CN116699035A - 赤霉素a34、12-羟基十二烷酸在食管鳞状细胞癌的诊断试剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，为了解决目前ESCC患者肠道代谢产物之间的相互关系以及在其中发挥的作用尚未得到有效解决等问题，提供了肠道代谢产物赤霉素A34、12‑羟基十二烷酸在食管鳞状细胞癌的诊断试剂中的应用。本发明发现在ESCC患者肠道中赤霉素A34在ESCC患者中含量显著增多，12‑羟基十二烷酸在ESCC患者中含量显著减少，ROC曲线下面积分别为82.56%。85.33%，对ESCC具有一定的诊断价值，但目前并没有关于这两种代谢产物的相关研究。ESCC患者粪便代谢产物发生了改变，为使用肠道代谢产物作为早期诊断ESCC的生物标志物奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及赤霉素A34、12-羟基十二烷酸在食管鳞状细胞癌的诊断试剂中的应用。
背景技术
食管癌是人体内发病率较高的恶性肿瘤之一，最近的研究报告表明全球食管癌在所有恶性肿瘤中发病率居第7位，死亡率居第6位。食管鳞状细胞癌(EsophagealsquaIilous cell carcinoma，ESCC)是中国食管癌最主要的病理类型，且预后极差，其具体发病机制目前尚不明确，当前的研究认为有多种危险因素与其相关，包括烟草、酒精及口腔菌群失调。
近年来，肠道代谢产物与肿瘤的关系是研究的热点，肠道代谢产物平衡的破坏可能导致恶性肿瘤的发生，寻找肠道标志代谢产物从而对ESCC进行早期诊断及治疗是至关重要的。然而，ESCC患者肠道代谢产物之间的相互关系以及在其中发挥的作用尚未得到有效解决。随着高通量分子检测技术的发展和应用，组学研究在人类医学学科中蓬勃发展，非靶向的粪便代谢组学可以对肠道内的代谢物进行定量分析，以给出一个系统的整体观点。非靶向的代谢组学技术又以液相色谱-质谱联用（Liquid Chromatograph MassSpectrometer，LC-MS）方法最为精确可靠。因此，我们采用基于LC-MS的非靶向代谢组学方法，结合生物统计学和生物信息学等技术进行了这项病例对照研究。以系统和全面地研究人类ESCC患者粪便样品代谢物，确定其代谢产物组成及变化，寻找潜在的生物诊断标志物，探究ESCC与肠道代谢产物的之间的关联。
发明内容
本发明为了解决目前ESCC患者肠道代谢产物之间的相互关系以及在其中发挥的作用尚未得到有效解决等问题，提供了肠道代谢产物赤霉素A34、12-羟基十二烷酸在食管鳞状细胞癌的诊断试剂中的应用。
本发明由如下技术方案实现的：本发明提供了肠道代谢产物赤霉素A34、12-羟基十二烷酸在制备食管鳞状细胞癌的诊断物中的应用。
进一步的，所述诊断物检测粪便中赤霉素A34、12-羟基十二烷酸的含量，所述的诊断物为诊断试剂盒，分别构建赤霉素A34和12-羟基十二烷酸ROC曲线，计算AUC值；所述赤霉素A34在ESCC患者中含量显著增多，12-羟基十二烷酸在ESCC患者中含量显著减少。
所述诊断试剂盒包含特异性检测粪便中赤霉素A34和12-羟基十二烷酸含量的试剂。
经检测，肠道代谢产物的PLS-DA 及OPLS-DA分析显示ESCC组和Control组的代谢物组成具有显著的差异，检验置换显示结果可靠有效。赤霉素A34（GibberellinA34）、12-羟基十二烷酸（12-Hydroxydodecanoicacid）ROC曲线下面积分别为82.56%、85.33%，对ESCC具有一定的诊断价值。
与现有技术相比，本发明证实了：赤霉素A34在ESCC患者中含量显著增多，12-羟基十二烷酸在ESCC患者中含量显著减少，ROC曲线下面积分别为82.56%。85.33%，对ESCC具有一定的诊断价值，但目前并没有关于这两种代谢产物的相关研究。ESCC患者粪便代谢产物发生了改变，为使用肠道代谢产物作为早期诊断ESCC的生物标志物奠定了基础。
附图说明
图1为正负离子模式下的PLS-DA 及OPLS-DA得分图；注：横坐标表示第一主成分解释度，纵坐标方向第二主成分解释度；点表示实验样本，颜色表示不同分组。组内样本越聚集，组间样本越分散，说明结果越可靠；
图2为正负离子模式下PLS-DA 及OPLS-DA置换检验图；注：当本图满足以下任意一点时，说明结果可靠有效：1.点的回归线与纵坐标交叉小于0。2.所有蓝色的 Q2 点均低于最右的原始的蓝色的Q2点；
图3为火山图；注：横坐标表示代谢物在两样本中定量差异倍数的Log2的对数值；纵坐标表示P值的-log10的对数值；横坐标绝对值越大，代谢物在两样本间的表达量倍数差异越大；纵坐标值越大，差异表达越显著；红色点代表上调差异表达代谢物，蓝色点代表下调；
图4为Z-score (标准分数)图；注：横坐标为代谢物在组中相对含量通过 Z-score换算得到的数值，越靠右代表该代谢物在该组中越多；
图5为差异代谢物相对定量比较；注：横坐标为代谢产物名称，纵坐标为代谢产物的相对定量；★表示P＜0.05，★★表示P＜0.01；按照P值显著性从低到高排序展示前5个最显著的上调差异物质与下调差异物质及与关注通路相关的物质；
图6为赤霉素A34（GibberellinA34）、12-羟基十二烷酸（12-Hydroxydodecanoicacid）的ROC曲线；注：横坐标为特异度，纵坐标为灵敏度。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
本领域技术人员意识到的通过常规实验就能了解到的描述的特定实施方案的等同技术，都将包含在本申请中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为由常规生化试剂商店购买得到的。
一、研究对象：以民族、性别、年龄（±5岁）为匹配条件进行1:1匹配，将2019年8月至2021年4月在中国山西省长治市某医院住院的30例ESCC患者纳入食管鳞状细胞癌组（ESCC组）；将同期在该医院进行健康体检的30名体检者纳入对照组（Control组）。所有入选者均向他们或其家属提供了问卷填写和粪便样本采集的知情同意书，长治医学院伦理委员会批准了该研究(伦理批准编号：RT2021148)。
病例组纳入和排除标准：（1）初诊的食管鳞状细胞癌患者，同意参加本研究。（2）能获得病理诊断结果和粪便标本；能获得有关暴露信息。（3）年龄40~80岁。（4）近3个月未使用抗生素。（5）无其它器官肿瘤。（6）无胃肠道疾病及胃食管相关手术史。
对照组纳入和排除标准：（1）健康体检人群，同意参加本研究。（2）能获得粪便标本及有关暴露信息。（3）年龄40~80岁。（4）近3个月未使用抗生素。（5）无其它器官肿瘤。（6）无胃肠道疾病及胃食管相关手术史。
二、粪便采集与检测：采集新鲜粪便500mg于清洁试管中，采集时避免混入尿液、水及其它物质，采集后于2小时内保存于-80℃冰箱内。检测时所有纳入者均为空腹或餐后2小时。
三、实验方法
1、用于非靶向代谢组学检测的粪便样品处理：称量样本并置于2 mL的离心管，接着加入600 µL甲醇(含2-氯- L-苯丙氨酸 (4 ppm) (-20 ℃保存) ，涡旋振荡30 s。加入100 mg玻璃珠，放入组织研磨器中，60 Hz研磨90 s。室温超声10 min，12,000 rpm 4℃离心10 min。取上清液过0.22μm膜过滤，过滤液加入到检测瓶中。
2、粪便非靶向代谢组学检测过程
A、色谱条件：Thermo Vanquish (Thermo Fisher Scientific, USA) 超高效液相系统，使用 ACQUITY UPLC® HSS T3 (2.1×150 mm, 1.8 µm) (Waters, Milford, MA,USA)色谱柱，0.25 mL/min 的流速，40℃的柱温，进样量为2μL。正离子模式，流动相为 0.1%甲酸乙腈 (C) 和 0.1%甲酸水 (D) ，梯度洗脱程序为：0~1 min，2% C；1~9 min，2%~50% C；9~12 min，50%~98% C；12~13.5 min，98% C；13.5~14 min，98%~2% C；14~20 min，2% C。负离子模式，流动相为乙腈 (A) 和 5 mM甲酸铵水 (B) ，梯度洗脱程序为：0~1 min，2% A；1~9min，2%~50% A；9~12 min，50%~98% A；12~13.5 min，98% A；13.5~14 min，98%~2% A；14~17min，2% A。
B、质谱条件：Thermo Q Exactive HF-X 质谱检测器 (Thermo FisherScientific, USA)，电喷雾离子源 (ESI) ，正负离子模式分别采集数据。正离子喷雾电压为3.50 kV，负离子喷雾电压为-2.50 kV，鞘气 30 arb，辅助气10 arb 。毛细管温度325℃，以分辨率 60000 进行一级全扫描，一级离子扫描范围 m/z 81~1000，并采用 HCD 进行二级裂解，碰撞电压为 30%，二级分辨率为15000 ，采集信号前8离子进行碎裂，同时采用动态排除去除无必要的MS/ MS信息。
C、粪便非靶向代谢组学数据的处理与分析：通过Proteowizard软件包(v3.0.8789) 中MSConvert工具将原始质谱下机文件转换为mzXML文件格式。采用R XCMS软件包进行峰检测、峰过滤、峰对齐处理，得到物质定量列表，参数设置有bw=2，ppm=15，peakwidth=c(5,30)，mzwid=0.015，mzdiff=0.01，method=”centWave”。采用公共数据库HMDB、massbank、LipidMaps、mzcloud、KEGG及自建物质库进行物质的鉴定，参数设置为ppm<30 ppm。基于 QC 样本的 LOESS信号校正方法实现数据矫正，消除系统误差。数据质控中过滤掉 QC 样本中 RSD>30%的物质。
在R软件包Ropls中分别对样本数据进行偏最小二乘判别分析(Partial LeastSquares-Discriminant Analysis，PLS-DA)及正交偏最小二乘判别分析(OrthogonalPartial Least Squares Discriminant Analysis，OPLS-DA) 降维分析，并分别绘制得分图、载荷图和S-plot图，展示各样本间代谢物组成的差异。用置换检验方法对模型进行过拟合检验。R2X和R2Y分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率，Q2标示模型的预测能力，它们的值越接近1表明模型的拟合度越好，训练集的样本越能够被准确划分到其原始归属中。
根据统计检验计算Pvalue值、OPLS-DA 降维方法计算变量投影重要度(VariableImportance for the Projection，VIP)、fold change计算组件差异倍数，衡量各代谢物组分含量对样本分类判别的影响强度和解释能力，辅助标志代谢物的筛选。当Pvalue值<0.05和VIP值>1时，认为代谢物分子具有统计学意义。
3、统计方法：肠道代谢产物的诊断效能使用ROC曲线。
四、实验结果
1、粪便非靶向代谢组学检测结果
A、差异代谢产物分析：在正离子模式下两组在一级代谢物中发现2577个差异代谢物（1606个在ESCC组上调，971个下调）。在负离子模式下两组在一级代谢物中发现1404个差异代谢物（955个在ESCC组上调，449个下调）。
PLS-DA 及OPLS-DA结果显示两组的代谢物组成具有显著的不同（图1），置换检验图显示结果可靠有效（图2）。然后从样本一级物质列表中寻找差异代谢物，筛选条件为Pvalue 小于0.05和VIP大于1.0。两组在二级代谢物中共发现了168个差异代谢物，88个代谢物含量在ESCC组中显著增加（图3），增加较显著的代谢产物有赤霉素A34（GibberellinA34）、氟伏沙明（Fluvoxamine）、次级胆汁酸石胆酸（Lithocholic acid）及胆汁酸盐脱氧胆酸钠（Sodium deoxycholate）。80个代谢物含量在ESCC组中显著降低，以氨基酸，肽和类似物居多(图4)。ESCC组中降低较显著的有12-羟基十二烷酸（12-Hydroxydodecanoic acid）、对苯二酚（Hydroquinone）、曲酸（Kojic acid）、L-天门冬氨酸（L-Aspartic acid）(图5)。
B、代谢产物对ESCC的诊断效能：为了探索识别的粪便中代谢产物诊断ESCC方面的潜在价值，我们制作了ROC，并计算了曲线下面积。结果显示：赤霉素A34（GibberellinA34）、12-羟基十二烷酸（12-Hydroxydodecanoicacid）曲线下面积分别为82.56%、85.33%，对ESCC具有一定的诊断价值（图6）。
本发明证实了：赤霉素A34在ESCC患者中含量显著增多，12-羟基十二烷酸在ESCC患者中含量显著减少，ROC曲线下面积分别为82.56%。85.33%，对ESCC具有一定的诊断价值，但目前并没有关于这两种代谢产物的相关研究。ESCC患者粪便代谢产物发生了改变，为使用肠道代谢产物作为早期诊断ESCC的生物标志物奠定了基础。
本发明为ESCC 的早期诊断及后续的个体化治疗和靶向干预提供了新的研究思路。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (3)
1.肠道代谢产物赤霉素A34、12-羟基十二烷酸在制备食管鳞状细胞癌的诊断物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述诊断物检测粪便中赤霉素A34、12-羟基十二烷酸的含量，所述的诊断物为诊断试剂盒，分别构建赤霉素A34和12-羟基十二烷酸ROC曲线，计算AUC值；所述赤霉素A34在ESCC患者中含量显著增多，12-羟基十二烷酸在ESCC患者中含量显著减少。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述诊断试剂盒包含特异性检测粪便中赤霉素A34和12-羟基十二烷酸含量的试剂。
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