CN116617467A - 一种抗凝血涂层、管道及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗凝血涂层、管道及其制备方法和应用，属于医疗器材技术领域。制备方法，包括以下步骤：S01，配制10‑20µM的Tris缓冲液100mL，盐酸调定至pH5.5‑6.5，获得酸性缓冲液；S02，称量100‑400mg多巴胺加入至酸性缓冲液中，摇匀；S03，在多巴胺溶液中放入清洗好的PVC管，紫外线光照，同时恒温摇床振摇。本发明利用多巴胺自聚合形成的聚多巴胺独有的理化属性，将多巴胺聚合在管道内部形成一层聚多巴胺涂层，通过共价结合的方式将白蛋白和阿加曲班结合在聚多巴胺层上，并且管道内壁还贴附有牛血清白蛋白BSA，形成一层稳固的且具有很好透明度的具有抗凝属性的涂层。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗凝血涂层、管道及其制备方法和应用，尤其涉及一种人工肾或ECMO等血液体外循环时所用抗凝血涂层、管道及其制备方法和应用，属于医疗器材技术领域。
背景技术
当下，在不论是CRRT、ECMO、人造血管或其它体外循环等需将患者血管内血液引出体外时，均需要经过人工制造的管路，而这些管路通常情况下均为进口管道，管道内壁涂层多为肝素涂层管道。现有技术的肝素涂层主要为三类：物理共混方式，离子键结合的方式和共价键结合的方式。物理共混方式是指基材与肝素共混的方式涂抹在连接管管道内表面，肝素通过自由扩散从基材的孔缝中被释放出来，由于无结合力的作用，肝素分子很容易脱落，不具有长时间抗凝的效果。离子键结合的方式是指利用肝素是一种酸性粘多糖，表面带有大量负电荷的属性，先将连接管管材内表面涂覆带正电荷的阳离子聚合物，再涂覆肝素，使阳离子聚合物与肝素通过离子键结合，形成一层肝素与阳离子聚合物涂层，由于是离子键结合，在亲水蛋白结合和血流冲洗下，肝素涂层不能长时间保存。共价键结合的方式是指利用肝素分子上存在大量的羧基和羟基官能团，先将连接管管材内表面活化使其表面官能化，再与肝素反应，形成共价键，由于肝素分子官能团较多，与管材内材料表面结合过于牢固，容易导致肝素分子的构象发生改变，肝素分子失去抗凝效果。
总体而言，现有的抗凝涂层管路有以下缺点，首先管路性能并无法做到对管道内流动血液的强效抗凝，临床应用过程中常见使用后管道内壁上附有血栓的现象，且在应用此类管道时仍需辅以大量抗凝药物的使用，但是大量肝素的使用，会造成患者多器官功能受损，增加了患者的身体负担；其次，此类管路往往跟随其他耗材一并进口，价格上较为昂贵。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种抗凝血涂层的制备方法，该法利用多巴胺自聚合形成的聚多巴胺独有的理化属性，将多巴胺聚合在管道内部形成一层聚多巴胺涂层，通过共价结合的方式将白蛋白和阿加曲班结合在聚多巴胺层上，并且管道内壁还贴附有牛血清白蛋白BSA，形成一层稳固的且具有很好透明度的具有抗凝属性的涂层。
同时，本发明提供一种抗凝血涂层，自制涂层管路ACT（激活全血凝固时间）平均值为265.6秒，肝素管路ACT平均值为117.3秒，延长了约117.3%。自制涂层管路CT（凝血时间）平均值25.1min，肝素管路CT平均值16.7min，延长了约50.3%。TXB-2分泌量减少31.4%，说明本发明的涂层抗凝效果显著。
同时，本发明提供一种包含本发明的抗凝血涂层的管道。
同时，本发明提供一种管道在体外血循环设备中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种抗凝血涂层的制备方法，包括以下步骤：
