CN116635058A

CN116635058A - 抗病毒剂

Info

Publication number: CN116635058A
Application number: CN202180085108.3A
Authority: CN
Inventors: 罗德尼·韦恩·克莱科姆; 科林·罗杰·奥格尔; 凯瑟琳·海伦·亚当
Original assignee: Quantec Ltd
Current assignee: Quantec Ltd
Priority date: 2020-11-06
Filing date: 2021-11-04
Publication date: 2023-08-22

Abstract

本发明涉及用于治疗或预防一种或多种病毒感染的产品和方法。特别地，本发明涉及通常从乳中获得的一种或多种蛋白用于治疗或预防一种或多种病毒感染的用途。在特定的实施方式中，本发明使用乳蛋白的组合来治疗或预防一种或多种病毒感染。本发明的产品可以与其他活性剂，包括其他抗病毒剂来组合使用。

Description

抗病毒剂

发明领域

背景技术

病毒是一种只在生物的活细胞内复制的小的感染原。由病毒病原体引起的病症的实例包括普通感冒、流感、水痘和唇疱疹。

感染病毒的动物的自然免疫应答可能足以改善感染病毒的影响或者甚至消除感染病毒。通过疫苗的使用也可以加速免疫应答，其甚至可以针对特定的病毒感染产生实际的免疫。疫苗的特异性的有利之处在于疫苗可以刺激强烈的应答，以及还有不利之处在于它们可能针对甚至密切相关的病毒无效。

此外，并非对于所有病毒都存在疫苗，并且超过200种已知病毒会导致季节性感冒和流行性感冒，并且为所有这些病毒接种是不现实的。幼儿平均每年经历8至10次感冒。

除了预防性疫苗治疗外，还开发了许多抗病毒剂，通常用于预防、抑制或降低病毒针对受试者或在受试者内的病毒活性。开发抗病毒剂的部分挑战是，病毒本质上依赖宿主生物细胞进行复制。因此，很难成功定位针对病毒有效而对宿主生物细胞不产生不利影响的抗病毒剂的靶标。

唇疱疹是由单纯疱疹病毒(HSV-1)引起的，并且是一种常见的疾病。一旦感染，人可能会经历溃疡复发。抗病毒药物可以降低症状的严重程度并降低发生，但只能凭处方使用。对于大多数病例，非处方局部治疗只能提供对于症状的缓解，并且不能解决症状的根本原因。HSV-2可以引起生殖器疱疹。

病毒感染的症状可以从轻微到严重衰弱不等。如果不治疗，病毒感染可能引起死亡。许多病毒，包括引起AIDS、HPV感染和病毒性肝炎的病毒，都能够导致慢性感染。

在相当多的病例中，人流感能够导致高烧、流涕、咽喉痛、肌肉和关节疼痛、头痛、咳嗽、感觉疲劳和死亡。每年，人流感导致约三至五百万例重症病例，和约290,000至650,000例死亡。在已知的流感病毒属(包括甲、乙、丙、丁型流感病毒)中，甲型流感病毒已导致相当多的大流行病，已造成数百万人死亡。基于对这些病毒的抗体应答，甲型流感病毒可以细分为不同的血清型，包括：

·H1N1，于1918年引起西班牙流行性感冒，以及于2009年引起猪流行性感冒

·H2N2，于1957年引起亚洲流行性感冒

·H3N2，于1968年引起香港流行性感冒

·H5N1，于2004年引起禽流行性感冒

·H7N7，具有不同寻常的人畜共患潜力

·H1N2，在人、猪和禽中流行

·H9N2

·H7N2

·H7N3

·H10N7

·H7N9，于2018年被定级为在甲型亚型中具有最大的大流行病潜力

·H6N1，只感染了一个人，他已经康复。

已经发现了两类抗病毒药物——神经氨酸酶抑制剂和M2抑制剂，然而这些药物的疗效并不强，并且针对这两类药物都产生了耐药性。

冠状病毒是感染哺乳动物和禽的包膜RNA病毒。严重急性呼吸综合征(SARS)和中东呼吸综合征两者都是乙型冠状病毒属(Betacoronavirus)的成员，并且分别导致亚洲和中东数百人死亡。2019年末，新型的SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)病原体的出现，具有快速的人传人和国际传播，引发了紧迫的全球卫生紧急情况。作为响应，在世界卫生组织(WorldHealth Organisation,WHO)基于全球SARS-CoV-2疾病(COVID-19)的大量病例宣布大流行病后，全球正在努力进行有效治疗。迫切需要有效的冠状病毒疫苗来预防这种病毒的传播，并且同时也迫切需要新的治疗策略来降低全球死亡率数目。

鉴定治疗策略被认为是应对这一大流行病的最快手段。然而，由于非预期的副作用，除了缺乏实质性证据证明其在治疗冠状病毒感染方面的疗效外，开发专门针对冠状病毒的新治疗选择的临床需求仍然明显未得到满足。

根据巴尔的摩分类法，冠状病毒属于冠状病毒科(Coronaviridae)，其包括四个属，即α冠状病毒、β冠状病毒(β-CoV)、γ冠状病毒和δ冠状病毒。α冠状病毒和β冠状病毒感染物种范围很广，包括人。在这方面，对人具有特定临床重要性的β-CoV包括A谱系的OC43和HKU1、B谱系的严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和SARS-CoV-2(引起COVID-19疾病)，以及C谱系的中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)。随着新的病毒毒株的出现，仍然需要开发新的、安全的、有效的抗病毒疗法。理想地，抗病毒疗法可以作为具有直接抗病毒特性和/或支持免疫系统对暴露做出有效应答的卫生与健康产品提供。

本发明旨在解决前述问题中的一个或多个，或者至少为公众提供有用的选择。

发明内容

在第一方面，本发明提供了一种预防、抑制或降低病毒对细胞或在细胞内的病毒活性的方法，所述方法包括以下步骤：使所述病毒或所述细胞与有效量的至少两种蛋白的组合接触，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取。

在第二方面，本发明提供了一种预防、抑制或降低病毒对受试者或在受试者内的病毒活性的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者给药有效量的至少两种蛋白的组合，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取。

在第三方面，本发明提供了一种治疗或预防受试者的病毒感染的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者给药有效量的至少两种蛋白的组合，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取。

在第四方面，本发明提供了至少两种蛋白的组合在制备用于预防、抑制或降低病毒对细胞或在细胞内的病毒活性的药物中的用途，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取。

在第五方面，本发明提供了至少两种蛋白的组合在制备用于预防、抑制或降低病毒对受试者或在受试者内的病毒活性的药物中的用途，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取。

在第六方面，本发明提供了至少两种蛋白的组合在制备用于治疗或预防受试者的病毒感染的药物中的用途，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取。

在第七方面，本发明提供了至少两种蛋白的组合，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取，用于预防、抑制或降低病毒在细胞上或细胞中的病毒活性。

在第八方面，本发明提供了至少两种蛋白的组合，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取，用于预防、抑制或降低病毒对受试者或在受试者内的病毒活性。

在第九方面，本发明提供了至少两种蛋白的组合，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取，用于治疗或预防受试者中病毒感染。

现在已经发现，至少两种蛋白的组合，具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点并且从乳中提取的每种蛋白具有抗病毒活性。

在优选实施方式中，组合显示抗病毒活性所针对的一种或多种病毒是：

i.来自冠状病毒科的毒株；诸如来自正冠状病毒亚科的毒株；诸如来自α冠状病毒属、β冠状病毒属(β-CoV)、γ冠状病毒属和δ冠状病毒属之一的毒株；诸如来自β冠状病毒属的毒株；诸如SARS病毒；诸如SARS-CoV毒株和/或SARS-CoV-2毒株；诸如COVID-19；

ii.人流感病毒，诸如人甲型流感病毒，诸如人甲型H1N1流感；和/或

iii.单纯疱疹病毒，诸如HSV-1或HSV-2，诸如HSV-1。

本发明的产品和方法可以用于治疗或预防多种受试者中的任何一种的病毒感染。例如，本发明的产品和方法可以用于治疗或预防哺乳动物，诸如家畜(诸如奶牛、绵羊、马、猫、狗、山羊、兔子)或人的病毒感染。通常，本发明的产品和方法被配制用于治疗或预防人的病毒感染。

组合中的至少两种蛋白可以单独、同时或顺序使用。组合中的至少两种蛋白通常将以紧密的掺合物，即在组合物中提供。

预防、抑制或降低病毒对细胞或在细胞内或者对受试者或在受试者体内的病毒活性，和/或治疗或预防受试者的病毒感染的一种方法，是使用通常具有不同作用机制的至少两种抗病毒剂的组合。这种方法在治疗由例如HIV感染的受试者中取得了部分成功。因此，本发明还提供了至少两种蛋白的组合与一种或多种抗病毒剂进一步组合的方法和用途，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取。可以与至少两种蛋白(每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取)组合使用的这种已知的抗病毒剂的实例包括(连同它们的预期病毒靶标的实例)：

