CN116648512A - 用于将物质递送至植物的方法、系统和介质 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于向植物递送物质，任选地化合物、载体或纳米材料的方法。该方法包括提供包含物质、载剂介质和至少一种气体的微气泡和/或纳米气泡的植物应用介质；以及将该植物应用介质应用于植物的部位。该物质进入植物的至少一个植物组织。该物质可以是用于诱导植物的表型、化学或生理学中的变化的一种或多种物质，例如表观遗传调节剂。本发明还涉及用于将物质递送至植物的系统，以及待应用于植物的介质。

Description

用于将物质递送至植物的方法、系统和介质

技术领域

本发明涉及用于将物质递送至植物的方法、系统和介质。更具体地，本发明包含用于培养植物的方法和相关系统，其包括提供纳米气泡和/或微气泡以及一种或多种物质的步骤，例如在植物根提供纳米气泡和物质，由此将该物质递送至植物细胞。该物质可以例如用于改变生理学和/或基因表达。

背景技术

植物产生大量的分子，其可以用作例如食物、药物、着色剂、调味品、食品添加剂或作物保护产品(例如杀真菌剂、杀线虫剂、杀虫剂等)。这些分子可能不是植物生存所必需的，因此仅在特定条件下表达和/或仅以低水平表达。通过植物化学合成此类分子可能是产生用于商业用途的分子的最高效的合成途径，例如当分子是复杂的和/或从植物中提取仍然是最好的供应来源时。

近年来，允许植物在温室或室外的受控条件下生长的无土生长，例如水培生长系统，已经有了相当大的发展。尽管已经提供了调节生长条件以允许来自植物的次级代谢产物的改善生产，但是需要进一步的改善。

EP2761993涉及使用人造光照射灯培养植物的方法，其中用红光然后用蓝光辐射植物持续预定的时间段，其中培养条件包括在营养液中提供溶解氧。

WO2017/156410讨论了提供组合物，其含有分散在液体载剂中的纳米气泡与另一种液体以产生富氧组合物，然后将该富氧组合物应用于植物根。此类组合物可以促进植物幼苗的发芽或生长。

EP2460582讨论了尺寸(直径)为几百nm至几十μm的超微气泡的产生以及可以提供此类气泡的方法。

EP3721979涉及带电纳米气泡分散液、其制造方法及其制造装置，以及使用纳米气泡分散液控制微生物和植物的生长速率的方法。

US2020/0045980讨论了由球孢枝孢(Cladosporium sphaerospermum)产生的一种或多种挥发性有机化合物在将植物暴露到挥发性有机化合物(VOC)之后提高植物中的至少一种生长特性的用途，其中将来自球孢枝孢的VOC提供至植物的顶部空间。球孢枝孢不需要与待处理的植物一起在土壤中生长；事实上，土壤中的此类生长可能导致对植物表型(生长、产率等)的影响降低。已经提供将VOC提供到植物细胞中的方法(Li Zhijian T.,Janisiewicz Wojciech J.,Liu Zongrang,Callahan Ann M.,Evans Breyn E.,JurickWayne M.,Dardick Chris.(2019).Exposure in vitro to an EnvironmentallyIsolated Strain TC09 of Cladosporium sphaerospermum Triggers Plant GrowthPromotion,Early Flowering,and Fruit Yield Increase.Frontiers in PlantScience,9 1959；但是需要替代的引入方法。

已经使用各种方法将DNA的短片段(反义寡核苷酸)或小RNA引入植物细胞中，但仅成功有限。

发明概述

没有适当的增氧，在水培溶液中生长的植物就会死亡。将氧气以纳米或微气泡的形式应用到水中，维持水中溶解氧的水平，使根系能够吸收营养物生长。迄今为止，纳米气泡在植物生长中的用途是提供氧气以促进生长或作为标准生长肥料组合物的添加剂。

本发明人已经确定与化合物或物质组合提供的纳米气泡和/或微气泡，其中化合物或物质附着到气泡、在气泡中或具有气泡的溶液中，允许化合物或物质在植物/植物细胞内的运输。纳米气泡和/或微气泡与在此类气泡中或附着到此类气泡，或者在具有这些纳米气泡和/或微气泡的溶液中的化合物或物质的组合可以用于改变例如基因表达。认为这为将外源性化合物或物质运输到植物中的细胞提供了有利方式。

特别地，认为本技术能够在生长期间实时地和在商业环境中控制植物基因表达。这使得作物生产具有更高的产率，通过植物产生新的化合物，在植物中产生产率增加的化合物，以及如“按需开花”的特征。例如，在植物中的化合物的产生可以通过操纵植物中潜在的和活性的生物合成途径来进行。

在第一方面，本发明提供了植物栽培系统，其包含：(i)微气泡和/或纳米气泡生成装置，其用于从至少一种气体生成微气泡和/或纳米气泡；(ii)植物应用介质，其包含物质、载剂介质和通过微气泡和/或纳米气泡生成装置由至少一种气体形成的微气泡和/或纳米气泡；和(iii)应用器系统，以将植物应用介质应用于植物的部位。

有利地，物质是能够诱导植物表型、基因型、化学或生理学变化的至少一种物质。

在一个实施方案中，应用器系统包含用于将植物的根和/或叶浸入植物应用介质中的系统。

在某些实例中，应用器系统包含用植物应用介质对植物喷洒、成雾或喷雾的系统。

任选地，至少一种气体包含二氧化碳，并且应用器系统包含用于对植物的叶喷雾的系统。

在某些实施方案中，应用器系统与微气泡和/或纳米气泡生成装置流体连通。

在一些实施方案中，系统包含水培植物栽培系统。

在某些优选的实施方案中，微气泡和/或纳米气泡生成装置是纳米气泡生成装置。

在一些实例中，物质是至少一种化合物、载体或纳米材料。

任选地，物质包含表观遗传调节剂。

在进一步的实例中，物质是选自以下的至少一种物质：挥发性有机化合物(VOC)；转基因、核酸、DNA、RNA、siRNA、反义寡核苷酸、合成或天然DNA或RNA、多达500个核苷酸，任选地多达200个核苷酸的合成或天然DNA或RNA；植物生长调节剂、赤霉素、生长素、脱落酸、细胞分裂素和乙烯；表观遗传调节剂；RNAi载体、表达载体、病毒载体、单多糖；多酚；萜类化合物；蛋白质或肽，任选地，多达150个氨基酸，任选地多达50个氨基酸的肽；纳米材料，任选地选自以下的纳米材料：脂质纳米颗粒、碳纳米管、铜纳米颗粒、铁或氧化铁纳米颗粒、锰或氧化锰纳米颗粒、二氧化钛纳米颗粒，以及锌或氧化锌纳米颗粒；和植物保护产品。

在一些优选的实例中，物质是选自VOC、RNA、siRNA、反义寡核苷酸、表观遗传调节剂、肽、RNAi载体、表达载体和病毒载体的至少一种物质。这些组不相互排斥。换句话说，该物质可以属于超过1个的这些组。

任选地，物质是选自以下的纳米材料：脂质纳米颗粒、碳纳米管、铜纳米颗粒、铁或氧化铁纳米颗粒、锰或氧化锰纳米颗粒、二氧化钛纳米颗粒，以及锌或氧化锌纳米颗粒。

植物纳米技术的应用Environ.Sci.:Nano,2020,7,2863–2874中综述，应进一步参考。

在第二方面，本发明提供了用于将物质递送至植物细胞的方法，该方法包括：(i)提供植物应用介质，该植物应用介质包含物质、载剂介质和至少一种气体的微气泡和/或纳米气泡；和(ii)将植物应用介质应用于植物的部位。

适当地，该物质是如上文关于本发明的第一方面所定义的物质。

任选地，将植物应用介质应用于植物的步骤包括将植物应用介质应用于植物的根和/或叶，任选地通过浸入、喷洒、成雾或喷雾。

有利地，将物质和微气泡和/或纳米气泡从植物的部位运输或转移到至少一个植物细胞，任选地，其中将物质和微气泡和/或纳米气泡从第一植物组织运输或转移到第二植物组织。

在第三方面，本发明提供了植物应用介质，其用于应用于植物的部位，该介质包含物质、载剂介质和至少一种气体的微气泡和/或纳米气泡。

在第四方面，本发明还提供了植物，其中介质已经应用于该植物的部位。

适当地，第三和第四方面的物质是如上文关于本发明的第一方面所定义的物质。

适当地，部位是植物的根或植物的叶。

在第五方面，本发明提供了用于通过将表观遗传调节剂递送至植物来诱导植物的表型、化学或生理学中的变化的方法，该方法包括：(i)提供植物应用介质，该植物应用介质包含物质、载剂介质和至少一种气体的微气泡和/或纳米气泡；和(ii)将植物应用介质应用于植物，由此该表观遗传调节剂进入植物的至少一种植物组织，并且在植物的表型、化学或生理学中诱导后续变化。

有利地，表观遗传调节剂选自：挥发性有机化合物(VOC)，任选地真菌、微生物或植物VOC；RNA、siRNA；反义寡核苷酸；肽；病毒载体；和植物生长调节剂。

在一些实例中，在该方法的使用中，表观遗传调节剂诱导DNA甲基化、RNA甲基化、组蛋白甲基化或组蛋白乙酰化，任选地在一个或多个开花基因座中。

在一些实例中，植物表观遗传调节剂是核酸。

在其他实例中，表观遗传调节剂是至少一种RNAi载体和/或表达载体。

在第六方面，本发明提供了用于编辑植物的基因的方法，该方法包括：(i)提供植物应用介质，该植物应用介质包含基因编辑物质、载剂介质和至少一种气体的微气泡和/或纳米气泡；和(ii)将植物应用介质应用于植物，由此该物质进入至少一个植物细胞。

有利地，该物质包含CRISPR/Cas9构建体，任选地其中该物质包含由农杆菌属(Agrobacterium)引入的CRISPR/Cas9构建体。

在某些实例中，该物质含有表达β葡糖苷酶基因的载体。

在第七方面，本发明提供了用于将植物或作物保护产品递送到植物中的方法，该方法包括：(i)提供植物应用介质，该植物应用介质包含物质、载剂介质和至少一种气体的微气泡和/或纳米气泡；和(ii)将植物应用介质应用于植物；其中该物质是至少一种植物或作物保护产品。

任选地，植物或作物保护产品是除草剂或农药(pesticide)，任选地是杀虫剂(insecticide)、杀线虫剂或杀螨剂。

在该方法的使用中，将植物或作物保护产品吸收到植物组织中，任选地叶或根组织。

在第八方面，本发明提供了用于将反义寡核苷酸递送至植物的方法，该方法包括：(i)提供植物应用介质，其包含物质、载剂介质和至少一种气体的微气泡和/或纳米气泡；和(ii)将植物应用介质应用于植物；其中该物质是至少一种反义寡核苷酸。

在该方法的使用中，反义寡核苷酸进入植物的至少一个植物细胞。

任选地，在该方法的使用中，将反义寡核苷酸植物应用介质应用于植物的根，进一步任选地，其中将该反义寡核苷酸从植物的根转移到植物的叶。

任选地，反义寡核苷酸是标记的反义寡核苷酸。

任选地，在本发明的任何方面，至少50％的所生成的微气泡和/或纳米气泡具有小于约1000nm，任选地小于约500nm，任选地约20nm，任选地在10nm至150nm的范围内，任选地2nm或更小的直径。

进一步任选地，在本发明的任何方面，100％或约100％的所生成的微气泡和/或纳米气泡具有小于约1000nm，任选小于约500nm，任选约20nm，任选在10nm至150nm的范围内，任选2nm或更小的直径

任选地，在本发明的任何方面，至少一种气体选自氧气、氮气、二氧化碳和空气。

任选地，在本发明的任何方面，纳米气泡使用电场生成。

有利地，在本发明的任何方面，所生成的纳米气泡维持稳定约2年或更长。

在本发明方法的某些实例中，该方法进一步包括预处理步骤，其中在应用介质之前，将植物的生根新枝在氧纳米气泡水中温育一至二天。

在本发明的方法的某些实例中，在植物生命周期中的任何时间，向植物提供纳米气泡水和改变基因表达的一种或多种物质的混合物，以实时诱导一种或多种表观遗传变化。

任选地，在本发明的任何方面，植物是大麻(Cannabis sativa)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、大麦(Hordeum vulgare)、烟草(Nicotiana tabacum)、莴苣(Lactuca sativa)或罗勒(Ocimum basilicum)。

适当地，纳米气泡和/或微气泡可以在液体介质中产生，例如液体生长介质、含糖溶液或水。

适当地，能够诱导植物的表型、基因型、化学或生理学中的变化的一种或多种物质是特定化合物，其可以用于以期望方式特异性增强植物。

适当地，该化合物可以改变生长，改变开花(例如提前开花/提供更早的繁殖)，改变作物生产力，例如果实产生(例如增加产率)。

适当地，该化合物可以增加由植物提供的初级或次级代谢物的量。

适当地，该化合物可以改善植物中必需营养物的吸收或可用性，以允许增加植物生长。

适当地，该化合物可能能够激活植物防御和/或刺激提供针对生物和非生物胁迫的保护的途径。

适当地，化合物或物质可以在微气泡和/或纳米气泡内，附着至微气泡和/或纳米气泡，或者可以与(不附着)微气泡和/或纳米气泡一起在溶液中或其组合。

认为先前的改善提高限于微气泡和/或纳米气泡提高仅在植物根的营养物(主要是氮、磷或钾)或基本肥料的摄取。认为没有任何关于微-纳米气泡进入植物并将化合物运输到植物细胞中，特别是植物的叶或地上部分中的植物细胞中的先前教导或描述。特别地，认为没有任何关于微气泡和/或纳米气泡增强遗传物质(例如核酸，诸如RNA、DNA、microRNA、RNAi、双链DNA或RNA片段等)的摄取和/或在摄取后增加此类遗传物质在植物内的转移(例如至植物的叶、开花部分或地上部分)的先前讨论。

通常认为氮、磷和钾对于植物生长是必需的。可以在用于植物的生长液中提供其他营养物，诸如矿物质，其包括例如钙、镁和铁。适当地，氮肥，诸如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、尿素、含氮石灰、硝酸钾、硝酸钙和硝酸钠；磷肥，诸如石灰的过磷酸钙和熔融磷酸镁；钾肥，诸如氯化钾和硫酸钾；以及矿物质，诸如钙、镁和铁，可以提供到植物生长溶液。适当地，正常植物生长所必需的营养物可以不涵盖在本文所用的术语“化合物”中。适当地，在本发明中，此类氮、磷和钾或矿物质诸如钙、镁和铁可以不被认为是能够诱导植物的表型、化学或生理学中的变化的一种或多种化合物。

适当地，待应用于植物的混合物可以进一步包含一种或多种进一步的成分，诸如表面活性剂、螯合剂、乳化剂、抗氧化剂、还原剂、pH和渗透缓冲剂。

适当地，可以选择核酸构建体，例如短干扰RNA(siRNA)、反义寡核苷酸、micro RNA等，以靶向负责植物中的通路的基因，例如负责在植物中产生次级代谢物的途径。可以选择任何适当的次级代谢物。

适当地，次级植物代谢物可以包含酚类、生物碱、皂苷、萜烯、脂类和碳水化合物。

适当地，酚类可以选自简单酚类、丹宁酸、香豆素、类黄酮、色酮和氧杂蒽酮(xanthones)、二苯乙烯(stilbene)和木脂素。

在某些优选的实例中，物质是至少一种反义寡核苷酸。

合适的植物生长调节剂可以选自生长素、细胞分裂素、乙烯、赤霉素、油菜素类固醇(brassinosteroid)、脱落酸或其他植物激素。例如，生长调节剂可以选自1-萘乙酸(NAA)、2,4-D,3-吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、麦草畏、毒莠定(picloram)、赤霉酸、6-苄基氨基嘌呤(BAP)、苄基腺嘌呤(BA)、2-iP、激动素、玉米素、二氢玉米素、噻苯隆(thidiazuron，TDZ)、metatopolin、乙烯、成花素、脱落酸(ABA)、油菜素类固醇(BR)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)、多胺、独脚金内酯(SL)和一氧化氮(NO)。

在某些实例中，植物生长调节剂是赤霉酸和/或DL-肉毒碱。

适当地，表观遗传调节剂可以选自甲基转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶和转移酶、胞嘧啶脱甲基化和DNA糖基化酶、甲基胞嘧啶结合蛋白、多梳和核染色质重塑蛋白(Polycomb and Chromatin-Remodeling Protein)。

适当地，表观遗传调节剂可以作为用于在植物中表达的核酸提供。

适当地，表观遗传调控可以由siRNA提供。

适当地，表观遗传调节可以由肽提供。

适当地，表观遗传调节剂可以是小分子表观遗传调节剂。

适当地，表观遗传调节剂可以选自5-氮杂胞苷(5-aza)和5-氮杂-2′-脱氧胞苷(aza-dC)、曲古抑菌素A(Trichostatin A)或磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine)。

适当地，肽可以选自表观遗传调节剂、植物防御肽/蛋白质、调控蛋白(例如适宜调节植物发育和生理过程的调控蛋白)、转录因子、开花相关蛋白等。

适当地，病毒载体可以选自基于例如马铃薯病毒X(PVX)、烟草脆裂病毒(TRV)、大麦条纹花叶病毒(BSMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)载体的RNA病毒载体，其能够通过靶向基因的编码序列或启动子/调控序列而快速诱导序列特异性基因沉默。

适当地，挥发性有机化合物可以选自具有低沸点和高蒸气压的小分子，并且可以是有机化合物，适当地是选自烃、萜烯、醇、羧酸和酯、酮或芳族化合物的合成有机化合物。

适当地，VOC可以合成产生。

适当地，VOC可以是植物VOC、真菌VOC、微生物VOC、植物VOC的组合、真菌VOC的组合或微生物VOC的组合，或植物VOC、真菌VOD和微生物VOC的至少两种的组合。

挥发性有机化合物(VOC)包含众多参与植物-微生物相互作用的信号分子(Junker,R.R.,and Tholl,D.(2013))。挥发性有机化合物介导植物-微生物界面相互作用。J.Chem.Ecol.39,810–825,Schulz-Bohm,K.,Martín-Sánchez,L.,and Garbeva,P.(2017.Microbial Volatiles:small molecules with an important role in intra-andinter-kingdom interactions.Front.Microbiol.8:2484)。

迄今，已在开花植物中描述了数千种VOC(Knudsen,J.T.,Eriksson,R.,Gershenzon,J.,andB.(2006).Diversity and distribution of floralscent.Bot.Rev.72,1–120)和microbes(Lemfack,M.C.,Gohlke,B.-O.,Toguem,S.M.T.,Preissner,S.,Piechulla,B.,and Preissner,R.(2018).mVOC 2.0:a database ofmicrobial volatiles.Nucleic Acids Res.46,D1261–D1265)。这些VOC主要包含萜类化合物、苯丙素类化合物/苯类化合物、脂肪酸和氨基酸衍生物(Dudareva,N.,Klempien,A.,Muhlemann,J.K.,and Kaplan,I.(2013).Biosynthesis,function and metabolicengineering of plant volatile organic compounds.New Phytol.198,16–32)。适当地，本发明可以利用此类植物VOC。

适当地，植物VOC可以选自β-石竹烯(β-caryophyllene)、乙苯(Ethylbenzene)、D-柠檬烯(D-Limonene)、Cosmene、Cosmene(同分异构体)、邻伞花烃(o-cymene)、甲基-庚烯酮(Methyl-heptenone)、(z)-3-己烯-1-醇((z)-3-hexen-1-ol)、戊基乙基甲醇(Amylethyl)、p-cymenene、戊基乙烯基甲醇(Amyl vinyl carbinol)、糠醛α-紫罗烯(Furfuralα-ionene)、二氢鸡蛋果素II(Dihydroedulan II)、二氢鸡蛋果素、β-芳樟醇(β-linalool)、(R)-(+)-薄荷呋喃(menthofuran)、5-甲基糠醛(5-methylfurfura)、α-紫罗酮(5-methylfurfura)、脱氢芳樟醇(Hotrienol)、反式-p-metha-二烯醇(trans-p-metha-2,8-dienol)、番红花醛(Safranal)、3-呋喃甲醇(3-furanmethanol)、四甲基-二氢化茚(Tetramethyl-indane)、乙基环戊烯醇酮(Ethyl cyclopentenolone)、p-menthen-1-ol、4,7-二苯并呋喃(4,7-dibenzofuran)、薄荷酮(Menthone)、樟脑(Camphor)、2-哌啶乌洛托品(2-piperidin methenamine)、1-(1-丁烯基)吡咯烷(1-(1-butenyl)pyrrolidine)、水杨酸甲酯(Methyl salicylate)、反式香叶醇(trans-geraniol)、特留山醇(Teresantalol)、β-大马酮(β-damascenone)、5-异丙基-2-甲基环戊-1-烯羧醛(5-isoproprenyl-2-methylcyclopent-1-enecarboxaldehyde)、菖蒲烯、胡椒烯酮(Piperitenone)、对伞花烃-8-醇(p-cymen-8-ol)、外切-2-羟基桉叶素(Exo-2-hydroxy cineole)、3,6-二甲基-苯基-1,4-二醇(3,6-dimethyl-phenyl-1,4-diol)、长叶蒎烯异薄荷二烯酮(LongipineneIsopiperitenone)、大马酮(同分异构体)、薄荷内酯(Mint lactone)、α、β-二氢-β-紫罗酮(α,β-dihydro-β-ionone)、Seudenone、二羟基-杜烯(Dihydroxy-durene)、Cinerolon、香芹酮(Cinerolon)、1-乙酰氧基-对薄荷-3-酮(1-acetoxy-p-menth-3-one)、2,6-二异丙基萘(2,6-diisopropyl naphthalene)、(萘衍生物)、丁子香酚(Eugenol)、4-乙基苯酚(4-ethylphenol)、百里香酚(Thymol)、2-乙酰-4-甲基苯酚(2-acetyl-4-methylphenol)、香芹酚(Carvacrol)。

