CN116626208A - 一种低聚半乳糖的液相色谱-质谱联用检测方法及其应用 - Google Patents

一种低聚半乳糖的液相色谱-质谱联用检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低聚半乳糖的液相色谱‑质谱联用检测方法及其应用，其包括如下步骤：S1、标准品溶液配制：将不同的糖标准品配制成糖标准品储备液；S2、将实际样品进行前处理得到待测液；S3、液相色谱质谱检测：将S1的糖标准品储备液和S2的待测液通过液相色谱质谱进行分离测定；S4、色谱质谱图分析：记录标准品和待测液中各色谱峰的保留时间，以及标准品和待测液中各色谱峰在串联质谱图上的特征子离子和母离子强度的比值；通过保留时间和子离子与母离子强度比值来鉴定GOS中二糖、三糖和四糖糖苷键的α/β构型和/或糖苷键的连接位置。本发明的检测方法有利于高活性低聚半乳糖产品的开发和质量控制。

Description

一种低聚半乳糖的液相色谱-质谱联用检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，尤其是涉及一种低聚半乳糖的液相色谱-质谱联用检测方法及其应用。
背景技术
低聚半乳糖（galactooligosaccharides, GOS）是一种具有天然属性的功能性低聚糖，主要存在于动物乳汁和母乳中，已被允许作为营养强化剂添加到婴幼儿配方奶粉等食品中，同时在医药和饲料等行业也受到广泛关注。GOS的分子结构是在半乳糖或葡萄糖一端通过不同糖苷键（有α/β构型和不同的连接位置（(1→6)，(1→4)，(1→3)或(1→2)））连接1~7个半乳糖基，即(Gal)n-Gal/Glc（n=1～7）（Gal, galactose, 半乳糖；Glc, glucose,葡萄糖）。GOS目前主要采用半乳糖苷酶催化乳糖制备，受酶来源和反应条件的影响，不同企业生产的GOS在化学组成上存在较大差异。构效关系研究显示GOS的功能与其结构密切相关，含不同糖苷键的异构体或由不同单糖组成的异构体往往具有不同的生物活性。近年来，随着理论上定向改造半乳糖苷酶以用于定向合成具有特定功能活性的特定GOS组分成为可能，对特定构型GOS组分的分析也提出了要求。因此，开发GOS中不同异构体组分的定性分析方法，对建立完整的GOS异构体营养价值判定体系，引导工业生产出高活性、高稳定性和高附加值的GOS产品具有重要意义，有助于增强我国乳制品与微生态营养健康科技的应用发展及国发健康。
由于聚合度、单糖组成和糖苷键的不同，GOS的组成复杂且存在多种异构体，这对GOS各组分的定性分析提出了挑战。液相色谱技术是目前GOS分析检测的主要方法，具体包括：高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）和离子色谱法中的高效阴离子交换色谱法（high performance anion exchange chromatography，HPAEC）。然而这些方法存在分析周期较长、样品前处理步骤复杂、多种异构体的分离鉴定难度大等问题。核磁共振谱（nuclear magnetic resonance，NMR）可以区分异构体，但该法需要预先获得高纯度组分，而纯化获得高纯度组分需要较长周期且步骤繁琐。质谱（massspectrometry，MS）是众多分析技术中同时具备灵敏度高、特异性好、响应速度快的分析技术，尤其是高分辨质谱，其针对基质复杂的样品在灵敏度和抗干扰能力方面表现出绝对优势，正成为糖类检测方法的重要发展趋势。然而，仅仅通过高分辨质谱的m/z值无法区分具有相同m/z值的异构体。
因此，有必要开发一种能够快速鉴定GOS糖苷键的α/β构型和糖苷键的连接位置的方法。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明第一方面提出一种低聚半乳糖的液相色谱-质谱联用检测方法，能够有效快速鉴定低聚半乳糖糖苷键的α/β构型和/或糖苷键的连接位置。
本发明第二方面还提供一种应用。
根据本发明的第一方面实施例提供的一种低聚半乳糖的液相色谱-质谱联用检测方法，包括如下步骤：
S1、标准品溶液配制：将不同的糖标准品配制成糖标准品储备液；
S2、将实际样品进行前处理得到待测液；
S3、液相色谱质谱检测：将S1的糖标准品储备液和S2的待测液通过液相色谱质谱进行分离测定；
S4、色谱质谱图分析：记录标准品和待测液中各色谱峰的保留时间，以及标准品和待测液中各色谱峰在串联质谱图上的特征子离子和母离子强度；计算特征子离子/母离子强度的比值；通过保留时间和色谱峰在串联质谱图上的子离子与母离子强度比值来鉴定低聚半乳糖中二糖、三糖和四糖糖苷键的α/β构型和/或糖苷键的连接位置。
根据本发明实施例的检测方法，至少具有如下有益效果：
本发明基于液相色谱质谱分析提出了一种利用低聚半乳糖中二糖、三糖和四糖各异构体在亲水柱上的保留时间，以及低聚半乳糖中二糖、三糖和四糖在亲水柱上分离的各异构体在串联质谱图上的子离子与母离子强度比值，来鉴定低聚半乳糖中二糖、三糖和四糖糖苷键的α/β构型和/或糖苷键的连接位置的方法。本发明操作简便、可直观快速鉴定低聚半乳糖的结构，可广泛应用于各种低聚半乳糖产品及含低聚半乳糖食品中低聚半乳糖的结构分析，为低聚半乳糖的构效关系研究提供了可靠的方法，有利于高活性低聚半乳糖产品的开发和质量控制。
根据本发明的一些实施例，所述标准品储备液的浓度为0.001~0.1 mg/mL。
根据本发明的一些实施例，所述标准品包括曲二糖(α-Glc-[1→2]-Glc)、异麦芽糖(α-Glc-[1→6]-Glc)、黑曲霉二糖(α-Glc-[1→3]-Glc)、蜜二糖(α-Gal-[1→6]-Glc)、麦芽糖(α-Glc-[1→4]-Glc)、1,4-半乳二糖(β-Gal-[1→4]-Gal)、1,6-半乳二糖(β-Gal-[1→6]-Gal)、乳糖(β-Gal-[1→4]-Glc)、纤维二糖(β-Glc-[1→4]-Glc)、槐糖(β-Glc-[1→2]-Glc)、昆布二糖(β-Glc-[1→3]-Glc)、龙胆二糖(β-Glc-[1→6]-Glc)、麦芽三糖(α-Glc-[1→4]-α-Glc-[1→4]-Glc)、纤维三糖(β-Glc-[1→4]-β-Glc-[1→4]-Glc)、异麦芽三糖(α-Glc-[1→6]-α-Glc-[1→6]-Glc)、黑曲霉三糖(α-Glc-[1→3]-α-Glc-[1→3]-Glc)、昆布三糖(β-Glc-[1→3]-β-Glc-[1→3]-Glc)、麦芽四糖(α-Glc-[1→4]-α-Glc-[1→4]-α-Glc-[1→4]-Glc)、纤维四糖(β-Glc-[1→4]-β-Glc-[1→4]-β-Glc-[1→4]-Glc)、异麦芽四糖(α-Glc-[1→6]-α-Glc-[1→6]-α-Glc-[1→6]-Glc)、黑曲霉四糖(α-Glc-[1→3]-α-Glc-[1→3]-α-Glc-[1→3]-Glc)、昆布四糖(β-Glc-[1→3]-β-Glc-[1→3]-β-Glc-[1→3]-Glc)中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述液相色谱的条件为：
色谱柱：Infinity Lab Poroshell 120 HILIC（3.0 mm×100 mm, 2.7 μm）；柱温：30~40 ℃；进样量：0.5~2 μL；流速：0.4~0.7 mL/min；
流动相：水（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0~10 min，90%~75% B；10~10.5 min，75%~90%B；10.5~15.5 min，90% B。
根据本发明的一些实施例，所述质谱条件为：电喷雾离子源：正离子，质谱扫描范围：m/z 50~1000 ；全扫描模式和母离子（m/z）：[C12H22O11+Na]+（m/z 365.1054）、[C18H32O16+Na]+（m/z 527.1583）、[C24H42O21+Na]+（m/z 689.2111）的串联质谱扫描。
根据本发明的一些实施例，步骤S4中，所述色谱质谱图分析包括，记录标准品和待测液中各色谱峰的保留时间，以及标准品和待测液中各色谱峰在串联质谱图上的特征子离子和母离子强度；计算特征子离子/母离子强度的比值；以保留时间为横坐标，特征子离子/母离子强度的比值为纵坐标对标准品和待测液作图；以不同结构的标准品和/或不同样品为横坐标，特征子离子/母离子强度的比值为纵坐标作图。
根据本发明的一些实施例，步骤S4中，所述色谱质谱图分析包括，通过对全扫描模式色谱图提取离子m/z 365.1054、m/z 527.1583和m/z 689.2111以获取提取离子色谱图，根据m/z 365.1054的提取离子色谱图记录标准品和待测液中二糖各异构体色谱峰的保留时间，根据m/z 527.1583的提取离子色谱图记录标准品和待测液中三糖各异构体色谱峰的保留时间，根据m/z 689.2111的提取离子色谱图记录标准品和待测液中四糖各异构体色谱峰的保留时间；基于母离子[C12H22O11+Na]+（m/z 365.1054）的串联质谱扫描获取二糖各异构体色谱峰的串联质谱图，基于母离子[C18H32O16+Na]+（m/z 527.1583）的串联质谱扫描获取三糖各异构体色谱峰的串联质谱图，基于母离子[C24H42O21+Na]+（m/z 689.2111）的串联质谱扫描获取四糖各异构体色谱峰的串联质谱图，根据二糖、三糖和四糖各异构体色谱峰的串联质谱图记录标准品和待测液中二糖、三糖和四糖各异构体色谱峰在串联质谱图上的特征子离子和母离子强度；所述特征子离子为[M+Na-18]+、[M+Na-60]+、[M+Na-120]+、[M+Na-162]+（对于二糖，M代表C12H22O11，对于三糖，M代表C18H32O16，对于四糖，M代表C24H42O21）；计算子离子/母离子强度的比值：[M+Na-162]+/[M+Na]+、[M+Na-18]+/[M+Na]+、[M+Na-60]+/[M+Na]+、[M+Na-120]+/[M+Na]+；以保留时间为横坐标，[M+Na-162]+/[M+Na]+为纵坐标对标准品和待测液作图，以及以不同结构的标准品和/或不同样品为横坐标，[M+Na-18]+/[M+Na]+、[M+Na-60]+/[M+Na]+、[M+Na-120]+/[M+Na]+为纵坐标作图。
根据本发明的一些实施例，所述前处理包括将低聚半乳糖样品溶于水，过滤即得待测液；或对含有低聚半乳糖的物质与水混匀超声，加入沉淀剂、混匀静置、离心、取上清液加水稀释，过滤得待测液。
根据本发明的一些实施例，所述沉淀剂为乙腈。
根据本发明的一些实施例，所述含有低聚半乳糖的物质包括含低聚半乳糖的奶粉、米粉、酸奶、乳酸菌饮料中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，低聚半乳糖样品的浓度在0.004~0.4 mg/mL。
根据本发明的一些实施例，所述超声的时间为10~30 min。
根据本发明的一些实施例，所述离心的转速为4000~6000 r/min。
根据本发明的一些实施例，所述稀释的倍数为10~50倍。
根据本发明的第二方面实施例提供的上述所述的液相色谱-质谱联用检测方法在鉴别低聚半乳糖的结构中的应用。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是实施例1的不同二糖标准品的串联质谱图；
图2是实施例1的不同二糖标准品的串联质谱图；
图3是实施例1的不同二糖标准品的串联质谱图；
图4是实施例1的不同二糖标准品的保留时间和子离子/母离子强度比值图；
图5是实施例2的不同三糖标准品的串联质谱图；
图6是实施例2的不同三糖标准品的保留时间和子离子/母离子强度比值图；
图7是实施例3的不同四糖标准品的串联质谱图；
图8是实施例3的不同四糖标准品的保留时间和子离子/母离子强度比值图；
图9是实施例4的两厂家低聚半乳糖样品（DGOS/YGOS）的二糖（DP2）/三糖（DP3）/四糖（DP4）组分的提取离子色谱图；
图10是实施例4的厂家低聚半乳糖样品（DGOS）的二糖（DP2）组分中各色谱峰所对应的串联质谱图；
图11是实施例4的厂家低聚半乳糖样品（YGOS）的二糖（DP2）组分中各色谱峰所对应的串联质谱图；
图12是实施例4的两厂家低聚半乳糖样品（DGOS/YGOS）的三糖（DP3）组分中各色谱峰所对应的串联质谱图；
图13是实施例4的两厂家低聚半乳糖样品（DGOS/YGOS）的四糖（DP4）组分中各色谱峰所对应的串联质谱图；
图14是实施例5的奶粉样品（gnf1）的二糖（DP2）/三糖（DP3）/四糖（DP4）组分的提取离子色谱图；
图15是实施例5的不同奶粉样品（jnf2/jnf3）的二糖（DP2）/三糖（DP3）/四糖（DP4）组分的提取离子色谱图；
图16是实施例5的奶粉样品（gnf1）的二糖（DP2）组分中各色谱峰所对应的串联质谱图；
图17是实施例5的不同奶粉样品（jnf2/jnf3）的二糖（DP2）组分中各色谱峰所对应的串联质谱图；
图18是实施例5的奶粉样品（gnf1）的三糖（DP3）组分中各色谱峰所对应的串联质谱图；
图19是实施例5的不同奶粉样品（jnf2/jnf3）的三糖（DP3）组分中各色谱峰所对应的串联质谱图；
图20是实施例5的不同奶粉样品（gnf1/jnf2/jnf3）的四糖（DP4）组分中各色谱峰所对应的串联质谱图；
图21是实施例4和实施例5的不同GOS样品（DGOS/YGOS）和不同奶粉样品（gnf1/jnf2/jnf3/）的二糖（DP2）组分中各色谱峰的保留时间和和子离子/母离子强度比值图；
图22是实施例4和实施例5的不同GOS样品（DGOS/YGOS）和不同奶粉样品（gnf1/jnf2/jnf3/）的三糖（DP3）组分中各色谱峰的保留时间和和子离子/母离子强度比值图；
图23是实施例4和实施例5的不同GOS样品（DGOS/YGOS）和不同奶粉样品（gnf1/jnf2/jnf3/）的四糖（DP4）组分中各色谱峰的保留时间和和子离子/母离子强度比图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，并结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
本发明所采用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
Ultimate3000 超高效液相色谱-四级杆串联静电轨道阱组合式高分辨质谱仪（美国Thermo公司）；
ME104E万分之一分析天平（梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司）；
Hei-Tec磁力搅拌器（德国海道夫）；
KQ-100DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
SCI-VS赛洛捷克旋涡混匀仪（美国赛洛捷克）；
实施例中采用的试剂如下：
实施例1
实施例1提供一种二糖标准品的液相色谱质谱分析；具体步骤如下：
以水作溶剂配制0.04 mg/mL的二糖标准品（曲二糖(α-Glc-[1→2]-Glc)、异麦芽糖(α-Glc-[1→6]-Glc)、黑曲霉二糖(α-Glc-[1→3]-Glc)、蜜二糖(α-Gal-[1→6]-Glc)、麦芽糖(α-Glc-[1→4]-Glc)、1,4-半乳二糖(β-Gal-[1→4]-Gal)、1,6-半乳二糖(β-Gal-[1→6]-Gal)、乳糖(β-Gal-[1→4]-Glc)、纤维二糖(β-Glc-[1→4]-Glc)、槐糖(β-Glc-[1→2]-Glc)、昆布二糖(β-Glc-[1→3]-Glc)、龙胆二糖(β-Glc-[1→6]-Glc)）溶液，过0.22 μm水系滤膜，进液相色谱质谱分析。
液相色谱条件如下：色谱柱，Infinity Lab Poroshell 120 HILIC（3.0 mm×100mm, 2.7 μm）；流动相：水（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0~10 min，90%~75% B；10~10.5 min，75%~90% B；10.5~15.5 min，90% B；柱温：30 ℃；进样量：1 μL；流速：0.6 mL/min。
质谱条件如下：电喷雾离子源（正离子），离子传输管温度为325 ℃；加热器温度为350 ℃；喷雾电压为3.2 kV；鞘气（N2）流速为40 arb；辅助器流速为10 arb；(1) 全扫描模式（Full MS），扫描分辨率为70000，质谱扫描范围：m/z 100~1000，静电轨道阱离子捕获器门限值（AGC Target）为3×106，最大注入捕获器时间为200 ms；(2) 数据依赖二级扫描（dd-MS2），二级扫描分辨率为17500，二级碎片离子捕获器门限值（dd-MS2 AGC Target）为1×105，最大注入捕获器时间（dd-MS2 Maximum inject time）为 50 ms，归一化碰撞能（normalized collision energy，NCE）为：45（母离子m/z 365.1054（二糖分析），子离子扫描范围：m/z 50~390）、45（母离子m/z 527.1583（三糖分析），子离子扫描范围：m/z 50~550）、50（母离子m/z 689.2111（四糖分析），子离子扫描范围：m/z 50~710）。
不同结构二糖标准品的串联质谱图见图1~3，其保留时间和子离子/母离子强度比值见图4。
从图1~图4可知，①对于相同糖苷键的二糖，单糖差异（Glc/Gal）对其串联质谱图的影响较小；②α构型二糖相比对应的β构型二糖具有较高的[C12H22O11+Na-C6H10O5]+（m/z203），即基于m/z203（[M+Na-162]+）和m/z 365（[M+Na]+）的峰强比值（Im/z203/Im/z365）可以识别二糖的α构型和β构型：Im/z203/Im/z365值较大时可鉴定为α构型，Im/z203/Im/z365值较小时可鉴定为β构型；③对仅含葡萄糖的二糖，其在亲水相互作用柱HILIC的保留时间规律有（(1→2)、(1→6)键的保留时间高于(1→3)、(1→4)键，且含半乳糖的二糖（Gal-Glc/Gal）的保留时间高于仅含葡萄糖的二糖（Glc-Glc）。即可得：对于Gal-Glc/Gal，保留时间小于2.7 min可鉴定为(1→3)或(1→4)键，保留时间大于2.7 min可鉴定为(1→2)或(1→6)键；④对同一α或β构型的二糖，(1→3)键较(1→4)键具有较强的[C12H22O11+Na-H2O]+（m/z 347）和较低的[C12H22O11+Na-C2H4O2]+（m/z 305），(1→2)键较(1→6)键具有较强的[C12H22O11+Na-C4H8O4]+（m/z 245），即基于m/z347（[M+Na-18]+）与m/z365（[M+Na]+）的峰强比值（Im/z347/Im/z365）、m/z305（[M+Na-60]+）与m/z365（[M+Na]+）的峰强比值（Im/z305/Im/z365）、m/z245（[M+Na-120]+）与m/z365（[M+Na]+）的峰强比值（Im/z245/Im/z365）以及③中的保留时间规律可以识别(1→2)、(1→3)键、(1→4)和(1→6)键：当保留时间较小且Im/z347/Im/z365值高于其它子离子/母离子值（如Im/z305/Im/z365、Im/z245/Im/z365）时可鉴定为(1→3)键，当保留时间较小且Im/z347/Im/z365值不高于其它子离子/母离子值（如Im/z305/Im/z365、Im/z245/Im/z365）时可鉴定为(1→4)键，当保留时间较大且Im/z245/Im/z365值高于其它子离子/母离子值（如Im/z305/Im/z365、Im/z347/Im/z365）时可鉴定为(1→2)键，当保留时间较大且Im/z245/Im/z365值不高于其它子离子/母离子值（如Im/z305/Im/z365、Im/z347/Im/z365）时可鉴定为(1→6)键。
实施例2
实施例2提供一种三糖标准品的液相色谱质谱分析：步骤如下
以水作溶剂配制0.04 mg/mL的三糖标准品（麦芽三糖(α-Glc-[1→4]-α-Glc-[1→4]-Glc)、纤维三糖(β-Glc-[1→4]-β-Glc-[1→4]-Glc)、异麦芽三糖(α-Glc-[1→6]-α-Glc-[1→6]-Glc)、黑曲霉三糖(α-Glc-[1→3]-α-Glc-[1→3]-Glc)、昆布三糖(β-Glc-[1→3]-β-Glc-[1→3]-Glc)）溶液，过0.22 μm水系滤膜，进液相色谱质谱分析。
液相色谱和质谱条件同实施例1；
不同三糖标准品的串联质谱图见图5，其保留时间和子离子/母离子强度比值见图6。
从图5和图6可知，①α构型三糖相比对应的β构型糖具有较高的[C18H32O16+Na-C6H10O5]+（m/z 365），即基于m/z365（[M+Na-162]+）和m/z527（[M+Na]+）的峰强比值（Im/z365/Im/z527）可以识别三糖的α构型和β构型：Im/z365/Im/z527值较大时可鉴定为α构型，Im/z365/Im/z527值较小时可鉴定为β构型；②对不同连接键的三糖，其在亲水相互作用柱HILIC的保留时间规律有(1→6)键的保留时间高于(1→3)、(1→4)键；③对同一β构型的三糖，β(1→3)键较β(1→4)键具有较强的[C18H32O16+Na-H2O]+（m/z 509），以及较低的[C18H32O16+Na-C2H4O2]+（m/z467）；结合二糖规律可得，基于m/z509（[M+Na-18]+）与m/z527（[M+Na]+）的峰强比值（Im/z509/Im/z527）、m/z467（[M+Na-60]+）与m/z527（[M+Na]+）的峰强比值（Im/z467/Im/z527）以及②中的保留时间规律可以识别β(1→3)键、β(1→4)和β(1→6)键：当保留时间较小且Im/z509/Im/z527值高于其它子离子/母离子值（如Im/z467/Im/z527、Im/z407/Im/z527）时可鉴定为β(1→3)键，当保留时间较小且Im/z509/Im/z527值不高于其它子离子/母离子值（如Im/z467/Im/z527、Im/z407/Im/z527）时可鉴定为β(1→4)键，当保留时间较大且Im/z407/Im/z527值或Im/z509/Im/z527值不高于Im/z467/Im/z527时可鉴定为β(1→6)键；④对同一α构型的三糖，α(1→3)键较α(1→4)键具有较强的[C18H32O16+Na-H2O]+（m/z 509），较低的[C18H32O16+Na-C2H4O2]+（m/z 467），且[C18H32O16+Na-C6H12O6]+（m/z 347）在串联质谱图上为最强峰（即基峰，相对丰度为100%）；结合二糖规律可得，基于m/z509（[M+Na-18]+）与m/z527（[M+Na]+）的峰强比值（Im/z509/Im/z527）、m/z467（[M+Na-60]+）与m/z527（[M+Na]+）的峰强比值（Im/z467/Im/z527）以及②中的保留时间规律可识别(1→3)键、(1→4)和(1→6)键：当保留时间较小，m/z 347在串联质谱图上呈现最强峰，Im/z509/Im/z527值高于其它子离子/母离子值（如Im/z467/Im/z527、Im/z407/Im/z527）时可鉴定为α(1→3)键，当保留时间较小且Im/z509/Im/z527值不高于其它子离子/母离子值（如Im/z467/Im/z527、Im/z407/Im/z527）时可鉴定为α(1→4)键，当保留时间较大且Im/z407/Im/z527值或Im/z509/Im/z527值不高于Im/z467/Im/z527时可鉴定为α(1→6)键。
实施例3
实施例3提供一种四糖标准品的液相色谱质谱分析：步骤如下：
以水作溶剂配制0.04 mg/mL的四糖标准品（麦芽四糖(α-Glc-[1→4]-α-Glc-[1→4]-α-Glc-[1→4]-Glc)、纤维四糖(β-Glc-[1→4]-β-Glc-[1→4]-β-Glc-[1→4]-Glc)、异麦芽四糖(α-Glc-[1→6]-α-Glc-[1→6]-α-Glc-[1→6]-Glc)、黑曲霉四糖(α-Glc-[1→3]-α-Glc-[1→3]-α-Glc-[1→3]-Glc)、昆布四糖(β-Glc-[1→3]-β-Glc-[1→3]-β-Glc- [1→3]-Glc)）溶液，过0.22 μm水系滤膜，进液相色谱质谱分析。
液相色谱和质谱条件同实施例1；
不同四糖标准品的串联质谱图见图7，其保留时间和子离子/母离子强度比值见图8。
从图7和图8可知，①α构型四糖相比对应的β构型糖分别具有较高的[C24H42O21+Na-C6H10O5]+（m/z 527），即基于m/z527（[M+Na-162]+）和m/z689（[M+Na]+）的峰强比值（Im/z527/Im/z689）可以识别四糖的α构型和β构型：Im/z527/Im/z689值较大时可以鉴定为α构型，Im/z527/Im/z689值较小时可以鉴定为β构型；②对不同连接键的四糖，其在亲水相互作用柱HILIC的保留时间规律有(1→6)键的保留时间高于(1→3)、(1→4)键；③对同一β构型的四糖，β(1→3)键较β(1→4)键具有较强的[C24H42O21+Na-H2O]+（m/z 671），以及较低的[C24H42O21+Na-C2H4O2]+（m/z 629），结合二糖规律可得，基于m/z671（[M+Na-18]+）与m/z689（[M+Na]+）的峰强比值（Im/z671/Im/z689）、m/z629（[M+Na-60]+）与m/z689（[M+Na]+）的峰强比值（Im/z629/Im/z689）以及②中的保留时间规律可以识别β(1→3)键、β(1→4)和β(1→6)键：当保留时间较小且Im/z671/Im/z689值高于其它子离子/母离子值（Im/z629/Im/z689、Im/z569/Im/z689）时可鉴定为β(1→3)键，当保留时间较小且Im/z671/Im/z689值不高于其它子离子/母离子值（Im/z629/Im/z689、Im/z569/Im/z689）时可鉴定为β(1→4)键，当保留时间较大且Im/z569/Im/z689值或Im/z671/Im/z689值不高于Im/z629/Im/z689值时可鉴定为β(1→6)键；④对同一α构型的四糖，α(1→3)键较α(1→4)键具有较强的[C24H42O21+Na-C12H22O11]+（m/z 347），m/z 347在串联质谱图上为最强峰（即基峰，相对丰度为100%），结合二糖规律可得，基于[C24H42O21+Na-C12H22O11]+（m/z 347）的相对丰度、②中的保留时间规律、以及③中子离子/母离子峰强比值（m/z671（[M+Na-18]+）与m/z689（[M+Na]+）的峰强比值（Im/z671/Im/z689）、m/z629（[M+Na-60]+）与m/z689（[M+Na]+）的峰强比值（Im/z629/Im/z689））规律可以识别α(1→3)键、α(1→4)和α(1→6)键：当保留时间较小且m/z 347在串联质谱图上为最强峰（相对丰度为100%）时可鉴定为α(1→3)键，当保留时间较小且Im/z347在串联质谱图上不为最强峰（相对丰度＜100%）时可鉴定为α(1→4)键，当保留时间较大，Im/z347在串联质谱图上不为最强峰，且Im/z569/Im/z689值或Im/z671/Im/z689值不高于Im/z629/Im/z689时可鉴定为α(1→6)键。
实施例4
实施例4提供实际样品的液相色谱质谱分析：步骤如下：
以水作溶剂配制0.04 mg/mL的两厂家低聚半乳糖样品（DGOS/YGOS），过0.22 μm水系滤膜，进液相色谱质谱分析。
液相色谱和质谱条件同实施例1；
两厂家低聚半乳糖样品（DGOS/YGOS）的二糖（DP2）/三糖（DP3）/四糖（DP4）组分的提取离子色谱图见图9，二糖（DP2）/三糖（DP3）/四糖（DP4）组分中各色谱峰所对应的串联质谱图见图10~图13，其保留时间和和子离子/母离子强度比值见图21~图23。
结合图21~图23与图4、图6和图8可快速鉴定：两厂家低聚半乳糖样品（DGOS/YGOS）的二糖含有β(1→3)（DGOS-DP2-1、YGOS-DP2-1）、β(1→4)（DGOS-DP2-2、YGOS-DP2-2）（与标准品β-Gal-(1→4)-Glc一致）、β(1→6)（DGOS-DP2-4、YGOS-DP2-3、YGOS-DP2-5（与标准品β-Gal-(1→6)-Gal一致）），以及少量的β(1→2)（DGOS-DP2-3）和α(1→6)（DGOS-DP2-5、YGOS-DP2-4）。
三糖含有α(1→4)（DGOS-DP3-2）、β(1→4)（YGOS-DP3-2）、α(1→6)（DGOS-DP3-4、YGOS-DP3-4）和β(1→6)（DGOS-DP3-3、YGOS-DP3-3），以及部分麦芽三糖（DGOS-DP3-1、YGOS-DP3-1）。
四糖含有α(1→4)（YGOS-DP4-2）、β(1→4)（YGOS-DP4-3）、β(1→6)（YGOS-DP4-4）和α/β(1→6)（DGOS-DP4-2），以及部分麦芽四糖（DGOS-DP4-1、YGOS-DP4-1）。
其他低聚半乳糖样品也可以通过上述方法进行鉴别，具有相似的效果。
实施例5
实施例5提供一种含低聚半乳糖的奶粉的液相色谱质谱分析：步骤如下
准确称取0.5 g含低聚半乳糖的奶粉（gnf1/jnf2/jnf3）试样于10 mL离心管中，加4 mL 60 ℃水溶解，混匀；超声提取10 min，待冷却至室温，加入6 mL沉淀剂乙腈，混匀，静置10 min；5000 r/min离心5 min，取上清液加水稀释50倍后，过0.22 μm水系滤膜，进液相色谱质谱分析。
液相色谱和质谱条件同实施例1；
不同奶粉样品（gnf1/jnf2/jnf3）的二糖（DP2）/三糖（DP3）/四糖（DP4）组分的提取离子色谱图见图14~15，二糖（DP2）/三糖（DP3）/四糖（DP4）组分中各色谱峰所对应的串联质谱图见图16~图20，其保留时间和和子离子/母离子强度比值见图21~图23。
结合图21~图23与图2、图4和图6可快速鉴定：同一品牌的产品其低聚糖组成相同，如jnf2/jnf3奶粉中的二糖均以乳糖为主（jnf2/jnf3-DP2-2），含少量的β(1→3)（jnf2/jnf3-DP2-1）和α(1→6)（jnf2/jnf3-DP2-3），gnf1奶粉中的二糖以乳糖为主（gnf1-DP2-2），含少量的β(1→3)（gnf1-DP2-1）和β(1→6)键（gnf1-DP2-3）；jnf2/jnf3奶粉中的三糖均主要含α(1→4)（jnf2/jnf3-DP3-1、jnf2/jnf3-DP3-2）和α(1→6)（jnf2/jnf3-DP3-3）；gnf1奶粉中的三糖主要含α(1→4)（gnf1-DP3-2、gnf1-DP3-3）、α(1→6)（gnf1-DP3-5）、β(1→6)（gnf1-DP3-4），以及部分麦芽三糖（gnf1-DP3-1）；jnf2/jnf3奶粉中的四糖主要含α(1→4)（jnf2/jnf3-DP4-1, jnf2/jnf3-DP4-2）和α(1→6)（jnf2/jnf3-DP4-3）；gnf1奶粉中的四糖含α/β(1→6)（gnf1-DP4-1）。
其他奶粉样品也可以通过上述方法进行鉴别，具有相似的效果。
上面结合本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

Claims (10)

1.一种低聚半乳糖的液相色谱-质谱联用检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、标准品溶液配制：将不同的糖标准品配制成糖标准品储备液；
S2、将实际样品进行前处理得到待测液；
S3、液相色谱质谱检测：将S1的糖标准品储备液和S2的待测液通过液相色谱质谱进行分离测定；
S4、色谱质谱图分析：记录标准品和待测液中各色谱峰的保留时间，以及标准品和待测液中各色谱峰在串联质谱图上的特征子离子和母离子强度；计算特征子离子/母离子强度的比值；通过保留时间和色谱峰在串联质谱图上的子离子与母离子强度比值来鉴定低聚半乳糖中二糖、三糖和四糖糖苷键的α/β构型和/或糖苷键的连接位置。
2.根据权利要求1所述的低聚半乳糖的液相色谱-质谱联用检测方法，其特征在于，所述标准品储备液的浓度为0.001~0.1 mg/mL。
3.根据权利要求1所述的低聚半乳糖的液相色谱-质谱联用检测方法，其特征在于，所述糖标准品包括曲二糖、异麦芽糖、黑曲霉二糖、蜜二糖、麦芽糖、1,4-半乳二糖、1,6-半乳二糖、乳糖、纤维二糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、麦芽三糖、纤维三糖、异麦芽三糖、黑曲霉三糖、昆布三糖、麦芽四糖、纤维四糖、异麦芽四糖、黑曲霉四糖、昆布四糖中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的低聚半乳糖的液相色谱-质谱联用检测方法，其特征在于，所述液相色谱的条件为：
色谱柱：Infinity Lab Poroshell 120 HILIC（3.0 mm×100 mm, 2.7 μm）；柱温：30~40 ℃；进样量：0.5~2 μL；流速：0.4~0.7 mL/min；
流动相：水（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0~10 min，90%~75% B；10~10.5 min，75%~90% B；10.5~15.5 min，90% B。
5.根据权利要求1所述的低聚半乳糖的液相色谱-质谱联用检测方法，其特征在于，所述质谱条件为：电喷雾离子源：正离子，质谱扫描范围：m/z 50~1000；全扫描模式和母离子（m/z）：[C12H22O11+Na]+（m/z 365.1054）、[C18H32O16+Na]+（m/z 527.1583）、[C24H42O21+Na]+（m/z 689.2111）的串联质谱扫描。
6.根据权利要求1所述的低聚半乳糖的液相色谱-质谱联用检测方法，其特征在于，步骤S4中，所述色谱质谱图分析包括，记录标准品和待测液中各色谱峰的保留时间，以及标准品和待测液中各色谱峰在串联质谱图上的特征子离子和母离子强度；计算特征子离子/母离子强度的比值；以保留时间为横坐标，特征子离子/母离子强度的比值为纵坐标对标准品和待测液作图；以不同结构的标准品和/或不同样品为横坐标，特征子离子/母离子强度的比值为纵坐标作图。
7.根据权利要求6所述的低聚半乳糖的液相色谱-质谱联用检测方法，其特征在于，步骤S4中，所述色谱质谱图分析包括，通过对全扫描模式色谱图提取离子m/z 365.1054、m/z527.1583和m/z 689.2111以获取提取离子色谱图，根据m/z 365.1054的提取离子色谱图记录标准品和待测液中二糖各异构体色谱峰的保留时间，根据m/z 527.1583的提取离子色谱图记录标准品和待测液中三糖各异构体色谱峰的保留时间，根据m/z 689.2111的提取离子色谱图记录标准品和待测液中四糖各异构体色谱峰的保留时间；基于母离子[C12H22O11+Na]+（m/z 365.1054）的串联质谱扫描获取二糖各异构体色谱峰的串联质谱图，基于母离子[C18H32O16+Na]+（m/z 527.1583）的串联质谱扫描获取三糖各异构体色谱峰的串联质谱图，基于母离子[C24H42O21+Na]+（m/z 689.2111）的串联质谱扫描获取四糖各异构体色谱峰的串联质谱图，根据二糖、三糖和四糖各异构体色谱峰的串联质谱图记录标准品和待测液中二糖、三糖和四糖各异构体色谱峰在串联质谱图上的特征子离子和母离子强度；所述特征子离子为[M+Na-18]+、[M+Na-60]+、[M+Na-120]+、[M+Na-162]+；分别计算子离子/母离子强度的比值：[M+Na-162]+/[M+Na]+、[M+Na-18]+/[M+Na]+、[M+Na-60]+/[M+Na]+、[M+Na-120]+/[M+Na]+；以保留时间为横坐标，[M+Na-162]+/[M+Na]+为纵坐标对标准品和待测液作图；以不同结构的标准品和/或不同样品为横坐标，[M+Na-18]+/[M+Na]+、[M+Na-60]+/[M+Na]+、[M+Na-120]+/[M+Na]+ 为纵坐标作图。
8.根据权利要求1所述的低聚半乳糖的液相色谱-质谱联用检测方法，其特征在于，所述前处理包括将低聚半乳糖样品溶于水，过滤即得待测液；或对含有低聚半乳糖的物质与水混匀超声，加入沉淀剂、混匀静置、离心、取上清液加水稀释，过滤得待测液。
9.根据权利要求8所述的低聚半乳糖的液相色谱-质谱联用检测方法，其特征在于，所述沉淀剂为乙腈。
10.根据权利要求1~9任一项所述的液相色谱-质谱联用检测方法在鉴别低聚半乳糖的结构中的应用。
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