CN116669772A - Gpc3结合剂、其缀合物以及使用它们的方法 - Google Patents

Gpc3结合剂、其缀合物以及使用它们的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于治疗癌症的抗GPC3抗体、其抗原结合部分及其GPC3缀合物。

Description

GPC3结合剂、其缀合物以及使用它们的方法
关于序列列表的声明
与本申请相关的序列表是以文本格式代替纸质副本提供的，在此通过引用将其并入到本说明书中。包含序列表的文本文件的名称是120301_403WO_Sequence_Listing.txt。文本文件是52KB，创建于2021年11月17日，并且正在通过EFS-Web以电子方式提交。
背景技术
对于各种类型的癌症的有效的和肿瘤靶向的治疗仍然是改善患者存活的重要需求。2018年全世界肝癌841,000例，死亡782,000例。在同一年中，肺癌和胃癌分别占135,700例死亡和11,000例死亡。目前，肝细胞癌的治疗选择很少。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3或GPC3在人类恶性细胞上过表达，并且已知在这些肿瘤以及结肠直肠癌、肺癌、食道癌、宫颈癌、头颈癌、乳腺癌包括三阴性乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌、生殖细胞(睾丸)癌、黑色素瘤、胃癌、肉瘤和膀胱癌中高度表达。鉴于GPC3在正常成人组织中的有限表达，使用装备有细胞毒性剂的抗体(抗体-药物缀合物)靶向GPC3提供了选择性攻击癌细胞并且不伤害正常组织的方法。
简要概述
本公开部分地提供了表现出改善的治疗特性的ARD103磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)结合抗体、其抗原结合部分和与GPC3特异性结合的相关结合剂、及其缀合物。GPC3是用于治疗某些癌症的重要的、有利的治疗靶标。GPC3结合抗体、其抗原结合部分及其结合剂和缀合物提供了基于在GPC3+癌症的治疗中使用这些抗体，抗原结合部分及其相关的结合剂和缀合物的组合物和方法。因此，本发明提供了与ARD103 GPC3抗体、抗原结合部分、结合剂和缀合物相关的方法、组合物、试剂盒和制品。
在一些实施方案中，提供了缀合物，其包含：结合剂，其包含(i)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)，和(ii)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)，其中所述重链和轻链框架区任选地用框架区中的1至8个氨基酸取代、缺失或插入修饰，其中所述结合剂特异性结合人GPC3；与所述结合剂连接的至少一种接头；和连接到每个接头的至少一种细胞毒性剂。
在一些实施方案中，所述结合剂包含：(i)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，提供了缀合物，其包含：包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的结合剂，其中所述VH区包含具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的互补决定区HCDR1序列，具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的HCDR3，它们各自位于重链框架区内；并且其中所述VL区包含具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的LCDR1序列，具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ IDNO:16所示的氨基酸序列的LCDR3，它们各自位于轻链框架区内；与所述结合剂连接的至少一种接头；和连接到每个接头的至少一种细胞毒性剂。
在一些实施方案中，所述框架区是鼠框架区。
在一些实施方案中，所述框架区域是人框架区。
在一些实施方案中，所述结合剂是抗体或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，所述结合剂是单克隆抗体、Fab、Fab’、F(ab’)、Fv、二硫键连接的Fc、scFv、单结构域抗体、双抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
在一些实施方案中，所述重链可变区还包含重链恒定区。
在一些实施方案中，所述重链恒定区是人IgG同种型。
在一些实施方案中，所述重链恒定区是IgG1恒定区。
在一些实施方案中，所述IgG1重链恒定区具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:32的116-445位所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链恒定区是IgG4恒定区。
在一些实施方案中，所述重链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述轻链可变区还包含轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述轻链恒定区是κ同种型。
在一些实施方案中，所述轻链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述κ轻链恒定区具有SEQ ID NO:4的113-219位所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述接头经由链间二硫化物残基、工程改造的半胱氨酸、聚糖或修饰的聚糖、结合剂的N-末端残基或与结合剂连接的聚组氨酸残基与结合剂连接。
在一些实施方案中，所述缀合物的平均药物负荷为约1至约8、约2、约4、约6、约8、约10、约12、约14、约16、约3至约5、约6至约8或约8至约16。
在一些实施方案中，所述结合剂是单特异性的。
在一些实施方案中，所述结合剂是二价的。
在一些实施方案中，所述结合剂包含第二结合结构域，并且所述结合剂是双特异性的。
在一些实施方案中，所述细胞毒性剂选自奥瑞他汀(auristatin)、喜树碱、多卡霉素(duocarmycin)和加利车霉素(calicheamicin)。
在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是奥瑞他汀。
在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是单甲基奥瑞他汀E(MMAE)。
在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是喜树碱。
在一些实施方案中，细胞毒性剂是依沙替康(exatecan)。
在一些实施方案中，细胞毒性剂是加利车霉素。
在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是SN-38(也称为7-乙基-10-羟基喜树碱)。
在一些实施方案中，所述接头选自mc-VC-PAB、CL2、CL2A和(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH2)n2-C(＝O)-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-CH2-O-CH2-(C＝O)-、其中n2代表2-8的整数。
在一些实施方案中，所述接头是mc-VC-PAB。
在一些实施方案中，所述接头连接到MMAE的至少一个分子。
在一些实施方案中，所述接头是CL2A。
在一些实施方案中，所述接头连接到SN-38的至少一个分子。
在一些实施方案中，所述接头是CL2。
在一些实施方案中，所述接头连接到SN-38的至少一个分子。
在一些实施方案中，接头是(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH2)n2-C(＝O)-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-CH2-O-CH2-(C＝O)-，其中n2代表2-8的整数。
在一些实施方案中，所述接头连接到依沙替康的至少一个分子。
在一些实施方案中，提供了包含本文所述的任何实施方案的缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
在一些实施方案中，提供了编码本文所述的任何实施方案的结合剂的核酸。
在一些实施方案中，提供了包含前述实施方案的核酸的载体。
在一些实施方案中，提供了包含本文所述的任何实施方案的核酸的细胞系。
在一些实施方案中，提供了治疗GPC3+癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的任何实施方案的缀合物或任何这些缀合物的药物组合物。
在所述方法的一些实施方案中，GPC3+癌症是癌或恶性肿瘤。
在所述方法的一些实施方案中，GPC3+癌症选自肝细胞癌、肺癌如小细胞肺癌和大细胞肺癌、结肠直肠癌、食道癌、宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、肾细胞癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、黑色素瘤、生殖细胞癌(例如，睾丸)、胃癌、肉瘤与膀胱癌。
在所述方法的一些实施方案中，其还包括向受试者施用免疫疗法。
在所述方法的一些实施方案中，所述免疫疗法包括免疫检查点抑制剂。
在所述方法的一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂选自特异性结合人PD-1、人PD-L1或人CTLA4的抗体。
在所述方法的一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、cemiplimab或伊匹单抗(ipilimumab)。
在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用化学疗法。
在所述方法的一些实施方案中，所述缀合物经静脉内施用。
在所述方法的一些实施方案中，所述缀合物以约0.1mg/kg至约10mg/kg或约0.1mg/kg至约12mg/kg的剂量施用。
在一些实施方案中，提供了改善接受GPC3+癌症的免疫疗法和/或化学疗法的受试者的治疗结果的方法，其包括：向患有癌症的受试者施用有效量的免疫疗法或化学疗法；和施用治疗有效量的本文所述的任何实施方案的缀合物或本文所述的任何缀合物的药物组合物；其中与单独施用免疫疗法或化学疗法相比，受试者的治疗结果得到改善。
在一些实施方案中，改善的治疗结果是选自稳定疾病、部分反应或完全反应的客观反应。
在一些实施方案中，改善的治疗结果是减少的肿瘤负荷。
在一些实施方案中，改善的治疗结果是无进展生存或无疾病生存。
在一些实施方案中，所述免疫疗法是免疫检查点抑制剂。
在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂包括特异性结合人PD-1、人PD-L1或CTLA4的抗体。
在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是派姆单抗、纳武单抗、cemiplimab或伊匹单抗。
在一些实施方案中，所述缀合物经静脉内施用。
在一些实施方案中，所述缀合物以约0.1mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。
在一些实施方案中，提供了本文所述的缀合物或本文所述的缀合物的药物组合物用于治疗受试者中的GPC3+癌症的用途。
在一些实施方案中，提供了本文所述的缀合物或本文所述的任何缀合物的药物组合物用于在接受免疫疗法或化学疗法的受试者中治疗GPC3+癌症的用途。
通过参考以下详细描述，具体实施方案的非限制性示例和附图，可以更全面地理解本公开的这些和其它方面。
附图的简要说明
图1A-1C ARD-103抗体和参照抗体与GPC3阳性细胞系：HepG2-C3A肝(图1A)；Hep3B肝(图1B)和NCI-H1975肺(图1C)的FACs结合图。
图2A-2C ARD-103抗体和相应ADC与GPC3阳性细胞系：HepG2-C3A肝(图2A)；Hep3B肝(图2B)和NCI-H1975肺(图2C)的FACs结合图。
图3A-3B参照mAb-vcMMAE在用5种肝癌细胞系(图3A)和4种肺癌细胞系(图3B)的体外细胞毒性测定中的活性图。
图4A-4C ARD103-vcMMAE(图4A)和参照ADC(参照mAb-DXD(图4B)和参照mAb-Duo(图4C))在体外细胞毒性测定中的活性图。
图5显示参照mAb-vcMMAE和参照mAb-SN38 ADC在NCI-H446肺癌小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用的图。
图6显示参照mAb-vcMMAE和参照mAb-SN38 ADC在NCI-H661肺癌小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用的图。
图7显示参照mAb-vcMMAE和参照mAb-SN38 ADC在Hep-G2肝癌小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用的图。
图8显示ARD103-vcMMAE、ARD103-SN38和ARD103-Dxd ADC在Hep-G2-C3A肝癌小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用的图。
图9显示ARD103-vcMMAE、ARD103-SN38和ARD103-Dxd ADC在Hep3B肝癌小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用的图。
图10显示ARD103-CL2-SN38在HepG2肝癌细胞中的体外测定的图。
图11A-11B显示ARD103-CL2A-SN38和ARD103-CL2-SN38在肝癌(图11A)HepG2-C3A和(图11B)Hep3B异种移植模型中的抗肿瘤作用的图。
详细描述内容
本公开提供了抗GPC3抗体、包含抗GPC3抗体的细胞毒性剂缀合物以及包含这种抗体和缀合物的药物组合物。本公开的抗体、缀合物和药物组合物可单独或与其它癌症治疗剂组合用于治疗GPC3+癌症。
为方便起见，本说明书、实施例和权利要求书中的某些术语在本文中定义。除非另有说明，或者从上下文中暗示，否则以下术语和短语具有以下提供的含义。提供这些定义是为了帮助描述特定的实施方案，而不是为了限制所要求保护的发明，因为本发明的范围仅由权利要求限定。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。
除非另有说明，本文所用的术语“一(a)”和“一个(种)(an)”是指“一个(种)”、“至少一个(种)”或“一个(种)或多个(种)”。除非上下文另有要求，否则本文所用的单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。
替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。如贯穿本公开所使用的，术语“包括”和“包含”被同义地使用。
“任选的”或“任选地”是指随后描述的要素、组分、事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括要素、组分、事件或情况发生的情况和它们不发生的情况。
短语“…的至少一个(种)”在后面跟随有项目或要素的列表时是指列表中的一个或多个要素的开放式集合，其可以但不一定包括多于一个(种)的元素。
在本公开全文中在数字的上下文中使用的术语“约”是指以该数字为中心并跨越小于该数字的15％和大于该数字的15％的范围。在范围的上下文中使用的术语“约”是指跨越小于该范围中列出的最低数字的15％并且大于范围中列出的最大数字的15％的扩展范围。
在整个公开中，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何值(包括整数或分数)或子范围。
除非上下文另外明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包含(comprise)”、“包含(comprising)”等应被解释为与排他性或穷尽性意义相反的包含性意义；也就是说，在“包括但不限于”的意义上。
术语“降低(decrease)”、“减少(reduce)”、“降低的(reduced)”、“减少(reduction)”、“降低(decrease)”和“抑制”在本文中一般都用于表示相对于参照物的统计学上显著量的降低。
术语“增加的”、“增加”或“增强”或“活化”在本文中一般都用于表示相对于参照物的统计学上显著量的增加。
本文所用的术语“分离的”或“部分纯化的”在核酸、多肽或蛋白质的情况下是指与至少一种其它组分(例如，核酸或多肽或蛋白质)分离的核酸、多肽或蛋白质，所述其它组分与所述核酸、所述多肽或所述蛋白质被发现在其天然来源中一起存在，和/或当由细胞表达时或在分泌的多肽和蛋白质分泌的情况下与所述多肽或所述蛋白质一起存在。化学合成的核酸、多肽或蛋白质，或使用体外转录/翻译合成的核酸、多肽或蛋白质被认为是“分离的”。术语“纯化的”或“基本上纯化的”是指分离的核酸、多肽或蛋白质，其主题核酸、多肽或蛋白质的至少95重量％，包括例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或更多。
本文所用的术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用，表示一系列氨基酸残基，每个氨基酸残基通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接。术语“蛋白质”和“多肽”还指蛋白质氨基酸的聚合物，所述氨基酸包括修饰的氨基酸(例如，磷酸化的、糖化的、糖基化的等)和氨基酸类似物，而不管其大小或功能。“蛋白质”和“多肽”常用于指相对大的多肽，而术语“肽”常用于指小的多肽，但这些术语在本领域中的使用重叠。术语“蛋白质”和“多肽”当涉及编码的基因产物及其片段时在本文中可互换使用。因此，示例性多肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白质、同源物、直向同源物、旁系同源物、片段以及前述的其它等同物、变体、片段和类似物。
GPC3或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3是糖基磷脂酰肌醇锚定的细胞表面蛋白，其可以作为细胞粘附蛋白起作用(也称为DGSX、OCI-5、SDYS、SGBS、GBS)。据报道，其在肝细胞癌、肺癌如小细胞肺癌和大细胞肺癌、结肠直肠癌、食道癌、宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肾细胞癌、胃癌、肉瘤和膀胱癌以及其它癌症中过表达。GPC3多肽包括但不限于具有NP_001158089.1(SEQ ID NO:9)、NP_001158090.1(SEQ ID NO:10)、NP_001158091.1(SEQ IDNO:23)和NP_004475.1(SEQ ID NO:24)中列出的氨基酸序列的那些；这些序列通过引用并入到本文中。
本文所用的“表位”是指通常与免疫球蛋白VH/VL对例如本文所述的抗体和结合剂结合的氨基酸。表位可以由多肽上的连续氨基酸或由通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常保留，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常丧失。表位通常包含在独特的空间构象中的至少3个，更通常至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。表位限定抗体或其它结合剂的最小结合位点，因此代表抗体，其抗原结合部分或其它基于免疫球蛋白的结合剂的特异性的靶标。在单结构域抗体的情况下，表位代表由分离的可变结构域结合的结构单位。
如本文所用，“特异性结合”是指本文所述的结合剂(例如抗体或其抗原结合部分)以10-5M(10000nM)或更低，例如10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或更低的KD与靶标(例如GPC3)结合的能力。特异性结合可受例如抗体或其它结合剂的亲和力和亲合力以及靶多肽的浓度的影响。本领域技术人员可以确定合适的条件，在该条件下，本文所述的抗体和其它结合剂使用任何合适的方法选择性地结合GPC3，例如在合适的细胞结合测定中滴定结合剂。特异性结合GPC3的结合剂不被不相似的竞争剂取代。在某些实施方案中，当抗GPC3抗体或其抗原结合部分优先识别在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的其靶抗原GPC3时，其被称为特异性结合GPC3。
在一些实施方案中，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂以10-5M(10000nM)或更低，例如10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或更低的解离常数(KD)特异性结合GPC3多肽。在一些实施方案中，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂以约10-5M至10-6M的解离常数(KD)特异性结合GPC3多肽。在一些实施方案中，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂以约10-6M至10-7M的解离常数(KD)特异性结合GPC3多肽。在一些实施方案中，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂以约10-7M至10-8M的解离常数(KD)特异性结合GPC3多肽。在一些实施方案中，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂特异性以约10-8M至10- 9M的解离常数(KD)特异性结合GPC3多肽。在一些实施方案中，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂以约10-9M至10-10M的解离常数(KD)特异性结合GPC3多肽。在一些实施方案中，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂以约10-10M至10-11M的解离常数(KD)特异性结合GPC3多肽。在一些实施方案中，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂以约10-11M至10-12M的解离常数(KD)特异性结合GPC3多肽。在一些实施方案中，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂以小于10- 12M的解离常数(KD)特异性结合GPC3多肽。
在整个公开中使用的“相同的”或“同一性”是指DNA、RNA、核苷酸、氨基酸或蛋白质序列与另一DNA、RNA、核苷酸、氨基酸或蛋白质序列之间的相似性。同一性可以用第一序列与第二序列的序列同一性的百分比来表示。与参照DNA序列的序列同一性百分比(％)可以是候选序列中在与参照DNA序列比对后与该参照DNA序列中的DNA核苷酸相同的DNA核苷酸的百分比。相对于参照氨基酸序列的序列同一性百分比(％)可以是候选序列中在与参照氨基酸序列比对并引入缺口(如果需要)以获得最大的序列同一性百分比，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，与该参照氨基酸序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。如本公开全文所用的，使用Altschul等人，“Gapped BLAST and PSI-BLAST:anew generation of protein database search programs,”Nucleic Acids Res.2007,25,3389-3402所定义的NCBI BLAST 2.0软件(参数设置为默认值)产生序列同一性百分比值。
如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需的那些要素。该术语允许存在不会实质上影响该实施方案的基本和新颖或功能特性的要素。
术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法和其各自的组分，其排除了在实施方案的那个描述中未陈述的任何要素。
除了在实施例中，或者在另外指出的情况下，本文使用的表示成分或反应条件的量的所有数字应当理解为在所有情况下由术语“约”修饰。当与百分比一起使用时，术语“约”可以是指+/-1％。
术语“统计学上显著的”或“显著地”是指统计学上的显著性，并且通常是指高于或低于参考值的两个标准偏差(2SD)的差异。
在本公开的各个方面的描述中定义了其它术语。
I.抗体
本文提供了特异性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)的ARD103结合抗体(也称为抗GPC3抗体或GPC3结合抗体)及其抗原结合部分。本文还提供了ARD103(抗GPC3)结合抗体和抗原结合部分以及细胞毒性剂的缀合物(也称为GPC3缀合物)。在一些实施方案中，GPC3缀合物减少受试者中的GPC3+癌细胞的数目。
在一些实施方案中，抗GPC3抗体或其抗原结合部分包含(i)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，GPC3结合抗体或其抗原结合部分包含(i)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链可变框架区和轻链可变框架区任选地用框架区中的1-8个、1-6个、1-4个或1-2个保守氨基酸取代修饰，其中所述重链或轻链可变区的CDR未被修饰。在一些实施方案中，抗GPC3抗体或其抗原结合部分包含(i)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQID NO：2所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链可变框架区和轻链可变框架区任选地用框架区中的1-8个、1-6个、1-4个或1-2个氨基酸取代、缺失或插入修饰，其中所述重链或轻链可变区的CDR未被修饰。
在一些实施方案中，本文提供了结合剂，其包含(i)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述结合剂特异性结合GPC3。在一些实施方案中，本文提供了结合剂，其包含(i)具有SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链和轻链可变框架区任选地用框架区中的1-8个、1-6个、1-4个或1-2个保守氨基酸取代修饰，其中重链或轻链可变区的CDR未被修饰。在一些实施方案中，本文提供了结合剂，其包含(i)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链和轻链可变框架区任选地用框架区中的1-8个、1-6个、1-4个或1-2个氨基酸取代、缺失或插入修饰，并且其中所述重链或轻链可变区的CDR未被修饰。如本文所述，结合剂包括抗GPC3抗体或其抗原结合部分，并且可以包括共价连接于抗GPC3抗体或其抗原结合部分的其它肽或多肽。在这些实施方案的任一个中，结合剂特异性结合GPC3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链CDR可通过使用以下方法中的任一种来鉴定：Kabat、Chothia、AbM、Contact、IMGT和/或Aho。在一些实施方案中，CDR由Kabat定义。
在一些实施方案中，提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的结合剂，其中所述VH区包含具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、具有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)和具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，并且所述VL区包含具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的轻链互补决定区轻链互补决定区2(LCDR2)和具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的3(LCDR3)，且其中各VH和VL包含人源化框架区且所述结合剂特异性结合GPC3。
在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法涉及通过抗GPC3抗体、其抗原结合部分、其它结合剂或其缀合物在体内减少受试者中的GPC3+细胞(例如，减少癌症或肿瘤中的GPC3+细胞的数目)。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法涉及通过施用抗GPC3抗体、其抗原结合部分、其它结合剂或其缀合物来治疗受试者的GPC3+癌症。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。该术语通常是指由两个免疫球蛋白重链可变区和两个免疫球蛋白轻链可变区组成的抗体，包括全长抗体(具有重链和轻链恒定区)及其抗原结合部分；包括，例如，完整的单克隆抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单结构域抗体(dAb)、双抗体、多特异性抗体、二特异性抗体、双特异性抗体和单链抗体(参见，例如，Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85,5879-5883(1988)和Bird等人，Science 242,423-426(1988)，其通过引用并入本文)。抗体可以包括，例如，多克隆、单克隆和基因工程改造的抗体、及其抗原结合片段。抗体可以是，例如，鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、异源缀合物、双特异性抗体、双抗体、三抗体或四抗体。
每个重链通常由可变区(缩写为VH)和恒定区组成。重链恒定区可包括三个结构域CH1、CH2和CH3以及任选的第四结构域CH4。每条轻链通常由可变区(缩写为VL)和恒定区组成。轻链恒定区是CL结构域。VH和VL区可进一步分成称为互补决定区(CDR)的高变区，以及散布有称为框架区(FR)的保守区。因此，每个VH和VL区由三个CDR和四个FR组成，它们按照以下顺序从N末端到C末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。这种结构是本领域技术人员公知的。CDR和FR序列可以通过几种不同的编号方案确定，包括Kabat、Chothia、AbM、Contact、IMGT和/或Aho。在一些实施方案中，CDR/FR由Kabat定义。
在一些实施方案中，抗原结合部分包含轻链互补决定区1(LCDR1)，轻链互补决定区2(LCDR2)，轻链互补决定区3(LCDR3)，重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)。
抗GPC3抗体的VH CDR的氨基酸序列在SEQ ID NO:1的氨基酸31-35(DYEMH，HCDR1，SEQ ID NO:11)、50-65(ALDPKTGDTAYSQKFKG，HCDR2，SEQ ID NO:12)和99-104(FYSYTY，HCDR3，SEQ ID NO:13)中示出。抗GPC3抗体的VL CDR的氨基酸序列在SEQ ID NO:2的氨基酸24-38(RSSQSLVHSNGNTYL，LCDR1，SEQ ID NO:14)、55-61(KVSNRFS，LCDR2，SEQ ID NO:15)和94-102(SQNTHVPPT，LCDR3，SEQ ID NO:16)中示出。短语“其中重链或轻链可变区的CDR未被修饰”是指这些VH和VL CDR(SEQ ID NO:11-16)，其不具有氨基酸取代、缺失或插入。
如本文所用，抗GPC3抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指特异性结合抗原的抗体分子的区域。在一些实施方案中，抗原结合部分是指具有抗GPC3抗体的VH和VL序列(如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，任选地如本文所述修饰)的本文所述的抗GPC3抗体的部分。根据术语抗体的“抗原结合部分”，抗原结合部分的实例包括Fab,Fab’,F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单结构域抗体(dAb)、双抗体、重链抗体(HCAb)、VHH、VNAR、纳米抗体和单链抗体。如本文所用，术语Fab、F(ab’)2和Fv是指以下：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，即包含两个Fab片段的二价片段，所述两个Fab片段在铰链区中通过二硫桥彼此连接；和(iii)由抗GPC3抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段。尽管Fv片段的两个结构域(即VL和VH)由单独的编码区编码，但是它们还可以使用合成接头彼此连接，所述接头例如聚-G4S氨基酸序列(‘(G4S)n’，其中n＝1至5，分别公开为SEQ ID NOS：17、28、29、30和31)，使得可以将它们制备为其中VL和VH区结合以形成单价分子(称为单链Fv(ScFv))的单蛋白链。术语抗体的“抗原结合部分”也意图包括这种单链抗体。其它形式的单链抗体如“双抗体”也包括在本文中。双抗体是二价，双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单一多肽链上表达，但使用连接VH和VL结构域的接头，该接头对于两个结构域太短以致不能在同一链上结合，从而迫使VH和VL结构域与不同链(分别为VL和VH)的互补结构域配对，并形成两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger,R等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:64446448；Poljak,R.J,等人，(1994)Structure 2:1121-1123)。
免疫球蛋白恒定区是指重链或轻链恒定区。恒定区提供抗体的一般框架，并且可以不直接参与抗体与抗原的结合，但是可以参与各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、ADCP(抗体依赖性细胞吞噬)、CDC(补体依赖性细胞毒性)和补体固定、结合Fc受体(例如，CD16、CD32、FcRn)、相对于缺乏Fc区的多肽的更长的体内半衰期、蛋白A结合、甚至胎盘转移(参见Capon等人，Nature 337：525，1989)。在本公开全文中使用时，“Fc区”是指来自抗体的Fc片段的重链恒定区区段(“片段可结晶”区或Fc区)，其可包括一个或多个恒定区，例如CH2、CH3、CH4或其任何组合。在一些实施方案中，Fc区包括IgG、IgA或IgD抗体的CH2和CH3结构域，或IgM或IgE抗体的CH3和CH4结构域。
人重链和轻链恒定区氨基酸序列是本领域已知的。恒定区可以是任何合适的类型，其可以选自免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的类别。几种免疫球蛋白类别可进一步分成同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区(Fc)可以分别是α、δ、ε、γ和μ。轻链可以是κ和λ中的一种。免疫球蛋白恒定区的同种异型变体也存在，例如对于IgG1、IgG2、IgG3和IgA重链恒定区以及Igκ轻链。
在一些实施方案中，恒定区可以具有IgG1同种型。在一些实施方案中，恒定区可以具有IgG2同种型。在一些实施方案中，恒定区可以具有IgG3同种型。在一些实施方案中，恒定区可以具有IgG4同种型。在一些实施方案中，Fc区可以具有包含来自两种或更多种同种型的恒定结构域的杂合同种型。在一些实施方案中，免疫球蛋白恒定区可以是IgG1或IgG4恒定区。在一些实施方案中，恒定区是IgG1同种异型变体(例如，G1m1或nG1m1)。IgG1 G1m1同种异型恒定区的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:3的氨基酸116-445中示出。IgG1 nG1m1同种异型恒定区的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:32中示出。
在一些实施方案中，抗GPC3抗体具有IgG1重链恒定区。在一些实施方案中，IgG1重链恒定区具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:32的116-445位所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗GPC3抗体具有κ轻链恒定区。在一些实施方案中，κ轻链恒定区具有SEQ ID NO:4的113-219位所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗GPC3抗体重链是IgG1同种型的，并具有SEQ ID NO:3、SEQID NO:7、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗GPC3抗体轻链是κ同种型的，并具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
此外，抗-GPC3抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价结合形成的较大结合剂的一部分。与这种结合剂相关的是使用链霉抗生物素蛋白核心区域来制备四聚scFv分子(Kipriyanov,S.M.，等人，(1995),Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)，以及半胱氨酸残基，标志物肽和C-末端聚组氨酰基肽，例如六组氨酰基标签(如SEQ ID NO:18所公开的‘六组氨酰基标签’)用于产生二价和生物素化scFv分子的用途(Kipriyanov,S.M.，等人，(1994)Mol.Immunol.31:10471058)。
至于VH和VL氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，对编码VH或VL的核酸，或对多肽中改变编码的序列中的单个氨基酸或小百分比氨基酸的氨基酸的单独取代、缺失或添加(插入)是“保守修饰的变体”，其中改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代(保守氨基酸取代)，并且改变的多肽保留特异性结合GPC3的能力。
在一些实施方案中，抗GPC3抗体或其抗原结合部分的保守修饰变体可在框架区(FR)中具有改变；即，除了在CDR中以外，例如抗GPC3抗体的保守修饰变体具有VH和VL CDR的氨基酸序列(如SEQ ID NO:11-16所示)，并且在FR中具有至少一个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，与VH和VL的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:1和2)相比，VH和VL氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:1和2中示出)在FR中共同具有不超过8个或6个或4个或2个或1个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，与VH和VL的氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:1和2中示出)相比，VH和VL氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:1和2中示出)在FR中具有8-1、6-1、4-1或2-1个保守氨基酸取代。在任何这些实施方案的其它方面，抗GPC3抗体、其抗原结合部分或其它结合剂的保守修饰变体表现出与GPC3的特异性结合。
对于保守氨基酸取代，给定的氨基酸可以被具有类似理化特性的残基取代，例如，用一个脂族残基取代另一个脂族残基(例如，用Ile、Val、Leu或Ala彼此取代)，或用一个极性残基取代另一个极性残基(例如，在Lys和Arg之间；在Glu和Asp之间；或在Gln和Asn之间)。其它这样的保守氨基酸取代，例如具有相似疏水性特征的整个区域的取代是众所周知的。可以在本文所述的任何一种测定中测试包含保守氨基酸取代的多肽，以证实保留了所需的活性，例如天然或参照多肽的抗原结合活性和特异性，即对GPC3的抗原结合活性和特异性。
对于保守取代，氨基酸可根据其侧链性质的相似性分组(A.L.Lehninger,Biochemistry，第二版,pp.73-75，Worth Publishers,New York(1975)):(1)非极性的：Ala(a)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电荷的极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(n)、Gln(Q)；(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)；和(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。
或者，对于保守取代，天然存在的残基可基于共同的侧链性质被分成组：(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性的：Asp、Glu；(4)碱性的：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和(6)芳族的：Trp、Tyr、Phe。非保守取代将需要交换这些类别或另一个类别中的一个成员。
具体的保守取代包括，例如；Ala至Gly或至Ser；Arg至Lys；Asp至Glu或者His；Asp至Glu；Cys至Ser；Gln至Asn；Glu至Asp；Gly至Ala或至Pro；His至Asn或至Gln；Ile至Leu或至Val；Leu至Ile或至Val；Lys至Arg、至Gln或至Glu；Met至Leu、Tyr或Ile；Phe至Met、至Leu或至Tyr；Ser至Thr；Thr至Ser；Trp至Tyr；Tyr至Trp；和/或Phe至Val、至Ile或至Leu。
在一些实施方案中，抗GPC3抗体或其抗原结合部分的保守修饰变体优选与参照VH或VL序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多相同。其中VH和VL CDR(SEQ ID NO:11-16)未被修饰。在整个公开中使用的“相同的”或“同一性”是指DNA、RNA、核苷酸、氨基酸或蛋白质序列与另一DNA、RNA、核苷酸、氨基酸或蛋白质序列之间的相似性。同一性可以用第一序列与第二序列的序列同一性的百分比来表示。与参照DNA序列的序列同一性百分比(％)可以是候选序列中在与参照DNA序列比对后与该参照DNA序列中的DNA核苷酸相同的DNA核苷酸的百分比。相对于参照氨基酸序列的序列同一性百分比(％)可以是候选序列中在与参照氨基酸序列比对并引入缺口(如果需要)以获得最大的序列同一性百分比，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，与该参照氨基酸序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。如本公开全文所用的，使用Altschul等人，“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a newgeneration of protein database search programs,”Nucleic Acids Res.2007,25,3389-3402所定义的NCBI BLAST 2.0软件(参数设置为默认值)产生序列同一性百分比值。
在一些实施方案中，与VH和VL的氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:1和2中示出)相比，VH和VL氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:1和2中示出)在框架区中共同具有不超过8个或6个或4个或2个或1个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，与VH和VL的氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:1和2中示出)相比，VH和VL氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:1和2中示出)在框架区中共同具有8-1个、或6-1个、或4-1个、或2-1个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，与VH和VL的氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:1和2中示出)相比，VH和VL氨基酸序列(分别在SEQID NO:1和2中示出)在框架区中共同具有不超过8个或6个或4个或2个或1个氨基酸取代、缺失或插入。在一些实施方案中，与VH和VL的氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:1和2中示出)相比，VH和VL氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:1和2中示出)在框架区中具有8-1、6-1、4-1或2-1个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，与VH和VL的氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:1和2中示出)相比，VH和VL氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:1和2中示出)共同具有不超过8个或6个或4个或2个或1个氨基酸取代、缺失或插入。
天然(或参照)氨基酸序列的修饰可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的任一种来完成。例如，通过合成含有所需突变序列的寡核苷酸，可以在特定位点引入突变，所述寡核苷酸的侧翼是能够与天然序列的片段连接的限制性位点。连接后，得到的重建序列编码具有所需氨基酸插入、取代或缺失的变体。或者，可采用寡核苷酸指导的位点特异性诱变方法来提供改变的核苷酸序列，其具有根据所需的取代、缺失或插入而改变的特定密码子。用于进行这种改变的技术是非常成熟的，并且包括例如Walder等人(基因42:133,1986)；Bauer等人(基因37:73,1985)；Craik(BioTechniques，1985年1月，12-19)；Smith等人(Genetic Engineering:Principles and Methods,Plenum Press,1981)；以及美国专利号4,518,584和4,737,4621中公开的那些，其全部内容通过引用整体并入本文中。
在一些实施方案中，抗GPC3抗体或其抗原结合部分具有全人恒定区。在一些实施方案中，抗GPC3抗体或其抗原结合部分具有非人恒定区。在一些实施方案中，抗GPC3抗体重链是IgG1同种型的，并具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗GPC3抗体轻链是κ同种型的，并具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在各种实施方案中，抗GPC3抗体、其抗原结合部分和其它结合剂可在人、鼠或其它动物来源的细胞系中产生。重组DNA表达可用于产生抗GPC3抗体、其抗原结合部分和其它结合剂。这允许在选择的宿主物种中产生抗GPC3抗体以及GPC3抗原结合部分的谱和其它结合剂(包括融合蛋白)。在细菌、酵母、转基因动物和鸡蛋中产生抗GPC3抗体、其抗原结合部分和其它结合剂也是基于细胞的生产系统的替代方案。转基因动物的主要优点是来自可再生资源的潜在高产率。
在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的抗GPC3VH多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的抗-GPC3 VL多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的抗GPC3 VH多肽由具有SEQID NO:21所示的序列的核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的抗-GPC3 VL多肽由具有SEQ ID NO:22所示的序列的核酸编码。
在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的抗-GPC3重链多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的抗GPC3轻链多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的抗-GPC3重链多肽由具有SEQ ID NO:19所示的序列的核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的抗GPC3轻链多肽由具有SEQ ID NO:20所示的序列的核酸编码。
在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的抗-GPC3重链多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的抗GPC3轻链多肽由核酸编码。
在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的抗-GPC3重链多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的抗GPC3轻链多肽由核酸编码。
如本文所用，术语“核酸”或“核酸序列”或“多核苷酸序列”或“核苷酸”是指并入核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物的单元的聚合分子。核酸可以是单链或双链的。单链核酸可以是变性双链DNA的一条链的核酸。如果是单链的，核酸可以是编码链或非编码的(反义链)。核酸分子可以含有天然亚单元或非天然亚单元。编码氨基酸序列的核酸分子包括编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。核苷酸序列的一些版本也可以包括内含子，其程度可以通过共转录或转录后机制除去内含子。换句话说，由于遗传密码的冗余或简并性，或通过剪接，不同的核苷酸序列可以编码相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸可以是cDNA，例如缺乏内含子的核酸。
编码抗GPC3抗体、其抗原结合部分以及其它结合剂的氨基酸序列的核酸分子可以通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于制备编码抗GPC3抗体、抗原结合部分或其它结合剂的合成核苷酸序列。此外，寡核苷酸介导的(或定点的)诱变、PCR介导的诱变和盒式诱变可用于制备编码抗-GPC3抗体或抗原结合部分以及其它结合剂的核苷酸序列。如本文所述，编码至少一种抗GPC3抗体、其抗原结合部分、结合剂或其多肽的核酸序列可根据常规技术与载体DNA重组，所述常规技术例如平端或错开端以用于连接，限制性酶消化以提供适当的末端，根据需要填充粘性末端，碱性磷酸酶处理以避免不希望的连接，以及用适当的连接酶连接。用于这种操作的技术例如由Maniatis等人，Molecular Cloning,Lab.Manual(Cold Spring Harbor Lab.Press,NY,1982and 1989)以及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons),1987-1993公开，并且可以用于构建编码抗-GPC3抗体或其抗原结合部分或其VH或VL多肽的核酸序列和载体。
如果核酸分子(例如DNA)含有核苷酸序列，所述核苷酸序列含有转录和翻译调控信息，并且这种序列与编码多肽的核苷酸序列“可操作地连接”，则认为所述核酸分子“能够表达”所述多肽。可操作地连接是其中调控DNA序列和寻求表达的DNA序列(例如，抗-GPC3抗体或其抗原结合部分)以允许可回收量的多肽或抗原结合部分的基因表达的方式连接的连接。基因表达所需的调控区的精确性质可因生物体而异，这在类似领域中是众所周知的。参见，例如，Sambrook等人,1989；Ausubel等人,1987-1993。
