CN116637085A - 椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的制备方法及应用 - Google Patents

椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116637085A
CN116637085A CN202310828497.5A CN202310828497A CN116637085A CN 116637085 A CN116637085 A CN 116637085A CN 202310828497 A CN202310828497 A CN 202310828497A CN 116637085 A CN116637085 A CN 116637085A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mirna
disc degeneration
group
autologous cell
intervertebral disc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310828497.5A
Other languages
English (en)
Inventor
杨惠林
郭江博
杨依林
罗宗平
施勤
钮俊杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of Suzhou University
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Suzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of Suzhou University filed Critical First Affiliated Hospital of Suzhou University
Priority to CN202310828497.5A priority Critical patent/CN116637085A/zh
Publication of CN116637085A publication Critical patent/CN116637085A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5063—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • A61K9/5068—Cell membranes or bacterial membranes enclosing drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的制备方法，步骤包括：(1)将miRNAmimics加入髓核细胞的PBS重悬液中；(2)使用梯度孔径减小的聚碳酸酯膜以及NV制备仪器对髓核细胞进行挤压，经过除菌、离心后获得自体细胞源NV负载miRNA；该种椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA制备治疗椎间盘退变的药物和复合药物中。本发明提供了一种自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的方法，通过识别椎间盘退变中的应力响应关键miRNA及其生物学功能，并将自体髓核细胞源NV对其进行负载，实现椎间盘内miRNA的有效递送，最终发挥延缓异常应力负荷椎间盘退变的功能。

Description

椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的制备方法及 应用
技术领域
本发明属于生物医疗技术领域，具体涉及一种椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的制备方法及应用。
背景技术
椎间盘退行性变是引起下腰痛、椎间盘突出、椎管狭窄等临床疾病的重要基础病理改变。然而目前临床上，对于椎间盘退变，治疗方法旨在缓解临床症状，而非干预其进展，探索缓解椎间盘退变进展的方法是目前的研究热点。
miRNA是一类非编码RNA，可以通过调节下游mRNA的表达对椎间盘退变中的多种生物学行为进行调控。调节miRNA的表达，进而调控椎间盘细胞的生物学功能，对于延缓椎间盘退变是具有希望的方法。椎间盘退变是一个多因素参与的过程，其中异常应力负荷是引起椎间盘进展的重要因素。部分miRNA具有响应力学信号的特点，参与椎间盘退变中异常应力负荷引起的生物学改变。进一步识别应力响应miRNA及其生物学功能，对于延缓椎间盘退变具有重要意义。
由于单纯裸miRNA在体内存在易降解性、不稳定性等问题，实现miRNA在椎间盘内的有效递送是其发挥作用的关键步骤。细胞外囊泡，可以携带诸多RNA、蛋白质、脂质，实现细胞间通讯，调节生物学功能。然而，细胞外囊泡产量低，成本较高，尚无法满足临床上大规模应用。一种细胞外囊泡模拟物——纳米囊泡(Nanovesicle，NV)，是具有希望的递送载体。NV可以通过梯度孔径减小的纳米滤膜挤压细胞获得，并且具有与细胞外囊泡相似的理化特征，具有与细胞外囊泡相似的生物分布行为和靶向效应，更重要的是，相对于细胞外囊泡，NV可以实现规模化生产，是一种具有前途的递送载体。同时，NV可以通过同源靶向表现出有效的内化。以上表明自体细胞源NV可能是椎间盘组织的有效递送载体。基于此，本发明提供了一种椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的制备方法及应用。
发明内容
本发明提供了一种椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的制备方法及应用，实现椎间盘内miRNA的有效递送，最终发挥延缓异常应力负荷椎间盘退变的功能。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的制备方法，步骤包括：(1)将miRNAmimics加入PBS重悬液中；(2)使用梯度孔径减小的聚碳酸酯膜以及NV制备仪器对髓核细胞进行挤压，除菌，离心后加入PBS缓冲液重悬沉淀，最终获得自体细胞源NV负载miRNA。
进一步地，所述miRNA包括rno-miR-10a-5p、rno-miR-30a-3p、rno-miR-16-5p、rno-miR-1249和rno-miR-370-3p中的至少一种。
进一步地，所述PBS重悬液为270万髓核细胞的PBS重悬液。
进一步地，所述梯度孔径包括1.0μm、0.4μm或0.2μm。
进一步地，所述NV制备仪器为脂质体挤出器。
所述挤压步骤包括：安装好NV制备仪器与1.0μm聚碳酸酯膜，在注射器中加入PBS重悬液，交互推两侧的推杆11次，细胞在通过聚碳酸脂膜时候被挤压并装载miRNAmimics，之后分别更换为0.4μm、0.2μm聚碳酸酯膜按照上述步骤继续对细胞进行挤压。
进一步地，所述离心步骤包括：经过1.5g、15min、4℃离心后弃沉淀保留上清液，对上清液进行15g、60min、4℃离心后弃上清。
第二方面，自体细胞源纳米囊泡负载miRNA应用在制备延缓椎间盘退变的药物或复合药物中。
第三方面，自体细胞源纳米囊泡负载miRNA应用在制备治疗椎间盘退变的药物或复合药物中。
进一步地，所述药物的剂型为气雾剂、片剂、胶囊剂、滴丸、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质剂、透皮剂、口含剂、栓剂或冻干粉针剂。
本发明的有益效果在于：本发明设计了一种自体髓核细胞源NV负载miRNA的策略，通过识别椎间盘退变中的应力响应关键miRNA及其生物学功能，并将自体髓核细胞源NV对其进行负载，实现椎间盘内miRNA的有效递送，最终发挥延缓异常应力负荷椎间盘退变的功能。
附图说明
图1-1异常压应力负荷引起的椎间盘退变体内模型的建立及椎间盘磁共振检测、X线检测；其中，(a)成功建立压应力载荷加载的椎间盘退变模型，压缩装置对尾椎椎间盘Co8-9进行压力加载；(b)Sham组与IDD组代表性T2磁共振图像；(c)Sham组与IDD组T2磁共振图像尾椎椎间盘Co8-9的T2信号强度统计；(d)Sham组与IDD组代表性X线图像；(e)Sham组与IDD组尾椎椎间盘Co8-9的椎间盘高度指数改变统计。****表示P<0.0001，n＝7；
图1-2为异常压应力负荷引起的椎间盘退变模型体外模型示意图；
图1-3为髓核细胞压应力加载后细胞外基质合成代谢、分解代谢基因表达；其中，(a-b)压应力加载12小时后，细胞外基质合成代谢基因Col2、Acan在Compression 12h组显著下调相对于Sham 12h组；(c-d)压应力加载12小时后，细胞外基质分解代谢基因Mmp13、Adamts5在Compression 12h组显著上调相对于Sham 12h组。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，n＝3；
图1-4为髓核细胞压应力加载后细胞外基质COL2、MMP13蛋白水平表达检测；其中，(a)髓核细胞压应力加载后细胞外基质COL2、MMP13蛋白水平表达Western Blot显影图；(b)髓核细胞在压应力分别加载12、24小时后细胞外基质COL2蛋白水平表达统计分析；(c)髓核细胞在压应力分别加载12、24小时后细胞外基质MMP13蛋白水平表达统计分析。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001，n＝3。
图1-5为候选应力响应miRNA聚类热图及miR-1249在异常压应力负荷引起的退变髓核细胞及髓核组织中的验证；其中，(a)候选应力响应miRNA聚类热图；(b)候选应力响应miRNA在髓核细胞Compression组及Sham组的表达水平；(c)miR-1249在髓核组织IDD组及Sham组中的验证。*表示P<0.05，**表示P<0.01，n＝3。
图1-6为过表达miR-1249对于异常压应力负荷髓核细胞的细胞外基质合成代谢的作用；其中，(a)过表达miR-1249对于异常压应力负荷髓核细胞的细胞外基质合成代谢Acan和Col2基因水平的表达检测；(b)过表达miR-1249对于异常压应力负荷髓核细胞细胞外基质合成代谢ACAN和COL2蛋白水平的Western Blot检测显影图；(c)过表达miR-1249对于异常压应力负荷髓核细胞的细胞外基质合成代谢ACAN和COL2蛋白水平的定量分析。**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001，n＝3。
图1-7为过表达miR-1249对于异常压应力负荷髓核细胞的细胞外基质分解代谢的作用；其中，(a)过表达miR-1249对于异常压应力负荷髓核细胞的细胞外基质分解代谢Mmp13和Adamts5基因水平的表达检测；(b)过表达miR-1249对于异常压应力负荷髓核细胞的细胞外基质分解代谢MMP13和ADAMTS5蛋白水平的Western Blot检测显影图；(c)过表达miR-1249对于异常压应力负荷髓核细胞的细胞外基质分解代谢MMP13和ADAMTS5蛋白水平的定量分析。*表示P<0.05，**表示P<0.01，****表示P<0.0001，n＝3。
图2-1为髓核细胞源NV的表征；其中，(a)髓核细胞源NV纳米粒径分析；(b)髓核细胞源NV透射电镜观察，可见典型的脂质双分子层类细胞外囊泡结构；(c)Western Blot检测细胞外囊泡标记物在髓核细胞源NV上的表达显影图；(d)细胞外囊泡标记物在髓核细胞源NV上的蛋白表达水平定量分析，*表示P<0.05，***表示P<0.001，****表示P<0.0001，n＝3。
图2-2为NV可以有效递送miRNA到受体髓核细胞；其中，(a)20X和40X倍数下，NV、miRNA、髓核细胞代表性荧光显微镜图；(b)20X和40X倍数下，NV和miRNA的荧光共定位分析，二者荧光具有明显的共定位分布特征；(c)带有蓝色荧光的细胞、以及同时带有蓝色荧光/黄色荧光的细胞计数统计，二者无显著性差异。ns表示P>0.05，n＝6。
图3-1为SD大鼠尾椎椎间盘Co8-9磁共振检测；其中，(a)各组代表性椎间盘Co8-9磁共振影像结果；(b)各组椎间盘Co8-9磁共振T2强度统计分析。#表示与Sham组相比，P<0.0001；+表示与IDD组相比，P<0.0001，****表示P<0.0001，n＝7。
图3-2为SD大鼠尾椎椎间盘Co8-9 X线检测；其中，(a)各组代表性椎间盘Co8-9 X线影像结果；(b)各组椎间盘Co8-9磁共振椎间盘高度指数改变统计分析。#表示与Sham组相比，P<0.0001；+表示与IDD组相比，P<0.0001，****表示P<0.0001，n＝7。
图3-3为SD大鼠尾椎椎间盘组织学分析；其中，(a)各组代表性椎间盘Co8-9苏木素-伊红染色及番红O-快绿染色结果；(b)各组椎间盘Co8-9椎间盘组织学评分统计分析。#表示与Sham组相比，P<0.0001；+表示与IDD组相比，P<0.01，*表示P<0.05，n＝7。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。下面用更为详细的实施例对本发明进行说明：
实施例1：椎间盘退变中应力响应miRNA的识别及生物学功能探索
1.1异常应力负荷引起的椎间盘退变模型构建
(1)体内模型构建：在大鼠第7至第10尾椎(Co7-10)安装压缩装置作为椎间盘退变组(IDD组，图1-1(a))，假手术组(Sham组)仅置入克氏针，四周后，进行影像学检测。
结果显示：IDD组尾椎椎间盘Co8-9的T2信号强度显著低于Sham组(P<0.0001，图1-1(b-c))。IDD组尾椎椎间盘Co8-9的椎间盘高度指数改变显著低于Sham组(P<0.0001，图1-1(d-e))。4周压应力加载可以引起椎间盘退变。
(2)体外模型构建：使用自制压应力加载装置，对髓核细胞进行压应力加载并作为压缩组(Compression组)，压应力大小为2.0g/cm2(图1-2)。假损伤组(Sham组)仅置入载玻片，压应力大小为0.1g/cm2。
结果显示：压应力加载12小时后，如图1-3(a-b)所示，细胞外基质合成代谢基因Col2、Acan在Compression 12h组显著下调相对于Sham 12h组，差异具有统计学意义(均P<0.05)。如图1-3(c-d)所示，细胞外基质分解代谢基因Mmp13、Adamts5在Compression 12h组显著上调相对于Sham 12h组，差异具有统计学意义(均P<0.01)。另外，对压应力加载12小时、24小时后的髓核细胞进行细胞外基质COL2、MMP13蛋白水平表达检测。如图1-4所示，在12小时压应力加载后，Compression 12h组COL2蛋白表达显著低于Sham 12h组(P<0.0001)，Compression 12h组MMP13蛋白表达显著高于Sham 12h组(P<0.0001)。12小时压应力加载可以引起髓核细胞退变。
1.2应力响应性miRNA的识别
构建体内异常压应力负荷椎间盘退变模型，对髓核组织进行miRNA高通量测序，利用标准化的reads数，计算倍数变化，P-value和FDR，以倍数变化≥1.5，P-value＜0.05作为差异miRNA筛选阈值。根据鉴定到的差异表达miRNA，按照倍数变化，从大到小对已知的差异表达miRNA进行排列。使用miRBase数据库，仔细比对差异表达miRNA在人和大鼠的序列，对于上调基因和下调基因，选取序列相一致的排名前5位倍数变化较大的miRNA作为候选miRNA，共计10个候选miRNA，证应力响应性miRNA在体内、体外异常应力椎间盘退变模型中的表达水平。
结果显示：10个候选应力响应性miRNA，在IDD组上调的是rno-miR-125a-5p、rno-miR-28-5p、rno-miR-21-5p、rno-miR-22-5p、rno-miR-335，在IDD组下调的是rno-miR-10a-5p、rno-miR-30a-3p、rno-miR-16-5p、rno-miR-1249、rno-miR-370-3p(图1-5(a))。
在异常压应力负荷引起退变的髓核细胞中，检测上述候选miRNA的表达(图1-5(b))。数据显示miR-1249是符合筛选条件的miRNA，在异常压应力负荷引起的退变髓核组织中，检测了miR-1249的表达水平(图1-5(c))，与测序结果和体外实验结果相一致，miR-1249在IDD组中相对于Sham组显著下调(P<0.01)。因此，miR-1249是椎间盘退变中关键的应力响应miRNA。
1.3应力响应性miRNA的生物学功能
本实施例对髓核细胞进行miR-1249过表达瞬时转染，探究其对于髓核细胞的细胞外基质代谢分子表达的影响。
结果显示：如图1-6所示，在基因水平上，Compression组相对于Sham组造成合成代谢基因Acan(P<0.01)和Col2(P<0.0001)显著下调。而经过miR-1249mimics过表达后，Compression+mimics组相对于Compression+NC组可以显著上调压应力所造成的Acan(P<0.001)和Col2(P<0.0001)基因的下调。在蛋白水平上，Compression组相对于Sham组造成显著的合成代谢蛋白ACAN和COL2下调(均P<0.0001)，而经过miR-1249mimics过表达后，Compression+mimics组相对于Compression+NC组可以显著上调压应力所造成的ACAN(P<0.01)和COL2(P<0.01)蛋白水平的下调。
如图1-7所示，在基因水平上，Compression组相对于Sham组造成分解代谢基因Mmp13(P<0.01)和Adamts5(P<0.05)显著上调。而经过miR-1249mimics过表达后，Compression+mimics组相对于Compression+NC组可以显著下调压应力所造成的Mmp13(P<0.05)和Adamts5(P<0.0001)基因的上调。在蛋白水平上，Compression组相对于Sham组造成显著的分解代谢蛋白MMP13(P<0.01)和ADAMTS5上调(P<0.01)，而经过miR-1249mimics过表达后，Compression+mimics组相对于Compression+NC组可以显著下调压应力所造成的MMP13(P<0.05)和ADAMTS5(P<0.05)蛋白水平的上调。miR-1249模拟物挽救了压应力负荷引起的髓核细胞的细胞外基质代谢失衡。
实施例2：髓核细胞源NV的表征与递送miRNA能力鉴定
2.1髓核细胞源NV的表征
使用梯度孔径减小的聚碳酸酯膜(孔径分别为1.0、0.4、0.2μm)以及NV制备仪器(脂质体挤出器)对髓核细胞进行挤压，经过除菌、离心后获得NV。
对髓核细胞源NV进行了相关表征，其结果显示：如图2-1所示，对NV进行纳米粒径分布分析，NV的粒径众数值出现在166.9nm，中值粒径为200.8nm。并且通过透射电镜观察，可以看到典型的脂质双分子层类细胞外囊泡结构。
检测细胞外囊泡经典标记物(ALIX、TSG101、CD63、CD9)在NV上的表达，并以髓核细胞作为对照。
结果显示，相对于Cell组，NV组高表达TSG101(P<0.05)、CD63(P<0.05)、CD9(P<0.001)标记物，而ALIX标记物则在NV组相对于Cell组低表达(P<0.0001)；NV表现出与细胞外囊泡相似的特征。
2.2髓核细胞源NV的递送miRNA能力鉴定
制备含带有FAM荧光的miRNAmimics NC的髓核细胞源NV，将40μL带有FAM荧光的miRNAmimics NC(20μM)加入270万髓核细胞的PBS重悬液中；使用梯度孔径减小的聚碳酸酯膜(分别是1.0μm、0.4μm、0.2μm)以及NV制备仪器对髓核细胞进行挤压，具体步骤为安装好NV制备仪器与1.0μm聚碳酸酯膜，在注射器中加入髓核细胞PBS重悬液，交互推两侧的推杆11次，细胞在通过聚碳酸脂膜时候被挤压并装载带有FAM荧光的miRNAmimics NC，之后分别更换为0.4μm、0.2μm聚碳酸酯膜按照上述步骤继续对细胞进行挤压，使用0.22μm滤器除菌，经过1.5g、15min、4℃离心后弃沉淀保留上清液，对上清液进行15g、60min、4℃离心后弃上清，加入PBS缓冲液重悬沉淀，最终获得自体细胞源NV负载带有FAM荧光的miRNAmimics NC，并使用DiI工作液(25μM)对NV进行染色，以浓度100μg/mL的NV孵育髓核细胞12小时，12小时后，对髓核细胞进行DAPI染色，荧光显微镜观察。
结果显示：如图2-2所示，不同倍数(20X和40X)下均可以清晰地看到髓核细胞(蓝色荧光)富集了miRNA(绿色荧光)与NV(红色荧光)，同时对miRNA荧光和NV的荧光进行共定位分析显示，绿色荧光与红色荧光在20X和40X的倍数下，呈现明显的荧光共定位分布；通过三种荧光的融合，可以看到黄色荧光与蓝色荧光的集聚，进一步地，对带有蓝色荧光的细胞(Blue组)、以及同时带有蓝色荧光/黄色荧光的细胞(Blue/Yellow组)进行计数，计数结果显示，二者无显著性差异，以上证明孵育12小时，髓核源NV即可有效携带miRNA递送到受体髓核细胞。
实施例3：自体髓核细胞源NV负载应力响应miRNA延缓椎间盘退变进展
为了检测髓核细胞源NV负载应力响应miRNA在体内椎间盘退变的干预效果，构建了异常压应力负荷引起的椎间盘退变大鼠模型，制备了负载miR-1249mimics的NV(NV-mimics)以及负载miRNAmimics NC(NV-NC)的NV，将40μL的miR-1249mimics或miRNAmimicsNC(20μM)加入270万髓核细胞的PBS重悬液中；使用梯度孔径减小的聚碳酸酯膜(分别是1.0μm、0.4μm、0.2μm)以及NV制备仪器对髓核细胞进行挤压，具体步骤为安装好NV制备仪器与1.0μm聚碳酸酯膜，在注射器中加入髓核细胞PBS重悬液，交互推两侧的推杆11次，细胞在通过聚碳酸脂膜时候被挤压并装载miR-1249mimics或miRNA mimics NC，之后分别更换为0.4μm、0.2μm聚碳酸酯膜按照上述步骤继续对细胞进行挤压，使用0.22μm滤器除菌，该滤器为Millipore品牌的一次性针头滤器，经过1.5g、15min、4℃离心后弃沉淀保留上清液，对上清液进行15g、60min、4℃离心后弃上清，加入PBS缓冲液重悬沉淀，最终获得自体细胞源NV负载miR-1249mimics或miRNAmimics NC，并在第三周、第四周对大鼠Co8-9进行注射操作，其中NV-mimics、NV-NC浓度为100μg/mL，四周后对椎间盘组织进行检测。
3.1椎间盘磁共振分析
对各组SD大鼠尾椎椎间盘Co8-9进行磁共振检测，结果如图3-1所示。从代表性磁共振影像结果可以看到，Sham组尾椎Co8-9椎间盘磁共振表现出最好的信号强度，IDD组、PBS组尾椎Co8-9椎间盘磁共振信号强度明显变暗，NV-NC组相对于IDD组，其尾椎Co8-9椎间盘磁共振信号强度则表现出一定的改善，NV-mimics组相对于IDD组，其尾椎Co8-9椎间盘磁共振信号强度则表现最好的增强。
另外，对尾椎Co8-9椎间盘磁共振信号强度进行统计，相对于Sham组，IDD组经过四周压应力加载，磁共振T2信号强度显著降低(P<0.0001)。PBS组与IDD组相比，T2信号强度无显著性差异。而NV-NC组与NV-mimics组与IDD组相比，相对于IDD组，NV-NC组与NV-mimics组的T2信号强度均显著上高(均P<0.0001)。同时NV-mimics组与NV-NC组相比，T2信号强度在NV-mimics组显著升高(P<0.0001)。
3.2椎间盘X线分析
对各组SD大鼠尾椎椎间盘Co8-9进行X线检测，结果如图3-2所示。从尾椎Co8-9 X线代表性结果可以看到，Sham组表现出最好的椎间盘高度，IDD组、PBS组椎间盘高度明显降低，而NV-NC组相对于IDD组，其椎间盘高度具有一定的改善，NV-mimics组相对于IDD组，其椎间盘高度表现出最好的改善。
另外，对尾椎Co8-9椎间盘高度指数改变进行统计，相对于Sham组，IDD组经过四周压应力加载，椎间盘高度指数改变显著降低(P<0.0001)。PBS组与IDD组相比，椎间盘高度指数改变无显著性差异。而NV-NC组与NV-mimics组与IDD组相比，相对于IDD组，NV-NC组与NV-mimics组的椎间盘高度指数改变均显著上高(均P<0.0001)。同时NV-mimics组与NV-NC组相比，椎间盘高度指数改变在NV-mimics组显著升高(P<0.0001)。
3.椎间盘组织学分析
对各组SD大鼠尾椎椎间盘Co8-9进行石蜡切片，组织学染色分析，结果如图3-3所示。组织切片染色显示，Sham组表现出较好的椎间盘高度以及髓核组织形态，IDD组髓核区域基本由紊乱的纤维组织代替，PBS组仅残留极少部分的髓核组织，NV-NC组的髓核组织则相对IDD组相比有部分的恢复，而在NV-mimics组的髓核组织相对于IDD组表现出最多的恢复。经过组织学评分分析，相对于Sham组，IDD组经过四周压应力加载，组织学评分显著升高(P<0.0001)。PBS组与IDD组相比，组织学评分无显著性差异。而NV-NC组与NV-mimics组与IDD组相比，相对于IDD组，NV-NC组与NV-mimics组的组织学评分改变均显著下降(均P<0.01)。同时NV-mimics组与NV-NC组相比，组织学评分在NV-mimics组显著下降(P<0.05)。
通过椎间盘磁共振、X线、组织学分析，结果明确了髓核细胞源NV负载miRNA具有延缓异常压应力负荷引起的椎间盘退变进展的作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的产品及详细制备方法，但本发明并不局限于上述产品和详细制备方法，即不意味着本发明必须依赖上述产品和详细制备方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅料成分的添加，具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单的变形。这些简单变形均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的制备方法，其特征在于，步骤包括：（1）将miRNA mimics加入PBS重悬液中；（2）使用梯度孔径减小的聚碳酸酯膜以及NV制备仪器对髓核细胞进行挤压，除菌，离心后加入PBS缓冲液重悬沉淀，最终获得自体细胞源NV负载miRNA。
2.根据权利要求1所述的一种椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的制备方法，其特征在于，所述miRNA包括rno-miR-10a-5p、rno-miR-30a-3p、rno-miR-16-5p、rno-miR-1249和rno-miR-370-3p中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的制备方法，其特征在于，所述PBS重悬液为270万髓核细胞的PBS重悬液。
4.根据权利要求1所述的一种椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的制备方法，其特征在于，所述梯度孔径包括1.0μm、0.4μm或0.2μm。
5.根据权利要求1所述的一种椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的制备方法，其特征在于，所述NV制备仪器为脂质体挤出器。
6.根据权利要求1所述的一种椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的制备方法，其特征在于，所述挤压步骤包括：安装好NV制备仪器与1.0μm聚碳酸酯膜，在注射器中加入PBS重悬液，交互推两侧的推杆11次，细胞在通过聚碳酸脂膜时候被挤压并装载miRNAmimics，之后分别更换为0.4μm、0.2μm聚碳酸酯膜安装上述步骤继续对细胞进行挤压。
7.根据权利要求1所述的一种椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的制备方法，其特征在于，所述离心步骤包括：经过1.5g、15min、4℃离心后弃沉淀保留上清液，对上清液进行15g、60min、4℃离心后弃上清。
8.自体细胞源纳米囊泡负载miRNA在制备延缓椎间盘退变的药物或复合药物中的应用。
9.自体细胞源纳米囊泡负载miRNA在制备治疗椎间盘退变的药物或复合药物中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述药物的剂型为气雾剂、片剂、胶囊剂、滴丸、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质剂、透皮剂、口含剂、栓剂或冻干粉针剂。
CN202310828497.5A 2023-07-07 2023-07-07 椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的制备方法及应用 Pending CN116637085A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310828497.5A CN116637085A (zh) 2023-07-07 2023-07-07 椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310828497.5A CN116637085A (zh) 2023-07-07 2023-07-07 椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的制备方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116637085A true CN116637085A (zh) 2023-08-25

Family

ID=87625017

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310828497.5A Pending CN116637085A (zh) 2023-07-07 2023-07-07 椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116637085A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117462749A (zh) * 2023-10-20 2024-01-30 中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院 一种环境适应型动态水凝胶及其制备方法和应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117462749A (zh) * 2023-10-20 2024-01-30 中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院 一种环境适应型动态水凝胶及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Osorio-Querejeta et al. MiR-219a-5p enriched extracellular vesicles induce OPC differentiation and EAE improvement more efficiently than liposomes and polymeric nanoparticles
You et al. Metabolically engineered stem cell–derived exosomes to regulate macrophage heterogeneity in rheumatoid arthritis
Feng et al. Reversing the surface charge of MSC‐derived small extracellular vesicles by εPL‐PEG‐DSPE for enhanced osteoarthritis treatment
te Boekhorst et al. MRI-assessed therapeutic effects of locally administered PLGA nanoparticles loaded with anti-inflammatory siRNA in a murine arthritis model
JP7217473B2 (ja) ハイドロゲル粒子およびその製造方法、ハイドロゲル粒子を内包する細胞または細胞構造体、ハイドロゲル粒子を用いた細胞活性の評価方法、並びにハイドロゲル粒子の徐放性製剤としての使用
CN116637085A (zh) 椎间盘退变中自体细胞源纳米囊泡负载miRNA的制备方法及应用
Costagliola di Polidoro et al. Theranostic design of angiopep-2 conjugated hyaluronic acid nanoparticles (Thera-ANG-cHANPs) for dual targeting and boosted imaging of glioma cells
CN113355290B (zh) 一种抗肿瘤的工程化外泌体、制备方法和应用
US20190307794A1 (en) Method for inducing transdifferentiation of immune cells based on exosomes
CN113969304A (zh) 细胞外囊泡在制备治疗或预防代谢性炎症综合征疾病的制剂中的应用
US20220288146A1 (en) Plant exosomes used for treatment of diseases originating from protein aggregates formed in cells
Son et al. Mesenchymal stem cell-extracellular vesicle therapy for stroke: scalable production and imaging biomarker studies
Xu et al. Oligodendrocyte progenitor cell-specific delivery of lipid nanoparticles loaded with Olig2 synthetically modified messenger RNA for ischemic stroke therapy
Ellison et al. Therapeutic and diagnostic potential of extracellular vesicles in amyotrophic lateral sclerosis
CN116496971A (zh) 艾叶来源外泌体样纳米囊泡及其应用和药物
CN114748508A (zh) 一种神经干细胞外泌体及其制备药物中的用途
CN112426537B (zh) 一种多肽纳米胶束及其制备方法和应用
CN115381880B (zh) 一种融合纳米囊泡及其制备方法与应用
Wang et al. Compounding engineered mesenchymal stem cell-derived exosomes: A potential rescue strategy for retinal degeneration
CN114854667B (zh) 一种猕猴桃来源的植物纳米囊泡及其应用
CN110638760A (zh) 一种cxcr4修饰的蛇床子素长循环脂质体、制备方法以及其应用
CN110585168A (zh) 一种利用细胞表面囊泡作为药物载体的用途
Liu et al. Drug-Loaded Nanoparticles from ‘Ershiwuwei Shanhu’Pill Induced Cellular Swelling of SH-SY5Y Neuroblastoma Cells
CN117771217B (zh) miR-29在制备预防溃疡性结肠炎靶向纳米药物中的应用
CN114903870B (zh) 一种工程化细胞膜纳米颗粒及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination