CN116669719A - 具有定义尺寸的纳米颗粒复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纳米颗粒，该纳米颗粒包括：(a)内芯，该内芯包含低聚(‑)‑表没食子儿茶素没食子酸酯(OEGCG)；(b)外芯，该外芯包含聚乙二醇‑表没食子儿茶素没食子酸酯缀合物(PEG‑EGCG)；和(c)药物物质的蛋白质分子，该蛋白质分子包封在该内芯中；其中至少70％的该纳米颗粒具有介于50nm至300nm之间的直径。本发明还提供一种用于制备该纳米颗粒的方法。本发明还提供了一种通过将本发明的纳米颗粒以有效治疗癌症的量施用给对其有需要的受试者来治疗癌症的方法。

Description

具有定义尺寸的纳米颗粒复合物
技术领域
本发明涉及纳米颗粒，该纳米颗粒包括：(a)内芯，该内芯包含低聚(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(OEGCG)；(b)外芯，该外芯包含PEG-EGCG缀合物；和(c)药物分子，该药物分子包封在该内芯中；其中至少70％的该纳米颗粒具有介于50nm至300nm之间的直径。本发明还涉及一种制造纳米颗粒的方法。
背景技术
绿茶儿茶素具有预防心血管疾病和癌症的健康益处。在茶叶儿茶素中，(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)含量最丰富，在绿茶叶的有益效应中发挥着重要作用。EGCG具有抗氧化、抗炎和免疫调节效应。EGCG还显示可通过靶向对癌细胞生存至关重要的多种信号转导通路来有效抑制肿瘤生长和转移。
尽管有这些期望的活性，但EGCG的临床应用因其稳定性差和口服生物利用度低而受到限制。例如，EGCG不稳定，在生理环境下容易分解。因此，口服施用后无法达到实现期望治疗效应所需的EGCG的血浆浓度。
癌症是一种具有多种信号传导通路的复杂疾病，其治疗面临三大挑战。首先，癌症是由人的免疫功能障碍引起的。恢复宿主免疫功能的免疫调节对于长期治疗解决方案至关重要。第二，单一治疗剂只能改变一种疾病通路，功效有限，有耐药性且无应答。癌细胞可通过替代的信号传导通路逃避单一药剂治疗。第三，药物毒性和对靶组织的非有效给药是癌症治疗面临的共同挑战，因为肿瘤尺寸只是身体尺寸的一小部分。仅小部分施用的药物到达靶向组织，大部分药物进入非靶向的正常组织，这导致对靶向组织的低功效和对正常组织的高毒性。
药物的分子尺寸决定了有多少药物选择性地进入靶组织(例如，炎症和快速生长的组织)，而不是非预期的其他组织(《化学学会评论》，2019年10月28日；48卷(21期)：第5381-5407页(Chem Soc Rev 2019 Oct 28；48(21)：5381-5407))。正常的、非预期的健康组织通常具有小于10nm的血管开口。肿瘤组织在血管壁中具有约300nm至1000nm的间隙。其他炎症组织(诸如自身免疫性疾病器官)具有各种间隙尺寸，通常也大于300nm。
需要一种药物组合物和药物递送系统，其克服上述挑战并有效地进入靶组织而没有潜在毒性。
附图说明
图1示出了本发明的纳米颗粒胶束组合物，其中药物分子包封在胶束内，并且胶束包含PEG-EGCG缀合物和低聚EGCG(OEGCG)。
图2示出了包含曲妥珠单抗(trastuzumab)的本发明的纳米颗粒胶束组合物的纳米颗粒尺寸分布。
图3示出了包含IL-12的本发明的纳米颗粒胶束组合物的纳米颗粒尺寸分布。
图4示出了包含抗CD3的本发明的纳米颗粒胶束组合物的纳米颗粒尺寸分布。
图5示出了包含IFN(干扰素)-α的本发明的纳米颗粒胶束组合物的纳米颗粒尺寸分布。
图6A和图6B示出了使用不同的曲妥珠单抗与OEGCG摩尔比制备的曲妥珠单抗纳米颗粒胶束组合物的比较。
图7A和图7B示出了使用(图7B)或不使用(图7A)10K截留分子量超滤制备的曲妥珠单抗纳米颗粒胶束组合物。
图8A和图8B示出了使用(图8B)或不使用(图7A)0.22μm过滤制备的曲妥珠单抗纳米颗粒胶束组合物的比较。
图9示出了通过逐步冷冻(本发明)、连续冷冻(比较)或一步冷冻(比较)制备的曲妥珠单抗纳米颗粒胶束组合物的比较。
图10示出了用对照、曲妥珠单抗和曲妥珠单抗纳米颗粒胶束组合物治疗后小鼠的肿瘤体积与时间的关系。
图11示出了包含抗CD71的本发明的纳米颗粒胶束组合物的纳米颗粒尺寸分布。
图12示出了包含抗表皮生长因子受体(EGFR)的本发明的纳米颗粒胶束组合物的纳米颗粒尺寸分布。
图13示出了包含抗Tau的本发明的纳米颗粒胶束组合物的纳米颗粒尺寸分布。
图14示出了包含抗血管内皮生长因子(VEGF)的本发明的纳米颗粒胶束组合物的纳米颗粒尺寸分布。
图15示出了包含IFN-γ的本发明的纳米颗粒胶束组合物的纳米颗粒尺寸分布。
图16示出了包含白介素(IL)-2的本发明的纳米颗粒胶束组合物的纳米颗粒尺寸分布。
图17示出了包含IL-6的本发明的纳米颗粒胶束组合物的纳米颗粒尺寸分布。
图18示出了包含IL-15的本发明的纳米颗粒胶束组合物的纳米颗粒尺寸分布。
图19示出了包含IL-21的本发明的纳米颗粒胶束组合物的纳米颗粒尺寸分布。
图20示出了包含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的本发明的纳米颗粒胶束组合物的纳米颗粒尺寸分布。
图21示出了包含牛血清白蛋白(BSA)的本发明的纳米颗粒胶束组合物的纳米颗粒尺寸分布。
具体实施方式
定义
术语″约″定义为所述值的±10％，优选±5％。
术语″细胞因子″是指在细胞信号传导中重要的小蛋白(约5kDa至70kDa)。细胞因子已显示作为免疫调节剂参与自分泌、旁分泌和内分泌信号传导。细胞因子包括干扰素、白介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子和趋化因子。
术语″表没食子儿茶素没食子酸酯″是指表没食子儿茶素和没食子酸的酯，可与″表没食子儿茶素-3-没食子酸酯″或EGCG互换使用。
术语″纳米颗粒″是指直径在1μm以下且在1nm至999nm之间的颗粒。
术语″低聚EGCG″(OEGCG)是指3至20个共价连接的EGCG单体。OEGCG优选含有4至12个EGCG单体。OEGCG的结构显示在WO2006/124000中。例如，OEGCG可根据WO2006/124000合成。
术语″聚乙二醇-表没食子儿茶素没食子酸酯缀合物″或″PEG-EGCG″是指与一个或两个EGCG分子缀合的聚乙二醇(PEG)。术语″PEG-EGCG″是指PEG-mEGCG缀合物(单体EGCG)和PEG-dEGCG(二聚体EGCG)缀合物两者。例如，可通过经由游离醛基与EGCG的A环的C6和/或C8位的反应，通过聚乙二醇的连接，将醛封端的PEG缀合至EGCG来制备PEG-EGCG。参见WO2006/124000和WO2009/054813。
纳米颗粒组合物
本发明提供了一种纳米颗粒胶束组合物，其中药物分子包封在胶束内，并且该胶束在外芯中包含PEG-EGCG缀合物并且在内芯中包含低聚EGCG(OEGCG)(参见图1)。纳米颗粒胶束组合物具有定义的和窄的尺寸分布，其中至少70％的纳米颗粒具有介于50nm至300nm之间的直径，并且纳米颗粒的尺寸分布仅具有一个主峰，该主峰含有所有纳米颗粒中的超过90％。
本发明纳米颗粒胶束组合物包含三种活性成分，这三种活性成分在功能上互补以形成″多靶向组合疗法″，通过其骨架组分(OEGCG/PEG-EGCG)处理免疫应答和信号传导通路两者，以及通过有效治疗复杂疾病的所选择的蛋白质药物分子处理附加的信号传导通路。每个纳米颗粒都是固定剂量的组合药物，具有固定摩尔比的三种活性成分。
本发明的组合物经由多种信号通路治疗疾病。本发明的组合物为癌症治疗提供了增强的功效(肿瘤减少率)和增加的患者应答率(对治疗有应答的患者数量)。
本发明的纳米颗粒胶束组合物的大部分颗粒的尺寸为50nm至300nm。定义的50nm至300nm的纳米颗粒尺寸允许三种活性成分优先分布至肿瘤，这减少了它们向其他非肿瘤组织的渗透。如果颗粒尺寸小于50nm，则颗粒将分布到正常组织并引起细胞毒性的风险更高。如果颗粒尺寸大于300nm，则可能引起由网状内皮(RE)系统摄入过量并导致副作用。本发明的组合物中超过70％的颗粒在50nm至300nm的尺寸范围内，这确保三种活性成分优先于正常组织和RE系统进入肿瘤。
