CN116712402A - 一种mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒及其制备方法和应用 - Google Patents
一种mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种mFe‑CA仿生膜包被抗菌微粒及其制备方法和应用。所述制备方法，包括以下步骤：(1)将四氧化三铁、肉桂醛与海藻酸盐制备获得Fe‑CA微粒；(2)用血小板膜和红细胞膜包被Fe‑CA微粒获得所述mFe‑CA仿生膜包被抗菌微粒。本发明肺靶向性的mFe‑CA抗菌微粒可以有效释放CA和快速释放Fe；出乎意料的是，两者协同产生了诱导细菌铁死亡效应和抑制群体感应作用，这可以影响生物膜的形成和毒力因子的表达，这种非抗生素的协同抗菌作用不易被耐药细菌抵抗，因此可以有效地抑制耐药性病原体，可以用于治疗耐药细菌感染产生的疾病。
Description
技术领域
本发明涉及医药材料技术领域，具体涉及一种mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒及其制备方法和应用。
背景技术
细菌性肺炎治疗是一个具有挑战性的全球性公共卫生问题，具有很高的发病率和死亡率。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的出现和流行增加了这种疾病的威胁。由于缺乏有效的抗菌素以及MRSA的高致病性，MRSA感染的死亡率显著高于敏感菌株。MRSA会分泌多种毒力因子，包括细胞溶素(α、β、γ、δ)、表皮剥脱毒素、肠毒素、磷脂酶C、金属蛋白酶、荚膜多糖、V8蛋白酶、杀白细胞素、酚溶性调节蛋白和葡萄球菌激酶等，这些毒素增强了细菌感染宿主的能力和危害。除了产生特定的毒素外，生物膜的形成在抗菌素耐药性中的贡献也不容忽视，包裹在生物膜基质中细菌的抗菌素抗性是浮游细菌的10-1000倍。因此，急需寻找MRSA肺炎治疗的抗菌新靶点和新方法。
细菌包膜的完整性对于细菌维持活力、毒力和正常功能形态非常重要。更重要的是膜双层中脂质是活性氧的关键缓冲剂，可以平衡细菌的氧化态和还原态。广泛的脂质过氧化可以通过一种被称为铁死亡的方式诱导细胞死亡。铁死亡是一种铁依赖性脂质过氧化引起的独特细胞死亡形式。具体而言，脂氧合酶和细胞内铁池介导了多不饱和脂肪酸的氧化，不稳定的铁自由基可以通过芬顿化学产生氧自由基，直接促进脂质过氧化和铁死亡。目前为止，铁死亡主要被发现存在于真核生物中，在肿瘤发病等方面起着很重要的作用。但最近发现铁死亡也可能存在于原核生物中，并且可能是对抗病原体的一种新的作用模式。
Fe3O4在生理条件下的抗菌活性弱，而且细菌内谷胱甘肽的存在可以使其免受各种氧化应激，在一定程度上抑制了Fe3O4引起的铁死亡。还原硫醇是谷胱甘肽(GSH)上能够消除活性氧(ROS)的关键官能团；因此，可以与硫醇发生不可逆反应的化合物会导致GSH失效。肉桂醛(CA)可以通过迈克尔加成与硫醇发生特异性反应消耗GSH，并升高细胞内的H2O2，然后进行高水平的芬顿反应，最终通过诱导ROS生成来提高细胞内氧化应激，加速脂质过氧化物(LPO)的积累，增强铁死亡。ROS产生也进一步加速了CA的活化，从而产生正反馈调节。所以，CA有望于和Fe3O4一起发挥协同抗菌的作用。
近年来，人们对封装在不同细胞膜中的仿生微纳米粒子产生了极大的兴趣。这些仿生的细胞膜-涂层微纳米粒子直接利用细胞膜的多功能性和复杂性，以执行特定功能。通过将整个膜从细胞转移到微纳米粒子的表面上，以实现免疫逃避和实现靶向性递送。该系统的一个实例是采用红细胞延长粒子在血液的停留时间。然而，单独的红细胞膜包被不能使得微粒主动靶向病变部位，也就是说封装的药物不能有效地递送到感染区域。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒及其制备方法和应用。通过将红细胞膜和血小板膜融合在一起，将其用作涂层材料来包被由CA和Fe3O4为主要成分的微粒，形成一种新型抗菌微粒体系(mFe-CA微粒)，克服了CA的生物利用度低和Fe3O4的释放能力有限，合成了具有良好稳定性和生物相容性的mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒，表现出长时间的循环特性又具有针对组织感染损伤的特异性靶向能力，并且具有抑制群体感应的作用，可以表现出优秀抗菌抗炎作用，最终用于治疗急性细菌性肺炎。