适当地，真菌VOC可以选自镰刀菌属(Fusarium genus)或木霉属(Trichoderma)。腐生真菌，例如枝孢属(Cladosporium)和白粉寄生孢属(Ampelomyces)种(Kaddes A.,Fauconnier M.L.,Sassi K.,Nasraoui B.,Jijakli M.H.Endophytic fungal volatilecompounds as solution for sustainable agriculture.Molecules.2019；24:1065,Morath S.U.,Hung R.,Bennett J.W.Fungal volatile organic compounds:a reviewwith emphasis on their biotechnological potential.Fungal Biol.Rev.2012；26:73–83)。适当地，VOC可以选自N-1-萘基邻氨甲酰苯甲酸(N-1-naphthylphthalamic acid,NPA)。适当地，VOC或多种VOC可以由选自球孢枝孢登录号NRRL 67603、球孢枝孢登录号No.NRRL 8131和球孢枝孢登录号NRRL 67749的至少一种的所述球孢枝孢(C.sphaerospermum)提供。

适当地，VOC可以选自γ-广藿香烯(γ-patchoulene)、3-甲基丁醇(3-methylbutanol)、1-辛烯-3-醇(1-octen 3-ol)、2-十一烷酮(2-undecanone)、3-甲基丁酸酯(3-methylbutanoate)、2-甲基丁-1-醇(2-methylbutan-1-ol)、4-甲基-2-庚酮(4-methyl-2-heptanone)、乙硫氨酸(ethanethioic acid,)、2-甲基丙醛(2-methyl propanal)、乙酸乙烯酯(ethenyl acetate)、3-甲基-2-戊烯(3-methyl 2-pentanoene)、2-甲基丁酸甲酯(methyl 2-methylbutanoate)、3-甲基丁酸甲酯(methyl 3-methylbutanoate)、4-甲基3-戊烯-2-酮(4-methyl 3-penten-2-one)、3-甲基2-庚酮(3-methyl 2-heptanone)、月桂烯(myrcene)、萜品烯(terpinene)、水杨酸甲酯(methyl salicylate)、2-十五烷酮(2-pentadecanone)、1H-吡咯(1H-pyrrole)、丁酸乙酯(ethyl butanoate)、氯苯(chlorobenzene)、二甲基砜(dimethylsulfone)、2-辛酮(2-octanone)、5-十二酮(5-dodecanone)、3-甲基-2-戊酮(3-methyl-2-pentanone)、土臭味素(geosmin)、1-戊醇(1-pentanol)、2-甲基-1-丙醇(2-methyl-1-propanol)、二甲基2-辛醇(dimethyl 2-octanol)、二硫化物(disulfide)、苯乙酮(acetophenone)、2-异丁基-3-甲氧基吡嗪(2-isobutyl-3-methoxypyrazine)、2-庚酮(2-heptanone)、5-甲基-3-庚酮(5-methyl-3-heptanone)、2-甲基-2-丁醇(2-methyl-2-butanol)、2-戊醇(2-pentanol)、3-辛醇(3-octanol)、乙醇、茴香醚(anisole)、2-异丙基-3-甲氧基吡嗪(2-isopropyl-3-methoxypyrazine)、己醇、2-甲基呋喃(2-methylfuran)、3-甲基-1-丁醇(3-methyl-1-butanol)、2戊酮(2-pentanone)、3-辛酮(3-octanone)、乙基-1-己醇(2-ethyl-1-hexanol)、1-丁醇(1-butanol)、异丙醇(isopropanol)、己酮(2-hexanone)、甲基呋喃(3-methylfuran)、甲基-2-丁醇(3-methyl-2-butanol)、2-戊基呋喃(2-pentylfuran)、1-辛烯-3-醇(1-octen-3-ol)、2-乙基呋喃(2-ethylfuran)、2-丁酮(2-butanone)、异丙基(isopropyl)、3-己酮(3-hexanone)、乙酸盐(acetate)、异丁酸盐(isobutyrate)、2-甲基异龙脑(2-methylisoborneol)、异戊醛(isovaleraldehyde)、a-萜品醇(a-terpineol)、2-壬酮(2-nonanone)、乙基呋喃(ethylfuran)、2r,3r-丁二醇(2r,3r-butanediol)、2-甲基-1-丁醇(2-methyl-1-butanol)、柠檬酸(citric acid)、1-辛醇(1-octanol)、Nod因子(Nodfactor)、类黄酮(flavonoid)、strigalactone，或其任何组合或衍生物。

适当地，可以将VOC注入到气流中，用于掺入微气泡和/或纳米气泡中，或以提供与微气泡和/或纳米气泡组合的VOC，或者在具有微气泡和/或纳米气泡的溶液中的VOC。

适当地，由于含有化合物的液体溶液通过纳米气泡生成器再循环，能够诱导植物的表型、化学或生理学中的变化的化合物可以进入微气泡和/或纳米气泡。

适当地，能够诱导植物表型、化学或生理学中变化的化合物可以结合到微气泡和/或纳米气泡的表面。

在包括植物预处理步骤的本发明的方法中，可以制备植物根以允许微气泡和/或纳米气泡中一种或多种气体的更大摄取。

适当地，可以清洁根部分以允许摄取。

适当地，在应用微气泡和/或纳米气泡与本文所讨论的一种或多种化合物(例如，核酸、植物表观遗传调节剂或VOC)的混合物之前，可以对根部分进行预充氧。

适当地，预处理步骤可包括在使用气体形成的纳米气泡水(或其他合适的液体介质)中温育生根新枝，该气体例如包括以下或由以下组成：空气、氧气、二氧化碳、或其他合适的气体或其组合，合适地为氧气纳米气泡水/液体介质。

适当地，在用包含一种或多种化合物的混合物处理之前，可以提供至少一天、至少两天、至少一周、至少一个月或几个月的预处理。

可以理解的是，考虑到根区的大小、健康状况、生长阶段或其他条件，可以适当地应用预处理。认为合适的预处理步骤可以导致改善的一种或多种化合物的摄取。

适当地，本发明的方法可以实时进行，以允许在植物生命中的任何时间提供本文所讨论的一种或多种化合物，例如核酸、植物表观遗传调节剂或VOC的摄取。

适当地，氧纳米气泡水/液体介质和改变基因表达的一种或多种化合物的组合可以在植物生命周期中的任何时间完成，以实现实时变化。

适当地，还可以实时监测化合物的摄取，以允许控制微气泡和/或纳米气泡和化合物混合物的递送。

适当地，微气泡和/或纳米气泡和化合物的混合物可以通过标准滴头提供给植物的根，例如通过标准浇水或灌溉系统输送微气泡和/或纳米气泡和化合物的混合物。

适当地，递送可以递送至土壤、水培系统、标准植物生长介质、椰子椰壳纤维(cococoir)、椰壳纤维(coir)、椰壳炭(coco peat)、标准植物组织生长基质或介质，或其他非土壤基质。

适当地，提供DNA和/或组蛋白的共价修饰、影响染色质的转录活性而不改变DNA序列的植物表观遗传调节剂可以诱导DNA甲基化、RNA甲基化、组蛋白甲基化或组蛋白乙酰化。例如，siRNA可以诱导DNA甲基化。表观遗传调节剂可以诱导瞬时变化，这种变化可以持续很短的时间(数小时、数天或数周)，或者可以持续植物的终生。

适当地，植物表观遗传调节剂可以在一个或多个开花基因座中诱导DNA甲基化、RNA甲基化、组蛋白甲基化或组蛋白乙酰化。

适当地，表观遗传调节剂可以选自挥发性有机化合物(VOC)、siRNA、其他RNA、反义寡核苷酸、植物生长调节剂、肽、RNAi载体、表达载体和/或病毒载体。

纳米气泡或微气泡与化合物的混合物可以与转基因、基因编辑载体、RNAi载体、表达载体或病毒载体一起使用，以增强通过根或其他种系组织摄取到顽抗(recalcitrant)植物细胞中。

适当地，病毒载体可以包含用于基因沉默或增强基因表达的核酸，例如通过外源核酸的瞬时基因表达，例如可以被表达以提供目的产物的外源基因。

适当地，混合物可以进一步包含一种或多种进一步的成分，例如表面活性剂、螯合剂、乳化剂、抗氧化剂、还原剂、pH和渗透缓冲剂。

适当地，化合物可以是诱导DNA甲基化、RNA甲基化、组蛋白甲基化或组蛋白乙酰化以提供可遗传变化的植物表观遗传调节剂。

适当地，植物表观遗传调节剂可以在一个或多个开花基因座中诱导DNA甲基化、RNA甲基化、组蛋白甲基化或组蛋白乙酰化。

适当地，表观遗传调节剂可以选自挥发性有机化合物(VOC)、siRNA、其他RNA、反义寡核苷酸、植物生长调节剂、肽、RNAi载体、表达载体和/或病毒载体。

适当地，微气泡和/或纳米气泡可以使用一种气体或气体的混合物生成。例如，气体可以选自由空气、氧气、二氧化碳、氮气、氢气、乙烯、环氧乙烷及其组合组成的组。

适当地，微气泡或纳米气泡可以在氧的存在下产生以提供富氧液体，该富氧液体然后可以应用于植物根。

适当地，微气泡或纳米气泡可以通过本领域已知的任何方法提供，包括涡流型液体流(swirl-type liquid flow)、文丘里管、高压溶解、喷射器、混合蒸汽直接接触冷凝(mixed vapour direct contact condensation)、电场和超声振动。

例如，可以使用使液体围绕马达旋转，通过泵压提高液体的流速；向液体提供空气或一种或多种其他气体；以及搅动液体以提供气泡，并且然后破裂气泡以形成微气泡或纳米气泡。

替代地，通过喷射嘴可以向液体提供空气或一种或多种其他气体，使得通过液体喷射嘴的喷射流的力将从喷射嘴喷射出的气泡碎裂成超微气泡。

进一步替代地，可以通过搅动生成气泡，然后使所生成的气泡通过网状膜的孔眼以形成纳米气泡。

又进一步替代地，可以提供用于在压力下将气体输送到液体中的压缩机和气泡生成介质，其中气泡生成介质由作为导电物质的高密度化合物组成。通过沿基本上垂直于气泡生成介质排出方向的方向喷射液体，可以生成纳米气泡，如EP 2460582中所描述。

适当地，可以使用这些方法或本领域已知的其他方法的组合。

适当地，纳米气泡是指具有小于1微米的直径的气泡。比纳米气泡大的微气泡是具有大于1微米的直径的气泡。

适当地，至少50％的所生成的纳米气泡具有直径小于300nm，适当地80nm或更小，任选地20nm或更小的直径。

适当地，纳米气泡的可以具有小于500nm或小于200nm，或在约20nm至约500nm范围(例如，约75nm至约200nm)的平均直径。

适当地，可以提供微气泡或纳米气泡混合物，例如具有200nm-10μm的气泡直径的微气泡或纳米气泡。

液体中大多数常规形成的气泡很容易浮到水面，破裂，并且气泡中含有的气体与液体上方的大气融合。相比之下，纳米气泡可以仅轻微地受到浮力影响并且在液体中存在较长的一段时间。适当地，如本发明中使用的纳米气泡在环境压力和温度下可以具有至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少5小时、至少1天、至少1周、至少1个月或至少3个月的存在期(lifetime)。适当地，纳米气泡可以由于其高内压力而具有于液体中的高气体溶解度。