本发明的纳米颗粒胶束组合物具有窄的颗粒尺寸分布，因为其仅具有一个主峰，该主峰含有所有纳米颗粒中的超过90％。重要的是使治疗组合物仅具有一个颗粒尺寸分布峰，而不是几个峰或多个峰。如果治疗组合物具有不止一种分子尺寸，则其可能引起治疗功效、患者应答率和不良作用(毒性)的严重变化。
本发明的纳米复合物在胶束组合物的骨架中含有前两种活性成分(OEGCG和PEG-EGCG)，它们是免疫调节剂和信号传导调控剂。它们是EGCG的衍生物，EGCG是强免疫调节剂并调控多种疾病信号传导通路。例如，EGCG激活靶向肿瘤的CD8+T细胞，并抑制癌症中的抗PD-L1表达。EGCG调控自身免疫疾病的先天性免疫和适应性免疫两者。然而，EGCG的生物利用度低且EGCG不稳定。本发明的纳米复合物组合物通过形成将EGCG运载至肿瘤的纳米载体来克服EGCG的生物利用度问题，并通过形成OEGCG和PEG-EGCG来克服EGCG的稳定性问题，这有效地使得EGCG能够成为高效的治疗剂。
本发明的纳米复合物还含有第三活性成分，该第三活性成分为包封在纳米颗粒中的药物分子。药物分子优选地为蛋白质药物，并且包括但不限于细胞因子和抗体。细胞因子包括但不限于IL-2、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、TARIL、IGF1、GLP-1、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCLl1、CX3CL1和重组细胞因子产物。抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、抗体-药物-缀合物和双特异性抗体。本发明的优选抗体为单克隆抗体。适用于本发明的抗体包括抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG3抗体、抗TIGIT抗体、抗TIM3抗体、抗HER2抗体、抗HER3抗体、抗HGFR抗体、抗EGFR抗体、抗EpCAM、抗FOLR1抗体、抗c-Met抗体、抗GD2神经节苷脂抗体、抗GD3神经节苷脂、抗VEGFR1抗体、抗VEGF抗体、抗TGF-β抗体、抗TNF-α抗体、抗IGF-1R抗体、抗IL-4抗体、抗IL-10抗体、抗IL-13抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD40抗体、抗CD40L抗体、抗CD43抗体、抗CD19抗体、抗CD27抗体、抗CD70抗体、抗CD71抗体、抗CD28抗体、抗CD38抗体、抗CD20抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗DR5抗体、抗MUC1抗体、抗Tau抗体、抗β淀粉样蛋白抗体、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿比妥珠单抗(abituzumab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿杜那单抗(aducanumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿麦妥单抗(amatuximab)、埃万妥单抗(amivantamab)、阿尼鲁单抗(anifrolumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴匹组单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝那珠单抗(benralizumab)、贝索单抗(besilesomab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、贝洛托舒单抗(bezlotoxumab)、贝林妥欧单抗(blinatumomab)、布雷库单抗(brazikumab)、布隆妥珠单抗(brontictuzumab)、卡比利珠单抗(cabiralizumab)、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)、卡芦单抗(carlumab)、卡罗妥昔单抗(carotuximab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、西利珠单抗(cedelizumab)、西利单抗(cetrelimab)、西妥昔单抗(cetuximab)、赛必妥单抗(cibisatamab)、克瑞组单抗(crenezumab)、古妥珠单抗(cusatuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)、达利珠单抗、达罗托组单抗(dalotuzumab)、达雷妥尤单抗(daratumumab)、地莫单抗(detumomab)、地妥西单抗(dinutuximab)、曲齐妥单抗(drozitumab)、度戈妥珠单抗(duligotuzumab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、度伐利尤单抗(durvalumab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依玛妥珠单抗(emibetuzumab)、艾可瑞妥单抗(epcoritamab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、依普奈珠单抗(eptinezumab)、依瑞奈尤单抗(erenumab)、厄妥索单抗(ertumaxomab)、埃达组单抗(etaracizumab)、埃特司韦单抗(etesevimab)、法妥组单抗(farletuzumab)、非扎奴单抗(fezakinumab)、非拉妥组单抗(ficlatuzumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、夫来库单抗(fletikumab)、福雷芦单抗(foralumab)、非苏木单抗(fresolimumab)、伏妥昔单抗(futuximab)、加尼妥单抗(ganitumab)、更汀芦单抗(gantenerumab)、伽妥珠单抗(gatipotuzumab)、吉伏组单抗(gevokizumab)、戈利木单抗(golimumab)、古塞库单抗(guselkumab)、艾芦库单抗(icrucumab)、伊戈伏单抗(igovomab)、伊玛鲁单抗(imalumab)、伊马曲单抗(imgatuzumab)、伊奈利珠单抗(inebilizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、英妥木单抗(intetumumab)、伊匹木单抗(ipilimumab)、艾司妥单抗(istiratumab)、伊西贝单抗(ixekizumab)、来利珠单抗(letolizumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、马夫利列单抗(mavrilimumab)、美泊利珠单抗(mepolizumab)、莫格利珠单抗(mogamulizumab)、莫那利珠单抗(monalizumab)、莫妥珠单抗(mosunetuzumab)、那他珠单抗(natalizumab)、那昔妥单抗(naxitamab)、奈妥木单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉妥单抗(olaratumab)、奥拉妥单抗奥匹努单抗(olaratumabopicinumab)、帕尼单抗(panitumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、泊奈组单抗(ponezumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、沙马组单抗(samalizumab)、沙利鲁单抗(sarilumab)、苏金单抗(secukinumab)、信迪利单抗(sintilimab)、苏兰组单抗(solanezumab)、替妥木单抗(teprotumumab)、替加组单抗(tigatuzumab)、替曲吉珠单抗(tildrakizumab)、替米妥珠单抗(timigutuzumab)、托西珠单抗(tocilizumab)、托木妥昔单抗(tomuzotuximab)、曲妥珠单抗、乌司奴单抗(ustekinumab)、伐努赛珠单抗(vanucizumab)、伐利苏单抗(varisacumab)、伐立鲁单抗(varlilumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、维帕莫单抗(vepalimomab)、维西库单抗(vesencumab)、维西珠单抗(visilizumab)、珀伽利珠单抗(vonlerolizumab)、扎木单抗(zanolimumab)、扎妥昔单抗(zatuximab)、泽妥珠单抗(zenocutuzumab)、佐妥昔单抗(zolbetuximab)、恩美曲妥珠单抗(ado-trastuzumab