光器被活化，并且转移层被活化以在所选择的区域处粘附到样品。在说明书的许多地方，转移层也被写成热聚合物层。

如本文所用的“活化样品”被定义为使条件有利于捕获样品的部分以便使用各种分析方法进一步分析。

现有的LCM技术利用红外辐射(IR)辐射来软化捕获装置的热聚合物层(称为LCM帽)。帽上的这个热聚合物层浸渍有IR吸收染料，使得当IR穿过帽时，它被吸收并且转化为热量，从而仅在被辐照的区域熔化热聚合物。这允许在帽被按压到组织的表面的同时，通过仅利用通过帽的IR辐照特定区域来捕获样品内的所选择的组织切片区域。这个系统受到这样的事实的限制，即IR辐射的波长较长，因此对IR光束的光斑大小设置了可能的下限。这个下限决定了要进行显微切割的区域的大小；小于光束的光斑大小的特征无法单独分离。

在本发明中，LCM机器和消耗品(如捕获元件、染料等)与UV辐射兼容，与红外辐射相比，该UV辐射具有更短的波长。过去，将UV应用于激光捕获受到了严重限制，因为用于LCM的组分的塑料材料不允许透过UV辐射。

图1A至图1B示出了现有技术和本发明之间的对比，本发明将UV捕获组分结合到LCM系统中。在一个实施例中，结合IR和UV捕获允许用户捕获较大的组织切片或单细胞的最高灵活性。

在一个实施例中，本发明的LCM对系统的组分进行了修改，主要是捕获装置，因为它现在结合了不同浓度下的不同染料，并且包含UV允许的基部材料。

在一个实施例中，使用UV激光作为辐射源，并且在捕获步骤中使用染料来吸收UV射线(UV-染料)。捕获装置结合了不同浓度下的不同染料，并且包含UV允许的基部材料。

在一个实施例中，LCM系统中的UV激光器具有用于LCM组分的UV透射膜和用于与LCM系统中的UV激光器一起使用的附加灵活性的UV染料浸渍转移膜。

在一个实施例中，LCM系统中的UV激光器具有用于LCM组分和UV吸收涂层载玻片的UV透射膜，以及用于与LCM系统中的UV激光器一起使用的附加灵活性的UV染料浸渍转移膜。

本发明是对现有技术的改进，因为它们允许以更小的光斑尺寸进行显微切割，从而提高精度。由本发明测量的光斑尺寸小于10μm、小于9μm、小于8μm、小于7μm、小于6μm、小于5μm、小于4μm、小于3μm、小于2μm、小于1μm、小于0.5μm、小于0.1μm或更小。

在一个实施例中，UV穿过细胞捕获元件，该细胞捕获元件包含透射膜以及含有吸收性物质的热聚合物膜。图7中示出了含有染料的吸收性物质的一些实例。

如本文所用的透射膜是允许透射约380nm至约780nm的波长范围内的可见光、约700nm至约1100nm波长的范围内的红外辐射(IR)辐射和约300nm至约380nm的波长范围内的UV辐射的膜。

在一个实施例中，透射膜具有从约300nm至约380nm的波长范围内的UV辐射的大于约80％的透射率、从约380nm至约780nm的波长范围内的可见光的大于约80％的透射率、以及从约700nm至约1100nm的近红外辐射的大于约80％的透射率。

在一个实施例中，透射膜具有从约300nm至约380nm的波长范围内的UV辐射的大于约90％的透射率、从约380nm至约780nm的波长范围内的可见光的大于约90％的透射率、以及从约700nm至约1100nm的近红外辐射的大于约90％的透射率。

在一个实施例中，透射膜具有从约300nm至约380nm的波长范围内的UV辐射的大于约95％的透射率、从约380nm至约780nm的波长范围内的可见光的大于约95％的透射率、以及从约700nm至约1100nm的近红外辐射的大于约95％的透射率。

在一个实施例中，捕获元件的主体由透射膜构成。

在一个实施例中，捕获元件的主体可以由Plexiglass G-UVT塑料构成。

在一个实施例中，捕获材料的主体可以包含除了可从Plexiglass获得的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)之外的另一品牌版本的UV可穿透的聚甲基丙烯酸甲酯，如Lucite PerspexXT0X02。