S01，配制10-20µM的Tris缓冲液100mL，即稀释缓冲液一，盐酸调定稀释缓冲液一至pH5.5-6.5，获得酸性缓冲液；
S02，称量100-400mg多巴胺加入至酸性缓冲液中，摇匀，获得浓度为1-4mg/mL的多巴胺溶液；
S03，在多巴胺溶液中放入清洗好的PVC管，紫外线光照，同时35-40℃恒温摇床以100-150r/min振摇6-12小时，紫外线强度为70-90µW/cm2；振摇完成后，取出PVC管，超纯水清洗至少30min，35-49℃烘干至少1小时；
S04，配制10-20µM的Tris缓冲液100mL，即稀释缓冲液二；
S05，称量10-200mg白蛋白加入至稀释缓冲液二中，摇匀，获得浓度为0.1-2mg/mL的白蛋白溶液；
S06，称量10-50mg阿加曲班加入至5-10mL无水乙醇中，混匀后加入至白蛋白溶液中，摇匀；
S07，充分混匀后，加入S03制备好的PVC管，在35-40℃恒温摇床以100-150r/min摇匀8-12h，然后取出使用超纯水清洗至少30min，35-40℃烘干至少1小时。
白蛋白为牛血清白蛋白BSA。
本发明的制备方法获得的抗凝血涂层。
抗凝血涂层的平均透光率为82.60~89.74%。
抗凝血涂层包括聚合在管道内部的聚多巴胺涂层以及通过共价结合的方式结合在聚多巴胺层上的白蛋白和阿加曲班；还包括贴附到管道内部的白蛋白。
包含本发明的抗凝血涂层的管道。
管道包括人工肾、ECMO血液体外循环时所用管道。
本发明的管道在体外血循环设备中的应用。
体外血循环设备包括CRRT、ECMO或人造血管。
在相比与现有技术，本发明具有以下优点：
本发明在现有抗凝血管路的基础上，进一步提升管道抗凝血的能力，做到管路成本可控。
本发明利用多巴胺自聚合形成的聚多巴胺独有的理化属性，将多巴胺聚合在管道内部形成一层聚多巴胺涂层，通过共价结合的方式将白蛋白和阿加曲班结合在聚多巴胺层上，并且管道内壁还贴附有牛血清白蛋白BSA，形成一层稳固的且具有很好透明度的具有抗凝属性的涂层。
附图说明
图1为普通PVC管路与自制涂层管路FTIR对比图；
图2为普通PVC管路与自制涂层管路电镜对比图；
图3为肝素涂层管路与自制涂层管路的凝血时间及TXB-2对比图；
图4为肝素涂层管路与自制涂层管路的体外循环后血栓生成量对比图；
图5为自制管路涂层稳定性测试图；
图6为对比例1和实施例1的涂层管路的对比图；
图7为对比例1和实施例1的涂层管路的透光率对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
一种抗凝血涂层的制备方法，包括以下步骤：
S01，取666µL、1.5M的Tris缓冲液，采用超纯水配制10µM的Tris缓冲液100mL（pH8.76，未调定），即稀释缓冲液一，盐酸调定稀释缓冲液一至pH6.0，获得酸性缓冲液；
S02，称量200mg多巴胺加入至酸性缓冲液中，摇匀，获得浓度为2mg/mL的多巴胺溶液；
S03，在多巴胺溶液中放入清洗好的10cm PVC管（PVC管清洗方法为：将PVC管放入无水乙醇溶液中，完全没入，超声波震荡10min。取出后用超纯水冲洗30min，随后放入37℃烘箱中烘干1h），紫外线光照，同时37℃恒温摇床以100r/min振摇6小时，紫外线强度为80µW/cm2；振摇完成后，取出PVC管，超纯水清洗30min，37℃烘干1小时；
S04，取666µL、1.5M的Tris缓冲液，采用超纯水配制10µM的Tris缓冲液100mL（pH8.76，未调定），即稀释缓冲液二；
S05，称量10mg牛血清白蛋白加入至稀释缓冲液二中，摇匀，获得浓度为0.1mg/mL的白蛋白溶液；
S06，称量10mg阿加曲班加入至5mL无水乙醇中，混匀后加入至白蛋白溶液中，摇匀；
S07，充分混匀后，加入S03制备好的PVC管，在37℃恒温摇床以100r/min摇匀12h，然后取出使用超纯水清洗30min，37℃烘干1小时。
本实施例的制备方法获得的抗凝血涂层。
抗凝血涂层的平均透光率为87.61%。
抗凝血涂层包括聚合在管道内部的聚多巴胺涂层以及通过共价结合的方式结合在聚多巴胺层上的白蛋白和阿加曲班；还包括贴附到管道内部的白蛋白。
包含本实施例的抗凝血涂层的管道。
管道包括人工肾、ECMO血液体外循环时所用管道。
本实施例的管道在体外血循环设备中的应用。
体外血循环设备包括CRRT、ECMO或人造血管。
本实施例获得的抗凝血涂层，又称自制涂层的验证方法如下：
自制涂层经FTIR、SEM检测证实制备成功
1、FTIR
如图1所示，与普通PVC表面的光谱相比，在1630cm-1处的小峰，则是归因于聚多巴胺PDA中芳环的C-C震动，而在1570cm-1处的峰则是PDA中仲胺的N-H弯曲振动，这两个峰的存在表明PDA的成功固定。
牛血清白蛋白BSA的吸收峰则是在1539cm-1处，其具体基团是BSA蛋白中的肽的-NH-基团。这个基团则是证明了BSA的成功固定。
由于阿加曲班的大部分仲胺和叔胺的存在，使得在3300cm-1处出现一平缓的宽峰，也表明阿加曲班的成功固定。
2、SEM电镜检测
如图2所示，电镜扫描下，普通PVC管路表面及自制涂层管路表面对比，可明显观察到自制管路表面有涂层覆盖。
性能结果：
1、凝血时间及机制：
如图3所示，自制的涂层管路，在凝血性能上完全达到国际现售的商用Bioline肝素涂层抗凝管道的标准，甚至在ACT（激活全血凝固时间）、CT（凝血时间）等指标上大幅领先于Bioline肝素涂层管路。此外，我们检测TXB-2以探究自制涂层凝血时间较现有的商用肝素涂层长的机制。经过三次重复实验，自制涂层管路ACT平均值为265.6秒，肝素管路ACT平均值为117.3秒，延长了约117.3%。自制管路CT平均值25.1min，肝素管路CT平均值16.7min，延长了约50.3%。TXB-2分泌量减少31.4%（TXB-2分泌量增加，意味着活化的血小板数量多，得出管路抗凝效果差的结论），进一步在凝血机制上证实自制抗凝涂层的抗凝效果。
2、体外循环测试：
为了进一步验证自制涂层的抗凝效果，我们采用磁悬浮离心泵系统构建体外循环回路进行与肝素涂层的对比测试。
系统搭建：
实验组：磁悬浮心室辅助系统+500mL羊血+自制涂层循环管路；
对照组：磁悬浮心室辅助系统+500mL羊血+肝素涂层循环管路；
循环方案：两组管路注入新鲜抗凝羊血各500mL（肝素抗凝，剂量0.25 U/mL），磁悬浮心室辅助系统以2500r/min速率循环血液12h，观察循环后血栓形成量。
实验结果：如图4所示，结果显示，肝素组体外循环管路血栓生成量明显多于自制涂层管路。（左：自制管路；右：肝素管路）。
3、自制管路涂层稳定性测试
如图5所示，为了检测自制管路涂层的稳定性，我们以循环12h后的肝素管路和自制管路为实验组，以空白PVC管路为对照组，行凝血时间测试。结果显示，肝素管路凝血时间较空白PVC管路延长1.42倍，自制涂层管路较空白PVC管路延长2.25倍，间接证明本实施例的涂层依旧存在且效果优于肝素涂层，稳定性良好。
实施例2
本实施例与实施例1的区别仅在于：
一种抗凝血涂层的制备方法，包括以下步骤：
S01，取666µL、1.5M的Tris缓冲液，采用超纯水配制10µM的Tris缓冲液100mL（pH8.76，未调定），即稀释缓冲液一，盐酸调定稀释缓冲液一至pH5.5，获得酸性缓冲液；
S02，称量100mg多巴胺加入至酸性缓冲液中，摇匀，获得浓度为1mg/mL的多巴胺溶液；
S03，在多巴胺溶液中放入清洗好的10cm PVC管，紫外线光照，同时35℃恒温摇床以150r/min振摇12小时，紫外线强度为70µW/cm2；振摇完成后，取出PVC管，超纯水清洗60min，35℃烘干2小时；
S04，取666µL、1.5M的Tris缓冲液，采用超纯水配制10µM的Tris缓冲液100mL（pH8.76，未调定），即稀释缓冲液二；
S05，称量200mg牛血清白蛋白加入至稀释缓冲液二中，摇匀，获得浓度为2mg/mL的白蛋白溶液；
S06，称量50mg阿加曲班加入至10mL无水乙醇中，混匀后加入至白蛋白溶液中，摇匀；
S07，充分混匀后，加入S03制备好的PVC管，在35℃恒温摇床以150r/min摇匀8h，然后取出使用超纯水清洗45min，35℃烘干1.5小时。
抗凝血涂层的平均透光率为89.74%。
实施例3
本实施例与实施例1的区别仅在于：
一种抗凝血涂层的制备方法，包括以下步骤：
S01，取1332µL、1.5M的Tris缓冲液，采用超纯水配制20µM的Tris缓冲液100mL，即稀释缓冲液一，盐酸调定稀释缓冲液一至pH6.5，获得酸性缓冲液；
S02，称量400mg多巴胺加入至酸性缓冲液中，摇匀，获得浓度为4mg/mL的多巴胺溶液；
S03，在多巴胺溶液中放入清洗好的10cm PVC管，紫外线光照，同时40℃恒温摇床以120r/min振摇8小时，紫外线强度为90µW/cm2；振摇完成后，取出PVC管，超纯水清洗45min，49℃烘干1.5小时；
S04，取1332µL、1.5M的Tris缓冲液，采用超纯水配制10uM的Tris缓冲液100mL，即稀释缓冲液二；
S05，称量100mg牛血清白蛋白加入至稀释缓冲液二中，摇匀，获得浓度为1mg/mL的白蛋白溶液；
S06，称量25mg阿加曲班加入至8mL无水乙醇中，混匀后加入至白蛋白溶液中，摇匀；
S07，充分混匀后，加入S03制备好的PVC管，在40℃恒温摇床以120r/min摇匀10h，然后取出使用超纯水清洗60min，40℃烘干2小时。
抗凝血涂层的平均透光率为82.60%。
对比例1
聚多巴胺层-阿加曲班-谷胱甘肽涂层与本发明涂层的对比研究。
参考现有技术“201810994725.5，一种具有抗凝性能的血液净化膜及其制备方法”中涂层的制备方法，制作1根10 cm长的PVC管。
具体步骤如下：
1.将准备好的管道浸没在多巴胺溶液里，制备多巴胺涂层；其中多巴胺溶液中，多巴胺溶液浓度为2mg/mL，pH为8.5。多巴胺溶液溶于Tris缓冲液中得到；
2.将表面附着聚多巴胺层的管道浸没在阿加曲班溶液中进行反应；其中阿加曲班溶液浓度1mg/mL，pH为8.5。阿加曲班溶液是将阿加曲班溶于乙醇，再与PBS缓冲液混合制成。
3.将接枝阿加曲班的管道浸没在谷胱甘肽溶液中，得到接枝阿加曲班和谷胱甘肽的PVC管；谷胱甘肽溶液浓度为10mg/mL，pH为8.5。谷胱甘肽溶液是将谷胱甘肽溶解在无氧Tris缓冲液中得到。
与之对比的本发明的管路制备过程如实施例1。
透光率对比：如图6所示，左图为对比例1获得的谷胱甘肽涂层管路，右图为实施例1获得的白蛋白-阿加曲班涂层管路。
透光率是采用UV-Vis紫外-可见分光光度法测量的两种方案制备的管路在可见光390-780nm波段时的透光率。如图7所示，本发明采用的BSA方法与对比例1的谷胱甘肽方法对比，其平均透光率为87.61%，远高于对比例1的69.34%。
在现有技术“201810994725.5，一种具有抗凝性能的血液净化膜及其制备方法”中，其应用场景是在血液净化膜上，对于透光率并无要求。而在本发明的应用场景中，体外循环管路在使用时需要观察内部血液流动情况，血液形状变化，需要制备出有更好的透光率的管路。
本发明能使涂层颜色变浅，考虑是BSA自身特性所致。BSA本身具有贴附到基材表面的性质，在本发明的制备条件中，酸性条件下制备的PDA涂层，可使聚多巴胺的厚度更可控。其次，浸泡在BSA溶液后，存在部分BSA并非接枝在PDA上，而是粘附在管道内表面，相对减少了基材表面PDA的比例，最终提高了整体基材透光率。
应当理解，为了精简本公开并帮助理解各个发明方面中的一个或多个，在上面对本发明的示例性实施例的描述中，本发明的各个特征有时被一起分组到单个实施例、图、或者对其的描述中。然而，并不应将该公开的方法解释成反映如下意图：即所要求保护的本发明要求比在每个权利要求中所明确记载的特征更多特征。更确切地说，如权利要求书所反映的那样，发明方面在于少于前面公开的实施例的所有特征。因此，遵循具体实施方式的权利要求书由此明确地并入该具体实施方式，其中每个权利要求本身都作为本发明的单独实施例。
尽管根据有限数量的实施例描述了本发明，但是受益于上面的描述，本技术领域内的技术人员明白，在由此描述的本发明的范围内，可以设想其它实施例。此外，应当注意，本说明书中使用的语言主要是为了可读性和教导的目的而选择的，而不是为了解释或者限定本发明的主题而选择的。因此，在不偏离所附权利要求书的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。对于本发明的范围，对本发明所做的公开是说明性的，而非限制性的，本发明的范围由所附权利要求书限定。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种抗凝血涂层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S01，配制10-20µM的Tris缓冲液100mL，即稀释缓冲液一，盐酸调定稀释缓冲液一至pH5.5-6.5，获得酸性缓冲液；
S02，称量100-400mg多巴胺加入至酸性缓冲液中，摇匀，获得浓度为1-4mg/mL的多巴胺溶液；
S03，在多巴胺溶液中放入清洗好的PVC管，紫外线光照，同时35-40℃恒温摇床以100-150r/min振摇6-12小时，紫外线强度为70-90µW/cm2；振摇完成后，取出PVC管，超纯水清洗至少30min，35-49℃烘干至少1小时；
S04，配制10-20µM的Tris缓冲液100mL，即稀释缓冲液二；
S05，称量10-200mg白蛋白加入至稀释缓冲液二中，摇匀，获得浓度为0.1-2mg/mL的白蛋白溶液；
S06，称量10-50mg阿加曲班加入至5-10mL无水乙醇中，混匀后加入至白蛋白溶液中，摇匀；
S07，充分混匀后，加入S03制备好的PVC管，在35-40℃恒温摇床以100-150r/min摇匀8-12h，然后取出使用超纯水清洗至少30min，35-40℃烘干至少1小时；
白蛋白为牛血清白蛋白BSA。
2.根据权利要求1所述的制备方法获得的抗凝血涂层。
3.根据权利要求2所述的抗凝血涂层，其特征在于，抗凝血涂层的平均透光率为82.60~89.74%。
4.根据权利要求2所述的抗凝血涂层，其特征在于，抗凝血涂层包括聚合在管道内部的聚多巴胺涂层以及通过共价结合的方式结合在聚多巴胺层上的白蛋白和阿加曲班；还包括贴附到管道内部的白蛋白。
5.包含权利要求2~4任意一项所述的抗凝血涂层的管道。
6.根据权利要求5所述的管道，其特征在于，管道包括人工肾、ECMO血液体外循环时所用管道。
7.根据权利要求5所述的管道在体外血循环设备中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，体外血循环设备包括CRRT、ECMO或人造血管。
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