emtansine)、雷星-阿奈妥单抗(anetumab ravtansine)、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、培塞利珠单抗(certolizumab pegol)、雷星-考妥昔单抗(coltuximab ravtansine)、玛汀-迪妥昔珠单抗(depatuxizumab mafodotin)、恩诺单抗-维汀(enapotamab vedotin)、吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)、维汀-格巴妥木单抗(glembatumumab vedotin)、维汀-纬拉妥珠单抗(iladatuzumab vedotin)、维汀-伊妥珠单抗(inatuzumab vedotin)、雷星-英妥昔单抗(indatuximab ravtansine)、维汀-英度妥单抗(indusatumab vedotin)、维汀-利法妥珠单抗(lifastuzumab vedotin)、赛坦-利洛托单抗(lilotomab satetraxetan)、莫星-洛沃妥珠单抗(lorvotuzumab mertansine)、维汀-罗妥昔珠单抗(losatuxizumabvedotin)、培戈-鲁利珠单抗(lulizumab pegol)、索星-米妥昔单抗(mirvetuximabsoravtansine)、恩星-那妥昔单抗(naratuximab emtansine)、尼妥珠单抗奥唑米星(notuzumab ozogamicin)、维汀-泊洛妥珠单抗(polatuzumab vedotin-piiq)、特司林-洛伐妥珠单抗(rovalpituzumab tesirine)、戈沙妥珠单抗(sacituzumab govitecan)、维汀-沙马妥单抗(samrotamab vedotin)、维汀-特立妥珠单抗(telisotuzumab vedotin)、德鲁替康-曲妥珠单抗(trastuzumab deruxtecan)和西莫白介素单抗(tucotuzumabcelmoleukin)。抗体还包括能够结合到其对应抗原的抗体片段，诸如Fab、(Fab)2或单链抗体。
尺寸为10nm至50nm的纳米颗粒倾向于从血液循环进入正常组织和靶组织两者。
尺寸为50nm至300nm的纳米颗粒优先进入肿瘤或炎症组织。由于较小纳米颗粒的聚集，大的纳米颗粒(500nm至999nm)或微米级(1000nm至5000nm)颗粒可导致毒性，这是因为大的纳米颗粒通常被位于肝脏、肺部和骨髓中的网状内皮系统(RES)(也称为单核吞噬系统(MPS))有效地吸收。这可降低纳米颗粒药物对期望疾病病变的功效并导致潜在的毒性。
本发明人已发现一种包含EGCG和用于靶向递送至靶组织的药物试剂的纳米颗粒胶束组合物，其中至少70％的纳米颗粒具有介于50nm至300nm之间的直径，并且纳米颗粒的尺寸分布仅具有一个主峰，该主峰含有所有颗粒中的超过90％。本发明人还发现了一种用于制备此种纳米颗粒组合物的方法。
本发明涉及一种包含纳米颗粒的纳米颗粒组合物，该纳米颗粒具有：(a)内芯，该内芯包含低聚(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(OEGCG)；(b)外芯，该外芯包含PEG-EGCG缀合物；和(c)药物分子，该药物分子包封在该内芯中；其中至少70％的纳米颗粒具有介于50nm至300nm之间的直径，并且纳米颗粒的尺寸分布仅具有一个主峰，该主峰包含所有颗粒中的超过90％。
图1中示出本发明的纳米颗粒的结构。
在一个实施方案中，至少80％或至少85％或至少90％或至少95％的纳米颗粒具有介于50nm至300nm之间的直径。
在一个实施方案中，纳米颗粒组合物中的中值纳米颗粒直径介于50nm至250nm、50nm至200nm、80nm至200nm、100nm至200nm或50nm至150nm之间。
在一个实施方案中，纳米颗粒的尺寸分布仅显示一个主(且窄)峰，该主峰含有所有颗粒中的超过80％、超过85％、超过90％、超过95％或超过98％。
在一个实施方案中，蛋白质药物为曲妥珠单抗，并且纳米颗粒组合物中至少80％或至少90％的纳米颗粒具有介于50nm至300nm之间的直径。纳米颗粒组合物中的中值纳米颗粒直径介于60nm至200nm之间。
在一个实施方案中，蛋白质药物为IL-12，并且至少75％的纳米颗粒具有介于50nm至300nm之间的直径。纳米颗粒的中值直径介于60nm至200nm之间。
在一个实施方案中，蛋白质药物为抗CD3，并且至少80％或至少90％的纳米颗粒具有介于50nm至300nm之间的直径。中值纳米颗粒直径介于60nm至200nm之间。
在一个实施方案中，蛋白质药物为IFN-α，并且至少80％或至少90％的纳米颗粒具有介于50nm至300nm之间的直径。中值纳米颗粒直径介于60nm至200nm之间。
本发明的纳米颗粒组合物具有直径为50nm至300nm的大部分颗粒尺寸，其中OEGCG、PEG-EGCG和药物分子通过疏水相互作用保持在一起。纳米颗粒组合物在亲水性环境(诸如血液循环)中稳定，而在疏水性环境(诸如肿瘤组织)中解离。由于炎症和其他过度活性(诸如快速、不受控制的肿瘤生长)，纳米颗粒组合物可选择性地从血管扩散到血管渗漏的周围组织。由于纳米颗粒组合物的尺寸，其被限制进入血管渗漏较少的正常组织。一旦纳米颗粒复合物进入疏水性组织，其解离并释放纳米复合物中的其活性组分OEGCG、PEG-EGCG和药物分子。游离的活性组分在癌症延缓中恢复它们的生物活性。纳米颗粒中的活性组分具有更长的循环半衰期，并起到缓释机制的作用，这进一步降低了药物剂量需求。因此，进一步减少了对正常组织的任何不良作用。
用于制备纳米颗粒组合物的方法
本发明还涉及一种用于制备固定剂量组合药物的纳米颗粒组合物的方法。该方法经过优化，因此仅生产纳米级颗粒，其中至少70％的颗粒具有介于50nm至300nm之间的直径。
该方法包括以下步骤：(a)将药物分子与OEGCG和PEG-EGCG在水性溶液中混合；(b)通过截留分子量为8,000道尔顿至300,000道尔顿的膜过滤混合物，以去除小分子量分子并保留大分子量分子；以及(c)通过0.2μm至0.3μm膜过滤大分子量分子并收集滤液。
本发明的方法任选地在步骤(c)之后还包括冻干步骤(d)。步骤(d)：通过处于(i)约0℃至5℃、(ii)约-20℃至-30℃和(iii)约-60℃至-100℃逐步冷冻以及然后干燥来冻干滤液。
在步骤(a)中，将药物分子溶解在水性溶剂中，该水性溶剂诸如磷酸盐缓冲盐水、盐水、水、碳酸氢盐缓冲液、氧合血红蛋白缓冲液、bis-tris链烷烃、Tris-HCl、HEPES、组氨酸缓冲液、NP-40、RIPA(放射免疫沉淀试验缓冲液)、tricine、TES、TAPS、TAPSO、Bicine、MOPS、PIPES、二甲胂酸盐或MES。优选的溶剂为磷酸盐缓冲盐水、盐水或水。蛋白质药物浓度通常为0.01mg/ml至50mg/ml，优选0.05mg/ml至10mg/ml，更优选0.1mg/ml至5mg/ml。