适当地，纳米气泡可以是带正电或带负电的纳米气泡。例如，纳米气泡可以具有10mV至200mV或-10mV至-200mV的ζ电势。适当地，纳米气泡可以具有5mV至150mV或-5mV至-150mV的ζ电势。适当地，由于纳米气泡的带负电表面，可以提供纳米气泡的稳定性。适当地，可以使用pH来产生带电的微纳米气泡。适当地，可以使用电场来提供和/或改变微气泡和/或纳米气泡的ζ电势

适当地，液体载体中纳米气泡的浓度可以为每ml至少10E+05个气泡，例如使用Zetasizer(ZetasizerUltra)或其他合适的装置所测定。

适当地，将植物应用介质提供给植物的应用时期为至少1小时、至少4小时、至少12小时、至少24小时，至少48小时，至少7天，至少10天、至少14天、至少20天，或在植物的生命期内，任选地在植物的栽培持续时间内。

适当地，在应用期间每天至少1小时、每天至少4小时、每天至少12小时、或每天连续提供向植物提供植物应用介质。

适当地，植物施用培养基在发芽后不到1小时，在发芽后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或在发芽后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30天，或在发芽后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或在发芽后1、2、3、4、5、6、7、8、9，10或更多年向植物提供。认为发芽是随着根和子叶的出现而发生的。

适当地，如本文所讨论的，植物可以认为是叶植物、果实植物、谷物和藻类或苔藓。

适当地，植物可以是种子或另一植物部分，例如叶或叶部分、一块茎、花粉、花药、胚或可以从其生长新植物的植物的任何其他干细胞，。

适当地，植物组织(外植体)可以在含有纳米气泡和化合物的固体培养基上温育，以增强转化载体等到顽抗植物物种中的摄取。

适当地，使用的植物可以选自包含适于大量合成代谢物的高等植物或维管植物的组。适当地，植物可以包含大麻属(Cannabis)、大麻(hemp)、玉米(maize/corn)、大豆、稻、小麦、马铃薯、甘蔗、丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhiza fungi)、番茄、莴苣、微型蔬菜(microgreen)、卷心菜、大麦、烟草、胡椒、高粱、棉花、甜菜或任何其他豆科植物(legumes)、水果、坚果、蔬菜、豆子(pulses)、花或与本公开的目的不一致的其他商业作物。

适当地，植物可以选自但不限于，能源作物植物，在农业中用于生产食物、水果、酒、生物燃料、纤维、油、动物饲料的植物，在园艺、花卉栽培、景观美化和装饰工业中使用的植物，以及在工业环境中使用的植物。

适当地，植物可以包含裸子植物(不开花)或被子植物(开花)。如果是被子植物，植物可以是单子叶植物或双子叶植物。可以使用的植物的非限制性实例包含沙漠植物、沙漠多年生植物、豆科植物，例如紫花苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿(alfalfa))、百脉根(Lotusjaponicas)和百脉根属(Lotus)的其他种、白香草木樨(Melilotus alba)(草木樨(sweetclover))、豌豆(Pisum sativum)(豌豆(pea))和豌豆属的其他种、豇豆(Vignaunguiculata)(豇豆(cowpea))、含羞草(Mimosa pudica)、羽扇豆(Lupinus succulentus)(羽扇豆(lupine))、紫花大翼豆(Macroptilium atropurpureum)(大翼豆(siratro))、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、豆属(Onobrychis)、豇豆属(Vigna)、和白三叶草(Trifoliumrepens)(白三叶(white clover))、玉米(玉蜀黍(maize))、胡椒、番茄、甜瓜属(Cucumis)(黄瓜、甜瓜等)、西瓜、草莓属、其他浆果、南瓜属(南瓜(squash)、西葫芦(pumpkin)等)、莴苣(lettuces)、胡萝卜属(Daucus)(胡萝卜)、芸苔属(Brassica)、欧白芥属(Sinapis)、萝卜属(Raphanus)、大黄(rhubarb)、高粱属(sorghum)、芒草(miscanthus)、甘蔗(sugarcane)、白杨(poplar)、云杉(spruce)、松树(pine)、小麦属(Triticum)(小麦)、黑麦属(Secale)(黑麦(rye))、稻属(Oryza)(稻)、大豆属(Glycine)(大豆)、棉花、大麦、烟草、马铃薯、竹、油菜、甜菜、向日葵、桃(李属种(Prunus spp.))、柳、银胶菊、桉树、魔芋属种(Amorphophallusspp.)、魔芋(Amorphophallus konjac)、芦竹(giant reed)(芦竹(Arundo donax))、金丝雀草(reed canarygrass)(虉草(Phalaris arundinacea))、巨芒草(Miscanthusgiganteus)、芒属种(Miscanthus sp.)、胡枝子(sericea lespedeza)(截叶铁扫帚(Lespedeza cuneata))、粟(millet)、黑麦草(ryegrass)(多花黑麦草，黑麦草属种)(Lolium multiflorum,Lolium sp.)、梯牧草(Phleum pratense)、地肤属(Kochia)(地肤(Kochia scoparia))、饲用大豆(forage soybean)、大麻属(Cannabis)、大麻(hemp)、红麻(kenaf)、百喜草(Paspalum notatum)(百喜草(bahiagrass))、狗牙根(bermuda grass)、Pangola-grass、羊茅(fescue)(羊茅属种(Festuca sp.))、鸭茅属种(Dactylis sp.)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、无芒雀麦(smooth bromegrass)、果园草(orchardgrass)、草地早熟禾(Kentucky bluegrass)、草坪草(turf grass)、蔷薇属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属(Juglans)、胡卢巴属(Trigonella)、柑橘属(Citrus)、亚麻属(Linum)、天竺葵(Geranium)、木薯(Manihot)、拟南芥属(Arabidopsis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、矮牵牛属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、马郁兰(Majorana)、Ciahorium、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、Heterocallis、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、Panieum、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、蛾蝶花属(Salpiglossis)、Browaalia、菜豆属(Phaseolus)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)和葱属(Allium)。

适当地，改变植物的表型、化学或生理学以增强由植物或这些领域中使用的组分提供的基于植物的药物和/或工业产品、药用和非药用健康相关或娱乐产品、保健品或其他功能性食品、化妆品化合物、添加剂、生物药物(bioceutical)或农产品的生产。

适当地，工程化改造植物中分泌途径或其部分的表达能够产生分子，例如生物制品，这些分子否则将以低水平或以正确加工的形式积累。

适当地，增强的产品可以是但不限于植物激素、类黄酮，特别是查尔酮(chalcones)、黄酮、黄酮醇、黄烷二醇、花青素(anthocyanin)和原花青素、缩合单宁或橙酮。

适当地，增强的产品可以是糖替代品，例如甜菊醇糖苷(steviol glycosides)。例如，增强的产品可包含或由其组成：甜菊苷(Stevioside)、莱鲍迪苷A(Rebaudioside A)、莱鲍迪苷C(Rebaudioside C)、杜尔科苷A(Dulcoside A)、莱鲍迪苷B(Rebaudioside B)、莱鲍迪苷D(Rebaudioside D)和/或莱鲍迪伊苷E(Rebaudioside E)。

适当地，增强的产品可以是植物衍生药物，例如强心剂乙酰地高辛(Acetyldigoxin)、阿东尼苷(Adoniside)、铃兰毒素(Convallatoxin)、地高辛苷(Deslanoside)、洋地黄苷(Digitalin)、洋地黄毒苷(Digitoxin)、地高辛(Digoxin)、依托泊苷(Etoposide)、吉他林(Gitalin)、毛花苷(Lanatosides)A、B、C、哇巴因(Ouabain)。

适当地，增强的产品可以是抗炎剂，例如七叶皂苷(Aescin)。

适当地，产品可以是抗胆碱能药物-山莨菪碱、樟柳碱、阿托品、莨菪碱。适当地，产品可以是抗癌药物-桦木酸、喜树碱、秋水仙酰胺、秋水仙碱、地美可辛、伊立替康、拉帕醇、野百合碱或紫杉酚。

适当地，植物产品可以选自七叶素(Aesculetin)、仙鹤草酚、阿吗碱、尿囊素、异硫氰酸烯丙酯、Anabesine、穿心莲内酯、槟榔碱、积雪草苷、苯甲酸苄酯、黄连素、岩白菜素、冰片、菠萝蛋白酶、咖啡因、樟脑、(+)-儿茶酸、木瓜凝乳蛋白酶、锡生藤灵(Cissampeline)、可卡因、可待因、姜黄素、洋蓟素、丹蒽醌、地舍平、L-左旋多巴(Danthron)、吐根碱、麻黄素、加兰他敏(Galanthamine)、格劳卡昔(Glaucarubin)、海罂粟碱(Glaucine)、Glasiovine、甘草酸苷(Glycyrrhizin)、棉子酚、雪胆素、橘皮苷、白毛莨碱、红藻氨酸(Kainic acid)、醉椒素(kawain)、Kheltin、吗啡、Papavarine、毛果芸香碱(Pilocarpine)、血根碱、东莨菪碱、水飞蓟素。

适当地，产品可以是植物来源的癌症药物，例如长春花生物碱(长春花碱、长春新碱和长春地辛)、表鬼臼毒素(依托泊苷和替尼泊苷)、紫杉烷(紫杉醇和多西他赛)或喜树碱衍生物(喜树碱和伊立替康)。

适当地，增强的产品可以是由植物如大麻天然形成的化合物。特别地，可以向本文所述的植物供应一种或多种表观遗传调节剂以调节单个或多组代谢途径。这可以修改通常表达的化合物的分布，以为大麻创建平台，该平台提供获得商业规模数量的常见组分大麻二酚和较少化合物如甲基-(C₁)、丁基-(C₄)和其他C_n烷基大麻类的途径。

适当地，植物中潜在生物合成途径的调节可用于产生基于上述大麻分子的新药物，但通过糖基化、o-烷基化、酯化、乙酰化、萜烯加成和通过添加无机部分(磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐和铵)的离子化来改变化学性质。

适当地，增强的产品可以是着色剂。例如，许多植物诸如岩高兰(Empetrumnigrum)、菘蓝(Isatis tinctoria)和番红花(Crocu ssativus)，生产用于食品、纺织品、染发剂等的颜色。使用本文所述的方法，可以调节植物提供的化合物的多样性和比例，以产生具有特定(可见光谱)和可再生颜色的可持续着色剂原料(作物)。此外，可以利用潜在途径的触发来改变着色剂的化学性质，从而通过烷基化、特异性氧化/还原、糖基化来扩展它们的用途，以提供诸如pH稳定性、光降解、水/油溶解性等的功能差异。

