CN116615437A - 唾液酸化糖蛋白 - Google Patents

唾液酸化糖蛋白 Download PDF

Info

Publication number
CN116615437A
CN116615437A CN202180077755.XA CN202180077755A CN116615437A CN 116615437 A CN116615437 A CN 116615437A CN 202180077755 A CN202180077755 A CN 202180077755A CN 116615437 A CN116615437 A CN 116615437A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
hsigg
composition
detectably labeled
patient sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180077755.XA
Other languages
English (en)
Inventor
N·沃什伯恩
D·奥尔蒂斯
J·沙克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Momenta Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Momenta Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Momenta Pharmaceuticals Inc filed Critical Momenta Pharmaceuticals Inc
Publication of CN116615437A publication Critical patent/CN116615437A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/001—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/15—Non-radioactive isotope labels, e.g. for detection by mass spectrometry

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本公开描述了用于测量生物样品中的二唾液酸化的Fc聚糖的方法。

Description

唾液酸化糖蛋白
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年11月20日提交的美国临时申请序列号63/116,643的权益。上述临时申请的内容以引用方式并入本文。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2021年11月19日，命名为14131_0237WO1_Seq_Listing.txt，并且为33,641字节。
背景技术
蛋白质药代动力学的测量在药物开发以及患者的治疗和监测中都是重要的。在抗体治疗剂的情况下，夹心ELISA特异性地检测负责抗原结合的抗体的独特部分(CDR)。当然，这些方法不能用于测量作为抗体的复杂混合物的治疗剂。
发明内容
本文描述了用于评估患者体内高度唾液酸化免疫球蛋白(hsIgG)的水平的方法。该方法可用于测量在施用包含hsIgG的组合物后的hsIgG的水平。该方法还可用于评估受试者体内天然存在的IgG抗体(例如，IgG1抗体)的水平，这些天然存在的IgG抗体在IgG1抗体的Fc结构域上的支链聚糖的α1,3臂和α1,6臂两者上被二唾液酸化。该方法需要检测具有序列EEQYNSTYR(SEQ ID NO:1)的可检测地标记的糖基化肽，其中，N用A2F(EEQYNSTYR-A2F)来糖基化。“A2F”聚糖也称为FA2G2S2(Oxford符号)和G2FS2(与IgG聚糖一起使用的简称)，并且由以下结构描绘：
本文描述了一种用于评估患者样品以确定在该患者样品中的Fc结构域上二唾液酸化的IgG1的水平的方法，该方法包括：提供患者样品(例如，血清样品)；向该样品中加入包含可检测地标记的EEQYNSTYR-A2F肽的组合物；使该样品中的蛋白质变性并进行胰蛋白酶消化以制备经处理的样品；使经处理的样品经受LC-MS/MS；以及计算患者样品中的EEQYNSTYR-A2F肽的水平。在各种实施方案中：患者已被施用包含hsIgG的药物组合物；计算患者样品中的EEQYNSTYR-A2F肽的步骤包括对使用包含hsIgG的药物组合物来生成的校正曲线的使用；可检测地标记的EEQYNSTYR-A2F是同位素标记的；并且在包含可检测地标记的EEQYNSTYR-A2F的组合物中，超过80％的EEQYNSTYR肽是EEQYNSTYR-A2F。
本文描述了用于评估患者样品以确定在该患者样品中的Fc结构域上二唾液酸化的IgG1的水平的体外或离体方法，这些方法包括：提供患者样品；向该样品中加入包含可检测地标记的EEQYNSTYR-A2F肽的组合物；使该样品中的蛋白质变性并进行胰蛋白酶消化以制备经处理的样品；使经处理的样品经受LC-MS/MS；以及计算患者样品中的EEQYNSTYR-A2F肽的水平。
