CN116637203A - 硫辛酸纳米粒子在制备氧化应激相关疾病治疗药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种硫辛酸纳米粒子在制备氧化应激相关疾病治疗药物中的应用,属于生物医药技术领域。所述氧化应激相关疾病治疗药物采用硫辛酸纳米粒子作为活性成分,可以通过抵抗氧化应激治疗一种或多种疾病。所述硫辛酸纳米粒子的治疗效果明显优于硫辛酸单体,且达到或优于相应阳性药物的治疗效果,有效克服了现有天然小分子抗氧化剂对氧化应激相关疾病治疗效果差的缺点,在低剂量的条件下实现良好的治疗效果,具有临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种用于治疗氧化应激相关疾病的纳米药物。
技术背景
活性氧(ROS)是体内一类氧的单电子还原产物,包括过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(·OH)和超氧化物阴离子(O2 ·-)等。机体正常条件下,由巨噬细胞和中性粒细胞等吞噬细胞产生的ROS通过杀死入侵的病原体来发挥生理作用。然而,ROS的过度产生会引起氧化应激,造成组织和细胞功能障碍,从而加速许多疾病的发展,如神经系统疾病(缺血性脑卒中、帕金森症、阿兹海默症、癫痫、脑血管病、脑膜炎和神经根/丛或周围神经的疾病)、循环系统疾病(动脉粥样硬化、高血压、心内膜炎、心包炎、心肌病和心力衰竭)、呼吸系统疾病(肺纤维化、鼻咽炎、气管炎和哮喘)、泌尿生殖系统疾病(卵巢早衰、宫颈炎、盆腔炎、阴道炎、肾病、膀胱炎和尿道炎)、免疫系统疾病(红斑狼疮和血管炎)、视觉系统疾病(白内障、结膜炎、角膜炎、视网膜病变和青光眼)、消化系统疾病(非酒精性脂肪肝、肝纤维化、肝硬变、肝衰竭、牙周炎、十二指肠溃疡、胆囊炎、胰腺炎、腹膜炎和炎性肠病)、内分泌疾病(糖尿病)、皮肤疾病(银屑病、褐斑、白癜风和疱疹)、肌肉骨骼系统或结缔组织疾病(骨关节炎、滑膜炎、腱鞘炎和滑膜炎)、感染性疾病(结肠炎、胃炎、艾滋病、病毒性肝炎和脓毒症)。由于抗氧化剂能够抵消氧化损伤,被认为是治疗氧化应激相关疾病的合理策略。虽然天然抗氧化剂可在一定程度上降低组织和细胞中活性氧水平,但只能作为保健品发挥保健功能,离临床药品的要求还有很大差距。目前为止,尚未见满足氧化应激相关疾病临床治疗要求的抗氧化药物。
发明内容
针对以上问题,本发明提供了一种用于治疗氧化应激相关疾病的纳米药物,针对氧化应激类相关疾病表现出优异的治疗效果,具有临床应用前景。
本发明包含以下技术方案:
一种用于治疗氧化应激相关疾病的纳米药物,所述纳米药物以硫辛酸纳米粒子作为活性成分,克服了硫辛酸单体治疗效果差的缺点。本发明所述硫辛酸纳米粒子能够缓慢解离释放出硫辛酸活性成分,相对于硫辛酸单体能够在明显更低的剂量下发挥强抗氧化效果,适应氧化应激相关疾病的临床应用需求。
作为可选方式,所述硫辛酸纳米粒子是由含硫辛酸和/或硫辛酸衍生物的原料形成的纳米粒子,所述形成过程可以包括对纳米粒子进行各种改性或修饰。所述硫辛酸衍生物包括硫辛酸盐或对硫辛酸进行的不影响其核心作用发挥的非实质性改性而获得的药学上可接受的改性物(包括但不限于在硫辛酸分子上接枝官能团)。
作为可选方式,所述氧化应激类相关疾病可为神经系统疾病(缺血性脑卒中、帕金森症、阿兹海默症、癫痫、脑血管病、脑膜炎和神经根/丛或周围神经疾病)、循环系统疾病(动脉粥样硬化、高血压、心内膜炎、心包炎、心肌病和心力衰竭)、呼吸系统疾病(肺纤维化、鼻咽炎、气管炎和哮喘)、泌尿生殖系统疾病(卵巢早衰、肾病、宫颈炎、盆腔炎、阴道炎、膀胱炎和尿道炎)、免疫系统疾病(红斑狼疮和血管炎)、视觉系统疾病(白内障、结膜炎、角膜炎、视网膜病变和青光眼)、消化系统疾病(非酒精性脂肪肝、肝纤维化、肝硬变、肝衰竭、牙周炎、十二指肠溃疡、胆囊炎、胰腺炎、腹膜炎和炎性肠病)、内分泌疾病(糖尿病)、皮肤疾病(银屑病、褐斑、白癜风和疱疹)、肌肉骨骼系统或结缔组织疾病(骨关节炎、滑膜炎、腱鞘炎和滑膜炎)和感染性疾病(结肠炎、胃炎、艾滋病、病毒性肝炎和脓毒症)。
作为可选方式,所述氧化应激类相关疾病可为糖尿病及其并发症。所述并发症包括糖尿病性白内障、糖尿病肾病、糖尿病周围神经病变、糖尿病足和糖尿病视网膜神经病变等。
作为可选方式,所述用于治疗氧化应激相关疾病的纳米药物为注射剂或口服剂。
作为可选方式,在上述用于治疗氧化应激相关疾病的纳米药物中,所述纳米药物中的硫辛酸和/或硫辛酸衍生物中的二硫键先被打断,再发生自交联。一部分硫辛酸和/或硫辛酸衍生物的五元环中的二硫键被打断,硫辛酸和/或硫辛酸衍生物分子间的巯基相互之间发生交联,无需额外引入交联分子即可实现稳定交联,药物成分单一、可控。经过交联的纳米药物结构稳定,有利于在血液中长效循环。而未交联的硫辛酸纳米粒子在体内自身会迅速发生解离,使被包封的药物过早释放,从而影响疗效。
作为可选方式,所述用于治疗氧化应激相关疾病的纳米药物为硫辛酸和/或硫辛酸衍生物自组装形成的胶束、囊泡或聚集体。硫辛酸和/或硫辛酸衍生物通过亲疏水作用即可形成自组装体,制备工艺简单,产品结构稳定。
作为可选方式,在上述用于治疗氧化应激相关疾病的纳米药物中,所述纳米药物的粒径为1-1000nm,优选为10-200nm,低于10nm的纳米粒子容易被肾脏清除,高于200nm的纳米粒子容易在肝脏和脾脏中积累,并存在激活补体系统的风险。
作为可选方式,在上述用于治疗氧化应激相关疾病的纳米药物中,所述纳米药物的表面电位为负,有助于减少与调理蛋白的结合,增强长循环。
作为可选方式,在上述用于治疗氧化应激相关疾病的纳米药物中,所述纳米药物还可包载对以上疾病具有治疗作用的其它药物活性成分。
作为可选方式,在上述用于治疗氧化应激相关疾病的纳米药物中,所述纳米药物为负载维生素C的硫辛酸纳米囊泡。
本发明还提供了一种上述用于治疗氧化应激相关疾病的纳米药物的制备方法,具体包括以下步骤:
(1)采用三氮杂壬烷与硫辛酸混合溶于有机溶剂,制备得超两亲分子溶液;
(2)在超声条件下,将(1)中溶液滴加到去离子水中,形成由硫辛酸和三氮杂壬烷构筑的未交联硫辛酸纳米囊泡;
(3)将步骤(2)中未交联硫辛酸纳米囊泡进行紫外光照交联并除去三氮杂壬烷后得到交联硫辛酸纳米囊泡。
本发明还提供了一种上述用于治疗氧化应激相关疾病的纳米药物的制备方法,具体包括以下步骤:
(1)采用N,N-二甲基甲酰胺使硫辛酸溶解,得到硫辛酸母液;
(2)将(1)中硫辛酸母液进行光照交联,得到硫辛酸纳米聚集体。
本发明还提供了一种上述用于治疗氧化应激相关疾病的纳米药物的制备方法,具体包括以下步骤:
(1)将硫辛酸加入碱性水溶液,再用酸溶液调节pH至中性,超声乳化形成硫辛酸纳米粒子。
(2)将上述所得纳米粒子溶液进行光照交联,得到硫辛酸纳米胶束。
作为可选方式,在上述制备方法中,在光照交联过程中,利用紫外光照打断一部分硫辛酸钠五元环中的二硫键并引发二硫键断裂后形成的部分巯基自交联。
作为可选方式,在上述制备方法中,将其它药物活性成分包载于硫辛酸纳米粒子中。
本发明还提供了一种上述硫辛酸纳米粒子在制备氧化应激类疾病治疗药物中的应用。
本说明书中公开的所有特征,或公开的所有方法或过程中的步骤,除了互相排斥的特征和/或步骤以外,均可以以任何方式组合。
本发明的有益效果:
本发明所述纳米药物有效克服了现有天然小分子抗氧化剂对氧化应激相关疾病治疗效果差的缺点,在明显更低的剂量下发挥强抗氧化作用,有效治疗神经系统疾病、循环系统疾病、呼吸系统疾病、泌尿生殖系统疾病、免疫系统疾病、视觉系统疾病、消化系统疾病、内分泌疾病、肌肉骨骼系统或结缔组织疾病和感染性疾病等。具体地,所述纳米药物的治疗效果约为硫辛酸单体的1.5-3倍,且达到或优于相应阳性药物。进一步的,当所述的纳米药物与其他氧化应激相关疾病药物活性成分联用时,具有“1+1>2”的协同效果,进一步提升治疗效果。
附图说明:
图1为硫辛酸纳米粒子治疗氧化应激相关疾病的示意图;
图2为实施例1中不同纳米粒子的粒径,以及交联与未交联硫辛酸纳米囊泡的稳定性;
图3为实施例2中载不同抗氧化剂的纳米粒子的粒径,以及载或不载维生素C硫辛酸纳米囊泡的电位;
图4为实施例3中不同硫辛酸纳米粒子的抗氧化结果;
图5为实施例4中硫辛酸纳米囊泡和载维生素C硫辛酸纳米囊泡清除1,1-二苯基-2-苦肼基、超氧化物阴离子、过氧化氢和羟基自由基的结果;
图6为实施例5中硫辛酸单体、硫辛酸纳米囊泡和载维生素C硫辛酸纳米囊泡体外抗氧化活性的实验结果;
图7为实施例6中硫辛酸单体、硫辛酸纳米囊泡和载维生素C硫辛酸纳米囊泡抑制脂质过氧化物丙二醛的实验结果;
图8实施例7中硫辛酸单体、硫辛酸纳米囊泡和载维生素硫辛酸纳米囊泡抑制细胞层面炎症因子的实验结果;
图9为实施例8中硫辛酸单体、硫辛酸纳米囊泡、硫辛酸单体+维生素C和载维生素C硫辛酸纳米囊泡治疗动脉粥样硬化的体内结果;
图10为实施例9中硫辛酸单体和硫辛酸纳米囊泡治疗缺血性脑卒中的体内结果;
图11为实施例10中硫辛酸单体和硫辛酸纳米囊泡治疗肺纤维化的体内结果;
图12为实施例11中硫辛酸单体和硫辛酸纳米囊泡治疗非酒精性脂肪肝的体内结果;
图13为实施例12中硫辛酸单体和硫辛酸纳米囊泡治疗卵巢早衰的体内结果;
图14为硫辛酸纳米粒子治疗动脉粥样硬化的机制示意图。
具体实施方式:
以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改,以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进,均应包括在本发明的保护范围内。
实施例1不同硫辛酸纳米粒子的制备
硫辛酸纳米胶束的制备
将300mg硫辛酸(LA)加至150mL去离子水中,在搅拌条件下逐滴加入1M的NaOH水溶液至LA完全溶解,再用1M的HCl溶液滴定LA溶液至中性,溶液冷冻干燥后得到硫辛酸钠粉末。称取41.2mg硫辛酸钠,溶解在1mL去离子水中,超声乳化形成硫辛酸纳米粒子。将上述所得纳米粒子通过365nm紫外光照引发硫辛酸二硫键自交联,反应2.5h,透析48h后得到尺寸约为15nm的交联硫辛酸纳米胶束,结果如图2a所示。
硫辛酸纳米囊泡的制备
