CN116723842A

CN116723842A - 与低bh4生物利用度相关的病症的治疗

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Publication number: CN116723842A
Application number: CN202180087165.5A
Authority: CN
Inventors: K·钱农
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2021-12-21
Publication date: 2023-09-08
Also published as: GB202108231D0

Abstract

本发明涉及还原型叶酸，诸如5‑MTHF(5‑甲基四氢叶酸)，任选地与四氢生物蝶呤(BH4)或其前体组合，用于预防或治疗与BH4缺乏或低BH4生物利用度相关的病症的用途。这样的病症主要包括具有血管内皮病理或影响氨基酸代谢或神经传递的疾病，尤其是妊娠相关的病症，诸如先兆子痫。

Description

与低BH4生物利用度相关的病症的治疗

发明领域

本发明涉及还原型叶酸，优选地5-MTHF(5-甲基四氢叶酸)，任选地与四氢生物蝶呤(BH4)或其前体联合，用于预防或治疗与BH4缺乏或低BH4生物利用度相关的病症的用途，所述病症可能全身发生或局部发生在特定细胞或组织中。这样的病症主要包括具有血管内皮病理或影响氨基酸代谢或神经传递的疾病。本发明还涉及选择用所述还原型叶酸，任选地与BH4或其前体联合治疗的患者的方法，包含还原型叶酸和BH4、其前体或功能等同物的组合物和药盒，药盒，和还原型叶酸(优选地5-MTHF)在防止BH4或其前体氧化中的体外用途。

发明背景

内皮功能障碍与血管一氧化氮(NO)生物利用度降低和氧化应激的标志物相关。已知一氧化氮(NO)缺乏是许多涉及血管内皮的疾病(诸如心血管疾病，或妊娠病症(诸如妊娠引起的高血压、胎盘功能不全(placental insufficiency)、胎儿生长受限和先兆子痫))的一个因素。

在妊娠期间，血管重塑是正常发育的必要条件，以便为胎盘灌注提供足够的血流量，确保胎儿生长。妊娠中的血管适应需要子宫动脉的重塑和胎盘血管系统的发育足以适应子宫血流量的大幅增加，而不导致全身血压升高。在正常妊娠中，子宫动脉口径增加与内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性和一氧化氮(NO)生物利用度增强相关。

子宫胎盘血管重塑不足以应对这种血流量增加会导致妊娠引起的高血压和胎儿生长受限或先兆子痫。这些是母亲和孩子两者的不良妊娠结果的主要原因，影响了全世界所有妊娠中的～7％。非洲和亚洲孕产妇死亡(maternal death)的近十分之一和拉丁美洲孕产妇死亡的近四分之一与妊娠期高血压疾病相关，包括先兆子痫。在这些状况中，子宫和胎盘血管显示出内侧血管平滑肌细胞(VSMC)肥大增加和口径降低。在从先兆子痫妊娠分离的动脉中，NO依赖性血流介导的血管舒张进一步降低。这导致胎盘功能不全，与涉及内皮细胞功能障碍和异常血管生成的血浆生物标志物(诸如胎盘生长因子(PlGF)(4)、sEng和sFLT-1)增加相关。这样的内皮功能障碍在许多妊娠相关的病症中是一致的发现。

四氢生物蝶呤(BH4)是内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的氧化还原辅因子，在NO生成中具有必需的作用。在其他心血管疾病中异常eNOS活性的一个共同特征是所需的eNOS辅因子四氢生物蝶呤(BH4)的损失，四氢生物蝶呤(BH4)在内皮细胞中由GCH1基因编码的GTP环水解酶I合成。然而，BH4尚未被作为治疗妊娠相关的病症诸如先兆子痫的潜在治疗靶来研究。

迄今为止，源于血管内皮病理学的妊娠相关的病症的治疗集中于治疗状况的症状，通常通过降低血压，直到胎儿可以分娩。先兆子痫很少发生在妊娠第20周之前。大多数病例发生在24周至26周之后，且通常趋向妊娠末期(end of pregnancy)。虽然不太常见，但该状况也可能在出生后的前6周首次发展(＝产后先兆子痫)。大多数人仅经历轻微的症状，但重要的是要管理状况，以防发展严重的症状或并发症。通常，先兆子痫发展得越早，状况将越严重。例如，先兆子痫的明确治疗是分娩胎儿和胎盘。分娩前用于降低血压的主要药物是阿司匹林(用于轻度病例)、拉贝洛尔(labelatol)、硝苯地平或甲基多巴。其中只有一种，即拉贝洛尔，在英国被批准用于妊娠女性。鉴于对胎儿的安全的主要考虑，难以开发用于治疗妊娠女性的药物并使其获得批准。抗惊厥药物诸如硫酸镁有时也被施用以预防癫痫发作。即使有这样的治疗，但鉴于这样的状况涉及的风险，许多母亲被迫留在医院接受密切监测，直到胎儿分娩，或经历早产。

除了服用低剂量阿司匹林外，没有已证实的预防性疗法可用于这样的妊娠相关的病症。然而，这只能有效地帮助预防高血压。其并未解决这些状况的其他影响，诸如胎盘形成和发育不良以及低氧。目前还没有解决这些状况的潜在血管原因的治疗方法。

四氢生物蝶呤(BH4)除了在内皮NO生成中的功能外，还是其他酶的氧化还原辅因子，特别是一组将氨基酸色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸转化的氨基酸羟化酶。这些酶用于氨基酸苯丙氨酸的降解和用于神经递质血清素(5-羟色胺，5HT)、褪黑激素、多巴胺、去甲肾上腺素(norepinephrine，noradrenaline)和肾上腺素(epinephrine，adrenaline)的生物合成。

许多病症与这些羟化酶的功能障碍有关，这些功能障碍也可能由必需的辅因子BH4的缺乏或生物利用度降低引起。这样的病症包括例如BH4缺乏本身和苯丙酮尿症(PKU)。此外，由于BH4在神经递质产生中的作用，BH4还与神经病症诸如孤独症、ADHD、抑郁症和帕金森病有牵连。特定细胞和组织中BH4的低利用度可能不仅与全身BH4水平有关，还可能受局部BH4氧化或再循环以及BH4分布(例如通过细胞摄取或转运)的影响。

然而，与心血管病症和妊娠相关的病症的治疗一样，这些疾病中的许多依赖于不基于BH4参与的其他治疗剂。

仅有一种沙丙蝶呤二盐酸盐(BH4*2HCL)形式的包含BH4的商业可得的治疗剂是可用的并被批准用于治疗PKU。然而，大多数患有PKU的人很少或没有从该药物获益(Camp KM,Parisi MA,Acosta PB,Berry GT,Bilder DA,Blau N,等人(June 2014)MolecularGenetics and Metabolism.112(2):87-122)。此外，施用口服形式的BH4对患有现存的血管疾病和内皮功能障碍的患者没有益处(Cunnington C等人Circulation 2012)。关于使用BH4的另一重要问题是它容易氧化。

本发明旨在通过以下方面中的一个或更多个来解决上述问题中的一个或多个。

发明陈述

根据本发明的第一方面，提供了还原型叶酸，用于在预防或治疗与低BH4生物利用度相关的病症中使用，其中所述还原型叶酸不用于与以下中的任一种联合施用：

-阿司匹林；

-植物提取物(herbal extract)。

在一种实施方案中，还原型叶酸用于与BH4、其前体或功能等同物联合施用。

在一种实施方案中，还原型叶酸和任选地BH4、其前体或功能等同物是仅有的活性药剂(sole active pharmaceutical agents)。在一种实施方案中，还原型叶酸是仅有的活性药剂。

根据本发明的第二方面，提供了还原型叶酸和BH4、其前体或功能等同物的组合，用于在预防或治疗与低BH4生物利用度相关的病症中使用。

根据本发明的第三方面，提供了一种组合物，包含一种或更多种活性药物成分，用于在预防或治疗与低BH4生物利用度相关的病症中使用，其中活性药物成分由还原型叶酸和任选地BH4、其前体或功能等同物组成。

在一种实施方案中，活性药物成分由还原型叶酸组成。

根据本发明的第四方面，提供了一种治疗患有与低BH4生物利用度相关的病症的受试者的方法，该方法包括向所述受试者施用还原型叶酸，其中还原型叶酸不与以下中的任一种联合施用：

-阿司匹林；

-植物提取物。

在一种实施方案中，还原型叶酸与BH4、其前体或功能等同物联合施用。

在一种实施方案中，还原型叶酸和任选地BH4、其前体或功能等同物是仅有的活性药剂。在一种实施方案中，还原型叶酸是仅有的活性药剂。

根据本发明的第五方面，提供了一种治疗患有与低BH4生物利用度相关的病症的受试者的方法，该方法包括向所述受试者施用还原型叶酸和BH4、其前体或功能等同物。

根据本发明的第六方面，提供了一种治疗患有与低BH4生物利用度相关的病症的受试者的方法，该方法包括向所述受试者施用包含一种或更多种活性药物成分的组合物，其中活性药物成分由还原型叶酸和任选地BH4、其前体或功能等同物组成。

在一种实施方案中，活性药物成分由还原型叶酸组成。

在第四方面、第五方面或第六方面中的任一方面的一种实施方案中，方法还包括确定受试者中与低BH4生物利用度相关的病症的一种或更多种标志物的水平，并适当地将所述标志物或每种标志物水平与健康受试者的参考水平进行比较。在一种实施方案中，方法还包括如果受试者表现出与低BH4生物利用度相关的病症的一种或更多种标志物，则选择受试者进行治疗。

根据本发明的第七方面，提供了还原型叶酸在制备用于治疗与低BH4生物利用度相关的病症的药物中的用途，其中所述药物不包含以下中的任一种：

-阿司匹林；

-植物提取物。

在一种实施方案中，还原型叶酸与BH4、其前体或功能等同物联合用于制备药物。

在一种实施方案中，还原型叶酸和任选地BH4、其前体或功能等同物是用于制备药物的仅有活性药剂。在一种实施方案中，还原型叶酸是用于制备药物的仅有活性药剂。

根据本发明的第八方面，提供了还原型叶酸与BH4、其前体或功能等同物联合在制备用于治疗与低BH4生物利用度相关的病症的药物中的用途。

根据本发明的第九方面，提供了一种或更多种活性药物成分在制备用于治疗与低BH4生物利用度相关的病症的药物中的用途，其中活性药物成分由还原型叶酸和任选地BH4、其前体或功能等同物组成。

在一种实施方案中，活性药物成分由还原型叶酸组成。

在上述方面中的任一方面的一种实施方案中，与低BH4生物利用度相关的病症是妊娠相关的病症。

在上述方面中的任一方面的一种实施方案中，还原型叶酸使BH4水平正常化或恢复。在上述方面中的任一方面的一种实施方案中，还原型叶酸增加BH4水平。在一种实施方案中，在内皮细胞中测量BH4水平。

在上述方面中的任一方面的一种实施方案中，还原型叶酸减少或防止BH4的氧化。

在上述方面中的任一方面的一种实施方案中，预防或治疗针对受试者，适当地针对具有与低BH4生物利用度相关的病症的一种或更多种标志物的受试者。在一种实施方案中，已经适当地通过第十方面的方法对受试者进行了与低BH4生物利用度相关的病症的一种或更多种标志物的测试。

根据本发明的第十方面，提供了一种选择受试者的方法，所述方法选择能够从使用还原型叶酸和任选地BH4、其前体或功能等同物的治疗中获益的受试者，该方法包括确定受试者中与低BH4生物利用度相关的病症的一种或更多种标志物的水平，将标志物的水平或每种标志物的水平与健康受试者中的参考水平进行比较，并且如果与参考水平相比，受试者表现出与低BH4生物利用度相关的病症的一种或更多种标志物的异常水平，则选择受试者进行治疗。

与低BH4生物利用度相关的病症的合适标志物在下文描述。适当地，术语“异常”意指标志物的水平与健康受试者中的标志物的水平显著不同。适当地，标志物的“异常”水平可以是相对于健康受试者中的标志物的水平的增加或降低。

在第十方面的一种实施方案中，与低BH4生物利用度相关的病症的一种或更多种标志物至少包括受试者中的BH4水平。适当地，在这样的实施方案中，方法包括确定受试者中的BH4水平，并且任选地确定受试者中与低BH4生物利用度相关的病症的一种或更多种其他标志物的水平。

在第十方面的一种实施方案中，方法还包括向所选择的受试者提供治疗。在一种实施方案中，治疗包括还原型叶酸和任选地BH4、其前体或功能等同物。

根据本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，包含还原型叶酸和BH4、其前体或功能等同物。

根据本发明的第十二方面，提供了一种药盒，包含：

-还原型叶酸；和

-BH4、其前体或其功能等同物。

根据本发明的第十三方面，提供了还原型叶酸在体外防止BH4、其前体或功能等同物氧化的用途。

在第十三方面的一种实施方案中，还原型叶酸可以是其天然立体异构体形式或非天然立体异构体形式。

在上述方面中的任一方面的一种实施方案中，还原型叶酸是其天然立体异构体形式。适当地，在与医学用途相关的方面，还原型叶酸是其天然立体异构体形式。

在上述方面中的任一方面的一种实施方案中，还原型叶酸包括完全还原型叶酸，诸如5-MTHF。

在上述方面中的任一方面的一种实施方案中，低BH4生物利用度是指BH4生物利用度的降低，适当地是指相对于健康受试者中的BH4水平的低水平的BH4。适当的低BH4生物利用度包括全身低BH4生物利用度或局部低BH4生物利用度。适当地，局部低BH4生物利用度可以包括在组织水平或细胞水平的BH4降低，例如特定组织或细胞中的低组织BH4生物利用度或低细胞BH4生物利用度。适当地，低BH4生物利用度可由BH4缺乏引起。可选地或另外地，低BH4生物利用度可由例如BH4向细胞中的转运或BH4向细胞中的摄取受损，或者BH4氧化增加或BH4减少引起。

本申请的发明人发现了BH4藉以参与以下病理学的机制：妊娠相关的血管病症诸如先兆子痫，以及潜在的与血管内皮病理学相关的许多其他病症，诸如心血管疾病、肝病和肾病。

本申请的发明人还发现了增加BH4水平的有效疗法，该疗法可以应用于由低BH4生物利用度介导的任何病症。

关于妊娠相关的血管病症，本申请的发明人发现BH4的损失介导母体内皮功能障碍，并且是妊娠相关的血管发病机制的主要促成因素。本申请的发明人令人惊讶地发现，内皮细胞中BH4的缺乏是这样的状况的关键原因，使其成为可行的治疗靶。

本申请的发明人发现，这些状况与内皮细胞BH4水平降低、eNOS活性受损和内皮细胞增殖降低有关，由BH4生物合成中的限速酶GTP环水解酶I蛋白降低介导。在妊娠小鼠中进行研究，本申请的发明人示出，由Gch1基因(编码合成酶GTP环水解酶I)的靶向缺失引起的母体内皮细胞BH4缺乏，导致妊娠期进行性高血压和胎儿生长受限。此外，本申请的发明人示出，母体内皮细胞Gch1缺失导致子宫动脉和螺旋动脉的功能和结构重塑缺陷，导致胎盘功能不全。

在本申请的发明人的研究之前，妊娠相关的血管病症中NO介导的血管重塑的机制还未被阐明。之前还不知道BH4参与了这样的状况的病理学，也不知道BH4在正常胎盘发育所需的血管重塑中具有如此重要的作用。本申请的发明人确定了妊娠期间子宫胎盘血管重塑中母体内皮细胞BH4生物合成的关键需求。

先前治疗涉及BH4的其他病症(诸如BH4缺乏本身或苯丙酮尿症(PKU))的尝试涉及直接用口服BH4片剂治疗患者。

然而，本申请的发明人进一步发现，涉及BH4的病症不总是能够通过提供BH4本身作为药物来治疗。本申请的发明人发现BH4被快速氧化成无效形式：BH2。由于BH4全身性氧化成BH2，因此通过口服BH4补充无法挽救妊娠内皮细胞Gch1缺陷小鼠的高血压和胎儿生长受限。这样的快速氧化成BH2的情况也发生在对照小鼠中，表明直接的BH4补充对治疗与低BH4生物利用度相关的病症无效。

为了解决这个问题，本申请的发明人发现，将BH4与还原型叶酸一起提供作为联合疗法解决了这个问题，并将BH4保持在其有效的还原状态。提供完全还原型叶酸5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)防止了BH4氧化，将血压降低到正常水平，并使胎儿生长正常化。

令人惊讶的是，还发现还原型叶酸的作用对体内存在的现有BH4起作用，允许还原型叶酸单独用作药物。

虽然相关的化学物质叶酸，即一种完全氧化形式的叶酸，长期以来一直被推荐作为妊娠女性的补充剂，但临床试验表明，在患有先兆子痫的女性中补充叶酸没有益处。事实上，在本申请的发明人自己的研究中，叶酸在提供给Gch1缺陷小鼠时没有显示出任何治疗作用。叶酸需要通过化学还原转化为5-MTHF，因此不能够对BH4水平发挥有益的氧化还原作用，这一有益的氧化还原作用已经被本申请的发明人用完全还原形式的5-MTHF观察到。本申请的发明人发现的5-MTHF在增加细胞中BH4利用度和防止BH4氧化中的新作用，令人惊讶地独立于任何先前已知的叶酸介导的经典1-碳叶酸途径或同型半胱氨酸降低的作用。

因此，令人惊讶的是，本申请的发明人发现，提供其中活性药物成分由还原型叶酸和任选地BH4组成的药物有效地预防和治疗妊娠相关的血管病症。用还原型叶酸恢复内皮细胞BH4提供了干预妊娠相关高血压、胎盘功能不全和相关胎儿生长受限的有效疗法。有利的是，这种疗法可以通过应对潜在的内皮病理学而不仅仅是减轻其高血压症状，来特别地用于治疗或预防目前没有有效治疗的先兆子痫。先兆子痫的预防可以在妊娠后20周之前的任何时间开始，优选地在妊娠后16周之前，甚至更优选地在妊娠后12周之前，并持续整个妊娠期加上出生后12周。

甚至更令人惊讶的是，本申请的发明人发现，提供其中活性药物成分由还原型叶酸和任选地BH4组成的药物，有效地防止复发性和遗传性妊娠相关的血管病症。

BH4也是体内其他机制的关键组成部分。虽然BH4是一氧化氮合酶产生一氧化氮(NO)的辅因子，这可以解释BH4在引起内皮功能障碍中(诸如在包括先兆子痫在内的血管病症中)的参与，BH4也是其他酶的辅因子，例如将氨基酸转化为神经递质或将氨基酸诸如苯丙氨酸分解代谢的芳族氨基酸羟化酶。本申请的发明人还预计在其他细胞或组织类型中BH4利用度的恢复或增加将为已知这些酶的功能障碍起关键作用的其他疾病的治疗提供有益的作用。例如在BH4缺乏本身、PKU或神经病症诸如帕金森病、孤独症和ADHD中。有利的是，具有益作用的不依赖于提供BH4本身的不同治疗方法的发现在这些病症中可能有很大的用处。这避免了单独使用BH4作为治疗剂的问题，BH4配制和施用可能更加昂贵和具有挑战性，并且研究已经表明BH4由于快速氧化成无效形式，在体内实际上可能不提供任何有益的作用。