将OEGCG、PEG-EGCG和任选的EGCG溶解在酮、乙腈、醇、醛、醚、乙酸酯、亚砜、苯、有机酸、酰胺、水性缓冲液及它们的任何组合中。优选的溶剂为醇、乙腈、亚砜、酰胺及它们的任何组合。OEGCG/EGCG和PEG-EGCG浓度通常独立地为0.001mg/ml至10mg/ml，优选0.005mg/ml至1mg/ml或0.1mg/ml至5mg/ml。
重要的是OEGCG相对于药物试剂是摩尔过量的。一般来讲，OEGCG中的EGCG与药物分子的摩尔比介于1-500∶1、2-500∶1、3-500∶1或5-500∶1之间，优选3-100∶1、5-100∶1或10-50∶1。通过OEGCG中的单体EGCG的摩尔数比药物分子的摩尔数来计算摩尔比。EGCG的摩尔过量确保大多数或所有药物试剂被OEGCG分子包封。在本发明的方法中，通过控制OEGCG与蛋白质的摩尔比来避免未包封的药物试剂，该未包封的药物试剂不会被选择性地分布至靶组织并会导致较低的功效和安全性问题。
将药物试剂、OEGCG和PEG-EGCG处于介于约0℃至60℃、优选0℃至45℃或0℃至37℃之间的温度混合1分钟至2天，优选1分钟至12小时。
在步骤(b)中，通过截留分子量介于8,000道尔顿至300,000道尔顿、优选8,000道尔顿至200,000道尔顿、8,000道尔顿至150,000道尔顿或8,000道尔顿至12,000道尔顿之间的膜过滤上述混合物，以去除小分子量分子并保留大分子量分子。超滤膜材料是选自由以下组成的组：纤维素(及其衍生物)、聚醚砜(PES)、聚四氟乙烯(PTFE)、尼龙、聚偏氟乙烯或聚偏二氟乙烯(PVDF)和聚丙烯(PP)；优选纤维素(及其衍生物)、PTFE和PVDF。
在超滤之前，将混合物任选地稀释在水性溶剂(诸如上文在步骤(a)中所述的那些溶剂)中。
超滤步骤(b)去除不想要的小分子量杂质，诸如未反应的OEGCG或EGCG，或反应副产物。这些杂质可降低药物功效和安全性。过量的未反应的OEGCG或EGCG也可导致单个纳米颗粒聚集成约1000nm尺寸的颗粒，这将降低功效并引起潜在的毒性。
在步骤(c)中，通过孔径为约0.2μm至0.3μm(诸如0.22μm)的膜过滤保留的大分子量分子，并收集滤液。这是为了去除不想要的大分子杂质，诸如巨型聚集体。这些聚集体由于其巨大的尺寸可从进入的组织中排出。这些聚集体降低了总体功效/安全性，并且对患者具有更高的诱导免疫原性的机会。大尺寸纳米颗粒也更容易被肝脏、肺部和更多不期望器官中的RES摄取。
步骤(c)的膜材料是选自由以下组成的组：纤维素(及其衍生物)、PES、PTFE、尼龙、PVDF和PP；优选纤维素(及其衍生物)、PES和PP。
在一个实施方案中，步骤(b)和(c)在步骤(d)之前重复至少一次，例如重复1次、2次、3次或4次，以有效地去除不想要的小分子杂质和大的聚集体。
在步骤(c)之后，将滤液储存在2℃至8℃，并稳定至少100天。
本发明的方法任选地在步骤(c)之后还包括冻干步骤(d)，以提供纳米颗粒组合物的长期稳定性。
在步骤(d)中，通过0.2μm至0.3μm膜过滤后收集的滤液首先通过在以下条件下逐步冷冻来冻干：(i)处于约0℃至5℃冷冻例如约1小时-3小时；(ii)处于约-25℃至-30℃冷冻例如约1小时-3小时；然后在(iii)处于-60℃至-100℃或-70℃至-100℃冷冻例如至少8小时。
冷冻后，将材料冻干1天至7天。
冷冻和冻干经常导致纳米颗粒形成复合物和聚集体。这些大颗粒可能太大而不能穿透血管并进入组织环境。因此，功效和安全性较低，并且免疫原性可增加。为了避免由冻干引起的这些变化，本发明的方法使用逐步冷冻方法，而不是连续冷冻方法(在冷冻期间逐渐且连续地降低温度)，以在冻干期间保持纳米颗粒尺寸。
药物组合物
本发明提供药物组合物，该药物组合物包含本发明的纳米颗粒组合物和任选的一种或多种药学上可接受的载体。对于片剂、粉剂或肠胃外制剂，药物组合物中的纳米颗粒组合物通常为约1％至90％、优选20％至90％或30％至80％。对于胶囊制剂，药物组合物中的纳米颗粒组合物通常为1％至100％、优选20％至100％、50％至100％或70％至100％。对于液体悬浮液制剂，药物组合物中的纳米颗粒组合物通常为1％至50％、5％至50％或10％至40％。
在一个实施方案中，药物组合物可以为诸如片剂、胶囊剂、颗粒剂、细颗粒剂、粉剂、悬浮液、贴剂、肠胃外剂、可注射剂等剂型。上述药物组合物可通过常规方法制备。
药学上可接受的载体是非活性成分，可由本领域技术人员使用常规标准来选择。药学上可接受的载体可含有多种成分，这些成分包括但不限于盐水和水性电解质溶液；离子和非离子渗透剂，诸如氯化钠、氯化钾、甘油和葡萄糖；pH调节剂和缓冲液，诸如氢氧化物、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、硼酸盐和三乙醇胺的盐；抗氧化剂，诸如亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、硫代亚硫酸盐、抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、生育酚和棕榈酸抗坏血酸酯的盐、酸和/或碱；表面活性剂，诸如卵磷脂和磷脂，包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇；泊洛沙姆(poloxamer)和泊洛沙胺(poloxamine)；聚山梨醇酯，诸如聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯60和聚山梨醇酯20；聚醚，诸如聚乙二醇和聚丙二醇；聚乙烯，诸如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP、聚维酮)；纤维素衍生物，诸如甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素及它们的盐；石油衍生物，诸如矿物油和白凡士林；脂肪，诸如羊毛脂、花生油、棕榈油、大豆油；甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯；多糖，诸如葡聚糖；和糖胺聚糖，诸如透明质酸钠。此类药学上可接受的载体可使用众所周知的防腐剂进行防腐以防止细菌污染，这些防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、乙二胺四乙酸及其盐、苄索氯铵、氯己定、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯、硫柳汞和苯乙醇，或者可配制为供单次或多次使用的非防腐制剂。
例如，活性化合物的片剂、胶囊剂或肠胃外制剂可含有不具有生物活性且不与活性化合物反应的其他赋形剂。片剂或胶囊剂的赋形剂可包括填充剂、粘合剂、润滑剂和助流剂、崩解剂、润湿剂和释放速率调节剂。片剂或胶囊剂的赋形剂的示例包括但不限于羧甲基纤维素、纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、刺梧桐树胶、淀粉、黄蓍胶、明胶、硬脂酸镁、二氧化钛、聚(丙烯酸)和聚乙烯吡咯烷酮。
例如，片剂制剂可含有非活性成分，诸如胶体二氧化硅、交聚维酮、羟丙甲纤维素、硬脂酸镁、微晶纤维素、聚乙二醇、淀粉羟乙酸钠和二氧化钛。胶囊制剂可含有非活性成分，诸如明胶、硬脂酸镁和二氧化钛。粉末口服制剂可含有非活性成分，诸如硅胶、苯甲酸钠、柠檬酸钠、蔗糖和黄原胶。
使用方法
本发明涉及一种制造用于治疗癌症和其他疾病的组合药物的方法。该方法包括将有效量的本发明的纳米颗粒组合物施用给对其有需要的受试者的步骤。如本文所用，″有效量″是通过改善病理状况或减少疾病症状而有效治疗疾病的量。
本发明的药物组合物可通过部分施用和全身施用来施加。部分施用包括局部施用。全身施用包括口服施用、肠胃外施用(诸如静脉内施用、肌内施用、皮下施用或直肠施用)和其他全身施用途径。在全身施用中，活性化合物首先到达血浆，然后分布到靶组织中。肠胃外施用(诸如静脉内弹丸式注射或静脉内输注)和口服施用是本发明纳米颗粒组合物的优选施用途径。
在一个实施方案中，纳米颗粒组合物中的蛋白质药物为抗HER2抗体(诸如曲妥珠单抗)，其获批用于治疗由HER2受体通路引起的乳腺癌。仅20％的乳腺癌患者对曲妥珠单抗治疗有应答。其余(80％)的乳腺癌是由替代信号通路的突变引起的。本发明纳米颗粒组合物中的OEGCG和PEG-EGCG可调节乳腺癌的替代信号通路，以治疗80％的为曲妥珠单抗无应答者的乳腺癌患者。多靶标免疫纳米载体组合物(MINC)-曲妥珠单抗也适用于治疗膀胱癌、脑癌、子宫颈癌、胆管癌、结肠直肠癌、食管癌、胆囊癌、胃癌、头颈癌、肝细胞癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌和子宫癌。
在一个实施方案中，纳米颗粒组合物中的蛋白质药物为IL-12，包括临床试验中的那些药物，诸如NHS-IL-12和rHU-IL-12。已知，IL-12广泛影响关键免疫细胞，包括CD4+T、CD8+T、B和NK细胞。然而，由于IL-12对人体免疫机制的高度影响，IL-12毒性很大。MINC-IL-12可显著降低其毒性，同时增强其功效，以允许将IL-12用作许多癌症的广谱免疫疗法。MINC-IL-12适用于治疗膀胱癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、儿童期癌、结肠直肠癌、食管癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌和子宫癌。MINC-IL12可与另一种癌症免疫治疗剂(诸如抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4、抗TIGIT、抗LAG3或抗TIM3)组合以改善治疗功效。
在一个实施方案中，纳米颗粒组合物中的蛋白质药物为抗CD3抗体，包括替利珠单抗(teplizumab)、莫罗单抗(muromonab)、奥昔珠单抗(otelixizumab)和维西珠单抗(visilizumab)。1型糖尿病是由T细胞攻击胰腺β细胞引起的自身免疫性疾病。抗CD3的毒性很大，临床试验中有严重的不利反应。MINC-抗CD3可优先将抗CD3运载至胰腺β细胞并使其低暴露于正常细胞，这提供了增强的功效和安全性。另外，EGCG具有增强胰腺β细胞增殖并帮助恢复其在胰岛素分泌中的功能的功能。MINC-抗CD3适用于治疗类风湿性关节炎、炎症性肠病、银屑病和其他一些自身免疫性疾病。
在一个实施方案中，纳米颗粒组合物中的蛋白质药物为α-干扰素。OEGCG和PEG-EGCG可激活T细胞并抑制抗PD-L1以帮助癌症患者更好地对癌症免疫疗法有应答。IFN-α还可诱导IFN-γ的产生并进一步抑制肿瘤生长。纳米颗粒可将活性成分OEGCG、PEG-EGCG和IFN-α递送至肿瘤，而不是正常组织，以增强IFN-α的功效并降低其毒性。MINC-IFN-α适用于需要增强对免疫疗法的应答的大多数癌症类型，包括膀胱癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、儿童期癌、结肠直肠癌、食管癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌和子宫癌。
在一个实施方案中，纳米颗粒组合物中的蛋白质药物为抗CD71。抗CD71靶向CD71，CD71也称为转铁蛋白受体蛋白1，是人类白血病和淋巴瘤的靶标。
在一个实施方案中，纳米颗粒组合物中的蛋白质药物为抗EGFR。抗EGFR是表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂药物，用于治疗转移性结肠直肠癌、头颈癌和更多EGFR阳性癌症。
在一个实施方案中，纳米颗粒组合物中的蛋白质药物为抗Tau。Tau蛋白引起神经系统的病理和痴呆，诸如阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)和帕金森病(Parkinson′sdisease)。抗Tau可经由靶向Tau蛋白用于治疗神经系统疾病。
在一个实施方案中，纳米颗粒组合物中的蛋白质药物为抗VEGF。抗VEGF用于阻断血管内皮生长因子，用于治疗某些癌症和年龄相关性黄斑变性。
在一个实施方案中，纳米颗粒组合物中的蛋白质药物为IFN-γ。IFN-γ是对抵抗病毒、一些细菌和原生动物感染的先天免疫和适应性免疫至关重要的细胞因子。IFN-γ也可用于治疗癌症。
在一个实施方案中，纳米颗粒组合物中的蛋白质药物为IL-2。IL-2增加了自然杀伤细胞和细胞毒性T细胞的细胞杀伤活性。IL-2可用于治疗癌症，包括恶性黑素瘤和肾细胞癌。
在一个实施方案中，纳米颗粒组合物中的蛋白质药物为IL-6。IL-6是同时作为促炎细胞因子和抗炎肌细胞因子的白介素。
在一个实施方案中，纳米颗粒组合物中的蛋白质药物为IL-15。IL-15是与白介素-2(IL-2)结构相似的细胞因子。IL-15已显示可增强CD8+T细胞的抗肿瘤免疫。
在一个实施方案中，纳米颗粒组合物中的蛋白质药物为IL-21。IL-21对免疫系统的细胞具有调控作用，这些细胞包括自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T细胞，它们能破坏病毒感染或癌细胞。
在一个实施方案中，纳米颗粒组合物中的蛋白质药物为TRAIL。TRAIL是作为配体发挥作用的蛋白质，可诱导称为细胞凋亡的细胞死亡过程。
在一个实施方案中，纳米颗粒组合物中的蛋白质药物为IL-21。IL-21通过持续和增加的CD8+T细胞应答来实现持久的抗肿瘤免疫，从而具有抗肿瘤作用。
在一个实施方案中，在纳米颗粒组合物中使用蛋白质，诸如BSA。BSA是源自牛的血清白蛋白。其通常用作实验室实验中的蛋白浓度标准。
纳米颗粒组合物的给药是基于用于治疗特定疾病的蛋白质药物的已知剂量和受试者状况。例如，对于治疗成年人的乳腺癌，经由IV输注施用曲妥珠单抗4mg/kg至8mg/kg，每周一次，持续52周。MINC-曲妥珠单抗的有效剂量在相同的剂量范围内，给药频率较低，为每12周至16周一次，持续52周。
对于治疗1型糖尿病，通过IV输注施用抗CD31μg/kg至20μg/kg达14天疗程，在每个人的一生中仅施用一次14天疗程，因药物毒性而没有重复给药。MINC-抗CD3在相同剂量范围内的有效剂量按每年3-5天疗程施用，每年可重复给药一次。
对于治疗黑素瘤，干扰素-α诱导为以IV输注2000万IU/m2，每周连续5天，持续4周。MINC-干扰素-α的有效剂量在相同的剂量范围内，以每周1天施用2周，以实现相同的功效以及降低的毒性。
对于治疗肾癌，每天三次施用600,000国际单位/kg(0.037mg/kg)的IL-12，最多14剂。休息9天后，在耐受的情况下，重复该计划14剂。MINC-IL-12在相同剂量范围内的有效剂量为每天施用1剂，3天总共9剂。
本发明可用于人类医学和兽医学。本发明可用于治疗人类和非人类动物。例如，本发明可用于治疗哺乳动物受试者，诸如人类、马、猪、猫和狗。
以下实施例进一步说明本发明。这些实施例仅旨在说明本发明，并且不应被解释为限制性的。
实施例
表1列出实施例中使用的原材料的供应商。
表1
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OEGCG和PEG-dEGCG是根据WO2006/12400的[0099]和[00102]合成的。
实施例1.用于制备MINC-曲妥珠单抗纳米颗粒的方法
根据以下方案制备MINC(多靶标免疫纳米载体组合)-曲妥珠单抗纳米颗粒：
1.将5mg曲妥珠单抗(34.4nmol)溶液在10ml的PBS中处于37℃孵育1小时。
2.加入16.7μl的OEGCG(30mM，在DMSO中，501nmol)。
3.加入65μl的PEG-EGCG(16mM，在DMSO中)。
4.将混合物处于25℃孵育3小时。
5.将液体转移到10K MWCO离心式过滤单元中。
6.离心以将液体体积减少至1ml。
7.加入9ml的0.9％NaCl并混合。
8.将步骤6和7再重复3次。
9.通过0.22μm膜过滤。
10.转移到冻存管，在以下条件下逐步冷冻：处于4℃冷冻1小时，处于-30℃冷冻1小时，然后处于80℃过夜。
11.冻干3天。
通过DLS(Malvem Zetasizer Nano ZS)测量纳米颗粒尺寸。最终产物示于图2中，中值纳米颗粒尺寸为102.1nm。标准偏差为41.1nm。曲妥珠单抗与OEGCG的摩尔比为1∶15。100％的纳米颗粒分布在50nm至300nm内。
实施例2.用于制备MINC-IL-12纳米颗粒的方法
根据以下方案制备MINC-IL-12纳米颗粒：
1.将0.5mg的IL-12(8.7nmol)溶液在1ml的PBS中处于37℃孵育1小时。
2.加入5μl的OEGCG(30mM，在DMSO中，150nmol)。
3.加入10μl的PEG-EGCG(16mM，在DMSO中)。
4.将混合物处于25℃孵育15小时。
5.将液体转移到10K MWCO离心式过滤单元中。
6.离心以将液体体积减少至0.1ml。
7.加入0.9ml的0.9％NaCl并混合。
8.将步骤6和7再重复3次。
9.通过0.22μm膜过滤。
10.转移到冻存管，在以下条件下逐步冷冻：处于4℃冷冻1小时，处于-30℃冷冻1小时，然后处于-80℃过夜。
11.冻干3天。
通过DLS(Malvem Zetasizer Nano ZS)测量纳米颗粒尺寸。最终产物示于图3中，中值纳米颗粒尺寸为74.8nm。IL-12与OEGCG的摩尔比为1∶17。90％的颗粒具有50nm至300nm的期望分子尺寸。
实施例3.用于制备MINC-抗CD3纳米颗粒的方法
根据以下方案制备MINC-抗CD3纳米颗粒：
1.将0.5mg的抗CD3(3.43nmol)在1ml的PBS中处于37℃孵育1.0小时。
2.加入6.7μl的OEGCG(30mM，在DMSO中，201nmol)。
3.加入26.6μl的PEG-EGCG(16mM，在DMSO中)。
4.将混合物处于25℃孵育3小时。
5.将液体转移到10K MWCO离心式过滤单元中。
6.离心以将液体减少至0.1ml。
7.溶于0.9ml的0.9％NaCl中。
8.将步骤6和7再重复3次。
9.用0.22μm膜过滤3次。
10.转移到冻存管，在以下条件下逐步冷冻：处于4℃冷冻1小时，处于-30℃冷冻1小时，然后处于80℃过夜。
11.冻干3天。
通过DLS(Malvem Zetasizer Nano ZS)测量纳米颗粒尺寸。最终产物示于图4中，中值纳米颗粒尺寸为90.24nm。标准偏差为31.7nm。抗CD3与OEGCG的摩尔比为1：59。超过95％的纳米颗粒分布在50nm至300nm内。
实施例4.用于制备MINC-INFα纳米颗粒的方法
根据以下方案制备MINC-INFα纳米颗粒：
1.将0.067mg(3.48nmol)的IFN-α在1ml的1x PBS中处于37℃孵育80分钟。
2.加入1.67μl的OEGCG(30mM，在DMSO中，50.1nmol)。
3.加入6.5μl的PEG-EGCG(16mM，在DMSO中)。
4.将混合物处于25℃孵育3小时。
5.将液体转移到10K MWCO离心式过滤单元中。
6.离心以将液体减少至0.1ml。
7.溶于0.9ml的0.9％NaCl中。
8.将步骤6和7再重复3次。
9.用0.22μm膜过滤。
10.转移到冻存管，在以下条件下逐步冷冻：处于4℃冷冻1小时，处于-30℃冷冻1小时，然后处于80℃过夜。
11.冻干3天。
通过DLS(Malvem Zetasizer Nano ZS)测量纳米颗粒尺寸。最终产物示于图5中，中值纳米颗粒尺寸为105.3nm。标准偏差为50.43nm。INFα与OEGCG的摩尔比为1∶14。超过80％的纳米颗粒分布在50nm至300nm内。
实施例5.使用不同的曲妥珠单抗与OEGCG摩尔比制备的MINC-曲妥珠单抗纳米颗 粒的比较
根据实施例1制备MINC-曲妥珠单抗纳米颗粒(图6B)。根据实施例1制备MINC-曲妥珠单抗纳米颗粒(图6A)，不同的是在步骤2中加入3.34μl的OEGCG(30mM，在DMSO中，100.2nmole)。图6B中加入16.7μl的OEGCG(30mM，在DMSO中，501nmole)。图6A和图6B的纳米颗粒尺寸分布非常不同。结果表明，当蛋白质与OEGCG(EGCG单位)的摩尔比从1∶15(图6B)变为1：3(图6A)时，纳米颗粒尺寸分布变为多个峰。另外，图6B中的主峰(峰1)的中值尺寸为164.2nm(94.8％强度)，而图6A中的主峰(峰1)的中值尺寸为267.7nm(68.0％强度)。
实施例6.具有或不具有10K分子量超滤制备的MINC-曲妥珠单抗纳米颗粒的比较
根据实施例1制备MINC-曲妥珠单抗纳米颗粒(图7B)。根据实施例1制备MINC-曲妥珠单抗纳米颗粒(图7A)，不同的是不使用10kDa MWCO离心过滤(步骤5-8)。结果显示，在没有10kDa MWCO超滤的情况下，纳米颗粒尺寸分布变为多个峰(图7A)。另外，图7B中的主峰(峰1)的中值尺寸为119.7nm(98.3％强度)，而图7A中的主峰(峰1)的中值尺寸为130.4nm(70.8％强度)。
实施例7.具有或不具有0.22μm过滤制备的MINC-曲妥珠单抗纳米颗粒的比较
根据实施例1制备MINC-曲妥珠单抗纳米颗粒(图8B)。根据实施例1制备纳米颗粒(图8A)，不同的是没有0.22μm过滤(步骤9)。使用DLS(Malvem Zetasizer Nano ZS)测量具有0.22μm膜过滤(图8B)和不具有0.22μm膜过滤(图8A)的MINC-曲妥珠单抗纳米颗粒的尺寸。使用0.22μm过滤器(图8B)，去除不期望的纳米颗粒(大于300nm)，并且提高了纯度。介于50nm至300nm之间的纳米颗粒尺寸分布从75.7％(图8A)改善为100％(图8B)。
实施例8.使用逐步冷冻与用于冻干的其他冷冻方法制备的曲妥珠单抗纳米颗粒 的比较
在图9中，根据实施例1或使用步骤10的不同步骤制备MINC-曲妥珠单抗纳米颗粒。在步骤10中，在(i)逐步冷冻、(ii)以-1℃/分钟连续冷冻至-80℃和(iii)处于-80℃的一步(立即冷冻)下，使用DLS(Malvern Zetasizer Nano ZS)测量MINC-曲妥珠单抗纳米颗粒的尺寸(参见图9)。在连续冷冻和一步冷冻程序中，在具有或不具有冷冻容器(-1℃/分钟，Thermo Scientific)的情况下将样品置于-80℃。在逐步冷冻中，将样品置于4℃1小时，置于-30℃1小时，然后转移至-80℃过夜。结果显示，逐步冷冻程序(4℃、-30℃、-80℃)保留MINC-曲妥珠单抗的尺寸，而连续冷冻或立即冷冻显著增加了冻干后的MINC-曲妥珠单抗的尺寸(图9)。
实施例9.MINC-曲妥珠单抗纳米颗粒的生物活性
根据实施例1制备MINC-曲妥珠单抗纳米颗粒。在图10中，将冻干的MINC-曲妥珠单抗用磷酸盐缓冲盐水(PBS)重构并用于BT474异种移植小鼠模型(每组n＝7-10)中的体内肿瘤抑制测定。对于BT474异种移植小鼠模型，向Balb/裸小鼠皮下注射17β-雌二醇粒料(0.72mg，60天释放)。第二天，向每只小鼠皮下注射8x106个BT474细胞的悬浮液(在100μL的Matrigel中)。在进行任何治疗之前，让肿瘤生长2周。肿瘤注射后两周，向小鼠静脉注射药物，每周两次，持续4周。将小鼠分为3个治疗组，分别用曲妥珠单抗(2.5mg/kg)、MINC曲妥珠单抗(相当于制剂开始时的2.5mg/kg曲妥珠单抗)和PBS作为媒介物对照。使用卡尺通过长度(l)和宽度(w)测量肿瘤尺寸。肿瘤体积(V)计算为V＝lw2/2，每周两次，并在第一次测量时标准化为肿瘤尺寸，如以下所述(W.P.McGuire等人，《新英格兰医学杂志》(N.Engl.J.Med.)，1996年，344(1)，1268)。结果显示，在整个制备过程中成功地保留了抗癌活性，并且MINC-曲妥珠单抗纳米颗粒的活性优于曲妥珠单抗。
实施例10.用于制备MINC-抗CD71纳米颗粒的方法
根据以下方案制备MINC-抗CD71纳米颗粒：
1.将0.0625mg的抗CD71(0.42pmol)在0.5ml的PBS中处于37℃孵育1.0小时。
2.加入5μl的OEGCG(1.25mM，在DMSO中，6.25pmol)。
3.加入10μl的PEG-EGCG(1.1mM，在DMSO中)。
4.将混合物处于25℃孵育3小时。
5.将液体转移到10K MWCO离心式过滤单元中。
6.离心以将液体减少至0.1ml。
7.溶于0.9ml的0.9％NaCl中。
8.将步骤6和7再重复1次。
9.用0.22μm膜过滤。
10.转移到冻存管，在以下条件下逐步冷冻：处于4℃冷冻1小时，处于-30℃冷冻1小时，然后处于-80℃过夜。
11.冻干3天。
通过DLS(Anton Paar，Litesizer 500)测量纳米颗粒尺寸。最终产物示于图11中，中值纳米颗粒尺寸为106.33nm。标准偏差为17.34nm。抗CD71与OEGCG的摩尔比为1∶15。超过95％的纳米颗粒分布在50nm至300nm内。
实施例11.用于制备MINC-抗EGFR纳米颗粒的方法
根据以下方案制备MINC-抗EGFR纳米颗粒：
1.将0.0625mg的抗EGFR(0.42pmol)在0.5ml的PBS中处于37℃孵育1小时。
2.加入5μl的OEGCG(5mM，在DMSO中，25pmol)。
3.加入10μl的PEG-EGCG(4.4mM，在DMSO中)。
4.将混合物处于25℃孵育3小时。
5.将液体转移到10K MWCO离心式过滤单元中。
6.离心以将液体减少至0.1ml。
7.溶于0.9ml的0.9％NaCl中。
8.将步骤6和7再重复1次。
9.用0.22μm膜过滤。
10.转移到冻存管，在以下条件下逐步冷冻：处于4℃冷冻1小时，处于-30℃冷冻1小时，然后处于-80℃过夜。
11.冻干3天。
通过DLS(Anton Paar，Litesizer 500)测量纳米颗粒尺寸。最终产物示于图12中，中值纳米颗粒尺寸为80.57nm。标准偏差为19.52nm。抗EGFR与OEGCG的摩尔比为1：60。超过95％的纳米颗粒分布在50nm至300nm内。
实施例12.用于制备MINC-抗Tau纳米颗粒的方法
根据以下方案制备MINC-抗Tau纳米颗粒：
1.将0.0625mg的抗Tau(0.42pmol)在0.5ml的PBS中处于37℃孵育1.0小时。
2.加入5μl的OEGCG(5mM，在DMSO中，25pmol)。
3.加入10μl的PEG-EGCG(4.4mM，在DMSO中)。
4.将混合物处于25℃孵育3小时。
5.将液体转移到10K MWCO离心式过滤单元中。
6.离心以将液体减少至0.1ml。
7.溶于0.9ml的0.9％NaCl中。
8.将步骤6和7再重复1次。
9.用0.22μm膜过滤。
10.转移到冻存管，在以下条件下逐步冷冻：处于4℃冷冻1小时，处于-30℃冷冻1小时，然后处于-80℃过夜。
11.冻干3天。
通过DLS(Anton Paar，Litesizer 500)测量纳米颗粒尺寸。最终产物示于图13中，中值纳米颗粒尺寸为119.31nm。标准偏差为35.47nm。抗Tau与OEGCG的摩尔比为1∶60。超过95％的纳米颗粒分布在50nm至300nm内。
实施例13.用于制备MINC-抗VEGF纳米颗粒的方法
根据以下方案制备MINC-抗VEGF纳米颗粒：
1.将0.0625mg的抗VEGF(0.42pmol)在0.5ml的PBS中处于37℃孵育1小时。
2.加入5μl的OEGCG(1.25mM，在DMSO中，6.25pmol)。
3.加入10μl的PEG-EGCG(1.1mM，在DMSO中)。
4.将混合物处于25℃孵育3小时。
5.将液体转移到10K MWCO离心式过滤单元中。
6.离心以将液体减少至0.1ml。
7.溶于0.9ml的0.9％NaCl中。
8.将步骤6和7再重复1次。
9.用0.22μm膜过滤。
10.转移到冻存管，在以下条件下逐步冷冻：处于4℃冷冻1小时，处于-30℃冷冻1小时，然后处于-80℃过夜。
11.冻干3天。
通过DLS(Anton Paar，Litesizer 500)测量纳米颗粒尺寸。最终产物示于图14中，中值纳米颗粒尺寸为140.07nm。标准偏差为27.55nm。抗VEGF与OEGCG的摩尔比为1∶15。超过95％的纳米颗粒分布在50nm至300nm内。
实施例14.用于制备MINC-IFN-γ纳米颗粒的方法
根据以下方案制备MINC-IFN-γ纳米颗粒：
1.将0.0625mg的IFN-γ(3.98pmol)在0.5ml的PBS中处于37℃孵育1.0小时。
2.加入5μl的OEGCG(5mM，在DMSO中，25pmol)。
3.加入10μl的PEG-EGCG(4.4mM，在DMSO中)。
4.将混合物处于25℃孵育3小时。
5.将液体转移到10K MWCO离心式过滤单元中。
6.离心以将液体减少至0.1ml。
7.溶于0.9ml的0.9％NaCl中。
8.将步骤6和7再重复1次。
9.用0.22μm膜过滤。
10.转移到冻存管，在以下条件下逐步冷冻：处于4℃冷冻1小时，处于-30℃冷冻1小时，然后处于-80℃过夜。
11.冻干3天。
通过DLS(Anton Paar，Litesizer 500)测量纳米颗粒尺寸。最终产物示于图15中，中值纳米颗粒尺寸为55.61nm。标准偏差为9.47nm。IFN-γ与OEGCG的摩尔比为1：6。超过85％的纳米颗粒分布在50nm至300nm内。
实施例15.用于制备MINC-IL-2纳米颗粒的方法
根据以下方案制备MINC-IL-2纳米颗粒：
1.将0.0625mg的IL-2(4.06pmol)在0.5ml的PBS中处于37℃孵育1.0小时。
2.加入5μl的OEGCG(5mM，在DMSO中，25pmol)。
3.加入10μl的PEG-EGCG(4.4mM，在DMSO中)。
4.将混合物处于25℃孵育3小时。
5.将液体转移到10K MWCO离心式过滤单元中。
6.离心以将液体减少至0.1ml。
7.溶于0.9ml的0.9％NaCl中。
8.将步骤6和7再重复1次。
9.用0.22μm膜过滤。
10.转移到冻存管，在以下条件下逐步冷冻：处于4℃冷冻1小时，处于-30℃冷冻1小时，然后处于-80℃过夜。
11.冻干3天。
通过DLS(Anton Paar，Litesizer 500)测量纳米颗粒尺寸。最终产物示于图16中，中值纳米颗粒尺寸为114.2nm。标准偏差为24.37nm。IL-2与OEGCG的摩尔比为1：6。超过95％的纳米颗粒分布在50nm至300nm内。
实施例16.用于制备MINC-IL-6纳米颗粒的方法
根据以下方案制备MINC-IL-6纳米颗粒：
1.将0.0625mg的IL-6(2.85pmol)在0.5ml的PBS中处于37℃孵育1.0小时。
2.加入5μl的OEGCG(5mM，在DMSO中，25pmol)。
3.加入10μl的PEG-EGCG(4.4mM，在DMSO中)。
4.将混合物处于25℃孵育3小时。
5.将液体转移到10K MWCO离心式过滤单元中。
6.离心以将液体减少至0.1ml。
7.溶于0.9ml的0.9％NaCl中。
8.将步骤6和7再重复1次。
9.用0.22μm膜过滤。
10.转移到冻存管，在以下条件下逐步冷冻：处于4℃冷冻1小时，处于-30℃冷冻1小时，然后处于-80℃过夜。
11.冻干3天。
通过DLS(Anton Paar，Litesizer 500)测量纳米颗粒尺寸。最终产物示于图17中，中值纳米颗粒尺寸为134.98nm。标准偏差为26nm。IL-6与OEGCG的摩尔比为1：9。超过95％的纳米颗粒分布在50nm至300nm内。
实施例17.用于制备MINC-IL-15纳米颗粒的方法
根据以下方案制备MINC-IL-15纳米颗粒：
1.将0.0625mg的IL-15(4.66pmol)在0.5ml的PBS中处于37℃孵育1.0小时。
2.加入5μl的OEGCG(5mM，在DMSO中，25pmol)。
3.加入10μl的PEG-EGCG(4.4mM，在DMSO中)。
4.将混合物处于25℃孵育3小时。
5.将液体转移到10K MWCO离心式过滤单元中。
6.离心以将液体减少至0.1ml。
7.溶于0.9ml的0.9％NaCl中。
8.将步骤6和7再重复1次。
9.用0.22μm膜过滤。
10.转移到冻存管，在以下条件下逐步冷冻：处于4℃冷冻1小时，处于-30℃冷冻1小时，然后处于-80℃过夜。
11.冻干3天。
通过DLS(Anton Paar，Litesizer 500)测量纳米颗粒尺寸。最终产物示于图18中，中值纳米颗粒尺寸为77.6nm。标准偏差为13.18nm。IL-15与OEGCG的摩尔比为1：5。超过95％的纳米颗粒分布在50nm至300nm内。