阿巴卡韦(Abacavir)(HIV)、阿昔洛韦(Acyclovir)(阿昔洛维(Aciclovir))(单纯疱疹)、阿德福韦(Adefovir)(乙型肝炎)、金刚烷胺(Amantadine)(流感)、安普利近(Ampligen)(禽流感)、安普那韦(Amprenavir)(Agenerase)(HIV)、乌芬米诺韦(Umifenovir)(阿比多尔(Arbidol))(流感)、阿扎那韦(Atazanavir)(HIV)、替拉依(Atripla)(HIV)、巴洛沙韦玛波西酯(Baloxavir marboxil)(速福达(Xofluza))(甲型流感、乙型流感)、必妥维(Biktarvy)(HIV)、波普瑞韦(Boceprevir)(丙型肝炎)、布尔韦肽(Bulevirtide)(丁型肝炎和乙型肝炎)、西多福韦(Cidofovir)(AIDS)、可比司他(Cobicistat)(Tybost)(HIV)、可比韦(Combivir)(HIV)、达拉他韦(Daclatasvir)(达卡他韦(Daklinza))(丙型肝炎)、达芦那韦(Darunavir)(HIV)、地拉韦啶(Delavirdine)(丙型肝炎)、达可挥(Descovy)(乙型肝炎)、地达诺新(Didanosine)(HIV)、二十二烷醇(单纯疱疹)、多替拉韦(Dolutegravir)(HIV)、多拉韦林(Doravirine)(沛卓(Pifeltro))(HIV)、依度尿苷(Edoxudine)(单纯疱疹)、依发韦仑(Efavirenz)(HIV)、艾维雷韦(Elvitegravir)(HIV)、恩曲他滨(Emtricitabine)(HIV)、恩夫韦肽(Enfuvirtide)(HIV)、恩替卡韦(Entecavir)(HIV)、依曲韦林(Etravirine)(英特莱(Intelence))(HIV)、泛昔洛韦(Famciclovir)(带状疱疹)、福米韦生(Fomivirsen)(AIDS)、福沙那韦(Fosamprenavir)(HIV)、膦甲酸(疱疹)、更昔洛韦(Ganciclovir)(赛美维(Cytovene))(巨细胞病毒(CMV))、伊巴他滨(Ibacitabine)(唇疱疹)、伊巴组单抗(Ibalizumab)(特罗格佐(Trogarzo))(HIV)、碘苷(疱疹)、咪喹莫德(Imiquimod)(生殖器疣)、Imunovir(单纯疱疹)、茚地那韦(Indinavir)(HIV)、拉米夫定(Lamivudine)(HIV)、来特莫韦(Letermovir)(普瑞明(Prevymis))(巨细胞病毒(CMV))、洛匹那韦(Lopinavir)(HIV)、洛韦胺(Loviride)(HIV)、马拉韦罗(Maraviroc)(HIV)、美替沙腙(Methisazone)(天花)、吗啉胍(流感)、奈非那韦(Nelfinavir)(HIV)、奈韦拉平(Nevirapine)(HIV)、Nexavir(原Kutapressin)(带状疱疹)、硝唑沙奈(Nitazoxanide)(广谱抗病毒)、诺韦(Norvir)(HIV)、奥司他韦(Oseltamivir)(达菲(Tamiflu))(流感)、喷昔洛韦(Penciclovir)(疱疹)、帕拉米韦(Peramivir)(流感)、喷昔洛韦(Penciclovir)(疱疹)、培拉米韦(Peramivir)(Rapivab)(流感)、普可那利(Pleconaril)(小RNA病毒)、鬼臼毒素(生殖器疣)、拉替拉韦(Raltegravir)(HIV)、瑞德西韦(Remdesivir)(COVID-19)、利巴韦林(Ribavirin)(丙型肝炎)、利匹韦林(Rilpivirine)(HIV)、金刚乙胺(Rimantadine)(甲型流感)、利托那韦(Ritonavir)(HIV)、沙奎那韦(Saquinavir)(HIV)、司美匹韦(Simeprevir)(奥莱森(Olysio))(丙型肝炎)、索磷布韦(Sofosbuvir)(丙型肝炎)、司他夫定(Stavudine)(HIV)、塔利韦林(Taribavirin)(韦拉密仃(Viramidine))(肝炎综合征，在其中利巴韦林(Ribavirin)具有活性)、替拉瑞韦(Telaprevir)(丙型肝炎)、替比夫定(Telbivudine)(替泽卡(Tyzeka))(乙型肝炎)、富马酸丙酚替诺福韦(Tenofovir alafenamide)(乙型肝炎)、替诺福韦二吡呋酯(Tenofovir disoproxil)(乙型肝炎、HIV)、替拉那韦(Tipranavir)(HIV)、曲氟尿苷(Trifluridine)(眼部相关疱疹)、三协唯(Trizivir)(HIV)、曲金刚胺(Tromantadine)(单纯疱疹)、舒发泰(Truvada)(HIV)、乌芬诺韦(Umifenovir)(流感)、伐昔洛韦(Valaciclovir)(维德思(Valtrex))(单纯疱疹、带状疱疹)、缬更昔洛韦(Valganciclovir)(万赛维(Valcyte))(HIV)、维利韦洛(Vicriviroc)(HIV-1)、阿糖腺苷(Vidarabine)(单纯疱疹、水痘-带状疱疹)、扎西他滨(Zalcitabine)(HIV)、扎那米韦(Zanamivir)(瑞乐砂(Relenza))(甲型流感、乙型流感)、齐多夫定(Zidovudine)(HIV)。

在第十方面，本发明提供了以下的组合：

(i)至少两种蛋白的组合，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取；以及

(ii)至少一种抗病毒剂。

“至少一种抗病毒剂”可以从上述已知抗病毒剂中的任何一种中的制剂或活性药物成分(API)中选择。

在第十一方面，本发明提供了一种至少两种蛋白的组合，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取，其中，当所述组合包括乳铁蛋白时，所述组合的乳铁蛋白含量小于40％w/w。

本发明人已经发现，具有低乳铁蛋白含量的乳蛋白组合可能针对某些病毒具有惊人的效力，包括人流感(诸如人甲型流感)；冠状病毒科的病毒(诸如COVID-19)；和/或单纯疱疹病毒(诸如HSV-1)。在一些实施方式中，本发明提供了一种至少两种蛋白的组合，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取，其中，当所述组合包括乳铁蛋白时，所述组合的乳铁蛋白含量小于30％w/w，诸如小于20％w/w，诸如小于10％w/w。这样的组合可以作为组合物存在，使得当所述组合物包括乳铁蛋白时，所述组合物的乳铁蛋白含量小于40％w/w，诸如小于30％w/w，诸如小于20％w/w，诸如少于10％w/w。

本发明的其他方面，应考虑其所有新颖性方面，在阅读以下描述后，对于本领域技术人员将变得显而易见。

附图说明

本发明的一种或多种实施方式将在下文中参考以下附图仅作为实例进行描述，并且不旨在限制，其中：

图1示出了测试样品#3针对人甲型H1N1流感的剂量抑制曲线，显示IC₅₀为193.6，并且没有细胞毒性；

图2示出了测试样品#4针对人甲型H1N1流感的剂量抑制曲线，显示IC₅₀为93.91和推断的细胞毒性；

图3示出了乳铁蛋白(Lf)针对人甲型H1N1流感的剂量抑制曲线，显示IC₅₀为272.4，并且没有细胞毒性；

图4示出了组合#4针对rVSV-SARS-CoV-2S的剂量抑制曲线，显示IC₅₀为70.04和推断的细胞毒性；

图5示出了组合#6针对rVSV-SARS-CoV-2S的剂量抑制曲线，显示了IC₅₀为89.68和推断的细胞毒性。

图6示出了冷冻干燥乳铁蛋白(Lf)针对rVSV-SARS-CoV-2S的剂量抑制曲线，显示IC₅₀为79.75和推断的细胞毒性；以及

图7示出了喷雾干燥乳铁蛋白(Lf)针对rVSV-SARS-CoV-2S的剂量抑制曲线，显示IC₅₀为56.64和推断的细胞毒性。

具体实施方式

蛋白组合的优选特征(例如乳的阳离子级分)

在整个说明书中，术语“阳离子级分”的使用应被视为意指来自乳中的级分或分离的组分，是与阳离子交换介质结合的阳离子组分，并包括具有等电点为基本上6.8或高于基本上6.8的乳的任何组分。

在不希望被理论束缚的情况下，本发明人认为从乳中分离的阳离子级分中的一些蛋白或所有蛋白共同作为抗病毒剂发挥作用。据信，两种或更多种蛋白作为抗病毒剂协同作用。

在不希望被理论束缚的情况下，至少两种蛋白的组合可以提供单一或多种作用模式。例如，组合中的蛋白可以独立地或组合地抑制病毒本身的一部分或全部(例如刺突蛋白)和/或与细胞本身相互作用以防止病毒黏附和/或进入。

如本文使用的，术语“协同”(及其变体)意指用本发明的组合物和组合所获得的效果大于使用独立组分作为单一疗法所产生的效果的总和。有利的是，这种协同作用在相同剂量下提供了更大的功效，并提供了一种效果，否则就不会有明显的效果。