附图

现将参考以下附图描述本发明，在附图中：

图1示出：来自血压正常妊娠和先兆子痫妊娠的内皮细胞中的GTPCH蛋白、BH4水平、NOS活性和体外内皮管形成。从来自血压正常(NT)妊娠或先兆子痫(PE)妊娠的胎盘脐带中分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。在内皮细胞生长培养基中培养HUVEC，并收获用于分析生物蝶呤、GTPCH蛋白水平和NOS活性。(a-b)对来自血压正常(NT)妊娠和先兆子痫妊娠(PE)的HUVEC中的生物蝶呤的HPLC分析。生物蝶呤表示为每mg细胞蛋白(*P<0.05；每组n＝12至14)；(c)示出来自NP妊娠和PE妊娠的HUVEC中的GTPCH蛋白的代表性免疫印迹，其中条带密度相对于β-微管蛋白上样对照进行定量(*P<0.05；每组n＝9)；(d)内皮型一氧化氮合酶活性(eNOS)通过细胞培养物中14C精氨酸的转化、随后通过放射化学HPLC对14C瓜氨酸产生进行定量来测量。在基础条件下和在用钙离子载体(A23187)刺激时，与NT相比，来自PE的HUVEC中的eNOS活性大大降低。用墨喋呤(Sep；1μM，通过细胞蝶呤挽救途径转化为BH4)处理显著增加了NT HUVEC和PE HUVEC两者中的eNOS活性，因此两组之间的eNOS活性不再有差异。非选择性NOS抑制剂NG-甲基-L-精氨酸(L-NMA)消除了所有组的eNOS活性(*P<0.05；每组n＝6-8)；(e)用或不用1μM墨喋呤处理的来自NT和PE的HUVEC中BH4的水平；(f)在存在或不存在墨喋呤(1μM)的情况下，铺板在生长因子减少的matrigel上的来自NT和PE的HUVEC的代表性显微照片；(g)使用Angiosys软件进行内皮分支点和总管长的定量，并以微米/视野表示。来自PE的HUVEC显示出比来自NT的HUVEC更少的内皮细胞生长和小管形成，但通过补充墨喋呤被挽救(*P<0.05；每组n＝6)；(g)使用Angiosys软件进行内皮分支点和总管长的定量，并以微米/视野表示。来自PE的HUVEC显示出比来自NT的HUVEC更少的内皮细胞生长和小管形成，但通过补充墨喋呤被挽救(*P<0.05；每组n＝6)；(h)通过双叶胎盘灌注和超速离心从来自血压正常妊娠(NT)女性或来自先兆子痫(PE)女性的胎盘中分离细胞外囊泡。通过HPLC测量BH4、BH2和总生物蝶呤(即BH4+BH2+生物蝶呤(B))的水平和BH4相对于氧化型生物蝶呤种类的比值“BH4/总生物蝶呤比值”(即BH4/(BH2+B))。与血压正常妊娠女性相比，从先兆子痫妊娠女性中分离的细胞外囊泡中的BH4、总生物蝶呤和BH4/总生物蝶呤比值显著降低(*P<0.05；每组n＝6)。

图2示出：Gch1敲低对内皮细胞中的体外内皮管形成的影响。用靶向Gch1的siRNA库(pool)或非靶向(NS)加扰对照siRNA转染sEnd.1鼠内皮细胞(a-e)和原代人子宫微血管内皮细胞(HutMEC)(f-h)。然后收获细胞，并通过蛋白印迹分析GTPCH蛋白表达，或使用HPLC用电化学和荧光检测分析生物蝶呤水平。(a)用非特异性Gch1 siRNA(NS)或特异性Gch1siRNA(Gch1 siRNA)处理的sEND.1小鼠内皮细胞系中GTPCH蛋白的代表性蛋白印迹。在用特异性Gch1 siRNA处理的sEND.1中，通过蛋白印迹检测不到GTPCH蛋白，而在用非特异性Gch1siRNA处理的sEND.1中很容易检测到GTPCH。印迹代表四个独立的实验；(b)与非特异性siRNA细胞相比，通过HPLC测量的Gch1特异性siRNA细胞中的细胞内BH4、BH2、总生物蝶呤(即BH4+BH2+B)和BH4相对于氧化型生物蝶呤种类的比值“BH4/总生物蝶呤比值”(即BH4/(BH2+B))显著降低(*P<0.05；每组n＝4)；(c)在存在或不存在墨喋呤(1μM)的情况下，用非特异性Gch1 siRNA或特异性Gch1 siRNA处理的铺板在生长因子减少的matrigel上的sEND.1小鼠内皮细胞的代表性显微照片。通过使用Angiosys软件进行内皮管长度和分支的定量，并以微米/视野表示；(d)体外内皮管形成和分支。与用非特异性Gch1 siRNA处理的sEND.1相比，用特异性Gch1 siRNA处理的sEND.1中Gch1的表达降低导致内皮细胞生长和小管形成的显著减少，这可以通过补充墨喋呤被挽救(*P<0.05；每组n＝6)；(e)在存在或不存在墨喋呤(1μM)的情况下，用非特异性Gch1 siRNA或特异性Gch1 siRNA处理的sEND.1细胞中BH4的水平(*P<0.05；每组n＝6)；(f)蛋白印迹分析显示，与非特异性(NS)siRNA相比，暴露于GCH1特异性siRNA后，HutMEC中的细胞GTPCH蛋白大大减少。使用来自用siRNA GCH1(作为阴性对照)或用非特异性siRNA(作为阳性对照)处理的HUVEC的对照裂解物来确认所获得的条带的身份；(g)GCH1特异性siRNA显著降低细胞生物蝶呤的可检测水平和BH4与BH2+B的比值(BH4/总生物蝶呤比值)(*P<0.05；每组n＝4)；(h)在存在或不存在墨喋呤(1μM)的情况下，用非特异性GCH1 siRNA或特异性GCH1 siRNA处理的铺板在生长因子减少的matrigel上的HutMEC的代表性显微照片。通过使用Angiosys软件进行内皮管长度和分支的定量，并以微米/视野表示；(i)体外内皮管形成和分支。人子宫内皮细胞中GCH1表达的降低导致内皮细胞生长和小管形成显著减少，这可以通过补充墨喋呤(1μM)被挽救(*P<0.05；每组n＝4)。

图3示出：内皮细胞特异性Gch1敲除在妊娠小鼠中的影响。妊娠通过将未交配过的野生型雌性小鼠和Gch1^fl/flTie2cre雌性小鼠(鼠龄在10-16周龄之间)与野生型雄性小鼠交配来实现。在妊娠的E18.5天或从非妊娠小鼠收获并收集组织用于实验。(a-d)通过HPLC测量来自非妊娠小鼠和妊娠(妊娠E18.5天)野生型(即Gch1^fl/fl)和Gch1^fl/flTie2cre小鼠的主动脉、子宫动脉和血浆中生物蝶呤的水平。在非妊娠小鼠和妊娠小鼠两者中，与野生型小鼠相比，Gch1^fl/flTie2cre小鼠中的BH4和总生物蝶呤水平显著降低。在非妊娠小鼠中，野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠之间的血浆BH4无显著差异。在妊娠小鼠中，野生型和Gch1^fl/ ^flTie2cre小鼠两者的血浆BH4水平均显著降低，但在Gch1^fl/flTie2cre小鼠中降低的程度更大，因此Gch1^fl/flTie2cre小鼠中的BH4/(BH2+B)比值显著降低。在每种情况中，空心(白色)条是BH4的水平，灰色填充条是总生物蝶呤(即BH4+BH2+B)。(*P<0.05；每组n＝7-10只动物)；(e)在野生型(Gch1^fl/fl)和Gch1^fl/flTie2cre小鼠中，在妊娠之前和妊娠期间通过非侵入性尾套体积描记法(tail-cuff plethysmography)测量收缩血压。(P<0.05，比较基因型；*P<0.05，比较基线血压；每组n＝7只至10只动物)；(f)与野生型小鼠相比，Gch1^fl/ ^flTie2cre小鼠在妊娠期间增加的母体体重增加有所降低。(*P<0.05；每组n＝7-10只动物)；(g和h)野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠之间每胎胎儿的数目(胎仔数)或分娩日；(i-k)在妊娠E18.5天从野生型和Gch1^fl/flTie2cre母鼠收集胎儿并称重(*P<0.05；每组n＝来自10胎至13胎的72只至85只幼仔)；(l和m)在出生时确定来自野生型和Gch1^fl/flTie2cre母鼠的后代体重。对每胎动物的体重取平均值(*P<0.05；每组n＝来自7胎至10胎的51只至75只幼仔)。

图4示出：内皮细胞BH4缺乏对妊娠期血管功能的影响。从两种基因型的非妊娠(NP)小鼠和妊娠E18.5天的妊娠(P)小鼠分离的子宫动脉(UA)的血管功能使用线肌动描记(wire myography)来确定。(a)在来自两种基因型的妊娠UA中，在100mmHg通过长度-张力关系确定的子宫动脉直径显著增加。在来自两种基因型的妊娠UA中，响应于KCL反应(45mM)的血管收缩显著增加(*P<0.05；每组n＝6只至8只动物)；(b)来自非妊娠和妊娠的野生型和Gch1fl/flTie2cre小鼠的子宫动脉中的壁应力。非妊娠野生型和非妊娠Gch1^fl/flTie2cre小鼠之间的壁应力(响应于U46619的血管收缩比内侧面积(media area)；mN/mm²)相似。野生型和Gch1fl/flTie2cre小鼠两者的妊娠子宫动脉中的壁应力均显著降低，但Gch1^fl/ ^flTie2cre小鼠中的降低程度较低。(*P<0.05；每组n＝6只至8只动物)；(c)来自两种基因型的非妊娠小鼠和妊娠小鼠响应于U46619的收缩百分比(*P<0.05；每组n＝6只至8只动物)；(d)在存在或不存在非选择性NOS抑制剂L-NAME的情况下，妊娠子宫动脉中响应于U46619的收缩百分比(*P<0.05；每组n＝6只至8只动物)；(e)在存在或不存在L-NAME的情况下响应于乙酰胆碱(Ach)的内皮依赖性血管舒张(*P<0.05妊娠WT对照相比于妊娠WT+L-NAME；每组n＝6只至8只动物)；(f)响应于一氧化氮供体硝普钠(SNP)的内皮非依赖性血管舒张(*P<0.05；每组n＝6只至8只动物)；(g和h)响应于U46619的EC50和最大收缩；(i和j)响应于乙酰胆碱(Ach)的EC50和最大舒张；(k和i)NOS源性血管扩张剂、前列环素和内皮源性超极化因子(EDHF)在来自两种基因型的非妊娠和妊娠中的贡献。确定在存在单独的环氧合酶抑制剂吲哚美辛(10μM)，或吲哚美辛和一氧化氮合酶抑制剂L-NAME(100μM)，或吲哚美辛、L-NAME和内皮源性超极化因子阻断剂(蜂毒明肽(apamin)和卡律蝎毒素(charybdotoxin))的情况下，非妊娠的野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠、以及妊娠的野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠中响应于Ach的内皮依赖性血管舒张；(m)NOS源性血管扩张剂、前列环素和EDHF(即组合的蜂毒明肽敏感组分(SKca)和卡律蝎毒素敏感组分(IKca和BKca))在两种基因型的非妊娠和妊娠中的贡献百分比(*P<0.05；每组n＝5只至6只动物)。

图5示出：内皮细胞BH4缺乏对妊娠期胎盘尺寸及子宫动脉和螺旋动脉中的血管重塑的影响。在来自非妊娠和妊娠的野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠的子宫动脉(以100mmHg灌注固定)和胎盘的包埋切片中分析血管重塑。(a)来自妊娠E18.5天的野生型(左图)和Gch1^fl/flTie2cre小鼠(右图)的脐动脉和静脉循环的胎盘铸型(placental casts)的代表性图像；(b)来自妊娠E18.5天的野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠(右图)的脐动脉和静脉循环的胎盘铸型的代表性显微计算机断层扫描(micro-computed tomography,uCT)图像(俯视图)；(c)从妊娠E18.5天的野生型和Gch1^fl/flTie2cre母鼠收集胎盘并称重(*P<0.05；每组n＝6至8)；(f)代表性图像示出子宫动脉的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)染色。空心箭头指示内弹性膜(internal elastic lamina)，并且实心箭头指示外弹性膜。(g)来自非妊娠(NP)和妊娠(P)的野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠的子宫动脉切片中的血管重塑和内侧肥大。血管重塑通过对以下定量来评价：管腔面积(lumen area)、内侧面积(media area)、血管平滑肌(VSM)面积(通过α-SMA免疫染色)、VSM与管腔+内侧的比值和内侧与管腔的比值。使用ImagePro Plus软件进行定量(*P<0.05；每组n＝5只至6只动物)。(h)来自野生型和Gch1^fl/ ^flTie2cre小鼠的小鼠胎盘蜕膜中的代表性螺旋动脉的H&E和α-SMA染色。(i)螺旋动脉的管腔面积和内侧平滑肌细胞百分比的定量通过α-SMA免疫染色和Image Pro Plus软件进行定量。(*p<0.05；每组n＝5只动物)。

图6示出：补充墨喋呤(BH4的功能等同物)和5-MTHF挽救了有内皮细胞BH4缺乏的妊娠小鼠的妊娠引起的高血压和胎儿生长受限。Gch1^fl/flTie2cre小鼠和野生型小鼠在按时交配前持续3天和随后的整个妊娠期间，用口服BH4(200mg/kg/天，补充在食物(chow)中)，或口服BH4(200mg/kg/天)与5-MTHF(15mg/kg/天)或对照饮食处理。(a-c)来自用单独的BH4，或用BH4与5-MTHF，或对照处理的妊娠E18.5天的野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠的血浆中的BH4、BH2和BH4/(BH2+B)(BH4/总生物蝶呤比值)的HPLC分析(*P<0.05；每组n＝5只至7只动物)。(d-f)在妊娠之前和妊娠期间用单独的BH4，或BH4与5-MTHF，或对照饮食处理的野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠的收缩血压通过非侵入性尾套进行测量(*P<0.05；每组n＝5只至7只动物)。(g-i)在妊娠E18.5时确定的胎儿重量和胎盘重量(*P<0.05；每组n＝来自5胎至7胎的32只至43只胎儿)。(j-l)来自用单独的BH4，或BH4+5-MTHF，或对照饮食处理的野生型小鼠和Gch1^fl/flTie2cre小鼠的子宫动脉的血管功能通过线肌动描记进行评估。(j)用或不用BH4和5-MTHF处理的野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠响应于U46619的血管收缩。(k)在Gch1^fl/flTie2cre小鼠中，通过补充BH4和5-MTHF来挽救响应于Ach的内皮依赖性血管舒张。(l)响应于SNP的内皮非依赖性血管舒张在各组之间相似。(P<0.05(*)野生型对照相比于Gch1^fl/flTie2cre小鼠对照，(#)Gch1^fl/flTie2cre对照相比于用BH4+5-MTHF处理的Gch1^fl/ ^flTie2cre小鼠；每组n＝4只至6只动物)。

图7示出了血压正常(NT)或先兆子痫(PE)妊娠的女性中的血浆生物标志物。(a和b)血浆抗血管生成标志物可溶性内皮联蛋白(endoglin，sENG)和可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)在分娩后5天通过酶联免疫吸附测定进行测量(每组n＝107)。产后5天的sENG和sFlt-1水平低于妊娠最后一天，但密切相关，并且仍然代表妊娠水平(参见Yu等人Hypertension 2016；68:749-59)。(c、d和e)在基线(妊娠后3个月)和妊娠晚期，通过HPLC测量来自先兆子痫女性(n＝38)和血压正常对照(n＝24)的血浆中的BH4、总生物蝶呤的水平和BH4/(BH2+B)(BH4/总生物蝶呤比值)。黑色符号表示NT，蓝色符号表示PE。*表示p<0.05，PE相比于NT，或妊娠晚期相比于妊娠早期。

图8示出：妊娠Tie2cre小鼠子宫动脉和胎盘中的内皮细胞特异性的loxp位点置于基因两侧的(floxed)等位基因切除。将Tie2cre小鼠与loxp位点置于基因两侧的TdTomato报告小鼠杂交。雌性Tie2cre/TdTomato小鼠与WT雄性小鼠进行按时交配。在妊娠E18.5天收获子宫动脉和胎盘组织进行荧光显微术。红色Tdt荧光分别突出显示了(a)子宫动脉和(b)蜕膜螺旋动脉(*)中的内皮细胞。细胞核被DAPI染成蓝色。

图9示出：妊娠期野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠的肝和尿液生物蝶呤水平。(a-e)通过HPLC测量从非妊娠的和妊娠末期的野生型(WT)和Gch1^fl/flTie2cre小鼠获得的肝组织匀浆中BH4、BH2、B(总生物蝶呤)的水平。计算总生物蝶呤(BH4+BH2+B)和BH4/(BH2+B)比值(每组n＝6只动物)。(f-g)通过HPLC测量来自非妊娠的和妊娠末期的野生型(WT)和Gch1^fl/ ^flTie2cre小鼠的尿液样品中生物蝶呤的浓度。计算总生物蝶呤(BH4+BH2+B)和BH4/(BH2+B)比值(每组n＝6只动物)。(*)表示p<0.05，WT相比于Gch1^fl/flTie2cre，或妊娠相比于非妊娠(每组n＝6只动物)。

图10示出：妊娠期野生型和Gch1_fl/flTie2cre小鼠中的尿蛋白和血浆蛋白及肝酶水平。(a-c)通过临床化学分析仪测量从非妊娠的和妊娠末期的野生型(WT)和Gch1^fl/ ^flTie2cre小鼠获得的尿液中肌酐和总蛋白的水平。计算尿蛋白/肌酐比值(每组n＝6只动物)。(d-g)通过临床化学分析仪测量从非妊娠的和妊娠末期的野生型(WT)和Gch1^fl/ ^flTie2cre小鼠获得的血浆中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酐和白蛋白的水平(每组n＝6只动物)。

图11示出：妊娠期野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠的尿生物蝶呤/肌酐比值和血浆生物蝶呤/尿生物蝶呤比值。(a-e)从非妊娠的和妊娠末期的野生型(WT)和Gch1^fl/flTie2cre小鼠获得的尿BH4/肌酐比值、BH2/肌酐比值、B/肌酐比值、总生物蝶呤/肌酐比值(每组n＝6只动物)。*表示p<0.05，WT相比于Gch1^fl/flTie2cre，或妊娠相比于非妊娠。(f-g)从非妊娠和妊娠末期的野生型(WT)和Gch1^fl/flTie2cre小鼠获得的血浆BH4/尿BH4比值和血浆总生物蝶呤与尿总生物蝶呤比值(每组n＝6只动物)。(*)表示p<0.05，WT相比于Gch1^fl/flTie2cre，或妊娠相比于非妊娠。

图12示出：Gch1^fl/flTie2cre小鼠中的肾组织学。从妊娠的野生型(WT)小鼠和Gch1^fl/flTie2cre小鼠收获肾、固定并处理用于组织学。切片用高碘酸-Schiff(PAS)、苏木精和伊红(H&E)或Masson三色染色法染色。尺寸和面积使用Image J来测量。(a)来自WT和Gch1^fl/flTie2cre的肾矢状切面的宏观图像。(b-f)肾长度、宽度、总面积以及皮质面积和髓质面积的组织学测量。(g)来自WT和Gch1^fl/flTie2cre小鼠的肾小球的组织学图像(x40放大，比例尺＝30um)。(h和i)从多个肾小球对肾小球面积和Bowman间隙面积进行定量(每组n＝6只至7只动物)。

图13示出：在妊娠最后一天期间自由行动的野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠中的心血管和行为活动。用遥测系统对清醒小鼠的血压和心率进行24小时遥测记录。以1min时间间隔连续绘制平均动脉血压和心率的图，从0000点整至次日1200点整持续24hr。(a-e)示出了妊娠E17.5-18.5天之间的平均动脉压、收缩压、舒张压、心率和活动计数的24小时记录。阴影区域代表关灯时的黑暗时段(2000点整至次日0800点整)。

图14示出：野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠的妊娠期遥测血压。雌性小鼠(野生型(WT)小鼠或Gch1^fl/flTie2cre小鼠)或WT雄性小鼠(以产生遗传匹配胎)，并在妊娠期间通过血压遥测测量血压。(a-c)在妊娠期间测量平均动脉压、收缩压和舒张压。与Gch1^fl/ ^flTie2cre小鼠交配的Gch1^fl/flTie2cre小鼠雌性小鼠在妊娠E18.5天的收缩压和平均血压两者均显著高于野生型同胎对照。(分别为n＝5和n＝7)。表示p<0.05，相比于WT；(*)表示p<0.05，相比于基线血压。(d-e)Gch1^fl/flTie2cre或WT雌性小鼠在整个妊娠期间的心率和活动(分别为n＝5和n＝7)。

图15示出：基线血压匹配的野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠的妊娠期血压变化。雌性小鼠(野生型(WT)或Gch1^fl/flTie2cre)与Gch1^fl/flTie2cre或WT雄性小鼠交配(以产生遗传匹配胎)，并且在妊娠期间通过尾套体积描记法每3天一次测量血压。(a)WT或Gch1_fl/ _flTie2cre雌性小鼠在妊娠早期(e2.5)和妊娠晚期(e18.5)之间的平均血压变化(分别为n＝5和n＝6)。(b)选自队列以确保基线血压相等的WT或Gch1^fl/flTie2cre雌性小鼠在整个妊娠期间的血压谱(分别为n＝5和n＝6)。即使在该基线协变量调整后，Gch1^fl/flTie2cre小鼠妊娠期间的BP增加与WT小鼠相比仍然大得多。(*)表示p<0.05，相比于WT；表示p<0.05，相比于基线血压。