实施例18.用于制备MINC-IL-21纳米颗粒的方法
根据以下方案制备MINC-IL-21纳米颗粒：
1.将0.0625mg的IL-21(4.40pmol)在0.5ml的PBS中处于37℃孵育1.0小时。
2.加入5μl的OEGCG(5mM，在DMSO中，25pmol)。
3.加入10μl的PEG-EGCG(4.4mM，在DMSO中)。
4.将混合物处于25℃孵育3小时。
5.将液体转移到10K MWCO离心式过滤单元中。
6.离心以将液体减少至0.1ml。
7.溶于0.9ml的0.9％NaCl中。
8.将步骤6和7再重复1次。
9.用0.22μm膜过滤。
10.转移到冻存管，在以下条件下逐步冷冻：处于4℃冷冻1小时，处于-30℃冷冻1小时，然后处于-80℃过夜。
11.冻干3天。
通过DLS(Anton Paar，Litesizer 500)测量纳米颗粒尺寸。最终产物示于图19中，中值纳米颗粒尺寸为126.59nm。标准偏差为42.65nm。IL-21与OEGCG的摩尔比为1：6。超过95％的纳米颗粒分布在50nm至300nm内。
实施例19.用于制备MINC-TRAIL纳米颗粒的方法
根据以下方案制备MINC-TRAIL纳米颗粒：
1.将0.0625mg的TRAIL(2.75pmol)在0.5ml的PBS中处于37℃孵育1.0小时。
2.加入5μl的OEGCG(5mM，在DMSO中，25pmol)。
3.加入10μl的PEG-EGCG(4.4mM，在DMSO中)。
4.将混合物处于25℃孵育3小时。
5.将液体转移到10K MWCO离心式过滤单元中。
6.离心以将液体减少至0.1ml。
7.溶于0.9ml的0.9％NaCl中。
8.将步骤6和7再重复1次。
9.用0.22μm膜过滤。
10.转移到冻存管，在以下条件下逐步冷冻：处于4℃冷冻1小时，处于-30℃冷冻1小时，然后处于-80℃过夜。
11.冻干3天。
通过DLS(Anton Paar，Litesizer 500)测量纳米颗粒尺寸。最终产物示于图20中，中值纳米颗粒尺寸为123.89nm。标准偏差为18.34nm。TRAIL与OEGCG的摩尔比为1：9。超过95％的纳米颗粒分布在50nm至300nm内。
实施例20.用于制备MINC-BSA纳米颗粒的方法
根据以下方案制备MINC-BSA纳米颗粒：
1.将0.5mg的BSA(0.42pmol)在1ml的PBS中处于37℃孵育1.0小时。
2.加入5μl的OEGCG(5mM，在DMSO中，25pmol)。
3.加入10μl的PEG-EGCG(4.4mM，在DMSO中)。
4.将混合物处于25℃孵育3小时。
5.将液体转移到10K MWCO离心式过滤单元中。
6.离心以将液体减少至0.1ml。
7.溶于0.9ml的0.9％NaCl中。
8.将步骤6和7再重复1次。
9.用0.22μm膜过滤。
10.转移到冻存管，在以下条件下逐步冷冻：处于4℃冷冻1小时，处于-30℃冷冻1小时，然后处于-80℃过夜。
11.冻干3天。
通过DLS(Anton Paar，Litesizer 500)测量纳米颗粒尺寸。最终产物示于图21中，中值纳米颗粒尺寸为100.57nm。标准偏差为27.12nm。BSA与OEGCG的摩尔比为1∶19。超过95％的纳米颗粒分布在50nm至300nm内。
本发明以及其制造和使用方式和方法现在以完整、清晰、简洁和确切的术语进行描述，以便使其所属领域的任何技术人员能够制造和使用本发明。应理解，前述内容描述了本发明的优选实施方案，并且可在不脱离如权利要求中所阐述的本发明的范围的情况下对其进行修改。为了特别指出并清楚地要求被视为发明性的主题，本说明书以以下权利要求书结束。

Claims (18)

1.一种包含纳米颗粒的纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒具有：(a)内芯，所述内芯包含低聚(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(OEGCG)；(b)外芯，所述外芯包含聚乙二醇-表没食子儿茶素没食子酸酯缀合物(PEG-EGCG)；和(c)药物分子，所述药物分子包封在所述内芯中；其中所述药物分子为抗体或细胞因子，至少70％的所述纳米颗粒具有介于50nm至300nm之间的直径，并且所述纳米颗粒的尺寸分布仅具有一个主峰，所述主峰含有所有所述颗粒中的超过90％。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中至少80％的所述纳米颗粒具有介于50nm至300nm之间的直径。
3.根据权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中至少90％的所述纳米颗粒具有介于50nm至300nm之间的直径。
4.根据权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒的中值直径为约50nm至250nm。
5.根据权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒的中值直径为约50nm至200nm。
6.根据权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒的尺寸分布仅具有一个主峰，所述主峰含有所有所述颗粒中的超过95％。
7.根据权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述抗体为单克隆抗体。
8.根据权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述抗体为抗HER2、抗CD71、抗EGFR、抗VEGF或抗Tau。
9.根据权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述细胞因子为干扰素、白介素、淋巴因子或肿瘤坏死因子。
10.根据权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述细胞因子为IL-12、IL-2、IL-6、IL-15、IL-21、IFN-α、IFN-γ或TRAIL。
11.一种用于制备根据权利要求1所述的纳米颗粒组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将药物蛋白分子与OEGCG和PEG-EGCG在水性溶液中混合，
(b)通过截留分子量为8,000道尔顿至300,000的膜过滤所述混合物，以去除小分子量分子并保留大分子量分子，以及
(c)通过0.2μm至0.3μm膜过滤所述大分子量分子并收集滤液。
12.根据权利要求11所述的方法，在步骤(c)之后还包括步骤(d)：
(d)通过处于(i)约0℃至5℃、(ii)约-20℃至-30℃和(iii)约-60℃至-100℃逐步冷冻以及然后干燥来冻干所述滤液。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中OEGCG中的所述EGCG与所述药物分子的摩尔比为5-100∶1。
14.根据权利要求13所述的方法，其中OEGCG中的所述EGCG与所述药物分子的摩尔比为10-50∶1。
15.根据权利要求11或12所述的方法，其中步骤(b)中的所述截留分子量为8,000道尔顿至12,000道尔顿。
16.根据权利要求11或12所述的方法，其中在步骤(d)之前将所述步骤(b)和(c)重复1次、2次、3次或4次。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述逐步冷冻处于(i)约0℃至5℃进行至少1小时，(ii)约-20℃至-30℃进行至少1小时，和(iii)-60℃至-100℃进行至少2小时。
18.一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求1所述的纳米颗粒组合物施用给对其有需要的受试者的步骤。
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