适当地，增强的产品可以是功能分子，例如表面活性剂。表面活性剂是用于混合两种互不相溶物质(例如油和水)的有机化合物。它们用于世界各地的许多行业，尤其是化妆品、医疗保健、食品和饮料行业。表面活性剂市场需求的很大一部分是通过使用石化产品作为前体的有机化学合成来满足的。本文公开的方法可用于种子作物(如油菜(或其他十字花科植物))，以增强称为可持续乳化剂的半乳糖脂的产率。表观遗传调节剂的应用使得实现新的乳化剂/表面活性剂化学变体(寡聚半乳糖脂)和产率，特别是较少所知/改性的半乳糖脂的产率的增加。替代地，可以通过利用本文公开的方法改变植物内的途径来改变乳化剂比活力、稳定性/耐久性、功能性pH范围等。

适当地，增强的产品可以是功能性食物分子，例如鸡蛋代用品，诸如卵白蛋白代用品。此类功能性食品分子可以作为乳化剂、澄清剂、结构改性剂(textural modification)、粘合剂、营养组分、稳定剂、上光剂等。卵白蛋白是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的一员。丝氨酸蛋白酶抑制剂存在于诸如大麦的许多植物中，其中谷物中富含蛋白质Z，并且本发明的方法可以用于增加此类丝氨酸蛋白酶抑制剂的产率。

适当地，可以改变植物的表型或生理学以增强植物的结构生长特性。例如，结构生长特性可以选自生长速率、生物量重量(全植物、植物的地上部分、根、块茎)、植物高度、分枝数量、分枝厚度、分枝长度、分枝重量、叶的数量、叶尺寸、叶重量、叶厚度、叶展开速率、叶柄尺寸、叶柄直径、叶柄厚度、茎粗、树干厚度(卡尺)、茎长度、树干长度、茎重量、树干重量、冠层/分枝结构、根生物量、根延伸、根深度、根重量、根直径、根坚固性、根锚固(rootanchorage)或根结构。

适当地，可以改变植物的表型或生理学以增强植物响应于环境条件，例如选自非生物胁迫耐受性(诸如冷、热、盐度和/或干旱)，或者响应于来自例如微生物或真菌攻击或感染或捕食的生物胁迫的生长特性。

适当地，可以改变植物的表型或生理学以增强选自以下的植物的生长特性：花色素苷色素(anthocyanin pigment)产生，花色素苷色素积累，植物油质量和数量，次级代谢产物积累，感觉和调味化合物产生，植物药物或植物化学化合物含量，蛋白质含量，纤维肥大和质量，叶绿素数量，光合作用速率，光合作用效率，叶片衰老延迟速率，早期和有效的座果，早期果实成熟，果实产率，营养部分(vegetative parts)、根和块茎、果实/谷粒和/或种子的产率，果实、谷粒和/或种子的尺寸，果实、谷粒和/或种子的硬度，果实、谷粒和/或者种子的重量，营养部分、根和块茎、果实、谷粒和/或者种子的淀粉含量，果实、谷粒和/或种子的糖含量，果实和种子中的有机酸含量，早期开花(开花早熟)，或收获持续时间。

适当地，改变植物的表型或生理学以增强植物的生长特性的组合。

适当地，植物可以通过连续浸入营养液中，通过暂时浸入所述营养液中(地下灌溉、水培、营养膜等)，通过使用标准滴头，或通过与薄雾(mist)或雾(fog)形式的营养液接触(气培)而生长在多孔载体上的无土培养物上或无土培养物中。

适当地，在本发明的方法中，将混合物应用于植物的器官。

任选地，器官是植物根系统。适当地，通过液体植物生长介质将混合物应用于植物根系统。

认为本文所讨论的纳米气泡提供了数种独特的物理和机械特性。例如，它们提供了持久寿命(longevity)、浮力的实质消失、高内部压力、极大的表面/体积比、高氧溶解速率。

适当地，可以将VOC注射到进入纳米气泡生成器的空气/气体通道中，以提供与纳米气泡组合的这些VOC。适当地，可以将其他化合物引入通过纳米气泡生成器再循环的纳米气泡水/液体载剂中，以在本发明的方法中提供这种化合物。

适当地，纳米气泡生成器可以包含用于在压力下输送气体的压缩机、用于将已经在压力下输送的气体作为超微气泡排放到液体中的气泡生成介质，其中气泡生成介质由导电的高密度化合物组成。

另外，纳米气泡生成器也可以配备有液体喷射设备，用于向与气泡生成介质排出气泡的方向基本上垂直的方向喷射液体。喷射液体可以是与超微气泡排出到其中的液体相同种类的液体。EP 2460582和US 8919747描述了适用于本发明的方法和系统的纳米气泡生成器。

适当地，可以将化合物递送到液体中。该液体可以通过纳米气泡生成器不断地再循环。当液体将纳米气泡推出表面时，由于气泡在离开表面之前重新形成，可能会有一些聚结。在此阶段，可以将化合物吸收在纳米气泡内或附着在其表面上。

适当地，纳米气泡可以在无菌条件下提供。装置(气体供应、再循环液体培养基、水、糖溶液或其他液体介质和纳米气泡发生成器)可以容纳在层流架(laminar flowcabinet)中，并且在层流架中进行这些过程。适当地，产生含有纳米气泡的液体或固体培养基用于组织培养。

适当地，提供了系统，其中该系统是无菌的和/或自动化的。

适当地，如本文所述的系统，其中将混合物应用于植物的步骤包括将混合物应用于水培植物栽培系统中的植物。

详细说明

现在将参考以下实施例和附图，仅以示例的方式，进一步详细说明本发明的上述和其他方面，其中：

图1说明了在充氧(O)水、水或氧纳米气泡(ONB)水中温育根24或30小时后，在具有或不具有氧纳米气泡的情况下各种植物组织中CY3-标记的DNA寡核苷酸的摄取。使用LSM710正置共聚焦显微镜可视化CY3。a)30小时后的大麻(Cs)根；b)30小时后的Cs叶，10倍放大；c)24小时后的本氏烟草(Nb)叶，10倍放大；d)24小时后的大麦(HV)叶，10倍放大；e)24小时后的罗勒(OB)叶，10倍放大。

图2说明了使用LSM 710正置共聚焦显微镜，在自来水中或用氧纳米气泡(ONB)温育根3或30小时后，大麻(Cs)植物组织中CY3标记的八氢番茄红素去饱和酶(phytoenedesaturase，PDS)寡核苷酸的摄取。a)30小时后的Cs根；b)3小时后的cs叶，10倍放大；c)30小时后的Cs叶，20倍放大；具有ONB处理与不具有ONB的水相比。

图3说明了用于DNA寡核苷酸处理的植物材料的范围。a)50ml falcon管中的大麻(Cs)生根植物；b)Eppendorf中的Cs生根插条；c)椰子椰壳纤维中的Cs生根插条；d)eppendorfs中的本氏烟草(Nb)幼苗。e)通用管中的大麦(Hv)幼苗。使用3-6周龄的范围。

图4说明了以下中的表型：a)用PDS反义寡核苷酸温育后5天的大麻(Cs)叶；b)用PDS反义寡核苷酸温育后20天的大麦(Hv)叶(右)。没有ONB的对照植物(左)；c)用PDS反义寡核苷酸温育后20-37天的本氏烟草(Nb)叶。

图5说明了以下中的PDS mRNA水平：a)用PDS反义寡核苷酸温育后5天的大麻(Cs)叶；b)在水或ONB水中用PDS反义寡核苷酸温育后37天的本氏烟草(Nb)叶。相对于eF1a对照通过qPCR定量的mRNA水平。

图6说明了在制备用于反义寡核苷酸处理的ONB水中测量的纳米气泡的尺寸分布。使用Zetasizer Nano ZS测量尺寸分布。纳米气泡的尺寸在12天内是稳定的。

图7说明了氧纳米气泡(ONB)对本氏烟草(Nb)幼苗摄取农杆菌属株AGL1的作用。a)在针对GUS活性进行染色之前，将Nb幼苗根在具有ONB(左)或不具有ONB(右)的含有在组成型启动子下表达GUS的农杆菌的MS30液体介质以及不具有农杆菌的对照(中)中温育两天。b)在针对GUS活性进行染色之前，将Nb幼苗浸入具有ONB(左)或不具有ONB(右)的含有表达含有内含子的GUS型式的农杆菌的1/4MS10培养基中4天。

图8说明了氧纳米气泡(ONB)对基于CRISPR/Cas9的基因编辑效率的作用。将含有CRISPR/Cas9构建体的农杆菌引入烟草(Nt)转基因系的幼苗中，该烟草(Nt)转基因系含有作为CRISPR靶基因的非功能性β-葡萄糖苷酶(GUS)重复。在Cas9/gRNA诱导DNA断裂后，两个片段之间的同源重组(HR)恢复功能性GUS基因。在ONB和含有靶向GUS基因的CRISPR构建体的农杆菌两者的存在下，以蓝色染色检测到强HR。Tap_C＝自来水和含有靶向马铃薯基因的CRISPR构建体的农杆菌(对照)；Tap_CRISPR＝自来水和含有靶向GUS基因的CRISPR构建体的农杆菌；ONBs_C＝ONB和含有靶向马铃薯基因的CRISPR构建体的农杆菌(对照)；ONBs_CRISPR＝ONB和含有靶向GUS基因的CRISPR构建体的农杆菌。*ONBs_CRISPR幼苗含有额外的GUS的斑块(patch)，这些斑块不能量化为单个斑点，因此不包含在图中。

图9说明了本文所讨论的植物栽培系统的实例。

图10说明了使用纳米气泡作为挥发性化合物的递送系统以改善罗勒(Ob)幼苗的生长。a)在具有和不具有挥发性化合物的纳米气泡水培系统中生长21天后的Ob幼苗；b)用纳米气泡引入的挥发物对Ob幼苗中众多生长参数的作用。

图11说明了用于引入纳米气泡和挥发性化合物以改善罗勒生长的递送方法的优化。

图12说明了使用纳米气泡作为液体肥料(Canna Coco A+B)的递送系统以改善大麻的生长。与没有纳米气泡的对照水相比，当用氧纳米气泡(ONB)引入液体肥料时，植物生物量显著更大。

图13说明了使用纳米气泡作为植物生长调节剂的递送系统以改善大麻中的植物生长。与自来水相比，当使用ONB作为a)赤霉酸和b)DL-肉碱的递送系统时，植物高度和生物量增加。

图14说明了用含有挥发性化合物的空气纳米气泡进行的叶的超声成雾对莴苣品种生长的作用。

实施例

以下实施例使用AZ-FB-20ASW纳米气泡生成器，其可从Anzaikantetsu Co-http://anzaimcs.com/en/main/examplenanobubble.html获得。图9说明了包含将根浸入在纳米气泡介质中的系统的实例，其与纳米气泡生成器流体连通。可以理解的是，可以布置替代的或额外的系统来将介质应用到植物上。