图16示出：具有内皮细胞Gch1杂合性缺失的小鼠(即Gch1^fl/+Tie2cre小鼠)妊娠期的生物蝶呤水平。具有内皮细胞Gch1杂合性缺失的小鼠(即Gch1^fl/+Tie2cre小鼠)通过将Gch1^fl/flTie2cre小鼠与WT(即Gch1^+/+)小鼠杂交产生。雌性Gch1^fl/+Tie2cre小鼠与WT雄性小鼠交配。(a)基因组PCR显示在Gch1^fl/+(WT)小鼠和Gch1^fl/+Tie2cre小鼠两者中均存在Gch1floxed和WT等位基因。(b-u)通过HPLC测量从妊娠末期的野生型(WT)和Gch1^fl/+Tie2cre获得的组织匀浆中的BH4、BH2、B(总生物蝶呤)的水平。计算总生物蝶呤(BH4+BH2+B)和BH4/(BH2+B)比值。示出了主动脉(b-f)、肺(g-k)、肝(l-p)和妊娠子宫动脉(q-u)中的生物蝶呤水平。(*)表示p<0.05，相比于WT。

图17示出：妊娠的具有内皮细胞Gch1杂合性缺失的小鼠(即Gch1^fl/+Tie2cre小鼠)的血压和胎儿生长。(a和b)基线(妊娠前)的血压和心率(每组n＝6只至8只动物)。(c和d)妊娠前和妊娠期间的血压和心率(每组n＝6只至8只动物)。(e)野生型和Gch1^fl/+Tie2cre小鼠之间的胎仔数(胚胎的数目)没有差异(每组n＝6只至8只动物)。(f-h)与野生型雌性相比，来自妊娠Gch1^fl/+Tie2cre的妊娠第18.5天的胎儿显著较小。(*)表示p<0.05，相比于WT；每组n＝6只至8只动物。

图18示出：来自妊娠期野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠的器官重量：器官重量：(a)心脏、(b)肺、(c)肝、(d)肾和(e)脾，来自非妊娠小鼠和妊娠(妊娠E18.5天)的野生型和Gch1_fl/flTie2cre小鼠。(*)表示p<0.05；每组n＝6只动物。

图19示出：用于研究妊娠期母体Gch1缺失的产生匹配胎的繁殖策略：a)雌性WT(即Gch1_fl/fl)小鼠与雄性Gch1^fl/flTie2cre小鼠杂交，或雌性Gch1_fl/flTie2cre小鼠与雄性WT小鼠杂交的繁殖对的示意图。两种繁殖对均产生相同的同胎仔，包括1:1比例的WT或Gch1_fl/ _flTie2cre后代，关键的区别在于遗传匹配的后代是由WT母鼠或Gch1^fl/flTie2cre母鼠所生。(b)与野生型雄性或Gch1_fl/flTie2cre雄性交配的野生型雌性在妊娠之前和妊娠期间通过非侵入性尾套测量收缩血压。(每组n＝7只至10只动物)。(c和d)按照胎儿基因型确定来自Gch1^fl/flTie2cre母鼠的胎儿重量和胎盘重量。在来自Gch1^fl/flTie2cre母鼠的野生型胎儿和Gch1^fl/flTie2cre胎儿之间，胎儿重量和胎盘重量均无差异。(e)野生型和Gch1^fl/ ^flTie2cre母鼠之间在分娩时胎仔数无差异。(f)来自野生型和Gch1^fl/flTie2cre母鼠的活的幼仔在出生时被收集和测量。

图20示出：来自野生型和Gch1^fl/flTie2cre母鼠的雄性和雌性胎儿的胎儿重量和胎盘重量。(a)来自野生型和Gch1^fl/flTie2cre母鼠的胚胎的性别代表使用检测Y染色体的Zfy引物进行基因分型。(b和c)来自野生型和Gch1^fl/flTie2cre母鼠的胎儿重量和胎盘重量在妊娠E18.5天收集，并按照胎儿基因型和性别称重。与野生型母鼠相比，来自妊娠Gch1^fl/ ^flTie2cre母鼠的雄性胎儿和雌性胎儿显著较小。在胎儿重量降低方面没有雄性-雌性差异。(*)表示p<0.05；25只雄性和22只雌性来自n＝4的WT母鼠和n＝4的Gch1^fl/flTie2cre母鼠。

图21示出：来自妊娠E18.5天的野生型和Gch1_fl/flTie2cre小鼠的子宫动脉中的被动壁张力曲线。来自妊娠的野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠的子宫动脉被解剖，并将2mm节段安置在线肌动描记仪上的无钙KHB缓冲液中。与野生型对照相比，来自Gch1^fl/flTie2cre小鼠的子宫动脉的被动张力显著增加，表明这些血管中的向内重塑或改变的柔度(compliance)。(*)表示p<0.05，相比于WT；每组n＝5只至6只动物。

图22示出：来自非妊娠和妊娠E18.5天的妊娠的野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠的主动脉中的血管舒缩功能。雌性小鼠(野生型(WT)或Gch1^fl/flTie2cre)与Gch1^fl/flTie2cre或WT雄性小鼠交配以产生遗传匹配胎。从两种基因型的非妊娠(NP)小鼠和E18.5的妊娠(P)小鼠分离的子宫动脉(UA)的血管功能使用线肌动描记来确定。(a)响应于KCL反应的绝对收缩(mN)。(b)来自两种基因型的非妊娠和妊娠的小鼠响应于苯肾上腺素的收缩百分比。(c和d)在存在或不存在L-NAME的情况下响应于乙酰胆碱(Ach)的内皮依赖性血管舒张。(e)响应于一氧化氮供体硝普钠(SNP)的内皮非依赖性血管舒张。(f和g)响应于苯肾上腺素(PE)的EC₅₀和最大收缩。(h和i)响应于乙酰胆碱(Ach)的EC₅₀和最大舒张。(*)表示p<0.05，妊娠Gch1^fl/flTie2cre相比于妊娠WT；(#)表示p<0.05，非妊娠小鼠相比于妊娠小鼠(每组n＝6只动物)。

图23示出：前列环素、eNOS源性血管扩张剂和EDHF在妊娠E18.5天的妊娠的野生型和Gch1^fl/flTie2cre子宫动脉中的贡献。对来自妊娠的WT小鼠(a)和Gch1^fl/flTie2cre小鼠(b)的子宫动脉的等长张力研究使用线肌动描记检查。在存在单独的环氧合酶抑制剂吲哚美辛(10μM)，或吲哚美辛和一氧化氮合酶抑制剂L-NAME(100μM)，或吲哚美辛、L-NAME和EDHF阻断剂(蜂毒明肽和卡律蝎毒素)的情况下，确定响应于乙酰胆碱(ACh)的内皮依赖性血管舒张。(c)蜂毒明肽敏感组分(SKca)、卡律蝎毒素敏感组分(IKca和BKca)、以及蜂毒明肽和卡律蝎毒素敏感组分的组合(即EDHF)的贡献百分比。(*)表示P<0.05，每组n＝5只动物。

图24示出：从妊娠期间用墨喋呤(BH4的功能等同物)和5-MTHF处理的妊娠的野生型和Gch1^fl/flTie2cre分离的子宫动脉中的BH4测量。妊娠的Gch1^fl/flTie2cre和野生型小鼠在按时交配前持续3天和随后的整个妊娠期间，用口服BH4(200mg/kg/天)补充，或口服BH4(200mg/kg/天)与5-MTHF(15mg/kg/天)或对照饮食处理。在妊娠E18.5天收获子宫动脉。(a-e)通过HPLC测量从妊娠E18.5天用单独的BH4，或BH4与5-MTHF，或对照处理的野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠获得的子宫动脉中的BH4、BH2、B(总生物蝶呤)水平(*)P<0.05，每组n＝5只至7只动物。

图25示出：妊娠E18.5天的野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠中的胎盘GTPCH和BH4测量。(a)代表性免疫印迹示出来自野生型(WT)和Gch1^fl/flTie2cre小鼠的胎盘中的GTPCH蛋白。蛋白印迹对照包括sEND细胞(小鼠内皮细胞系)。(b)与WT同胎仔相比，来自Gch1^fl/ ^flTie2cre小鼠的胎盘中通过HPLC测量的胎盘BH4和总生物蝶呤显著降低(*)表示P<0.05，每组n＝5-7只动物；对于每只动物，选择2-3个胎儿基因型未知的胎盘进行BH4测量。

图26示出：5-MTHF而不是叶酸的补充挽救了有内皮细胞BH4缺乏的妊娠小鼠中的妊娠引起的高血压。Gch1^fl/flTie2cre(方形)和野生型(圆形)小鼠在按时交配前持续3天和随后的整个妊娠期间，用口服叶酸(15mg/kg/天，补充在食物中)或口服5-MTHF(15mg/kg/天)或对照饮食处理。(a-c)在妊娠之前和妊娠期间用单独的叶酸(每组每只动物n＝3)或5-MTHF(每组n＝5-7只动物)或对照饮食(每组n＝5只动物)处理的野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠的收缩血压通过非侵入性尾套进行测量。(*)表示P<0.05，野生型对照相比于Gch1^fl/ ^flTie2cre小鼠对照；(#)表示P<0.05，非妊娠Gch1^fl/flTie2cre小鼠相比于妊娠Gch1^fl/ ^flTie2cre小鼠。

图27示出了5MTHF补充对小鼠内皮细胞(sEnd.1)中BH4水平的影响。sEnd.1细胞在37℃暴露于单独的MTX(1μm)，或单独的5MTHF(10μm)，或MTX+5MTHF，持续16h，并且细胞内生物蝶呤水平通过HPLC进行定量。(*，p<0.05比较对照与MTX；#，p<0.05比较MTX与MTX+5MTHF；对于所有实验n＝6)。

图28示出了叶酸补充在小鼠内皮细胞中的影响。sEnd.1细胞在37℃暴露于单独的MTX(1μm)，或单独的叶酸(10μm)，或MTX+叶酸，持续16h，并且细胞内生物蝶呤水平通过HPLC进行定量。(*，p<0.05，比较对照与MTX，对于所有实验n＝3)。

图29示出了5MTHF补充对小鼠内皮细胞系中GTPCH和eNOS蛋白表达的影响。sEnd.1细胞在37℃暴露于单独的MTX(1μm)，或单独的5MTHF(10μm)，或MTX+5MTHF，持续16h，并且细胞内生物蝶呤水平通过HPLC进行定量。(A)代表性免疫印迹与相应的定量数据(B)示出在单独的MTX、单独的5MTHF或5MTHF+MTX处理的内皮细胞中的GTPCH蛋白。β-微管蛋白(上样对照)的相应免疫印迹(*，p<0.05，每组n＝6)。

图30示出了抗坏血酸补充在小鼠内皮细胞中的影响。sEnd.1细胞在37℃暴露于单独的MTX(1μm)，或单独的抗坏血酸(10μm)，或MTX+5MTHF，持续16h，并且细胞内生物蝶呤水平通过HPLC进行定量。(*，p<0.05，每组n＝3-6)。

图31示出了使用HPLC测量DHF、THF和5MTHF。sEnd.1细胞在37℃暴露于单独的MTX(1μm)，或单独的5MTHF(10μm)，或MTX+5MTHF，持续16h，并且细胞内DHF、THF和5MTHF水平通过HPLC进行定量。(*，p<0.05比较对照与MTX；#，p<0.05比较MTX与MTX+5MTHF；对于所有实验n＝6)。

图32示出了5MTHF补充对小鼠内皮细胞中ROS产生的影响。通过二氢乙锭(DHE)高效液相色谱(HPLC)检测超氧化物和其他活性氧种类(ROS)的产生。分别通过2-羟基乙锭(2-HE)和乙锭测量超氧化物和其他ROS的产生。sEnd.1细胞在37℃暴露于单独的MTX(1μm)，或单独的5MTHF(10μm)，或MTX+5MTHF，持续16h，并且2-HE和乙锭水平通过HPLC进行定量。(*，p<0.05；对于所有实验n＝6)。

图33示出了叶酸补充对小鼠内皮细胞中ROS产生的影响。通过二氢乙锭(DHE)高效液相色谱(HPLC)检测超氧化物和其他活性氧种类(ROS)的产生。分别通过2-羟基乙锭(2-HE)和乙锭测量超氧化物和其他ROS的产生。sEnd.1细胞在37℃暴露于单独的MTX(1μm)，或单独的叶酸(10μm)，或MTX+5MTHF，持续16h，并且2-HE和乙锭水平通过HPLC进行定量。(*，p<0.05；对于所有实验n＝3)。

图34示出了5MTHF补充对小鼠内皮细胞中NOS活性的影响。14C精氨酸向14C瓜氨酸的转化被用作内皮型一氧化氮合酶活性(eNOS)的量度。sEnd.1细胞在37℃暴露于单独的氨甲蝶呤(MTX；1μm)，或单独的5MTHF(10μm)，或MTX+5MTHF，持续16h，并且14C精氨酸向14C瓜氨酸的转化通过HPLC进行定量。(*，p<0.05；对于所有实验n＝6)。

图35示出了墨喋呤(BH4的功能前体)补充在人内皮细胞中的影响。HUVEC在37℃暴露于单独的氨甲蝶呤(MTX；1μm)，或单独的墨喋呤(1μm)，或MTX+墨喋呤，持续16h，并且细胞内生物蝶呤水平通过HPLC进行定量。(*，p<0.05比较对照与MTX；#，p<0.05比较MTX与MTX+5MTHF；对于所有实验n＝6)。

图36示出了Arcofolin(5-MTHF)补充增加了人内皮细胞中的BH4水平。HUVEC在37℃暴露于单独的MTX(1μm)，或单独的5MTHF(10μm)，或MTX+5MTHF，持续16h，并且细胞内BH4和氧化型生物蝶呤(BH2和生物蝶呤)通过高效液相色谱(HPLC)确定。(*，p<0.05比较对照与MTX；#，p<0.05比较MTX与MTX+5MTHF；对于所有实验n＝6)。

图37示出了5MTHF补充对人内皮细胞中ROS产生的影响。通过二氢乙锭(DHE)高效液相色谱(HPLC)检测超氧化物和其他活性氧种类(ROS)的产生。分别通过2-羟基乙锭(2-HE)和乙锭测量超氧化物和其他ROS的产生。HUVEC细胞在37℃暴露于单独的MTX(1μm)，或单独的5MTHF(10μm)，或MTX+5MTHF，持续16h，并且2-HE和乙锭水平通过HPLC进行定量。(*，p<0.05；对于所有实验n＝6)。

图38示出了5MTHF补充对人内皮细胞中ROS产生的影响的另外的数据。通过二氢乙锭(DHE)高效液相色谱(HPLC)检测超氧化物和其他活性氧种类(ROS)的产生。分别通过2-羟基乙锭(2-HE)和乙锭测量超氧化物和其他ROS的产生。HUVEC细胞在37℃暴露于单独的MTX(1μm)，或单独的5MTHF(10μm)，或MTX+5MTHF，持续16h，并且2-HE和乙锭水平通过HPLC进行定量。(*，p<0.05；对于所有实验n＝6)。

图39示出了在妊娠10.5天(妊娠中期)补充5MTHF对有内皮细胞BH4缺乏的妊娠小鼠中的妊娠引起的高血压的影响。Gch1fl/flTie2cre和野生型小鼠在妊娠10.5天用口服5MTHF(15mg/kg/天)或对照饮食处理。在妊娠之前和妊娠期间，通过非侵入性尾套测量野生型(WT)和Gch1fl/flTie2cre小鼠中的收缩血压。图示出了来自每组n＝3只至6只动物的平均血压，在整个妊娠期间在所示时间点测量(*P<0.05比较基因型；#P<0.05比较基线血压)。

图40示出了在妊娠10.5天(妊娠中期)补充5MTHF挽救了有内皮细胞BH4缺乏的妊娠小鼠中的妊娠引起的高血压和胎儿生长受限。(A)在妊娠之前和妊娠期间，通过非侵入性尾套测量野生型(WT)和Gch1fl/flTie2cre小鼠中的收缩血压，其中每个数据点示出在时间点基线(妊娠前)或E18.5(妊娠第18.5天)来自每只动物的平均血压。(*P<0.05比较基因型；#P<0.05比较基线血压；每组n＝3只至6只动物)(B)示出了用5-MTHF或对照饮食处理后野生型(WT)和Gch1fl/flTie2cre小鼠的胎仔数(出生的幼仔的数目)、胎儿重量和胎盘重量。

图41示出了在妊娠16.5天(妊娠晚期)补充5MTHF挽救了有内皮细胞BH4缺乏的妊娠小鼠中的妊娠引起的高血压。Gch1fl/flTie2cre和野生型小鼠在妊娠16.5天用口服5MTHF(15mg/kg/天)或对照饮食处理。在妊娠之前和妊娠期间，通过非侵入性尾套测量野生型(WT)和Gch1fl/flTie2cre小鼠的收缩血压。(*P<0.05比较基因型；#P<0.05比较基线血压；每组n＝6只至7只动物)。

描述

现将参考本文上面定义的方面和实施方案的特定共同特征来描述本发明。任何部分中的任何特征可以与任何其他部分中的任何其他特征组合，并且以任何可行的组合与任何方面或实施方案组合。

应当注意，术语“一(a)”或“一(an)”个实体是指一个或更多个该实体。因此，术语“一(a)”(或“一(an)”)、“一(a)或更多”和“至少一(an)”在本文中可以互换使用。

如本文所使用的，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施两者，其中目的是防止或减缓(减轻)不期望的生理变化或病症。有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的减轻、病症程度的减小、疾病状态的稳定(即，不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或减轻、以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测到的还是不可检测到的。“治疗”也可以意指与未接受治疗的预期生存期相比，延长生存期。需要治疗的人包括那些已经患有状况或病症的人，以及那些容易患有状况或病症的人，或者那些需要预防状况或病症的人。

“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指任何需要诊断、预后或治疗的受试者，尤其是哺乳动物受试者，除非受试者被定义为“健康受试者”。哺乳动物受试者包括人；家畜；农场动物；诸如犬、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛类(cattle)、奶牛(cow)等。术语“受试者”在下文中进一步定义。

还原型叶酸

本发明基于这样的发现，即还原型叶酸，单独或任选地与BH4、其前体或功能等同物联合，可以治疗与低BH4生物利用度相关的病症。

如本文中使用的术语“叶酸”是指基于通过肽键与谷氨酸偶联的蝶酸(pteroate)基团的化合物。如本文使用的叶酸的优选代表基于叶酸骨架，即分别为蝶酰基(pteroyl)-谷氨酸，N-[4-[[(2-氨基-1,4-二氢-4-氧代-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸及其衍生物。适当地，还原型叶酸可以选自：二氢叶酸(DHF)；5-甲酰基四氢叶酸(5-FTHF)；四氢叶酸(THF)；5,10-亚甲基四氢叶酸(5,10-CH₂-THF)；5,10-次甲基四氢叶酸(5,10-CH-THF)；10-甲酰基四氢叶酸(10-FTHF)或5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)或其药学上可接受的盐或其聚谷氨酸盐。在优选的实施方案中，叶酸是其天然立体异构体形式，诸如5-甲基-(6S)-四氢叶酸、5,10-次甲基-(6R)-四氢叶酸或5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸。

适当地，还原型叶酸可选自：5,10-CH-THF、5-FTHF、10-FTHF和5-MTHF或其药学上可接受盐。

在一种实施方案中，还原型叶酸是5-MTHF或其药学上可接受的盐。在一种实施方案中，还原型叶酸是5-MTHF。

在一种实施方案中，还原型叶酸是其天然立体异构体形式。在一种实施方案中，还原型叶酸是5-甲基-(6S)-四氢叶酸。

如本文使用的5-MTHF是指5-甲基四氢叶酸，另外称为：levomefolic acid、L-5-MTHF、L-甲基叶酸、L-5-甲基四氢叶酸、(6S)-5-甲基四氢叶酸或(6S)-5-MTHF。

适当地，还原型叶酸可以是还原型叶酸的药学上可接受的盐。药学领域的技术人员将知悉合适的药学上可接受的盐。合适的药学上可接受的盐可以包括钙、镁、钠、钾或铵盐。5-MTHF的合适的钙盐是合适钠盐是/> BH4、其前体或功能等同物

本发明基于还原型叶酸可以用于保护BH4免于氧化成BH2的发现。单独提供还原型叶酸，或与BH4、其前体或功能等同物联合提供还原型叶酸，可以提高体内BH4水平和治疗与低BH4生物利用度相关的病症。