在一些实施方案中，可检测地标记的EEQYNSTYR-A2F是同位素标记的。在一些实施方案中，可检测地标记的EEQYNSTYR-A2F是用Arg-10(13C6H1415N4O2)和/或Lys-8(13C6H14 15N2O2)进行同位素标记的。在一些实施方案中，计算患者样品中的EEQYNSTYR-A2F肽的步骤包括对使用包含hsIgG的药物组合物来生成的校正曲线的使用。在一些实施方案中，该校正曲线是通过绘制内标(IS)质量转变的面积与hsIgG质量转变的面积的比率来生成的。在一些实施方案中，患者样品中的hsIgG的绝对丰度是使用基于未知物的面积比率的校正曲线来确定的。在一些实施方案中，在包含可检测地标记的EEQYNSTYR-A2F的组合物中，超过80％的EEQYNSTYR肽是EEQYNSTYR-A2F。在一些实施方案中，患者已被施用包含hsIgG的药物组合物。
本文还描述了组合物，该组合物包含：可检测地标记的EEQYNSTYR-A2F；和包含经二唾液酸化的IgG1的组合物。
本文还描述了用于评估患者样品以确定在该患者样品中的Fc结构域上二唾液酸化的IgG2/3的水平的体外或离体方法，这些方法包括：提供患者样品；向该样品中加入包含可检测地标记的EEQFNSTFR-A2F肽的组合物；使该样品中的蛋白质变性并进行胰蛋白酶消化以制备经处理的样品；使经处理的样品经受LC-MS/MS；以及计算患者样品中的EEQFNSTFR-A2F肽的水平。
在一些实施方案中，可检测地标记的EEQFNSTFR-A2F是同位素标记的。在一些实施方案中，可检测地标记的EEQFNSTFR-A2F是用Arg-10(13C6H1415N4O2)和/或Lys-8(13C6H14 15N2O2)进行同位素标记的。在一些实施方案中，计算患者样品中的EEQFNSTFR-A2F肽的步骤包括对使用包含hsIgG的药物组合物来生成的校正曲线的使用。在一些实施方案中，该校正曲线是通过绘制内标(IS)质量转变的面积与hsIgG质量转变的面积的比率来生成的。在一些实施方案中，患者样品中的hsIgG的绝对丰度是使用基于未知物的面积比率的校正曲线来确定的。在一些实施方案中，在包含可检测地标记的EEQFNSTFR-A2F的组合物中，超过80％的EEQFNSTFR肽是EEQFNSTFR-A2F。在一些实施方案中，患者已被施用包含hsIgG的药物组合物。
本文还描述了组合物，该组合物包含：可检测地标记的EEQFNSTFR-A2F；和包含经二唾液酸化的IgG的组合物。
本文还描述了用于评估患者样品以确定在该患者样品中的Fc结构域上二唾液酸化的IgG3/4的水平的体外或离体方法，这些方法包括：提供患者样品；向该样品中加入包含可检测地标记的EEQYNSTFR-A2F和/或EEQFNSTYR-A2F肽的组合物；使该样品中的蛋白质变性并进行胰蛋白酶消化以制备经处理的样品；使经处理的样品经受LC-MS/MS；以及计算患者样品中的EEQYNSTFR-A2F和/或EEQFNSTYR-A2F肽的水平。
在一些实施方案中，可检测地标记的EEQYNSTFR-A2F和/或EEQFNSTYR-A2F是同位素标记的。在一些实施方案中，可检测地标记的EEQYNSTFR-A2F和/或EEQFNSTYR-A2F是用Arg-10(13C6H1415N4O2)和/或Lys-8(13C6H14 15N2O2)进行同位素标记的。在一些实施方案中，计算患者样品中的EEQYNSTFR-A2F和/或EEQFNSTYR-A2F肽的步骤包括对使用包含hsIgG的药物组合物来生成的校正曲线的使用。在一些实施方案中，该校正曲线是通过绘制内标(IS)质量转变的面积与hsIgG质量转变的面积的比率来生成的。在一些实施方案中，患者样品中的hsIgG的绝对丰度是使用基于未知物的面积比率的校正曲线来确定的。在一些实施方案中，超过80％的EEQYNSTFR和/或EEQFNSTYR肽在包含可检测地标记的EEQYNSTFR-A2F和/或EEQFNSTYR-A2F的组合物中。在一些实施方案中，患者已被施用包含hsIgG的药物组合物。
本文还提供了组合物，该组合物包含：可检测地标记的EEQYNSTFR-A2F和/或EEQFNSTYR-A2F；和包含经二唾液酸化的IgG的组合物。
HsIgG(在WO2020/215021、WO/2014/018747、WO/2014/179601和WO/2015/05762中更详细地进行描述)在免疫球蛋白的Fc区上的支链聚糖上具有非常高水平的唾液酸，例如，免疫球蛋白的Fc区上的至少50％(60％、70％、80％、90％或更多)的支链聚糖经由支链聚糖的α1,3臂和α1,6臂两者上的NeuAc-α2,6-Gal末端键进行唾液酸化。HsIgG含有IgG抗体(主要是IgG1抗体)的多种混合物。抗体的多样性很高。用于制备hsIgG的免疫球蛋白可以例如从人类混合血浆(例如，来自至少1,000至30,000个供体的混合血浆)获得。另选地，IVIG可用于制备hsIgG。在hsIgG中，免疫球蛋白的Fc区上至少50％(例如，60％、70％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、94％、95％、97％、98％至多100％且包括100％)的支链聚糖在α1,3臂和α1,6臂两者上具有唾液酸残基(即，通过NeuAc-α2,6-Gal末端键进行二唾液酸化)。在一些实施方案中，除了Fc唾液酸化之外，Fab区上至少50％(例如，60％、70％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、94％、95％、97％、98％或至多100％且包括100％)的支链聚糖通过NeuAc-α2,6-Gal末端键进行二唾液酸化。在一些情况下，至少85％(87％、90％、92％、94％、95％、97％、98％或至多100％且包括100％)的总支链聚糖(Fc结构域和Fab结构域上的聚糖的总和)通过NeuAc-α2,6-Gal末端键进行二唾液酸化。在一些实施方案中，Fc区上少于50％(例如，少于40％、30％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％)的支链聚糖通过NeuAc-α2,6-Gal末端键进行单唾液酸化(例如，仅在α1,3臂或α1,6臂上唾液酸化)。HsIgG制剂主要是IgG抗体(例如，至少80重量％、85重量％、90重量％、95重量％的免疫球蛋白是各种同种型的IgG抗体)。