所有材料从商业供应商获得。

实施例1

在最初的实验中，设置了三种不同的水处理，以比较反义寡核苷酸通过根转移到植物细胞的效率。

1.充氧自来水(O水)通过在非常低的压力下通过气幕(air curtain)将氧鼓泡到水中来制备。这种水中的溶解氧平均为300％空气饱和度。

2.使用标准自来水作为对照。自来水中的溶解氧平均为100％空气饱和度。

3.氧纳米气泡自来水(ONB)通过在2bar压力下从氧气瓶连续进料到纳米气泡机中来制备，标准自来水通过纳米气泡机进料以收集氧纳米气泡。纳米气泡水中的溶解氧平均为400％空气饱和度。

所有的水处理均在槽中独立循环。

如图3a所示，大麻植物的根在每种水处理中预处理30-120分钟，然后与来自其各自槽的5ml样品一起转移到50ml falcon管中。将CY3标记的DNA反义寡核苷酸添加到每种水处理中以对来自每种水处理的每个植物给予1μM的终浓度。所有样品在黑暗中在室温保存，然后在3小时和30小时去除根和叶切片(section)，用于在LSM 710正置共聚焦显微镜下观察。图1a、1b显示了温育30小时后的结果。在ONB水中温育的反义寡核苷酸的摄取和转移显著高于用其他水处理。用充氧水处理显示，反义寡核苷酸摄取的增加是由于水中存在纳米气泡而不是氧。在所有处理中用超纯水代替自来水得到相似的结果。

实施例2

进行了一系列实验以证明通过在有和没有氧纳米气泡(ONB)的情况下在根处的引入，反义寡核苷酸在来自许多植物物种的植物、生根插条或幼苗(图3a-e)中的摄取。

在引入CY3标记的反义寡核苷酸后24小时，测量叶中荧光，表明反义寡核苷酸从根到叶的高效转移(图1c-e)。与对照处理相比，从ONB处理取样的所有叶中可见显著更高的荧光信号。

在进一步的实验中，在大麻(Cs)中引入反义寡核苷酸以沉默具有或不具有CY3标记的八氢番茄红素去饱和酶(PDS)基因。在引入反义寡核苷酸后3小时或30小时在共聚焦下可视化荧光(图2a-c)。由于类胡萝卜素和叶绿素生物合成的受损，PDS基因的沉默导致叶中的白化表型。白化叶表型在许多植物物种中可见(图4a-c)，并通过实时定量PCR(qPCR)进一步定量，以确定叶中mRNA水平的减少(图5a-b)。在一系列实验中，使用反义寡核苷酸与ONB组合，PDS mRNA的水平减少高达80％。

认为用于通过植物根运输化合物的氧纳米气泡的最佳尺寸范围为10nm–150nm。发现生成的纳米气泡水稳定数天，可能数周(图6)。

引入植物中的纳米气泡和化合物的组合已被证明是一种快速、有效的诱导基因表达变化的方式。与荧光信号低的充氧水和荧光信号主要在毛状体中的自来水相反，对于ONB，信号存在于大多数叶细胞中。这提供了高效的系统来实现实时变化，例如诱导开花，这必须在完全生长的植物中进行。

实施例3

进行了一系列实验以将含有表达β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，GUS)基因的载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株AGL1细胞引入本氏烟草(Nb)幼苗中，以比较在有和没有氧气纳米气泡(ONBS)的情况下的摄取。首先，将2叶期的Nb幼苗与含有具有在组成型启动子控制下的GUS的构建体(图7a)的农杆菌一起在用或不用ONB水和用或不用农杆菌制成的MS30液体中温育并且在针对GUS活性进行染色之前温育2天。与不具有ONB水的处理相比，在用ONB水制成的MS30温育的幼苗中检测到GUS的更高表达。

在进一步的实验中，用含有转基因构建体的AGL1转化4周龄的Nb幼苗，该构建体具有β-葡萄糖苷酶(GUSplus)基因，其具有在拟南芥泛素10启动子(AtUBI10p)和烟草延伸蛋白终止子(NtExtT)的转录控制下的内含子(黑线)(图7b)。将幼苗浸入具有或不具有ONB的含有农杆菌的1/4MS10介质中并在针对GUS活性进行染色前温育4天。与不具有ONB水的处理相比，在用ONB水温育的幼苗中检测到GUS的更高表达。

进行了进一步的实验以确定氧纳米气泡(ONB)对基于CRISPR/Cas9的基因编辑效率的影响。制备CRISPR/Cas9构建体以表达番茄密码子优化的Cas9(LeCas9)和向导RNA(gRNA)以靶向β-葡萄糖苷酶(GUS)基因(图8a)。靶GUS基因由两个缺失5’或3’末端的缺陷型部分GUS片段制成，并通过可选择标志物潮霉素(hpt)分隔(图8b)。将此转基因引入烟草(Nt)SR1以生成转基因系(GUS^DR)，其中罕见的自发同源重组(HR)事件可以作为蓝色斑点检测到(图8c，白色箭头)。用含有CRISPR/Cas9构建体的农杆菌属株AGL1转化GUS^DR幼苗将导致重叠GUS区中的一个或两个位点(红色三角形)处的DNA断裂。通过HR的双链断裂修复导致功能性GUS的恢复。这种重组事件可以通过对GUS活性的组织化学染色来检测，显示幼苗上的蓝色斑点(图8d、e，白色箭头和放大区域(白色框))。对每个处理的每个幼苗的蓝色斑点的数量进行评分(图8f)。在ONB和含有靶向GUS基因的CRISPR_GUS构建体的农杆菌的存在下检测到强HR。样品为Tap_C、自来水和含有靶向马铃薯基因的CRISPR构建体的农杆菌(对照)；Tap_CRISPR、自来水和含有靶向GUS基因的CRISPR构建体的农杆菌；ONBs_C、氧纳米气泡和含有靶向马铃薯基因的CRISPR构建体的农杆菌(对照)；ONBs_CRISPR、ONB和含有靶向GUS基因的CRISPR_GUS构建体的农杆菌。这种HR测定可能低估了基因编辑的效率，因为其他预期的插入/缺失(Indel)事件无法由GUS染色检测到。此实验显示了使用ONB水的基于CRISPR/Cas9的基因编辑的更高效率。

实施例4

据了解，细菌和真菌可以通过涉及挥发性有机化合物的互惠相互作用(mutualistic interaction)促进植物生长。已显示球孢枝孢株TC09通过释放由植物组织在体外摄取的VOC来增强植物生长。

认为纳米气泡生成器可以流体连接到水培系统以使含有VOC的纳米气泡进料到水培系统(植物生长系统)中。作为示例，来自在容器中生长的TC09(例如来自球孢枝孢，特别是其中所述球孢枝孢是球孢枝孢登录号NRRL 67603、球孢枝孢登录号NRRL 8131和球孢枝孢登录号NRRL 67749的至少一种)的VOC可以与氧气(或来自二氧化碳、氮气、空气的其他气体)一起提供到纳米气泡生成器的气体入口中。可以通过纳米气泡生成器泵送水以产生含有氧气和VOC的纳米气泡水。所产生的含有氧气和VOC的纳米气泡水然后可以在植物根周围循环/再循环，例如使用任何合适的植物生长系统。

适当地，具有诱导植物的表型、化学或生理学中的变化的至少一种化合物的纳米气泡水可以在水培系统中与植物再循环。如将理解的，纳米气泡水可以包含其他营养物等以提供可以提供给植物的液体介质。可以利用几种可能的设置以向植物提供纳米气泡水，例如可以在槽中提供植物，其中槽是再循环系统的一部分，水不断地移动过植物根部。可替代地，可以在设置中提供植物，其中纳米气泡水作为涨落系统的一部分提供，其中随着纳米气泡水通过该系统泵送，罐被间歇地填充和清空。

进行了一系列使用挥发物的实验，以确定使用纳米气泡作为递送系统的效率。

通过蒸发将挥发性化合物引入气体管线(图9)，补料到循环水系统中的纳米气泡生成器中21天。与在不含挥发物的纳米气泡水中生长的罗勒幼苗相比，在这种挥发性纳米气泡水中生长的罗勒(Ob)幼苗具有更大的植物高度、新枝湿生物量、茎的数量、叶的数量和叶的重量(图10)。此实验显示纳米气泡高效地通过根将挥发物运输到植物中。

进行了进一步的实验以优化挥发物与纳米气泡在具有再循环水的水培中通过根到植物的递送方法。测试了不同浓度的挥发物以及用植物肥料和ONB制备挥发物的两种方法。在第一种方法中，制备ONB水；然后向ONB中添加植物液体肥料(以在自来水中植物生长最佳的浓度)和不同浓度的挥发物。在第二种方法中，制备挥发物和液体肥料混合物然后使其通过纳米气泡生成器。纳米气泡制备的第二种方法被证明能更高效地递送液体肥料和挥发物。来自第二设置的对照植物生长受到营养物浓度的抑制(图11)，表明当用纳米气泡递送时，有可能减少待在水培试验中使用的肥料的浓度。此外，第二种NB制备方法显示出对挥发物的剂量响应，证明挥发物在产生的纳米气泡的存在下/在产生的纳米气泡的内部通过根运输到植物。在产生纳米气泡之前，即使向水溶液中加入少量的挥发物，植物也能更好地耐受液体肥料浓度。这表明那些挥发物改善了盐胁迫条件下的植物生长。

实施例5

进行了一系列实验以证明大麻(Cs)中用纳米气泡的液体营养物的高效摄取。设置两种水处理以比较液体肥料向植物根的转移：1)使用标准自来水作为对照，2)氧纳米气泡自来水(ONB)。在温室条件中设置水培实验：日间温度25℃，夜间温度18℃，16/8小时昼/夜和150μmol m^-2s^-1光强度。使用Cs顶端插条。使用具有0.75标准升每分钟(SLPM)的O₂流量和800L/H的水流量的细气泡生成器(Anzaikantetsu Co,AZ-FB-20ASW)生成氧纳米气泡自来水(ONB)。使120L自来水通过喷嘴运行3小时。接下来，在25L桶中准备不同的处理。在生成NB后加入液体肥料(Canna；每1L水中加入4mL coco A和4mL coco B；电导率EC＝2.0mS/cm)。将所有桶中的pH调整至6.0。每天检查EC和pH并调整到正确的水平。植物在水培中生长14天。监测植物生长并与对照比较。通过测量包括植物高度、整个植物鲜重和茎的数量的主要生长参数来确定植物生长。使用Windows第21版的GenStat(VSN International Ltd.,Hemel Hempstead,U.K.)中的t-检验以分析生长参数。那些实验显示与用coco A+B和自来水处理的植物相比，用coco A+B和ONB处理的植物具有显著更大的植物生物量(图12)。

实施例6

植物生长调节剂(PGR)是用于改变植物生长的化学品。例如，PGR可用于增加或停止分枝、抑制或刺激新枝生长、增加开花或缩短开花时间、去除多余的果实、改变果实成熟度或阻断植物激素的生物合成。大量因素影响PGR性能，包括植物吸收化学品的程度。用ONB进行的PGR的递送将改善植物对PGR的吸收。

在温室条件下设置水培实验：日间温度25℃，夜间温度18℃，16/8小时昼/夜和150μmol m^-2s^-1光强度。大麻(Cs)顶端插条用赤霉酸A3(GA3；Duchefa,G0907)以12mg/L终浓度处理，类似于Mansouri等人(2011)，或用DL-肉碱盐酸盐(Merck S7021474Cas-No 461-05-2,8.41774.0025)以1mM/L终浓度处理，如Signem Oney-Birol(2019)中。

首先在桶中制备所有溶液，将pH调节至6.0。液体肥料(Canna Coco A+B)以如下浓度添加：每1L水4mL coco A和4mL coco B；电导率EC＝2.0mS/cm。接下来，使溶液穿过具有0.75标准升每分钟(SLPM)O₂流量和800L/H水流量的细气泡生成器(Anzaikantetsu Co,AZ-FB-20ASW)。每个25L桶通过喷嘴运行30分钟。每天检查EC和pH并调整到正确的水平。植物在水培中生长14天。监测植物生长并与对照比较。通过测量包括植物高度、整个植物鲜重和茎的数量的主要生长参数来确定植物生长。使用Windows第21版的GenStat(VSNInternational Ltd.,Hemel Hempstead,U.K.)中的单向设计方差分析(One-way designanalysis of variance，ANOVA)和Tukey的95％置信区间检验以分析生长参数。结果如图13所示，其显示了通过在水培条件下使用PGR和ONB的生长的显著增加。

实施例7

将各种莴苣品种(莴苣，Lactuca sativa)的幼苗暴露于由含有携带MVOC的空气纳米气泡的水生成的超声雾中。14天后，处理的植物显示出鲜重的显著增加。

将98.5％硫酸沙丁胺醇(Albuterol Sulfate)(Spectrum Chemical，NewBrunswick，NJ，USA)在自来水中稀释至1.65mg/L。然后将5升置于容器中，该容器通过空气压缩机加压至1.3bar。将来自加压容器的气流引导至安装在总共60L水的再循环流中的纳米气泡生成器。在最少2小时的处理后，将4L纳米气泡处理的水从再循环系统中移除并置于具有6L总容量的矩形塑料蓄水池中。然后将三头超声雾生成器置于蓄水池中，并将蓄水池置于封闭的植物生长室中。将莴苣(Lactuca sativa,var.Tango)的种子种植在充满ProMix生长介质的2.5cm方形池中。嫩芽出现后，将幼苗置于生长室中并开始雾处理。将植物的“对照”组置于不经受任何处理的生长室的不同部分中。室内的生长参数维持在适合作物的水平，包含16小时/天的光周期。雾生成器操作由循环计时器控制，具有5分钟/小时的“开启”时间。仅在日间的光周期的期间制造雾应用。根据需要对植物进行灌溉，以维持细胞内适当的湿度水平。根据需要，通过添加来自上述纳米气泡再循环流动系统的处理的水来维持蓄水池水位。14天后，收获所有植物并记录鲜重。与对照植物相比，处理的植物显示出超过30％的重量的平均增加。结果如图14a所示。在第22天，关于卷心莴苣(Lactuca sativavar.Iceberg)也证明类似的结果，如图14b所示。

本文中引用的每个文件、参考文献、专利申请或专利通过引用明确地将其整体并入本文，这意味着读者应当将其阅读和视为本文的一部分。仅出于简明的原因，本文中引用的文件、参考文献、专利申请或专利在本文中不重复。

提及文本中含有的引用材料或信息，不应被理解为承认该材料或信息是公知常识的一部分或在任何国家都是众所周知的。

尽管已经参考具体实施例具体地示出和描述了本发明，但是本领域的技术人员将理解，在不背离本发明的范围下，可以在其中进行形式和细节的各种变化。

附图题注

图1-在具有和不具有氧纳米气泡(ONB)的情况下来自大麻(Cs)；本氏烟草(Nb)；大麦(Hv)；和罗勒(Ob)的植物组织中的CY3标记的DNA寡核苷酸的摄取。

a)在O水(左)、水(中)或ONB水(右)中用CY3标记的DNA寡核苷酸温育30小时后的Cs根。

b)在O水(左)、水(中)或ONB水(右)中用CY3标记的DNA寡核苷酸温育30小时后的Cs叶。10倍放大。

c)在水(左)或ONB水(右)中用CY3标记的DNA寡核苷酸温育24小时后的Nb叶。10倍放大。

d)在水(左)或ONB水(右)中用CY3标记的DNA寡核苷酸温育24小时后的Hv叶。10倍放大。

e)在水(左)或ONB水(右)中用CY3标记的DNA寡核苷酸温育24小时后的Ob叶。10倍放大。

图2-在具有和不具有氧纳米气泡(ONB)的情况下来自大麻(Cs)的植物组织中的CY3标记的PDS寡核苷酸的摄取

a)在自来水(左)或ONB水(右)中用CY3标记的PDS寡核苷酸温育30小时后的Cs根。

b)在自来水(左)或ONB水(右)中用CY3标记的PDS寡核苷酸温育3小时后的Cs叶。10倍放大。

c)在自来水(左)或ONB水(右)中用CY3标记的PDS寡核苷酸温育30小时后的Cs叶。20倍放大。

图3-用于DNA寡核苷酸处理的植物材料(生根插条或幼苗)的范围

a)50ml Falcon管中的大麻(Cs)生根植物。

b)Eppendorf中的Cs生根插条。

c)椰子椰壳纤维中的Cs生根插条。

d)Eppendorf中的本氏烟草(Nb)幼苗。

e)通用管中的大麦幼苗。

使用3-6周龄的年龄范围。

图4-在具有和不具有氧纳米气泡(ONB)的情况下摄取PDS反义寡核苷酸之后大麻(Cs)、本氏烟草(Nb)和大麦(Hv)植物的表型

a)在ONB水中用PDS寡核苷酸温育后5天显示局部表型的Cs叶。

b)在ONB水中用PDS寡核苷酸温育后20天显示PDS表型的Hv叶(右)。没有ONB的对照(左)。

c)在ONB水中用PDS寡核苷酸温育天20-37后显示PDS表型的Nb新叶。

图5-在具有和不具有氧纳米气泡(ONB)的情况下摄取PDS反义寡核苷酸之后大麻(Cs)、本氏烟草(Nb)叶中的PDS mRNA水平

a)相对于eF1a对照基因，在水(左)和ONB水(右)中用PDS反义寡核苷酸温育后5天的Cs叶中的PDS mRNA水平。

b)相对于eF1a对照基因，在水(左)和ONB水(右)中用PDS反义寡核苷酸温育后37天的Nb叶中的PDS mRNA水平。

图6-在制备用于反义寡核苷酸处理的ONB水中测量的纳米气泡的尺寸分布

收集后5天(虚线)和收集后12天(实线)在ONB水样品中测量的纳米气泡按强度的尺寸分布。

图7-氧纳米气泡(ONB)对本氏烟草(Nb)幼苗摄取农杆菌的作用

a)在针对GUS活性进行染色之前，将Nb幼苗在MS30介质+/-表达GUS的农杆菌+/-ONB中温育两天。中间的对照不用农杆菌或ONB处理。

B)在针对GUS活性进行染色之前，将Nb幼苗浸入具有ONB(左)或不具有ONB(右)的含有表达GUS的农杆菌的1/4MS10培养基中四天。

图8-氧纳米气泡(ONB)对烟草(Nt)幼苗中基于CRISPR/Cas9的基因编辑效率的作用

a)表达番茄密码子优化的Cas9(LeCas9)和向导RNA(gRNA)的CRISPR/Cas9构建体以靶向β-葡萄糖苷酶(GUS)基因。

b)靶GUS基因由两个缺失5’或3’末端的缺陷型部分GUS片段构成。在DNA断裂后，两个片段之间的同源重组(HR)恢复功能性GUS基因。

c)这些罕见的自发HR事件被检测为幼苗上的蓝色斑点(白色箭头)。

d)与对照(左)相比，ONB的存在(右)下检测到更多的蓝色斑点。

e)小图e(右)中幼苗的放大的叶区域(AE1–3)和另一幼苗的EA4。

f)在每种处理中将蓝色斑点的总数进行评分：

Tap_C＝自来水和农杆菌对照

Tap_CRISPR＝自来水和农杆菌CRISPR_GUS

ONBs_C＝ONB和农杆菌对照

ONBs_CRISPR＝ONB和农杆菌CRISPR_GUS。

图9-再循环水中具有挥发物的氧(或其他气体)纳米气泡水的产生

图10-使用纳米气泡作为挥发性化合物的递送系统以促进罗勒幼苗的生长

a)在再循环纳米气泡水(左)和具有挥发性化合物的纳米气泡水中生长21天后的罗勒(Ob)幼苗。

b)在再循环水培系统中生长21天后，纳米气泡(灰色条)和具有挥发物的纳米气泡(黑色)对Ob幼苗的众多生长参数的作用。

图11-挥发物与纳米气泡在具有再循环水的水培中通过根到植物的递送方法的优化。测试了不同浓度的挥发物以及用植物肥料和ONB制备挥发物的两种方法。

a)首先制备ONB水，然后向ONB水中添加植物液体肥料(以在自来水中植物生长最佳的浓度)和不同浓度的挥发物。

b)将挥发物和液体肥料混合物添加到自来水中并然后使混合物通过纳米气泡生成器。

c)第一种制备方法(实心灰色和黑色条)显示罗勒对照植物是最高的并且具有最大的茎生物量；植物生长在最高浓度的挥发物中受到抑制。与对照植物相比，第二种NB混合物制备方法(灰色和黑色图案条)显示出对照植物生长抑制、对挥发物的剂量响应和用挥发物处理的植物的植物生长改善。

图12-使用纳米气泡作为液体肥料的递送系统以改善大麻植物中的生长

a)在用再循环自来水(左)或用再循环ONB(右)递送的液体肥料中生长14天后的大麻(Cs)插条。

b)在再循环水培系统中生长14天后，自来水(灰色条)和ONB(黑色条)对CS插条中湿植物生物量的液体肥料摄取的作用。

图13-使用纳米气泡作为植物生长调节剂(赤霉酸和DL-肉碱)的递送系统

a)用再循环自来水(左)或用再循环ONB(右)递送的大麻插条中赤霉酸的摄取。

b)自来水(灰色条)和ONB(黑色条)对大麻插条中赤霉酸的摄取的作用。

c)用再循环自来水(左)或用再循环ONB(右)递送的大麻插条中DL-肉碱的摄取。

d)自来水(灰色条)和ONB(黑色条)对大麻插条中DL-肉碱的摄取的作用。

图14-将空气纳米气泡中的挥发物作为超声雾递送到叶，用于改善莴苣品种的生长

a)在14天后，与没有成雾的对照(左)相比，用超声雾处理的莴苣(Tango品种)到含有具有挥发性化合物的空气纳米气泡的叶(右)。

b)在22天，与没有成雾的对照(左)相比，用超声雾处理的莴苣(Iceberg品种)到含有具有挥发性化合物的空气纳米气泡的叶(右)。

Claims (35)

1.植物栽培系统，其包含：

(i)微气泡和/或纳米气泡生成装置，其用于从至少一种气体生成微气泡和/或纳米气泡；

(ii)植物应用介质，其包含物质、载剂介质和通过所述微气泡和/或纳米气泡生成装置从所述至少一种气体形成的微气泡和/或纳米气泡；和

(iii)应用器系统，以将包含所述物质的所述植物应用介质应用于植物的至少一个部位。

2.权利要求1所述的系统，其中所述应用器系统包含用于将所述植物的根和/或叶浸入所述植物应用介质中的系统。

3.权利要求1或权利要求2所述的系统，其中所述应用器系统包含用于用所述植物应用介质对所述植物喷洒、成雾或喷雾的系统，任选地其中所述至少一种气体包含二氧化碳，并且所述应用器系统包含用于对所述植物的叶喷雾的系统。

4.前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述应用器系统与所述微气泡和/或纳米气泡生成装置流体连通。

5.前述权利要求中任一项所述的系统，其包含水培植物栽培系统。

6.前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述微气泡和/或纳米气泡生成装置是纳米气泡生成装置。

7.前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述物质是或包含至少一种化合物、载体或纳米材料，任选地是表观遗传调节剂。

8.前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述物质是或包含选自以下的至少一种物质：挥发性有机化合物(VOC)；转基因、核酸、DNA、RNA、siRNA、反义寡核苷酸、合成或天然DNA或RNA、多达500个核苷酸，任选地多达200个核苷酸的合成或天然DNA或RNA；植物生长调节剂、赤霉素、生长素、脱落酸、细胞分裂素和乙烯；表观遗传调节剂；RNAi载体、表达载体、病毒载体、单多糖；多酚；萜类化合物；蛋白质或肽，任选地，多达150个氨基酸，任选地多达50个氨基酸的肽；纳米材料，任选地选自以下的纳米材料：脂质纳米颗粒、碳纳米管、铜纳米颗粒、铁或氧化铁纳米颗粒、锰或氧化锰纳米颗粒、二氧化钛纳米颗粒以及锌或氧化锌纳米颗粒；和植物保护产品。

9.权利要求8所述的系统，其中所述物质是或包含选自VOC、RNA、siRNA、反义寡核苷酸、表观遗传调节剂、肽、RNAi、表达和病毒载体的至少一种物质。

10.用于将物质递送至植物细胞的方法，所述方法包括：

(i)提供植物应用介质，所述植物应用介质包含物质、载剂介质和至少一种气体的微气泡和/或纳米气泡；和

(ii)将所述植物应用介质应用于植物的部位。

11.权利要求10所述的方法，其中将所述植物应用介质应用于所述植物的步骤包括将所述植物应用介质应用于所述植物的根和/或叶，任选地通过浸入、喷洒、成雾或喷雾。

12.权利要求10或权利要求11所述的方法，其中将所述物质和微气泡和/或纳米气泡从所述植物的部位运输或转移到至少一个植物细胞，任选地其中将所述物质和微气泡和/或纳米气泡从第一植物组织运输或转移到第二植物组织。

13.权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述物质是或包含至少一种化合物、载体或纳米材料，任选地其中所述物质是或包含选自以下的至少一种物质：挥发性有机化合物(VOC)；转基因、核酸、DNA、RNA、siRNA、反义寡核苷酸、合成或天然DNA或RNA、多达500个核苷酸，任选地多达200个核苷酸的合成或天然DNA或RNA；植物生长调节剂、赤霉素、生长素、脱落酸、细胞分裂素和乙烯；表观遗传调节剂；RNAi载体、表达载体、病毒载体、单多糖；多酚；萜类化合物；蛋白质或肽，任选地，多达150个氨基酸，任选地多达50个氨基酸的肽；纳米材料，任选地选自以下的纳米材料：脂质纳米颗粒、碳纳米管、铜纳米颗粒、铁或氧化铁纳米颗粒、锰或氧化锰纳米颗粒、二氧化钛纳米颗粒以及锌或氧化锌纳米颗粒；和植物保护产品。

14.权利要求13所述的方法，其中所述物质是或包含选自VOC、RNA、siRNA、反义寡核苷酸、表观遗传调节剂、肽、RNAi、表达和病毒载体的至少一种物质，任选地其中所述物质包含表观遗传调节剂。

15.植物应用介质，其用于应用于植物的部位，所述介质包含物质、载剂介质和至少一种气体的微气泡和/或纳米气泡。

16.权利要求15所述的介质，其中所述物质是或包含至少一种化合物、载体或纳米材料，任选地其中所述物质是或包含选自以下的至少一种物质：挥发性有机化合物(VOC)；转基因、核酸、DNA、RNA、siRNA、反义寡核苷酸、合成或天然DNA或RNA、多达500个核苷酸，任选地多达200个核苷酸的合成或天然DNA或RNA；植物生长调节剂、赤霉素、生长素、脱落酸、细胞分裂素和乙烯；表观遗传调节剂；RNAi载体、表达载体、病毒载体、单多糖；多酚；萜类化合物；蛋白质或肽，任选地，多达150个氨基酸，任选地多达50个氨基酸的肽；纳米材料，任选地选自以下的纳米材料：脂质纳米颗粒、碳纳米管、铜纳米颗粒、铁或氧化铁纳米颗粒、锰或氧化锰纳米颗粒、二氧化钛纳米颗粒以及锌或氧化锌纳米颗粒；和植物保护产品。

17.权利要求16所述的介质，其中所述物质是或包含选自VOC、RNA、siRNA、反义寡核苷酸、表观遗传调节剂、肽、RNAi、表达和病毒载体的至少一种物质，任选地其中所述物质包含表观遗传调节剂。

18.植物，其中权利要求15-17中任一项所述的介质已应用于所述植物的部位；任选地，其中所述部位是所述植物的根或所述植物的叶。

19.用于通过将表观遗传调节剂递送到植物来诱导植物的表型、化学或生理学中的变化的方法，所述方法包括：

(i)提供植物应用介质，所述植物应用介质包含物质、载剂介质和至少一种气体的微气泡和/或纳米气泡；和

(ii)将所述植物应用介质应用于植物，由此所述表观遗传调节剂进入所述植物的至少一个植物组织，并且在所述植物的表型、化学或生理学中诱导后续变化。

20.权利要求19所述的方法，其中所述表观遗传调节剂是选自以下的至少一种表观遗传调节剂：挥发性有机化合物(VOC)，任选地真菌、微生物或植物VOC；RNA、siRNA；反义寡核苷酸；肽；RNAi载体；表达载体；病毒载体；和植物生长调节剂。

21.权利要求19或权利要求20所述的方法，其中，在所述方法的使用中，所述表观遗传调节剂诱导DNA甲基化、RNA甲基化、组蛋白甲基化或组蛋白乙酰化，任选地在一个或多个开花基因座中。

22.权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述植物表观遗传调节剂是或包含核酸。

23.用于编辑植物的基因的方法，所述方法包括：

(i)提供植物应用介质，所述植物应用介质包含基因编辑物质、载剂介质和至少一种气体的微气泡和/或纳米气泡；和

(ii)将所述植物应用介质应用于植物，由此所述物质进入至少一个植物细胞。

24.权利要求23所述的方法，其中所述物质包含CRISPR/Cas9构建体，任选地其中所述物质包含由农杆菌属引入的CRISPR/Cas9构建体。

25.用于将植物或作物保护产品递送到植物中的方法，所述方法包括：

(i)提供植物应用介质，所述植物应用介质包含物质、载剂介质和至少一种气体的微气泡和/或纳米气泡；和

(ii)将所述植物应用介质应用于植物；

其中所述物质是或包含至少一种植物或作物保护产品，任选地除草剂或农药，进一步任选地杀虫剂、杀线虫剂或杀螨剂；

其中，在所述方法的使用中，所述植物或作物保护产品吸收到植物组织中，任选地叶或根组织。

26.用于将反义寡核苷酸递送至植物的方法，所述方法包括：

(i)提供植物应用介质，所述植物应用介质包含物质、载剂介质和至少一种气体的微气泡和/或纳米气泡；和

(ii)将所述植物应用介质应用于所述植物；

其中所述物质是或包含至少一种反义寡核苷酸；

其中，在所述方法的使用中，所述反义寡核苷酸进入所述植物的至少一个植物细胞。

27.权利要求26的方法，其中在所述方法的使用中，将所述反义寡核苷酸植物应用介质应用于所述植物的根，任选地其中将所述反义寡核苷酸从所述植物的根转移到所述植物的叶。

28.权利要求1至9中任一项所述的系统、权利要求10至14或权利要求19至27中任一项所述的方法、权利要求15至17中任一项所述的介质，或权利要求18所述的植物，其中至少50％的所生成的微气泡和/或纳米气泡具有小于约1000nm、任选地小于约500nm、任选地约20nm、任选地在10nm至150nm的范围、任选地2nm或更小的直径。

29.权利要求28所述的系统、方法、介质或植物，其中100％或约100％的所生成的微气泡和/或纳米气泡具有小于约1000nm、任选地小于约500nm、任选地约20nm、任选地在10nm至150nm的范围、任选地2nm或更小的直径。

30.权利要求1至9、权利要求28或权利要求29中任一项所述的系统、权利要求10至14或19至29中任一项所述的方法、权利要求15至17、权利要求28或权利要求29任一项所述的介质，或权利要求18、权利要求28或权利要求29所述的植物，其中所述至少一种气体是选自氧气、氮气、二氧化碳和空气的至少一种气体。

31.权利要求1至9或权利要求28至30中任一项所述的系统、权利要求10至14或19至30中任一项所述的方法、权利要求15至17或权利要求28至30中任一项所述的介质，或权利要求18或权利要求28至30中任一项所述的植物，其中所述纳米气泡使用电场生成。

32.权利要求1至9或权利要求28至31中任一项所述的系统、权利要求10至14或19至31中任一项所述的方法、权利要求15至17或权利要求28至31中任一项所述的介质，或权利要求18或权利要求28至31中任一项所述的植物，其中所生成的纳米气泡维持稳定达约2年或更长。

33.权利要求10至14或19至32中任一项所述的方法，其进一步包括预处理步骤，其中在应用所述介质之前，将所述植物的生根新枝在氧纳米气泡水中温育一至两天。

34.权利要求10至14或19至33中任一项所述的方法，其中在植物生命周期中的任何时间，向所述植物提供纳米气泡水和改变基因表达的一种或多种物质的混合物，以实时诱导一种或多种表观遗传变化。

35.权利要求1至9或权利要求28至32中任一项所述的系统、权利要求10至14或19至32中任一项所述的方法、权利要求15至17或权利要求28至32中任一项所述的介质，或权利要求18或权利要求28至32中任一项所述的植物，其中所述植物是大麻、本氏烟草、大麦、烟草、莴苣或罗勒。