将210mg硫辛酸(LA)和43.5mg模板分子1,4,7-三氮杂壬烷溶于3.5mL的二甲基亚砜(DMSO)中,振荡4h,形成超两亲分子溶液;在超声条件下,将上述超两亲分子溶液缓慢滴加到300mL去离子水中,形成由LA和1,4,7-三氮杂壬烷构筑的未交联硫辛酸纳米囊泡,粒径如图2a所示。上述未交联硫辛酸纳米囊泡通过365nm紫外光照4h引发硫辛酸二硫键自交联,NaOH调节pH至9.0左右,二氯甲烷萃取3次,除去溶液中的1,4,7-三氮杂壬烷,之后上清液用稀HCl调至中性,再用去离子水透析48h(spectrum/pore,MWCO 2000)制备得到粒径约为130nm左右的交联硫辛酸纳米囊泡,结果如图2a所示。
稳定性测试:分别取4.5mL上述交联硫辛酸纳米囊泡和未交联硫辛酸纳米囊泡与0.5mL胎牛血清孵育2h,测其孵育前后的粒径变化。结果如图2b所示,交联纳米囊泡尺寸未发生改变,保持在130nm左右,而未交联纳米囊泡则从100nm下降到仅几十纳米,说明交联的硫辛酸纳米囊泡比未交联硫辛酸纳米囊泡更为稳定。
硫辛酸纳米聚集体的制备
将41.2mg硫辛酸溶于1mL DMF中,在振荡器上振荡2h后得到0.2M的硫辛酸母液。取50μL该母液在超声条件下加入到5mL去离子水中得到硫辛酸纳米粒子。将上述所得纳米粒子通过365nm紫外光照2.5h引发硫辛酸二硫键自交联,透析48h后得到尺寸约为80nm的交联硫辛酸聚集体,结果如图2a所示。
实施例2包载不同抗氧化剂硫辛酸纳米粒子的制备
载亲水性抗氧化剂维生素C硫辛酸纳米囊泡的制备
将10g维生素C(VC)溶于50mL硫辛酸空囊泡溶液中,待完全溶解后于4℃冰箱中静置13h,避光透析16h后制备得载维生素C的硫辛酸纳米囊泡(VC@cLAVs)。结果如图3a、b所示,VC@cLAVs粒径约为200nm,电位约为-6mV。
载亲脂性抗氧化剂维生素E的硫辛酸纳米胶束的制备
称取200mg硫辛酸钠和50mg维生素E(VE)溶解在5mL去离子水中,超声乳化形成硫辛酸纳米粒子。将上述所得纳米粒子通过365nm紫外光照2.5h引发硫辛酸二硫键自交联,透析48h后得到尺寸约为30nm的交联硫辛酸纳米胶束,结果如图3a所示。
载亲脂性抗氧化剂辅酶Q10的硫辛酸纳米聚集体的制备
取200mg硫辛酸与50mg辅酶Q10溶于5mL DMF中,在振荡器上振荡2h后得到0.2M的硫辛酸母液。取50μL该母液在超声条件下加入到5mL去离子水中得到硫辛酸纳米粒子,通过365nm紫外光照2.5h引发硫辛酸二硫键自交联,透析48h后得到尺寸约为110nm的交联硫辛酸纳米聚集体,结果如图3a所示。
载阿托伐他汀的硫辛酸纳米囊泡的制备
称取200mg硫辛酸纳米囊泡和20mg阿托伐他汀共溶于50mL去离子水中,搅拌5h后透析24h制备得载阿托伐他汀的硫辛酸纳米囊泡(AVT@cLAVs),粒径约为180nm,电位约为-15mV。
实施例3不同硫辛酸纳米粒子的抗氧化活性
不同硫辛酸纳米粒子的抗氧化活性:将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板中(透明底,黑板),培养12h后,将细胞进行饥饿孵育18h。对照组细胞不做任何处理,三个实验组分别加入8μg/mL实施例1中制备的三种硫辛酸纳米粒子孵育6h,弃去培养基后,模型组和实验组加入无血清的LPS(500ng/mL)处理12h,接着所有组加入无血清的DCFH-DA探针(30uM)孵育30min,采用荧光酶标仪检测胞内ROS,荧光强度的大小反应检测到的ROS的强度。如图4a所示:与模型组相比,三种硫辛酸纳米粒子对应的荧光强度明显减弱(P<0.01),并且三种纳米粒子间的荧光强度差异较小(P>0.05),说明三种纳米粒子具有强的抗氧化活性且纳米粒子间抗氧化活性无显著差异。
载不同抗氧化剂的硫辛酸纳米粒子的抗氧化活性:将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板中(透明底,黑板),培养12h后,将细胞进行饥饿孵育18h。对照组细胞不做任何处理,三个实验组分别加入20μg/mL实施例2中制备的三种包载不同抗氧化剂的硫辛酸纳米粒子孵育6h,弃去培养基后,模型组和实验组加入无血清的LPS(500ng/mL)处理12h,接着所有组加入无血清的DCFH-DA探针(30μM)孵育30min,采用荧光酶标仪检测胞内ROS,结果如图4b所示:负载抗氧化剂的纳米粒子的荧光强度比对应未负载抗氧化剂的空纳米粒子显著降低(P<0.05),表明纳米粒子包载抗氧化剂后抗氧化能力进一步增强。
实施例4硫辛酸纳米囊泡与载维生素C硫辛酸纳米囊泡清除1,1-二苯基-2-苦基肼、超氧化物阴离子、过氧化氢和羟基自由基的能力
通过清除率评价硫辛酸纳米粒子清除活性氧的能力:
清除率(%)=(1-A/A0)×100
1. 1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)的清除
(1)DPPH测试液的配制
取10mg DPPH溶于200mL无水乙醇中,超声5min,充分混匀。取1mL DPPH溶液,检测其在519nm处的紫外吸光度(A),使A=1.2-1.3之间最佳。
(2)cLAVs和VC@cLAVs样品液的配制
用无水乙醇配制浓度为0、5、10、15、20、25、30和35μg/mL样品梯度溶液。
(3)测量
取(1)中DPPH测试液2mL加入到玻璃瓶中,加无水乙醇200uL,充分混合,测量A值,此A值为A0;取(1)中DPPH测试液2mL分别加入200uL(2)中样品梯度溶液,混合均匀,静置30min后测A值。每一个浓度设三个平行对照。结果如图5a所示,35μg/mL的cLAVs能产生约71%的DPPH清除率,35μg/mL的VC@cLAVs能产生约86%的DPPH清除率。
2.超氧化物阴离子(O2 ·-)的清除
(1)邻苯三酚/三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)测试液的配制
取100mg邻苯三酚溶于20mL PBS中,超声溶解,配制得5mg/mL的邻苯三酚溶液;取1.21g Tris至100mL蒸馏水中,加HCl调pH至8.2,得到Tris-HCl溶液。
(2)cLAVs和VC@cLAVs样品液的配制
用PBS配制浓度为0、5、10、15、20、25、30和35μg/mL样品梯度溶液。
(3)测量
取(1)中Tris-HCl溶液2950uL置于25℃水浴中预热20min,分别加入(2)中cLAVs和VC@cLAVs 1mL和(1)中50μL邻苯三酚溶液,混匀后于25℃中反应5min,然后加入1mL 8moL/LHCl溶液终止反应,测定325nm处紫外吸光度为A,以1mL PBS代替样品溶液,测得吸光度为A0。每一个浓度设三个平行对照。结果如图5b所示,35μg/mL cLAVs产生约79%的O2 ·-清除率,35μg/mL的VC@cLAVs能产生约90%的O2 ·-清除率。
3.过氧化氢(H2O2)的清除
(1)H2O2测试液的配制
将50μL 30%H2O2与25mL去离子水混匀,制备得20mM H2O2溶液。
(2)cLAVs和VC@cLAVs样品液的配制
用PBS配制浓度为0、5、10、15、20、25、30和35μg/mL样品梯度溶液。
(3)测量
取(1)中12mL H2O2溶液分别与(2)中1mL中样品梯度液均匀混合,37℃摇床孵育24h。然后每组取100uL上述混合溶液加入到含有1mL pH=4.0标准液的EP管中,加入20μL3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB 5mg/mL)和20uL辣根过氧化物酶(HRP,0.2μg/mL),孵育5min后,测定650nm处的吸光度为A,以100uL PBS代替样品溶液,测定吸光度为A0。每一个浓度设三个平行对照。结果如图5c所示,浓度为35μg/mL的cLAVs产生约68%的H2O2清除率,浓度为35μg/mL的VC@cLAVs产生约84%的H2O2清除率。
4.羟基自由基(·OH)的清除
(1)H2O2和FeSO4测试液的配制
取40μL 30%H2O2至100mL容量瓶中,用蒸馏水定容,配置成浓度为4mmol/L的H2O2溶液;称取13.9mg FeSO4晶体置于10mL容量瓶中,溶解并定容,配置成浓度为5mmol/L的FeSO4溶液。
(2)cLAVs和VC@cLAVs样品液的配制
用PBS配制浓度为0、5、10、15、20、25、30和35μg/mL样品梯度溶液。
(3)测量
各取(1)中H2O2,FeSO4和(2)中样品液1mL,混匀后静置10min,加入1mL甲基紫溶液,孵育12h,578nm测定吸光度为A。以1mL PBS代替样品溶液,测定吸光度A0。每一个浓度设三个平行对照。结果如图5d所示,35μg/mL的cLAVs产生约65%的·OH清除率,35μg/mL的VC@cLAVs产生约83%的·OH清除率。
以上结果表明,cLAVs可以强效清除ROS,包封维生素C以后,抗氧化能力进一步增强。比较而言,0.4mg/mL维生素C可以清除大约80-90%的H2O2(1mM),而35μg/mL的cLAVs能清除大约68%的H2O2(2mM),进一步包封维生素C后清除率达到83%(2mM)。以上结果证实硫辛酸纳米药物可以高效清除广谱ROS,有利于氧化应激相关疾病的治疗。
实施例5硫辛酸纳米囊泡和载维生素C硫辛酸纳米囊泡的体外抗氧化活性
选择处于对数生长活跃期的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)接种于6孔板,培养12h后,分别加入8μg/mL硫辛酸(LA)、8μg/mL硫辛酸空纳米囊泡(cLAVs)和20μg/mL的载维生素C硫辛酸纳米囊泡(VC@cLAVs)孵育3h,并设置对照组和模型组。然后加入500ng/mL的LPS刺激6h,加入30uM的DCFH-DA探针,孵育30min后通过共聚焦显微镜测定体外抗活性氧能力。
选择处于对数生长活跃期的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)接种于48孔板,培养12h后,分别加入8μg/mL LA、8μg/mL cLAVs和20μg/mL的VC@cLAVs孵育3h,并设置对照组和模型组,每一个浓度设5个平行对照。然后加入500ng/mL的LPS孵育6h,加入30μM的DCFH-DA探针,孵育30min后收集细胞,通过流式定量测定体外抗活性氧能力。结果如图6所示:LA单体组与模型组相比荧光强度降低29.9%(P<0.05),而cLAVs组荧光强度与模型组相比降低60.6%(P<0.01),是相同剂量LA单体的2倍(P<0.05),表明纳米囊泡强的抗氧化作用;此外,VC@cLAVs组荧光强度较模型组降低67.7%(P<0.001),是cLAVs的1.2倍(P<0.05);表明负载维生素C以后纳米囊泡抗氧化活力进一步增强。
实施例6硫辛酸纳米囊泡和载维生素C硫辛酸纳米囊泡对脂质过氧化物丙二醛的抑制作用
选择处于对数生长活跃期的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)接种于48孔板,培养12h后,加入8μg/mL硫辛酸(LA)、8μg/mL硫辛酸纳米囊泡(cLAVs)和20μg/mL载维生素C硫辛酸纳米囊泡(VC@cLAVs)孵育3h,并设置对照组和模型组,每一个浓度设5个平行对照。然后加入500ng/mL LPS刺激12h,刺激完成后,收集细胞,用细胞裂解液裂解细胞,4℃以15000r离心20min后,收集上清用丙二醛(MDA)检测试剂盒测定MDA的产生。结果如图7所示:与模型组相比,LA单体组MDA减少25.3%(P<0.05),而cLAVs组MDA减少40.1%(P<0.01),是相同剂量LA单体的1.6倍(P<0.05);同时,VC@cLAVs组MDA减少62.6%(P<0.001),是cLAVs的1.6倍(P<0.05);以上结果表明纳米囊泡显著抑制脂质过氧化物MDA的产生,负载维生素C后抑制作用进一步增强。
实施例7硫辛酸纳米囊泡和载维生素C硫辛酸纳米囊泡的抗炎作用
选择处于对数生长活跃期的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)接种于24孔板,培养12h后,分别加入8μg/mL硫辛酸(LA)、8μg/mL硫辛酸纳米囊泡(cLAVs)和20μg/mL载维生素C硫辛酸纳米囊泡(VC@cLAVs)孵育3h,并设置对照组和模型组。然后用酶联免疫检测试剂盒检测上清液中的炎性细胞因子,包括肿瘤坏死因子-а(TNF-а)、白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和抗炎因子白细胞介素-10(IL-10)。结果如图8所示:用LPS诱导的模型组显著增加了促炎细胞因子的分泌,并抑制了抗炎因子的分泌;与模型组相比,LA单体组IL-6、TNF-а和MCP-1分别降低17.9%、38.3%和26.4%(P<0.01),IL-10升高30.6%(P<0.01);而cLAVs组IL-6、TNF-а和MCP-1分别降低26.9%、32.9%和44.0%,IL-10升高35.3%,IL-6、MCP-1降低效果分别约为相同剂量LA单体的1.5倍和1.7倍(P<0.05);同时,VC@cLAVs组IL-6、TNF-а和MCP-1分别降低33.2%、55.9%和45.7%,IL-10升高39.1%,IL-6和TNF-а降低效果分别是cLAVs的1.2倍和1.7倍(P<0.05);以上结果表明纳米囊泡强的抗炎作用,包封维生素C后抗炎作用进一步增强。
实施例8硫辛酸纳米囊泡和载维生素C硫辛酸纳米囊泡降低动脉粥样硬化斑块的效果
将50只喂食高脂饲料一个月的ApoE-/-小鼠随机分成5组,每组10只,使用不同治疗剂治疗2个月。模型对照组的小鼠用生理盐水处理,其他四组分别尾静脉注射20mg/kg的硫辛酸单体(LA)、20mg/kg的硫辛酸纳米囊泡(cLAVs)、20mg/kg的硫辛酸单体(LA)+30mg/kg维生素C(VC)和50mg/kg的载维生素C硫辛酸纳米囊泡(VC@cLAVs)。所有制剂在1周内静脉注射两次。到达治疗时间后,ApoE-/-小鼠被处安乐死。切除主动脉并用多聚甲醛固定,然后纵向剖开后用0.3%油红染色,并对斑块面积进行定量分析。结果如图9a-d所示,LA单体组与对照组无显著性差异(P>0.05),而cLAVs组较对照组阳性区域减少59.0%(P<0.01),VC@cLAVs较对照组阳性区域减小73.7%(P<0.001)。切除主动脉根并用多聚甲醛固定,在10%中性缓冲福尔马林固定后,制备石蜡主动脉根切片,用油红对斑块进行染色。结果如图9c、e所示,对照组显示出主动脉根的高阳性区域(~21%),LA单体组与对照组相比无显著性差异(P>0.05),而cLAVs组较对照组阳性区域减少46.2%(P<0.01),VC@cLAVs较对照组阳性区域减小64.6%(P<0.001)。上述整根主动脉和主动脉根病变区域量化结果表明cLAVs可有效治疗动脉粥样硬化,包封维生素C后其疗效进一步强化。
实施例9硫辛酸纳米囊泡治疗缺血性脑卒中的体内结果
首先采用缝合封闭法构建大鼠MCAO模型。具体地,雄性SD大鼠(250~280g)用1%戊巴比妥麻醉后,分开其左颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。之后,从ECA到ICA插入尼龙缝线,阻断大脑中动脉的血供,到时间后撤回缝线以实现再灌注。在MCAO模型构建前1小时通过腹腔注射给药100mg/kg的硫辛酸单体(LA)和50mg/kg的硫辛酸囊泡(cLAVs),DMSO、生理盐水作为对照(n=3)。大鼠脑缺血1小时后实施脑血管再通,分别在再灌注0、6、24h后对模型小鼠进行神经功能评分。神经功能评分是使用完善的五点量表方法进行的(评分表,4=自发转圈,3=通过拉尾巴向左转圈,2=左前爪握力下降,1=左前爪伸展失败,0=无缺损)。神经评分评估后,处死大鼠,立即取出脑组织并在-20℃下冷冻5min。将脑切片制成2mm厚,然后用2%的2,3,5-三苯基氯化四唑(TTC)在37℃染色30min。组织切片保存在4%多聚甲醛溶液中。对TTC染色切片进行拍照,并使用图像工具3.0将梗塞半球冠状切面的百分比面积显示为梗塞体积。结果如图10a所示,经过cLAVs治疗后的大鼠在6h后的神经功能评分相较对照组有明显的降低,并且cLAVs(50mg/kg)组优于两倍剂量的LA单体(100mg/kg)组,说明cLAVs对神经功能的显著改善。24h后的脑组织TTC切片显示,cLAVs治疗后的大鼠脑组织中白色的梗死区域相较对照组显著减小(图10b)。通过对组织梗死面积定量(图10c),发现经过cLAVs治疗的大鼠脑组织的梗死面积相较对照组减小了6倍,而LA组相较于对照组仅减小了2.8倍。综上,cLAVs在使用剂量只有LA单体一半的情况下达到了远优于LA单体的治疗效果,表明cLAVs在治疗缺血性脑卒中的巨大潜力。更重要的是,LA单体的溶剂为DMSO,而cLAVs溶于生理盐水,后者具备更大的临床价值。
实施例10硫辛酸纳米囊泡治疗肺纤维化的体内结果
雄性C57BL/6小鼠50只,按体重随机分为5组,每组10只小鼠,分别为假手术组、模型对照组、硫辛酸囊泡组(100mg/kg)、硫辛酸单体组(100mg/kg)和阳性药比菲尼酮治疗组。各组小鼠腹腔注射苯巴比妥钠(50mg/kg)麻醉后,乙醇消毒颈部皮肤,于颈中部作钝性分离,暴露气管,模型组和竹柏内酯D组于气管软骨环间隙缓慢注入博莱霉素50μL(3.5mg/kg),对照组注入相同体积的生理盐水。注入后立即直立旋转小鼠,使液体在双肺均匀分布,并缝合颈部皮肤。自造模第7天起,按10mL/kg体积腹腔注射给予分组设置药物,每天1次,连续15次;假手术对照组及模型组小鼠每日腹腔注射同体积生理盐水。实验动物于造模21天后处死小鼠。取右肺下叶组织,置于4%多聚甲醛溶液中固定,常规石蜡包埋、切片,苏木素-伊红(H&E)染色观察肺组织验证、细胞变性和纤维化状况,马松三色(Masson's trichrome)染色法观察肺组织内胶原纤维增生情况。另称取30mg右肺上叶组织,按试剂盒说明碱水解法检测羟脯氨酸含量。
实验结果如图11所示,博莱霉素气管滴注21天后,假手术组小鼠肺组织结构清晰,肺泡呈多边形囊状小体,肺泡腔内无分泌物,肺泡上皮结构完整,肺泡壁未见增厚,肺泡隔中未见炎性细胞,可见丰富毛细血管,细支气管壁及肺泡隔仅有少量蓝色胶原纤维沉积。博莱霉素模型组小鼠肺泡结构紊乱,肺泡壁明显增厚,肺泡隔中巨噬细胞和淋巴细胞浸润明显,肺泡壁及间隔可见大量的蓝染胶原纤维,肺组织羟脯氨酸含量明显升高,表明模型组有明显的肺纤维化损伤。与模型组相比,LA单体组肺损伤评分降低32.3%(p<0.05),肺部纤维化面积减少45.7%(p<0.05),肺组织羟脯氨酸含量减少28.8%(p<0.05),表明LA对肺纤维化有一定的作用。作为治疗特发性肺纤维化的临床药物,比菲尼酮治疗后显示,肺损伤评分降低67.9%(p<0.01),肺部纤维化面积减少75.0%(p<0.01),肺组织羟脯氨酸含量减少48.4%(p<0.01);而硫辛酸纳米囊泡组肺损伤评分降低78.0%(p<0.01),肺部纤维化面积减少77.0%(p<0.01),肺组织羟脯氨酸含量减少55.6%(p<0.01),治疗效果分别为同剂量LA单体的2.4、1.7和1.9倍(p<0.05),且与比菲尼酮治疗效果无显著性差异(p>0.05)。以上结果表明硫辛酸纳米囊泡在治疗肺纤维化中的巨大潜力。
实施例11硫辛酸纳米囊泡治疗非酒精性脂肪肝的体内结果
雄性C57BL/KsJ db/db小鼠,SPF级,由江苏集萃药康生物科技有限公司常州分公司提供,合格证号:202012449,初始体重44±2g。C57BL/KsJ db/db小鼠18只,按体重随机分为3组,每组6只,分别为db/db模型组、db/db+硫辛酸囊泡组(30mg/kg)和db/db+硫辛酸单体组(30mg/kg);db/m小鼠作为对照组。按10mL/kg体积分别腹腔注射给予不同剂量的药物,每天一次,连续四周,对照组和模型组腹腔注射给予等体积的生理盐水。实验动物于第4周末给药1h后,检测小鼠体重后,眼球摘除放血处死,高速离心机室温下3000转/分,离心15min分离血清标本;按试剂盒说明测量小鼠血清中ALT、AST和FFA含量。肝左叶和附睾脂肪组织经4%多聚甲醛固定,脱水、透明、石蜡包埋、切片,苏木素-伊红(HE)染色观察肝组织炎症、细胞脂肪样变和附睾脂肪细胞肥大情况,油红O(Oil red O)染色观察肝组织脂质沉积情况。
实验结果如图12所示,在改善肝组织病变方面,db/m对照组小鼠肝小叶结构清晰,肝细胞索由中央静脉向四周整齐排列;db/db模型组小鼠可见肝细胞质疏松、空泡变性,肝实质有大量脂滴聚集,肝组织重量明显增加,提示模型组有明显的肝组织病变。与模型组相比,LA单体组肝脏损伤评分降低59.2%(p<0.05),脂质沉积面积减少51.7%(p<0.05),肝脏重量减少13.0%(p<0.05),表明LA对非酒精性脂肪肝组织病变有一定的作用。硫辛酸纳米囊泡组肝脏损伤评分降低83.0%(p<0.01),脂质沉积面积减少77.1%(p<0.01),肝脏重量减少35.3%(p<0.01),治疗效果分别为同剂量LA单体的1.4、1.5和2.7倍(p<0.05)。以上结果显示硫辛酸纳米囊泡对非酒精性脂肪肝组织病变的优异治疗效果。
在改善肝功方面,与db/m对照组比较,db/db模型组小鼠血清中ALT、AST和FFA水平显著升高(P<0.05),提示模型组出现严重的肝功能损伤;与db/db模型组比较,LA单体组血清ALT含量减少30.3%(p<0.05),AST含量减少43.5%(p<0.05),FFA含量减少17.6%(p<0.05),表明LA对非酒精性脂肪肝肝功有一定的改善作用。硫辛酸纳米囊泡组血清ALT含量减少44.2%(p<0.01),AST含量减少59.1%(p<0.01),FFA含量减少38.2%(p<0.01),治疗效果分别为同剂量LA单体的1.5、1.4和2.2倍(p<0.05),并与正常对照组无显著性差异(p>0.05),表明硫辛酸纳米囊泡对非酒精性脂肪肝肝功损伤的优异治疗效果。
实施例12硫辛酸纳米囊泡治疗卵巢早衰的体内结果
将饲养至28周的C57小鼠随机分为5组,每组10只,分别为正常对照组、模型组、硫辛酸单体(20mg/kg)组、硫辛酸纳米囊泡(20mg/kg)和褪黑素组(20mg/kg)。正常对照组小鼠不做任何处理,其余各组小鼠通过一次性腹腔注射120mg/kg环磷酰胺进行卵巢早衰模型构建。自造膜第七天起,按l0 mL/kg体积腹腔注射给予分组设置药物,每天1次,连续注射21天,正常对照组和模型组给予生理盐水。给药结束后,眼球取血检测小鼠血清中AMH(抗缪勒氏管激素)和FSH(促卵泡生成素)含量。结果如图13所示,环磷酰胺处理后的模型组的AMH含量显著降低,FSH含量显著升高,说明小鼠的卵巢功能明显受损。与模型组相比,硫辛酸单体组和褪黑素组均无显著性差异(P>0.05);硫辛酸纳米囊泡较模型组相比AMH升高40%(P<0.05),FSH降低50.0%(P<0.01),并且与正常组无显著性差异(P>0.05),表明硫辛酸纳米囊泡在治疗卵巢早衰中的临床潜力。
实施例13载阿托伐他汀的纳米囊泡治疗动脉粥样硬化
将50只喂食高脂饲料一个月的ApoE-/-小鼠随机分成5组,每组10只,使用不同治疗剂治疗2个月。模型对照组的小鼠用生理盐水处理,其他四组分别为尾静脉注射20mg/kg的硫辛酸单体(LA)、20mg/kg的硫辛酸纳米囊泡(cLAVs)、30mg/kg的阿托伐他汀(AVT)和50mg/kg的载阿托伐他汀的硫辛酸纳米囊泡(AVT@cLAVs)。所有制剂在1周内静脉注射两次。到达治疗时间后,ApoE-/-小鼠被处安乐死。切除主动脉并用多聚甲醛固定,然后纵向剖开后用0.3%油红染色,并对斑块面积进行定量分析。结果显示:对照组显示出高阳性区域;与对照组相比,LA单体组与对照组无显著性差异(P>0.05),AVT组阳性区域下降49.8%(P<0.01),cLAVs组阳性区域下降52.3%(P<0.01),与AVT组无显著性差异(P>0.05),以上结果表明20mg/kg的cLAVs的治疗效果与30mg/kg的AVT治疗效果相当。进一步地,AVT@cLAVs阳性区域下降74.3%,分别是cLAVs和AVT的1.4倍和1.5倍,表明cLAVs包载阳性药物阿托伐他汀后其疗效进一步强化。
实施例14
硫辛酸纳米囊泡治疗红斑狼疮的体内结果。将20周雌性NZBWF1(SLE)小鼠随机分为3组,每组10只,分别为模型组(生理盐水)、LA单体组(50mg/kg)和硫辛酸纳米囊泡组(50mg/kg);以NZW/LacJ(n=10)作为对照组(生理盐水)。按10mL/kg体积分别腹腔注射给予不同剂量的药物,每周两次,连续8周。治疗结束后,将小鼠用异氟醚麻醉处死并收集样本,测定血浆中内毒素的水平、T盒转录因子(T-bet)和GATA结合蛋白3(GATA-3)的表达。结果显示:与对照组相比,模型组表现出较高的内毒素水平(P<0.001);LA单体组与模型组无显著差异(P>0.05);纳米囊泡组较模型组内毒素水平下降45.6%(P<0.01);与对照组小鼠比较,模型组小鼠的T-Bet蛋白表达和mRNA水平显著降低(P<0.001),GATA-3蛋白和mRNA表达水平均显著升高(P<0.001);LA单体组与模型组无显著性差异(P>0.05);硫辛酸囊泡组较模型组相比,T-Bet蛋白表达和mRNA水平分别升高45.8%和42.5%(P<0.05),GATA-3蛋白表达和mRNA水平分别降低47.5%和27.5%(P<0.05)。以上结果表明硫辛酸纳米囊泡对红斑狼疮的优异治疗效果。
硫辛酸纳米囊泡治疗糖尿病性白内障的体内结果。将SD大鼠随机分为4组,每组10只,分别为对照组(生理盐水)、模型组(生理盐水)、LA单体组(30mg/kg)和硫辛酸纳米囊泡组(30mg/kg)。除正常对照组外,其余各组通过静脉注射STZ(45mg/kg)构建糖尿病性白内障模型。按10mL/kg体积分别腹腔注射给予不同剂量的药物,每周三次,连续8周。试验结束后处死大鼠测定晶状体中MDA和GSH含量水平,晶状体用HE染色。结果显示:与对照组相比,模型组中MDA含量显著升高(P<0.001),谷胱甘肽水平显著降低(P<0.001);硫辛酸单体组MDA含量和谷胱甘肽水平较模型组均无显著变化(P>0.05);硫辛酸纳米囊泡较模型组MDA含量下降48.5%(P<0.01),谷胱甘肽水平升高21.5%(P<0.05)。HE结果显示,硫辛酸纳米囊泡组糖尿病大鼠的晶状体前囊包括上皮细胞和晶状体纤维均如对照组大鼠一样有序排列,而LA单体组晶状体较模型组无显著变化。以上结果表明硫辛酸纳米囊泡在治疗糖尿病性白内障中的临床潜力。
硫辛酸纳米囊泡治疗结肠炎的体内结果。雄性C57BL/6只小鼠随机分为4组,每组10只,分别为对照组(生理盐水)、模型组(生理盐水)、LA单体组(30mg/kg)和硫辛酸纳米囊泡组(30mg/kg)。除正常对照组,其余各组通过口服3%葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导结肠炎6天,然后7天连续口服给予药物。实验结束后处死小鼠测定炎症因子和组织病理。结果显示:与对照组相比,模型组TNF-а和IL-6呈高表达(P<0.001)。与模型组相比,硫辛酸单体组TNF-а和IL-6均无显著变化(P>0.05),而硫辛酸纳米囊泡TNF-а和IL-6的水平分别降低36.7%和40.2%(P<0.01)。HE染色进一步证实DSS通过破坏结肠隐窝结构,积累炎症细胞,导致结肠组织严重损伤;LA单体治疗不能减轻DSS诱导的结肠损伤,而硫辛酸纳米囊泡处理小鼠结肠组织结构接近正常。以上结果表明口服硫辛酸纳米囊泡在治疗结肠炎中的临床潜力。
实施例15
参照实施例1和2所述方法制备硫辛酸纳米囊泡,然后使用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)通过酰胺化反应将Arg-Gly-Asp(RGD)接枝到上述硫辛酸纳米囊泡上,制得具有靶向基团修饰的纳米药物。参照实施例8所述的方法,验证接枝RGD的纳米囊泡治疗动脉粥样硬化的效果。结果显示:与未接枝RGD的纳米囊泡相比,接枝RGD增强了纳米囊泡到达靶部位的效率,在使用剂量只有囊泡剂量一半的情况下达到了相当于囊泡的治疗效果。
实施例16
参照实施例4-15所述的实验方法,分别将其中的囊泡换成胶束和聚集体,得到的实验论与实施例4-15基本一致。
以上所述仅为本发明的优选实施例,对本发明而言仅是说明性的,而非限制性的;本领域普通技术人员理解,在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变,修改,甚至等效变更,但都将落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.硫辛酸纳米粒子在制备氧化应激相关疾病治疗药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述氧化应激相关疾病为神经系统疾病、循环系统疾病、呼吸系统疾病、泌尿生殖系统疾病、免疫系统疾病、视觉系统疾病、消化系统疾病、内分泌疾病、皮肤疾病、肌肉骨骼系统或结缔组织疾病和感染性疾病中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述氧化应激相关疾病为缺血性脑卒中、帕金森症、阿兹海默症、癫痫、脑血管病、神经根/丛或周围神经疾病、脑膜炎、动脉粥样硬化、高血压、心内膜炎、心包炎、心肌病、心衰、肺纤维化、鼻咽炎、气管炎、哮喘、卵巢早衰、宫颈炎、盆腔炎、阴道炎、肾病、膀胱炎、尿道炎、红斑狼疮、血管炎、白内障、结膜炎、角膜炎、视网膜病变、青光眼、非酒精性脂肪肝、肝纤维化、肝硬变、肝衰竭、牙周炎、十二指肠溃疡、胆囊炎、胰腺炎、腹膜炎、炎性肠病、褐斑、银屑病、白癜风、疱疹、骨关节炎、滑膜炎、腱鞘炎、滑膜炎、结肠炎、胃炎、艾滋病、病毒性肝炎和脓毒症中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述硫辛酸纳米粒子是由含硫辛酸和/或硫辛酸衍生物的原料形成的纳米粒子。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述硫辛酸纳米粒子中硫辛酸和/或硫辛酸衍生物的五元环中二硫键先被打断,硫辛酸分子相互之间发生交联。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述纳米粒子的表面电位为负。
7.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,以硫辛酸纳米粒子为载体,包载其它药物活性成分,所述硫辛酸纳米粒子既作为药物活性成分,又起到纳米载体的作用。
8.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述纳米粒子的粒径为1-1000nm。
9.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,将其制成注射剂或口服剂。
10.一种用于治疗氧化应激相关疾病的药物,其特征在于,含有硫辛酸纳米粒子。
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