因此，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分的表达可以在原核或真核细胞中发生。合适的宿主包括体内或原位的细菌或真核宿主，包括酵母，昆虫，真菌，鸟和哺乳动物细胞，或哺乳动物，昆虫，鸟或酵母来源的宿主细胞。哺乳动物细胞或组织可以是人、灵长类、仓鼠、兔、啮齿类、牛、猪、绵羊、马、山羊、狗或猫来源的，但也可以使用任何其它哺乳动物细胞。此外，通过使用例如酵母遍在蛋白水解酶系统，可以实现遍在蛋白-跨膜多肽融合蛋白的体内合成。如此产生的融合蛋白可在体内加工或纯化并在体外加工，允许合成如本文所述的具有特定氨基末端序列的抗-GPC3抗体或其抗原结合部分。此外，可以避免与在直接酵母(或细菌)表达中保留起始密码子衍生的甲硫氨酸残基有关的问题(参见，例如，Sabin等人，7Bio/Technol.705(1989)；Miller等人，7Bio/Technol.698(1989))。当酵母在富含葡萄糖的培养基中生长时，可以利用并入来自编码大量产生的糖酵解酶的活性表达基因的启动子和终止元件的一系列酵母基因表达系统中的任何一种来获得重组抗-GPC3抗体或其抗原结合部分。已知的糖酵解基因也可以提供非常有效的转录控制信号。例如，可以利用磷酸甘油酸激酶基因的启动子和终止子信号。
在昆虫中产生抗-GPC3抗体或其抗原结合部分可以例如通过本领域技术人员已知的方法用经改造以表达多肽的杆状病毒感染昆虫宿主来实现。参见Ausubel等人,1987-1993。
在一些实施方案中，将导入的核酸序列(编码抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其多肽)并入能够在受体宿主细胞中自主复制的质粒或病毒载体中。为此目的可以使用多种载体中的任一种，并且是本领域技术人员已知的和可获得的。参见，例如，Ausubel等人,1987-1993。在选择特定质粒或病毒载体中重要的因素包括：含有载体的受体细胞可以被识别并从不含有载体的那些受体细胞选择的便利性；特定宿主中所需的载体拷贝数；以及是否希望能够在不同物种的宿主细胞之间“穿梭”载体。
示例性的病毒载体包括逆转录病毒，腺病毒，细小病毒(例如腺伴随病毒)，冠状病毒，负链RNA病毒如正粘病毒(例如流感病毒)，弹状病毒(例如狂犬病和水疱性口炎病毒)，副粘病毒(例如麻疹和仙台病毒)，正链RNA病毒如小RNA病毒和甲病毒，以及双链DNA病毒，包括腺病毒，疱疹病毒(例如，1型和2型单纯疱疹病毒，Epstein-Barr病毒，巨细胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘，禽痘和金丝雀痘)。其它病毒包括例如诺沃克病毒，披膜病毒，黄病毒，呼肠孤病毒，乳多空病毒，嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括禽类白血病-肉瘤，哺乳动物C-型病毒，B-型病毒，D型病毒，HTLV-BLV组，慢病毒，泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,In Fundamental Virology,第三版，B.N.Fields等人，编辑,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996)。在一些这样的实施方案中，病毒载体是慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体。
本领域已知的示例性原核载体包括质粒，例如能够在大肠杆菌中复制的质粒。用于表达编码抗GPC3抗体或其抗原结合部分的DNA的其它基因表达元件包括但不限于(a)病毒转录启动子及其增强子元件，例如SV40早期启动子。(Okayama等人,3Mol.Cell.Biol.280(1983))，劳斯肉瘤病毒LTR(Gorman等人，79PNAS 6777(1982))，和莫洛尼鼠白血病病毒LTR(Grosschedl等人，41Cell 885(1985))；(b)剪接区和聚腺苷酸化位点，例如源自SV40晚期区域的那些(Okayarea等人，1983)，和(c)聚腺苷酸化位点，例如在SV40中(Okayama等人,1983)。编码免疫球蛋白的DNA基因可以如Liu等人(在下文)和Weidle等人,51Gene 21(1987)所述，使用SV40早期启动子及其增强子，小鼠免疫球蛋白H链启动子增强子，SV40晚期区域mRNA剪接，兔S-珠蛋白插入序列，免疫球蛋白和兔S-珠蛋白聚腺苷酸化位点和SV40聚腺苷酸化元件作为表达元件进行表达。
对于编码免疫球蛋白的核苷酸序列，转录启动子可以是例如人巨细胞病毒，启动子增强子可以是巨细胞病毒和小鼠/人免疫球蛋白。
在一些实施方案中，为了在啮齿动物细胞中表达DNA编码区，转录启动子可以是病毒LTR序列，转录启动子增强子可以是小鼠免疫球蛋白重链增强子和病毒LTR增强子之一或两者，以及聚腺苷酸化和转录终止区。在其它实施方案中，编码其它蛋白质的DNA序列与上述表达元件组合以实现在哺乳动物细胞中的蛋白质的表达。
每个编码区或基因融合体组装在表达载体中或插入表达载体中。能够表达抗GPC3可变区或其抗原结合部分(例如，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列的VL或其如本文所述的变体)的受体细胞然后用编码抗GPC3抗体或抗体多肽或其抗原结合部分的核苷酸单独转染，或用编码VH和VL链编码区的多核苷酸共转染。在允许并入的编码区表达的条件下培养转染的受体细胞，并从培养物中回收表达的抗体链或完整的抗体或抗原结合部分。
在一些实施方案中，含有编码抗-GPC3抗体或其抗原结合部分(例如，具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL或其如本文所述的变体)的编码区的核酸组装在单独的表达载体中，所述载体然后用于共转染受体宿主细胞。每种载体可以含有一个或多个可选择基因。例如，在一些实施方案中，使用两个可选择基因，设计用于在细菌系统中选择的第一可选择基因和设计用于在真核系统中选择的第二可选择基因，其中每种载体具有一组编码区。该策略产生首先指导细菌系统中核苷酸序列的产生和允许其扩增的载体。随后将在细菌宿主中如此产生和扩增的DNA载体用于共转染真核细胞，并允许选择携带所需转染核酸(例如，含有抗GPC3抗体重链和轻链)的共转染细胞。用于细菌系统的可选择基因的非限制性实例是赋予氨苄青霉素抗性的基因和赋予氯霉素抗性的基因。用于真核转染子的可选择基因包括黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(命名为gpt)和来自Tn5的磷酸转移酶基因(命名为neo)。或者，编码VH和VL链的融合核苷酸序列可以组装在同一表达载体上。
为了转染表达载体和产生抗GPC3抗体或其抗原结合部分，受体细胞系可以是中国仓鼠卵巢细胞系(例如DG44)或骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞可以合成，组装和分泌由转染的免疫球蛋白基因编码的免疫球蛋白，并具有免疫球蛋白糖基化的机制。例如，在一些实施方案中，受体细胞是产生重组Ig的骨髓瘤细胞SP2/0。SP2/0细胞仅产生由转染基因编码的免疫球蛋白。骨髓瘤细胞可以在培养物中或在小鼠的腹膜腔中生长，其中分泌的免疫球蛋白可以从腹水中获得。
编码抗-GPC3抗体或其抗原结合部分(例如，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL或其如本文所述的变体)的表达载体可以通过多种合适方式中的任一种引入到合适的宿主细胞中，包括生物化学方式如转化、转染、原生质体融合、磷酸钙沉淀和用聚阳离子如二乙基氨基乙基(DEAE)葡聚糖的施加，以及诸如电穿孔、直接显微注射和微粒轰击的机械方式。Johnston等人，240Science1538(1988)，如本领域技术人员已知的。
酵母为免疫球蛋白重链和轻链的产生提供了优于细菌的某些优点。酵母进行翻译后肽修饰，包括糖基化。存在许多利用强启动子序列和高拷贝数质粒的重组DNA策略，所述质粒可用于在酵母中生产所需的蛋白质。酵母识别克隆的哺乳动物基因产物的前导序列并分泌带有前导序列的多肽(即，前多肽)。参见，例如，Hitzman等人，第11Intl.Conf.Yeast,Genetics&Molec.Biol.(Montpelier,France,1982)。
酵母基因表达系统可以常规地评价抗体的生产，分泌和稳定性水平，以及组装的抗GPC3抗体及其抗原结合部分。可以利用各种酵母基因表达系统，这些酵母基因表达系统并入来自当酵母在富含葡萄糖的培养基中生长时大量产生的编码糖酵解酶的活性表达基因的启动子和终止元件。已知的糖酵解基因也可以提供非常有效的转录控制信号。例如，可以利用磷酸甘油酸激酶(PGK)基因的启动子和终止子信号。另一个实例是翻译延伸因子1α启动子。可以采用多种方法来评价用于在酵母中表达免疫球蛋白的最佳表达质粒。参见IIDNA Cloning 45,(Glover编辑,IRL Press,1985)和例如，美国公开号US 2006/0270045A1。
细菌菌株也可用作产生本文所述的抗体分子或其抗原结合部分的宿主，可使用大肠杆菌K12菌株如大肠杆菌W3110、芽孢杆菌属物种、肠细菌如鼠伤寒沙门氏菌或粘质沙雷氏菌，以及各种假单胞菌属物种。含有来自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些细菌宿主结合使用。载体携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的特定基因。可以采用多种方法来评价表达质粒以在细菌中产生抗-GPC3抗体及其抗原结合部分(参见Glover,1985；Ausubel，1987，1993；Sambrook,1989；Colligan,1992-1996)。
宿主哺乳动物细胞可以在体外或体内生长。哺乳动物细胞对免疫球蛋白分子提供翻译后修饰，包括前导肽去除，VH和VL链的折叠和组装，抗体分子的糖基化，以及功能性抗体和/或其抗原结合部分的分泌。
除了上述淋巴来源的细胞外，还可用作产生抗体蛋白的宿主的哺乳动物细胞包括成纤维细胞来源的细胞，如Vero或CHO-K1细胞。可用于表达免疫球蛋白多肽的示例性真核细胞包括但不限于COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S和DG44细胞；PERC6TM细胞(Crucell)；以及NSO细胞。在一些实施方案中，基于特定真核宿主细胞对重链和/或轻链进行所需的翻译后修饰的能力来选择它们。例如，在一些实施方案中，CHO细胞产生具有比293细胞中产生的相同多肽更高水平的唾液酸化的多肽。
在一些实施方案中，一种或多种抗-GPC3抗体或其抗原结合部分(例如，具有SEQID NO:1所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL或其如本文所述的变体)可以在根据任何合适的方法，已经用一种或多种编码多肽的核酸分子工程改造或转染的动物体内产生。
在一些实施方案中，在无细胞系统中产生抗体或其抗原结合部分(例如，具有SEQID NO:1所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL或其如本文所述的变体)。例如，在Sitaraman等人,Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,Trends Biotechnol.22:538-45(2004)；Endo等人,Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)的文献中描述了非限制性的示例性无细胞系统。
许多载体系统可用于在哺乳动物细胞中表达VH和VL链(例如，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL或其如本文所述的变体)(参见Glover,1985)。可以采用各种方法获得完整的抗体。如上所述，可以在相同细胞中共表达VH和VL链以及任选的相关恒定区，以实现VH和VL链在细胞内缔合和连接成完整的四聚H2L2抗体或其抗原结合部分。共表达可以通过在相同的宿主中使用相同或不同的质粒来进行。可以将编码VH和VL链或其抗原结合部分(例如，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL或其如本文所述的变体)的核酸置于相同的质粒中，然后将其转染到细胞中，从而直接选择表达两条链的细胞。或者，可以首先用编码一条链，例如VL链的质粒转染细胞，然后用含有第二选择标志物的VH链质粒转染所得的细胞系。可以用编码肽、VH、VL或VH加VL链(例如，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL或其如本文所述的变体)的额外拷贝以及额外的可选择标志物的质粒通过任一途径转染产生抗体，其抗原结合部分的细胞系，以产生具有增强特性的细胞系，例如更高产量的组装的抗-GPC3抗体或其抗原结合部分或增强的转染细胞系的稳定性。
另外，植物已经作为用于重组抗体生产的方便，安全和经济的替代表达系统出现，其基于微生物或动物细胞的大规模培养。抗GPC3抗体或抗原结合部分可以在植物细胞培养物或常规生长的植物中表达。植物中的表达可以是全身性的，限于亚细胞质体，或限于种子(内胚层)。参见，例如，美国专利公开号2003/0167531；美国专利号6,080,560；美国专利号6,512,162；WO 0129242。几种植物来源的抗体已经达到了发展的高级阶段，包括临床试验(参见，例如，Biolex,N.C.)。
对于完整抗体，抗-GPC3抗体的可变区(VH和VL)(例如，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL或其如本文所述的变体)通常与免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白的Fc)的至少一部分连接。人恒定区DNA序列可以根据公知的方法从多种人细胞，例如永生化的B细胞(WO 87/02671；其通过引用全文并入本文中)中分离。抗GPC3抗体可以含有轻链和重链恒定区。重链恒定区可包括CH1、铰链区、CH2、CH3，有时还包括CH4区。在一些实施方案中，CH2结构域可以被删除或省略。
或者，描述了用于生产单链抗体的技术(参见，例如，美国专利号4,946,778；Bird,Science 242:423-42(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988；和Ward等人,Nature334:544-54(1989)；其通过引用全文并入本文中)可适于产生特异性结合GPC3的单链抗体。通过氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链可变区(例如，具有SEQ ID NO:1和2所示的氨基酸序列，或其如本文所述的变体(例如，任选地用1-8个氨基酸取代、缺失和/或插入修饰))，形成单链多肽，从而形成单链抗体。也可使用在大肠杆菌中组装功能性Fv片段的技术(参见，例如Skerra等人，Science 242：1038-1041(1988)；其通过引用全文并入本文中)。
完整的(例如，整个)抗体，它们的二聚体，单独的轻链和重链，或其抗原结合部分可以通过已知技术回收和纯化，例如免疫吸附或免疫亲和层析、诸如HPLC(高效液相层析)的层析方法，硫酸铵沉淀，凝胶电泳，或这些的任意组合。一般参见范围，Scopes,ProteinPurification(Springer-Verlag,N.Y.,1982)。至少约90％至95％均一性的基本上纯的抗-GPC3抗体或其抗原结合部分，如98％至99％或更均一性的那些抗体或其抗原结合部分，特别是对于药物用途是有利的。一旦根据需要部分纯化或至均一性，完整的抗-GPC3抗体或其抗原结合部分就可用于治疗或开发和进行分析方法，免疫荧光染色等。一般参见Vols.I&IIImmunol.Meth.(Lefkovits&Pernis,eds.,Acad.Press,NY,1979和1981)。
另外，如本文所述，可以进一步优化抗GPC3抗体或其抗原结合部分，以降低潜在的免疫原性，同时保持功能活性，用于人的治疗。在一些实施方案中，优化的GPC3结合抗体或其抗原结合部分衍生自抗GPC3抗体，所述抗GPC3抗体包含(i)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链和轻链可变框架区任选地用框架区中的1-8个、1-6个、1-4个或1-2个保守氨基酸取代修饰，其中所述重链或轻链可变区的CDR未被修饰。在一些实施方案中，优化的GPC3结合抗体或其抗原结合部分衍生自GPC3结合抗体，所述GPC3结合抗体包含(i)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链和轻链可变框架区任选地用框架区中的1-8个、1-6个、1-4个或1-2个氨基酸取代、缺失或插入修饰，其中所述重链或轻链可变区的CDR未被修饰。在这方面，功能活性是指能够显示与GPC3结合抗体或其抗原结合部分相关的一种或多种已知功能活性的抗GPC3抗体或其抗原结合部分，所述抗GPC3抗体或其抗原结合部分包含(i)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区。在这些实施方案的任一个中，GPC3结合抗体或其抗原结合部分的功能活性包括特异性结合GPC3。其它功能活性包括抗癌活性。此外，具有功能活性的抗GPC3抗体或其抗原结合部分意指多肽显示出与本文所述的参照抗体或其抗原结合部分(例如，GPC3结合抗体或其抗原结合部分，其包含(i)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的轻链可变区，或其如本文所述的变体)的活性相似或更好的活性，如在具有或不具有剂量依赖性的特定测定中测量的，所述特定测定例如生物测定。在存在剂量依赖性的情况下，其不必与参照抗体或其抗原结合部分的剂量依赖性相同，而是与本文所述的参照抗体或其抗原结合部分相比，基本上类似于或好于给定活性中的剂量依赖性(即，候选多肽相对于参照抗体将显示更大的活性)。
II.抗体药物缀合物
在一些实施方案中，抗GPC3(ARD103)抗体是抗GPC3抗体药物缀合物(或GPC3缀合物)的一部分。在一些实施方案中，抗GPC3抗体连接到至少一个接头，并且至少一种细胞毒性剂连接到每个接头。
如本文所用，“细胞毒性剂”是指例如通过防止细胞生长或复制对细胞发挥细胞毒性或细胞抑制作用的化合物。“小分子”或“化合物”是分子量小于1500、或100、或900、或750、或600、或500道尔顿的有机化合物。“小分子药物”是具有治疗效果如治疗疾病或病症的小分子。在一些实施方案中，小分子不是蛋白质、多糖或核酸。
在一些实施方案中，细胞毒性剂是微管破坏剂(例如，微管蛋白破坏剂)或DNA修饰剂。
在一些实施方案中，GPC3缀合物包括作为微管蛋白破坏剂的细胞毒性剂。已知几种不同类型的微管蛋白破坏剂，包括奥瑞他汀、tubulysin、秋水仙碱、长春花生物碱、紫杉烷类、cryptophycin、美登素生物碱，cryptophycin以及其它微管蛋白破坏剂。奥瑞他汀是天然产物尾海兔素(dolastatin)10的衍生物。示例性的奥瑞他汀包括MMAE(N-甲基缬氨酸-缬氨酸-dolaisoleuine-dolaproine-去甲麻黄碱或单甲基奥瑞他汀E)和MMAF(N-甲基缬氨酸-缬氨酸-dolaisoleuine-dolaproine-苯丙氨酸或单甲基奥瑞他汀F))和AFP(参见PCT公开号WO2004/010957和WO2007/008603)。PCT公开号WO 2015/057699描述了包括MMAE在内的聚乙二醇化的奥瑞他汀。在美国专利号9,345,785中公开了预期使用的其它尾海兔素衍生物，该专利通过引用并入到本文中。
tubulysin包括但不限于tubulysins D、tubulysins M、小管苯基丙氨酸和tubutyrosine。PCT公开号WO2017/096311和WO2016/040684描述了微管蛋白类似物，包括tubulysin M。
秋水仙碱类包括但不限于秋水仙碱和CA-4。
长春花生物碱包括但不限于长春碱(VBL)、长春瑞滨(VRL)、长春新碱(VCR)和长春地辛(VOS)。
紫杉烷类包括但不限于紫杉醇和多西他赛。
cryptophycin包括但不限于cryptophycin-1和cryptophycin-52。
美登素生物碱包括但不限于美登木素、美登木素醇、DM1、DM3和DM4中的美登木素类似物，和ansamatocin-2。示例性的美登素生物碱药物部分包括具有经修饰的芳环的那些，例如：C-19-脱氯(美国专利号4,256,746)(通过安丝菌素P2(ansamitocin P2)的氢化铝锂还原制备)；C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利号4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌或放线菌的脱甲基化或使用LAH的脱氯制备)；和C-20-脱甲氧基，C-20-酰氧基(--OCOR)，+/-脱氯(美国专利号4,739,047)(通过使用酰氯的酰化制备)，以及在其它位置具有修饰的那些。
美登素生物碱药物部分还包括具有修饰的那些，例如：C-9-SH(美国专利号4,424,219)(通过美登醇与H2S或P2S5的反应制备)；C1-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH2OR)(美国专利号4,331,598)；C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利4,450,254)(由诺卡氏菌制备)；C-15-羟基/酰氧基(美国专利号4,364,866)(通过链霉菌转化美登醇制备)；C-15-甲氧基(美国专利号4,313,946和4,315,929)(分离自Trewia nudiflora)；C-18-N-脱甲基(美国专利号4,362,663和4,322,348(通过链霉菌使美登醇脱甲基化制备)；和4,5-脱氧(美国专利No.4,371,533)(通过三氯化钛/美登醇的LAH还原制备)。结合HER-2的TA.1-美登素生物碱缀合物的细胞毒性(Chari等人,Cancer Research 52:127-131(1992)在体外对人乳腺癌细胞系SK-BR-3进行测试。药物缀合物达到了与游离美登素生物碱药物相似的细胞毒性程度，其可以通过增加每抗体分子的美登素生物碱分子的数量来增加。
Hemiasterlin包括但不限于hemiasterlin和HT1-286。
其它的微管蛋白破坏剂包括根薯酮内酯A、根薯酮内酯B、根薯酮内酯AF、根薯酮内酯AJ、根薯酮内酯Al-环氧化物、圆皮海绵内酯(discodermolide)、埃坡霉素A、埃坡霉素B和laulimalide。
在一些实施方案中，细胞毒性剂是DNA修饰剂。在一些实施方案中，DNA修饰剂是烷化剂或拓扑异构酶抑制剂。在一些实施方案中，DNA修饰剂是多卡霉素或其类似物、加利车霉素或吡咯并苯并二氮杂。
在一些实施方案中，细胞毒性剂可以是拓扑异构酶抑制剂，例如喜树碱或喜树碱类似物，或蒽环霉素。喜树碱或其类似物的实例包括伊立替康(也称为CPT-11)、拓扑替康、10-羟基-CPT、SN-38、依沙替康和依沙替康类似物DXD(参见美国专利公开号2015/0297748)。蒽环霉素的实例包括多柔比星、表柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682及其衍生物(参见美国专利号10,960,083；Quintieri等人(2005)Clin.Cancer Res.11:1608-1617；Stefan等人(2017)Mol.Cancer Ther.16:879-892)。
在一些实施方案中，细胞毒性剂是多卡霉素，包括合成类似物KW-2189和CBI-TMI。
预期用于本文方法的GPC3缀合物包含至少一个接头，每个接头具有至少一个与其连接的细胞毒性剂。通常，缀合物包括抗-GPC3抗体或其抗原结合片段与细胞毒性剂之间的接头。接头可以是蛋白酶可裂解的接头(参见，例如，PCT公开号WO2004/010957)、酸可裂解的接头、二硫化物接头、自稳定接头(参见，例如PCT公开号WO2018/031690和WO2015/095755)、不可裂解的接头(参见，例如PCT公开号WO2007/008603)、和/或亲水性接头(参见，例如PCT公开号WO2015/123679)。在各种实施方案中，接头在细胞内条件下是可裂解的，使得接头的裂解在细胞内环境中从抗体释放细胞毒性剂。
例如，在一些实施方案中，接头是存在于细胞内环境(例如，在溶酶体或内体或小窝内)中的裂解剂可裂解的。接头可以是例如被细胞内肽酶或蛋白酶(包括但不限于溶酶体或内体蛋白酶)裂解的肽基接头。通常，肽基接头是至少一个氨基酸长或至少两个氨基酸长。裂解剂可以包括组织蛋白酶B和D以及纤溶酶，已知所有这些都水解二肽药物衍生物，导致活性药物在靶细胞内释放(参见，例如，Dubowchik和Walker，1999，Pharm.Therapeutics83:67-123)。最典型的是可被存在于靶抗原表达细胞中的酶裂解的肽基接头。例如，可以使用在癌组织中高度表达的可由硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶-B裂解的肽基接头(例如，Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:26)接头)。其他此类接头描述于例如美国专利号6,214,345中。在具体的实施方案中，可被细胞内蛋白酶裂解的肽基接头是Val-Cit接头或Phe-Lys接头(参见，例如，美国专利号6,214,345，其描述了具有val-cit接头的多柔比星的合成)或Gly-Gly-Phe-Gly(SEQ ID NO:25)接头(参见，例如，美国专利公开2015/0297748)。使用细胞毒性剂的细胞内蛋白水解释放的一个优点是，当缀合时，该试剂通常是减毒的，并且缀合物的血清稳定性通常是高的。还参见美国专利号9,345,785。
如本文所用，术语“细胞内裂解的”和“细胞内裂解”是指细胞内在抗体药物缀合物上的代谢过程或反应，由此细胞毒性剂和抗体之间的共价连接，例如接头被破坏，产生游离的细胞毒性剂或缀合物的其它代谢物从细胞内的抗体解离。因此，缀合物的裂解部分是细胞内代谢物。
在一些实施方案中，可裂解接头是pH敏感的，即在某些pH值下对水解敏感。通常，pH敏感的接头在酸性条件下是可水解的。例如，可以使用在溶酶体中可水解的酸不稳定接头(例如，腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式-乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等)。(参见，例如，美国专利号5,122,368；5,824,805；和5,622,929；Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123；Neville等人,1989,Biol.Chem.264:14653-14661)。这种接头在中性pH条件下相对稳定，如血液中的那些，但在低于pH 5.5或5.0(溶酶体的近似pH)时是不稳定的。在某些实施方案中，可水解的接头是硫醚接头(例如，硫醚通过酰基腙键与治疗剂连接(参见，例如，美国专利号5,622,929))。
在各种实施方案中，接头在还原条件下是可裂解的(例如，二硫键接头)。已知多种二硫键，包括例如可以使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-5-乙酰硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)-、SPDB和SMPT形成的那些(参见，例如，Thorpe等人，1987，Cancer Res.47:5924-5931；Wawrzynczak等人，Inlmmunoconjugates:Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer(C.W.Vogel ed.,Oxford U.Press,1987.还参见美国专利号4,880,935)。
在各种实施方案中，接头是丙二酸酯接头(Johnson等人,1995，AnticancerRes.15:1387-93)、马来酰亚胺基苯甲酰基接头(Lau等人，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10):1299-1304)、或3’-N-酰胺类似物(Lau等人，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。在一些实施方案中，接头单元是不可裂解的，并且药物通过抗体降解而释放(参见美国公开号2005/0238649)。
在各种实施方案中，接头对细胞外环境基本上不敏感。如本文所用，“对细胞外环境基本上不敏感”在接头的上下文中是指抗体药物缀合物(ADC)或ADC衍生物的样品中不超过约20％，通常不超过约15％，更通常不超过约10％，甚至更通常不超过约5％，不超过约3％，或不超过约1％的接头在ADC或ADC衍生物存在于细胞外环境(例如，在血浆中)时被裂解。接头对细胞外环境是否基本上不敏感可例如通过以下方式来确定：独立地与血浆孵育(a)ADC或ADC衍生物(“ADC样品”)和(b)等摩尔量的未缀合抗体或治疗剂(“对照样品”)达预定的时间段(例如2、4、8、16或24小时)，然后将ADC样品中存在的未缀合抗体或治疗剂的量与对照样品中存在的未缀合抗体或治疗剂的量进行比较，例如通过高效液相色谱测量。
在各种实施方案中，接头促进细胞内化。在某些实施方案中，当与细胞毒性剂缀合时(即，在本文所述的ADC或ADC衍生物的接头-治疗剂部分的环境中)，接头促进细胞内化。在其它实施方案中，当与细胞毒性剂和抗-GPC3抗体或其衍生物缀合时(即，在本文所述的ADC或ADC衍生物的环境中)，接头促进细胞内化。
可用于本发明组合物和方法的各种接头描述于PCT公开WO2004010957中。在各种实施方案中，蛋白酶可裂解接头包含硫醇反应性间隔基和二肽。在一些实施方案中，蛋白酶可裂解接头由硫醇反应性马来酰亚胺基己酰基间隔基、缬氨酸-瓜氨酸二肽和对氨基苄氧基羰基间隔基组成。
在各种实施方案中，酸可裂解接头是肼接头或季铵接头(参见PCT公开WO2017/096311和WO2016/040684)。
包含马来酰亚胺基团的自稳定接头描述于美国专利9,504,756中。
在各种实施方案中，微管蛋白破坏剂，例如奥瑞他汀，通过C-末端羧基与接头缀合，所述羧基与接头单元(LU)形成酰胺键，如美国专利号9,463,252中所述，其通过引用并入本文。在各种实施方案中，接头单元包含至少一个氨基酸。N,N’-二烷基奥瑞他汀的接头-药物缀合物(ADC)公开于美国专利号8,992,932中。
在各种实施方案中，接头还包含延伸单元(stretcher unit)和/或氨基酸单元。示例性的延伸单元和氨基酸单元描述于美国专利号9,345,785和美国专利号9,078,931中，其各自通过引用并入本文。
在各种实施方案中，本文提供了包含通过mc-val-cit-PAB接头共价连接至MMAE的抗GPC3抗体的抗体药物缀合物的用途。将GPC3缀合物作为药物组合物递送至受试者。
在一些实施方案中，GPC3缀合物具有下式：
或其药学上可接受的盐；其中：mAb是抗GPC3抗体，S是抗体的硫原子，A-是延伸单元，p是约3至约5，或约3至约8。
药物负荷由p表示，p是药物组合物中每个抗体的药物分子(细胞毒性剂)的平均数目。例如，如果p为约4，考虑到药物组合物中存在的所有抗体的平均药物负荷为约4。在一些实施方案中，P在约3至约5，更优选约3.6至约4.4，甚至更优选约3.8至约4.2的范围内。p可为约3、约4或约5。在一些实施方案中，P在约6至约8，更优选约7.5至约8.4的范围内。p可为约6、约7或约8。在缀合反应的制备中每个抗体的药物的平均数目可以通过常规方法如质谱、ELISA测定和HPLC来表征。抗体-药物缀合物的定量分布也可以根据p来确定。在一些情况下，同质抗体-药物缀合物的分离、纯化和表征可以通过诸如反相HPLC或电泳的方式实现，其中p是来自具有其它药物负荷的抗体-药物缀合物的特定值。
延伸单元(A)能够通过抗体的巯基将抗体单元与氨基酸单元(例如缬氨酸-瓜氨酸肽)连接。巯基可以例如通过还原抗-GPC3抗体的链间二硫键来产生。例如，可以通过由抗体的链间二硫键的还原产生的硫原子将延伸单元连接到抗体上。在一些实施方案中，延伸单元仅通过由抗体的链间二硫键的还原产生的硫原子与抗体连接。在一些实施方案中，巯基可通过抗GPC3抗体的赖氨酸部分的氨基与2-亚氨基硫戊环(Traut's试剂)或其它巯基产生试剂反应而产生。在某些实施方案中，抗GPC3抗体是重组抗体，并且被工程改造以携带一个或多个赖氨酸。在某些其它实施方案中，工程改造重组GPC3抗体以携带另外的巯基，例如另外的半胱氨酸。
MMAE的合成和结构描述于美国专利号6,884,869中，其通过引用全文并入本文中，且用于所有目的。在例如美国公开号2006/0074008和2009/0010945中描述了用于制备抗体药物缀合物的示例性延伸单元和方法的合成和结构，其各自通过引用全文并入本文。
代表性的延伸单元描述在美国专利No.9,211,319的式IIIa和IIIb的方括号内，并通过引用并入本文。
在各种实施方案中，抗体药物缀合物包含单甲基奥瑞他汀E和蛋白酶可裂解的接头。预期蛋白酶可裂解接头包含硫醇反应性间隔基和二肽。在各种实施方案中，蛋白酶可裂解接头由硫醇反应性马来酰亚胺基己酰基间隔基、缬氨酸-瓜氨酸二肽和对氨基-苄氧羰基或PAB间隔基组成。
缩写“MMAE”是指单甲基奥司他汀E。
缩写“vc”和“val-cit”是指二肽缬氨酸-瓜氨酸。
缩写“PAB”是指自消间隔基(self-immolative spacer)：
缩写“MC”是指延伸单元马来酰亚胺基己酰基：
在其它示例性实施方案中，所述缀合物具有以下通式：
AB-[L3]-[L2]-[L1]m-AAn-细胞毒性剂，
其中Ab是抗-GPC3抗体；细胞毒性剂可以是微管蛋白破坏剂或拓扑异构酶抑制剂；L3是包含抗体偶联部分和一个或多个乙炔(或叠氮化物)基团的接头的组分；L2在一端包含与L3中的乙炔(或叠氮化物)部分互补的限定的PEG(聚乙二醇)叠氮化物(或乙炔)，并且在另一端包含反应性基团，例如羧酸或羟基；L1包括可折叠单元(例如，自消基团)，或任选地连接到可折叠单元的肽酶可裂解部分，或酸可裂解部分；AA是氨基酸；m是值为0或1的整数，并且n是值为0、1、2、3或4的整数。这种接头可以通过点击化学来组装(参见，例如，美国专利号7,591,944和7,999,083)。
在一些实施方案中，细胞毒性剂是喜树碱或喜树碱(CPT)类似物，例如伊立替康(也称为CPT-11)、托泊替康、10-羟基-CPT、依沙替康、DXD和SN-38。代表性的结构如下所示。
关于缀合物式Ab-[L3]-[L2]-[L1]m-AAn-细胞毒性剂，在一些实施方案中，m为0。在这样的实施方案中，首先在氨基酸(AA)(例如甘氨酸、丙氨酸或肌氨酸)或肽如双甘氨酸的羧酸与细胞毒性剂的羟基之间形成酯部分。在该实例中，氨基酸或多肽的N-末端可以被保护为Boc或Fmoc或单甲氧基三苯甲基(MMT)衍生物，其在与细胞毒性剂的羟基形成酯键之后被去保护。在含有额外羟基的细胞毒性剂的羟基位置处的BOC保护基团的存在下，使用单甲氧基三苯甲基(MMT)作为涉及酯形成的氨基酸或多肽的氨基的保护基团，可以实现胺保护基团的选择性去除，因为通过弱酸处理，例如不裂解BOC基团的二氯乙酸，‘MMT’是可去除的。在与细胞毒性剂的羟基形成酯键的氨基酸或多肽的氨基被去掩蔽后，在标准酰胺形成条件下，氨基与L2的PEG部分上的COOH基团的活化形式反应。在优选的实施方案中，L3包含与抗体的硫醇基团连接的硫醇反应性基团。硫醇反应性基团任选地是马来酰亚胺或乙烯砜，或溴乙酰胺，或碘乙酰胺，其与抗体的硫醇基团连接。在一些实施方案中，带有硫醇反应性基团的试剂由琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)或琥珀酰亚胺基-(ε-马来酰亚胺基)己酸酯产生，例如，硫醇反应性基团是马来酰亚胺基团。
在另一个实施方案中，m是0，并且AA包含可被细胞内肽酶如组织蛋白酶-B裂解的肽部分，优选二、三或四肽。组织蛋白酶-B可裂解的肽的实例是：Phe-Lys、Val-Cit(Dubowchick，2002)、Ala-Leu、Leu-Ala-Leu和Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：27)(Trouet等人,1982)。
在优选的实施方案中，L1包含细胞内可裂解的肽，例如组织蛋白酶-B可裂解的肽，其在肽的C-末端与可折叠单元对-氨基苄醇(或对-氨基-苄氧基羰基)连接，其苄醇部分又直接与氯甲酸酯形式的细胞毒性剂的羟基连接。在该实施方案中，n为0。或者，当n≠0时，对-酰胺基苄醇(或对-氨基-苄氧基羰基)部分的苄醇部分通过活化形式的对-酰胺基苄醇(即PNP为对-硝基苯基的PABOCOPNP)连接到在细胞毒性剂的羟基处连接的氨基酸或肽的N-末端。在优选的实施方案中，接头包含与抗体的硫醇基团连接的硫醇反应性基团。硫醇反应性基团任选地是马来酰亚胺或乙烯砜，或溴乙酰胺，或碘乙酰胺，其与抗体的硫醇基团连接。在优选的实施方案中，带有硫醇反应性基团的组分由琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)或琥珀酰亚胺基-(ε-马来酰亚胺基)己酸酯产生，例如，硫醇反应性基团是马来酰亚胺基团。
在优选的实施方案中，当细胞毒性剂是具有20-羟基的喜树碱或其类似物或衍生物时，L1包含细胞内可裂解的肽，例如组织蛋白酶-B可裂解的肽，其在肽的C-末端与可折叠的接头对-氨基苄醇(或对-氨基-苄氧基羰基)连接，其苄醇部分又直接与CPT-20-O-氯甲酸酯连接。在该实施方案中，n为0。或者，当n≠0时，对-酰氨基苄醇部分的苄醇部分通过活化形式的对-酰氨基苄醇(即PNP为对-硝基苯基的PABOCOPNP)连接到氨基酸或多肽的N-末端，所述氨基酸或多肽在CPT的20位连接。在优选的实施方案中，接头包含与抗体的硫醇基团连接的硫醇反应性基团。硫醇反应性基团任选地是马来酰亚胺或乙烯砜，或溴乙酰胺，或碘乙酰胺，其与抗体的硫醇基团连接。在优选的实施方案中，带有硫醇反应性基团的组分由琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)或琥珀酰亚胺基-(ε-马来酰亚胺基)己酸酯产生，例如，硫醇反应性基团是马来酰亚胺基团。
在另一个实施方案中，缀合物的L2组分含有聚乙二醇(PEG)间隔基，其大小可以高达MW 5000，并且在优选的实施方案中，PEG是具有(1-12或1-30)个重复单体单元的限定的PEG。在另一个优选的实施方案中，PEG是具有1-12个重复单体单元的限定的PEG。PEG的引入可以包括使用可商购的杂双官能化的PEG衍生物。在本公开的上下文中，杂双官能PEG含有叠氮化物或乙炔基团。含有8个重复单体单元的杂双官能限定的PEG的实例在以下式中给出，其中‘NHS’是琥珀酰亚胺基：
在优选的实施方案中，L3具有多个乙炔(或叠氮化物)基团，范围为2-40，但优选2-20，更优选2-5，以及单个抗体结合部分。
下面给出了一种代表性的缀合物，其中细胞毒性剂是用含有马来酰亚胺的SN-38-接头衍生物制备的SN-38(CPT类似物)，与表示为琥珀酰亚胺的抗体(命名为MAb)结合。这里，m＝0，并且与SN-38结合的20-O-AA酯是甘氨酸盐；L2和L3的叠氮化物-乙炔偶联连接产生如图所示的三唑部分。
在另一个代表性的缀合物(用含有马来酰亚胺的SN-38-接头衍生物制备)中，与表示为琥珀酰亚胺的抗体(MAb)结合，如下所示。这里，通式2中的n＝0；‘L1’包含连接到可折叠的对氨基苄醇部分的组织蛋白酶-B可裂解的二肽，并且前者在20位作为碳酸酯键连接到SN-38；连接‘L2’和‘L3’部分的叠氮化物-乙炔偶联连接产生如图所示的三唑部分。
下面给出了用含有马来酰亚胺的SN-38-接头衍生物制备的另一种代表性的SN-38缀合物Mab-CL2-SN-38，其与表示为琥珀酰亚胺的抗体结合。这里，与SN-38结合的20-O-AA酯是通过对氨基苄醇部分和组织蛋白酶-B可裂解的二肽与L1部分连接的甘氨酸盐；前者又通过酰胺键连接到‘L2’，而‘L2’和‘L3’部分通过叠氮化物-乙炔‘点击化学’偶联。
在下面给出的优选实施方案的另一个实例中，‘L1’含有与可折叠的对氨基苄醇部分连接的单个氨基酸，其中对氨基苄醇是取代的或未取代的(R)，其中在通式中m＝1和n＝0，并且细胞毒性剂用SN-38举例说明。该结构表示如下(称为MAb-CLX-SN-38)。AA的单个氨基酸可选自以下L-氨基酸中的任一种：丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸和缬氨酸。4-氨基苯甲醇部分上的取代基R是氢或选自C1-C10烷基的烷基。
MAb-CLX-SN-38(上文)的一个实施方案，其中单个氨基酸AA是L-赖氨酸并且R＝H，并且细胞毒性剂示例为SN-38(称为MAb-CL2A-SN-38)如下所示：
在其它实施方案中，细胞毒性剂连接于包含连接于氨基酸单元(AA)的延伸单元(Z)的接头，氨基酸单元(AA)连接于间隔基单元(Y)，其中延伸单元连接于抗体(Ab或MAb)，间隔基单元连接于细胞毒性剂的氨基。这样的接头具有下式：
Ab-Z-AA-Y-细胞毒性剂，
其中Z选自-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH2)n2-C(＝O)-、-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)n3-C(＝O)-、-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH2--(N-基-3-diminiccus)-或--C(＝O)--(CH2)n4-C(＝O)--，其中n2表示2至8的整数，n3表示1至8的整数，并且n4表示1至8的整数；cyc.Hex(1,4)表示1,4-亚环己基；和(N-基-3-diminiccus)-具有由下式表示的结构：
AA是2-7个氨基酸的肽。间隔基单元Y是-NH-(CH2)b-(C＝O)-或-NH-CH2-O-CH2-(C＝O)-，其中b是1-5的整数。
在一些实施方案中，细胞毒性剂是依沙替康。在一些实施方案中，氨基酸单元(AA)是-Gly-Gly-Phe-Gly-(SEQ ID NO:25)。在一些实施方案中，间隔基单元Y为-NH-CH2-O-CH2-(C＝O)-。
在一些实施方案中，所述接头-细胞毒性剂具有以下结构：
其中所释放的细胞毒性剂是DXd(参见美国专利号9,808,537)。
细胞毒性剂-接头与抗体或抗体结合部分的连接
通过接头将细胞毒性剂与抗体或其抗原结合部分连接的技术是本领域熟知的。参见，例如，Alley等人，Current Opinion in Chemical Biology 2010 14:1-9；Senter,Cancer J.,2008,14(3):154-169。在一些实施方案中，首先将接头连接于细胞毒性剂，然后将接头-细胞毒性剂连接于抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，首先将接头连接于抗体或其抗原结合部分，然后将细胞毒性剂连接于接头。在以下讨论中，术语接头-细胞毒性剂用于举例说明接头或接头-细胞毒性剂与抗体或其抗原结合部分的连接；本领域技术人员将理解，可以根据接头和细胞毒性剂来选择所选择的连接方法。在一些实施方案中，细胞毒性剂以降低其活性直至其从缀合物释放的方式(例如通过水解，通过蛋白水解降解或通过裂解剂)通过接头连接于抗体或其抗原结合部分上。
通常，可以采用本领域技术人员已知的有机化学反应，条件和试剂通过几种途径来制备缀合物，包括：(1)使抗体或其抗原结合部分的亲核基团与二价接头试剂反应以经由共价键形成抗体-接头中间体，随后与细胞毒性剂反应；以及(2)使细胞毒性剂的亲核基团与二价接头试剂反应，以经由共价键形成接头-细胞毒性剂，随后与抗体或其抗原结合部分的亲核基团反应。用于通过后一途径制备缀合物的示例性方法描述于美国专利7,498,298中，其通过引用明确地并入本文。
抗体上的亲核基团包括但不限于：(i)N-末端胺基，(ii)侧链胺基，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸，和(iv)糖羟基或氨基，其中抗体被糖基化。胺、硫醇和羟基是亲核的并且能够与接头部分和接头试剂上的亲电基团反应以形成共价键，所述亲电基团包括：(i)活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酰基卤；(ii)烷基和苄基卤化物，例如卤代乙酰胺；和(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫化物，即半胱氨酸桥。抗体可通过用还原剂如DTT(二硫苏糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)处理，而使抗体完全或部分还原，从而被制成反应性的以与接头试剂发生缀合。因此，理论上，每个半胱氨酸桥将形成两个反应性硫醇亲核体。另外的亲核基团可以通过赖氨酸残基的修饰引入抗体，例如通过赖氨酸残基与2-亚氨基噻吩(Traut’s试剂)反应，导致胺转化为硫醇。反应性硫醇基也可以通过引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基(例如，通过制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的变体抗体)而引入抗体中。
本公开的缀合物还可以通过抗体上的亲电基团(例如醛或酮羰基)与接头试剂或药物上的亲核基团之间的反应来产生。接头试剂上有用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、氨基硫脲、肼甲酸苄酯和芳酰肼。在一个实施方案中，修饰抗体以引入能够与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电部分。在另一个实施方案中，糖基化抗体的糖可以被氧化，例如用高碘酸盐氧化试剂氧化，以形成醛基或酮基，其可以与接头试剂或药物部分的胺基反应。所得亚胺席夫碱基团可以形成稳定的键，或者可以被还原，例如通过硼氢化物试剂形成稳定的胺键。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可以在抗体或其抗原结合部分中产生羰基(醛和酮)基团，其可以与药物上的适当基团反应(参见，例如，Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一个实施方案中，含有N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的抗体可以与偏高碘酸钠反应，导致产生醛来代替第一个氨基酸(Geoghegan&Stroh,(1992)Bioconjugate Chem.3:138-146；US 5362852)。这种醛可以与细胞毒性剂或接头反应。
细胞毒性剂上的示例性亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、氨基硫脲、肼甲酸苄酯和芳酰肼基团，其能够与接头部分和接头试剂上的亲电基团反应以形成共价键，所述亲电基团包括：(i)活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酰基卤；(ii)烷基和苄基卤化物，例如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。
可用于制备缀合物的非限制性示例性交联剂试剂在本文中描述或为本领域技术人员所知。使用这种交联剂试剂连接两个部分(包括蛋白质部分和化学部分)的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，包含抗体和细胞毒性剂的融合蛋白可例如通过重组技术或肽合成来制备。重组DNA分子可以包含编码缀合物的抗体和细胞毒性部分的区域，所述抗体和细胞毒性部分彼此相邻或被编码接头肽的区域隔开，所述接头肽不破坏缀合物的所需特性。
在另一个实施方案中，抗体可以缀合到“受体”(例如链霉抗生物素)以用于肿瘤预靶向，其中抗体-受体缀合物施用于患者，随后使用清除剂从循环中除去未结合的缀合物，然后施用缀合到细胞毒性剂(例如药物或放射性核苷酸)的“配体”(例如抗生物素蛋白)。
在一些实施方案中，接头细胞毒性剂连接于抗体或其抗原结合片段的链间半胱氨酸残基。参见，例如，PCT公开号WO2004/010957和WO2005/081711。在这样的实施方案中，接头通常包含马来酰亚胺基团，用于连接链间二硫化物的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，接头或接头细胞毒性剂与抗体或其抗原结合部分的半胱氨酸残基连接，如美国专利号7,585,491或8,080250中所述。所得缀合物的药物载量通常为1至8。
在一些实施方案中，接头或接头-细胞毒性剂连接于抗体或其抗原结合部分的赖氨酸或半胱氨酸残基，如PCT公开号WO2005/037992或WO2010/141566中所述。所得缀合物的药物载量通常为1至8。
在一些实施方案中，工程改造的半胱氨酸残基、聚组氨酸序列、糖工程标签或转谷氨酰胺酶识别序列可用于接头或接头-细胞毒性剂与抗体或其抗原结合部分的位点特异性连接。
在一些实施方案中，接头细胞毒性剂与除链间二硫化物以外的Fc区残基处的工程改造的半胱氨酸残基连接。在一些实施方案中，接头细胞毒性剂(一种或多种)连接到工程改造的半胱氨酸上，所述工程改造的半胱氨酸在重链的位置118、221、224、227、228、230、231、223、233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、249、250、258、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、275、276、278、280、281、283、285、286、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、302、305、313、318、323、324、325、327、328、329、330、331、332、333、335、336、396和/或428处，和/或轻链的位置106、108、142(轻链)、149(轻链)和/或位置V205处，被引入IgG(通常为IgG1)中，所有位置根据Kabat的EU编号。使用工程改造的半胱氨酸的位点特异性缀合的示例性取代是S239C(参见，例如，美国专利公开号2010/0158909；Fc区的编号根据EU索引)。
在一些实施方案中，如PCT公开号WO2006/034488、WO2011/156328和/或WO2016/040856中所述，接头或接头-细胞毒性剂与抗体或其抗原结合部分的一个或多个引入的半胱氨酸残基连接。
在一些实施方案中，使用细菌转谷氨酰胺酶的位点特异性缀合的示例性取代是Fc区的N297S或N297Q。在一些实施方案中，接头或接头-细胞毒性剂连接于抗体或抗原结合部分或糖基改造的抗体或其抗原结合部分的聚糖或修饰的聚糖。参见，例如，PCT公开号WO2017/147542、WO2020123425、WO2014/072482；WO2014//065661、WO2015/057066和WO2016/022027。
III.药物制剂
抗-GPC3抗体及其抗原结合部分或其它结合剂的其它方面涉及包含活性成分(即，包括本文所述的抗-GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂或其缀合物或本文所述的编码抗体或其抗原结合部分或其它结合剂的核酸)的组合物。在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物。如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂与被接受用于制药工业的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合。本文所用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
含有溶解或分散于其中的活性成分的药物组合物的制备在本领域中是充分理解的，并且不需要基于任何特定的制剂来限制。典型地，这种组合物被制备为可注射的液体溶液或悬浮液；然而，也可以制备适于在使用前在液体中再水合的固体形式，或悬浮液。制剂也可以被乳化或作为脂质体组合物提供。抗-GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂或其缀合物可以与药学上可接受的且与活性成分相容的赋形剂混合，并且其量适合用于本文所述的治疗方法。合适的赋形剂是，例如，水，盐水，右旋糖，甘油，乙醇等及其组合。此外，如果需要，药物组合物可以含有少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等，其增强或维持活性成分(例如，抗GPC3抗体或其抗原结合部分)的有效性。如本文所述的药物组合物可以包括其中的组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与无机酸或有机酸形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基形成)，所述无机酸例如盐酸或磷酸，所述有机酸例如乙酸，酒石酸，扁桃酸等。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱(例如氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，氢氧化钙或氢氧化铁)以及有机碱，例如异丙胺，三甲胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等。生理学上可耐受的载体是本领域熟知的。示例性的液体载体是无菌水溶液，其含有活性成分(例如，抗GPC3抗体和/或其抗原结合部分或其缀合物)和水，并且可以含有缓冲液，例如生理pH值的磷酸钠，生理盐水或两者，例如磷酸盐缓冲盐水。此外，水性载体可以含有一种以上的缓冲盐，以及盐，例如氯化钠和氯化钾，右旋糖，聚乙二醇和其它溶质。除了水之外，液体组合物还可以包含液相。这种另外的液相的实例是甘油，植物油如棉籽油和水-油乳液。有效治疗特定病症或病状的活性剂的量将取决于病症或病状的性质，并且可以通过标准临床技术来确定。