如本文使用的‘BH4’是指四氢生物蝶呤，另外称为沙丙蝶呤(sapropterin)。

适当地，BH4或其前体或功能等同物可以作为药学上可接受的盐提供。药学领域的技术人员将知悉合适的药学上可接受的盐。与BH4相关的合适的药学上可接受的盐可以包括BH4的无机酸盐或有机酸盐。合适的BH4盐包括BH4的乙酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、酒石酸盐、富马酸盐和扁桃酸盐。合适的BH4盐酸盐是沙丙蝶呤二盐酸盐(BH4*2HCL)，另外称为或/>

如本文使用的‘前体’是指可以通过一种或更多种代谢反应转化为指定化学物质的任何化合物。适当地，BH4前体可以包括可以通过一种或更多种代谢反应、适当地一种或更多种酶促反应转化为BH4的任何化合物。适当地，BH4前体可以包括蝶呤代谢途径内的任何化合物。适当地，BH4前体可以包括BH4生物合成途径内的任何化合物。适当地，BH4前体可以包括，例如：GTP、NH2TP、PTP、氧代-PH4、7,8-BH2、HO-BH4、q-BH2、L-精氨酸和/或L-瓜氨酸。

如本文使用的‘功能等同物’是指能够或确实执行与指定化学物质在体内执行的相同功能的任何化合物。适当地，BH4功能等同物可以包括能够作为羟化酶或合酶的辅因子发挥作用的任何化合物。适当地作为一氧化氮合酶的辅因子，或适当地作为芳族氨基酸羟化酶的辅因子，适当地作为生物蝶呤依赖性芳族氨基酸羟化酶的辅因子，诸如例如：苯丙氨酸4-羟化酶、酪氨酸3-羟化酶和色氨酸5-羟化酶。适当地，BH4的功能等同物可以包括例如：新蝶呤、墨蝶呤(sepiapterin)、生物蝶呤和7-生物蝶呤(primapterin)。

适当地，功能等同物也可以是BH4的前体。

在一种实施方案中，BH4、其前体或功能等同物包括墨喋呤。在一种实施方案中，BH4、其前体或功能等同物以墨喋呤提供。

与低BH4生物利用度相关的病症

本发明基于预防或治疗与低BH4生物利用度相关的病症。

低生物利用度意指当与健康受试者相比时BH4的低水平。适当地，当与健康受试者相比时，BH4的低水平可以是在任何组织或细胞类型中。适当地，当与健康受试者相比时，BH4的低水平可以是在内皮细胞中。因此，适当地，低BH4生物利用度是指BH4生物利用度的降低，适当地是BH4的低水平。

在一种实施方案中，低BH4生物利用度包括全身低BH4生物利用度或局部低BH4生物利用度。适当地，局部低BH4生物利用度可以包括在组织水平或细胞水平的BH4降低，例如特定组织或细胞中的低组织BH4生物利用度或低细胞BH4生物利用度。在一种实施方案中，低BH4生物利用度可以包括低内皮BH4生物利用度。适当地，低BH4生物利用度可由BH4缺乏引起。适当地，低BH4生物利用度也可由遗传性BH4缺乏引起。可选地或另外地，低BH4生物利用度可由生物化学因素引起。例如BH4向细胞中的转运或BH4向细胞中的摄取受损，或者例如BH4氧化增加或BH4减少。

在一种实施方案中，病症可以是BH4缺乏(四氢生物蝶呤缺乏)本身或与BH4缺乏相关的病症。适当地，本文中对‘低BH4生物利用度’的任何提及同样可以指‘BH4缺乏’。适当地，这种缺乏或低生物利用度可以由相似或相同的原因或者原因的组合引起。

适当地，低BH4生物利用度可由受损的BH4合成引起。适当地，受损的BH4合成可由适当地在蝶呤生物合成途径内、适当地在BH4生物合成途径内受损的酶活性引起。适当地，受损的BH4合成可由蝶呤生物合成途径内的一种或更多种受损的酶引起。适当地，受损的BH4合成也可由BH4生物合成途径内的一种或更多种受损的酶引起。BH4缺乏也可由酶二氢生物蝶呤还原酶(DHPR)的缺乏引起，该酶的活性是将醌类-二氢生物蝶呤补充回其四氢生物蝶呤形式所必需的。

因此，适当地，与低BH4生物利用度相关的病症可与受损的BH4合成相关的病症基本相同。因此，适当地，与低BH4生物利用度相关的病症可与蝶呤生物合成途径内一种或更多种受损的酶相关的病症基本相同。因此，适当地，与低BH4生物利用度相关的病症也可与BH4生物合成途径内的一种或更多种受损的酶相关的病症基本相同。

适当地，本发明用于预防或治疗由蝶呤生物合成途径内的一种或更多种酶的活性受损引起的与低BH4生物利用度相关的病症。适当地，本发明还用于预防或治疗由BH4生物合成途径内的一种或更多种酶的活性受损引起的与低BH4生物利用度相关的病症。适当地，本发明用于预防或治疗由蝶呤生物合成途径内的一种或更多种酶的活性受损引起的低BH4生物利用度。适当地，本发明还用于预防或治疗由BH4生物合成途径内的一种或更多种酶的活性受损引起的低BH4生物利用度。适当地，本发明用于预防或治疗由蝶呤生物合成途径内的一种或更多种酶的活性受损引起的病症。适当地，本发明用于预防或治疗由BH4生物合成途径内的一种或更多种酶的活性受损引起的病症。

蝶呤或BH4生物合成途径内的酶包括：GTP环水解酶I(GTPCH)、6-丙酮酰-四氢蝶呤合酶(PTPS)、墨喋呤还原酶(SP)、羰基还原酶(CR)、醛酮还原酶(AKR)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、二氢蝶啶还原酶(DHPR)、蝶呤-4a-甲醇胺脱水酶(PCD)和内皮型NOS(eNOS)。

适当地，本发明用于预防或治疗由以下中的一种或更多种的活性受损引起的与蝶呤或BH4缺乏相关的病症：GTP环水解酶I(GTPCH)、6-丙酮酰-四氢蝶呤合酶(PTPS)、墨喋呤还原酶(SP)、羰基还原酶(CR)、醛酮还原酶(AKR)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、二氢蝶啶还原酶(DHPR)、蝶呤-4a-甲醇胺脱水酶(PCD)和内皮型NOS(eNOS)。

适当地，本发明用于预防或治疗由以下中的一种或更多种的活性受损引起的蝶呤或BH4缺乏：GTP环水解酶I(GTPCH)、6-丙酮酰-四氢蝶呤合酶(PTPS)、墨喋呤还原酶(SP)、羰基还原酶(CR)、醛酮还原酶(AKR)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、二氢蝶啶还原酶(DHPR)、蝶呤-4a-甲醇胺脱水酶(PCD)和内皮型NOS(eNOS)。适当地，本发明用于预防或治疗由以下中的一种或更多种的活性受损引起的病症：GTP环水解酶I(GTPCH)、6-丙酮酰-四氢蝶呤合酶(PTPS)、墨喋呤还原酶(SP)、羰基还原酶(CR)、醛酮还原酶(AKR)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、二氢蝶啶还原酶(DHPR)、蝶呤-4a-甲醇胺脱水酶(PCD)和内皮型NOS(eNOS)。

由蝶呤或BH4生物合成途径中的一种或更多种酶的活性受损引起的病症包括：BH4缺乏(四氢生物蝶呤缺乏)、GTP环水解酶缺乏、多巴反应性肌张力障碍、6-丙酮酰-四氢蝶呤合酶缺乏、墨喋呤还原酶缺乏、二氢叶酸还原酶缺乏、二氢蝶啶还原酶缺乏和蝶呤-4a-甲醇胺脱水酶缺乏。因此，适当地，本发明用于预防或治疗这些病症中的任一种。

在一种实施方案中，本发明用于预防或治疗由GTP环水解酶I(GTPCH)活性受损、适当地GTP环水解酶缺乏引起的与低BH4生物利用度相关的病症。在一种实施方案中，本发明用于预防或治疗由GTP环水解酶I(GTPCH)活性受损、适当地GTP环水解酶缺乏引起的低BH4生物利用度。在一种实施方案中，本发明用于预防或治疗由GTP环水解酶I(GTPCH)活性受损、适当地GTP环水解酶缺乏引起的的病症。

在一种实施方案中，本发明用于预防或治疗GTP环水解酶缺乏。

适当地，与低BH4生物利用度相关的病症也可以包括涉及依赖于BH4作为辅因子的酶的病症。因此，适当地，与低BH4生物利用度相关的病症可以与生物蝶呤依赖性酶相关的病症基本相同。

适当地，与低BH4生物利用度相关的病症可以包括与生物蝶呤依赖性酶相关的病症。适当地，本发明用于预防或治疗与一种或更多种生物蝶呤依赖性酶的活性受损相关的病症。

适当地，与低BH4生物利用度相关的病症可以包括与生物蝶呤依赖性羟化酶或合酶相关的病症。合适的生物蝶呤依赖性羟化酶或合酶可以选自苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶、色氨酸羟化酶1、色氨酸羟化酶2和一氧化氮合酶。

适当地，与低BH4生物利用度相关的病症可以选自与苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶、色氨酸羟化酶1或色氨酸羟化酶2或一氧化氮合酶的活性受损相关或由其引起的病症。

适当地，与苯丙氨酸羟化酶活性受损相关或由其引起的病症包括苯丙酮尿症(PKU)、肝硬化和脂肪肝疾病。

适当地，与酪氨酸羟化酶活性受损相关或由其引起的病症包括：酪氨酸羟化酶缺乏、Segawa肌张力障碍、帕金森病、婴儿帕金森症(infantile parkinsonism)、多巴反应性肌张力障碍、精神分裂症、阿尔茨海默病、双相障碍、孤独症、ADHD和抑郁症。

适当地，与色氨酸羟化酶1或色氨酸羟化酶2的活性受损相关或由其引起的病症包括骨质疏松症、高血压、ADHD、精神分裂症、孤独症、抑郁症、双相障碍、人格障碍。

适当地，与一氧化氮合酶活性受损相关或由其引起的病症可以包括与神经元型一氧化氮合酶(nNOS或NOS1)、内皮型NOS(eNOS或NOS3)或诱导型NOS(iNOS或NOS2)的活性受损相关或由其引起的病症。适当地，与一氧化氮合酶活性受损相关或由其引起的病症可以包括抑郁症、双相障碍、脑卒中、帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化、糖尿病、心肌肥大、心肌病、高血压、动脉粥样硬化、缺血-再灌注、妊娠引起的高血压、胎盘功能不全、胎儿生长受限和先兆子痫。

在一种实施方案中，本发明用于预防或治疗由苯丙氨酸-4羟化酶(PAH)活性受损引起的与低BH4生物利用度相关的病症，适当地苯丙酮尿症(PKU)。在一种实施方案中，本发明用于预防或治疗由苯丙氨酸-4羟化酶(PAH)活性受损引起的病症，适当地苯丙酮尿症(PKU)。

在一种实施方案中，本发明用于预防或治疗由内皮型一氧化氮合酶活性受损引起的与低BH4生物利用度相关的病症，适当地先兆子痫。在一种实施方案中，本发明用于预防或治疗由内皮型一氧化氮合酶活性受损引起的病症，适当地先兆子痫。

适当地，上述生物蝶呤依赖性酶中的任一种的活性受损由低BH4生物利用度引起。因此，适当地，活性受损可以是BH4介导的活性受损。适当地，上述病症或疾病中的任一种由低BH4生物利用度引起。因此，适当地，疾病或病症可以与低BH4生物利用度相关或源自低BH4生物利用度。适当地，低BH4生物利用度本身可以由BH4缺乏引起。

适当地，本发明可以用于预防或治疗与低BH4生物利用度相关的心脏疾病或病症、肝疾病或病症、神经疾病或病症，或者血管疾病或病症。

与低BH4生物利用度相关的合适的心脏疾病包括：糖尿病、心肌肥大、心肌病和缺血再灌注。

与低BH4生物利用度相关的合适的肝疾病包括：代谢病症，诸如苯丙酮尿症、肝硬化和脂肪肝疾病。

与低BH4生物利用度相关的合适的神经疾病包括：孤独症、ADHD、帕金森病、神经病、肌萎缩侧索硬化、肌张力障碍、抑郁症、阿尔茨海默病，和精神状况诸如精神分裂症、双相障碍、人格障碍。

与低BH4生物利用度相关的合适的血管疾病包括：高血压、动脉粥样硬化、脑卒中、妊娠引起的高血压、胎盘功能不全、胎儿生长受限和先兆子痫。

适当地，本发明可以用于预防或治疗妊娠相关的病症。适当地，本发明可以用于预防或治疗与低BH4生物利用度相关的妊娠相关的病症。

在一种实施方案中，与低BH4生物利用度相关的病症是血管疾病。在一种实施方案中，与低BH4生物利用度相关的病症是内皮病症。在一种实施方案中，与低BH4生物利用度相关的病症是妊娠相关的血管疾病。在一种实施方案中，与低BH4生物利用度相关的病症是妊娠相关的内皮病症。

在一种优选的实施方案中，与低BH4生物利用度相关的病症是先兆子痫，因此本发明用于治疗或预防先兆子痫。

在一种实施方案中，与低BH4生物利用度相关的病症可以是复发性病症。在一种实施方案中，先兆子痫可以是复发性的。适当地，复发性先兆子痫发生在先前妊娠中经历过先兆子痫的女性中。

预防或治疗

本发明涉及还原型叶酸，任选地与BH4、其前体或功能等同物联合，在预防或治疗与低BH4生物利用度相关的病症中的用途。

如上所述，‘治疗’可以适当地指以下中的任一种：症状的减轻、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即，不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或减轻、以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测到还是不可检测到的。

‘预防’可以另外指避免疾病或疾病的症状。

适当地，还原型叶酸任选地与BH4、其前体或功能等同物联合，使受试者中的BH4水平正常化或恢复。适当地，还原型叶酸任选地与BH4、其前体或功能等同物联合，增加受试者中的BH4水平。在一种实施方案中，在内皮细胞中测量BH4水平。适当地，还原型叶酸任选地与BH4、其前体或功能等同物联合，使受试者的内皮细胞中的BH4水平正常化或恢复。适当地，还原型叶酸任选地与BH4、其前体或功能等同物联合，增加受试者的内皮细胞中的BH4水平。

适当地，还原型叶酸任选地与BH4、其前体或功能等同物联合，减少或防止受试者中BH4的氧化。因此，适当地，还原型叶酸防止BH4因氧化而损失。适当地，与还原型叶酸联合添加BH4还可以直接增加受试者中的BH4水平。适当地，还原型叶酸也可以通过其他机制增加BH4的水平。适当地，还原型叶酸可以与二氢叶酸还原酶(DHFR)相互作用，以增加该酶的水平、稳定性或活性。适当地，DHFR活性的增加增加了BH2还原回BH4。适当地，这可以是与DHFR的直接相互作用或间接相互作用。适当地，还原型叶酸可以阻断DHFR抑制剂诸如氨甲蝶呤的作用。适当地，还原型叶酸可以发挥作用以增加GTP环水解酶I(GTPCH)表达或活性，适当地增加内皮GTPCH表达或活性。

适当地，还原型叶酸可以具有其他细胞内氧化还原作用，以增加细胞还原能力。适当地，细胞还原能力的增加可以包括细胞还原剂或体系(诸如与谷胱甘肽、NADPH或过氧还原蛋白相关的那些)水平的增加。适当地，还原型叶酸可以清除或抑制活性氧种类(ROS)或活性氮种类(RNS)的作用。因此合适地，还原型叶酸可以直接或通过对细胞还原剂或体系的作用来降低或改变ROS或RNS对靶分子的生物学作用。适当地，还原型叶酸可以发挥作用以增加一氧化氮合酶表达或活性，适当地，增加内皮型一氧化氮合酶表达或活性。适当地，还原型叶酸可以发挥作用以减少活性氧种类，适当地减少内皮细胞中的活性氧种类。

适当地，还原型叶酸任选地与BH4、其前体或功能等同物联合，通过维持或恢复受试者中的健康BH4水平来预防或治疗与低BH4生物利用度相关的病症。

适当地，还原型叶酸任选地与BH4、其前体或功能等同物联合，通过增加受试者中BH4的水平来预防或治疗与低BH4生物利用度相关的病症。适当地，通过使受试者中的BH4水平增加到健康BH4水平。

适当地，健康BH4水平意指参考健康受试者中的BH4水平。

适当地，还原型叶酸任选地与BH4、其前体或功能等同物联合，通过减少或防止BH4的氧化来增加受试者中BH4的水平。适当地，通过减少或防止BH4氧化成BH2。

因此，适当地，还原型叶酸任选地与BH4、其前体或功能等同物联合，通过减少或防止BH4氧化来预防或治疗与低BH4生物利用度相关的病症。

适当地，还原型叶酸任选地与BH4、前体或功能等同物联合，可以使受试者中的BH4水平增加多至500％、适当地多至400％、适当地多至300％、适当地多至200％、适当地多至100％、50％、适当地45％、适当地40％、适当地35％、适当地30％、适当地25％。

适当地，还原型叶酸任选地与BH4、前体或功能等同物联合，可以使受试者中BH4的氧化状态改善多至500％、适当地多至400％、适当地多至300％、适当地多至200％、适当地多至100％、适当地多至50％、适当地多至25％。适当地，‘受试者中BH4的氧化状态’意指受试者中BH4相对于BH2或其他氧化形式的生物蝶呤或蝶呤的水平。

适当地，还原型叶酸任选地与BH4、前体或功能等同物联合，可以使BH4:BH2的比值增加多至14倍、适当地多至12倍、适当地多至10倍、适当地多至8倍、适当地多至6倍、适当地多至4倍、适当地多至2倍。适当地，还原型叶酸任选地与BH4、前体或功能等同物联合，可以使BH4:BH2的比值增加到1.0和1.5之间。

适当地，增加是与对照进行比较。合适的对照是在未接受任何使用还原型叶酸(任选地与BH4联合)的治疗的具有相同状况或疾病的受试者中的相关测量。例如，患有与低BH4生物利用度相关的病症且未接受任何使用还原型叶酸(任选地与BH4联合)的治疗的受试者中的BH4水平。

仅有的API

在本发明的一些方面，与低BH4生物利用度相关的病症可以仅用还原型叶酸来预防或治疗。本申请的发明人发现，单独提供还原型叶酸可以治疗或预防与低BH4生物利用度相关的病症，而不需要提供BH4本身或其前体或功能等同物。

适当地，还原型叶酸可以是仅有的活性药物成分(API)。适当地，还原型叶酸可以单独使用。适当地，还原型叶酸可以不与任何其他活性药物成分联合使用。适当地，可以仅向受试者提供还原型叶酸，用于治疗或预防与低BH4生物利用度相关的病症。适当地，对于与低BH4生物利用度相关的病症，受试者可以仅用还原型叶酸进行治疗。适当地，对于治疗或预防与低BH4生物利用度相关的病症，不向受试者提供或施用其他活性药物成分。适当地，对于与低BH4生物利用度相关的病症，可以不使用其他活性药物成分治疗受试者。

如本文使用的“活性药物成分”旨在意指在人体内提供药理作用的任何物质。该术语不包括在人体内没有药理作用的惰性物质，诸如赋形剂。合适的赋形剂在下文定义。

因此，适当地，本发明提及使用还原型叶酸作为仅有的活性药物成分的方面可以包括赋形剂的使用。适当地，赋形剂可以与还原型叶酸一起被包括在内。适当地，在这样的情况下，还原型叶酸被包含在组合物中，其中组合物可以包含赋形剂。因此，适当地，本发明可以包括用包含一种或更多种活性药物成分和一种或更多种赋形剂的组合物进行治疗或预防，其中活性药物成分由还原型叶酸组成。适当地，组合物可以是药物组合物。

在本发明第三方面的一种实施方案中，提供了一种组合物，其包含一种或更多种活性药物成分和一种或更多种赋形剂，用于预防或治疗与低BH4生物利用度相关的病症，其中活性药物成分由还原型叶酸组成。

联合疗法

在本发明的一些方面，还原型叶酸可以与其他活性药物成分联合使用。例如，还原型叶酸可以与如下文所述的BH4、其前体或功能等同物联合使用，但还原型叶酸也可以与其他活性药物成分联合使用。

适当地，其他活性药物成分可以包括对与低BH4生物利用度相关的病症具有有益作用的任何其他药物成分。合适的其他活性药物成分可以包括另外的还原型叶酸和/或另外的BH4前体或其功能等同物。合适的其他活性药物成分还可以包括：维生素诸如维生素C和/或维生素B12；和/或神经递质前体诸如L-多巴或卡比多巴；和/或5-羟基色氨酸；和/或精氨酸和/或瓜氨酸。

然而，适当地，其他活性药物成分不包括阿司匹林或植物提取物。适当地，还原型叶酸不用于与阿司匹林或植物提取物联合施用。

适当地，还原型叶酸可以不用于与水杨酸联合施用。因此，适当地，还原型叶酸可以不与水杨酸联合。

如本文使用的‘水杨酸’意指衍生自水杨酸的任何药物。适当地，这样的药物是NSAID。水杨酸的实例包括：阿司匹林、二氟尼柳、水杨酸和双水杨酸。

适当地，还原型叶酸可以不与非甾体抗炎药(NSAID)联合施用。因此，适当地，还原型叶酸可以不与非甾体抗炎药(NSAID)联合。

如本文使用的‘非甾体抗炎药’(NSAID)意指减轻炎症和/或疼痛但不是甾体的任何药物。适当地，NSAID可以包括抑制环氧合酶(适当地COX1和/或COX2)的活性的任何药物。NSAID的实例包括：阿司匹林、二氟尼柳、水杨酸、双水杨酸、布洛芬、右旋布洛芬、萘普生、非诺洛芬、酮洛芬、右旋酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普秦、洛索洛芬、吲哚美辛、托美丁、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、双氯芬酸、醋氯芬酸、溴芬酸、萘丁美酮、吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康(tenoxicam)、屈昔康(droxicam)、氯诺昔康、伊索昔康(isoxicam)、保泰松、甲芬那酸、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、氟芬那酸、托芬那酸(tolfenamic acid)、塞来昔布、罗非昔布(rofecoxib)、伐地昔布(valdecoxib)、帕瑞昔布、罗美昔布(lumiracoxib)、依托考昔、非罗考昔(firocoxib)、尼美舒利、氯尼辛(clonixin)和利克飞龙(licofelone)。

如本文使用的‘植物提取物’意指在使用溶剂选择或去除植物组分或植物的任何部分后获得的任何化合物或其混合物。植物提取物可以是干燥形式、液体形式或半固体形式。植物提取物包括任何中草药。适当地，还原型叶酸可以不用于与中草药提取物或药物联合施用。植物提取物的实例包括：榅桲提取物(quince extract)、芡属植物(euryale)提取物、瞿麦(fringed pink)提取物、金银花提取物、蕺菜属植物(houttuynia)提取物、枸橼提取物、百脉根属植物(lotus)提取物、高良姜提取物、菊属植物(chrysanthemum)提取物、薄荷提取物、槐属植物(sophora)提取物、赤小豆提取物、小麦提取物和日本蓟提取物。

在本发明的一些方面，与低BH4生物利用度相关的病症可以用还原型叶酸与BH4、其前体或功能等同物的联合来预防或治疗。将BH4、其前体或功能等同物与还原型叶酸一起添加可以直接帮助增加BH4的生物利用度。适当地，这对于治疗具有低BH4水平或缺乏BH4的受试者可能特别有用。

适当地，还原型叶酸和BH4、其前体或功能等同物可以是用于在治疗中使用的仅有的活性药物成分。适当地，还原型叶酸和BH4、其前体或功能等同物可以在没有任何其他活性药物成分的情况下联合使用。适当地，可以仅向受试者提供还原型叶酸和BH4、其前体或功能等同物，用于治疗或预防与低BH4生物利用度相关的病症。适当地，对于治疗或预防与低BH4生物利用度相关的病症，不向受试者提供或施用其他活性药物成分。适当地，对于与低BH4生物利用度相关的病症，可以不使用其他活性药物成分治疗受试者。

因此，适当地，本发明提及使用还原型叶酸和BH4、前体或功能等同物作为仅有的活性药物成分的方面仍然可以包括赋形剂的使用。适当地，赋形剂可以与还原型叶酸和BH4、前体或功能等同物一起被包含在内。适当地，在这种情况下，还原型叶酸、BH4、前体或功能等同物被包含在组合物中，其中组合物可以包含赋形剂。因此，适当地，本发明可以包括用包含一种或更多种活性药物成分和一种或更多种赋形剂的组合物进行治疗或预防，其中活性药物成分由还原型叶酸和BH4、其前体或功能等同物组成。

在本发明第三方面的一种实施方案中，提供了一种组合物，其包含一种或更多种活性药物成分和一种或更多种赋形剂，用于预防或治疗与低BH4生物利用度相关的病症，其中活性药物成分由还原型叶酸和BH4、其前体或功能等同物组成。

还原型叶酸和BH4、其前体或功能等同物的组合可以以任何合适的方式施用。适当地，还原型叶酸和BH4、前体或功能等同物可以同时或以任何顺序顺序施用至受试者。

适当地，顺序施用包括施用第一活性药物成分，并随后适当地在一段时间间隔后施用第二活性药物成分。

适当地，如果顺序施用还原型叶酸和BH4、前体或功能等同物，则还原型叶酸可以是第一活性药物成分，并且BH4、前体或功能等同物可以是第二活性药物成分。可选地，BH4、前体或功能等同物可以是第一活性药物成分，并且还原型叶酸可以是第二药物成分。

适当地，顺序施用可以包括施用第一活性药物成分和第二活性药物成分之间的时间间隔。适当地，时间间隔可以是秒、分钟、小时、天或周。适当地，时间间隔可以是例如30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时、4天、7天、10天、14天。

适当地，选择时间间隔，使得两种API能够在重叠的时间段发挥它们的治疗作用。

适当地，还原型叶酸和BH4、其前体或功能等同物可以一起配制成单一组合物。可选地，还原型叶酸和BH4、其前体或功能等同物可以配制成两种单独的组合物。

适当地，对于顺序施用，还原型叶酸和BH4、其前体或功能等同物被配制成两种单独的组合物。适当地，第一组合物和第二组合物。适当地，第一组合物包含第一活性药物成分，并且第二组合物包含第二活性药物成分。

适当地，对于同时施用，还原型叶酸和BH4、其前体或功能等同物可以配制成单一组合物，或者可以配制成两种单独的组合物，适当地配制成一起施用的两种单独的组合物。

适当地，第一组合物和第二组合物可以包含不同的制剂。本文别处描述了用于药物组合物的合适制剂。

在一种实施方案中，还原型叶酸和BH4、前体或功能等同物以单一组合物同时施用。

适当地，活性药物成分或包含其的组合物通过合适的施用途径施用至受试者。合适的施用途径在下文描述。适当地，第一活性药物成分和第二活性药物成分或包含它们的第一组合物和第二组合物可以通过不同的途径施用。

例如，第一活性药物成分或其组合物可以静脉内施用，并且第二活性药物成分或其组合物可以口服施用。

在一种实施方案中，还原型叶酸和BH4、前体或功能等同物通过相同的施用途径以单一组合物同时施用。在一种实施方案中，还原型叶酸和BH4、前体或功能等同物通过口服施用以单一组合物同时施用。

药物组合物

在本发明的方面中使用的还原型叶酸和任选地BH4或其前体或功能等同物可以配制成一种或更多种用于施用至受试者的组合物。适当地，组合物是药物组合物。

适当地，本文中对根据本发明的用于使用的‘组合物’或‘活性药物成分’的任何提及也可以指药物组合物，适当地指包含根据本发明的用于使用的活性药物成分的药物组合物。

适当地，药物组合物包含一种或更多种活性药物成分(API)和一种或更多种赋形剂、稀释剂和/或载体。适当地，用于在本发明中使用的药物组合物可以包含还原型叶酸和任选地BH4或其前体或功能等同物，以及一种或更多种赋形剂、稀释剂和/或载体。

适当地，药物组合物还可以包含一种或更多种赋形剂、稀释剂和/或载体。例如，可以添加赋形剂以调节浓度；增强稳定性；限制微生物生长；改善组合物的干燥、流动或其他制备特征；提高生物利用度；或者减慢或加快API的吸收。

适当地，用于在本发明中使用的药物组合物可以包含一种或更多种活性药物成分，所述活性药物成分由还原型叶酸和任选地BH4或其前体或功能等同物、以及一种或更多种另外的赋形剂、稀释剂和/或载体组成。在一种实施方案中，用于在本发明中使用的药物组合物可以包含仅有的活性药物成分和一种或更多种赋形剂、稀释剂和/或载体，其中仅有的活性药物成分是还原型叶酸。

适当地，如上文所述，活性药物成分还原型叶酸和BH4或其前体或功能等同物可以被包含在两种不同的药物组合物中。适当地，第一药物组合物包含第一活性药物成分，并且第二药物组合物包含第二活性药物成分。适当地，第一药物组合物可以包含还原型叶酸，并且第二药物组合物可以包含BH4或其前体或功能等同物，反之亦然。适当地，第一药物组合物可以包含仅有的活性药物成分还原型叶酸，并且第二药物组合物可以包含仅有的活性药物成分BH4或其前体或功能等同物，反之亦然。

适当地，第一药物组合物和第二药物组合物可以包含不同的制剂。适当地，制剂被定制成在其中包含活性药物成分，以使活性药物成分的功效最大化。

适当地，最佳药物制剂可以由本领域技术人员根据施用途径和所需剂量来确定。参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.(1990,Mack Publ.Co,EastonPa.18042)pp 1435 1712。

合适的赋形剂、载体或稀释剂可以包括例如粘合剂、崩解剂、表面活性剂、调味剂、涂层材料、防腐剂、着色剂、增稠剂、抗微生物剂、抗氧化剂或润滑剂或其组合。

粘合剂的非限制性实例包括黄蓍胶、阿拉伯胶、淀粉、明胶，和可生物降解聚合物诸如二羧酸、亚烷基二醇、聚亚烷基二醇和/或脂肪族羟基羧酸的均聚酯或共聚酯；二羧酸、亚烷基二胺和/或脂肪族氨基羧酸的均聚酰胺或共聚酰胺；相应的聚酯-聚酰胺-共聚物、聚酸酐、聚原酸酯、聚膦腈和聚碳酸酯。可生物降解聚合物可以是线性的、支化的或交联的。特定的实例是聚乙醇酸、聚乳酸和聚-d,l-丙交酯/乙交酯。聚合物的其他实例是水溶性聚合物，诸如聚氧化烯(聚氧乙烯、聚氧丙烯)及其混合聚合物、聚丙烯酰胺和羟基烷基化聚丙烯酰胺、聚马来酸及其酯或酰胺、聚丙烯酸及其酯或酰胺、聚乙烯醇及其酯或醚、聚乙烯基咪唑、聚乙烯吡咯烷酮和天然聚合物如壳聚糖。

示例性崩解剂包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP，例如以名称POVIDONE出售)、交联形式的聚维酮(CPVP，例如以名称CROSPOVIDONE出售)、交联形式的羧甲基纤维素钠(NaCMC，例如以名称AC-DI-SOL出售)、其他改性纤维素和改性淀粉。

示例性抗氧化剂包括抗坏血酸、抗坏血酸的脂肪酸酯诸如抗坏血酸棕榈酸酯和抗坏血酸硬脂酸酯，以及抗坏血酸的盐诸如抗坏血酸钠、抗坏血酸钙或抗坏血酸钾。也可以使用非酸性抗氧化剂，诸如β-胡萝卜素、α-生育酚。

润滑剂的非限制性实例包括天然的或合成的油、脂肪、蜡或脂肪酸盐诸如硬脂酸镁。

示例性表面活性剂可以是阳离子的、阴离子的、两性或中性的。表面活性剂的非限制性实例包括卵磷脂、磷脂、硫酸辛酯、硫酸癸酯、硫酸十二酯、硫酸十四酯、硫酸十六酯和硫酸十八酯、油酸钠或癸酸钠、1-酰基氨基乙烷-2-磺酸，诸如1-辛酰基氨基乙烷-2-磺酸、1-癸酰基氨基乙烷-2-磺酸、1-十二酰基氨基乙烷-2-磺酸、1-十四酰基氨基乙烷-2-磺酸、1-十六酰基氨基乙烷-2-磺酸，和1-十八酰基氨基乙烷-2-磺酸，和牛磺胆酸及牛磺脱氧胆酸、胆汁酸及其盐，诸如胆酸、脱氧胆酸和甘胆酸钠、癸酸钠或月桂酸钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠、十六烷基硫酸钠、硫酸化蓖麻油和二辛基磺基琥珀酸钠、椰油酰胺丙基甜菜碱和月桂基甜菜碱、脂肪醇、胆固醇、单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯或二油酸甘油酯，和单棕榈酸甘油酯或二棕榈酸甘油酯和聚氧乙烯硬脂酸酯。

防腐剂的非限制性实例包括对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、山梨酸、氯丁醇、苯酚和硫柳汞。

在一种实施方案中，包含还原型叶酸和BH4、其前体或功能等同物的药物组合物包含以下赋形剂、稀释剂和/或载体：无水磷酸氢钙、交联聚维酮和硬脂富马酸酯。

适当地，药物组合物可以被配制成固体或液体。适当地，药物组合物被配制成选自丸剂、胶囊、片剂或粉末的固体。在一种实施方案中，药物组合物被配制成片剂。适当地，固体制剂是水溶性的。

适当地，药物组合物可以通过任何合适的途径施用至受试者。合适的施用途径可以是：口服、肠胃外、吸入或局部(topical)。适当地，如本文使用的术语肠胃外包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道施用。

在一种实施方案中，本发明的组合物口服施用。在一种实施方案中，本发明的组合物被包含在口服施用的片剂形式中。

适当地，用于在本发明中使用的活性药物成分或包含用于在本发明中使用的活性药物成分的组合物可以以药学有效量施用至受试者。适当地，药学有效量是足以实现治疗效果的活性药物成分或每种活性药物成分的量。适当地，药学有效量可以是有效改善与低BH4生物利用度相关的病症的活性药物成分或每种活性药物成分的量。适当地，药学有效量可以是有效实现受试者中BH4水平增加的活性药物成分或每种活性药物成分的量。

适当地，用于在本发明中使用的活性药物成分的单剂量包含药学有效量。

用于在本发明中使用的活性药物成分的合适剂量可以由本领域技术人员确定。

然而，BH4、其前体或功能等同物的合适剂量可以是例如：每天1mg/kg体重至约20mg/kg体重之间，适当地每天10mg/kg体重至约20mg/kg体重之间。适当地，日剂量可以是每天1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg。适当地，这样的剂量可以用于包含BH4、其前体或功能等同物的药物组合物中。适当地，这样的剂量可以用于包含BH4、其前体或功能等同物并且还包含一种或更多种另外的活性成分诸如还原型叶酸的药物组合物中。

还原型叶酸的合适剂量可以是每天1mg和50mg之间、适当地2mg和30mg之间、适当地3mg和25mg之间、适当地4mg和20mg之间、适当地5mg和15mg之间。适当地，这样的剂量可以用于包含还原型叶酸的药物组合物中。适当地，这样的剂量可以用于包含还原型叶酸并且还包含一种或更多种另外的活性成分诸如BH4、其前体或功能等同物的药物组合物中。

本发明的活性药物成分或根据本发明的组合物的合适剂量将取决于接受者的性别、年龄、健康状况、身高、饮食和体重、任何同时治疗和期望效果的性质。最优选的剂量可以为个体受试者定制，如本领域技术人员理解和可确定的，而无需过度实验。这通常包括调整标准剂量，例如，如果患者体重较低，则减少剂量。

适当地，本发明的活性药物成分或包含本发明的活性药物成分的组合物可以以多于一个剂量或单剂量施用。适当地，多于一个剂量可以以适当的间隔施用。适当地，还可以调整剂量方案以提供最佳的期望响应(例如，治疗响应或预防响应)。

受试者

本发明用于在预防或治疗受试者中与低BH4生物利用度相关的病症中使用。

适当地，受试者是哺乳动物。适当地，受试者是人。适当地，受试者可以是成人或儿童。适当地，受试者可以是男性或女性。在一些实施方案中，其中病症是妊娠相关的病症，受试者是女性。在这样的实施方案中，受试者是妊娠的女性。

适当地，本发明的方面可以用于预防或治疗有相应需要的受试者中与低BH4生物利用度相关的病症。

有相应需要的受试者可以是已经被诊断为患有与低BH4生物利用度相关的病症的受试者，或者被怀疑患有与低BH4生物利用度相关的病症的受试者。合适的病症在本文别处定义。

被诊断为患有与低BH4生物利用度相关的病症的受试者可以已经接受了诊断测试。适当地，受试者可以已经被测试了与低BH4生物利用度相关的病症的一种或更多种标志物，例如如下文进一步描述的降低的BH4水平。适当地，受试者可以已经根据本发明的第十方面被测试。可选地或另外地，受试者可以已经被测试了如本文别处所述的蝶呤生物合成途径中的一种或更多种酶的活性降低，或如本文别处所述的一种或更多种生物蝶呤依赖性酶的活性降低。

在一种实施方案中，受试者已经被诊断为患有先兆子痫。适当地，受试者可以已经被诊断为患有先兆子痫(通过测试高血压)、血小板减少症和/或蛋白尿。

适当地，已经被诊断为患有病症或已知患有病症的受试者在本文中可以被称为“患者”。

被怀疑患有与低BH4生物利用度相关的病症的受试者可以表现出与低BH4生物利用度相关的病症的一种或更多种症状。症状可以包括：头痛；暂时性肌张力低下；智力残疾；情绪波动；情绪低落；自杀的想法；精神病；爆发(outbursts)；失眠；幻觉；失明；妄想；失忆；意识错乱；语言困难；运动障碍包括强直；肌张力障碍或震颤；吞咽困难；胃酸倒流；恶心；呕吐；疼痛；体重增加；水肿；癫痫发作；行为问题；进行性发育问题；不能控制体温；多动症；代谢紊乱包括氨基酸水平紊乱；心血管异常；小头畸形；出生体重低；高血压；血小板减少症；肝功能受损；肾功能障碍；肿胀；瘀伤；呼吸急促；蛋白尿。在一种实施方案中，受试者具有这些症状中的一种或更多种。

被怀疑患有与低BH4生物利用度相关的病症的受试者可以具有与低BH4生物利用度相关的病症的一种或更多种标志物。与低BH4生物利用度相关的合适标志物包括：

(i)BH4水平低；

(ii)BH4与BH2的比值低；

(iii)BH4与总生物蝶呤的比值低；

(iv)还原型叶酸水平低；

(v)还原型叶酸相对于氧化型叶酸水平低；

(vi)前臂血流反应降低；

(vii)血流介导的血管舒张减少；

(viii)循环sICAM、P-选择素、von Willebrand因子或微量白蛋白尿增加；

(ix)神经递质(诸如血清素、多巴胺或其代谢物)水平低；

(x)苯丙氨酸或相关代谢物水平升高；和/或

(xi)sFlt-1与PlGF的比值高；

(xii)由于例如同型半胱氨酸甲基转移酶缺陷或维生素B12缺乏引起的叶酸代谢紊乱；

(xiii)血浆同型半胱氨酸水平高(任选地由于维生素B-12或叶酸缺乏)；

(xiv)甲基丙二酸水平高(任选地由于维生素B-12缺乏)。

适当地，相对的术语诸如‘低’、‘高’、‘增加’或‘降低’是相对于在参考受试者中测量时相同的标志物。

在一种实施方案中，受试者具有这些标志物中的一种或更多种。在一种实施方案中，受试者具有上述症状中的一种或更多种和/或标志物中的一种或更多种。

在一种实施方案中，受试者可以表现出选自以下的一种或更多种先兆子痫症状：头痛、视力受损、胃酸倒流、肋骨以下疼痛、恶心或呕吐、高血压、血小板减少症、肝功能受损、肾功能障碍、肿胀、瘀伤、呼吸急促、胃灼热、肋骨以下疼痛、体重过度增加、水肿突然加重和蛋白尿。

适当地，高血压可以定义为在至少两个不同的情况下血压为收缩压≥140mmHg或舒张压≥90mmHg。

适当地，血小板减少症可以定义为血小板计数<100,000/微升血液。

适当地，蛋白尿可以定义为24小时尿样中≥0.3克(300mg)或更多的蛋白，或SPOT尿蛋白与肌酐的比值≥0.3，或尿液浸量尺读数为1+或更大。

在一种实施方案中，被怀疑患有先兆子痫的受试者可以具有高sFlt-1/PlGF比值。适当地，高sFlt-1/PlGF比值可以定义为高于38。适当地，在妊娠早期(其可以多至34周)高于85的sFlt-1/PlGF比值或在妊娠晚期(其可以在34周之后)高于110的sFlt-1/PlGF比值指示患有先兆子痫的高风险。

在一种实施方案中，受试者是患有高血压、蛋白尿和/或血小板减少症的妊娠女性。在一种实施方案中，受试者被怀疑患有先兆子痫。

在本发明的各方面和实施方案中，将受试者与参考受试者进行比较。适当地，参考受试者是健康受试者。适当地，没有与低BH4生物利用度相关的病症的受试者。适当地，参考受试者与受试者相当。适当地，参考受试者与受试者应当在性别、年龄、体重和种族方面相当。

剂量方案

适当地，本发明的活性药物成分或包含本发明的活性药物成分的组合物可以根据确定的剂量方案施用。

例如，适当地，本发明的活性药物成分或其组合物可以每天多于一次、每天一次、每两天一次、每四天一次、每周一次、每10天一次或每2周一次施用。在一种实施方案中，本发明的活性药物成分或包含本发明的活性药物成分的组合物每天一次或两次施用。

适当地，还原型叶酸或包含还原型叶酸的药物组合物每天一次或两次施用。适当地，BH4、其前体或功能等同物，或包含BH4、其前体或功能等同物的药物组合物每天一次或两次施用。

适当地，本发明的活性药物成分或包含本发明的活性药物成分的组合物可以在确定的治疗窗口期间施用。

适当地，选择治疗窗口以使与低BH4生物利用度相关的有关病症的预防或治疗受益。适当地，治疗窗口可以是病症前、病症期间或病症后。因此，适当地，本发明的活性药物成分或包含本发明的活性药物成分的组合物可以在与低BH4生物利用度相关的病症之前、在与低BH4生物利用度相关的病症期间或在与低BH4生物利用度相关的病症之后施用。适当地，治疗窗口可以是在(计划的)妊娠之前，或者在相关病症的早期、中期或晚期期间。因此，适当地，本发明的活性药物成分或包含本发明的活性药物成分的组合物可以在(计划的)妊娠之前，或者在与低BH4生物利用度相关的病症的早期、中期或晚期施用。

适当地，当与低BH4生物利用度相关的有关病症是妊娠相关的病症时，本发明的活性药物成分或包含本发明的活性药物成分的组合物可以在妊娠前、妊娠期间或妊娠后施用。适当地，在妊娠期间，本发明的活性药物成分或包含本发明的活性药物成分的组合物可在妊娠早期(0-13周)、妊娠中期(14-26周)或妊娠晚期(27-40周)期间施用。

适当地，在妊娠相关的病症的预防中，本发明的活性药物成分或包含本发明的活性药物成分的组合物在妊娠前或妊娠期间施用。

适当地，在妊娠相关的病症的治疗中，本发明的活性药物成分或包含本发明的活性药物成分的组合物在妊娠期间或妊娠后施用。

适当地，在一些情况下，本发明的活性药物成分或包含本发明的活性药物成分的组合物在妊娠后施用，以加速恢复和/或防止妊娠相关的病症的长期并发症。适当地，这样的病症可以被称为产后病症。

在一种实施方案中，在先兆子痫的治疗中，适当地，本发明的活性药物成分或包含本发明的活性药物成分的组合物在状况出现时施用。通常，这可能是在妊娠晚期，适当地在妊娠第20周之后、适当地在妊娠第22周之后、适当地在妊娠第24周之后、适当地在妊娠晚期期间。然而，先兆子痫也可能在产后发展。适当地，本发明的活性药物成分或包含本发明的活性药物成分的组合物可以在产后施用。适当地，多至产后6周。

选择可能从治疗中受益的受试者的方法

在本发明的一些方面，受试者可能已经被测试了与低BH4生物利用度相关的病症的一种或更多种标志物，以便允许选择可能患有与低BH4生物利用度相关的病症的受试者。然后这些受试者可以用还原型叶酸和任选地BH4或其前体或功能等同物治疗。另外或可选地，受试者可以被测试与低BH4生物利用度相关的病症的一种或更多种症状，以便允许选择可能患有与低BH4生物利用度相关的病症的受试者。然后这些受试者可以用还原型叶酸和任选地BH4或其前体或功能等同物治疗。

适当地，可以通过第十方面的方法来测试受试者。

适当地，被确定为具有一种或更多种标志和/或症状的受试者可以被诊断为患有与BH4缺乏相关的病症。因此，适当地，本发明还可以提供将受试者诊断为患有与低BH4生物利用度相关的病症的方法。适当地，包括本文所提及的测试步骤。另外地或可选地，可以选择被确定为具有一种或更多种标志物和/或症状的受试者进行治疗，适当地使用根据本发明的还原型叶酸和任选地BH4或其前体或功能等同物。因此，本发明还可以适当地提供治疗受试者的方法，该受试者被诊断为具有低BH4生物利用度，或者因具有与低BH4生物利用度相关的病症的标志物而被选择，或者表现出与低BH4生物利用度相关的病症的症状。适当地，借助于本文描述的测试方法。

适当地，与低BH4生物利用度相关的病症的一种或更多种症状在上文定义。

适当地，与低BH4生物利用度相关的病症的一种或更多种标志物可以包括以下中的任一种：

(i)BH4水平低；

(ii)BH4与BH2的比值低；

(iii)BH4与总生物蝶呤的比值低；

(iv)还原型叶酸水平低；

(v)还原型叶酸相对于氧化型叶酸水平低；

(vi)前臂血流反应降低；

(vii)血流介导的血管舒张减少；

(ix)神经递质(诸如血清素、多巴胺或其代谢物)水平低；和/或

(x)苯丙氨酸或相关代谢物水平升高；

(xi)sFlt-1与PlGF的比值高；

(xiv)甲基丙二酸水平高(任选地由于维生素B-12缺乏)。

适当地，‘低’、‘降低’、‘高’或‘增加’意指当与在健康受试者中测量的参考水平相比时，相对于相同的标志物。

适当地，测试受试者可以包括以下步骤：(a)确定受试者中以任何组合的任何上述标志物的水平，以及(b)与来自健康受试者的相同标志物的参考水平进行比较。适当地，测试受试者可以包括(a)确定受试者是否具有任何症状。适当地，这可以是确定任何标志物的水平的补充或替代。

在一种实施方案中，测试受试者包括以下步骤：(a)确定受试者的BH4水平；以及(b)将所确定的BH4水平与来自健康受试者的参考BH4水平进行比较。

适当地确定受试者中任何标志物的水平可以包括(i)从受试者获得合适的样品；以及ii)测量样品中一种或更多种所选标志物的水平。

在一种实施方案中，确定受试者的BH4水平可以包括(i)从受试者获得合适的样品；以及(ii)测量样品中BH4的水平。因此，步骤(a)可以适当地包括确定来自受试者的样品中的BH4水平。

合适的样品可以是组织样品、血液样品、血清样品、脑脊液样品。适当地，样品是血液。适当地，样品来自组织，诸如内皮、心脏组织、肝组织、脑组织。

在一种实施方案中，可以测量内皮细胞中的BH4水平。

在一种实施方案中，可以测量存在于血液内的源自受试者体内特定细胞或组织的微囊泡中的BH4水平。在一种实施方案中，可以测量存在于血液内的胎盘微囊泡中的BH4水平。适当地，在这样的实施方案中，可以测量来自内皮细胞、心脏细胞、免疫细胞、肝细胞、神经元细胞或癌细胞的微囊泡中的BH4水平。

在一种实施方案中，可以测量来自妊娠受试者的微囊泡中的BH4水平。适当地，在胎盘微囊泡中。适当地，在这样的实施方案中，受试者被怀疑具有妊娠相关的BH4生物利用度降低。适当地，在这样的实施方案中，受试者被怀疑患有先兆子痫。

在一种实施方案中，可以测量组织中、适当地组织的细胞中的BH4水平。适当地，在这样的实施方案中，受试者被怀疑具有非妊娠相关的BH4生物利用度降低。适当地，如果测量心脏组织中的BH4水平，则受试者被怀疑患有与低BH4生物利用度相关的心脏疾病。适当地，如果测量脑组织中的BH4水平，则受试者被怀疑患有与低BH4生物利用度相关的神经疾病。适当地，如果测量肝组织中的BH4水平，则受试者被怀疑患有与低BH4生物利用度相关的肝疾病。

适当地，方法还可以包括处理来自受试者的样品的步骤。因此，适当地确定受试者中一种或更多种标志物的水平可以包括(i)从受试者获得合适的样品；(ii)处理样品；以及(ii)测量样品中一种或更多种标志物的水平。

适当地，在一种实施方案中，处理样品可以包括从血液样品中分离胎盘微囊泡或其他微囊泡。因此，适当地，在这样的实施方案中，确定受试者的BH4水平可以包括(i)从受试者获得血液样品；(ii)从血液样品中分离胎盘微囊泡；和(ii)测量胎盘微囊泡或其他微囊泡中的BH4水平。

适当地，可以通过任何合适的分离手段，诸如离心或过滤，从血液中分离胎盘微囊泡或其他微囊泡。

适当地，测量样品中化学标志物的水平包括根据已知技术对样品进行免疫测定、HPLC或质谱。例如，测量BH4的水平，BH4与BH2的比值，BH4与总生物蝶呤的比值，还原型叶酸的水平，还原型叶酸相对于氧化型叶酸的水平，，sICAM、P-选择素、von Willebrand因子或微量白蛋白尿的水平，，神经递质的水平，sFlt-1/PlGF的比值，苯丙氨酸的水平，甲基四氢叶酸还原酶中的多态性(C677T)的水平，维生素B12的水平，血浆同型半胱氨酸的水平和/或甲基丙二酸的水平可以使用免疫测定、HPLC或质谱来进行。适当地，大多数所述标志物可以在组织、血液或血清样品中测量。

适当地，测量血流反应或血管舒张的水平可以通过超声进行。

适当地，与健康受试者相比BH4水平降低或BH4水平低包括当与健康受试者中的水平相比时BH4水平降低至少20％。适当地，与健康受试者相比BH4水平降低包括当与健康受试者中的水平相比时BH4水平降低20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％。

在一种实施方案中，测量内皮细胞中的BH4水平，因此，适当地，与健康受试者相比BH4水平低包括当与健康受试者中的内皮细胞BH4水平相比时内皮细胞BH4的水平降低20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％。

适当地，高sFlt-1/PlGF比值包括高于38的比值。适当地，在妊娠早期的受试者中，高sFlt-1/PlGF比值可以包括高于85的比值。适当地，在妊娠晚期的受试者中，高sFlt-1/PlGF比值可以包括高于110的比值。

在本发明的另外的方面，可以提供选择可以从使用还原型叶酸和任选地BH4、其前体或功能等同物的治疗中受益的受试者的方法，该方法包括确定受试者的还原型叶酸水平，将该还原型叶酸水平与健康受试者的参考还原型叶酸水平进行比较，并且如果受试者表现出比参考水平低的还原型叶酸水平，则选择受试者进行治疗。

在一种实施方案中，方法还包括向所选择的受试者提供治疗。在一种实施方案中，治疗包括还原型叶酸和任选地BH4、其前体或功能等同物。

适当地，上述方法步骤或特征中的任何一个可以应用于包括确定上文列出的一种或更多种标志物的水平的方法，其中进行适当的修改以确定和比较受试者的一种或更多种标志物的水平。在一种实施方案中，‘BH4水平’被替换为‘还原型叶酸水平’，并且‘低BH4生物利用度’被替换为‘低还原型叶酸生物利用度’或‘还原型叶酸缺乏’。

适当地，上述方法步骤或特征中的任何一个可以应用于包括确定上文列出的一种或更多种标志物的水平和/或确定受试者是否具有上文列出的任何症状的方法。

另外地或可选地，测试受试者的与低BH4生物利用度相关的病症的一种或更多种标志物可以包括测试受试者的参与BH4合成的一种或更多种酶的受损活性，或一种或更多种生物蝶呤依赖性酶的受损活性。

根据本发明的另外的方面，提供了选择可以从使用还原型叶酸和任选地BH4、其前体或功能等同物的治疗中获益的受试者的方法，该方法包括确定受试者中蝶呤生物合成途径中的一种或更多种酶的活性，将所述酶或每种酶的活性与健康受试者中的一种或更多种参考酶的活性进行比较，并且如果与参考酶相比，患者表现出一种或更多种酶的活性受损，则选择受试者进行治疗。

适当地，蝶呤生物合成途径可以是BH4生物合成途径。

适当地，每种参考酶与来自接受测试的受试者的酶相同，但存在于健康受试者中。

适当地，方法还可以包括确定受试者的BH4水平，并将该BH4水平与健康受试者的参考BH4水平进行比较。适当地，方法还可以包括，如果受试者表现出与健康受试者中的参考酶相比蝶呤生物合成途径中的一种或更多种酶的活性受损，和/或与健康受试者中的参考水平相比BH4水平降低，则选择受试者进行治疗。适当地，一种或更多种酶的活性受损将通过适当地在酶活性测定期间酶的产物水平的降低或酶的底物消耗的减少来检测。因此，适当地，方法可以包括确定受试者中蝶呤生物合成途径中一种或更多种酶的底物消耗或产物的产生。因此，适当地，方法可以包括使用酶活性测定来确定受试者中蝶呤生物合成途径中一种或更多种酶的产物的产生。

BH4生物合成途径中的一种或更多种酶在本文别处定义。适当地，方法可以包括确定选自以下的一种或更多种酶的活性：GTP环水解酶I(GTPCH)、6-丙酮酰-四氢蝶呤合酶(PTPS)、墨喋呤还原酶(SP)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、二氢蝶啶还原酶(DHPR)、蝶呤-4a-甲醇胺脱水酶(PCD)和内皮型NOS(eNOS)。

确定酶活性的方法在本领域是熟知的，并且可以包括各种测定。适当地，这样的测定包括将待测试的酶与底物一起孵育一段时间，以允许发生底物向产物的转化，然后可以测量底物的消耗或产物的产生。例如，可以使用HPLC或质谱来测量产物的水平。

适当地，GTPCH的酶活性测定可以包括测量由GTP产生的二氢新蝶呤三磷酸，其中去磷酸化步骤使得能够通过荧光HPLC对新蝶呤定量。适当地，DHFR的酶活性测定可以包括通过HPLC用电化学检测对由二氢叶酸产生的四氢叶酸定量。

适当地，在本发明中，测量酶产物的产量。适当地，被测量的产物是蝶呤。因此，适当地，确定蝶呤生物合成途径中一种或更多种酶的活性包括在酶活性测定中测量由所述酶或每种酶产生的蝶呤产物的水平。适当地，蝶呤是由被测试的酶产生的相关蝶呤。适当地，与参考酶相比，由被测试的酶产生的预期产物的水平降低表明被测试的酶受损。适当地，与参考酶相比，由被测试的酶产生的蝶呤产物的水平降低表明被测试的酶受损。

在一种实施方案中，方法可以包括确定受试者的GTP环水解酶I(GTPCH)活性，并适当地，将其与健康受试者的参考GTP环水解酶I(GTPCH)活性进行比较。在一种实施方案中，方法还包括如果受试者表现出GTP环水解酶I(GTPCH)活性受损，则选择受试者进行治疗。适当地，GTP环水解酶I(GTPCH)活性受损可以通过产物7,8-二氢新蝶呤三磷酸(DHNTP)水平的降低来检测，适当地，使用如上所述的酶活性测定来测量。

适当地，当与健康受试者中相同的酶的活性相比时，蝶呤生物合成途径中酶的活性受损包括酶的活性降低至少20％。适当地，当与健康受试者中相同的酶的活性相比时，蝶呤生物合成途径中酶的活性受损包括酶的活性降低20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％。

药盒

本发明还提供了包含两种活性药物成分的药盒，其可以用于形成如本文所述的预防或治疗低BH4生物利用度的疗法。

药盒至少包含还原型叶酸和任选地BH4，或其前体或功能等同物。适当地，还原型叶酸和/或BH4，或其前体或功能等同物可以储存在适当的容器中。合适的容器可以是例如安瓿、袋、瓶、注射器、小瓶或泡罩包装。适当地，每个容器包含例如一个剂量或剂量的合适分割。

适当地，泡罩包装可以包含片剂。适当地，每片片剂被配制成包含例如一个剂量或剂量的合适分割。

适当地，药盒还可以包括使用说明。适当地，说明可以告知使用者用于受试者的正确剂量。这样的药盒将适当地具有标签或包装插页，指示相关的活性药物成分可用于治疗罹患或易患与低BH4生物利用度相关的病症的受试者。

适当地，药盒还可以包含一种或更多种赋形剂、稀释剂或载体。适当地，赋形剂、稀释剂或载体可以用于与还原型叶酸和/或BH4或其前体或功能等同物混合。适当地，说明可以告知使用者如何将赋形剂与还原型叶酸和/或BH4或其前体或功能等同物混合。

适当地，药盒可以包括用于施用还原型叶酸和/或BH4或其前体或功能等同物的设备。例如，药盒可以包括注射器。适当地，说明可以告知使用者如何向受试者施用还原型叶酸和/或BH4、或其前体或功能等同物。

体外用途

本发明基于还原型叶酸可以防止BH4不期望地氧化成不太有用的BH2形式的发现。这在实验室中还具有体外用途。本发明的第十三方面定义了这样的体外用途。

适当地，还原型叶酸可以用于防止BH4或其前体或功能等同物的氧化。适当地，还原型叶酸可以用于保存BH4、或其前体或功能等同物。

适当地，在这样的实施方案中，还原型叶酸可以是其天然立体异构体形式或非天然立体异构体形式。

适当地，还原型叶酸可以被添加到任何包括BH4或其前体或功能等同物的实验室工艺中。适当地，添加到任何需要BH4或前体或其功能等同物保持还原状态的实验室工艺中。

因此，适当地，在实验室工艺期间或储存期间，可以添加还原型叶酸以稳定生物样品中的BH4。适当地，在实验室工艺期间，BH4可以是所需的底物或辅因子。合适的实验室工艺可以包括测定，诸如酶测定。适当地，其中BH4是所需辅因子的这样的酶测定可以包括涉及以下的测定：色氨酸羟化酶、苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶、一氧化氮合酶和醚脂质氧化酶。

适当地，可以添加还原型叶酸以防止BH4或其前体或其功能等同物在储存时的氧化。适当地，以保存BH4或其前体或功能等同物。适当地，本发明包括使用还原型叶酸作为防腐剂，以保存BH4或其前体或功能等同物。因此，适当地，还原型叶酸可以添加到含有BH4或其前体或功能等同物的容器中。因此，适当地，还原型叶酸可以作为防腐剂添加到含有BH4或其前体或功能等同物的容器中。

在本发明的另外的方面，提供了包含BH4或其前体或功能等同物的容器；和防腐剂，其中防腐剂是还原型叶酸。

适当地，在实验室工艺或容器中，还原型叶酸以合适的浓度存在，防止BH4或其前体或功能等同物的氧化。适当地，还原型叶酸以与BH4相比大致等摩尔的浓度存在。因此，适当地，在实验室工艺或容器中，还原型叶酸相对于实验室工艺中存在或容器中存在的BH4以约1:1的比存在。

实施例

1.方法：

1.1临床队列

在2011年和2015年之间接受Oxford University Hospitals NHS FoundationTrust护理的妊娠女性被邀请参加临床研究，如前所述^1-3。从根据ISSHP指南定义的血压正常的妊娠、妊娠引起的高血压和先兆子痫中招募母亲和婴儿。血液样品在出生时采集。所有母亲都给出了书面知情同意书，以及同意其孩子参与，包括允许查阅母亲和子女的临床记录。16岁以下的母亲被排除在研究之外，那些产前患有慢性心血管状况(包括先前存在的高血压)的母亲也被排除在研究之外¹。伦理批准由South Central Berkshire ResearchEthics Committee ref.11/SC/0006,clinicaltrials.gov ref.NCT01888770授予^2,3。

1.2HUVEC分离、HutMEC培养和Matrigel测定

根据研究组织库(Oxford Cardiovascular Tissue Bioresource；伦理批准09/H0606/68,07/H0606/148和11/SC/0230)中的标准操作程序，在出生时收集脐带，并分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并储存在液氮中。为了当前研究的目的，从母亲年龄和妊娠期匹配的血压正常的妊娠和先兆子痫并发的妊娠中鉴定出HUVEC。HUVEC和人子宫微血管内皮细胞(HutMEC；Cat C-12295,Promocell)用bullet试剂盒(Cat CC-3162,Lonza)按推荐在EBM2(内皮基础培养基)中培养。所有细胞培养物均维持在37℃在加湿的5％ CO₂中。原代HUVEC和HutMEC细胞分别在第1-3代之间和第4-6代之间获得，用于所有实验。sEnd.1内皮细胞在补充有谷氨酰胺(2mmol/升)、青霉素(100单位/ml)和链霉素(0.1mg/ml)的Dulbecco改良Eagle培养基(Invitrogen)中生长。

为了评估内皮细胞的管形成能力，用50μl生长因子减少的Matrigel(BDBiosciences,UK)均匀涂覆96孔板。内皮细胞以每孔1×10⁴个细胞的密度铺板。在显微照像术之前，将板在37℃孵育16小时。每个样品以一式三份重复，并使用Nikon EclipseTE2000-U显微镜(Nikon Ltd,London,UK)以x4放大拍摄每个孔的图像。使用采集软件调整从Matrigel测定获得的图像的平均亮度，以控制显微镜的明场照明(Simple PCI 6.6.0.0版；Hamamatsu Corporation,Sewickley,PA)。将图像保存为TIFF文件，并使用AngioSys1.0(TCS Cell Works,UK)来分析管形成。基于单色图像的强度值调整图像阈值，并且然后使每个图像缩略(skeletonized)以减小到一个像素宽。在每个小管上画线，并用点标记每个分支点。以像素对线的总长度定量(然后转换成微米)，并记录分支点的总数。

1.3通过RNA干扰进行GCH1敲低

GCH1特异性ON-TARGETplus SMARTpool siRNA购自Dharmacon ThermoScientific。转染前24h，将细胞接种到6孔板中。然后用GCH1-特异性siRNA(100nmol/升)、GAPDH阳性(100nmol/升)或非特异性汇集双链体阴性对照siRNA(100nmol/升)转染细胞。将细胞培养72h，并使用标准方案，使用GTPCH特异性抗体(来自Cornell University NewYork的S.Gross的惠赠)通过蛋白印迹分析细胞中的GTPCH蛋白表达，从而检测基因沉默。

1.4胎盘细胞外囊泡的分离

使用改良的双叶胎盘灌注系统和差速离心来制备合体滋养层来源的细胞外囊泡(STBEV)，如前所述⁴。简而言之，将胎盘灌注3h，并收集母体侧灌注液，并立即在4℃以1500×g离心(Beckman Coulter Avanti J-20XP离心机和Beckman Coulter JS-5.3水平转子(swing-out rotor))10min两次，以去除红细胞和大细胞碎片。将上清液以150000g离心3小时以收集微囊泡和纳米囊泡。如前所述使用纳米颗粒追踪分析和流式细胞术来确认样品中颗粒的胎盘来源和尺寸分布⁵。收集后，将STBEV稀释在过滤的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中(4.9mg蛋白/ml)，并冷冻(-80℃)直到进一步用于血管实验。

1.5母体血液样品分析

用商业酶联免疫吸附测定(ELISA)对血浆循环促血管生成因子和抗血管生成因子定量。所有样品、标准品和对照以一式两份铺板。使用FLUOstar Omega微板读取器(BMGLabtech,KBioScience,USA)在450nm处测量每个孔的光密度。使用Omega Data Analysis软件分析数据。对每个标准品、对照和样品的一式两份的读数取平均值，并减去平均零标准光密度。通过生成四参数逻辑曲线拟合来创建标准曲线。sFlt-1的变异系数为4.5％且SD为1.9％，并且对于sEng，其变异系数为4.1％且SD为1.6％。

1.6内皮细胞-靶向Gch1敲除小鼠的产生

我们产生了内皮细胞特异性BH4缺乏的新的小鼠模型：Gch1^fl/flTie2cre小鼠。Gch1的编码GTPCH活性位点的外显子2和3的侧翼是靶向构建体中的loxP位点，用于在胚胎干细胞中同源重组后产生Gch1^fl/fl小鼠。将这些小鼠与Tie2cre转基因小鼠杂交以产生Gch1^fl/ ^flTie2cre小鼠，其中Gch1在内皮细胞中特异性缺失，产生内皮细胞BH4缺乏的小鼠⁶。小鼠居于通风的笼子中，有12小时的光/暗循环和受控的温度(20℃-22℃)，并随意进食正常的食物和水。雌性Gch1^fl/flTie2cre小鼠及其Gch1^fl/fl同胎仔(此后称为野生型)在10周至16周用于所有实验。所有研究均根据UK Home Office Animals(Scientific Procedures)Act1986(HMSO,London,United Kingdom)进行。使用从耳部活检制备的DNA通过聚合酶链式反应对小鼠进行基因分型。对于Gch1^fl/fl基因分型，使用以下引物进行PCR：Gch1 fl/fl-Fw5’-GTC CTT GGT CTC AGT AAA CTT GCC AGG-3’，Gch1 fl/fl-Rv 5’-GCC CAG CCA AGGATA GAT GCAG-3’。Gch1的loxp位点置于基因两侧的等位基因显示为1030bp。对于Tie2cre基因分型，使用以下引物进行PCR：Tie2cre Fw 5’-GCA TAACCA GTG AAA CAG CAT TGC TG-3’。Tie2cre Rv 5’-GGA CAT GTT CAG GGA TCG CCA GGC G-3’。Tie2cre等位基因扩增为280bp片段。

1.7按时交配

妊娠通过将未交配过的雌性(Gch1^fl/flTie2cre或Gch1^fl/fl(野生型)雌性(鼠龄在10周至16周之间))与Gch1^fl/fl雄性交配来实现。为了评估妊娠日，在次日早上检查阴道栓，视为妊娠0.5天(E0.5)。有栓的Gch1^fl/flTie2cre和野生型小鼠的体重在整个妊娠期间(E0、E2.5、E5.5、E7.5、E10.5、E12.5、E15.5、E16.5、E17.5和E18.5)进行确定。从非妊娠和妊娠(在E18.5)的Gch1^fl/flTie2cre和野生型雌性收集尿液样品，并储存在-80℃，用于生物化学分析。除非另外说明，否则所有组织均在受孕前(在按时交配之前)或妊娠E18.5天(妊娠晚期，正常足月分娩前两天)收获和采集用于实验。

1.8BH4和生物蝶呤测量

血浆和子宫动脉中的BH4和氧化型生物蝶呤(BH2和生物蝶呤)分别通过高效液相色谱(HPLC)随后电化学和荧光检测来测定，遵循已确立的方案^7,8。简而言之，将样品在冰冷的重悬缓冲液(50mM磷酸盐缓冲盐水，1mM二硫赤藓糖醇，1mM EDTA，pH 7.4)中冻融。在4℃以13,200rpm离心10min后，去除上清液并添加冰冷的酸沉淀缓冲液(1M磷酸、2M三氯乙酸、1mM二硫赤藓糖醇)。在4℃以13,200rpm离心10min后，去除上清液并注射到HPLC系统上。通过与外部标准品进行比较获得BH4和氧化型生物蝶呤的定量，并归一化至通过BCA蛋白测定确定的蛋白浓度。

1.9血管功能研究

在线肌动描记仪(MultiMyogrph 610M,Danish Myo Technology,Denmark)中使用等长张力研究来检查来自非妊娠和妊娠(E18.5)的Gch1 fl/flTie2cre和野生型同胎仔的子宫动脉和主动脉的血管舒缩功能⁶。简而言之，通过过量吸入异氟醚处死小鼠，并从子宫角或胸主动脉中分离血管环。然后在37℃将2mm子宫动脉环(主环)或主动脉环安置在含有5ml冰冷KrebsHenseleit缓冲液(KHB[以mmol/l计]：NaCl 120、KCl 4.7、MgSO₄ 1.2、KH₂PO₄1.2、CaCl₂ 2.5、NaHCO₃ 25、葡萄糖5.5)的线肌动描记仪中，用95％ O₂/5％ CO₂通气。允许血管平衡30分钟后，设定最佳张力(相当于100mmHg)。分别使用U46619(血栓素A2受体激动剂)和苯肾上腺素的累积半对数浓度建立浓度-响应收缩曲线。用新鲜KHB洗涤血管三次，平衡20分钟，并且然后用U46619使子宫动脉或用苯肾上腺素使主动脉预收缩至最大张力的约80％-90％。使用累积浓度递增的乙酰胆碱来刺激内皮依赖性血管舒张。响应表示为预收缩张力的百分比。最后，使用NO供体硝普钠(SNP)来测试在存在L-NAME的情况下内皮非依赖性平滑肌舒张。在确定剂量响应曲线之前，所有药理学药物均被预孵育至少20min。以100μM使用L-NAME，以50nM使用蜂毒明肽，以100nM使用卡律蝎毒素，并以10μM使用吲哚美辛。使用的所有药物均购自Sigma Chemical Company。

1.10通过尾套体积描记法测量血压

使用计算机化的尾套系统(Visitech,USA)确定清醒小鼠中的收缩血压和心率⁶。实验在上午8点和12点之间进行。将动物尾巴穿过圆筒形乳胶尾套，并用胶带粘住以减少移动。每只小鼠采集20个读数，其中前5个读数被弃去。剩余15个读数用于计算每只小鼠中的平均收缩血压和心率。

1.11通过植入式遥测测量血压

非妊娠的雌性Gch1fl/flTie2cre和Gch1fl/fl(野生型)小鼠(8周龄-10周龄)接受遥测仪(PAC10无线电遥测仪；DSI,Transoma Medical Inc.)的胸主动脉植入，如前所述。简而言之，将遥测仪导管植入左颈动脉，其中将遥测仪的主体放置在与前爪和后爪等距的皮下袋(subcutaneous pocket)中。然后用4.0Vicryl使伤口闭合。术后，将小鼠保持在37℃的恢复室中直到小鼠活动，并随后移至28℃的恢复室中，再持续4h。在居住笼子(放置在遥测接收器上方)中恢复14天后，将遥测仪磁激活，并连续记录基线平均动脉血压(MAP)5天(每1分钟取样，10秒区隔)。妊娠通过雌性Gch1^fl/flTie2cre或Gch1^fl/fl(野生型)雌性与Gch1^fl/fl雄性交配实现。为了评估妊娠日，在次日早上检查阴道栓，视为妊娠0.5天(E0.5)。在整个妊娠期间连续记录MAP，直到妊娠E18.5天。

1.12分析由eNOS的NO合成

由eNOS的NO合成通过在存在和不存在N-单甲基-L-精氨酸(1mM，Sigma)的情况下¹⁴C L-精氨酸向瓜氨酸的转化来评估，如前所述⁹。简而言之，将HUVEC在200μl含有¹⁴C L-精氨酸(2μl的50μCi/mL)的Krebs-HEPES缓冲液中在37℃孵育4小时。样品在SCX 300阳离子交换HPLC柱(Sigma)上运行，伴随在线闪烁检测。用没有细胞的单独的¹⁴C L-精氨酸对样品的背景信号进行校正。

1.13显微CT成像

使用SkyScan 1172显微CT(Bruker)对胎盘进行成像。将胎盘封固在密封样品容器中的1.5％琼脂糖中。X射线图像以45kv的电压和218μA的电流产生，未应用滤光器。扫描分辨率设定为每像素2.5μM。使用NRecon软件(Bruker)生成虚拟图像栈(virtual imagestack)。将图像栈缩小到每像素10μM的分辨率。使用AMIRA软件(5.5.0版)生成3D重建。

1.14组织学和免疫染色

以100mmHg灌注固定后，从妊娠E18.5天的野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠收获胎盘和子宫动脉。根据制造商的说明，将石蜡包埋的胎盘和子宫动脉用H&E染色并且针对α-平滑肌肌动蛋白进行免疫组织化学染色(Sigma)。

1.15统计分析

数据呈现为平均值±SEM。使用D’Agostino和Pearson omnibus正态性检验来检验正态性。对于非参数数据，使用Mann-Whitney U检验对各组进行比较；或者对于参数数据，使用非配对Student t检验对各组进行比较。在对多于一个组进行比较时，对于参数数据，通过方差分析(ANOVA)和Newman-Keuls事后检验来分析数据；或者对于非参数数据，通过Kruskal-Wallis检验和Dunns事后检验来分析数据。当存在多于两个自变量时，使用双因素ANOVA和Tukey多重比较检验。当受试者内存在重复测量时，使用重复测量(RM)ANOVA。P值<0.05被认为是统计学上显著的。

1.16通过HPLC对超氧化物产生进行定量

如前所述，通过HPLC测量2-羟基乙锭形成用于对超氧化物产生进行定量。简而言之，将细胞在PBS中洗涤三次，并在存在或不存在l-NAME(100μm)的情况下在Krebs-Hepes缓冲液中孵育。30min后，添加二氢乙锭(25μm)，并且然后将细胞在37℃孵育另外20min。然后通过刮取来收获细胞、离心并在冰冷的甲醇中裂解。添加盐酸(100mm)(1:1v/v)，然后装载到自动进样器中进行分析。所有的样品均储存在黑暗的管中，并始终避光。乙锭、氧乙锭(oxyethidium)和二氢乙锭的分离使用梯度HPLC系统(Jasco)和ODS3反相柱(250mm,4.5mm；Hichrom)进行，并使用设定在510nm(激发)和595nm(发射)的荧光检测器进行定量。应用23min内从流动相A(0.1％ TFA(v/v))至流动相B(0.1％ TFA(v/v)在乙腈中)的线性梯度(30％乙腈至50％乙腈)。

1.17免疫沉淀和蛋白印迹

在将细胞暴露于适当处理后，将细胞悬浮在包含蛋白酶抑制剂混合物(RocheApplied Science)的放射免疫沉淀测定裂解缓冲液(20mm Tris-HCl、150mm NaCl、20mm N-乙基马来酰亚胺、1mm Na₂EDTA、1mm EGTA、1％Triton(v/v)、0.1％SDS(w/v)、0.1脱氧胆酸钠，pH 7.4)中，并在液氮中进行三次冻融循环。使用标准技术，用兔抗小鼠GTPCH抗体(Steve Gross教授的惠赠)、抗eNOS抗体(BD Transduction Laboratories)和抗GAPDH(Sigma)抗体中的任一种进行蛋白印迹。

2.结果

2.1先兆子痫或妊娠期高血压与降低的内皮细胞GTPCH和BH4水平、受损的NOS活性和受损的内皮管形成相关

为了研究先兆子痫或妊娠并发高血压中内皮GCH1和BH4是否发生改变，我们测量了从患有妊娠并发先兆子痫(PE)和/或高血压的女性分娩时获得的原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和血浆中的BH4水平，与具有血压正常的妊娠母亲进行比较。研究患者的临床特征在表1中示出：

表1.队列特征(HUVEC)

除非另外说明，否则值为平均值±标准差。

sBP收缩血压；dBP舒张血压；LFT：肝功能测试。统计学上显著的p值标星号。

*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001

患有先兆子痫和/或高血压的母亲在产后5天血压较高，并且可溶性内皮联蛋白和sFlt1两者水平升高。我们发现，与来自血压正常妊娠的内皮细胞相比，来自先兆子痫/高血压妊娠的HUVEC中的BH4、GTPCH蛋白水平和eNOS活性显著降低(图1a-d)。此外，内皮细胞管形成(内皮细胞生长的标志物)在来自高血压/先兆子痫妊娠的HUVEC中减少(图1e-g)。为了测试这些内皮细胞异常对BH4的依赖性，与BH4前体墨喋呤一起孵育，使来自高血压/先兆子痫妊娠的HUVEC中的BH4水平和NOS活性两者均正常化，使得各组之间的BH4水平和NOS活性不再有差异(图1d和e)。此外，墨喋呤恢复了来自高血压/先兆子痫妊娠的HUVEC中的管形成(图1e-g)。与来自高血压/先兆子痫妊娠的内皮细胞中BH4水平降低相比，患有高血压/先兆子痫的母亲中的循环血浆BH4水平和总生物蝶呤显著高于对照(图7c-e)，并与BH4/BH2比值降低相关，表明更大的全身BH4氧化。此外，与妊娠早期相比，正常女性和高血压/先兆子痫女性两者中的血浆BH4水平在妊娠晚期均显著降低(图7)。为了进一步研究BH4在人类胎盘循环中的相关性，我们研究了从患有或未患有高血压/先兆子痫的女性获得的灌注胎盘中分离的胎盘细胞外囊泡(该模型系统以前被显示反映了胎盘血管功能的关键方面的变化)中的BH4水平，包括eNOS的水平。我们发现来自高血压/先兆子痫妊娠的胎盘灌注的胎盘细胞外囊泡中的BH4含量显著低于来自健康妊娠的胎盘细胞外囊泡中的BH4含量(图1H)。

2.2Gch1的敲低降低了GTPCH蛋白和BH4水平并损害了内皮细胞中的内皮管形成

接下来，利用siRNA在小鼠sEND.1内皮细胞系(其作为eNOS受Gch1和BH4调节的模型系统已被广泛研究)中敲低Gch1，我们测试了Gch1和BH4在内皮细胞管形成中的因果作用。我们发现，Gch1特异性siRNA显著降低了GTPCH蛋白水平(图2a)，其中与非特异性siRNA对照相比，细胞内BH4水平相应降低了～90％(图2b)。BH4相对于氧化型生物蝶呤种类的比值(BH4:BH2+B)在用Gch1-特异性siRNA处理的细胞中也显著降低(图2b)。与先前在HUVEC中的发现一致，Gch1敲低损害了内皮细胞管形成(图2c-e)，而与墨喋呤一起孵育，通过蝶呤挽救途径导致细胞内BH4合成，增加了BH4水平并完全恢复了管形成(图2c-e)。因此，Gch1是培养的内皮细胞中正常BH4生物合成、eNOS活性和管形成所需的，支持了以下观点，即，在来自先兆子痫妊娠的内皮细胞中观察到的内皮细胞GTPCH和BH4的降低可能在先兆子痫的发病机制中起因果作用。为了进一步测试这些观察结果与人母体内皮细胞的相关性，我们还在原代人子宫微血管内皮细胞(HUtMEC)中敲低了GCH1。GCH1敲低显著降低了HUtMEC中GTPCH蛋白表达和BH4水平(图2f和g)，并导致管形成测定中内皮细胞生长显著降低(图2h和i)。总之，这些观察结果表明内皮细胞GCH1和BH4调节内皮细胞生长和管形成，内皮细胞BH4降低是先兆子痫的特征，并且与内皮细胞NOS活性的损失相关。

2.3内皮细胞特异性Gch1缺失在雌性Gch1^fl/flTie2cre小鼠中导致妊娠引起的高血压和胎儿生长受限

为了研究母体内皮细胞BH4在妊娠期间子宫胎盘血管适应和血压调节中的具体作用，我们接下来研究了具有内皮细胞特异性Gch1(编码GTP环水解酶1)缺失的雌性小鼠中对妊娠的反应。在妊娠第18.5天，利用来自与tdTomato报告小鼠杂交的Tie2cre小鼠的组织切片的荧光成像，在子宫动脉和胎盘蜕膜的螺旋动脉而不是其他蜕膜细胞中确认了loxp位点置于基因两侧的等位基因的内皮细胞特异性切除(图8)。在非妊娠小鼠中，与野生型小鼠相比，来自Gch1^fl/flTie2cre小鼠的主动脉和子宫动脉中的BH4和总生物蝶呤水平显著较低(图3a和b)，而血浆BH4水平在基因型之间没有差异(图3c)，表明内皮细胞BH4合成不是健康非妊娠雌性小鼠中的循环生物蝶呤水平的主要贡献者。在妊娠小鼠中，主动脉和子宫动脉中的BH4和总生物蝶呤水平与来自相同基因型的非妊娠小鼠相当(图3a和b)。然而，在野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠两者中，BH4和总生物蝶呤的血浆水平在妊娠小鼠中显著降低，在Gch1^fl/flTie2cre小鼠中降低的程度更大(图3c)。此外，与非妊娠Gch1^fl/flTie2cre小鼠或妊娠野生型小鼠相比，在妊娠Gch1fl/flTie2cre小鼠中血浆中的BH4:BH2+B(总生物蝶呤)比值显著降低(图3d)，表明妊娠期内皮细胞特异性BH4缺乏导致BH4由于氧化形成BH2和B而进一步减少。妊娠期血浆生物蝶呤的减少与肝生物蝶呤(被认为是循环生物蝶呤的主要来源)的任何差异不相关，但与尿液生物蝶呤的显著增加相关，表明妊娠期生物蝶呤的肾排泄增加(图9和图10)。然而，在Gch1^fl/flTie2cre小鼠中妊娠相关的尿生物蝶呤增加并未更大，在Gch1^fl/flTie2cre小鼠中血浆肌酐或肾组织学也没有任何变化，表明内皮细胞Gch1和BH4缺失并不通过肾功能的变化产生影响(图11和图12)。

接下来，我们确定了母体内皮细胞BH4生物合成在妊娠期血压调节中的需求。我们首先在妊娠小鼠中使用尾套体积描记法。如先前报道的(17)，与非妊娠野生型同胎仔相比，雌性非妊娠Gch1^fl/flTie2cre小鼠中的收缩血压略高(～5mmHg)(图3e)。然而，与非妊娠Gch1^fl/flTie2cre小鼠相比，到妊娠E15.5天，妊娠Gch1^fl/flTie2cre小鼠的收缩血压显著增加到基础水平以上，并且在妊娠E18.5天进一步升高(图3e)。相比之下，在妊娠期间，野生型小鼠的血压未观察到显著变化(图3e)。我们使用妊娠前植入的植入式遥测仪进一步评估了血压变化。我们观察到，Gch1^fl/flTie2cre小鼠在妊娠期间血压的进行性升高主要由升高的收缩血压驱动，而Gch1^fl/flTie2cre小鼠的舒张血压仅在妊娠末期显著增加(图13和图14)。为了解决Gch1^fl/flTie2cre小鼠中的基线血压小幅升高的潜在影响，我们首先分析了基线血压匹配的另外的Gch1^fl/flTie2cre和野生型小鼠的队列。在妊娠前血压与配对的野生型小鼠队列相同的Gch1^fl/flTie2cre小鼠中，妊娠期间的血压升高显著增加(23+/-5mmHg)，而野生型队列显示在妊娠期间血压没有升高(图14)。接下来，我们生成了仅有一个Gch1等位基因为内皮细胞特异性缺失的小鼠的队列，即Gch1^fl/+Tie2cre小鼠，以便研究损失单个Gch1是否会足以引起内皮细胞BH4缺乏，并且如果是这样，对血压有何影响。我们发现，与野生型小鼠相比，Gch1^fl/+Tie2cre小鼠的主动脉和肺中的BH4水平降低了约50％，而小于在Gch1^fl/ ^flTie2cre小鼠中观察到的BH4的～80％的降低(图16)。Gch1^fl/+Tie2cre小鼠的肝中BH4水平无变化。在妊娠Gch1^fl/+Tie2cre小鼠中，子宫动脉中的BH4水平降低了～80％(图16)。Gch1^fl/+Tie2cre小鼠中的血压测量揭示，基线(妊娠前)血压没有差异，但在Gch1^fl/+Tie2cre小鼠中，在妊娠晚期期间仍观察到血压显著升高，尽管基线血压正常且内皮细胞BH4缺乏的程度降低(图17)。

这些数据表明，在Gch1^fl/flTie2cre小鼠中，由内皮细胞BH4缺乏引起的对妊娠的高血压响应是剂量依赖性的，但不依赖于基线血压的小幅升高。为确定母体内皮细胞BH4对胎盘和胎儿发育的重要性，在受孕前和整个妊娠期间确定了Gch1^fl/flTie2cre和野生型小鼠的体重增加。Gch1^fl/flTie2cre小鼠和野生型同胎仔之间的受孕前体重相似。然而，与野生型同胎仔相比，从妊娠E12.5天开始，Gch1^fl/flTie2cre小鼠中的母体体重增加显著降低(图3f)，这不是由心脏、肝、肺、肾或脾的器官重量的任何差异引起的(图18)。Gch1^fl/flTie2cre和野生型小鼠之间在妊娠E18.5天或分娩时每胎幼仔数无显著差异(图3g)。Gch1^fl/flTie2cre和野生型小鼠之间的分娩开始时间相当(图3h)。由于先兆子痫与胎盘和胎儿生长受限相关，因此我们评估了母体内皮细胞BH4缺乏对妊娠第18.5天的胎盘尺寸和胎儿重量的影响。我们发现，与野生型雌性相比，来自妊娠Gch1^fl/flTie2cre雌性的胎儿和胎盘两者均显著更小(胎儿和胎盘两者均小～10％)(图3i和j)。来自妊娠Gch1^fl/flTie2cre小鼠的胎儿的冠-臀长有相应降低(图3k)。与在E18.5的胎儿尺寸的降低一致，来自Gch1^fl/flTie2cre雌性的足月出生的后代的平均体重显著低于来自野生型小鼠的后代的平均体重(图3l和m)。为了区分母体内皮细胞BH4生物合成的作用与胎儿BH4生物合成的作用，将野生型雌性与Gch1^fl/ ^flTie2cre雄性交配，并将Gch1^fl/flTie2cre雌性与野生型雄性交配，以便产生具有等比例野生型和Gch1^fl/flTie2cre后代的匹配胎的妊娠雌性小鼠(对于繁殖策略，参见图19)。仅Gch1^fl/flTie2cre雌性在妊娠期间发展为进行性高血压，而与Gch1^fl/flTie2cre雄性交配的野生型雌性小鼠在妊娠期间具有正常血压(图19)。类似地，胎儿尺寸的降低仅依赖于母体Gch1^fl/flTie2cre基因型。此外，来自Gch1^fl/flTie2cre小鼠的雄性胎儿和雌性胎儿之间的胎儿重量降低没有差异(图20)。我们还在妊娠Gch1^fl/+Tie2cre小鼠中评估了母体内皮细胞中Gch1杂合性损失对胎儿生长的影响，Gch1^fl/+Tie2cre小鼠与WT雄性小鼠杂交以产生仅具有WT和Gch1^fl/+Tie2cre胚胎(即没有内皮细胞Gch1纯合性缺失的胚胎)的胎仔。妊娠Gch1^fl/+Tie2cre小鼠生出的幼仔显著小于WT小鼠生出的幼仔(图17)。这些发现表明，母体而不是胎儿的内皮细胞BH4的缺乏，导致妊娠引起的高血压，并且是胎儿生长降低的原因。

2.4内皮细胞BH4是妊娠中功能性和结构性子宫胎盘重塑所需的

接下来，我们使用线肌动描记测试了内皮细胞BH4缺乏对来自非妊娠小鼠和来自E18.5妊娠小鼠的子宫动脉(UA)的血管功能的影响。在妊娠期间，与非妊娠小鼠相比，来自妊娠的野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠两者的子宫动脉产生的最大张力均显著增加(图4a)，但壁应力(相对于血管壁面积的张力)降低，反映了妊娠相关的子宫动脉内皮功能变化(图4b)。然而，与WT小鼠相比，来自妊娠Gch1^fl/flTie2cre小鼠的子宫动脉的长度-张力关系显著改变(图21)。此外，在存在一氧化氮抑制剂L-NAME的情况下，野生型小鼠的子宫动脉中响应于U46619的血管收缩反应增加(达到在非妊娠子宫动脉中观察到的水平)，而在Gch1^fl/ ^flTie2cre小鼠中不变(图4c和d)，表明野生型子宫动脉中的eNOS源性收缩反应调节不存在于妊娠Gch1^fl/flTie2cre小鼠中。

在Gch1^fl/flTie2cre子宫动脉中，响应于乙酰胆碱(ACh)的内皮依赖性血管舒张降低(图4E)，且EC50相应增加，而对于直接NO供体硝普钠SNP，内皮非依赖性血管舒张没有差异(图4e-j)。在主动脉响应于苯肾上腺素的收缩反应和响应于ACh的舒张反应方面观察到相应的差异(图22)。与野生型子宫动脉相比，NOS抑制剂L-NAME并未显著抑制Gch1^fl/ ^flTie2cre子宫动脉中的ACh血管舒张(图4g和h)，这添加了妊娠期间Gch1^fl/flTie2cre子宫动脉中eNOS介导的血管舒张功能损失的进一步证据。

为了研究妊娠期间Gch1^fl/flTie2cre子宫动脉中的替代性血管舒张机制，我们接下来对L-NAME、吲哚美辛(前列环素的产生的抑制剂)、蜂毒明肽(小电导率Ca²⁺激活的K⁺通道的抑制剂)和卡律蝎毒素(中等电导率和大电导率Ca²⁺激活的K⁺通道的抑制剂)的抑制作用进行了比较。吲哚美辛的添加对来自妊娠或非妊娠的野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠的子宫动脉的内皮依赖性血管舒张作用最小(图4k和l)。相比之下，蜂毒明肽和卡律蝎毒素的添加完全抑制了子宫动脉中的内皮依赖性血管舒张。对子宫动脉中的血管舒张反应的相对贡献的系统定量揭示，在妊娠Gch1^fl/flTie2cre小鼠中，L-NAME抑制作用显著损失，并且蜂毒明肽/卡律蝎毒素抑制作用显著增加(图4m和图23)。总之，这些观察结果表明，eNOS源性血管舒张功能在来自妊娠Gch1^fl/flTie2cre小鼠的子宫动脉中损失，其中Ca²⁺激活的K⁺通道提供了替代性的内皮源性血管舒张功能。为了确定内皮细胞BH4缺乏对妊娠期结构性血管重塑的影响，我们对来自野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠的子宫动脉和胎盘螺旋动脉进行了比较。与来自野生型妊娠雌性的胎盘重量和胎盘尺寸相比，来自妊娠日E18.5天的Gch1^fl/ ^flTie2cre妊娠的胎盘重量和胎盘尺寸显著降低(图5a-e)。在子宫动脉中，与非妊娠小鼠相比，妊娠导致野生型和Gch1^fl/flTie2cre小鼠两者的子宫动脉中的内侧面积、管腔直径和管腔面积的预期显著增加(图5f和g)，反映了妊娠期间子宫血流量的增加。然而，这些变化在Gch1^fl/flTie2cre小鼠的子宫动脉中显著受损(图5f和g)，其中管腔面积增加较小，内侧面积和血管平滑肌肌动蛋白免疫染色面积增加，并且内侧与管腔的比值显著增加。此外，我们发现来自Gch1^fl/flTie2cre小鼠的胎盘中的蜕膜螺旋动脉未能经历在野生型小鼠中观察到的重塑，如由管腔面积降低和肌肉化增加所示，通过针对VSMCα-肌动蛋白的免疫组织化学揭示(图5h和i)。这些发现表明，选择性内皮细胞BH4缺乏导致在对妊娠的母体生理反应中子宫导管动脉和胎盘阻力血管(placental resistance vessel)两者中的血管重塑受损。

2.5补充BH4未能预防Gch1^fl/flTie2cre小鼠中的妊娠引起的高血压和胎儿生长受限，但被还原型叶酸5-MTHF挽救

我们推断，妊娠期内皮细胞BH4缺乏的后果可能可通过BH4补充来预防，并且这可能具有转化为治疗的潜力。在按时交配前持续3天和随后的整个妊娠期间，我们用口服补充BH4处理Gch1^fl/flTie2cre和野生型小鼠两者。我们发现，口服补充BH4增加了血浆BH4水平，但与氧化型种类二氢生物蝶呤(BH2)的相似或甚至更大的增加相关，且BH4/BH2+B(总生物蝶呤)比值相应降低(图6a-c和图24)，如同我们先前在已确定血管疾病的患者中观察到的¹⁰。口服补充BH4对Gch1^fl/flTie2cre小鼠的血压或胎儿生长受限均无有益作用(图6d-i)。

二氢叶酸还原酶(DHFR)将二氢叶酸还原为完全还原型叶酸(四氢叶酸)，并且也可以将氧化型BH2还原以再生BH4。因此，我们假设共施用完全还原型叶酸5-甲基-四氢叶酸(5-MTHF)可能会增加血管BH4水平(18)。用BH4和5-MTHF处理妊娠小鼠导致Gch1^fl/flTie2cre小鼠中的BH4水平显著恢复，而BH2未显著升高，并且预防了在未经处理的Gch1^fl/flTie2cre小鼠中观察到的血压升高和胎儿生长受限(图6d-i)。另外，我们发现BH4+5-MTHF的组合导致Gch1^fl/flTie2cre小鼠中响应于U46619的收缩反应和响应于ACh的舒张反应明显正常化，恢复了在野生型动物中观察到的反应(图6j-l)。

此外，用单独的5-MTHF处理也有治疗益处。用单独的5-MTHF处理导致Gch1^fl/ ^flTie2cre小鼠的收缩血压显著且几乎立即降低至野生型小鼠的正常血压(参见图26c)。另外，我们发现用常见补充的叶酸进行处理对收缩血压没有有益作用，事实上，血压在妊娠期间以与对照类似的方式升高(参见图26a和图26b)。在内皮细胞中，与叶酸一起孵育对BH4水平没有影响(图28)，相比之下，在与氨甲蝶呤(二氢叶酸还原酶(DHFR)抑制剂)一起孵育后，5-MTHF使来自具有高血压的妊娠的HUVEC中的内皮细胞(图36)或细胞(图27)中的BH4水平增加或恢复。事实上，叶酸增加了内皮细胞的活性氧种类(ROS)的产生(图33)，而5-MTHF降低了内皮细胞ROS产生(图37和图38)。5-MTHF，而不是叶酸，增加了内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性，如通过被eNOS抑制剂L-NAME抑制的L-精氨酸向L-瓜氨酸的转化所测量的(图34)。这些观察结果表明，由本申请的发明人发现并在本文中展示的治疗作用不是‘叶酸’的作用(即熟知的叶酸对甲基化过程、同型半胱氨酸等的经典作用)，而是依赖于叶酸的化学还原形式(即5-MTHF)而不是氧化形式(即叶酸)的新作用。

我们还测试了当5-MTHF处理在妊娠期间而不是在妊娠之前开始时，5-MTHF处理降低妊娠Gch1^fl/flTie2cre小鼠中血压的能力。在按时交配后10.5天或16.5天开始以及妊娠的整个剩余时间(分别代表对应于妊娠中期和妊娠晚期的时间点)，我们用口服5-MTHF处理Gch1^fl/flTie2cre和野生型小鼠两者。我们发现，当在第10.5天开始时，口服5-MTHF处理使Gch1^fl/flTie2cre小鼠中的高血压正常化(图39和图40)，并显著改善了胎儿生长受限(图40)。当在第16.5天开始时，5-MTHF也使Gch1^fl/flTie2cre小鼠中的高血压正常化(图41)。在这两种情况中均观察到，在5-MTHF处理后，在开始处理的2天内血压快速降低。这些研究表明，5-MTHF不仅能够预防妊娠Gch1^fl/flTie2cre小鼠中发展高血压，而且能够治疗妊娠期间已经发展的高血压。

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Claims

1.一种还原型叶酸，用于在预防或治疗与低BH4生物利用度相关的病症中使用，其中所述还原型叶酸不用于与以下中的任一种联合施用：

o阿司匹林；

o植物提取物。

2.根据权利要求1所述的用于使用的还原型叶酸，与BH4、其前体或功能等同物联合。

3.根据权利要求1或2所述的用于使用的还原型叶酸，其中所述还原型叶酸和任选地BH4、其前体或功能等同物是仅有的活性药剂。

4.根据权利要求1所述的用于使用的还原型叶酸，其中所述还原型叶酸是仅有的活性药剂。

5.一种组合，所述组合为还原型叶酸和BH4、其前体或功能等同物的组合，用于在预防或治疗与低BH4生物利用度相关的病症中使用。

6.一种组合物，包含一种或更多种活性药物成分，用于在预防或治疗与低BH4生物利用度相关的病症中使用，其中所述一种或更多种活性药物成分由还原型叶酸和任选地BH4、其前体或功能等同物组成。

7.根据权利要求6所述的用于使用的组合物，其中所述活性药物成分由还原型叶酸组成。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述还原型叶酸是其天然立体异构体形式。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述还原型叶酸增加或恢复BH4水平。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述还原型叶酸防止BH4的氧化。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述还原型叶酸选自：DHF、5-FTHF、THF、5,10-CH-THF、5,10-CH₂-THF、5-MTHF和10-FTHF，或其药学上可接受的盐，优选地其中所述还原型叶酸是5-MTHF或其药学上可接受的盐。

12.如权利要求1-11中任一项所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述BH4、其前体或其功能等同物是选自以下的前体：GTP；NH2TP；PTP；氧代-PH4；7,8-BH2；HO-BH4；q-BH2；L-精氨酸和L-瓜氨酸。

13.根据权利要求1-11中任一项所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述BH4、其前体或其功能等同物是选自以下的功能等同物：新蝶呤；墨蝶呤；生物蝶呤；和7-生物蝶呤。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述与低BH4生物利用度相关的病症由蝶呤生物合成途径内的一种或更多种酶的活性受损引起。

15.根据权利要求14所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述蝶呤生物合成途径内的一种或更多种酶选自：GTP环水解酶I(GTPCH)、6-丙酮酰-四氢蝶呤合酶(PTPS)、墨喋呤还原酶(SP)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、二氢蝶啶还原酶(DHPR)、蝶呤-4a-甲醇胺脱水酶(PCD)和内皮型NOS(eNOS)。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述与低BH4生物利用度相关的病症选自：BH4缺乏(四氢生物蝶呤缺乏)、苯丙酮尿症(PKU)、GTP环水解酶缺乏、多巴反应性肌张力障碍、6-丙酮酰-四氢蝶呤合酶缺乏、墨喋呤还原酶缺乏、二氢叶酸还原酶缺乏、二氢蝶啶还原酶缺乏和蝶呤-4a-甲醇胺脱水酶缺乏。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述与低BH4生物利用度相关的病症是心脏疾病、肝疾病、神经疾病或血管疾病。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述与低BH4生物利用度相关的病症是妊娠相关的病症。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述与低BH4生物利用度相关的病症是妊娠相关的血管病症。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述与低BH4生物利用度相关的病症是妊娠期高血压。

21.根据权利要求1-19中任一项所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述与低BH4生物利用度相关的病症是先兆子痫。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述还原型叶酸用于施用至被诊断为患有妊娠相关的血管病症后的受试者。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述还原型叶酸、组合或组合物在预防后代中与BH4水平不足相关的病症方面是有效的。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述预防或治疗是在先前罹患与BH4水平不足相关的病症的受试者中进行。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述预防或治疗是在先前罹患妊娠期高血压的受试者中进行。

26.根据权利要求1-24中任一项所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述预防或治疗是在先前罹患先兆子痫的受试者中进行。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述还原型叶酸用于以每天1mg和50mg之间、优选地每天2mg和30mg之间、优选地每天3mg和25mg之间、优选地每天4mg和20mg之间、优选地每天5mg和15mg之间的剂量施用。

28.根据权利要求1-27中任一项所述的用于使用的还原型叶酸、组合或组合物，其中所述还原型叶酸用于每天一次或两次施用。

29.一种选择受试者的方法，所述方法选择能够从使用还原型叶酸和任选地BH4、其前体或功能等同物的治疗中获益的受试者，所述方法包括确定受试者中与低BH4生物利用度相关的病症的一种或更多种标志物的水平，将所述标志物的水平或每种标志物的水平与健康受试者中的参考水平进行比较，并且如果与所述参考水平相比，受试者表现出与低BH4生物利用度相关的病症的一种或更多种标志物的异常水平，则选择所述受试者进行治疗。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述方法还包括向所选择的受试者提供治疗。

31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述治疗包括还原型叶酸和任选地BH4、其前体或功能等同物。

32.根据权利要求29-31中任一项所述的方法，其中所述还原型叶酸是其天然立体异构体形式。

33.根据权利要求31-32中任一项所述的方法，其中在妊娠之前向所选择的受试者提供所述还原型叶酸。

34.根据权利要求31-33中任一项所述的方法，其中在妊娠早期中向所选择的受试者提供所述还原型叶酸。

35.根据权利要求31-34中任一项所述的方法，其中在妊娠中期或妊娠晚期中向所选择的受试者提供所述还原型叶酸。

36.根据权利要求31-35中任一项所述的方法，其中在所选择的受试者中测量到与低BH4生物利用度相关的病症的一种或更多种标志物的异常水平之后，向所述受试者提供所述还原型叶酸。

37.一种药物组合物，包含还原型叶酸和BH4、其前体或功能等同物。

38.一种药盒，包含：

-还原型叶酸；和

-BH4、其前体或其功能等同物。

39.还原型叶酸用于在体外防止BH4、其前体或功能等同物氧化的用途。

40.根据权利要求37所述的药物组合物、权利要求38所述的药盒或权利要求39所述的用途，其中所述还原型叶酸是其天然立体异构体形式。