应当理解，将组合物中的蛋白质组合在一起的似乎提供了有利的选择性的特定方法，不应被认为是对本发明的限制。例如，本领域技术人员可以潜在地制备来自不同来源的蛋白的组合，或者甚至潜在地对每种蛋白进行合成工程并将它们适当地组合。然而，使用色谱法从乳样品中分离和洗脱蛋白的阳离子级分的能力代表了制备本发明的一种或多种组合作为组合物的方便方法，并且还提供了将蛋白保持在其固有环境中的精细机制，以避免蛋白功能的丧失或与其他乳蛋白的相互结合，并促进似乎在蛋白之间发挥作用的任何形式的协同作用。因此，乳的这种级分是形成本发明的乳蛋白组合的优选方法。

组合中使用的蛋白，诸如组合物，可以从一种或多种乳源中分离或提取，诸如牛乳、羊乳、山羊乳、水牛乳、骆驼乳、人乳等。虽然牛乳是优选的，但在乳的其他来源中也发现了牛乳中的主要和次要蛋白，在每种情况下都具有非常相似的等电点。此外，术语“乳”应包括全乳、脱脂乳或乳清。

在一种优选的实施方式中，通过SDS-PAGE，阳离子级分可以具有3,000–80,000道尔顿的分子量分布。该蛋白尺寸分布范围涵括在乳的阳离子级分(和亚级分)中观察到的蛋白的尺寸。

本发明蛋白组合中最普遍的蛋白是乳铁蛋白、血管生成蛋白和乳过氧化物酶。这些蛋白在乳中的相对量可以有所不同。在一些实施方式中，用于本发明的乳蛋白的组合可以包括：

·乳铁蛋白在约0％w/w和约90％w/w之间的范围内；诸如在约1％w/w和约70％w/w之间；诸如在约5％w/w和约70％w/w之间的范围内；和/或

·乳过氧化物酶在约0％w/w约80％w/w之间的范围内；诸如在约1％w/w和约80％w/w之间；诸如在约1％w/w和约70％w/w之间的范围内；和/或

·血管生成蛋白在0-30％w/w的范围内，诸如在约0％w/w和约15％w/w之间的范围内；诸如在约1％w/w和约10％w/w之间的范围内。

本发明中使用的乳蛋白的组合可以与其他组分组合，这些组分不是具有等电点为基本上6.8或高于基本上6.8的蛋白，并且是从乳中提取的蛋白。本文提供的本发明组合中乳蛋白浓度的示例性范围应解释为本发明中使用的总组合的比例或该组合的总乳蛋白部分的比例。例如，当乳铁蛋白被陈述为约45％w/w时，该参考包括以下公开：

·乳铁蛋白在组合物中是整个组合物的每重量的45％重量的组合物；或

·替代地为组合物的蛋白级分的每重量的45％重量；或

·替代地为组合物中具有等电点为基本上6.8或高于基本上6.8的那些蛋白的每重量的45％重量。

在不希望受理论束缚的情况下，相信乳铁蛋白含量相对低的乳蛋白的组合可以提供针对某些病毒的增强的活性，诸如人流感病毒，诸如人甲型流感病毒，诸如人甲型H1N1流感病毒。例如，乳蛋白组合的乳铁蛋白含量可以小于30％w/w，诸如小于20％w/w，诸如小于10％w/w。这一结果尤其令人惊讶，因为人们曾认为乳铁蛋白可能对乳蛋白的抗病毒活性有很大的贡献，如果不是主要的话。这一结果表明，乳蛋白组合的一种或多种其他成分(单独或组合)是比乳铁蛋白更有效的抗病毒剂。

乳中存在大量额外的蛋白，这些蛋白可以作为阳离子级分和组合的一部分分离出来，诸如由本发明人研究的组合物，其中许多也可能有助于抗病毒活性。

在不受限制的情况下，在乳的阳离子级分中发现的蛋白，并且也被认为与本发明相关，并且可以被单独认为是各种优选的，以包括在本发明的组合中，将在下面更详细地讨论。应当意识到，尽管乳铁蛋白本身先前已被证明对一些病毒具有一定的抗病毒活性，但乳中的许多其他蛋白先前根本没有被证明具有任何抗病毒活性。

乳过氧化物酶

乳过氧化物酶(Lp)是存在于哺乳动物的乳腺分泌物和许多其他外分泌分泌物中的蛋白。

美国专利No.6,544,498(其全部内容通过援引并入本文)公开了通过梯度洗脱提取碱性蛋白级分，该碱性蛋白级分具有7.5和11之间的等电点以及3,000至80,000道尔顿的分子量分布，具有的主要组分为乳过氧化物酶和乳铁蛋白。

乳铁蛋白

乳铁蛋白(Lp)是存在于哺乳动物的乳腺分泌物和许多其他外分泌分泌物中的糖蛋白。Lf主要由表面上皮分泌到黏膜环境中。乳铁蛋白是多功能蛋白质，具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎和免疫调节特性。

Lf在鼻道和气管通道以及在胃、生殖器和眼分泌物中以高水平产生。Lf也在中性粒细胞中以高水平产生，储存在次级颗粒中，并在炎症期间释放。

牛乳铁蛋白的高碱性N末端区域被认为对于抗微生物剂至关重要。25个N-末端氨基酸可以通过蛋白酶去除以形成乳铁蛋白肽(Lfcin)。这些蛋白酶可能天然存在于乳或血清中，并且许多微生物会产生蛋白酶。Lfcin针对某些微生物的有效性是完整乳铁蛋白的最高达1000倍。已示出Lfcin能抑制多种微生物，诸如革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、酵母、丝状真菌和寄生原生动物，包括一些抗生素耐药性病原体。本发明考虑到可以将乳铁蛋白肽添加到组合诸如组合物中，取代乳铁蛋白，和/或由于蛋白水解作用而成为本发明组合中乳铁蛋白的天然降解产物。

牛Lf的目前商业应用包括婴幼儿配方乳粉、发酵乳、营养铁补充剂、口香糖、增强免疫的营养品、化妆品配方以及饲料和宠物护理补充剂。因此，值得注意的是，在组合诸如组合物中使用乳铁蛋白具有普遍的消费者接受度和食品安全法规。

血管生成蛋白

血管生成蛋白属于核糖核酸酶超家族，已在乳中被鉴定。

溶菌酶样蛋白，诸如几丁质酶样蛋白(CLP-1)或溶酶体α-甘露糖苷酶(LAM)

本发明的组合可以包括溶菌酶样蛋白，诸如几丁质酶样蛋白(CLP-1)或溶酶体α-甘露糖苷酶(LAM)。溶菌酶样蛋白(诸如CLP-1或LAM)具有细胞裂解活性。

该组合(诸如阳离子级分)可以包括静止蛋白(quiescin)和/或木菠萝凝集素(jacalin)样蛋白。

可以单独认为优选包括在组合中以提高其有效性的其他乳蛋白(通过赋予选择性或某种其他形式的一种或多种蛋白功能性的间接调节)包括：

-内源性抗菌多肽(cathelicidin)1、3和/或6；

-N-乙酰氨基葡糖苷酶；

-血清淀粉样蛋白A；

-防御肽；

-肽聚糖识别蛋白；

-黄嘌呤脱氢酶；

-一种或多种免疫球蛋白IgA、IgD、IgG、IgM、IgA和/或IgE；

-生长因子EGF、IGF 1、TGF B1和TGF B2。

免疫球蛋白是乳作为食物来源的重要组分，因为它们为哺乳期的婴儿提供被动保护。尽管某些免疫球蛋白不是强阳离子，但是IgG、IgM、IgA和多聚免疫球蛋白受体(PIGR)可以通过阳离子交换方法来提取。

预计从乳奶中分离到的组合(诸如阳离子级分)也可能包括少量的多种生长因子；虽然这些生长因子可能以低水平存在，但它们的作用可以有效地刺激细胞修复。例如，这些生长因子可以包括：EGF、IGF 1、TGF B1和TGF B2。

Smolenski et al.(2007)报道了通过质谱(MS)得到了牛乳中次要蛋白的种类和显著数量，尤其是鉴定了参与宿主防御的显著数量的乳蛋白。结果在表1中示出，经调整后，以粗体示出了对应于可以优选被掺入到本发明(并且根据本发明经由乳中的阳离子级分分离并示出具有高选择性)组合中的蛋白的一些。值得注意的是，Smolenski et al.(2007)使用的SDS-PAGE方法没有公开在本发明中使用的组合(诸如包括阳离子级分的组合物)中鉴定的蛋白质(例如血管生成蛋白、木菠萝凝集素样蛋白、静止蛋白、PIGR和生长因子)的检测。