如本文所用，术语“Fc区”是指两个“Fc多肽”的二聚体，每个“Fc多肽”包含除CH1结构域之外的抗体恒定区。在一些实施方案中，“Fc区”包括通过一个或多个二硫键、化学接头或肽接头连接的两个Fc多肽。“Fc多肽”是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，并且还可包括这些结构域的柔性铰链N末端的部分或全部。
如本文所用，“聚糖”是糖，其可以是糖残基的单体或聚合物，诸如三种或更多种糖，并且可以是直链或支链的。“聚糖”可包括天然糖残基(例如，葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰神经氨酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、己糖、阿拉伯糖、核糖、木糖等)和/或改性糖(例如，2'-氟核糖、2'-脱氧核糖、磷酸甘露糖、6'磺基N-乙酰葡糖胺等)。术语“聚糖”包括糖残基的均聚物和杂聚物。术语“聚糖”还涵盖糖缀合物(例如，多肽、糖脂、蛋白聚糖等)的聚糖组分。该术语还涵盖游离聚糖，包括已从糖缀合物裂解或以其他方式释放的聚糖。
如本文所用，术语“糖蛋白类”是指含有共价连接到一个或多个糖部分(即，聚糖)的肽主链的蛋白质。糖部分可为单糖、二糖、低聚糖和/或多糖的形式。糖部分可包含糖残基的单条非支链，或者可包含一条或多条支链。糖蛋白可含有O连接的糖部分和/或N连接的糖部分。
IVIg是从至少1,000个人供体的血浆中提取的合并的多价免疫球蛋白(包括所有四种IgG同种型)的制备。批准用于美国的IVIg的形式包括Gammagard(Baxter HealthcareCorporation)、Gammaplex(Bio Products Laboratory)、Bivigam(BiotestPharmaceuticals Corporation)、CarimmuneNF(CSL Behring AG)、Gamunes-C(GrifolsTherapeutics,Inc.)、Glebogamma DID(Instituto Grifols,SA)和Octagam(OctapharmaPharmazeutika Produktionsges Mbh)。IVIg被批准用于免疫缺陷患者和其他用途的血浆蛋白替代疗法。IVIg Fc聚糖唾液酸化的水平在IVIg制剂之间有所不同，但通常小于20％。二唾液酸化水平通常低得多。
如本文所用，“Fc多肽的N-糖基化位点”是指聚糖与之N连接的Fc多肽内的氨基酸残基。在一些实施方案中，Fc区含有Fc多肽的二聚体，并且Fc区包含两个N-糖基化位点，每个Fc多肽上一个。
如本文所用，“支链聚糖的百分比(％)”是指聚糖X相对于所存在的聚糖总摩尔数的摩尔数，其中，X表示感兴趣的聚糖。
术语“药物有效量”或“治疗有效量”是指在治疗患有本文所述的疾病或病症的患者有效的量(例如，剂量)。本文还应当理解，“药物有效量”可解释为赋予所需治疗效果的量，以单剂量或任何剂量或途径单独服用或与其它治疗剂组合服用。
“药物制剂”和“药物产品”可包括在含有该制剂或产品以及使用说明的试剂盒中。
“药物制剂”和“药物产品”通常是指其中已经实现了唾液酸化的最终预定水平并且不含工艺杂质的组合物。为此，“药物制剂”和“药物产品”基本上不含ST6Gal唾液酸转移酶和/或唾液酸供体(例如，胞苷5'-单磷酸-N-乙酰神经氨酸)或其副产物(例如，胞苷5'-单磷酸)。
“药物制剂”和“药物产品”通常基本上不含其中产生糖蛋白的细胞的其它组分(例如，内质网或细胞质蛋白和RNA，如果是重组的话)。
所谓“纯化的”(或“分离的”)是指多核苷酸或多肽从存在于其天然环境中的其它组分中去除或分离。例如，分离的多肽是与产生其的细胞的其它组分(例如，内质网或细胞质蛋白和RNA)分离的多肽。分离的多核苷酸是与其它核组分(例如，组蛋白)和/或与上游或下游核酸分离的多核苷酸。分离的多核苷酸或多肽可至少60％不含、或至少75％不含、或至少90％不含、或至少95％不含所指出的多核苷酸或多肽的天然环境中存在的其它组分。
如本文所用，术语“唾液酸化”是指具有末端唾液酸的聚糖。术语“单唾液酸化”是指例如在α1,3臂或α1,6臂上具有一个末端唾液酸的支链聚糖。术语“二唾液酸化”是指在两个臂(例如，α1,3臂和α1,6臂两者)上具有末端唾液酸的支链聚糖。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可使用本领域已知的其他合适的方法和材料。另外，材料、方法和示例仅为例示性的，而非旨在进行限制。本文提到的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目及其他参考文献均全文以引用方式并入。若有矛盾，应以本说明书及其定义为准。
根据如下具体实施方式和附图以及权利要求书，本发明的其他特征和优点将显而易见。
附图说明
图1左图：将合并的免疫球蛋白转化成hsIgG的酶促唾液酸化反应的示意图。右图：起始IVIg(上)和由IVIg酶促制备的hsIgG(下)的IgG Fc聚糖谱。经由糖肽质谱分析得出不同IgG亚类的聚糖谱。用于定量不同IgG亚类的糖肽的肽序列是：IgG1＝EEQYNSTYR(SEQ IDNO:1)、IgG2/3EEQFNSTFR(SEQ ID NO:2)、IgG3/4EEQYNSTFR(SEQ ID NO:3)和EEQFNSTYR(SEQ ID NO:4)。从左到右的条形：IgG1、IgG2/3、IgG3/4。
图2：色谱法的示例。上图：LLOQ样品(5.0ug/mol，在5％BSA PBS中)。下图：血浆样品(20ug/ml)。
图3：描绘了EEQYNSTYR-A2肽的相关质量转变。
具体实施方式
免疫球蛋白在其重链恒定区中的保守位置处糖基化。例如，人IgG在CH2结构域的Asn297处具有单个N连接的糖基化位点。每种免疫球蛋白型在恒定区中具有不同种类的N-连接的碳水化合物结构。对于人IgG，核心低聚糖通常由具有不同数目的外部残基的GlcNAc2Man3GlcNAc组成。各个IgG之间的差异可经由半乳糖和/或半乳糖-唾液酸在一个或两个末端GlcNAc处的连接或经由第三GlcNAc臂的连接(平分GlcNAc)而发生。
本公开部分地涵盖包括具有Fc区的合并的人免疫球蛋白的药物制剂，该Fc区具有特定水平的支链聚糖，该支链聚糖在Fc区中的两个支链聚糖上唾液酸化(例如，通过NeuAc-α2,6-Gal末端键)。
合并的多价人免疫球蛋白的制剂，包括IVIg制剂，是高度复杂的，因为它们在几个方面是高度异质的。它们包括从数百个或超过1000个个体合并的免疫球蛋白。虽然至少约90％或95％的免疫球蛋白是IgG同种型(在所有亚类中)，但也存在其它同种型，包括IgA和IgM。IVIg中的免疫球蛋白和合并的多价人免疫球蛋白的制备在特异性和糖基化模式方面均有差别。
合并的多价免疫球蛋白的高度唾液酸化改变了存在于免疫球蛋白上的聚糖。对于一些聚糖，改变需要添加一个或多个半乳糖分子以及添加一个或多个唾液酸分子。对于其它聚糖，该改变仅需要添加一个或多个唾液酸分子。此外，虽然基本上所有IgG抗体(即合并的多价免疫球蛋白制剂中的主要免疫球蛋白)在每个形成Fc区的多肽上具有糖基化位点，但并非所有IgG抗体都在Fab结构域上具有糖基化位点。改变免疫球蛋白制剂的糖基化改变了制剂中单独免疫球蛋白的结构和活性，并且重要的是，改变了单独免疫球蛋白之间的相互作用以及免疫球蛋白制剂的整体行为。
广泛使用的用于IVIg制剂的制剂完全不适用于高度唾液酸化免疫球蛋白(hsIgG)的药物制剂，这至少是因为该制剂在用于hsIgG时对药物制剂正常运输中发生的剪切应力不稳定。当经受这种类型的剪切应力时，在hsIgG制剂中形成亚可见颗粒。已知的是，抗体制剂中的此类亚可见颗粒可在注射部位处引起严重不良事件并导致靶免疫应答。抗体制剂中的亚可见颗粒还可激活补体系统、引起栓塞和其它阴性免疫原性反应。据发现，添加非离子表面活性剂使得hsIgG制剂对剪切应力更稳定，并且大大减少了亚可见颗粒的形成。
由于其高度复杂和异质的性质，用于测量患者体内单克隆抗体的量的方法不能用于测量患者体内hsIgG的量。本公开部分地涵盖用于确定患者体内hsIgG的水平的方法。这些方法可用于例如监测在施用hsIgG的药物组合物后的水平或者用于测量患者体内天然存在的IgG水平。由本文所述的方法提供的信息可用于：例如，对患者进行诊断、对患者的治疗进行监测、对患者体内天然存在的hsIgG的水平进行监测、对患者体内hsIgG的水平进行监测并且然后进行治疗、或调整对患者施用的药物组合物的水平等。
可用于制备hsIgG的天然来源多肽包括例如从合并的人血清分离的免疫球蛋白。HsIgG也可由IVIg和来源于IVIg的多肽制备。HsIgG可如WO2014/179601中所述制备。hsIgG的制备还描述于Washburn等人(美国国家科学院院刊2015年3月17日(Proc Natl Acad SciU S A 2015Mar17)；112(11):E1297-306)中。hsIgG制剂中的唾液酸化水平可在Fc结构域上测量(例如，在Fc结构域中的支链聚糖的α1,3臂、α1,6臂或两者上唾液酸化的支链聚糖的数量)，或在总体唾液酸化上测量(例如，在多肽制备中无论在Fc结构域还是Fab结构域上在支链聚糖的α1,3臂、α1,6臂或两者上唾液酸化的支链聚糖的数量或百分比)。
在一些情况下，用作制备hsIgG的免疫球蛋白来源的合并血清是从特定的个体群体中分离出来的，例如产生对抗一种或多种病毒(诸如COVID-19、SARS、副流感、流行性感冒病毒)的抗体但不具有活性感染的个体。在一些情况下，免疫球蛋白是从其中大于50％、55％、60％、75％产生针对所选病毒的抗体的个体群体分离的。
将N连接的低聚糖链添加到内质网的内腔中的蛋白质。具体地，将初始低聚糖(通常为14-糖)添加到Asn-X-Ser/Thr的靶共有序列内含有的天冬酰胺残基的侧链上的氨基，其中，X可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。该初始低聚糖的结构是大多数真核生物共有的，并且含有三个葡萄糖残基、九个甘露糖残基和两个N-乙酰葡糖胺残基。该初始低聚糖链可被内质网中的特定糖苷酶修剪，从而得到由两个N-乙酰葡糖胺残基和三个甘露糖残基构成的短支链核心低聚糖。分支之一在本领域中被称为“α1,3臂”，并且第二分支被称为“α1,6臂”，如下所示。黄圆为Gal；绿圆为Man；三角形为Fuc，菱形为NANA；正方形为GlcNAc。
N-聚糖可细分成被称为“高甘露糖型”、“杂合型”和“复杂型”的三个不同组，其中，在所有三个组中出现共同的五糖核心(Man(α1,6)-(Man(α1,3))-Man(β1,4)-GlcpNAc(β1,4)-GlcpNAc(β1,N)-Asn)。
在内质网中进行初始加工后，多肽被转运到高尔基体，在此可进行进一步加工。如果在将聚糖完全修剪成核心五糖结构之前将聚糖转移到高尔基体，则得到“高甘露糖聚糖”。
附加地或另选地，可将N-乙酰葡糖胺的一个或多个单糖单元添加到核心甘露糖亚基以形成“复杂聚糖”。可将半乳糖添加至N-乙酰葡糖胺亚基，并且可将唾液酸亚基添加到半乳糖亚基，从而得到以唾液酸、半乳糖或N-乙酰葡糖胺残基中的任一者封端的链。另外，可将岩藻糖残基添加到核心低聚糖的N-乙酰葡糖胺残基。这些添加中的每一者均由特定糖基转移酶催化。
“杂合聚糖”包含高甘露糖和复杂聚糖两者的特征。例如，杂合聚糖的一个分支可主要包含或仅包含甘露糖残基，而另一个分支可包含N-乙酰葡糖胺、唾液酸、半乳糖和/或岩藻糖。
唾液酸是具有杂环结构的9碳单糖家族。它们经由附接到环的羧酸基团以及包括N-乙酰基和N-乙醇酰基基团在内的其它化学修饰而带有负电荷。存在于哺乳动物表达系统中产生的多肽中的两种主要类型的唾液酸残基是N-乙酰神经氨酸(NeuAc)和N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc)。它们通常作为在N连接的聚糖和O连接的聚糖两者的非还原末端处附接到半乳糖(Gal)残基的末端结构出现。这些唾液酸基团的糖苷键构型可为α2,3或α2,6。
Fc区在保守的N连接糖基化位点处被糖基化。例如，IgG抗体的每条重链在CH2结构域的Asn297处具有单个N连接糖基化位点。IgA抗体在CH2和CH3结构域内具有N连接的糖基化位点，IgE抗体在CH3结构域内具有N连接的糖基化位点，并且IgM抗体在CH1、CH2、CH3和CH4结构域内具有N连接的糖基化位点。
每种抗体同种型在恒定区中具有不同种类的N连接的碳水化合物结构。例如，IgG在Fc区的每个Fc多肽中在CH2结构域的Asn297处具有单个N连接的双触角碳水化合物，其还包含C1q和FcγR的结合位点。对于人IgG，核心低聚糖通常由具有不同数目的外部残基的GlcNAc2Man3GlcNAc组成。各个IgG之间的差异可经由半乳糖和/或半乳糖-唾液酸在一个或两个末端GlcNAc处的连接或经由第三GlcNAc臂的连接(平分GlcNAc)而发生。可使用本领域已知的任何方法评估多肽的聚糖。例如，聚糖组合物的唾液酸化(例如，在α1,3臂和/或α1,6臂上唾液酸化的支链聚糖的水平)可使用WO2014/179601中所述的方法来表征。
实施例1：高度唾液酸化的IgG
其中超过60％的支链Fc区聚糖被二唾液酸化的高度唾液酸化IgG通常如WO2014/179601中所述制备。
简而言之，将IVIg暴露于使用β1,4半乳糖基转移酶1(B4-GalT)和α2,6-唾液酸转移酶(ST6-Gal1)的一锅顺序酶促反应。半乳糖基转移酶选择性地将半乳糖残基添加到IVIg中预先存在的天冬酰胺连接的聚糖。所得的半乳糖基化聚糖用作唾液酸转移酶的底物，其选择性地添加唾液酸残基以封端连接到IVIg的天冬酰胺连接的聚糖结构。因此，总体唾液酸化反应采用两个糖核苷酸(UDPGal和CMP-NANA)。定期补充后者以相对于单唾液酸化产物增加二唾液酸化产物。该反应包括辅因子氯化锰。
起始IVIg和反应产物的对应IgG-Fc聚糖谱的代表性示例在图1中示出。聚糖数据按IgG亚类示出。来自IgG3和IgG4亚类的聚糖不能单独定量。如所示，对于IVIg，所有未唾液酸化聚糖的总和大于80％，并且所有唾液酸化聚糖的总和小于20％。对于反应产物，所有未唾液酸化聚糖的总和小于20％，并且所有唾液酸化聚糖的总和大于80％。糖图谱中列出的不同聚糖的命名使用N连接的聚糖的Oxford符号。
实施例2：hsIgG的定量
制备高度唾液酸化的IgG1 Fc结构域。简而言之，重组IgG1 Fc结构域在HEK细胞中产生并随后纯化，该HEK细胞是在补充有Arg-10(13C6H1415N4O2)和Lys-8(13C6H14 15N2O2)的精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)游离培养基中生长。然后将经纯化的、同位素标记的Fc结构域酶促半乳糖基化和唾液酸化并用作内标。用于半乳糖基化和唾液酸化的一种合适方法是描述于Washburn等人(美国国家科学院院刊2015年3月17日(Proc Natl Acad Sci U S A2015Mar 17)；112(11):E1297-306)中的方法。另选地，将同位素标记的IgG1 Fc结构域缓冲交换到50mM BIS-TRIS/150mM NaCl pH 6.9中。通过加入158μL的1M MnCl2、121μL的1MUDP-Gal和76μL的B4-GalT1酶(5.9mg/ml)，将重组Fc(4.5mL，55mg/mL)半乳糖基化。将样品在37℃下孵育19小时。接着，加入645μL的ST6(13mg/ml或约42U/ml)和95μL的1M CMP-NANA，并且将样品在37℃下孵育9小时。接着，加入1M CMP-NANA的第二等分试样(95μL)，并且将样品再次在37℃下孵育。在第一等分试样(在第二等分试样后约14.75小时)后23.75小时加入第三等分试样的CMP-NANA。接着，加入2mL的EDTA并且将样品在4℃下放置32.5小时。将样品进行离心并倾出上清液，并且使用0.2μm Vivaspin 6过滤器对上清液进行无菌过滤。然后将样品施加到已经用0.1N NaOH、盐酸胍和1xPBS洗涤的蛋白A柱上。上样后，用1xPBS、5xPBS、然后又用1xPBS洗涤该柱。将所需材料用100mM pH 3.0甘氨酸缓冲液洗脱，用1/10体积的1M TRIS pH 8.8缓冲液中和，并且缓冲交换到1xPBS中并进行无菌过滤。
得到的IgG1Fc结构域(标记的二唾液酸化Fc结构域)在支链聚糖上超过80％被二唾液酸化。
为了创建用于评估hsIgG(例如，患者体内用hsIgG组合物处理的hsIgG)的校正曲线，将标记的二唾液酸化Fc结构域掺入到合适生物基质(例如，磷酸缓冲盐水中的2％BSA)中的不同浓度的hsIgG组合物中。使样品变性，用胰蛋白酶使其消化，清洗并通过LC-MS/MS进行分析。测得的糖基化肽是在N处用A2F修饰的EEQYNSTYR(“EEQYNSTYR-A2F”)。“A2F”聚糖也称为FA2G2S2(Oxford符号)和G2FS2(与IgG聚糖一起使用的简称)，并且由以下结构描绘：
物种 肽 表示 Q1 Q3-1
1 EEQYNSTYR-2F hsIgG1 1181.3 1443.1
2 EEQYNSTYR*-2F hsIgG1内标 1184.4 1447.8
EEQYNSTYR-2F肽对在支链聚糖上二唾液酸化的IgG1 Fc具有特异性。其它肽可用于评估其它IgG亚类。对于IgG2/3抗体，可以使用在N处用A2F(EEQFNSTFR-A2F)修饰的EEQFNSTFR(SEQ ID NO:2)。对于IgG3/4，可以使用在N处用A2F(分别为EEQYNSTFR-A2F和EEQFNSTYR-A2F)修饰的EEQYNSTFR(SEQ ID NO:3)和EEQFNSTYR(SEQ ID NO:4)。
校正曲线是通过绘制内标(IS)质量转变的面积与hsIgG质量转变的面积的比率来生成的。生物基质(例如，患者血清样品)中的hsIgG的绝对丰度是使用基于未知物的面积比率的该校正曲线来确定的。
用于分析患者血浆样品的合适样品制备条件包括：在工作溶液中将10μL标记的、二唾液酸化的Fc结构域(内标)加入到25μL血浆中；加入25μL 50mM碳酸氢铵+50μL 2％脱氧胆酸钠；在75℃下孵育45分钟以使蛋白质变性；旋转并收集沉淀物；使沉淀物重新悬浮在50mM碳酸氢铵中的200μL 0.5mg/mL胰蛋白酶中；在37℃下孵育180分钟；加入50μL 10％三氟乙酸以停止消化并使脱氧胆酸盐沉淀；通过离心除去脱氧胆酸盐。
LC-MS/MS分析可采用Acquity CSH C18(2.1mm×100mm，1.7μm颗粒)柱(Waters,Inc.)(流动相A＝10％甲醇/0.1％甲酸水溶液；流动相B＝乙腈)和Sciex triple quad6500+系统。图2描绘了该色谱法的结果的示例，并且图3描绘了观察到的质量转变的示例。
其他实施方案
应当理解，虽然已结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是前述描述旨在说明而非限制由随附权利要求书所限定的本发明的范围。其他方面、优点和修改均在以下权利要求书的范围内。
序列表
<110> 杨森生物科技公司（Janssen Biotech, Inc.）
<120> 唾液酸化糖蛋白
<130> 14131-0237WO1
<150> US 63/116,643
<151> 2020-11-20
<160> 4
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
1 5

Claims (27)

1.一种用于评估患者样品以确定在所述患者样品中的Fc结构域上二唾液酸化的IgG1的水平的体外或离体方法，所述方法包括：
提供患者样品；
向所述样品中加入包含可检测地标记的EEQYNSTYR-A2F肽的组合物；
使所述样品中的蛋白质变性并进行胰蛋白酶消化以制备经处理的样品；
使经处理的样品经受LC-MS/MS；以及
计算所述患者样品中的所述EEQYNSTYR-A2F肽的水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述可检测地标记的EEQYNSTYR-A2F是同位素标记的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述可检测地标记的EEQYNSTYR-A2F是用Arg-10(13C6H1415N4O2)和/或Lys-8(13C6H14 15N2O2)进行同位素标记的。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述计算所述患者样品中的所述EEQYNSTYR-A2F肽的步骤包括对使用包含hsIgG的药物组合物来生成的校正曲线的使用。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述校正曲线是通过绘制内标(IS)质量转变的面积与hsIgG质量转变的面积的比率来生成的。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中，所述患者样品中的所述hsIgG的绝对丰度是使用基于未知物的面积比率的所述校正曲线来确定的。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在包含可检测地标记的EEQYNSTYR-A2F的所述组合物中，超过80％的所述EEQYNSTYR肽是EEQYNSTYR-A2F。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述患者已被施用包含hsIgG的药物组合物。
9.一种组合物，包含：
可检测地标记的EEQYNSTYR-A2F；
包含经二唾液酸化的IgG1的组合物。
10.一种用于评估患者样品以确定在所述患者样品中的所述Fc结构域上二唾液酸化的IgG2/3的水平的体外或离体方法，所述方法包括：
提供患者样品；
向所述样品中加入包含可检测地标记的EEQFNSTFR-A2F肽的组合物；
使所述样品中的蛋白质变性并进行胰蛋白酶消化以制备经处理的样品；
使经处理的样品经受LC-MS/MS；以及
计算所述患者样品中的所述EEQFNSTFR-A2F肽的水平。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述可检测地标记的EEQFNSTFR-A2F是同位素标记的。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述可检测地标记的EEQFNSTFR-A2F是用Arg-10(13C6H1415N4O2)和/或Lys-8(13C6H14 15N2O2)进行同位素标记的。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中，所述计算所述患者样品中的所述EEQFNSTFR-A2F肽的步骤包括对使用包含hsIgG的所述药物组合物来生成的校正曲线的使用。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述校正曲线是通过绘制所述内标(IS)质量转变的面积与所述hsIgG质量转变的面积的比率来生成的。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中，所述患者样品中的所述hsIgG的绝对丰度是使用基于所述未知物的所述面积比率的所述校正曲线来确定的。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的方法，其中，在包含可检测地标记的EEQFNSTFR-A2F的所述组合物中，超过80％的所述EEQFNSTFR肽是EEQFNSTFR-A2F。
17.根据权利要求10至16中任一项所述的方法，其中，所述患者已被施用包含hsIgG的药物组合物。
18.一种组合物，包含：
可检测地标记的EEQFNSTFR-A2F；
包含经二唾液酸化的IgG的组合物。
19.一种用于评估患者样品以确定在所述患者样品中的所述Fc结构域上二唾液酸化的IgG3/4的水平的体外或离体方法，所述方法包括：
提供患者样品；
向所述样品中加入包含可检测地标记的EEQYNSTFR-A2F和/或EEQFNSTYR-A2F肽的组合物；
使所述样品中的蛋白质变性并进行胰蛋白酶消化以制备经处理的样品；
使经处理的样品经受LC-MS/MS；以及
计算所述患者样品中的所述EEQYNSTFR-A2F和/或EEQFNSTYR-A2F肽的水平。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述可检测地标记的EEQYNSTFR-A2F和/或EEQFNSTYR-A2F是同位素标记的。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述可检测地标记的EEQYNSTFR-A2F和/或EEQFNSTYR-A2F是用Arg-10(13C6H1415N4O2)和/或Lys-8(13C6H14 15N2O2)进行同位素标记的。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中，所述计算所述患者样品中的所述EEQYNSTFR-A2F和/或EEQFNSTYR-A2F肽的步骤包括对使用包含hsIgG的所述药物组合物来生成的校正曲线的使用。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述校正曲线是通过绘制所述内标(IS)质量转变的面积与所述hsIgG质量转变的面积的比率来生成的。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，其中，所述患者样品中的所述hsIgG的绝对丰度是使用基于所述未知物的所述面积比率的所述校正曲线来确定的。
25.根据权利要求19至24中任一项所述的方法，其中，超过80％的所述EEQYNSTFR和/或EEQFNSTYR肽在包含可检测地标记的EEQYNSTFR-A2F和/或EEQFNSTYR-A2F的所述组合物中。
26.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中，所述患者已被施用包含hsIgG的药物组合物。
27.一种组合物，包含：
可检测地标记的EEQYNSTFR-A2F和/或EEQFNSTYR-A2F；
包含经二唾液酸化的IgG的组合物。
CN202180077755.XA 2020-11-20 2021-11-19 唾液酸化糖蛋白 Pending CN116615437A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063116643P 2020-11-20 2020-11-20
US63/116643 2020-11-20
PCT/US2021/060182 WO2022109327A1 (en) 2020-11-20 2021-11-19 Sialylated glycoproteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116615437A true CN116615437A (zh) 2023-08-18

Family