出乎意料的，本发明开发了包含临床认可的肉桂醛(CA)和Fe3O4在SA水溶液中通过红细胞膜和血小板膜杂交膜包被的生物相容性非抗生素治疗肺炎mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒，以对抗耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)。所述的mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒拥有出色的稳定性，可以缓慢的释放CA，在超声作用下可以快速释放Fe。临床使用时，可以用超声理疗仪进行辅助药物释放Fe。
本发明通过乳化作用，快速方便地合成了一种特殊的同时含有CA和Fe3O4的仿生膜包被抗菌微粒，其可以有效释放CA和Fe，使其通过诱导铁死亡发挥杀菌作用。该微粒有着出色的抗菌效果，在超声作用下可以杀死100％的MRSA，在前期可以抑制90％生物膜的形成，在后期可以破坏80％已形成的生物膜。由于包裹了血小板膜和红细胞膜，使得该微粒具备了肺靶向能力和躲避巨噬细胞吞噬的能力。而由于使用了生物相容性较高的CA、Fe3O4和SA，所得的微粒也有着出色的生物相容性，用该微粒和肺支气管上皮细胞进行体外共孵育后细胞的存活率均达到80％，且细胞未发生铁死亡的现象，经过该微粒处理的BALB/C小鼠的血常规、血生化和心肝脾肺肾均未发现异常，表明该仿生膜包被抗菌微粒对机体安全基本不会产生影响。
本发明所述的mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒在超声作用下可同时释放CA和Fe，从而提高CA的生物利用度和Fe的释放速度，发挥CA和Fe3O4的协同诱导铁死亡、杀菌作用。CA可以和GSH表面的还原硫醇发生不可逆的化学反应，使得GSH发生大量消耗，并通过提高胞内的H2O2水平，介导高水平的芬顿反应，最终促进脂质过氧化，放大细菌铁死亡，进一步杀灭细菌。更重要的是，mFe-CA微粒可以通过抑制群体感应(QS)系统，从而破坏生物膜，降低毒力因子的表达，进而抑制细菌的杀菌能力，大大提高了杀菌效率。此外，微粒表面包裹的杂交细胞膜可以同时赋予其血小板膜和红细胞膜的功能，使其不但能具有肺部病灶的靶向性，而且可以具有较长的血液停留能力。mFe-CA微粒在体外和体内均显示出对MRSA的优异抗菌效果，也为治疗MRSA感染性肺炎提供了有效的治疗靶点和策略。
一种mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将四氧化三铁、肉桂醛与海藻酸盐制备获得Fe-CA微粒；
(2)用血小板膜和红细胞膜包被Fe-CA微粒获得所述mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒。
优选的，步骤(1)中，将四氧化三铁加入肉桂醛溶液中，然后滴加到海藻酸盐水溶液中，制备获得Fe-CA微粒。
更优选的，步骤(1)中，还加入有吐温80，吐温80与四氧化三铁加入肉桂醛溶液中，然后滴加到海藻酸盐水溶液中，制备获得Fe-CA微粒。吐温80为表面活性剂，用于使四氧化三铁和肉桂醛分散成微乳。吐温80的用量以能够形成微乳即可，比如，每毫升四氧化三铁悬浮液对应使用400μl的吐温80。
优选的，肉桂醛的用量为每100～180mg的四氧化三铁对应加入0.8～1.5mL肉桂醛；
海藻酸盐的用量为每20.8～37.5mg的四氧化三铁对应加入10～30mg海藻酸盐；
优选的，血小板膜和红细胞膜的总用量与Fe-CA微粒的用量关系为：以Fe-CA微粒中肉桂醛的量100μL计，对应加入总蛋白质量为0.2～0.3mg的血小板膜和红细胞膜。
优选的，步骤(2)中，血小板膜和红细胞膜的量按总蛋白质量比为1：0.5～2。
优选的，所述海藻酸盐为以下至少一种：海藻酸钠、海藻酸钾。
本发明又提供了所述制备方法制备的mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒。
本发明还提供了所述mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒在制备抗菌和/或抗炎症药物中的应用。
本发明还提供了一种抗菌和/或抗炎症药物，活性成分为所述mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒。
本发明的有益效果是：本发明设计了一种肺靶向性的mFe-CA抗菌微粒。该微粒可以有效释放CA和快速释放Fe；出乎意料的是，两者协同产生了诱导细菌铁死亡效应和抑制群体感应作用，这可以影响生物膜的形成和毒力因子的表达，这种非抗生素的协同抗菌作用不易被耐药细菌抵抗，因此可以有效地抑制耐药性病原体，可以用于治疗耐药细菌感染产生的疾病，在1.0W/cm2的超声处理10分钟的情况下，其MBC为0.95μL/mL。而且该抗菌在处理细胞后，细胞活性均大于80％，且未发生铁死亡的现象。因此，该材料的有效杀菌浓度远远低于其会对正常组织产生毒性的浓度，具有安全抗菌的特点。此外，该微粒可以明显提高急性重症肺炎小鼠的生存率，降低肺部病变部位的炎症反应，最终治愈急性细菌性肺炎，治疗过程中对其他器官组织的系统毒性几乎可被忽略。因此，本发明的mFe-CA成为非常有潜力的治疗急性细菌性肺炎的抗菌材料。
附图说明
图1为mFe-CA抗菌微粒的合成示意图。
图2为mFe-CA抗菌微粒的表征图。其中A图：不同放大倍数下Fe3O4纳米粒子的透射电子显微镜(TEM)图像；B、C、D图：CA、Fe-CA和mFe-CA的光学显微镜照片；E图：Fe、CA、Fe-CA和mFe-CA的粒径统计图；F图：Fe、CA、Fe-CA和mFe-CA的电位统计图；G、H图：Fe-CA和mFe-CA中的Fe和CA在生理环境中的释放曲线，(红色箭头：在第2小时给予1W/cm2超声10min)。
图3为对耐药菌的体外抗菌活性检测结果图，其中A图：不同时间、不同浓度mFe-CA处理后MRSA的相应CFU计数统计图，显示MBC为0.95μL/mL；B图：不同处理后MRSA的存活率统计图；C图：不同处理后MRSA的定量分析；D、E图：MRSA经不同处理后分别用钙黄绿素AM(绿色，活菌)和PI(红色，死菌)染色的定量分析和荧光图像。
图4为体外抗MRSA生物膜活性。其中A图：用结晶紫染色检测各组MRSA生物膜形成的抑制率；B图：不同组中MRSA未成熟生物膜中活菌的CFU计数；C图：用激光共聚焦显微镜观察在第0小时进行不同处理后MRSA未成熟生物膜的3D结构，(左：俯视图；右：侧视图)；D图：用结晶紫染色检测各组MRSA成熟生物膜的破坏率；E图：不同组中MRSA成熟生物膜中活菌的CFU计数；F图：通过激光共聚焦显微镜观察在第24小时进行不同处理后MRSA成熟生物膜的3D结构，(左：顶视图；右：侧视图)。
图5为MRSA中细菌完整性破坏检测结果图。其中，A图：不同处理后MRSA的代表性TEM图像(顶部)和相应的较高放大率图像(底部)；B图：不同组MRSA的代表性扫描电子显微镜(SEM)图像(顶部)和相应的较高放大率图像(底部)；C图：DiSC3(5)染料检测的细菌膜电位的荧光图像。
图6为MRSA的铁死亡表型检测结果图。其中，A、B、C、D、E、F图：ATP、ADP、谷氨酸、GSH、TCEP和ferrostatin-1对mFe-CA诱导的细菌死亡的抑制作用；G图：空白LB组、Fe组、CA组、Fe-CA组、mFe-CA组和mFe-CA+US组MRSA的ROS(绿色)的DCFH-DA染色荧光照片；H图：各组GSH/GSSG比值；I图：MDA试剂盒检测相应处理后MRSA的脂质过氧化水平统计图。
图7为体内和体外肺靶向能力、分布和生物降解检测结果图。其中，A图：尾静脉注射100μL IR783-Fe-CA或IR783-mFe-CA后，MRSA肺炎小鼠在3小时、6小时、24小时、48小时、96小时、120小时、168小时的体内荧光照片；B图：在尾静脉注射IR783-Fe-CA或IR783-mFe-CA后的指定时间内，肝脏(Li)、脾脏(Sp)、肾脏(Ki)、肺(Lu)、心脏(H)、肠(in)、肌肉(Mu)、骨骼(Bo)、胃(St)和大脑(Br)中的代表性离体荧光图像。
图8为mFe-CA+US的体内抗菌作用检测结果图。其中，A图：PBS、Fe、CA、Fe-CA、mFe-CA和mFe-CA+US处理的MRSA肺炎小鼠的存活率；B图：相应组MRSA肺炎小鼠的核心体温；C、D、E图：分别在不同处理24小时后或48小时后肺组织匀浆的琼脂平板照片和MRSA定量分析；F图：感染后24小时不同处理组的小鼠肺切片中细菌菌落的革兰氏染色照片，(红色三角形：细菌菌落)。
图9为mFe-CA+US的体内抗炎作用检测结果图。其中，A、B、C、D、E、F图：感染后24小时和48小时的肺匀浆中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的定量分析；G图：感染后24小时和48小时，肺组织的H&E染色图片和免疫组织化学染色(MPO)图片；H、I图：感染后24小时和48小时BALF中中性粒细胞的定量分析；J、K图：感染后24和48小时BALF中总细胞计数的定量分析。
图10为Fe、CA、Fe-CA、mFe-CA的初步毒性检测结果图。其中，A、B、C、D图：不同浓度CA、Fe、Fe-CA和mFe-CA的溶血率(插图：溶血反应照片)，PBS和ddH2O分别作为阴性对照和阳性对照；E-H图：第14天不同组的健康BALB/c小鼠的血液生化分析；I-L图：第14天不同组的健康BALB/c小鼠的血常规检查；M图：第14天各组BALB/c小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)H&E染色结果图。
具体实施方式
实验材料：
FeCl3、FeSO4、NaOH、C6H5Na3O7(柠檬酸钠)和肉桂醛(CA)购自麦克林(中国上海)。海藻酸钠(SA)购自阿拉丁(中国上海)。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)来自美国典型培养物保藏中心(ATCC43300)。LB肉汤、LB肉汤琼脂和MDA检测试剂盒购自索莱宝(中国北京)。胎牛血清(FBS)购自Gibco。双蒸馏水(ddH2O)来自Milli-Q净化系统。BALB/c小鼠来自上海生物科技有限公司。Live/Dead细菌活力试剂盒和DCFH-DA试剂盒和购自Thermo FisherScientific(中国)。
从康赞医疗设备有限公司购买了一台1MHz和3MHz双频可调超声仪器(Nu-Tek，UT1021)，可调输出功率0.1-3W/cm2，有效辐射面积5.0cm2。
表征仪器：
使用Malvem Zetasizer通过动态光散射(DLS)分别测量了Fe、CA、Fe-CA、mFe-CA的粒度分布和表面电位。透射电子显微镜(TEM)和光学显微镜用于观察这些颗粒的结构。
实施例1
(1)mFe-CA抗菌微粒的合成。
首先，将4g NaOH和5.9g柠檬酸钠(C6H5Na3O7)溶于100mL ddH2O中，记为溶液a。将5.4g FeCl3 6H2O和2.78g FeSO4·7H2O溶于20mL ddH2O中，搅拌后得到黄绿色铁盐溶液(Fe3+/Fe2+摩尔比：2：1)，记为溶液b。在室温下将溶液b逐滴加入溶液a中，同时打开超声波并剧烈搅拌10分钟以获得黑色悬浮液。随后，将该黑色悬浮液转移到水浴锅中，在90℃下反应30分钟，同时进行机械搅拌并加入氩气(Ar)以防止Fe3O4氧化。将反应产物磁力分离，用脱氧蒸馏水和无水乙醇交替洗涤两次，将离心获得的Fe3O4纳米粒子重悬于ddH2O中，使得Fe3O4的浓度为140mg/mL。将该Fe3O4悬浮液储存在4℃的冰箱中备用，其结构形态如图2中的A所示。
mFe-CA的合成流程如图1所示，将400μL吐温80和1mL Fe3O4悬浮液(140mg/mL)依次加入1mL游离CA的油状溶液(纯度≥98％)中，辅以超声来获得溶液c。然后将500μL溶液c逐滴加入到5mL的4mg/mL海藻酸钠(SA)水溶液中，辅以超声，随后通过离心和洗涤获得了Fe-CA微粒(其结构如图2中的C所示)。将Fe-CA微粒重悬于PBS中获得Fe-CA悬液，使其浓度为20μL/mL(以Fe-CA中的CA浓度来表示Fe-CA的浓度)。
将Sprague-Dawley(SD)大鼠的全血置于含有肝素的真空采血管中，然后使用大鼠外周血血小板分离试剂盒(Solarbio)收集血小板和红细胞，将新鲜全血加入分离液中，通过反复离心和洗涤分离血小板和红细胞。然后，通过反复冻融提取获得红细胞膜和血小板膜，就是在-80℃和室温下进行反复冷冻和解冻，将冷冻破裂的血小板和红细胞悬浮液进一步离心，分别获得血小板膜和红细胞膜。用BCA蛋白检测试剂盒测量所获得的血小板膜和红细胞膜的总蛋白质量，并均用PBS稀释至1mg/mL，按照总蛋白质量比1∶1将100μL血小板膜(1mg/mL)和100μL红细胞膜(1mg/mL)混合，随后通过超声将该200μL的杂交膜与5mL Fe-CA混合物(20μL/mL)融合10分钟。然后，再用PBS洗涤三次以去除去多余的膜后，获得mFe-CA(其结构如图2中的D所示)，并在-80℃下储存以供进一步使用。
(2)性状表征。
Fe的直径约为11.6nm，CA的直径约2073.3nm，Fe-CA的直径约2293.0nm，mFe-CA直径约2491.4nm(图2中的E)。此外，Fe、CA、Fe-CA和mFe-CA的电位分别为-43.3mV、-10.0mV、-16.5mV和-18.7mV(图2中的F)。释放实验表明，Fe和CA可以在模拟生理条件下有效释放，超声(US)可以明显促进Fe的释放(图2中的G、H)。更重要的是，与Fe-CA相比，涂覆混合膜的Fe-CA的释放能力没有明显影响。
(3)体外抗菌性能表征。
为了探索对MRSA的抗菌活性，我们将获得的mFe-CA稀释成不同浓度(0.238、0.475、0.950、1.900、3.800μL/mL)，随后将MRSA与不同浓度的mFe-CA共孵育并辅以US，然后分别在0、1、2、4、8、18、24小时将相应的混合物均匀地涂覆在LB琼脂板上，观察并计数各组中细菌克隆的数量。正如预期的，mFe-CA+US可以以剂量和时间依赖的方式杀死浮游MRSA，最小杀菌浓度(MBC)为0.950μL/mL(图3中的A)，在后续的实验中，均使用0.950μL/mL的mFe-CA进行体外实验。
随后，我们进一步比较了Fe、CA、Fe-CA、mFe-CA和mFe-CA+US组的抗菌活性，图3中的B显示，CA、Fe-CA、mFe-CA和mFe-CA+US组的细菌溶液几乎是透明的，而对照组和Fe非常浑浊，这也表明CA、Fe-CA、mFe CA和mFe-CA+US组具有一定的抗菌作用。为了进一步直观地判断各组的抗菌活性，我们使用琼脂平板计数法记录各组在相应处理后的菌落形成状态和克隆数量。我们可以观察到，Fe-CA组和mFe-CA+US组的平板上几乎没有菌落形成，表明了优异的抗菌效果，而mFe-CA中有少量菌落，这可能是由于膜包膜对抗菌效果的影响(图3中的C)。与mFe-CA组相比，mFe-CA+US组的抗菌效果增强可能归因于US有助于有效抗菌成分的释放。与上述结果一致，细菌活/死染色的结果也表明，mFe-CA+US组的红色荧光强度最大，表明抗菌活性最好，CA、Fe-CA、mFe-CA组更强，而Fe组最弱，与对照组无显著差异(图3中的D、E)。总之，这些发现均表明了mFe-CA作为一种高效抗菌材料有美好的前景。
接下来，我们通过结晶紫染色、平板计数和SYTO 9染色来检测抗生物膜活性。我们比较了各组的抗生物膜活性。正如预期的那样，在生物膜形成的早期(0小时)用Fe-CA、mFe-CA和mFe-CA+US处理后，只剩下零星的生物膜，而用空白LB或Fe处理的生物膜还是致密的。此外，CA、Fe-CA、mFe-CA和mFe-CA+US组的OD 570值显著低于未处理组，表明生物膜形成受到明显抑制(图4中的A)。此外，通过琼脂平板计数法获得残余生物膜中的活细菌数量。与空白LB培养基处理相比，CA组的活细菌负荷明显降低，Fe-CA、mFe-CA和mFe-CA+US组的活菌负荷降低的更多(图4中的B)。不同处理后，通过共焦显微镜对生物膜的3D结构进行成像。可以观察到，mFe-CA+US组显示出最弱的绿色信号和最薄的厚度，这意味着抑制生物膜形成的能力最突出(图4中的C)。在生物膜形成的后期(24小时)用CA、Fe-CA、mFe-CA和mFe-CA+US处理后，成熟的生物膜也可能受损，破坏率分别为约31.0％、约47.3％、约66.3％和约79.8％(图4中的D)。生物膜中活菌的定量实验(图4中的E)和SYTO 9染色(图4中的F)和都表明，mFe-CA+US可以有效地破坏成熟的生物膜，使其更稀疏和更薄，同时可以有效地杀死成熟生物膜中的细菌。总之，无论是在生物膜形成的早期还是晚期，mFe-CA+US都具有显著的抗生物膜活性。
我们用TEM和SEM观察了处理后MRSA的形态变化。TEM显微照片显示，空白LB或Fe处理的MRSA保持正常形状，细胞壁完整，细胞膜光滑，细胞质均匀致密，可形成隔膜并在细胞中部分裂。然而，CA、Fe-CA、mFe-CA或mFe-CA+US处理可导致细胞壁破裂、细胞膜收缩和细胞质渗漏(图5中的A)。此外，通过SEM检查了细菌的超微结构变化。图5中的B显示，用CA处理的MRSA对细胞壁和膜显示出轻微的损伤，而Fe-CA、mFe-CA或mFe-CA+US诱导了显著的变形，如突出的膜结构的出现。然后，使用3，3′-二丙基噻二碳菁碘化物(DiSC3(5))荧光探针评估细菌膜电位的变化。细菌膜破裂引起的膜干扰将表现为膜电位去极化，荧光强度相应增强。如图5中的C所示，由于膜去极化，CA、Fe-CA、mFe-CA和mFe-CA+US的荧光强度很强，而对照组和Fe组几乎没有荧光。其中，mFe-CA+US组的绿色荧光强度最强，表明细菌膜破坏最严重。
(4)体外细菌发生铁死亡表征。
为了进一步探讨mFe-CA+US的抗菌机制是否可归因于其诱导细菌发生铁死亡，各种类型的铁死亡抑制剂包括三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、谷氨酸、谷胱甘肽(GSH)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)和ferrostatin-1被加入mFe-CA中，并与MRSA一起孵育。这些结果都表明，每种抑制剂单独对MRSA没有抑制或促进作用，但当与mFe-CA+US组合时，其抗菌作用可以不同程度地抑制，并且抑制作用取决于浓度(图6中的A-F)。更重要的是，基于DCFH-DA探针，我们发现mFe-CA+US诱导的ROS荧光强度增加，表明ROS产生最多(图6中的G)。图6中的H表明氧化型谷胱甘肽(GSSG)和还原型谷胱甘肽(GSH)的比例明显增加，即GSH被耗尽，GSSG和GSH之间的生物平衡被破坏。细菌膜脂质过氧化水平主要通过丙二醛(MDA)实验测定。正如预期的，MDA实验(图6中的I)表明，mFe-CA+US可以使细菌膜的脂质过氧化水平提高。
(5)体内和体外肺靶向能力、分布和生物降解。
为了比较Fe-CA和mFe-CA的肺靶向性，我们分别将IR783染料修饰微粒，将修饰好的微粒通过静脉注射到肺炎小鼠体内，并通过荧光成像检测体内和体外不同时间每个器官(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、脑、骨、肌肉、胃、肠)的荧光强度(图7中的A)。我们可以观察到IR783-Fe-CA组的荧光信号几乎集中在肝脏中，并随着时间的推移逐渐消失。然而，IR783-mFe-CA的荧光信号在24小时内在肺部呈现出强烈的荧光信号，并且在48-168小时内逐渐降解，而IR783-mFe-CA在24小时内主要积聚在肺和肝脏中，并且在168小时内也被完全代谢(图7中的B)。
(6)mFe-CA+US的体内抗菌作用。
在体外实验的鼓励下，我们进一步验证了mFe-CA+US介导的体内抗菌作用。根据生存曲线，发现所有急性MRSA肺炎小鼠在用PBS、Fe或CA处理后分别在48小时、72小时或96小时内死亡(图8中的A)。然而，在用Fe-CA、mFe-CA和mFe-CA+US治疗后，存活率分别提高到10％、40％和60％。
关于各组肺部的细菌载量，图8中的B、C、D显示，mFe-CA+US处理组的肺匀浆中细菌CFU最低，体内抗菌活性最好。此外，mFe-CA+US组在48小时的细菌负荷显著低于24小时，显示出时间依赖性杀菌作用。革兰氏染色显示，在对照组、Fe组和CA组中，更多的革兰氏阳性细菌(红色三角形)附着在支气管或肺泡上皮上并聚集形成微生物群，这是生物膜形成的第一步(图8中的E)。相反，在Fe-CA、mFe-CA和mFe-CA+US组中，Fe-CA组、mFe-CA组和mFe-CA+US组的小鼠具有较少的革兰氏阳性细菌，这些细菌分散并表现出较小的聚集程度。其中mFe-CA+US组的菌落最少。
(7)mFe-CA+US的体内抗炎作用。
我们检测了mFe-CA+US的抗炎作用，以进一步评估其对急性MRSA肺炎治疗的有益作用。在相应治疗后24小时和48小时，通过ELISA测定肺组织中炎性细胞因子(白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-a))的水平。可以发现，mFe-CA+US组肺组织中炎性因子的产生(图9中的A-F)最低，意味着炎症水平最低。
随后，组织学分析显示，各组小鼠的肺组织结构均在一定程度上丢失，肺间质血管出现不同程度的水肿、出血和坏死，炎性细胞浸润位于肺泡腔(图9中的G)。其中，mFe-CA+US治疗组肺泡组织结构仍清晰，小部分肺泡壁水肿增厚，肺泡腔内炎性细胞仅局部浸润，肺损伤程度较其他组明显减轻。48小时后肺损伤程度均有不同程度的缓解，其中mFe-CA+US修复程度最好，证实治疗效果与时间有关。中性粒细胞衍生的髓过氧化物酶(MPO)是一种重要的炎症介质，可刺激肺泡巨噬细胞，引发炎症和细胞毒性状态增强，最终促进肺部炎症。因此，其表达可用于表征肺组织中性粒细胞浸润。如图9中的G所示，mFe-CA+US治疗组的MPO表达量最低，表明最少的炎症细胞浸润。
为了进一步有效地评估小鼠的炎症水平，收集不同组的肺泡灌洗液并离心，并用Giemsa染色对其细胞沉淀进行分类和计数。Giemsa染色显示，处理24小时后，对照组和Fe组中性粒细胞的比例分别为～83％和～82％，CA、Fe-CA、mFe-CA和mFe-CA+US组的中性粒细胞比例分别为～69％、～56％、～55％和～46％(图9中的H)。48小时时，各组巨噬细胞的数量增加不同，但mFe CA+US组中性粒细胞的比例仍然最低(图9中的I)。与此结果一致，肺泡灌洗液中总细胞计数的分析显示，感染后24小时和48小时，用mFe-CA+US处理的小鼠肺部的炎性细胞浸润最少(图9中的J、K)。总之，这些结果表明，mFe-CA+US治疗可以明显抑制炎症的发生和发展，降低肺水肿和充血的程度，从而保护小鼠免受过度炎症反应引起的肺损伤。
(8)Fe、CA、Fe-CA、mFe-CA的体内外初步毒性。
考虑到颗粒是静脉注射的，我们进一步评估了血液相容性。溶血试验表明，与不同浓度的相应组孵育后，溶血率低于5％(图10中的A-D)。在健康小鼠中评估了Fe、CA、Fe-CA和mFe-CA的长期潜在副作用。第14天，血液生化指标(如谷氨酸-丙酮酸转氨酶(ALT)、谷氨酸-草酸转氨酶(AST))和血常规指标(如白细胞(WBC)、红细胞(RBC))在正常范围内(图10中的E-L)。主要器官(包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)的组织结构保持正常，没有明显的炎症侵袭，表明体内生物安全性良好(图10中的M)。所有这些结果都为生物安全提供了有力证据，换句话说，每一组对肺上皮细胞、造血系统、肝肾功能和主要器官都没有明显的负面影响。
实施例2-实施例10
参照实施例1的合成和检测方法，实施例2-实施例10合成了各种mFe-CA抗菌微粒，内容详见表1，表中的浓度均为制备这个产品时原料的使用浓度，血小板膜/红细胞膜比值为总蛋白质量比。实施例2-实施例10中均只是各个步骤中对应的参数进行了调整，调整的参数在表1中展示，其余参数均未调整。
表1
结果表明，不同反应条件下的mFe-CA抗菌微粒均具有良好的杀菌效果、生物相容性和流动性，同时可根据实际需求，通过调节血小板膜和红细胞膜的比例可以调整抗菌微粒的靶向性。
检测例1
表2
| mFe-CA(CA/μL/mL) | 杀菌率 | 细胞毒性 |
| 0.475 | 92％ | 1.6％ |
| 0.950 | 96％ | 2.0％ |
| 1.900 | 99％ | 7.8％ |
| 3.800 | 99％ | 16.4％ |
采用实施例1中的mFe-CA储备液稀释不同倍数后，检测杀菌率和细胞毒性，其中mFe-CA的浓度以其中的CA终浓度来表示。结果如表2所示，表明随着浓度越来越高，杀菌率也越来越高，但同时细胞毒性也提高，所以，需要选择合适的mFe-CA浓度，以平衡杀菌率与细胞毒性之间的关系。
Claims (10)
1.一种mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将四氧化三铁、肉桂醛与海藻酸盐制备获得Fe-CA微粒；
(2)用血小板膜和红细胞膜包被Fe-CA微粒获得所述mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒。
2.根据权利要求1所述mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将四氧化三铁加入肉桂醛溶液中，然后滴加到海藻酸盐水溶液中，制备获得Fe-CA微粒。
3.根据权利要求2所述mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，还加入有吐温80，吐温80与四氧化三铁加入肉桂醛溶液中，然后滴加到海藻酸盐水溶液中，制备获得Fe-CA微粒。
4.根据权利要求1所述mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒的制备方法，其特征在于，肉桂醛的用量为每100～180mg的四氧化三铁对应加入0.8～1.5mL肉桂醛；
海藻酸盐的用量为每20.8～37.5mg的四氧化三铁对应加入10～30mg海藻酸盐。
5.根据权利要求1所述mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒的制备方法，其特征在于，血小板膜和红细胞膜的总用量与Fe-CA微粒的用量关系为：以Fe-CA微粒中肉桂醛的量100μL计，对应加入总蛋白质量为0.2～0.3mg的血小板膜和红细胞膜。
6.根据权利要求1所述mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，血小板膜和红细胞膜的量按总蛋白质量比为1∶0.5～2。
7.根据权利要求1所述mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒的制备方法，其特征在于，所述海藻酸盐为以下至少一种：海藻酸钠、海藻酸钾。
8.权利要求1～7任一所述制备方法制备的mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒。
9.权利要求8所述mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒在制备抗菌和/或抗炎症药物中的应用。
10.一种抗菌和/或抗炎症药物，其特征在于，活性成分为权利要求8所述mFe-CA仿生膜包被抗菌微粒。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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