本文所述的药物组合物可配制用于口服、局部、透皮、吸入、肠胃外、舌下、口腔、直肠、阴道和鼻内施用。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、胸骨内和肿瘤内注射或输注技术。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物配制成单剂量单位或包含多个剂量单位的形式。制备此类剂型的方法是本领域技术人员已知的或将是显而易见的；例如，参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第20版(Philadelphia College ofPharmacy and Science,2000)。
在一些实施方案中，包含如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其缀合物或如本文所述的编码抗GPC3抗体或其抗原结合部分的核酸的药物组合物可以是冻干物。
在一些实施方案中，提供了包含治疗有效量的本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其缀合物或药物组合物的注射器。IV.抗GPC3抗体、其抗原结合部分、结合剂和缀合物的治疗用途
在一些方面，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分、结合剂和缀合物可用于包括向有需要的受试者施用如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂或缀合物的方法中。在一些实施方案中，抗GPC3抗体或其抗原结合部分包含(i)具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗GPC3抗体或其抗原结合部分包含：(i)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链和轻链可变框架区任选地用框架区中的1-8个、1-6个、1-4或1-2个保守氨基酸取代修饰，其中重链或轻链可变区的CDR未被修饰。在一些实施方案中，所述抗GPC3抗体或其抗原结合部分包含：(i)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述重链和轻链可变框架区任选地用框架区中的1-8个、1-6个、1-4个或1-2个氨基酸取代、缺失或插入修饰，其中重链或轻链可变区的CDR未被修饰。GPC3缀合物包含任何这些实施方案的抗体或抗原结合部分。
在一些实施方案中，受试者需要治疗癌症和/或恶性肿瘤。在一些实施方案中，受试者需要治疗GPC3+癌症或GPC3+恶性肿瘤，例如肝细胞癌、肺癌如小细胞肺癌和大细胞肺癌、结肠直肠癌、食道癌、宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、肾细胞癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、黑色素瘤、生殖细胞癌(例如，睾丸)、胃癌、肉瘤和膀胱癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗患有GPC3+癌症或恶性肿瘤的受试者。在一些实施方案中，所述方法用于治疗受试者的肝细胞癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗受试者的肺癌，例如小细胞肺癌和大细胞肺癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗受试者的结肠直肠癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗受试者的食道癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗受试者的宫颈癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗受试者的头颈癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗受试者的卵巢癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗受试者的肾细胞癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗受试者的乳腺癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗受试者的三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗受试者的黑色素瘤。在一些实施方案中，所述方法用于治疗受试者中的生殖细胞癌症。在一些实施方案中，所述方法用于治疗受试者的肉瘤。在一些实施方案中，所述方法用于治疗胃癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗受试者的膀胱癌。
本文所述的方法包括向患有GPC3+癌症或恶性肿瘤的受试者施用治疗有效量的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂或缀合物。如本文所用，短语“治疗有效量”、“有效量”或“有效剂量”是指如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂或缀合物在治疗、控制或预防癌症或恶性肿瘤的复发方面提供治疗益处的量，例如在肿瘤或恶性肿瘤的至少一种症状、迹象或标记中提供统计学显著降低的量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。通常，治疗有效量可随受试者的病史、年龄、病状、性别以及受试者的医学病状的严重程度和类型以及其它药物活性剂的施用而变化。
术语“癌症”和“恶性肿瘤”是指干扰身体器官和系统的正常功能的细胞的不受控制的生长。癌症或恶性肿瘤可以是原发的或转移的，即它已经变成侵入性的，在远离原始肿瘤部位的组织中播种了肿瘤生长。“肿瘤”是指干扰身体器官和系统的正常功能的细胞的不受控制的生长。患有癌症的受试者是具有存在于受试者体内的可客观测量的癌细胞的受试者。在该定义中包括良性肿瘤和恶性癌症，以及潜在的休眠肿瘤和微转移。从它们的原始位置迁移并播种其它重要器官的癌症最终可以通过受影响器官的功能退化而导致受试者的死亡。血液恶性肿瘤(造血癌症)，例如白血病和淋巴瘤，能够例如使受试者中的正常造血区失去竞争力，从而导致造血衰竭(以贫血，血小板减少症和中性粒细胞减少症的形式)，最终导致死亡。
癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这样的癌症的更具体的实例包括但不限于基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、腹膜癌、宫颈癌；胆管癌、绒毛膜癌、软骨肉瘤、结肠癌和直肠癌(结肠直肠癌)、结缔组织癌、消化系统癌症、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌(包括胃肠癌和胃癌)、成胶质细胞瘤(GBM)、肝癌(hepatic carcinoma)、肝细胞癌(hepatoma)、上皮内赘生物、肾脏癌或肾癌(例如，透明细胞癌)、喉癌、白血病、肝癌、肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、黑色素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌(例如，唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、呼吸系统癌症、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、子宫严重癌、泌尿系统癌症、外阴癌；以及其它癌和肉瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级免疫母细胞NHL、高级淋巴母细胞NHL、高级小非裂解细胞NHL、庞大疾病NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病、慢性成髓细胞白血病和移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)，以及与母斑病相关的异常血管增殖、水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)和梅格斯综合征。
在一些实施方案中，所述癌选自实体瘤，包括但不限于肝细胞癌、肺癌如小细胞肺癌和大细胞肺癌、结肠直肠癌、食道癌、宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、肾细胞癌和膀胱癌。
在一些实施方案中，癌症或恶性肿瘤是GPC3阳性(GPC3+)。如本文所用，术语“GPC3-阳性”或“GPC3+”用于描述癌细胞、癌细胞簇、肿瘤块或在细胞表面上表达GPC3(膜结合的GPC3)的转移细胞。GPC3阳性癌症的一些非限制性实例包括肝细胞癌、肺癌(例如小细胞肺癌和大细胞肺癌)、结肠直肠癌、食道癌、宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、肾细胞癌、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、黑色素瘤、生殖细胞癌(例如睾丸)、胃癌、肉瘤和膀胱癌。
预期本文的方法减小受试者中的肿瘤大小或肿瘤负荷，和/或减少受试者中的转移。在各种实施方案中，受试者中的肿瘤大小降低约25-50％、约40-70％或约50-90％或更多。在各种实施方案中，所述方法将肿瘤大小减小10％、20％、30％或更多。在各种实施方案中，所述方法将肿瘤大小减小10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
如本文所用，“受试者”是指人或动物。通常，所述动物是脊椎动物，例如灵长类、啮齿类、家畜或猎物。灵长类包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿类包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔和仓鼠。家畜和猎物包括牛、马、猪、鹿、北美野牛、水牛，猫科动物，例如家猫，犬科动物，例如狗、狐、狼，鸟类，例如鸡，猴、鸵鸟，以及鱼，例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类，例如人。术语“患者”、“个体”和“受试者”在本文中可互换使用。
优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可有利地用作例如代表例如各种癌症的动物模型的受试者。此外，本文所述的方法可用于治疗家养的动物和/或宠物。受试者可以是男性或女性。在某些实施方案中，受试者是人。
受试者可以是先前已经被诊断患有或被鉴定患有GPC3+癌症并且需要治疗，但不需要已经经历GPC3+癌症的治疗的受试者。或者，受试者也可以是先前未被诊断为具有需要治疗的GPC3+癌症的受试者。受试者可以是表现出与GPC3+癌症有关的病状或一种或多种并发症的一种或多种风险因素的受试者或不表现出风险因素的受试者。治疗GPC3+癌症的“需要的受试者”可以是患有该病状或被诊断为患有该病状的受试者。在其它实施方案中，“处于发展病状的风险中”的受试者是指被诊断为处于发展该病状(例如GPC3+癌症)的风险中的受试者。
本文所用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“改善”当用于涉及疾病、病症或医学病状时，是指对病状的治疗性处理，其中所述目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止症状或病状的进展或严重程度。术语“治疗”包括减弱或减轻病状的至少一种副作用或症状。如果一种或多种症状或临床标记减弱，治疗通常是“有效的”。或者，如果病状的进展减弱或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标记的改善，而且包括停止或至少减缓在没有治疗的情况下预期的症状的进展或恶化。有益的或期望的临床结果包括但不限于受试者中GPC3+癌细胞的减少，一种或多种症状的减轻，缺陷程度的减少，癌症或恶性肿瘤的稳定(即不恶化)状态，肿瘤生长和/或转移的延迟或减缓，以及与没有治疗的情况下所预期的相比增加的寿命。如本文所用，术语“施用”是指通过导致GPC3结合抗体或其抗原结合部分或其它结合剂或缀合物与GPC3+癌细胞或恶性细胞结合的方法或途径向受试者提供本文所述的GPC3结合抗体或其抗原结合部分或其它结合剂或缀合物或本文所述的编码抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂的核酸。类似地，包含本文所述的GPC3结合抗体或其抗原结合部分或其它结合剂或缀合物或本文所公开的编码本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂的核酸的药物组合物可以通过任何合适的途径施用，所述途径导致受试者的有效治疗。
抗GPC3抗体或其抗原结合部分或结合剂或缀合物的剂量范围取决于效力，并且包括足够大以产生所需效果的量，所述所需效果例如肿瘤生长减慢或肿瘤大小减小。剂量不应大到引起不可接受的不良副作用。通常，剂量将随受试者的年龄、病状和性别而变化，并且可以由本领域技术人员确定。在任何并发症的情况下，剂量也可以由单独的医师调节。在一些实施方案中，剂量范围为0.1mg/kg体重至10mg/kg体重。在一些实施方案中，剂量范围为0.5mg/kg体重至15mg/kg体重。在一些实施方案中，剂量范围为0.5mg/kg体重至5mg/kg体重。或者，可滴定剂量范围以将血清水平维持在1μg/mL至1000μg/mL。对于全身性施用，可向受试者施用治疗量，例如0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、12mg/kg或更多。
可以重复上述剂量的施用。在优选的实施方案中，上述剂量每周，每两周，每三周或每月施用，持续几周或几个月。治疗的持续时间取决于受试者的临床进展和对治疗的响应。
在一些实施方案中，剂量可以是约0.1mg/kg至约100mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约0.1mg/kg至约25mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约0.1mg/kg至约20mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约0.1mg/kg至约15mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约0.1mg/kg至约12mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约1mg/kg至约100mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约1mg/kg至约25mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约1mg/kg至约20mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约1mg/kg至约15mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约1mg/kg至约12mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约2mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约4mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约5mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约6mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约8mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约10mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约10mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约12mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约100mg/m2至约700mg/m2。在一些实施方案中，剂量可以是约250mg/m2。在一些实施方案中，剂量可以是约375mg/m2。在一些实施方案中，剂量可以是约400mg/m2。在一些实施方案中，剂量可以是约500mg/m2。
在一些实施方案中，可以静脉内施用剂量。在一些实施方案中，静脉内施用可以是在约10分钟至约4小时的时间段内发生的输注。在一些实施方案中，静脉内施用可以是在约30分钟至约90分钟的时间段内发生的输注。
在一些实施方案中，可以每周施用一次剂量。在一些实施方案中，可以每两周施用一次剂量。在一些实施方案中，可以约每2周施用一次剂量。在一些实施方案中，可以约每3周施用一次剂量。在一些实施方案中，可以每三周施用一次剂量。在一些实施方案中，可以每四周施用一次剂量。
在一些实施方案中，将总共约2至约10个剂量施用于受试者。在一些实施方案中，总共施用4个剂量。在一些实施方案中，总共施用5个剂量。在一些实施方案中，施用总共6个剂量。在一些实施方案中，施用总共7个剂量。在一些实施方案中，施用总共8个剂量。在一些实施方案中，施用总共9个剂量。在一些实施方案中，施用总共10个剂量。在一些实施方案中，施用总共多于10个剂量。
含有抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它GPC3结合剂或GPC3缀合物的药物组合物可以单位剂量施用。当涉及药物组合物使用时，术语“单位剂量”是指适于作为受试者的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有预定量的活性物质(例如，抗-GPC3抗体或其抗原结合部分或缀合物)，其经计算与所需生理学上可接受的稀释剂(即，载体或媒介物)结合产生所需的治疗效果。
在一些实施方案中，抗GPC3抗体或其抗原结合部分或缀合物，或任何这些的药物组合物与免疫疗法一起施用。本文所用的“免疫疗法”是指设计用于诱导或增强受试者自身免疫系统以对抗癌症或恶性肿瘤的治疗策略。免疫疗法的实例包括但不限于抗体如检查点抑制剂。
在一些实施方案中，免疫疗法包括施用免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂选自CTLA-4、PD-1、PD-L1、PL-L2、B7-H3、B7-H4、BMA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2和A2AR的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括抑制CTLA-4、PD-1、PD-L1等的药剂。合适的抗CTLA-4治疗剂，包括例如抗CTLA-4抗体、人抗CTLA-4抗体、小鼠抗CTLA-4抗体、哺乳动物抗CTLA-4抗体、人源化抗CTLA-4抗体、单克隆抗CTLA-4抗体、多克隆抗CTLA-4抗体、嵌合抗CTLA-4抗体、伊匹单抗、曲美木单抗、抗CTLA-4adnectin、抗CTLA-4结构域抗体、单链抗CTLA-4mAb、重链抗CTLA-4mAb、轻链抗CTLA-4mAb、激动共刺激途径的CTLA-4抑制剂、PCT公开号WO2004/035607中公开的抗体、美国公开号2005/0201994中公开的抗体、和授权的欧洲专利号EP1212422B1中公开的抗体。另外的抗CTLA-4抗体描述于美国专利号5,811,097、5,855,887、6,051,227和6,984,720中；PCT公开号WO 01/14424和WO 00/37504中；以及美国公开号2002/0039581和2002/086014中。可用于本公开的方法的其它抗CTLA-4抗体包括，例如，以下公开的那些：PCT公开号WO 98/42752；美国专利号6,682,736和6,207,156；Hurwitz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95(17):10067-10071(1998)；Camacho等人,J.Clin.Oncology,22(145):Abstract No.2505(2004)(抗体CP-675206)；Mokyr等人,Cancer Res,58:5301-5304(1998),美国专利号5,977,318、6,682,736、7,109,003和7,132,281。
合适的抗PD-1和抗PD-L1治疗剂包括，例如，抗PD-1和抗PD-L1抗体、人抗PD-1和抗PD-L1抗体、小鼠抗PD-1和抗PD-L1抗体、哺乳动物抗PD-1和抗PD-L1抗体、人源化抗PD-1和抗PD-L1抗体、单克隆抗PD-1和抗PD-L1抗体、多克隆抗PD-1和抗PD-L1抗体、嵌合抗PD-1和抗PD-L1抗体、抗PD-1adnectin和抗PD-L1adnectin、抗PD-1结构域抗体和抗PD-L1结构域抗体、单链抗PD-1mAb和单链抗PD-L1 mAb；重链抗PD-1mAb和重链抗PD-L1 mAb、轻链抗PD-1mAb和轻链抗PD-L1 mAb。在具体的实施方案中，抗PD-1治疗剂包括尼伐单抗、派姆单抗、pidilizumab、MEDI0680及其组合。在其它具体的实施方案中，抗PD-L1治疗剂包括阿特珠单抗、阿维鲁单抗(avelumab)、BMS-936559、德瓦鲁单抗(MEDI4736)、MSB0010718C及其组合。
合适的抗PD-1和抗PD-L1抗体也描述于Topalian等人,Immune CheckpointBlockade:A Common Denominator Approach to Cancer Therapy,Cancer Cell 27:450-61(2015年4月13日)，通过引用将其全文并入本文。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是伊匹单抗(Yervoy)、Nivomab(Opdivo)、派姆单抗(Keytruda)、阿特珠单抗(Tecentriq)、阿维鲁单抗(Bavencio)或德瓦鲁单抗(Imfinzi)。
在一些实施方案中，提供了改善接受免疫疗法的受试者的治疗结果的方法。所述方法通常包括向患有癌症的受试者施用有效量的免疫疗法；以及向所述受试者施用治疗有效量的GPC3结合剂或缀合物或其药物组合物，其中所述结合剂或缀合物特异性结合GPC3+癌细胞；其中与单独施用免疫疗法相比，受试者的治疗结果得到改善。在一些实施方案中，结合剂或其缀合物包含(i)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链和轻链框架区任选地用框架区中的1-8个氨基酸取代、缺失或插入修饰。在一些实施方案中，结合剂或其缀合物包含(i)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中结合剂特异性结合GPC3+癌细胞。在一些实施方案中，结合剂是抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，结合剂是单克隆抗体，Fab、Fab’、F(ab’)、Fv、二硫键连接的Fc、scFv、单结构域抗体、双抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施方案中，结合剂是抗-GPC3单克隆抗体、Fab、Fab’、F(ab’)、Fv、二硫键连接的Fc、scFv、单结构域抗体、双抗体、双特异性抗体或多特异性抗体的缀合物。
在一些实施方案中，改善的治疗结果是选自稳定疾病、部分反应或完全反应的客观反应，如通过所治疗的癌症的标准医学标准所确定的。在一些实施方案中，改善的治疗结果是减少的肿瘤负荷。在一些实施方案中，改善的治疗结果是无进展生存或无疾病生存。
本公开的实施方案的描述并非旨在穷举或将本公开限制于所公开的精确形式。虽然本文出于说明目的描述了本公开的具体实施方案和实施例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开的范围内，各种等同的修改是可能的。本文提供的本公开的教导可适用于其它程序或方法(如适用)。本文所描述的各种实施方案可经组合以提供其它实施方案。如果需要，可以修改本公开的方面，以采用上述参照文献和申请的组成，功能和概念来提供本公开的其它实施方案。根据详细描述，可以对本公开进行这些和其它改变。
任何前述实施方案的特定要素可组合或替代其它实施方案中的要素。此外，虽然已经在这些实施方案的上下文中描述了与本公开的某些实施方案相关联的优点，但是其他实施方案也可以呈现这些优点，并且不是所有实施方案都必须呈现落入本公开的范围内的这些优点。
为了描述和公开例如在可能结合本公开使用的这类出版物中描述的方法，在此明确地通过引用并入所标识的所有专利和其它出版物。在本申请的申请日之前，这些出版物仅用于它们的公开。在这一点上，不应将任何东西解释为承认本发明人不具有借助于先前发明或出于任何其它原因而先于这样的公开的权利。关于这些文件的内容的日期或表示的所有声明都是基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何认可。
通过以下不应被解释为限制的实施方案进一步说明本公开。
1.缀合物，其包含：