ID=79287772

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180077755.XA Pending CN116615437A (zh) 2020-11-20 2021-11-19 唾液酸化糖蛋白

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230417762A1 (zh)
EP (1) EP4248218A1 (zh)
JP (1) JP2023551190A (zh)
CN (1) CN116615437A (zh)
WO (1) WO2022109327A1 (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014018747A2 (en) 2012-07-26 2014-01-30 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Glycoproteins with anti-inflammatory properties
US20160108450A1 (en) 2013-05-02 2016-04-21 Momenta Pharmaceutcals, Inc. Sialylated glycoproteins
MX2013008153A (es) 2013-07-12 2015-01-12 Geo Estratos S A De C V Metodo y aparato secuestrante de acido sulfhidrico en gas de pozos petroleros.
CR20210521A (es) 2019-04-18 2022-04-01 Janssen Biotech Inc Glicoproteínas saliladas

Also Published As

Publication number Publication date
US20230417762A1 (en) 2023-12-28
JP2023551190A (ja) 2023-12-07
EP4248218A1 (en) 2023-09-27
WO2022109327A1 (en) 2022-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1969007B1 (en) Compositions and methods for producing a composition
CN101432301B (zh) 具有增强的抗炎性和降低的细胞毒性特性的多肽以及相关方法
US20200362003A1 (en) IL-22 Fc FUSION PROTEINS AND METHODS OF USE
BG63213B1 (bg) Метод за контролиране на сиализацията на протеини, продуцирани от клетъчна култура на бозайници
US20240052040A1 (en) Sialylated Glycoproteins
DK2205258T3 (en) Method and structural conformations of antibody preparations with increased resistance to proteases
Coombs et al. Identification of novel contributions to high-affinity glycoprotein–receptor interactions using engineered ligands
US20220324952A1 (en) Recombinant glycosylated eculizumab and eculizumab variants
US20210353752A1 (en) Treatment with highly silylated igg compositions
CN113795275A (zh) 唾液酸化糖蛋白
CN116615437A (zh) 唾液酸化糖蛋白
Leibiger et al. Structural characterization of the oligosaccharides of a human monoclonal anti-lipopolysaccharide immunoglobulin M
CN115605230A (zh) 用于聚糖唾液酸化的酶
US20230192814A1 (en) Hyper-sialylated immunoglobulin
US20230357813A1 (en) Hypersialylated immunoglobulin
US20230365713A1 (en) Sialylated glycoproteins
US20230193339A1 (en) Preparation and Purification of Hypersialylated IGG
Nahrgang Influence of cell-line and process conditions on the glycosylation of recombinant proteins
CN115666751A (zh) 制备高唾液酸化免疫球蛋白的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination