CN116617263A - 一种治疗骨关节炎的组合物及负载该组合物的微针贴片 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种治疗骨关节炎的组合物，所述组合物包括以下组分：(a)间充质干细胞来源的外泌体；(b)药学上可用的载体，还提供了一种负载该组合物的微针贴片；所述微针贴片包含一体成型的背衬层和微针，所述背衬层由基质材料构成，所述微针由基质材料和所述治疗骨关节炎的组合物的混合物构成；通过优化外泌体和载体的种类及含量，基质材料的总类和含量，本申请的组合物具有优异的抗炎和修复功效，所制备的微针可实现短期快速高效治疗和长期缓释治疗，所述组合物和微针的制备方法简单，材料生物相容性好，可用于实际生产使用。

Description

一种治疗骨关节炎的组合物及负载该组合物的微针贴片
技术领域
本发明涉及药物及药物制造技术领域，A61M37/00，尤其涉及一种治疗骨关节炎的组合物及负载该组合物的微针贴片。
背景技术
骨关节炎是一种在机体衰老过程中所产生的关节软骨的退化和机械应力所导致的关节破坏、软骨增生的疾病，是老年人中最常见的骨骼疾病。现有研究已经指出了骨关节炎可能的发病机理：1、软骨基本机能减弱，胶原结构改变且修复能力受限；2、软骨细胞中基质金属蛋白酶生产量过高，引起软骨变性；3、由于应激、细胞因子等作用下导致的软骨细胞死亡。目前，自体软骨细胞移植是治疗该疾病的有效方法，但是手术治疗存在难以大规模治疗骨损的缺陷，而大多数药物只能缓解骨关节炎所致的疼痛，无法从病理病因上治愈骨关节炎，且这些药物在病理环境中的驻留效果不够，药效成分也易被迫坏而失效。
中国专利CN102256996A公开了一种使用甲状旁腺素或由甲状旁腺素衍生的物质来治疗早期骨关节炎的方法，通过抑制或逆转早期骨关节炎的软骨细胞的退化进程以治疗骨关节炎，但是该方法对早期骨关节炎才能表现出较好的治疗效果。中国专利CN104706675A公开了一种治疗骨关节炎的组合物，该组合物采用支架材料与脂肪干细胞组分互相组合，延长组合物在病变部位存留的时间，增强治疗效果，但是其短期治疗效果和长效缓释作用仍然有待提高。
因此，非常有必要制备出一种从根源上治疗骨关节炎、短期治疗和长效治疗效果均优异的组合物，并将该组合物应用于便捷的治疗工具中使用。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种治疗骨关节炎的组合物，所述组合物包括以下组分：
(a)间充质干细胞来源的外泌体；
(b)药学上可用的载体。
进一步地，所述间充质干细胞来自于骨髓、脐带血、脐带组织、胎盘组织、脂肪组织、皮肤组织、血液中的任意一种或几种的组合。
在一种优选的实施方式中，所述间充质干细胞来自于骨髓。
进一步地，所述间充质干细胞来源的外泌体的制备方法包括密度梯度离心法、聚合沉淀法、超滤法、磁珠免疫捕获法、凝胶色谱法中的至少一种。
在一种实施方式中，所述间充质干细胞来源的外泌体的制备方法包括密度梯度离心法。
进一步地，所述间充质干细胞来源的外泌体的制备方法为：
S1、培养间充质干细胞后收集培养基；
S2、对培养基离心：先200-600g离心7-15min，再于1500-2500g离心7-15min，后于8000-13000g离心25-40min，收集上清液；
S3、使用滤膜对上清液过滤，再于90000-120000g下离心1-4h，收集沉淀即获得外泌体。
优选地，所述S2为：对培养基离心：先250-450g离心8-12min，再于1800-2200g离心8-12min，后于9000-11000g离心25-35min，收集上清液。
优选地，所述S3中滤膜孔径为0.2-0.25μm，于90000-110000g下离心1.5-3h。
进一步地，所述药学上可用的载体选自生物可降解高分子材料、脂质体、蛋白质中的至少一种。
进一步地，所述生物可降解高分子材料包括纤维素、葡聚糖、聚丙交酯、聚乙交酯、聚乙交酯-丙交酯共聚物、聚原酸酯、聚己内酯、聚乳酸、聚羟基脂肪酸酯、聚乙醇酸、多元醇聚酯、聚多巴胺中的至少一种。
进一步地，所述蛋白质包括胶原、明胶、白蛋白、纤维蛋白原中的至少一种。
优选地，所述生物可降解高分子材料包括葡聚糖、聚乙交酯-丙交酯共聚物、聚乳酸、聚羟基脂肪酸酯、聚多巴胺中的至少一种。
进一步地，所述载体具有抗炎、抗氧化功效。
在一种优选的实施方式中，所述载体为生物可降解高分子材料，包括聚多巴胺。
间充质干细胞外泌体携带多种治疗活性蛋白与核酸，能够增强修复能力并促进成骨，但是其在病理环境中的驻留效果和持效性不强，不仅容易流失，还容易被快速清除；聚多巴胺具有良好的抗氧化功能，能够在关节炎病灶局部起到抗炎的作用，从而改善局部氧化应激压力；本申请通过共挤压物理作用将外泌体负载在聚多巴胺载体上制备间充质干细胞外泌体包裹的聚多巴胺，两者不仅存在功能上的互补作用，还提供了结构上的互补效果：首先，聚多巴胺为外泌体提供黏附作用，利用聚多巴胺在有氧及碱性条件下的自发交联反应实现外泌体的稳定性，提高了组合物对外泌体的缓释效果；其次，外泌体为多巴胺提供了必需的生物界面，有利于抗炎成分向组织内的扩散。两者共同存在时组合物的治疗效果更加突出，进一步控制两者的相对质量，同时保证组合物的快速治疗效果和使用时间内的缓释效果。
进一步地，所述组合物为间充质干细胞来源的外泌体包裹的载体。
在一种优选的实施方式中，所述组合物为间充质干细胞来源的外泌体包裹的聚多巴胺，间充质干细胞来源的外泌体与聚多巴胺的质量比为(1-4)：1。
进一步优选地，所述组合物中，间充质干细胞来源的外泌体与聚多巴胺的质量比为(1.5-2.5)：1；更优选为2：1。
进一步地，所述聚多巴胺的制备方法为：将3-羟酪胺盐酸盐与碱溶液在室温下混合搅拌反应3-10h，之后对液体离心，收集沉淀，即为聚多巴胺。
进一步地，所述3-羟酪胺盐酸盐与碱溶液中OH-的摩尔比为(0.005-0.4)：1，优选为(0.008-0.05)：1，更优选为(0.01-0.02)：1。
进一步地，所述碱溶液包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁、氢氧化钙、氢氧化铁中的任意一种或几种的组合；本发明对比不做严格限定，保持3-羟酪胺盐酸盐与碱溶液中OH-的摩尔比在规定范围内即可。
进一步地，所述组合物的制备方法为：
(1)将间充质干细胞来源的外泌体溶于PBS中，制备成外泌体溶液；将载体溶于溶剂中，配置成载体溶液；
(2)将外泌体溶液和载体溶液分别装入脂质体挤出器的两端气密注射器内，通过反复共挤出使两者结合并得到组合物。
进一步地，所述外泌体溶液和载体溶液中，外泌体和载体的质量比为(1-4)：1。
在一种实施方式中，步骤(1)中外泌体溶液的质量浓度为0.6-2mg/mL，载体溶液的质量浓度为0.6-2.5mg/mL，步骤(2)中外泌体溶液和载体溶液的体积比为(1-5)：1。
在一种优选的实施方式中，步骤(1)中外泌体溶液的质量浓度为0.8-1.5mg/mL，载体溶液的质量浓度为0.8-1.5mg/mL，步骤(2)中外泌体溶液和载体溶液的体积比为(1-3)：1。
进一步地，步骤(2)中，所述脂质体挤出器中间设置有聚碳酸酯膜，孔径为0.1-0.3μm。
其次，本申请还提供了一种负载该组合物的微针贴片；所述微针贴片包含一体成型的背衬层和微针。
进一步地，所述背衬层由基质材料构成，所述微针由基质材料和所述治疗骨关节炎的组合物的混合物构成。
进一步地，所述基质材料包括：透明质酸钠、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、纤维素、环糊精、羟丙基β-环糊精、聚氧乙烯脂肪酸酯、果胶中的至少一种。
优选地，所述基质材料包括透明质酸钠和羟丙基β-环糊精，两者质量比为(0.5-6)：1。
优选地，所述基质材料包括透明质酸钠和羟丙基β-环糊精，两者质量比为(1-3)：1。
透明质酸钠和羟丙基β环糊精材料无毒并具有良好的生物相容性，通过限定透明质酸钠的平均分子量和其与羟丙基β环糊精的用量以控制基质材料的交联程度，使其作为微针使用时能够具有较高的力学强度和特殊的溶解性能，提高组合物的经皮传递效率和短期药物释放及治疗效果；若只采用透明质酸钠，所制备微针的硬度低，不满足骨关节处的透皮刺入条件，且微针容易吸潮，不便存放，羟丙基β环糊精的加入可改善以上问题，但是使用量过多时，则又导致微针透皮刺入部分溶解较慢，虽然缓释效果较好，但是微针的短期(24h)治疗效果则不理想。
进一步地，所述透明质酸钠选自低分子量透明质酸钠、中分子量透明质酸钠和高分子量透明质酸钠中的至少两种，所述低分子量透明质酸钠平均分子量为0.5-20万，中分子量透明质酸钠平均分子量为16-70万，高分子量透明质酸钠平均分子量为75-200万。
优选地，按透明质酸钠总量计，所述透明质酸钠包括80-95wt％的低分子量透明质酸钠和5-20wt％的高分子量透明质酸钠；所述低分子量透明质酸钠平均分子量为1-10万，所述高分子量透明质酸钠平均分子量为80-100万。
优选地，所述微针中，基质材料占组合物和基质材料总质量的10-25％，优选13-20％。
进一步地，所述微针贴片的制备方法包括以下步骤：
(1)按照比例配置基质材料；
(2)按照相应的质量分数将基质材料和组合物混合，并对混合液除气泡；
(3)将混合液浇铸于模具上，抽真空，混合液填充模具腔体并形成针体后，再向模具上补充添加基质材料形成背衬，之后置于干燥器内干燥成型。
进一步地，所述步骤(3)中采用的模具为PDMS模具，抽真空次数为2-5次，每次抽真空的时间为2-4min。
进一步地，所述微针的针尖长度为200-1500μm。
进一步地，每片微针贴片至少包括25个负载所述组合物的微针。
有益效果
1、本申请利用间充质干细胞来源的外泌体和生物相容性优异并具有抗氧抗炎的载体制备出治疗骨关节炎的组合物，该组合物的成分达到了功效上相互促进、结构上相互稳定的作用，可同时实现病理环境的抗炎和修复，从根源上改善并治疗病理环境，有效延长组合物在病理环境中的驻留和持效能力；
2、本申请以微针形式对组合物成型并给药，实现组合物局部驻留、定点缓释给药效果的同时，还提升了药物向更深组织的渗透表现，使药物更快达到病灶部位并实现持久治疗；
3、本申请通过优化组合物的成分和相对含量，并进一步优化微针中基质材料的组分和相对含量，同时实现组合物给药后的短时(约24h)最佳治疗效果和长期持效性；
4、本申请的组合物和微针贴片组分生物相容性好、无毒性，药效持续性好，组合物制作方法简单，微针贴片使用便捷。
附图说明
图1：实施例1微针不同角度的SEM图片；其中左图和中图比例尺寸为200μm、右图比例尺寸为1mm。
图2：实施例1的骨髓来源间充质干细胞外泌体、PDA颗粒和组合物的TEM图片(依次从左到右)。
图3：不同组合物的体外抗炎效果对比图。
图4：不同微针治疗后的大鼠体内抗骨关节炎效果对比图(上方为大鼠胫骨平台的三维重建、矢状面和冠状面的micro CT图像，下方从左到右依次为不同治疗组中的大鼠TbBV/TV、Tb.SP和Tb.PF值)。图5：不同微针治疗后的大鼠体内骨关节炎病理对比图。
图6：不同深度的皮肤组织图像(左图为未插入微针的皮肤，中图和右图分别为插入含有荧光染料的实施例1微针贴片的皮肤)。
图7：实施例1的微针贴片显微镜下形貌图(左图放大倍数为3*10右图放大倍数为是4*10)。
图8：实施例1微针贴片的实物形貌图(FITC对预混材料进行荧光标记)。
具体实施方式
实施例
实施例1
本实施例提供了一种治疗骨关节炎的组合物，所述组合物包括以下组分：
(a)骨髓间充质干细胞来源的外泌体(简写为EXO)；
(b)药学上可用的载体—聚多巴胺(简写为PDA)；
所述组合物具体为骨髓间充质干细胞来源的外泌体包裹的聚多巴胺(简写为：PDA@EXO)，制备方法为：
(1)EXO的制备：S1、培养骨髓间充质干细胞至80％汇合度后收集培养基；S2、对培养基离心：先300g离心10min，再于2000g离心10min，后于10000g离心30min，收集上清液；S3、使用0.22μm规格的滤膜对上清液过滤，再于100000g下离心2h，收集沉淀即获得外泌体；
(2)PDA的制备：按照0.01：1的摩尔比将3-羟酪胺盐酸盐(10mM)与氢氧化钠溶液(1M)在室温下混合搅拌反应5h，之后对液体10000rpm离心20min，收集沉淀，即可；
(3)PDA@EXO的制备：将EXO重悬于无菌PBS中，制备成1mg/mL的EXO溶液；将PDA用超纯水混悬，配置成1mg/mL的PDA溶液；将EXO溶液和PDA溶液按照2：1的体积比分别装入脂质体挤出器的两端气密注射器内，中间设置孔径为0.2μm的聚碳酸酯膜，通过脂质体挤出器反复共挤出使两者结合并得到组合物PDA@EXO。
本实施例还提供了一种负载该组合物的微针贴片；所述微针贴片包含一体成型的背衬层和微针，所述背衬层由基质材料构成，所述微针由基质材料和所述治疗骨关节炎的组合物的混合物构成；微针中基质材料占组合物和基质材料总质量的15.99％；
所述基质材料为透明质酸钠和羟丙基β-环糊精，两者质量比为2：1；所述透明质酸钠由87.5wt％的平均分子量为6万的透明质酸钠和12.5wt％的平均分子量为90万的透明质酸钠构成；
所述微针贴片的制备方法包括以下步骤：
(1)按比例将两种分子量的透明质酸钠和羟丙基β-环糊精混合均匀获得基质材料；
(2)按照相应的质量分数将基质材料和10mL组合物超声混合均匀，并采用超声对混合液除气泡；
(3)将混合液浇铸于PDMS模具上，抽真空3次，每次3min，混合液填充模具腔体并形成针体后，再向模具上补充添加基质材料形成背衬，之后置于干燥器内于25℃下干燥24h成型。
所述微针贴片(1cm*1cm方形片状)由49根微针组成，所述微针高度为1000±10μm，基宽为900±10μm，相邻微针的中心空间间距为573±5μm，微针的针尖长度为800μm。
图7为实施例1所制备微针贴片的显微形貌图，可以看出，在微针的针尖部分聚集了由聚多巴胺和骨髓来源间充质干细胞工程化结合成的纳米颗粒，显示为淡黑色。可观察到规律的阵列结构，针尖形貌，以及针尖药物的负载。
图8为实施例1微针贴片的实物形貌图，利用FITC对预混材料进行荧光标记，因此整体呈现黄绿色，便于观察。可观察到整齐的阵列结构，约1cm*1cm方形贴片状。
实施例2
本实施例提供了一种治疗骨关节炎的组合物，所述组合物包括以下组分：
(a)骨髓间充质干细胞来源的外泌体(简写为EXO)；
(b)药学上可用的载体—聚多巴胺(简写为PDA)；
所述组合物具体为骨髓间充质干细胞来源的外泌体包裹的聚多巴胺(简写为：PDA@EXO)，制备方法为：
(1)EXO的制备：S1、培养骨髓间充质干细胞至汇合度为80％后收集培养基；S2、对培养基离心：先250g离心12min，再于2200g离心8min，后于9000g离心35min，收集上清液；S3、使用0.22μm规格的滤膜对上清液过滤，再于90000g下离心3h，收集沉淀即获得外泌体；
(2)PDA的制备：按照0.05：1的摩尔比将3-羟酪胺盐酸盐(50mM)与氢氧化钠溶液(1M)在室温下混合搅拌反应10h，之后对液体10000rpm离心30min，收集沉淀，即可；
(3)PDA@EXO的制备：将EXO重悬于无菌PBS中，制备成1.5mg/mL的EXO溶液；将PDA用超纯水混悬，配置成1.5mg/mL的PDA溶液；将EXO溶液和PDA溶液按照1.5：1的体积比分别装入脂质体挤出器的两端气密注射器内，中间设置孔径为0.2μm的聚碳酸酯膜，通过脂质体挤出器反复共挤出使两者结合并得到组合物PDA@EXO。
本实施例还提供了一种负载该组合物的微针贴片；所述微针贴片包含一体成型的背衬层和微针，所述背衬层由基质材料构成，所述微针由基质材料和所述治疗骨关节炎的组合物的混合物构成；微针中基质材料占组合物和基质材料总质量的20％；
所述基质材料为透明质酸钠和羟丙基β-环糊精，两者质量比为2.5：1；所述透明质酸钠由95wt％的平均分子量为10万的透明质酸钠和5wt％的平均分子量为80万的透明质酸钠构成；
所述微针贴片的制备方法包括以下步骤：
(1)按比例将两种分子量的透明质酸钠和羟丙基β-环糊精混合均匀获得基质材料；
(2)按照相应的质量分数将基质材料和10mL组合物超声混合均匀，并采用超声对混合液除气泡；
(3)将混合液浇铸于PDMS模具上，抽真空3次，每次3min，混合液填充模具腔体并形成针体后，再向其中补充添加基质材料形成背衬，之后置于干燥器内于25℃下干燥24h成型。
所述微针贴片(1cm*1cm方形片状)由49根微针组成，所述微针高度为1500μm±10μm，基宽为1300μm±10μm，相邻微针的中心空间间距为580μm±5μm，微针的针尖长度为900μm。
实施例3
本实施例提供了一种治疗骨关节炎的组合物，所述组合物包括以下组分：
(a)骨髓间充质干细胞来源的外泌体(简写为EXO)；
(b)药学上可用的载体—聚多巴胺(简写为PDA)；
所述组合物具体为骨髓间充质干细胞来源的外泌体包裹的聚多巴胺(简写为：PDA@EXO)，制备方法为：
(1)EXO的制备：S1、培养骨髓间充质干细胞至汇合度为80％后收集培养基；S2、对培养基离心：先450g离心8min，再于2200g离心12min，后于11000g离心25min，收集上清液；S3、使用0.22μm规格的滤膜对上清液过滤，再于110000g下离心1.5h，收集沉淀即获得外泌体；
(2)PDA的制备：按照0.008：1的摩尔比将3-羟酪胺盐酸盐(8mM)与氢氧化钠溶液(1M)在室温下混合搅拌反应3h，之后对液体离心，收集沉淀，即可；
(3)PDA@EXO的制备：将EXO重悬于无菌PBS中，制备成0.8mg/mL的EXO溶液；将PDA用超纯水混悬，配置成0.8mg/mL的PDA溶液；将EXO溶液和PDA溶液按照2.5：1的体积比分别装入脂质体挤出器的两端气密注射器内，中间设置孔径为0.2μm的聚碳酸酯膜，通过脂质体挤出器反复共挤出使两者结合并得到组合物PDA@EXO。
本实施例还提供了一种负载该组合物的微针贴片；所述微针贴片包含一体成型的背衬层和微针，所述背衬层由基质材料构成，所述微针由基质材料和所述治疗骨关节炎的组合物的混合物构成；微针中基质材料占组合物和基质材料总质量的13％；
所述基质材料为透明质酸钠和羟丙基β-环糊精，两者质量比为1：1；所述透明质酸钠由80wt％的平均分子量为3万的透明质酸钠和20wt％的平均分子量为100万的透明质酸钠构成；
所述微针贴片的制备方法包括以下步骤：
(1)按比例将两种分子量的透明质酸钠和羟丙基β-环糊精混合均匀获得基质材料；
(2)按照相应的质量分数将基质材料和10mL组合物超声混合均匀，并采用超声对混合液除气泡；
(3)将混合液浇铸于PDMS模具上，抽真空5次，每次2min，混合液填充模具腔体并形成针体后，再向模具上补充添加基质材料形成背衬，之后置于干燥器内于25℃下干燥24h成型。
所述微针贴片(1cm*1cm方形片状)由49根微针组成，所述微针高度为1000±10μm，基宽为900±10μm，相邻微针的中心空间间距为573±5μm，微针的针尖长度为800μm。
实施例4
本实施例提供了一种治疗骨关节炎的组合物，所述组合物包括以下组分：
(a)骨髓间充质干细胞来源的外泌体(简写为EXO)；
(b)药学上可用的载体—聚多巴胺(简写为PDA)；
所述组合物具体为骨髓间充质干细胞来源的外泌体包裹的聚多巴胺(简写为：PDA@EXO)，制备方法为：
(1)EXO的制备：S1、培养骨髓间充质干细胞至汇合度为80％后收集培养基；S2、对培养基离心：先200g离心15min，再于1500g离心15min，后于13000g离心25min，收集上清液；S3、使用0.22μm规格的滤膜对上清液过滤，再于120000g下离心1h，收集沉淀即获得外泌体；
(2)PDA的制备：按照0.01：1的摩尔比将3-羟酪胺盐酸盐(10mM)与氢氧化钠溶液(1M)在室温下混合搅拌反应5h，之后对液体离心，收集沉淀，即可；
(3)PDA@EXO的制备：将EXO重悬于无菌PBS中，制备成2mg/mL的EXO溶液；将PDA用超纯水混悬，配置成2.5mg/mL的PDA溶液；将EXO溶液和PDA溶液按照5：1的体积比分别装入脂质体挤出器的两端气密注射器内，中间设置孔径为0.2μm的聚碳酸酯膜，通过脂质体挤出器反复共挤出使两者结合并得到组合物PDA@EXO。
本实施例还提供了一种负载该组合物的微针贴片；所述微针贴片包含一体成型的背衬层和微针，所述背衬层由基质材料构成，所述微针由基质材料和所述治疗骨关节炎的组合物的混合物构成；微针中基质材料占组合物和基质材料总质量的18％；
所述基质材料为透明质酸钠和羟丙基β-环糊精，两者质量比为2：1；所述透明质酸钠由87.5wt％的平均分子量为6万的透明质酸钠和12.5wt％的平均分子量为90万的透明质酸钠构成；
所述微针贴片的制备方法：同实施例1。
所述微针贴片规格：同实施例1。
实施例5
本实施例提供了一种治疗骨关节炎的组合物，所述组合物包括以下组分：
(a)骨髓间充质干细胞来源的外泌体(简写为EXO)；
(b)药学上可用的载体—聚多巴胺(简写为PDA)；
所述组合物具体为骨髓间充质干细胞来源的外泌体包裹的聚多巴胺(简写为：PDA@EXO)，制备方法为：
(1)EXO的制备：S1、培养骨髓间充质干细胞后收集培养基；S2、对培养基离心：先600g离心7min，再于2500g离心7min，后于8000g离心40min，收集上清液；S3、使用0.25μm规格的滤膜对上清液过滤，再于90000g下离心4h，收集沉淀即获得外泌体；
(2)PDA的制备：按照0.01：1的摩尔比将3-羟酪胺盐酸盐(10mM)与氢氧化钠溶液(1M)在室温下混合搅拌反应5h，之后对液体离心，收集沉淀，即可；
(3)PDA@EXO的制备：将EXO重悬于无菌PBS中，制备成0.6mg/mL的EXO溶液；将PDA用超纯水混悬，配置成2.5mg/mL的PDA溶液；将EXO溶液和PDA溶液按照4.17：1的体积比分别装入脂质体挤出器的两端气密注射器内，中间设置孔径为0.2μm的聚碳酸酯膜，通过脂质体挤出器反复共挤出使两者结合并得到组合物PDA@EXO。
本实施例还提供了一种负载该组合物的微针贴片：同实施例1；
所述微针贴片的制备方法：同实施例1；
所述微针贴片的规格：同实施例1。
对比例1
与实施例1基本一致，区别在于：将所述PDA@EXO替换为PDA。
对比例2
与实施例1基本一致，区别在于：将所述PDA@EXO替换为EXO。
对比例3
本对比例提供了一种负载该组合物的微针贴片；所述微针贴片包含背衬层和微针，两者通过浇铸成型并一体连接，所述背衬层和微针均由基质材料构成，基质材料组分同实施例1；
所述微针贴片的制备方法：将组合物替换为基质材料，其他同实施例1；
所述微针贴片的规格：同实施例1。
对比例4
与实施例1基本一致，区别在于：所述透明质酸钠由98wt％的平均分子量为6万的透明质酸钠和2wt％的平均分子量为90万的透明质酸钠构成。
对比例5
与实施例1基本一致，区别在于：所述基质材料为透明质酸钠和羟丙基β-环糊精，两者质量比为1：2.5。
对比例6
与实施例1基本一致，区别在于：在所述组合物制备方法的步骤(3)中，EXO溶液和PDA溶液的体积比为1：1.5。
以上实施例1-5所制备的微针针尖强度合适，可以有效穿过关节部位并起到优异的短期释放和长效缓释效果，而对比例4-5所制备的微针强度不足，透皮性能不佳，很难穿过关节部位，其治疗和缓释效果表现也更差；对比例6所制备的微针中，PDA未完全被外泌体有效包裹，微针的缓释性能相对实施例1-5较差。
性能测试方法：
说明：实施例1组合物的体外实验记为PDA@EXO组，实施例1微针的体内实验记为PDA@EXO+微针组；对比例1组合物的体外实验记为PDA组，对比例1微针的体内实验记为PDA+微针组；对比例2组合物的体外实验记为记为EXO组，对比例2微针的体外实验记为记为EXO+微针组；对比例3微针的体外实验记为空白微针组；对照组为正常细胞，阳性对照组为利用脂多糖LPS诱导的氧化损伤细胞模型。
1、SEM和TEM：SEM测试结果见图1，SEM结果显示微针实施例1的微针呈现出圆锥的形状，尺寸均匀，尖端锋利；TEM结果见图2，TEM结果显示PDA呈相对均匀的球形，与PDA相比，PDA@EXO表面出现呈黑色的厚膜，呈偏球形的不规则形态，粒径增大。表明间充质干细胞来源的外泌体有效包裹在聚多巴胺颗粒表面，经过醋酸铀负染后呈现黑色。
2、体外抗炎效果：通过检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平来评估治疗物质的细胞层面(体外，in vitro)抗氧化活性。采用微针对氧化损伤模型细胞治疗后的测试结果见图3，其中，DCF探针(ROS染料)可以与活性氧(ROS)结合，在共聚焦显微镜下呈绿色荧光，绿色荧光强度越大，其活性氧含量越多；蓝色为利用DAPI进行的细胞核染色。
总结：通过细胞共聚焦图片可以看出，在采用不同实施例和对比例所制备的组合物对氧化损伤模型细胞进行抗氧化治疗后，与阳性对照组相比，PDA(对比例1)、EXO(对比例2)和PDA@EXO组(实施例1)的ROS荧光水平明显下降，其中，PDA(对比例1)和EXO(对比例2)的荧光强度较高，说明活性氧含量相对较高，体外抗氧化活性相对较差，而PDA@EXO组(实施例1)的荧光水平几乎与对照组相当；证明PDA@EXO组合物(实施例1)具有良好的体外抗氧化活性，能够对氧化损伤的细胞产生修复作用，缓解局部氧化应激压力。
3、大鼠体内抗骨关节炎效果评估：通过在SD大鼠上进行前交叉韧带切断术(ACLT)来建立膝骨关节炎(OA)动物模型，评估不同实施例的微针对OA的治疗效果。具体为：选用体重在180-220g的Sprague-Dawley(SD)大鼠(购买并养殖于同济大学，实验方案已获得同济大学动物保护和使用委员会的批准)，在合适量的异氟醚麻醉下，对SD大鼠的右腿进行前交叉韧带暴露和切断，在假手术组(即对照组)中，暴露前交叉韧带但不切断；在手术后2周开始给予不同实施例所制备的微针贴片，每2天一次，为期2周；在ACLT手术后8周，对大鼠进行牺牲取材以进行进一步实验。
通过大鼠胫骨平台矢状面和冠状面的micro CT图像揭示了不同组中下关节骨形态的变化。Tb BV/TV指的是骨小梁体积与总体积之比，是评估骨小梁数量的指标，骨关节炎造模后进行治疗后，Tb BV/TV升高，意味着骨小梁数量增加或骨组织密度增加，表示骨质量的改善。Tb.SP指的是骨小梁间距，是评估骨小梁排列紧密程度的指标。Tb.PF是骨小梁形态因子，是评估骨小梁排列形态的指标，在骨关节炎中，骨小梁可能会出现非正常的断裂、稀疏或不规则排列等病理变化，导致Tb.PF的升高。抗骨关节炎效果见图4。
结果：(1)阳性对照组中，骨关节炎模型大鼠的下关节骨发生了严重的骨吸收，呈现稀疏的骨小梁；而PDA@EXO+微针组(实施例1)中下关节骨形态有所改善，几乎可以恢复至对照组正常大鼠水平；(2)骨关节炎造模并进行治疗后，PDA@EXO+微针组(实施例1)中，TbBV/TV升高至接近对照组，意味着骨小梁数量增加或骨组织密度增加，表示骨质量的改善；骨关节炎阳性对照组中Tb.SP明显升高，提示骨赘形成，而在PDA@EXO+微针组(实施例1)中，骨关节炎造模模型利用PDA@EXO微针治疗后，与其他组相比，Tb.SP有明显的降低，提示骨赘形成减少，该组中Tb.Pf降低，说明该组合物PDA@EXO的微针延缓了骨关节炎的进程。
综上所述，在大鼠骨关节炎模型中观察到了PDA@EXO微针的良好治疗效果，有效缓解骨关节炎进程，有助于恢复正常骨形态。
4、大鼠病理评估：分别通过苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色和番红固绿染色对不同组关节结构和组织病理进行观测(结果见图5)。
结果：对照组表现出正常的关节结构和组织，阳性对照组表现出关节软骨不规则、骨质增生和炎症细胞浸润的病理特征。相比之下，治疗组PDA+微针组(对比例1)、EXO+微针组(对比例2)、Exo@PDA+微针组(实施例1)中的大鼠膝关节部分出现了不同程度的病理改善，其中Exo@PDA+微针组(实施例1)的效果最好。
综合而言，Exo@PDA+微针组相较于其他治疗组表现出更显著的软骨修复和炎症减轻的特征，甲苯胺蓝染色和番红固绿染色均显示了软骨纤维组织和炎症细胞的明显变化。
5、缓释性能：为了可视化药物的皮肤渗透情况，制备了含有FITC(荧光染料)的微针贴片。将该微针贴片插入小香猪皮肤中并保持3分钟。通过共聚焦显微镜观测皮肤组织中FITC的绿色荧光信号，并通过纵切收集不同深度的皮肤组织图像。
结果：根据图6可知，实施例1微针贴片中的FITC在皮肤中的扩散深度超过150微米，表现了优异的透皮刺入效果，说明实施例1的微针贴片可将有效物质精准输送至骨关节处进行治疗。此外，所存在的连续荧光信号还表明该微针贴片存在优异的缓释作用。

Claims (10)

1.一种治疗骨关节炎的组合物，其特征在于，所述组合物包括以下组分：
(a)间充质干细胞来源的外泌体；
(b)药学上可用的载体；
所述间充质干细胞来自于骨髓、脐带血、脐带组织、胎盘组织、脂肪组织、皮肤组织、血液中的任意一种或几种的组合；药学上可用的载体选自生物可降解高分子材料、脂质体、蛋白质中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述间充质干细胞来自于骨髓；所述生物可降解高分子材料包括纤维素、葡聚糖、聚丙交酯、聚乙交酯、聚乙交酯-丙交酯共聚物、聚原酸酯、聚己内酯、聚乳酸、聚羟基脂肪酸酯、聚乙醇酸、多元醇聚酯、聚多巴胺中的至少一种，优选为葡聚糖、聚乙交酯-丙交酯共聚物、聚乳酸、聚羟基脂肪酸酯、聚多巴胺中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述载体具有抗炎、抗氧化功效；所述载体为生物可降解高分子材料，包括聚多巴胺。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物为间充质干细胞来源的外泌体包裹的聚多巴胺，间充质干细胞来源的外泌体与聚多巴胺的质量比为(1-4)：1；优选为(1.5-2.5)：1。
5.一种负载权利要求1-4任一项组合物的微针贴片，包含一体成型的背衬层和微针，其特征在于，所述背衬层由基质材料构成，所述微针由基质材料和所述治疗骨关节炎的组合物的混合物构成；
所述微针中，基质材料占组合物和基质材料总质量的10-25％。
6.根据权利要求5所述的微针贴片，其特征在于，所述基质材料包括：透明质酸钠、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、纤维素、环糊精、羟丙基β-环糊精、聚氧乙烯脂肪酸酯、果胶中的至少一种，优选为包括透明质酸钠和羟丙基β-环糊精。
7.根据权利要求6所述的微针贴片，其特征在于，所述透明质酸钠和羟丙基β-环糊精的质量比为(0.5-6)：1。
8.根据权利要求6所述的微针贴片，其特征在于，所述透明质酸钠和羟丙基β-环糊精的质量比为(1-3)：1。
9.根据权利要求7所述的微针贴片，其特征在于，所述透明质酸钠选自低分子量透明质酸钠、中分子量透明质酸钠和高分子量透明质酸钠中的至少两种，所述低分子量透明质酸钠平均分子量为0.5-20万，中分子量透明质酸钠平均分子量为16-70万，高分子量透明质酸钠平均分子量为75-200万。
10.根据权利要求8所述的微针贴片，其特征在于，按透明质酸钠总量计，所述透明质酸钠包括80-95wt％的低分子量透明质酸钠和5-20wt％的高分子量透明质酸钠。
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