结合剂，其包含(i)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)，和(ii)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)，其中重链和轻链框架区任选地用所述框架区中的1-8个氨基酸取代、缺失或插入进行修饰，其中所述结合剂特异性结合人GPC3；
与所述结合剂连接的至少一种接头；和
与每个接头连接的至少一种细胞毒性剂。
2.如实施方案1所述的缀合物，其中所述结合剂包含：(i)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区。
3.缀合物，其包含：
包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的结合剂，其中所述VH区包含具有SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列的互补决定区HCDR1序列，具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的HCDR2序列和具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的HCDR3，其各自位于重链框架区内；并且其中所述VL区包含具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的LCDR1序列，具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的LCDR3，其各自位于轻链框架区内；
与所述结合剂连接的至少一种接头；和
与每个接头连接的至少一种细胞毒性剂。
4.如实施方案3所述的缀合物，其中所述框架区是鼠框架区。
5.如实施方案3所述的结合物，其中所述框架区是人框架区。
6.如实施方案1-5中任一项所述的缀合物，其中所述结合剂是抗体或其抗原结合部分。
7.如实施方案6所述的缀合物，其中所述结合剂是单克隆抗体、Fab、Fab’、F(ab’)、Fv、二硫键连接的Fc、scFv、单结构域抗体、双抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
8.如前述实施方案中任一项所述的缀合物，其中所述重链可变区还包含重链恒定区。
9.如实施方案8所述的缀合物，其中重链恒定区是IgG同种型。
10.如实施方案9所述的缀合物，其中重链恒定区是IgG1恒定区。
11.如实施方案10所述的缀合物，其中所述IgG1重链恒定区具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:32的116-445位所示的氨基酸序列。
12.如实施方案9所述的缀合物，其中所述重链恒定区是IgG4恒定区。
13.如实施方案10或11所述的缀合物，其中所述重链可变区和恒定区具有SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列。
14.如前述实施方案中任一项所述的缀合物，其中所述轻链可变区还包含轻链恒定区。
15.如实施方案14所述的缀合物，其中所述轻链恒定区是κ同种型。
16.如实施方案15所述的缀合物，其中所述κ轻链恒定区具有SEQ ID NO:4的113-219位所示的氨基酸序列。
17.如实施方案15或16所述的缀合物，其中所述轻链可变区和恒定区具有SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列。
18.如实施方案1-17中任一项所述的缀合物，其中所述接头通过链间二硫化物残基、工程改造的半胱氨酸、聚糖或修饰的聚糖、所述结合剂的N-末端残基或与所述结合剂连接的聚组氨酸残基与所述结合剂连接。
19.如实施方案1至18中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物的平均药物负荷为约1至约8、约2、约4、约6、约8、约10、约12、约14、约16、约3至约5、约6至约8或约8至约16。
20.如前述实施方案中任一项所述的缀合物，其中所述结合剂是单特异性的。
21.如实施方案1-20中任一项所述的缀合物，其中所述结合剂是二价的。
22.如实施方案1-19中任一项所述的缀合物，其中所述结合剂包含第二结合结构域，并且所述结合剂是双特异性的。
23.如前述实施方案中任一项所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂选自奥瑞他汀、喜树碱、多卡霉素、蒽环霉素和加利车霉素。
24.如实施方案23所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是奥瑞他汀。
25.如实施方案24所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是MMAE。
26.如实施方案23所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是喜树碱。
27.如实施方案26所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是依沙替康。
28.如实施方案23所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是加利车霉素。
29.如实施方案28所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是SN-38。
30.如前述实施方案中任一项所述的缀合物，其中所述接头选自mc-VC-PAB、CL2、CL2A和(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH2)n2-C(＝O)-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-CH2-O-CH2-(C＝O)-，其中n2代表2-8的整数。
31.如实施方案30所述的缀合物，其中所述接头是mc-VC-PAB。
32.如实施方案31所述的缀合物，其中所述接头与MMAE的至少一个分子连接。
33.如实施方案30所述的缀合物，其中所述接头是CL2A。
34.如实施方案33所述的缀合物，其中所述接头与SN-38的至少一个分子连接。
35.如实施方案30所述的缀合物，其中所述接头是CL2。
36.如实施方案35所述的缀合物，其中所述接头与SN-38的至少一个分子连接。
37.如实施方案30所述的缀合物，其中所述接头是(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH2)n2-C(＝O)-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-CH2-O-CH2-(C＝O)-，其中n2代表2-8的整数。
38.如实施方案37所述的缀合物，其中所述接头与依沙替康的至少一个分子连接。
39.药物组合物，其包含前述实施方案中任一项所述的缀合物和药学上可接受的载体。
40.核酸，其编码实施方案1-22中任一项所述的结合剂。
41.载体，其包含实施方案40所述的核酸。
42.细胞系，其包含实施方案40所述的核酸。
43.治疗GPC3+癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的实施方案1-38中任一项所述的缀合物或实施方案39所述的药物组合物。
44.如实施方案43所述的方法，其中所述GPC3+癌症是癌或恶性肿瘤。
45.如实施方案44所述的方法，其中所述GPC3+癌症选自肝细胞癌、肺癌如小细胞肺癌和大细胞肺癌、结肠直肠癌、食道癌、宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、肾细胞癌、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、黑色素瘤、生殖细胞癌(例如睾丸)、胃癌、肉瘤和膀胱癌。
46.如实施方案43-45中任一项所述的方法，还包括对所述受试者施用免疫疗法。
47.如实施方案46所述的方法，其中所述免疫疗法包括免疫检查点抑制剂。
48.如实施方案47所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自特异性结合人PD-1、人PD-L1或人CTLA4的抗体。
49.如实施方案48所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是派姆单抗、纳武单抗、cemiplimab或伊匹单抗。
50.如实施方案43-49中任一项所述的方法，还包括对所述受试者施用化学疗法。
51.如实施方案43-50中任一项所述的方法，其中所述缀合物经静脉内施用。
52.如实施方案43-51中任一项所述的方法，其中所述缀合物以约0.1mg/kg至约10mg/kg或约0.1mg/kg至约12mg/kg的剂量施用。
53.改善接受了针对GPC3+癌症的免疫疗法和/或化学疗法的受试者中的治疗结果的方法，其包括：
向患有癌症的受试者施用有效量的免疫疗法或化学疗法；和
向所述受试者施用治疗有效量的实施方案1-38中任一项所述的缀合物或实施方案39所述的药物组合物；
其中与单独施用免疫疗法或化学疗法相比，所述受试者的治疗结果得到改善。
54.如实施方案53所述的方法，其中改善的治疗结果是选自稳定疾病、部分反应或完全反应的客观反应。
55.如实施方案53所述的方法，其中改善的治疗结果是减少的肿瘤负荷。
56.如实施方案53所述的方法，其中改善的治疗结果是无进展生存或无疾病生存。
57.如实施方案53-56中任一项所述的方法，其中所述免疫疗法是免疫检查点抑制剂。
58.如实施方案57所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包括特异性结合人PD-1、人PD-L1或CTLA4的抗体。
59.如实施方案58所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是派姆单抗、纳武单抗、cemiplimab或伊匹单抗。
60.如实施方案53至59中任一项所述的方法，其中所述缀合物经静脉内施用。
61.如实施方案53-60中任一项所述的方法，其中所述缀合物以约0.1mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。
62.实施方案1-38中任一项所述的缀合物或实施方案39所述的药物组合物用于治疗受试者的GPC3+癌症的用途。
63.实施方案1-38中任一项所述的缀合物或实施方案39所述的药物组合物用于治疗接受了免疫疗法或化学疗法的受试者中的GPC3+癌症的用途。
实施例
方法和材料
在以下实施例中使用以下方法和材料。
细胞培养-肝癌细胞系(HepG2、HepG2-C3A、Hep3B、JHH5、JHH7、Huh7、PLC/PRF/5、SNU398和SNU182)和肺癌细胞系(NCI-H446、NCI-H661、NCI-H524、DMS153、DMS53；NCI-H2029、NCI-H1048、NCI-H1092和NCI-H1975)获自ATCC(Manassas,VA)并根据供应商的说明维持培养。
流式细胞术-用PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH7.4)冲洗细胞并用Versene(ThermoFisher)收获，然后用含有测试抗体或ADC的FACs缓冲液(PBS+1％ FBS(FBS；来源BioSun))在4℃下孵育1小时。冲洗细胞并用FACs缓冲液洗涤，并用抗-hIgG-AF488进行检测。在FACsCanto II(BD Biosciences)上分析细胞。用DAKO QifiKit(DAKO,Carpinteria,CA)进行定量FACs(qFACs)以根据制造商的说明测量抗原结合位点的数目。
药物缀合物的制备-ARD103-vcMMAE(ARD103-mc-vc-PAB-MMAE)和参照mAb-vcMMAE(参照mAb-mc-vc-PAB-MMAE)通过在室温下在pH 7.4的硼酸钠缓冲液中的随机缀合来制备。(参照抗体具有PCT公开号WO2006046751的SEQ ID NO:87和121所示的重链可变区和轻链可变区序列，其分别连接于人IgG1和κ恒定区)。简言之，ARD103(重链＝SEQ ID NO:3；轻链＝SEQ ID NO:4)或参照抗体用TCEP(tris,2-羧乙基膦)还原，然后用药物接头mc-vc-PAB-MMAE以10:1的有效载荷：抗体比率孵育。通过透析除去过量的药物接头。尺寸排阻HPLC证实缀合物纯度(99％单体，<1％聚集体)。通过LC-MS评估的药物负荷平均为4。ARD103-vcMMAE的代表性结构如下所示。
ARD103-SN38(ARD103-CL2A-SN38)、ARD103-CL2-SN38、对照ADC(hIgG-CL2-SN38、hIgG-CL2A-SN38)和参照mAb-SN38(参照mAb-CL2A-SN38)在室温下在pH7.4的PBS缓冲液中制备。简言之，ARD103或参照抗体在与药物接头CL2A-SN38或CL2-SN38(MedChem Express)以10:1的比率孵育之前用TCEP还原。用N-乙基马来酰亚胺终止反应。通过透析除去过量的药物接头。尺寸排阻HPLC证实缀合物纯度(99％单体，1％聚集体)。通过LC-MS评估的药物负荷平均为8。ARD103-SN38(ARD103-CL2A-SN38)的代表性结构如下所示。
ARD103-CL2-SN38的代表性结构如下所示。
ARD103-Dxd(ARD103-MC-GGFG-Dxd)和对照ADC(hIgG-Dxd)在室温下在pH7.4的PBS缓冲液中制备。简言之，ARD103或参照抗体在与药物接头MC-GGFG-Dxd(也称为Dxd)以10:1的比率孵育之前用TCEP还原。用N-乙基马来酰亚胺终止反应。通过透析除去过量的药物接头。尺寸排阻HPLC证实缀合纯度(98％单体，2％聚集体)。通过LC-MS评估的药物负荷平均为8。ARD103-Dxd的代表性结构如下所示。
参照mAb-Duo(参照mAb-MA-vc-PAB-多卡霉素)在室温下在pH7.4的PBS缓冲液中制备。简言之，参照抗体在与药物接头MA-vc-PAB-Duo以6:1的比率孵育之前用TCEP还原。通过透析除去过量的药物接头。尺寸排阻HPLC证实缀合物纯度(99％单体，1％聚集体)。通过LC-MS评估的药物负荷平均为2。
体外细胞毒性测定-用胰蛋白酶收获细胞，并以1000个细胞/孔铺在96孔平底透明黑壁组织培养板的组织培养基中。第二天，添加测试化合物(通过连续稀释以产生10点剂量曲线而制备的ADC)或媒介物。将细胞孵育144h。按照制造商的说明用CelltiterGlo(Promega,Madison,WI)测定细胞活力。用Prism(GraphPad,La Jolla,CA)绘制数据。
小鼠异种移植研究-根据IACUC(机构动物护理和使用)批准的方案，按照AAALAC(实验室动物护理的评估和认可协会)指南进行所有动物实验。对于肺癌模型，将2百万NCI-H446细胞或5百万NCI-H661细胞植入CB17 SCID小鼠的右侧。对于肝癌模型，将1千万HepG2细胞或5百万Hep3B细胞植入Balb/c小鼠的右侧，而将5百万HepG2-C3A细胞植入NOD/SCID小鼠的右侧。每周监测两次肿瘤生长，用卡尺测量，用公式计算肿瘤体积(V＝0.5a×b2，其中a＝最长直径，b＝最短直径)。当肿瘤达到～150至200mm3时，用测试化合物静脉内处理小鼠。在最终剂量的测试剂后，监测小鼠的肿瘤生长、体重和一般健康状况1至2周。用Prism(GraphPad,La Jolla,CA)绘制数据。实施例1:ARD-103抗体和参照抗体与GPC3阳性细胞系的FACS结合
进行ARD-103抗体和参照抗体与GPC3阳性细胞系的FACs结合。将细胞系HepG2-C3A肝、Hep3B肝和NCI-H1975肺与递增浓度(8点剂量曲线)的抗体或hIgG1在4℃下孵育1小时。用抗hIgG-AF488二抗进行检测。
结果如图1A-1C所示。ARD-103抗体与HepG2-C3A(图1A)和Hep3B(图1B)肝癌细胞以EC50～3.5至4nM类似地结合。在这些条件下，参照mAb与肝癌细胞以EC50～7nM(对于HepG2-C3A)和EC50～8nM(对于Hep3B细胞)结合。mAb都不与GPC3-阴性NCI-H1975肺癌细胞结合(图1C)。
实施例2:ARD-103抗体和相应的ADC与GPC3阳性细胞系的FACS结合。
进行ARD-103抗体和相应ADC与GPC3阳性细胞系的FACs结合。将细胞系HepG2-C3A肝、Hep3B肝和NCI-H1975肺与递增浓度(8点剂量曲线)的抗体、ADC(ARD103-vcMMAE、ARD103-Dxd、ARD103-SN38)或hIgG1 ADC(hIgG1-vcMMAE、hIgG1-Dxd、hIgG1-SN38)在4℃下孵育1小时。用抗hIgG-AF488二抗进行检测。
图2A-2C显示ARD-103抗体和相应的ADC与GPC3阳性细胞系的FACs结合的体外测试结果。ARD103抗体和相应的ADC(ARD103-vcMMAE、ARD103-SN38和ARD103-Dxd)以EC50～2至2.5nM与HepG2-C3A和Hep3B肝癌细胞类似地结合(分别为图2A和2B)。相比之下，对照hIgGADC(hIgG-vcMMAE、hIgG-SN38和hIgG-Dxd)不与HepG2-C3A或Hep3B细胞结合。ARD-103抗体、相应的ARD103 ADC或对照ADC与GPC3-阴性NCI-H1975肺癌细胞没有结合(图2C)。
实施例3：参照MAB-vcMMAE在体外细胞毒性测定中的活性
在体外细胞毒性测定中测定参照mAb-vcMMAE的活性。将五种肝癌细胞系(HepG2、HepG2-C3A、Hep3B、Huh7和PLC/PRF/5)和四种肺癌细胞系(NCI-H446、NCI-H661、NCI-H524和NCI-H1975)与递增浓度的ADC(10点剂量曲线)一起孵育144小时。用CelltiterGlo测定细胞活力。
结果显示在图3A和3B以及下表中。如图3和表中所示，参照ADC对所有5种肝癌细胞系和2种肺癌细胞系(NCI-H446和NCI-H661)具有高活性，IC50≤1nM(范围为0.01nM至0.73nM)。对NCI-H524和GPC3-阴性细胞系NCI-H1975具有最小的活性。
实施例4:ARD103-vcMMAE和参照ADC(参照MAB-Dxd和参照MAB-Duo)在体外细胞毒性测定中的活性
在体外细胞毒性测定中测定ARD103-vcMMAE和参照ADC(参照mAb-Dxd和参照mAb-Duo)的活性。将五种肝癌细胞系(HepG2、HepG2-C3A、Hep3B、Huh7和PLC/PRF/5)和一种肺癌细胞系(NCI-H1975)与递增浓度的ADC(10点剂量曲线)一起孵育144小时。用CelltiterGlo测定细胞活力。
结果示于图4的A至C和下表中。ARD103-vcMMAE对5种肝癌细胞系中的4种具有活性，IC50在0.26nM至2.6nM的范围内。参照mAb-Dxd对5种肝癌细胞系中的3种具有活性，IC50在0.13-0.17nM范围内。这两种ADC对PLC/PRF/5肝癌细胞系或GPC3-阴性细胞系NCI-H1975没有活性。相比之下，参照mAb-Duo对所有细胞系都有活性，IC50范围从0.09nM至27nM。
实施例5：参照MAB-vcMMAE和参照MAB-SN38 ADC在NCI-H446肺癌小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用
在NCI-H446肺癌小鼠异种移植模型中测定参照mAb-vcMMAE和参照mAb-SN38 ADC的抗肿瘤作用。小鼠植入NCI-H446细胞，并且当肿瘤达到170mm3时，用ADC处理。每4天静脉内给予一次ADC，持续4个剂量(箭头)或如图5的图例所示。
参照图5，在这种快速生长的肿瘤模型中，10mg/kg或15mg/kg的参照mAb-SN38和3mg/kg的参照mAb-vcMMAE显著降低了肿瘤负荷。在用10mg/kg的4个剂量的参照mAb-SN38处理的小鼠组中有5个CRs，在用3mg/kg的4个剂量的参照mAb-vcMMAE处理的小鼠组中有1个CRs。
实施例6：参照MAB-vcMMAE和参照MAB-SN38 ADC在NCI-H661肺癌小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用
测定参照mAb-vcMMAE和参照mAb-SN38 ADC在NCI-h661肺癌小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用。小鼠植入NCI-H661细胞，并且当肿瘤达到150mm3时，用ADC处理。每4天静脉内给予一次ADC，持续4个剂量(箭头)或如图6的图例所示。
参照图6，在该模型中，所有剂量的参照mAb-vcMMAE和参照mAb-SN38 ADC都能有效减少肿瘤生长。在参照mAb-vcMMAE组中存在多个CRs：在每周给予ADC的3mg/kg组中存在7个CRs(q7dx4)，在3mg/kg组中存在5个CRs(q4dx4)，以及在1.5mg/kg组中存在3个CRs(q4dx4)。对于参照mAb-SN38 ADC，在8mg/kg组中有1CR，其中小鼠每周给药(q7dx4)或每4天给药4个剂量(q4dx4)。
实施例7：参照MAB-vcMMAE和参照MAB-SN38 ADC在HEP-G2肝癌小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用
测定参照mAb-vcMMAE和参照mAb-SN38 ADC在Hep-G2肝癌小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用。小鼠植入HepG2细胞，并且当肿瘤达到150mm3时，用ADC处理。每4天静脉内给予一次ADC，持续4个剂量(箭头)或如图7的图例所示。
参照图7，在给予6剂8mg/kg参照mAb-SN38 ADC的小鼠中，肿瘤生长减少62％。
实施例8:ARD103-vcMMAE、ARD103-SN38和ARD103-Dxd ADC在HEP-G2-C3A肝癌小鼠异种移植物模型中的抗肿瘤作用
测定ARD103-vcMMAE、ARD103-SN38和ARD103-Dxd ADC在Hep-G2-C3A肝癌小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用。小鼠植入HepG2-C3A细胞，并且当肿瘤达到162mm3时，用ADC处理。每4天静脉内给予一次ADC，持续4个剂量(箭头)或如图8的图例所示。
参照图8，在该模型中，所有剂量的ARD103-SN38和ARD103-Dxd在减少肿瘤生长方面都是有效的。ARD103-SN38的显著抗肿瘤活性与参照mAb-SN38在HepG2模型中的适度作用形成对比(图7)。ARD103-SN38组有多个CRs:10mg/kg组有7个持久CRs,12mg/kg组有8个持久CRs。在给予5mg/kg ARD103-Dxd的小鼠组中有3个持久的CRs。用对照-Dxd或对照-SN38 ADC处理的小鼠显示35至40％的肿瘤生长延迟。用ARD103-vcMMAE处理的小鼠显示肿瘤生长减少66.5％，而在给予对照-vcMMAE的小鼠中观察到最小的抗肿瘤作用。
实施例9:ARD103-vcMMAE、ARD103-SN38和ARD103-Dxd ADC在HEP3B肝癌小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用
测定ARD103-vcMMAE、ARD103-SN38和ARD103-Dxd ADC在Hep3B肝癌小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用。小鼠植入Hep3B细胞，并且当肿瘤达到155mm3时，用ADC处理。每4天静脉内给予一次ADC，持续4个剂量(箭头)或如图9的图例所示。
参照图9，在该模型中，所有剂量的ARD103-SN38和ARD103-Dxd在减少肿瘤生长方面都是有效的。ARD103-SN38的显著抗肿瘤活性与参照mAb-SN38在HepG2模型中的适度作用形成对比(图7)。用ARD103-SN38(10mg/kg或12mg/kg)处理的小鼠抑制肿瘤生长110％，而ARD103-Dxd抑制肿瘤生长115％。用ARD103-vcMMAE处理的小鼠中的肿瘤生长减少70％。
给予对照-SN38 ADC的小鼠显示肿瘤生长减少40％，而在给予对照-vcMMAE或对照-Dxd ADC的小鼠中观察到最小抗肿瘤作用。实施例10：ARD103-C12-SN38在肝癌细胞系中的体外活性、ARD103-CL2A-SN38和ARD103-C12-SN38肝癌小鼠异种移植模型的体内活性
ARD103-CL2-SN38在HepG2肝癌细胞中的体外活性显示在图10中。在用PromegaCelltiterGlo处理之前，将HepG2细胞与ADC一起孵育96小时。在这些条件下，ADC对该细胞系具有活性，IC50～300ng/ml(15nM ADC)。
在HepG2-C3A(图11A)和Hep3B(图11B)模型中进行两项另外的异种移植研究以比较携带CL2A-SN38和CL2-SN38药物接头的ARD103缀合物。在HepG2-C3A异种移植模型中比较ARD103-CL2A-SN38和ARD103-CL2-SN38的抗肿瘤作用(图11A)。当肿瘤达到154mm3时，每4天静脉内给予携带肿瘤的小鼠(8只小鼠/组)一次ADC，共4次剂量(箭头)。在这些条件下，两种ADC的活性是可比较的，并且这些图重叠。两组中的所有小鼠(8只小鼠中的8只)都实现了完全的肿瘤消退。与媒介物组相比，在这些条件下，对照ADC(hIgG-CL2A-SN38和hIgG-CL2-SN38)的活性低得多，并且肿瘤生长减少49％。
在Hep3B异种移植模型中比较ARD103-CL2A-SN38和ARD103-CL2-SN38的抗肿瘤作用(图11B)。当肿瘤达到173mm3时，每4天静脉内给予携带肿瘤的小鼠(8只小鼠/组)一次ADC，共6次剂量(箭头)。在这些条件下，两种ADC的活性是相当的。在用ARD103-CL2A-SN38(8只小鼠中的5只)和ARD103-CL2-SN38(8只小鼠中的2只)处理的小鼠中观察到完全的肿瘤消退。与媒介物组相比，在这些条件下，对照ADC(hIgG-CL2A-SN38和hIgG-CL2-SN38)的活性低得多，并且肿瘤生长分别降低52％和33％。
本发明不限于在此描述的特定实施方案的范围。实际上，除了在此描述的那些之外，从前面的描述和附图，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本文引用了各种出版物，包括专利，专利申请出版物和科学文献，将它们的公开内容整体并入本文用于所有目的。
可以组合上述各种实施方案以提供进一步的实施方案。在本说明书中提及和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物，包括2020年11月19日提交的美国专利申请号63/116,001，通过引用整体并入本文。如果需要，可以修改实施方案的各方面，以采用各种专利，申请和出版物的概念来提供另外的实施方案。
根据以上详细描述，可以对实施方案进行这些和其它改变。通常，在以下权利要求中，所使用的术语不应被解释为将权利要求限制于说明书和权利要求中所公开的具体实施方案，而应被解释为包括所有可能的实施方案以及这些权利要求所授权的等同物的全部范围。因此，权利要求不受本公开的限制。
序列表
<110> 艾迪健公司
<120> GPC3结合剂、其缀合物以及使用它们的方法
<130> 120301.403WO
<150> US 63/116,001
<151> 2020-11-19
<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ARD103 VH氨基酸序列
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ARD103 VL氨基酸序列
<400> 2
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 3
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ARD103 VH-IgG1氨基酸序列
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 4
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ARD103 VL-Ig κ氨基酸序列
<400> 4
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH信号序列
<400> 5
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 6
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL信号序列
<400> 6
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ser Arg Cys
20
<210> 7
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 具有信号序列的ARD103 VH-IgG1氨基酸序列
<400> 7
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
165 170 175
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
180 185 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
210 215 220
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
225 230 235 240
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
245 250 255
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
260 265 270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
275 280 285
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
290 295 300
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
305 310 315 320
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
325 330 335
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
340 345 350
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
355 360 365
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
370 375 380
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
405 410 415
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
420 425 430
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
435 440 445
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 8
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 具有信号序列的ARD103 VL-Ig κ氨基酸序列
<400> 8
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ser Arg Cys Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser
20 25 30
Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
35 40 45
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu
50 55 60
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
130 135 140
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
145 150 155 160
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
165 170 175
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
180 185 190
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
195 200 205
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
210 215 220
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
225 230 235 240
Cys
<210> 9
<211> 603
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(603)
<223> 人GPC3, 同种型1 NP_001158089.1
<400> 9
Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp
20 25 30
Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly
35 40 45
Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val
50 55 60
Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys
65 70 75 80
Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala
85 90 95
Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln
100 105 110
Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala
115 120 125
Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe
130 135 140
Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp
145 150 155 160
Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro
165 170 175
Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu
180 185 190
Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe
195 200 205
Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln
210 215 220
Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile
225 230 235 240
Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu
245 250 255
Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys
260 265 270
Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly
275 280 285
Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu
290 295 300
Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu
305 310 315 320
Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys
325 330 335
Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Glu Thr Glu Lys Lys Ile Trp His
340 345 350
Phe Lys Tyr Pro Ile Phe Phe Leu Cys Ile Gly Leu Asp Leu Gln Ile
355 360 365
Gly Lys Leu Cys Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr
370 375 380
Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His
385 390 395 400
Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln
405 410 415
Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile
420 425 430
Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly
435 440 445
Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met
450 455 460
Lys Asn Gln Phe Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro
465 470 475 480
Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu
485 490 495
Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp
500 505 510
Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys
515 520 525
Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg
530 535 540
Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly
545 550 555 560
Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His
565 570 575
Asn Leu Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala
580 585 590
Ile Ser Val Val Cys Phe Phe Phe Leu Val His
595 600
<210> 10
<211> 564
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(564)
<223> 人GPC3, 同种型3 NP_001158090.1
<400> 10
Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp
20 25 30
Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly
35 40 45
Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val
50 55 60
Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys
65 70 75 80
Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala
85 90 95
Lys Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala
100 105 110
Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Glx Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe
115 120 125
Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp
130 135 140
Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro
145 150 155 160
Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu
165 170 175
Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe
180 185 190
Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln
195 200 205
Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile
210 215 220
Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu
225 230 235 240
Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys
245 250 255
Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly
260 265 270
Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu
275 280 285
Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu
290 295 300
Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys
305 310 315 320
Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser
325 330 335
Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile
340 345 350
Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu
355 360 365
Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser
370 375 380
Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala
385 390 395 400
Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr
405 410 415
Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His
420 425 430
Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp
435 440 445
Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys
450 455 460
Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly
465 470 475 480
Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly
485 490 495
Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr
500 505 510
Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro
515 520 525
Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser
530 535 540
Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe
545 550 555 560
Phe Leu Val His
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ARD103 VH CDR1
<400> 11
Asp Tyr Glu Met His
1 5
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ARD103 VH CDR2
<400> 12
Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ARD103 VH CDR3
<400> 13
Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
1 5
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ARD103 VL CDR1
<400> 14
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ARD103 VL CDR2
<400> 15
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ARD103 VL CDR3
<400> 16
Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> G4S合成接头
<400> 17
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 18
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 六组氨酸标签
<400> 18
His His His His His His
1 5
<210> 19
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ARD103 VH和IgG1的编码序列
<400> 19
caggtgcagc tggtcgagtc aggagcagag gtcaagaagc ccggagcaag cgtcaaggtg 60
tcatgtaaag caagcggata tactttcacc gactacgaga tgcactgggt gcggcaggca 120
ccaggacagg gcctggagtg gatgggcgcc ctggacccta agaccggcga tacagcctac 180
tcccagaagt tcaagggcag agtgaccctg acagccgaca agtctaccag cacagcctat 240
atggagctga gctccctgac ctctgaggat acagccgtgt actattgcac aaggttttat 300
tcctacactt attggggaca gggcactctg gtcacagtca gcagcgctag caccaagggc 360
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 720
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1080
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320
ctgtctccgg gtaaatga 1338
<210> 20
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ARD103 VL和 Igκ的编码序列
<400> 20
gatgtcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcctgtga ctcccggcga gcccgcaagc 60
atttcctgta gaagtagcca gagcctggtg cactctaacg gcaataccta cctgcactgg 120
tatctgcaga agcccggcca gagccctcag ctgctgatct acaaggtgag caaccggttc 180
tccggagtgc cagaccggtt cagcggatcc ggctctggca ccgatttcac actgaagatc 240
tccagggtgg aggcagagga cgtgggcgtg tactattgct cacagaacac tcacgtcccc 300
ccaacattcg ggcagggcac aaaactggag atcaaacgta cggtggcggc gccatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttga 660
<210> 21
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ARD103 VH编码区
<400> 21
caggtgcagc tggtcgagtc aggagcagag gtcaagaagc ccggagcaag cgtcaaggtg 60
tcatgtaaag caagcggata tactttcacc gactacgaga tgcactgggt gcggcaggca 120
ccaggacagg gcctggagtg gatgggcgcc ctggacccta agaccggcga tacagcctac 180
tcccagaagt tcaagggcag agtgaccctg acagccgaca agtctaccag cacagcctat 240
atggagctga gctccctgac ctctgaggat acagccgtgt actattgcac aaggttttat 300
tcctacactt attggggaca gggcactctg gtcacagtca gcagc 345
<210> 22
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ARD103 VL编码区
<400> 22
gatgtcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcctgtga ctcccggcga gcccgcaagc 60
atttcctgta gaagtagcca gagcctggtg cactctaacg gcaataccta cctgcactgg 120
tatctgcaga agcccggcca gagccctcag ctgctgatct acaaggtgag caaccggttc 180
tccggagtgc cagaccggtt cagcggatcc ggctctggca ccgatttcac actgaagatc 240
tccagggtgg aggcagagga cgtgggcgtg tactattgct cacagaacac tcacgtcccc 300
ccaacattcg ggcagggcac aaaactggag atcaaa 336
<210> 23
<211> 526
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(526)
<223> 人GPC3, 同种型4 NP_001158091.1
<400> 23
Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp
20 25 30
Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly
35 40 45
Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Glu Ala Phe Glu Ile Val
50 55 60
Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala Met Phe Lys Asn Asn Tyr
65 70 75 80
Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr
85 90 95
Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp Ile Asn Val Asp Asp Met
100 105 110
Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro Val Ile Tyr Thr Gln Leu
115 120 125
Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu Asp Ile Asn Glu Cys Leu
130 135 140
Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe Gly Asn Phe Pro Lys Leu
145 150 155 160
Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln Val Thr Arg Ile Phe Leu
165 170 175
Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile Asn Thr Thr Asp His Leu
180 185 190
Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu Thr Arg Met Trp Tyr Cys
195 200 205
Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys Pro Cys Gly Gly Tyr Cys
210 215 220
Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly Val Val Glu Ile Asp Lys
225 230 235 240
Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu Glu Leu Val Asn Gly Met
245 250 255
Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu Phe Ser Thr
260 265 270
Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys Asn Ala Gly Lys Leu Thr
275 280 285
Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg
290 295 300
Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys
305 310 315 320
Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu
325 330 335
Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro
340 345 350
Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys
355 360 365
Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg
370 375 380
Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly
385 390 395 400
Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn
405 410 415
Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys
420 425 430
Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu
435 440 445
Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly Met Ile Lys Val Lys Asn
450 455 460
Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp
465 470 475 480
Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser
485 490 495
Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys Leu Leu Thr
500 505 510
Ser Met Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe Phe Leu Val His
515 520 525
<210> 24
<211> 580
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(580)
<223> 人GPC3, 同种型2 NP_004475.1
<400> 24
Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp
20 25 30
Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly
35 40 45
Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val
50 55 60
Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys
65 70 75 80
Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala
85 90 95
Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln
100 105 110
Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala
115 120 125
Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe
130 135 140
Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp
145 150 155 160
Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro
165 170 175
Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu
180 185 190
Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe
195 200 205
Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln
210 215 220
Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile
225 230 235 240
Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu
245 250 255
Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys
260 265 270
Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly
275 280 285
Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu
290 295 300
Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu
305 310 315 320
Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys
325 330 335
Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser
340 345 350
Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile
355 360 365
Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu
370 375 380
Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser
385 390 395 400
Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala
405 410 415
Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr
420 425 430
Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His
435 440 445
Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp
450 455 460
Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys
465 470 475 480
Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly
485 490 495
Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly
500 505 510
Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr
515 520 525
Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro
530 535 540
Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser
545 550 555 560
Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe
565 570 575
Phe Leu Val His
580
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头
<400> 25
Gly Gly Phe Gly
1
<210> 26
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头
<400> 26
Gly Phe Leu Gly
1
<210> 27
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组织蛋白酶-B-可裂解肽
<400> 27
Ala Leu Ala Leu
1
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> (G4S)2合成接头
<400> 28
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> (G4S)3合成接头
<400> 29
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> (G4S)4合成接头
<400> 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 31
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> (G4S)5合成接头
<400> 31
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 32
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体 IgG1恒定区
<400> 32
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 33
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ARD103 VH变体 IgG1恒定区
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 34
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 具有信号序列的ARD103 VH变体IgG1恒定区
<400> 34
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
165 170 175
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
180 185 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
210 215 220
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
225 230 235 240
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
245 250 255
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
260 265 270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
275 280 285
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
290 295 300
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
305 310 315 320
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
325 330 335
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
340 345 350
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
355 360 365
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
370 375 380
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
405 410 415
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
420 425 430
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
435 440 445
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460

Claims (63)

1.缀合物，其包含：
结合剂，其包含(i)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)，和(ii)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)，其中重链和轻链框架区任选地用所述框架区中的1-8个氨基酸取代、缺失或插入进行修饰，其中所述结合剂特异性结合人GPC3；
与所述结合剂连接的至少一种接头；和
与每个接头连接的至少一种细胞毒性剂。
2.如权利要求1所述的缀合物，其中所述结合剂包含：(i)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区。
3.缀合物，其包含：
包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的结合剂，其中所述VH区包含具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的互补决定区HCDR1序列，具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的HCDR2序列和具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的HCDR3，其各自位于重链框架区内；并且其中所述VL区包含具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的LCDR1序列，具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的LCDR3，其各自位于轻链框架区内；
与所述结合剂连接的至少一种接头；和
与每个接头连接的至少一种细胞毒性剂。
4.如权利要求3所述的缀合物，其中所述框架区是鼠框架区。
5.如权利要求3所述的结合物，其中所述框架区是人框架区。
6.如权利要求1-5中任一项所述的缀合物，其中所述结合剂是抗体或其抗原结合部分。
7.如权利要求6所述的缀合物，其中所述结合剂是单克隆抗体、Fab、Fab’、F(ab’)、Fv、二硫键连接的Fc、scFv、单结构域抗体、双抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
8.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述重链可变区还包含重链恒定区。
9.如权利要求8所述的缀合物，其中重链恒定区是IgG同种型。
10.如权利要求9所述的缀合物，其中重链恒定区是IgG1恒定区。
11.如权利要求10所述的缀合物，其中所述IgG1重链恒定区具有SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:32的116-445位所示的氨基酸序列。
12.如权利要求9所述的缀合物，其中所述重链恒定区是IgG4恒定区。
13.如权利要求10或11所述的缀合物，其中所述重链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
14.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述轻链可变区还包含轻链恒定区。
15.如权利要求14所述的缀合物，其中所述轻链恒定区是κ同种型。
16.如权利要求15所述的缀合物，其中所述κ轻链恒定区具有SEQ ID NO:4的113-219位所示的氨基酸序列。
17.如权利要求15或16所述的缀合物，其中所述轻链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
18.如权利要求1-17中任一项所述的缀合物，其中所述接头通过链间二硫化物残基、工程改造的半胱氨酸、聚糖或修饰的聚糖、所述结合剂的N-末端残基或与所述结合剂连接的聚组氨酸残基与所述结合剂连接。
19.如权利要求1至18中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物的平均药物负荷为约1至约8、约2、约4、约6、约8、约10、约12、约14、约16、约3至约5、约6至约8或约8至约16。
20.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述结合剂是单特异性的。
21.如权利要求1-20中任一项所述的缀合物，其中所述结合剂是二价的。
22.如权利要求1-19中任一项所述的缀合物，其中所述结合剂包含第二结合结构域，并且所述结合剂是双特异性的。
23.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂选自奥瑞他汀、喜树碱、多卡霉素、蒽环霉素和加利车霉素。
24.如权利要求23所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是奥瑞他汀。
25.如权利要求24所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是MMAE。
26.如权利要求23所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是喜树碱。
27.如权利要求26所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是依沙替康。
28.如权利要求23所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是加利车霉素。
29.如权利要求28所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是SN-38。
30.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述接头选自mc-VC-PAB、CL2、CL2A和(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH2)n2-C(＝O)-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-CH2-O-CH2-(C＝O)-，其中n2代表2-8的整数。
31.如权利要求30所述的缀合物，其中所述接头是mc-VC-PAB。
32.如权利要求31所述的缀合物，其中所述接头与MMAE的至少一个分子连接。
33.如权利要求30所述的缀合物，其中所述接头是CL2A。
34.如权利要求33所述的缀合物，其中所述接头与SN-38的至少一个分子连接。
35.如权利要求30所述的缀合物，其中所述接头是CL2。
36.如权利要求35所述的缀合物，其中所述接头与SN-38的至少一个分子连接。
37.如权利要求30所述的缀合物，其中所述接头是(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH2)n2-C(＝O)-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-CH2-O-CH2-(C＝O)-，其中n2代表2-8的整数。
38.如权利要求37所述的缀合物，其中所述接头与依沙替康的至少一个分子连接。
39.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的缀合物和药学上可接受的载体。
40.核酸，其编码权利要求1-22中任一项所述的结合剂。
41.载体，其包含权利要求40所述的核酸。
42.细胞系，其包含权利要求40所述的核酸。
43.治疗GPC3+癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1-38中任一项所述的缀合物或权利要求39所述的药物组合物。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述GPC3+癌症是癌或恶性肿瘤。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述GPC3+癌症选自肝细胞癌、肺癌如小细胞肺癌和大细胞肺癌、结肠直肠癌、食道癌、宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、肾细胞癌、乳腺癌、黑色素瘤、生殖细胞癌(例如睾丸)、胃癌、肉瘤和膀胱癌。
46.如权利要求43-45中任一项所述的方法，还包括对所述受试者施用免疫疗法。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述免疫疗法包括免疫检查点抑制剂。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自特异性结合人PD-1、人PD-L1或人CTLA4的抗体。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是派姆单抗、纳武单抗、cemiplimab或伊匹单抗。
50.如权利要求43-49中任一项所述的方法，还包括对所述受试者施用化学疗法。
51.如权利要求43-50中任一项所述的方法，其中所述缀合物经静脉内施用。
52.如权利要求43-51中任一项所述的方法，其中所述缀合物以约0.1mg/kg至约12mg/kg的剂量施用。
53.改善接受了针对GPC3+癌症的免疫疗法和/或化学疗法的受试者中的治疗结果的方法，其包括：
向患有癌症的受试者施用有效量的免疫疗法或化学疗法；和
向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-38中任一项所述的缀合物或权利要求39所述的药物组合物；
其中与单独施用免疫疗法或化学疗法相比，所述受试者的治疗结果得到改善。
54.如权利要求53所述的方法，其中改善的治疗结果是选自稳定疾病、部分反应或完全反应的客观反应。
55.如权利要求53所述的方法，其中改善的治疗结果是减少的肿瘤负荷。
56.如权利要求53所述的方法，其中改善的治疗结果是无进展生存或无疾病生存。
57.如权利要求53-56中任一项所述的方法，其中所述免疫疗法是免疫检查点抑制剂。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包括特异性结合人PD-1、人PD-L1或CTLA4的抗体。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是派姆单抗、纳武单抗、cemiplimab或伊匹单抗。
60.如权利要求53至59中任一项所述的方法，其中所述缀合物经静脉内施用。
61.如权利要求53-60中任一项所述的方法，其中所述缀合物以约0.1mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。
62.权利要求1-38中任一项所述的缀合物或权利要求39所述的药物组合物用于治疗受试者的GPC3+癌症的用途。
63.权利要求1-38中任一项所述的缀合物或权利要求39所述的药物组合物用于治疗接受了免疫疗法或化学疗法的受试者中的GPC3+癌症的用途。
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