表1.宿主防御相关的次要蛋白从乳中鉴定出来，示出这些蛋白中的一些可能作为阳离子级分(粗体)的部分被提取(转载自Smolenski et al.,2007)。

表1：牛乳中鉴定出的次要蛋白。

¹免疫球蛋白通常具有5.0-9.5范围的等电点。因此，并不是全部都与阳离子交换树脂结合。

*这些蛋白的等电点已基于预期的蛋白结构计算出来。(Swiss Prot/TrEMBL,www.expasy.org)。

一些阳离子级分组分(例如乳铁蛋白、血管生成蛋白)也可能具有微小的变体，——诸如氨基酸序列或糖基化程度和类型的变异。本发明考虑到这些小的变体可以结合在本发明的组合中。

在优选的实施方式中，本发明的组合包括以下蛋白中的至少两种：乳铁蛋白(Lf)；乳过氧化物酶(Lp)；溶酶体α-甘露糖苷酶(LAM)；免疫球蛋白重链(IgG)；血管生成蛋白(ANG)；和/或核糖核酸酶4(RNase4)。

在优选的实施方式中，本发明的组合包括以下蛋白中的至少三种：乳铁蛋白(Lf)；乳过氧化物酶(Lp)；溶酶体α-甘露糖苷酶(LAM)；免疫球蛋白重链(IgG)；血管生成蛋白(ANG)；和/或核糖核酸酶4(RNase4)。

在优选的实施方式中，本发明的组合包括以下蛋白中的至少四种：乳铁蛋白(Lf)；乳过氧化物酶(Lp)；溶酶体α-甘露糖苷酶(LAM)；免疫球蛋白重链(IgG)；血管生成蛋白(ANG)；和/或核糖核酸酶4(RNase4)。

在优选的实施方式中，本发明的组合包括以下蛋白中的至少五种：乳铁蛋白(Lf)；乳过氧化物酶(Lp)；溶酶体α-甘露糖苷酶(LAM)；免疫球蛋白重链(IgG)；血管生成蛋白(ANG)；和/或核糖核酸酶4(RNase4)。

在优选的实施方式中，本发明的组合包括以下蛋白中的每一种：乳铁蛋白(Lf)；乳过氧化物酶(Lp)；溶酶体α-甘露糖苷酶(LAM)；免疫球蛋白重链(IgG)；血管生成蛋白(ANG)；和/或核糖核酸酶4(RNase4)。

在优选的实施方式中，本发明的组合包括以下蛋白中的每一种：乳铁蛋白(Lf)；乳过氧化物酶(Lp)；溶酶体α-甘露糖苷酶(LAM)；巯基氧化酶(QSOX)；免疫球蛋白重链(IgG)；血管生成蛋白(ANG)；和/或核糖核酸酶4(RNase4)。

药物

在一种优选的实施方式中，最终的治疗组合，诸如组合物，可以是药物的形式，诸如液体、乳膏、凝胶、糊剂、粉末、胶囊、锭剂、片剂、栓剂、丸剂、注射溶液、喷雾剂等。该药物可以配制用于肠内或肠胃外给药。该药物可以配制用于局部给药。在优选的实施方式中，本发明的组合可以用作针对人流感、来自冠状病毒科的病毒和/或单纯疱疹的抗病毒剂。

人流感可能主要被认为是呼吸道感染。因此，在优选实施方式中，可以将本发明的组合配制为用于向受试者的呼吸系统给药诸如通过口服和/或鼻腔给药(诸如吸入)的药物。当通过吸入给药时，可以配制药物以将组合引导至呼吸系统的一个或多个特定区域。例如，在通过口吸入将该组合作为固体药物给药的情况下，该固体药物可以被微粉化。微粉化的固体可以具有限定的粒度。例如，人们认为，吸入的直径<3μm的粉状颗粒可能主要经由扩散沉积在外周肺的呼吸区域。吸入的直径在3和8μm之间的粉状颗粒可能通过沉淀在肺的过渡区而沉积。吸入的>8μm的粉状颗粒可能通过惯性撞击来沉积在中央和传导气道(传导区)。应当理解，人流感的不同毒株可能在不同程度上感染呼吸系统的不同部位。在此基础上，通过利用不同大小的颗粒，可以针对不同的病毒毒株靶向呼吸系统的特定区域。

单纯疱疹，特别是单纯疱疹-1(HSV-1)可能自身表现为特别是在人受试者中呈现为唇疱疹。为了治疗HSV-1，在优选的实施方式中，可以将本发明的组合配制为用于向唇疱疹给药的药物，诸如以液体、乳膏、凝胶、糊剂或喷雾的形式。

该组合可以在药物中纯配制，但通常该药物将包括确保该组合的形式易于配制、使用，并且对于其作为抗病毒剂的预期目的是有效的而所需的以下至少一种或多种：载体、缓冲剂、防腐剂、赋形剂或其他药学上可接受的组分。

药物可以配制成即释，或者可以配制成控释。控释可以提供持续释放、延迟释放、脉冲式释放或其组合。可以掺入药物中以实现控释的已知组分对于本领域技术人员来说是众所周知的。

药物可以以足以引发期望反应的剂量掺入本发明的组合。如本文使用的，表达“有效量”是指对实现期望反应是有效的蛋白组合的量。例如，有效量的组合可以用于治疗或预防受试者的病毒感染。在这种情况下，将通过例如症状和/或传染性程度的降低来观察期望的反应，诸如治疗受试者。

给定受试者的有效量可以通过常规实验来确定，该常规实验在临床医生或本领域技术人员根据与受试者相关的因素的技能和判断范围内。可以调整剂量和给药以提供足够水平的一种或多种活性剂或维持期望的效果。可以考虑的因素包括遗传筛查、疾病状态的严重程度、疾病进展状况、受试者的总体健康状况、种族、年龄、体重、性别、饮食、一天中的时间和给药频率、一种或多种药物组合、反应敏感性、其他疗法的经验以及对于疗法的耐受性/反应。

给药/接触的方法

如本文使用的，术语“预防”是指防止疾病、疾患和/或病症在可能易患疾病、疾患和/或病症但尚未被诊断为患有疾病、疾患和/或病症的受试者中发生。

如本文使用的，术语“治疗”是指抑制已经呈现出疾病、疾患和/或病症的症状的受试者的疾病、疾患或病症的发展，即阻止已经影响该受试者的疾病、疾患和/或病症的发展。

如本文使用的，术语“抑制”是指减缓或预防(过程、反应或功能)或降低病毒活性。

如本文使用的，术语“降低”是指减轻已经呈现出疾病、疾患和/或病症的症状的受试者的疾病、疾患或病症的症状，即，引起已经影响该受试者的疾病、疾患和/或病症的消退。

如本文使用的，术语“受试者”是指人、灵长类、马、猪、牛、鼠、大鼠、犬和猫物种。优选地，受试者是人。如本文使用的，术语“患者”可以与“受试者”和“人”互换使用。

本文所述的化合物和组合物可以经由本领域已知的任何药物递送途径向受试者给药。非限制性实例包括口服、眼部、直肠、口腔、局部、鼻腔、舌下、经皮、皮下、肌内、静脉内(推注和输注)、脑内和肺途径的给药。

如本文所述，“使病毒与有效量的至少两种蛋白的组合接触”的步骤是指在某些情况下(适当的时间和在适当的条件下)提供该组合，使得组合与病毒直接接触，或者诸如在将组合应用于细胞外介质的情况下接触病毒，使得其将在病毒是细胞内的情况下进入细胞。

制造和储存的方法

应当意识到，术语“乳”可以包括任何生的(或未加工的)乳。这包括在冷的温度或环境温度下已经变冷、温育或储存的生乳。

在一些实施方式中，阳离子级分中不同阳离子组分的比例可以是提取的或浓缩的。

然而，这不应被视为限制性的，因为可能需要分别改变或控制至少一种或多种蛋白组分的比率。应当意识到，阳离子级分组分的比例的任何这样的改变都被本公开所涵盖。

在一些优选的实施方式中，阳离子级分可以在挤乳过程期间或直接在挤乳过程之后在“农场内”提取。这可能是有利的，因为在随后的处理、储存、脂肪去除或其他处理步骤期间，一些组分可能会丢失、损坏或变性。

可以使用多种方法来制备根据本发明所述的组合，诸如组合物。然而，阳离子交换被认为是优选的制造方法，这将在下面进一步详细讨论。

优选地，该方法包括从乳中提取优选的蛋白，包括以下步骤：

a)使乳通过提取材料，以及

b)洗脱具有等电点(pI)高于6.8的结合的乳组分的阳离子级分。

在优选的实施方式中，提取材料可以是阳离子交换材料。这可以是树脂、膨胀床树脂、磁珠粒、膜或用于大规模提取的其他适合形式。

在优选实施方式中，阳离子交换材料可以是具有足够的机械强度以抵抗高压并保持高流速的任何材料。

在优选实施方式中，阳离子交换树脂具有的平均粒度可以超过100μm。较大珠粒形式的树脂已被开发用于黏性进料流，因为它们不像较小珠粒那样紧密地堆积，因此有更宽的通道，从而不会有过大的背压。

合适的阳离子交换树脂的实例是SP-Sepharose Big Bead、SP-Sepharose FastFlow、SP-Toyopearl和S-Ceramic HyperD。

提取和纯化过程的一种实例如下：

乳铁蛋白与阳离子交换牢固结合，并且是在盐梯度中洗脱的最后的主要蛋白。因此，用1M盐(80mS–100mS)进行一步洗脱，在单个级分(阳离子级分)中洗脱所有蛋白和肽。在之前的40mS洗脱后，用80–100mS盐洗脱将产生主要为乳铁蛋白的级分。为了首先提取乳铁蛋白水平降低的蛋白样品，可以优选使用该技术将所有乳铁蛋白基本保留在柱上。

在乳铁蛋白之后，乳过氧化物酶是通过离子交换从乳中捕获的第二丰富的阳离子蛋白(0.03–0.075mg/ml乳)。在盐梯度中，乳过氧化物酶在乳铁蛋白之前以25-30mS从阳离子交换中洗脱。

生长因子EGF、IGF 1、IGF 2、TGF B1和TGF B2以ng/ml的量存在于乳中，并且已经证明通过阳离子交换捕获。

许多其他具有生物活性的阳离子肽在乳过氧化物酶和乳铁蛋白之间以35-40mS(中间级分)洗脱。这些可能包括血管生成蛋白、静止蛋白、木菠萝凝集素样蛋白和溶菌酶样蛋白，诸如几丁质酶样蛋白(CLP-1)或溶酶体α-甘露糖苷酶(LAM)。

免疫球蛋白在低盐(15–20mS)中洗脱。

在优选的实施方式中，乳或乳产品可以通过具有阳离子交换特性的膜，或填充有阳离子交换树脂的柱，或具有悬浮阳离子树脂的间歇式反应器，由此微组分从起始乳或其产品吸附至阳离子交换树脂或膜上。

在吸附乳微组分之后，优选通过用盐溶液洗脱来提取阳离子级分。

然而，这不应被视为限制性的，因为阳离子级分的洗脱也可能经由pH的变化。然而，这种方法在大规模商业工艺中并不流行，因为从树脂中去除乳铁蛋白所需的高pH可能会损害乳铁蛋白，或者在本例中损害阳离子级分中的任何其他组分。

在优选的实施方式中，在洗脱之前，可以用盐溶液冲洗树脂或膜。优选地，冲洗溶液可以是氯化钠或碳酸氢钠，具有的电导率在5和10mS(毫西门子/cm)之间。该冲洗步骤确保基本上所有未吸附的乳组分都被从树脂中冲洗掉或从膜中冲洗出来。

在优选的实施方式中，阳离子级分可以在基本上10mS和100mS电导率(0.1至2.0M盐)之间的盐梯度中洗脱。

在一些实施方式中，阳离子级分可以通过使电导率在80和100mS之间的盐溶液通过柱或膜来在单个级分中洗脱。

在优选的实施方式中，洗脱盐可以优选为氯化钠。然而，这不应被视为限制性的，因为可以使用其他盐，包括乙酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢铵或氯化钾。

在一步洗脱中洗脱阳离子级分提供了显著的优点。它缩短了提取时间的长度，从而降低了生物活性物质变性的可能性。它还减少了提取过程的时间、劳动力和成本。这可以提供显著的优势，尤其是在大规模的情况下。此外，结果表明，当pI高于6.8的乳组分作为单个分离级分保留并一起给药时，抗病毒效果将增强。

在优选的实施方式中，在对洗脱流中的蛋白水平进行初始监测以确定盐的浓度和洗脱所有蛋白所需的体积之后，典型的大规模过程按照体积而不是连续监测来进行操作。

在一些实施方式中，提取可以以连续的方式进行。

在一些实施方式中，提取可以在分批洗脱中进行。

在一些实施方式中，阳离子级分可以通过“一步”工艺、分步洗脱来提取。

在一些实施方式中，可以使用梯度洗脱来提取阳离子级分。

然而，这不应被视为限制性的，因为阳离子级分也可以在独立的级分中提取并在稍后阶段重组以形成完整的阳离子级分。

在一些实施方式中，阳离子级分可以通过本领域已知的标准技术进行进一步处理，例如去除盐，或浓缩，或过滤无菌或去除内毒素。浓缩的级分也可以被冻干。

在优选的实施方式中，阳离子级分可以浓缩至大约20％的固体。

如果阳离子级分是从以涉及储存、运输和转化为脱脂乳或乳清的通常方式加工的乳中提取的，则温度应优选保持在基本上4-7℃，以使微生物生长最小化。

在从全乳中提取阳离子级分的情况下，温度应优选保持在不低于35℃，以确保脂质保持液态，从而使其易于通过提取材料。并确保阳离子级分中因子的生物活性保持在内源性状态或接近内源性状态。

在一些实施方式中，阳离子级分可以从基因修饰的动物中提取，例如基因修饰以增强乳用牛中的乳铁蛋白生产。本领域技术人员将意识到，从基因修饰的动物的乳中的提取可能会影响乳铁蛋白、或阳离子级分中的其他组分、或关键组分的整个级联的比率或浓度。

在一些实施方式中，阳离子级分可以从已经免疫的动物中提取，例如为了在它们的乳中产生特异性抗体(免疫球蛋白)而免疫的乳用牛。本领域技术人员将意识到，从免疫动物的乳中进行提取可能影响乳铁蛋白、或阳离子级分中的其他组分诸如免疫球蛋白、或关键组分的整个级联的比率或浓度。

在一些实施方式中，阳离子级分可以从处理物质旨在用于的相同物种的动物中提取。在一些实施方式中，阳离子级分可以从与处理物质旨在用于的动物不同的物种动物中提取。在优选的实施方式中，本发明方法的受试者将是人，并且乳蛋白的来源将是非人类的。例如，牛乳将用于提取蛋白，这些蛋白组合用于治疗患有单纯疱疹感染或人流感感染的人。

以下实例是非限制性的，并且不减损本文所描述的产品和过程的一般性。

实施例

实施例1：经由质谱来评估组合物中的蛋白(即阳离子级分)

生产阳离子级分的过程涉及通过阳离子交换树脂来分级乳，使用盐溶液从树脂中洗脱结合的组分，该盐溶液可以是一步高摩尔浓度(>1M)盐，或可以是从较低摩尔浓度上升到超过1M的梯度洗脱，将洗脱的组分收集在单个级分中，并且然后对收集的级分进行脱盐和纯化。

对示例性阳离子级分的组成组分进行了分析，并且结果在表2中示出。这示出了在阳离子蛋白级分中鉴定的主要蛋白的产率和鉴定的典型结果。

这种特殊的阳离子级分是从生全乳中捕获的。

表2.通过质谱法(MS)测量的阳离子级分的亚级分。(乳过氧化物酶是经由消光系数而不是MS测定的)

根据本发明的乳蛋白的组合的另外两个实施例在下表3中示出。这些组合之一(组合1)具有低乳铁蛋白含量，并且被认为针对人类流感特别有效。低乳铁蛋白含量的样品可以通过修改分级技术来获得，以将由于乳铁蛋白的级分与其他级分分离。

表3：

在每个组合中，命名蛋白的相对丰度(w/w％)表示为命名蛋白质总量的百分比。这不应被视为限制性的，并且该组合可以包括：具有的等电点为基本上6.8或高于基本上6.8并且从乳中提取的其他蛋白；和/或不是具有的等电点为基本上6.8或高于基本上6.8的蛋白并且从乳中提取的一种或多种组分。应当理解，在包括其他蛋白和/或其他非蛋白的情况下，命名蛋白在总组合物中的相对丰度将降低到表3中提供的值以下。

例如，在一些实施方式中，组合1和组合2可以与其他未命名的蛋白、和/或未鉴定的蛋白和/或非蛋白组分共同配制，使得组合物如下表4中所示出，并分别称为组合3和组合4。在其他实施方式中，组合1和组合2可以衍生自从乳源共分离的蛋白的混合物，包括其他未命名的蛋白和/或未鉴定的蛋白，使得组合物如下表4中所示出。

表4：

由MS的鉴定	组合3“低Lf”(％w/w)	组合4(％w/w)
			乳铁蛋白	4.684	44.9
乳过氧化物酶	45.564	18.3
			LAM	0.425	0.27
QSOX	0.244	0.53
			IgG	5.837	3.56
血管生成蛋白	0.017	9.64
			RNase4	8.911	3.06
其他蛋白	平衡至100	平衡至100
			总计	100	100

适用于本发明的制剂可以包括不是具有等电点为基本上6.8或高于基本上6.8并且从乳中提取的蛋白的一种或多种组分。这些额外的组分包括：葡萄糖；葡萄糖氧化酶；硫氰酸盐；和/或单月桂酸甘油酯。这些组分中的每一种可以独立地以高于0％且低于1％w/w，诸如高于0％且低于0.9％w/w存在。葡萄糖氧化酶；硫氰酸盐；和/或单月桂酸甘油酯可以各自独立地以高于0％且低于1％w/w，诸如高于0％且低于0.5％存在。

例如，适用于该制剂的其他样品制剂包括表4中示出的以下组合物：

表4

葡萄糖氧化酶可以利用葡萄糖作为底物原位生成过氧化物。其他过氧化物生成系统可以包括过碳酸盐或过醋酸盐，其可以被包封或被包被以控制过氧化物的释放速率。这些组分可以被认为是作为促进剂或佐剂。

硫氰酸盐存在于“活化阳离子级分”中，并且是底物的实例。底物的其他实例包括具有钠、钾或钙的抗衡阳离子的碘化物或氯化物。

先天性乳过氧化物酶系统保护眼、鼻、嘴和气道免受有害微生物的侵袭，并需要存在乳过氧化物酶、过氧化物和硫氰酸盐或卤化物。

H₂O₂由于是各种氧化过程的副产物，如天然存在于内部生物环境中。例如，中性粒细胞产生大量的自由过氧自由基(O₂ ^-)，其稳态浓度估计在微摩尔范围内。(参考Hampton,MB,Kettle AJ,Winterbourn CC.Inside the neutrophil phagosome:oxidants,myeloperoxidase,and bacterial killing.Blood1998；92:3007-17)。

过氧化物酶(诸如乳过氧化物酶)存在于生物分泌物中，并催化卤化物(硫氰酸盐、碘化物、溴化物、氯化物)的H₂O₂依赖性氧化，该卤化物可以与微生物反应并杀死微生物。(参考Klebanoff SJ.Antimicrobial mechanisms in neutrophilic polymorphonuclearleukocytes.Semin.Hematol1975；12:117-42)。

硫氰酸盐天然存在于淋巴和血液、存在于乳腺、唾液腺和甲状腺及其分泌物、存在于滑膜、脑、宫颈和脊髓液以及存在于器官诸如胃和肾中。例如，在插管的成年患者的人气管-支气管分泌物中测得的硫氰酸盐水平为0.46+/-0.19mM或26.7+/-11ppm(范围16-38ppm)。(参考Wijkstrom-Frei,C.,El-Chemaly,S.,Ali-Rachedi,R.,Gerson,C.,Cobas,M.A.,Forteza,R.,Salathe,M.and G.E.Conner.2003.Lactoperoxidase and humanairway host defense,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,29:206-12)。

实施例2：组合3、组合4和纯乳铁蛋白针对人甲型H1N1流感的抗病毒活性

使用乳铁蛋白(Lf)作为阳性对照来评价本发明的两种组合针对流感(INFV A)H1N1 A/Puerto Rico/8/34的细胞毒性(CC₅₀)和抗病毒活性(IC₅₀)。

细胞毒性测定

使用本发明的两种测试组合和Lf的八份2倍稀释液(起始于1000和625μM)用于与接种在96孔板中的MDCK细胞一式三份温育一小时，之后将新鲜培养基添加至板中；在35℃下温育。

温育3天后，使用Promega的试剂盒裂解细胞以评价ATP含量。读取以相对光单位(RFU)的萤光素酶发光，并使用XLfit剂量反应模型计算百分之50的细胞毒性浓度(CC50)。

基于CPE的抑制测定

将本发明的两种测试组合和Lf的八份2倍连续稀释液(起始于1000和625μM)一式三份制备，与接种在96孔板中的MDCK细胞温育一小时。

将INFV A以0.02的感染复数(MOI)添加至混合TA-MDCK细胞中，在35℃下温育一小时，之后将新鲜培养基添加至板中。

在INFV A感染后第三天(3dpi)，用结晶紫染色MDCK细胞，并读取光密度以使用XLfit剂量反应模型来计算两个测试样品和Lf的百分之50抑制浓度(IC₅₀)。结果在图1-3中呈现，并在下表5中列出。考虑到本发明的组合通常包括具有潜在非常不同分子量的蛋白组分，以w/v表示的IC₅₀数据是最具代表性的。对于细胞毒性，将50,000g/mol的标称MW用于本发明的组合，以及将80,000g/mol的标称MW用于乳铁蛋白。

表5：本发明的两种测试组合和乳铁蛋白(Lf)的抗病毒活性

ND:图中不可检测或#相贯线

对于两种测试组合和Lf中的每一种，都观察到零至低的细胞毒性。

两种测试组合和Lf都检测到了针对INFV A的抗病毒活性，尽管这两中测试组合表现出了增强的活性，这从较低的IC₅₀值中可以明显看出。这一结果令人惊讶，因为所使用的测试组合包含不超过约45％的乳铁蛋白。仅基于Lf，两种测试组合针对INFV A的活性最多可能具有Lf活性的大约45％——这表明IC₅₀值为约48.4mg/mL。替代地，组合#3(6.9％ Lf)和#4(44.91％ Lf)的活性是单独的乳铁蛋白(乳铁蛋白含量归一化)的5-68高，这是令人惊讶的，并表明本发明的组合的组分与INFV A之间存在意想不到的协同相互作用。特别是，低Lf组合#4表现出显著的活性，证明了根据本发明的乳蛋白组合中非Lf组分的抗病毒特性。

在不希望受理论约束的情况下，发明人认为来自该测定的结果表明本发明的组合起到防止病毒颗粒与MDCK细胞表面对接的作用。这种作用模式被认为对其他病毒颗粒是保守的，因此表明其原理能够普遍应用于其他病毒靶标。

实施例3：组合3、组合4、组合5和纯乳铁蛋白针对单纯疱疹1型(HSV-1)的抗病毒活性

使用乳铁蛋白(Lf)作为阳性对照来评价本发明的三种组合(组合#3、组合#4、组合#5)针对单纯疱疹1型(HSV-1)的细胞毒性(CC₅₀)和抗病毒活性(IC₅₀)。

组合5的组成如下示出：

细胞毒性测定

将测试组合和乳铁蛋白的八份2倍稀释液(起始于40和25μM)用于与接种在96孔板中的Vero细胞一式三份温育一小时。

在3dpi和/或6dpi上，使用Promega的CelltiterGlo试剂盒裂解细胞以评价ATP含量。读取以相对光单位(RFU)的萤光素酶发光，并使用XLfit剂量反应模型计算百分之50的细胞毒性浓度(CC₅₀)。

基于CPE的抑制测定

制备八份2倍连续稀释液，一式三份，与接种在96孔板中的Vero细胞温育一小时。将HSV-1以0.04的感染复数(MOI)添加至混合测试组合/乳铁蛋白-Vero细胞中，在37℃下温育一小时。

在HSV-1感染后第三天(3dpi)，用结晶紫染色Vero细胞，并读取光密度，以使用XLfit剂量反应模型来计算测试组合/乳铁蛋白的百分之50抑制浓度(IC₅₀)。将结果列表显示于下表6中。考虑到本发明的组合通常包括具有潜在非常不同分子量的蛋白组分，以w/v表示的数据是最具代表性的。对于细胞毒性，将50,000g/mol的标称MW用于本发明的组合，以及将80,000g/mol的标称MW用于乳铁蛋白。

表6：本发明的两种测试组合和乳铁蛋白(Lf)的抗病毒活性

ND:图中不可检测或#相贯线

对于三种测试组合和Lf中的每一种，都观察到零至低的细胞毒性。

每种测试组合和Lf都检测到了针对HSV-1的抗病毒活性，尽管组合#5表现出了增强的活性，这从较低的IC₅₀值中可以明显看出。这一结果令人惊讶，因为所使用的测试组合包含不超过约45％的乳铁蛋白。基于已知的Lf的抗病毒特性，组合#5针对HSV-1的活性预计最多为Lf活性的大约45％——这表明IC₅₀值为约0.07mg/mL。在此基础上，不仅组合#5，而且组合#4和#3都表现出了令人惊讶的活性。组合#3(6.8％ Lf)、#4(44.91％ Lf)和#5(44.91％ Lf)的活性是单独的乳铁蛋白(乳铁蛋白含量归一化)的1.2-3.9倍高，这是令人惊讶的，并表明本发明的组合的组分与HSV-1之间存在意想不到的协同相互作用。

在不希望受理论约束的情况下，发明人认为来自该测定的结果表明本发明的组合起到防止病毒颗粒与Vero细胞表面对接的作用。这种作用模式被认为对其他病毒颗粒是保守的，因此表明其原理能够普遍应用于其他病毒靶标。

实施例4：至少两种蛋白的组合的其他实施例，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且至少两种蛋白从乳中提取。

下面的表7、8、9和10提供了可以用于本发明的产品和方法的本发明的其他实例组合的范围。值以mg/g表示，由此可以容易地计算出组合物的％。LTF＝乳铁蛋白；LPO＝乳过氧化物酶；LAM＝溶酶体α-甘露糖苷酶；QSOX＝巯基氧化酶；IgG＝免疫球蛋白G；JCKL＝木菠萝凝集素样蛋白；CH3L1＝几丁质酶-3样蛋白-1；RNase4＝核糖核酸酶4。如果值被标记为“-”或零值，则该组分可能以低于检测水平存在；或不存在；或可能未在蛋白组合中进行测试。

表7

组分	A	B	C	D	E	F	G	H	I
										LTF	3.1	64.3	653.4	729.0	813.0	12.7	9.7	346.1	5.0
LPO	0.37	0.76	254.7	236.2	205.6	6.1	5.8	232.6	1.6
										LAM	0.01	0.01	1.4	1.3	1.4	0.1	0.1	2.7	0.0
QSOX	0.00	0.01	0.65	0.41	0.18	0.14	0.13	6.44	0.05
										IgG	2.7	4.7	5.0	5.0	3.7	3.88	3.29	34.99	152.3
JCKL	0.01	0.01	0.05	0.04	0.04	-	-	-	-
										CH3L1	0.01	0.00	0.00	0.00	0.00	-	-	-	-
血管生成	-	-	-	-	-	2.8	2.5	91.5	0.2
										RNase4	-	-	-	-	-	1.7	1.5	60.6	0.3
其他	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.
										总计	1000	1000	1000	1000	1000	1000	1000	1000	1000

表8

组分	J	K	L	M	N	O	P	Q	R
										LTF	346.5	16.4	10.5	10.0	9.2	8.2	406.6	30.6	23.3
LPO	208	6.0	5.4	5.1	4.8	4.8	238.1	12.7	9.2
										LAM	2.5	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	3.3	0.2	0.2
QSOX	4.89	0.08	0.11	0.10	0.10	0.10	5.66	0.15	0.18
										IgG	26.63	1.95	1.90	1.76	1.67	1.65	34.74	3.93	3.99
JCKL	-	-	-	-	-	-	-	-	-
										CH3L1	-	-	-	-	-	-	-	-	-
血管生成	130.61	2.49	4.66	5.23	3.98	2.87	12.7	0.3	0.2
										RNase4	76.05	1.04	1.07	1.37	2.08	1.76	7.1	<0.2	<0.2
其他	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.
										总计	1000	1000	1000	1000	1000	1000	1000	1000	1000

表9

组分	S	T	U	V	W	X	Y	Z	AA
										LTF	566.7	9.3	504.1	478.1	14.0	12.8	14.8	12.7	11.4
LPO	193.0	4.8	178.6	203.4	4.6	3.9	4.6	4.4	3.8
										LAM	4.7	0.1	3.9	2.7	0.1	0.1	0.1	0.2	0.2
QSOX	4.13	0.08	0.17	0.17	<0.0	<0.0	<0.0	<0.0	<0.0
										IgG	30.42	1.48	12.9	8.3	0.50	0.51	0.54	0.72	0.65
JCKL	-	-	-	-	-	-	-	-	-
										CH3L1	-	-	-	-	-	-	-	-	-
血管生成	41.0	0.4	23.2	52.0	2.0	1.9	2.2	0.9	0.6
										RNase4	30.0	1.2	9.4	11.5	1.1	1.3	2.2	0.5	0.6
其他	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.
										总计	1000	1000	1000	1000	1000	1000	1000	1000	1000

表10

组分	AB	AC	AD	AE
					LTF	11.9	12.1	572.7	675.6
LPO	3.9	4.3	171.0	155.8
					LAM	0.1	0.1	1.5	1.5
QSOX	<0.06	<0.0	0.16	0.18
					IgG	0.72	0.50	4.20	5.40
JCKL	-	-	-	-
					CH3L1	-	-	-	-
血管生成	0.5	1.7	138.2	32.6
					RNase4	0.6	1.5	51.7	21.9
其他	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.
					总计	1000	1000	1000	1000

根据这些示例性组合，检测组分中的每一种的值范围如下：

·LTF–3.1-813mg/g；

·LPO–0.37-254.7mg/g；

·LAM–0.01-4.7mg/g；

·QSOX–最高达6.44mg/g；

·IgG–0.50-152.30mg/g；

·JCKL–最高达0.05mg/g；

·CH3L1–最高达0.01mg/g；

·血管生成蛋白–最高达130.61mg/g；以及

·RNase4–最高达76.05mg/g。

在一些实施方式中，组合中蛋白质组分的浓度可以各自独立地选自以下值(使得蛋白组分总浓度不超过组合的100％)：

·组合中的LTF浓度为0-900mg/g(0-90％w/w)；诸如0-850mg/g(0-85％w/w)。

·组合中的LPO浓度为0-400mg/g(0-40％w/w)；诸如0-300mg/g(0-30％w/w)。

·组合中的LAM浓度为0-10mg/g(0-1％w/w)；诸如0-6mg/g(0-0.6％w/w)。

·组合中的QSOX浓度为0-15mg/g(0-1.5％w/w)；诸如0-10mg/g(0-1％w/w)。

·组合中的IgG浓度为0-300mg/g(0-30％w/w)；诸如0-200mg/g(0-20％w/w)。

·组合中的JCKL浓度为0-1mg/g(0-0.01％w/w)；诸如0-0.2mg/g(0-0.02％w/w)。

·组合中的CH3L1浓度为0-1mg/g(0-0.01％w/w)；诸如0-0.2mg/g(0-0.02％w/w)。

·组合中的ANG浓度为0-300mg/g(0-30％w/w)；诸如0-150mg/g(0-15％w/w)。

·组合中的RNase4浓度为0-150mg/g(0-15％w/w)；诸如0-100mg/g(0-10％w/w)。

在这些示例性组合中，组合可以被广泛分类为“低Lf”和“高Lf”组合，其中LTF(也称为Lf)组分可以是：

·低Lf–3.1-64.3mg/g；和

·高Lf–346.1-813mg/g。

因此，在一些实施方式中，组合中的Lf浓度为1-100mg/g(0.1-10％w/w)；诸如2-70mg/g(0.2-7％w/w)。在其他实施方式，组合中的Lf浓度为200-900mg/g(20-90％w/w)；诸如300-850mg/g(30-85％w/w)。如前所讨论的，低Lf组合可以提供针对一些病毒靶标的优势，而高Lf组合可以提供针对其他病毒靶标的优势。

实施例5：组合3、组合4、组合5和纯乳铁蛋白针对SARS-CoV-2(COVID-19)的抗病毒活性

使用乳铁蛋白(Lf)作为阳性对照来评价本发明的三种组合(组合#3、组合#4、组合#5)针对SARS-CoV-2(COVID-19)的细胞毒性(CC₅₀)和抗病毒活性(IC₅₀)。

细胞毒性测定

基于CPE的抑制测定

制备八份2倍连续稀释液，一式三份，与接种在96孔板中的Vero细胞温育一小时。

SARS-CoV-2(COVID-19)以0.04的感染复数(MOI)添加至混合测试组合/乳铁蛋白-Vero细胞中，在37℃下温育一小时。

在SARS-CoV-2(COVID-19)感染后第三天(3dpi)，用结晶紫染色Vero细胞，并读取光密度，以使用XLfit剂量反应模型来计算测试组合/乳铁蛋白的百分之50抑制浓度(IC₅₀)。考虑到本发明的组合通常包括具有潜在非常不同分子量的蛋白组分，以w/v表示的数据是最具代表性的。对于细胞毒性，将50,000g/mol的标称MW用于本发明的组合，以及将80,000g/mol的标称MW用于乳铁蛋白。

在每个测试组合和Lf中检测针对SARS-CoV-2(COVID-19)的抗病毒活性。

在不希望受理论约束的情况下，发明人认为本发明的组合将起到防止病毒颗粒与Vero细胞表面对接的作用。这种作用模式被认为对其他病毒颗粒是保守的，因此表明其原理能够普遍应用于其他病毒靶标。

实施例6：组合4、组合6和纯乳铁蛋白针对口腔炎病毒-假型(rVSVSARS-CoV-2S)的抗病毒活性

使用乳铁蛋白(Lf)作为阳性对照来评价本发明的两种组合(组合#4和组合#6)针对口腔炎病毒-假型(rVSVSARS-CoV-2S)的细胞毒性(CC₅₀)和抗病毒活性(IC₅₀)。

实施例6中使用的组合4和6、冷冻干燥和喷雾干燥的乳铁蛋白的组合物如下示出。值以mg/g或mg/mL表示，由此可以容易地计算出组合物的％。LTF＝乳铁蛋白；LPO＝乳过氧化物酶；LAM＝溶酶体α-甘露糖苷酶；QSOX＝巯基氧化酶；IgG＝免疫球蛋白G；JCKL＝木菠萝凝集素样蛋白；RNase4＝核糖核酸酶4。如果值被标记为“-”或零值，则该组分可能以低于检测水平存在；或不存在；或可能未在蛋白组合中进行检测。

表11

细胞毒性测定和基于CPE的抑制定

获得冷冻干燥、喷雾干燥的Lf和这两种组合。建立了体外试验，以显示这两种组合对rVSVSARS-CoV-2S进入细胞能力的影响。出于健康和安全考虑，将该假型病毒用作SARS-CoV-2的模型。将两种组合的抗COVID 19效果与Lf进行比较。这些试验由IntegratedBioTheraputics Inc.(IBT,Rockville,USA)独立进行。

使用Vero细胞进行基于组织培养的测定。测量了两种组合和乳铁蛋白的细胞毒性。对于抑制性浓度测定，将rVSV-SARS-CoV-2S颗粒暴露于在一定浓度范围的两种组合和Lf中。暴露后，将rVSVSARS-CoV-2S颗粒添加至含有Vero细胞培养物的板中，并孵育24小时。感染程度通过测量萤火虫萤光素酶活性来确定，使用Bright-Glo^TM测定系统试剂盒(Promega)来检测，使用XLfit剂量反应模型来计算IC₅₀。

只有当样品浓度高时，才能检测到低水平的细胞毒性。细胞毒性不干扰IC₅₀的测定。

考虑到本发明的组合通常包括具有潜在非常不同分子量的蛋白组分，以w/v表示的数据是最具代表性的。将50,000g/mol的标称MW用于本发明的组合，以及将80,000g/mol的标称MW用于乳铁蛋白。

图4-7示出了两种组合和乳铁蛋白样品对rVSV-SARS-CoV-2S的细胞毒性和抑制。两种组合具有的IC₅₀值为3.5mg/ml和4mg/ml。冷冻干燥的乳铁蛋白样品具有的IC₅₀值为6.4mg/ml，以及喷雾干燥的乳铁蛋白样品具有的IC₅₀值为4.5mg/ml。

讨论

体外抗SARS-CoV-2研究

这些体外试验示出，本发明的组合抑制了rVSV-SARS-CoV-2S感染宿主细胞的能力。该结果与冷冻干燥和喷雾干燥的乳铁蛋白样品的结果相比较是有利的，本发明的组合的IC₅₀在相同或更低的浓度下出现。

该测定中使用的假病毒模拟了SARS-CoV-2表面蛋白与宿主细胞的相互作用。应考虑使用本发明的组合(其可能包含乳铁蛋白和一系列其他蛋白)来调节免疫系统对SARS-CoV-2做出适当反应的潜力。

结论

这些结果表明，本发明的组合具有与乳铁蛋白一样好或可能比乳铁蛋白更好的抗COVID特性。这种抗COVID活性使本发明的组合成为营养和膳食补充剂以及外用产品诸如滴剂、乳膏或喷雾剂的理想成分。

除非上下文另有明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包括(comprise)”、“包括(comprising)”等应在包容性意义上的解释，而不是排他性或穷尽意义上的解释，也就是说，在“包括但不限于”意义上的解释。

以上和以下引用的所有申请、专利和出版物的全部公开内容(如有)通过援引并入本文。

本说明书中对任何现有技术的援引不是，也不应被视为承认或以任何形式暗示该现有技术构成世界上任何国家努力领域的共同一般知识的一部分。

本发明也可以广义地说包括在本申请的说明书中单独地或共同地提及或指示的部分、元素和特征，包括所述部分、元素或特征中的两个或更多个的任何或所有组合。

如果在上述描述中提及了具有其已知等价物的整数或组分，则将这些整数并入本文，就好像单独列出一样。

应当注意，对本文所述的当前优选实施方式的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。可以在不脱离本发明的精神和范围以及不削弱其伴随的优势的情况下进行这样的改变和修改。因此，旨在将这样的改变和修改包括在本发明内。

Claims

1.一种预防、抑制或降低病毒对细胞或在细胞内的病毒活性的方法，所述方法包括以下步骤：使所述病毒或所述细胞与有效量的至少两种蛋白的组合接触，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取。

2.一种预防、抑制或降低病毒对受试者或在受试者内的病毒活性的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者给药有效量的至少两种蛋白的组合，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取。

3.一种治疗或预防受试者中病毒感染的方法，所述方法包括以下步骤：

向所述受试者给药有效量的至少两种蛋白的组合，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取。

4.至少两种蛋白的组合在制备用于预防、抑制或降低病毒对细胞或在细胞内的病毒活性的药物中的用途，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取。

5.至少两种蛋白的组合在制备用于预防、抑制或降低病毒对受试者或在受试者内的病毒活性的药物中的用途，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取。

6.至少两种蛋白的组合在制备用于治疗或预防受试者的病毒感染的药物中的用途，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法或根据权利要求4至6中任一项所述的用途，其中，所述病毒选自：

i.来自冠状病毒科(Coronaviridae)的毒株；

ii.人流感病毒；和/或

iii.单纯疱疹病毒。

8.根据权利要求7所述的方法或用途，其中，所述来自冠状病毒科的毒株是来自正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)的毒株。

9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法或用途，其中,所述来自冠状病毒科的毒株是SARS病毒。

10.根据权利要求9所述的方法或用途，其中，所述来自冠状病毒科的毒株是COVID-19。

11.根据权利要求7所述的方法或用途，其中，所述人流感病毒是人甲型流感病毒。

12.根据权利要求7或权利要求11所述的方法或用途，其中,人流感病毒是人甲型H1N1流感。

13.根据权利要求7所述的方法或用途，其中，所述单纯疱疹病毒是HSV-1或HSV-2。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法或用途，其中，当所述组合包括乳铁蛋白时，所述组合的乳铁蛋白含量小于40％w/w。

15.根据权利要求1至13中任一项所述的方法或用途，其中，当所述组合包括乳铁蛋白时，所述组合的乳铁蛋白含量小于10％w/w。

16.以下的组合：

(ii)至少一种抗病毒剂。

17.根据权利要求16所述的组合，其中，所述抗病毒剂选自：阿巴卡韦(HIV)；阿昔洛韦(阿昔洛维)(单纯疱疹)；阿德福韦(乙型肝炎)；金刚烷胺(流感)；安普利近(禽流感)；安普那韦(Agenerase)(HIV)；乌米芬诺韦(阿比多尔)(流感)；阿扎那韦(HIV)；替拉依(HIV)；巴洛沙韦玛波西酯(速福达)(甲型流感、乙型流感)；必妥维(HIV)、波普瑞韦(丙型肝炎)、布尔韦肽(丁型肝炎和乙型肝炎)、西多福韦(AIDS)、可比司他(Tybost)(HIV)、可比韦(HIV)、达拉他韦(达卡他韦)(丙型肝炎)、达芦那韦(HIV)、地拉韦啶(丙型肝炎)、达可挥(乙型肝炎)、地达诺新(HIV)、二十二烷醇(单纯疱疹)、多替拉韦(HIV)、多拉韦林(沛卓)(HIV)、依度尿苷(单纯疱疹)、依发韦仑(HIV)、艾维雷韦(HIV)、恩曲他滨(HIV)、恩夫韦肽(HIV)、恩替卡韦(HIV)、依曲韦林(英特莱)(HIV)、泛昔洛韦(带状疱疹)、福米韦生(AIDS)、福沙那韦(HIV)、膦甲酸(疱疹)、更昔洛韦(赛美维)(巨细胞病毒(CMV))、伊巴他滨(唇疱疹)、伊巴组单抗(特罗格佐)(HIV)、碘苷(疱疹)、咪喹莫德(生殖器疣)、Imunovir(单纯疱疹)、茚地那韦(HIV)、拉米夫定(HIV)、来特莫韦(普瑞明)(巨细胞病毒(CMV))、洛匹那韦(HIV)、洛韦胺(HIV)、马拉韦罗(HIV)、美替沙腙(天花)、吗啉胍(流感)、奈非那韦(HIV)、奈韦拉平(HIV)、Nexavir(原Kutapressin)(带状疱疹)、硝唑沙奈(广谱抗病毒)、诺韦(HIV)、奥司他韦(达菲)(流感)、喷昔洛韦(疱疹)、帕拉米韦(流感)、喷昔洛韦(疱疹)、帕拉米韦(Rapivab)(流感)、普可那利(小RNA病毒)、鬼臼毒素(生殖器疣)、拉替拉韦(HIV)、瑞德西韦(COVID-19)、利巴韦林(丙型肝炎)、利匹韦林(HIV)、金刚乙胺(甲型流感)、利托那韦(HIV)、沙奎那韦(HIV)、司美匹韦(奥莱森)(丙型肝炎)、索磷布韦(丙型肝炎)、司他夫定(HIV)、塔利韦林(韦拉密仃)(肝炎综合征，在其中利巴韦林具有活性)、替拉瑞韦(丙型肝炎)、替比夫定(替泽卡)(乙型肝炎)、富马酸丙酚替诺福韦(乙型肝炎)、替诺福韦二吡呋酯(乙型肝炎、HIV)、替拉那韦(HIV)、曲氟尿苷(眼部相关疱疹)、三协唯(HIV)、曲金刚胺(单纯疱疹)、舒发泰(HIV)、乌芬诺韦(流感)、伐昔洛韦(维德思)(单纯疱疹、带状疱疹)、缬更昔洛韦(万赛维)(HIV)、维利韦洛(HIV-1)、阿糖腺苷(单纯疱疹、水痘-带状疱疹)、扎西他滨(HIV)、扎那米韦(瑞乐砂)(甲型流感、乙型流感)和齐多夫定(HIV)。

18.至少两种蛋白的组合，每种蛋白具有基本上6.8或高于基本上6.8的等电点，并且所述至少两种蛋白从乳中提取，其中，当所述组合包括乳铁蛋白时，所述组合的乳铁蛋白含量小于40％w/w。

19.根据权利要求17或权利要求18所述的组合，其中，当所述组合包括乳铁蛋白时，所述组合的乳铁蛋白含量小于10％w/w。