在一个实施例中，Plexiglass G-UVT的透射光谱在图2中示出。

在另一个实施例中，其他潜在合适材料的透射光谱在图3中示出，UVT(白色)、Lucite(红色)、Policril HP UVT(橙色)和Policril UVT(黄色)。在图3中，在495mm至510mm之间玻璃材料在y轴上从最高点到最低点的顺序(透射率％)对应于Pilkington的Optiwhite高透光玻璃(4mm)、Irpen Polycril的UVT日光浴床丙烯酸树脂3mm、IrpenPolycril的HP UVT日光浴床丙烯酸树脂2mm、UVT丙烯酸树脂片(10年，品牌未知，2mm)、Asahi Glass公司的Planibel Clearvision玻璃4mm、Lucite Perspex的XT0X02 3mm、丙烯酸树脂片(非UVT)5mm、标准动物饲养室/窗玻璃4mm，Plexiglas的全顶SDP-16双壁丙烯酸树脂、以及标准温室双壁聚碳酸酯。

如本文所用的热聚合物膜是由在一定的高温下变得柔韧或可塑的聚合物材料制成的膜。在本说明书中，热聚合物也称为热塑性塑料。各种热塑性聚合物膜被广泛用作适用于转移膜的热活化粘合剂。在一个实施例中，优选的是使用具有高熔融指数范围(如大于100dg/min)的聚合物膜，使得其在较低温度下可活化，以避免对组织样品的性质的损坏或组织样品的性质方面的改变。

在一个实施例中，热聚合物聚合物膜具有高熔融指数范围(如大于100dg/min)，使得其在范围在50℃至150℃的温度下被活化。

在一个实施例中，热聚合物膜由乙烯-乙酸乙烯酯(EVA)制成。

在一个实施例中，可以使用含有突起(如微柱、微突起、水凝胶微球和/或微针)的图案化(例如，微图案化)转移膜来采用LCM。微图案化的转移膜在US 2017/0176301中公开，针对其中公开的装置和方法其全部内容通过引用结合于此。

在一个实施例中，LCM技术中使用的微图案化热塑性膜(如EVA膜)可以包含吸收性物质。

在一个实施例中，捕获元件具有由热聚合物膜制成的脚。

热聚合物膜可以浸渍有吸收UV辐射的不同染料。通过在帽内组合具有稍微不同的λ最大吸光度值的染料，可以控制入射UV辐射的吸收，从而允许在帽“脚”接触并且粘到组织表面和/或感兴趣细胞上时控制帽“脚”的选择性膨胀和熔化。

为了增强能量吸收，转移膜可以包含吸收性物质。存在能够热耦合到转印膜上的许多众所周知的吸收性物质。例如，吸收性物质可以包含吸收性染料或在本说明书中简称为染料。

在一个实施例中，染料可以是宽带吸收性染料或频率特定的吸收性染料。宽带吸收性染料是能够吸收电磁光谱的一部分的染料。UV宽带吸收性染料将具有吸收从10nm至400nm，优选地50nm至400nm，更优选地100nm至400nm的范围内的射线的能力。类似地，IR宽带吸收性染料将具有吸收红外辐射的波长范围内的射线的能力。宽带吸收性染料可以具有相对宽的吸收线，或者吸收整个紫外光谱区域的能量。

在一个实施例中，吸收性染料可以是吸收紫外线的二苯甲酮染料、苯并三唑染料或三嗪染料。吸收性物质可以在280nm至380nm区域(即，与用于选择性熔化膜或切割组织的激光发射器重叠的波长区域)具有强吸收。吸收性物质在高温下与熔化的大块塑料混合，然后使用标准膜制造技术将包含吸收性物质的热塑性塑料制造成膜。

在一个实施例中，UV吸收染料包含苯并三唑(苯并三唑染料的骨架，如染料奥克三唑)、均三嗪(三嗪染料的骨架，如所示的2-乙基己酸-2-(4-(4,6-二苯基-1,3,5-三嗪-2-基-3-羟基苯氧基)乙酯)和二苯甲酮(二苯甲酮染料的骨架，如2,4-二羟基二苯甲酮)。候选UV吸收染料的结构在图4中示出。

在另一个实施例中，二苯甲酮、苯并三唑和均三嗪基染料的吸光度光谱在340nm处或附近显示出强吸光度，并且可以单独使用或结合使用以覆盖从300nm至380nm的UV范围。吸收光谱在图5和图6中示出。在图5中，在x轴的起点，按照从y轴上的最大值到y轴上的最小值的顺序，光谱对应于如上所述的UV1、UV3和UV2，以及乙酸乙酯基线。在图6中，在x轴的起点，按照从y轴上的最大值到y轴上的最小值的顺序，光谱对应于如上所述的UV5和UV4、以及基线。

在一个实施例中，热聚合物中的染料浓度可以是约1mM、约0.5mN或更低至0.1mM。

在另一个实施例中，UV帽中的染料浓度可以很高，使得所有来自激光捕获显微切割仪器的入射UV光被吸收并且转化为热量，从而熔化激光捕获显微切割帽的热聚合物层并且允许聚合物熔化到组织表面上。在这个实施例中，选择的感兴趣区域附着到熔化的聚合物，并且可以从大块组织分离以便进行下游分子分析。

在一个实施例中，UV帽中的染料浓度可以很低，使得来自激光捕获显微切割仪器的少量入射UV光不被帽吸收，而是转移到组织表面。被LCM帽吸收的入射UV光的剩余部分被转换成热量，从而熔化激光捕获显微切割帽的热聚合物层并且允许聚合物熔化到组织表面上。在这个实施例中，选择的感兴趣区域附着到熔化的聚合物，并且可以从大块组织分离。

在另一个实施例中，吸收性物质可以在有或没有温和加热的情况下直接施加到LCM帽的预成型微图案化表面上。

在这个实施例中，到达组织表面的少量UV光可以从分子探针上解离出对UV不稳定的标记，该分子探针在显微切割之前被添加到组织的表面。在这个实施例中，激光捕获显微切割过程既释放了感兴趣的组织切片，又从分子探针释放了标记，然后可以分析该标记以便获得存在或身份。

如本文所用的分子探针被广义地定义为在分子生物学或化学中用于研究其他分子或结构的性质的一组原子或分子。在《国际生命杂志(International Journal ofLifesc.)》BT.Pharm.,2,32-42,2013年出版的文章《分子探针及其应用(molecular probesand their application)》中公开不同的分子探针，其全部内容结合于此。所用探针是体外合成的双和单标准DNA、mRNA和其它RNA、cDNA探针、合成的寡核苷酸探针、放射性标记的探针、3H、32_P、35_S、14_C、¹²⁵1,4-(苯氧甲基)哌啶、生物素、地高辛配基、地高辛配基-II–dUTP、异源cDNA探针、动质体DNA(KDNA，重复DNA序列)、动质体DNA(KDNA)重复DNA、总寄生虫DNA、核糖体RNA基因、重复DNA序列、核糖体DNA、核糖体DNA。

在另一个实施例中，分子探针可以是但不限于用对UV不稳定的标记元件标记的抗体、肽或小分子。

在另一个实施例中，标记元件可以是但不限于DNA条形码、重金属标记、肽标记或小分子标记。标记是指使用适当的分子标记来检测或纯化所标记的蛋白质及其结合配偶体。DNA条形码是来自特定基因的用于标识未知基因或序列的一小段DNA。

在一个实施例中，本发明的捕获元件允许IR和UV转移层两者。IR转移层将吸收IR射线并且从样品中捕获所选择的区域。与IR相比，UV转移将吸收UV射线并且捕获更小的切片。这将为用户提供更大的灵活性。

在一个实施例中，结合IR和UV捕获允许用户捕获较大的组织切片或单细胞的最高灵活性。

在一个实施例中，捕获元件的主体允许UV以及红外线和可见光透射。这允许用户将含有许多细胞的较小区域显微切割成单细胞或更小。能够分析单细胞将允许对几种情况进行更大的科学研究，其中感兴趣的单细胞可能携带关于该组织切片中疾病或病症的状态的大量信息。

本发明可以用于a)进行组织细胞的高分辨率采集，或b)进行远离组织的分子探针的高分辨率捕获。

捕获元件可以是激光捕获显微切割帽。在一个实施例中，捕获元件的主体可以被形成为片或载玻片。

在一个实施例中，载玻片涂覆有UV吸收物质或涂层。

在一个实施例中，经涂覆的载玻片和/或UV染料浸渍的EVA转移膜、UV吸收化合物具有以下性质：透明涂层或染料可以是金属聚合物或有机涂层或染料，其具有这样的性质，即其是透明的并且可以通过经受LCM系统中发现的UV激光而熔化、软化或使其吸收UV光。

在一个实施例中，涂层或染料将含有小于1000kDa的分子，该分子在可见波长范围(380nm至700nm)中具有大于80％的透射率，以及在紫外线波长范围(280nm至380nm，UV-A和UV-B)中具有大于80％的吸光度。

在另一个实施例中，可以通过涂覆具有透明或半透明的导电基底的表面来处理载玻片底层的表面，该表面在经受LCM机器的UV激光束下(即，当利用UV或IR光谱中的电磁能量或波长辐照时)熔化或软化。这种透明的导电涂层可以是金属、聚合物或有机涂层，其性质是，其是透明的并且可以通过适当波长的UV激光的作用而熔化或软化。这允许载玻片基底容易与感兴趣的组织切片解离，从而提高LCM的捕获效率。

在另一个实施例中，可以通过涂覆具有透明或半透明的吸收性基底的表面来处理载玻片底层的表面，该表面在经受LCM机器的UV激光束下(即，当利用UV或IR光谱中的电磁能量或波长辐照时)熔化或软化。这种透明的导电涂层可以是金属、聚合物或有机涂层，其性质是，其是透明的并且可以通过适当波长的UV激光的作用而熔化或软化。

UV激光束的合适波长从10nm到400nm变化，优选地从200nm到400nm。这允许载玻片基底容易与感兴趣的组织切片解离，从而提高LCM的捕获效率。

在另一个实施例中，可以通过涂覆具有透明或半透明的吸收性基底的表面来处理载玻片底层的表面，该表面在经受LCM机器的IR激光束下(即，当利用UV或IR光谱中的电磁能量或波长辐照时)熔化或软化。这种透明的导电涂层可以是金属、聚合物或有机涂层，其性质是，其是透明的并且可以通过适当波长的IR激光的作用而熔化或软化。这允许载玻片基底容易与感兴趣的组织切片解离，从而提高LCM的捕获效率。

通过在载玻片上结合附加涂层，这样的实施例有效地改善了这样的顾虑，即感兴趣的组织切片对载玻片的亲和力太大而不能被LCM帽对组织切片的亲和力完全克服，否则这可能导致感兴趣的细胞的撕裂或不完全捕获。

在另一方面，根据一些实施例的用于LCM的载玻片利用与转移层的吸收性材料不同的材料处理，以评估它们对捕获效率的影响，而没有样品变形。将经涂覆的载玻片与从常规二氧化硅未涂覆的显微镜载玻片显微切割的细胞针对捕获效率进行比较。

在一个实施例中，在LCM中使用UV为标记和检测特定分子组织特征开启了附加可能性。图8概述了这样的过程，其中低功率UV功率设置(或捕获元件中的UV染料吸收性能力下的功率设置)允许热聚合物层的熔化，从而导致细胞捕获。如图8中切片(1)(左部部分)所示，组织表面涂覆有所标记的亲和分子。标记通过可光切割接头(UV可解离的)附着到亲和分子上。在图8，切片(2)(中间部分)，热聚合物层中的UC染料吸收所有UV能量，将其转化为热量，并且将其熔化到细胞表面。期望的细胞通过附到熔化的热聚合物上而被捕获。在图8，切片(3)(右部部分)，高功率UV脉冲超过了UV染料吸收从而破坏了UV可解离键。可以收集标记以便进行下游分析。

如果期望的话，可以使用后续更高的捕获后功率设置，其中功率设置超过捕获元件的吸收能力，从而允许少量的UV穿透过热聚合物层到达被捕获的组织表面，在那里如果期望的话，其可以用于从细胞标记物解离标记。

在一个实施例中，本发明不是显而易见的，因为在这个主要进步中，它允许UV以及红外和可见光透射。这允许用户将含有许多细胞的较小区域显微切割成单细胞或更小。能够分析单细胞将允许对几种情况进行更大的科学研究，其中感兴趣的单细胞可能携带关于该组织切片中疾病或病症的状态的大量信息。本发明可以用于a)进行组织细胞的高分辨率采集，或b)进行远离组织的分子探针的高分辨率捕获。本发明公开内容用于描述新的塑料材料本身，以及更新的消耗品所需的其他组分，以及本发明实现的以前不可能的应用。

本文提及的所有参考文献(包含授权专利和专利申请公开)均通过引用整体结合于此。

参考文献

1)Vasavirama,K.(2013).《分子探针及其应用(Molecular probes and theirapplications.)》Int J Lifesc Bt Pharm Res,2,32-42.

2)美国专利公开号2017/0176301.

3)Espina V.,等人.(2006)《自然保护(Nature Prot.)》1(2),586-603.

4)Michael,R.等人(1996).《激光捕获切割(Laser Capture Microdissection》,《科学(Science,)》第274卷,第5289号,(8),998-1001.

Claims

1.一种装置，所述装置包括透射膜和转移膜，所述透射膜包括第一材料，所述第一材料被配置为透射包括约280nm至约380nm的第一波长的第一射线，并且所述转移膜包括第二材料，所述第二材料被配置为吸收所述第一射线；并且其中所述装置被配置为捕获元件。

2.根据权利要求1所述的装置，其中所述第一材料被配置为透射约80％的波长为约280nm到约1100nm的射线，并且其中所述转移膜包括吸收性物质。

3.根据权利要求2所述的装置，其中所述吸收性物质包括被配置为吸收所述第一射线的染料。

4.根据权利要求3所述的装置，其中所述染料被配置为透射具有约380nm到约700nm的第二波长的第二射线并且吸收所述第一射线。

5.根据权利要求3所述的装置，其中所述染料包括宽带吸收性染料或频率特定的吸收性染料。

6.根据权利要求3所述的装置，其中所述吸收性物质包括二苯甲酮染料、苯并三唑染料或三嗪染料。

7.根据权利要求3所述的装置，其中所述转移膜包括约1mM或更少的所述染料。

8.根据权利要求4所述的装置，其中所述染料被配置为透射约80％的所述第二射线并且吸收约80％的所述第一射线。

9.一种方法，所述方法包括：

a)将样品放置在包括捕获元件的仪器的载物台上，其中所述仪器被配置为检查所述样品；

b)将UV射线透射通过所述捕获元件，其中所述捕获元件中的吸收性物质被配置为吸收所述UV射线并且转化为热量；

c)在所述捕获元件上捕获所述样品的一部分；并且

d)分析所述样品。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述捕获元件包括透射膜和转移膜，其中所述透射膜被配置为透射所述UV射线，并且所述转移膜包括材料和所述吸收性物质。

11.根据权利要求9所述的方法，其中包括所述样品的载玻片被配置为放置在所述仪器的所述载物台上，其中所述载玻片包括被配置为在经受所述UV射线的情况下活化所述样品的导电基底。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述样品包括被配置为对所述UV射线不稳定的标记。

13.根据权利要求9所述的方法，其中所述吸收性物质包括二苯甲酮染料、苯并三唑染料或三嗪染料。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述样品还包括有包括所述标记的分子探针，其中到达所述样品的所述UV射线将所述标记从所述分子探针解离。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述分子探针包括抗体、肽或小分子。

16.根据权利要求12所述的方法，其中所述标记包括DNA条形码、重金属标记、肽标记或小分子标记。

17.一种系统，所述系统包括：捕获元件，所述捕获元件包括透射膜和转移膜，其中所述透射膜包括第一材料，所述第一材料被配置为透射包括约300nm至约1100nm的波长的射线，并且所述转移膜包含第二材料，所述第二材料被配置为吸收包含约280nm至380nm的波长的第一射线；其中所述第二材料包括吸收性材料，并且其中所述系统被配置为检查放置在所述系统的载物台上的样品。

18.根据权利要求17所述的系统，其中所述转移膜还包括第三材料，所述第三材料被配置为吸收具有约700nm至1100nm的第二波长的第二射线。

19.根据权利要求17所述的系统，其中所述载物台被配置为放置在包括所述样品的载玻片上，其中所述载玻片包括被配置为在经受所述第一射线照射的情况下活化所述样品的导电基底。

20.根据权利要求17所述的系统，其中所述吸收性材料包括二苯甲酮染料、苯并三唑染料或三嗪染料。