CN116601287A - 用于自动化类器官培养的微孔板 - Google Patents

Abstract

本公开涉及使用微孔板系统来生长、培养、监测和分析胚状体、融合胚状体、球状体、类器官或其它多细胞体的各种实施例。不同类型的微孔板(100、300、500)设计成在细胞生长和培养的各个阶段期间使用，以形成胚状体、融合胚状体、球状体、类器官或其它多细胞体。不同微孔板设计成彼此配合，以允许细胞从一个板中的孔转移至另一板中的孔。测定板包括可灌注单元阵列，该可灌注单元阵列包括供应孔，该供应孔与培养孔流体连通以允许流体交换。

Description

用于自动化类器官培养的微孔板

相关申请的交叉引用

本申请作为PCT国际专利申请于2021年10月22日提交，并且要求于2020年10月22日提交的美国临时专利申请No.63/094,946的优先权和权益，该美国临时专利申请的公开内容在本文通过引用全部并入本文。

背景技术

在三维(3D)环境中培养细胞所产生的细胞行为和形态与在人体中观察到的细胞行为和形态非常吻合。用于此类培养的3D水凝胶/水凝胶支架具有独特的属性：细胞可以沉积在3D空间中的特定位置，并且在延伸的时间段内保持就位。这使得能够产生各种结构(例如，胚状体、融合胚状体、球状体、类器官和/或其它多细胞体)和观察随时间细胞相互作用和发展的共培养环境。虽然在使用3D水凝胶/水凝胶支架来进行细胞体的3D培养方面取得了长足进步，但是生长保持健康并且维持寿命的合适尺寸和类型的细胞体以用于生化测定仍然具有挑战性。这种培养同样是非常耗时的并且是劳动密集型的。

发明内容

在一个方面，本技术涉及用于生长类器官的组织培养试剂盒，该组织培养试剂盒包括：组合板，该组合板包括孔阵列；以及测定板，该测定板包括可灌注单元阵列，每个可灌注单元包括彼此流体连接的相应培养孔和相应供应孔，可灌注单元阵列的定位与组合板的孔阵列的定位成镜像，从而允许可灌注单元阵列中的相应可灌注单元与组合板的孔阵列配合。在示例中，孔阵列包括第一孔阵列，并且组织培养试剂盒还包括：起始板，该起始板包括第二孔阵列，该起始板的第二孔阵列的定位与组合板的第一孔阵列的定位成镜像，从而允许第一孔阵列中的相应孔与第二孔阵列中的相对应孔配合。在另一示例中，起始板的第二孔阵列的各个孔包括相应起始板配合套环，该相应起始板配合套环的尺寸和形状确定为与第一孔阵列的各个孔的相应组合板配合套环产生过盈配合。在又一示例中，相应起始板配合套环的尺寸小于相应组合板配合套环的尺寸。在另一示例中，起始板与组合板配合，以允许将一个或多个细胞从第一孔阵列中的相应孔转移至第二孔阵列中的相应相对应孔。

在上述方面的另一方面中，孔阵列的各个孔包括相应组合板配合套环，该组合板配合套环的尺寸和形状设定成与可灌注单元阵列的相应可灌注单元的相应孔的相应第三开口产生过盈配合。在示例中，组合板与测定板配合以允许将一个或多个细胞从孔阵列的相应相对应孔转移至测定板的相应培养孔中。在另一示例中，组合板和测定板各自包括相应对准销和相应对准接收孔。在又一示例中，组合板在与测定板互连时相对于测定板倒置。在另一示例中，测定板还包括光学透明观察表面，该光学透明观察表面形成可灌注单元阵列的底表面。

在上述方面的另一示例中，光学透明观察表面为透气的。

在另一方面，本技术涉及用于在组织培养板之间转移一个或多个细胞的方法，该方法包括：将倒置的具有第一孔阵列的第一板对准在非倒置的具有第二孔阵列的第二板上，一个或多个细胞包括在第一孔阵列的至少一个孔中；通过将倒置的第一板的第一孔阵列与非倒置的第二板的第二孔阵列互连，使倒置的第一板与非倒置的第二板配合；以及搅动配合的板以将第一孔阵列的至少一个孔中包括的一个或多个细胞转移至第二孔阵列的相对应至少一个孔中。在示例中，该方法还包括将第一板中的一个或多个细胞在生长介质中培养第一培育期；以及在第一培育期后倒置第一板。在另一示例中，搅动配合的板包括将超声脉冲施加至第一板，以使至少一个孔中的一个或多个细胞落入第二板的相对应至少一个孔中。在又一示例中，该方法还包括在使第一孔阵列与第二孔阵列配合之前，将水凝胶添加至第二孔阵列的至少一个孔。在另一示例中，第二板的至少一个孔包括至少一个其它细胞，将第一板的至少一个孔中的一个或多个细胞转移至第二板的至少一个孔中，以与至少一个其它细胞形成至少一个类器官。

在上述方面的另一示例中，该方法还包括将第二板的第二孔中的一个或多个细胞培养第二培育时间；将第二板倒置；将第二板与非倒置的第三板配合；以及搅动配合的第二板和非倒置的第三板，以将一个或多个细胞从第二板的至少一个孔转移至非倒置的第三板的至少一个培养孔中。

在另一方面，本技术涉及细胞培养板的布置，以允许一个或多个细胞的转移，包括：第一板，该第一板包括第一孔阵列，该第一孔阵列中的至少一个孔包括至少一个胚状体；以及第二板，该第二板与第一板配合，该第二板包括第二孔阵列，该第二孔阵列与第一板互连以形成过盈配合。在示例中，第一板与第二板配合，以用于将至少一个胚状体从第一孔阵列中的至少一个孔转移至第二孔阵列的至少一个相对应孔中。在另一示例中，在将至少一个胚状体从第一孔阵列的至少一个第一孔中转移之前，第二孔阵列的至少一个相对应孔容纳有至少一个其它胚状体。

在另一方面，本技术涉及用于培养类器官的测定板，该测定板包括：孔板，该孔板包括可灌注单元阵列，单个可灌注单元包括经由至少一个通道与供应孔流体连接的培养孔，该至少一个通道的尺寸和形状确定为允许通过至少一个通道使液体在培养孔和供应孔之间重力流动；以及底层片，该底层片布置在孔板的下侧上，形成用于可灌注单元阵列的底层。在示例中，底层片包括光学透明观察窗。在另一示例中，底层片为透气的，从而允许氧气流至在可灌注单元的一个或多个中生长的细胞聚集体。在又一示例中，培养孔的容积大于供应孔的容积。在另一示例中，培养孔和供应孔共用限定培养孔和供应孔的至少一个侧壁的一部分，培养孔和供应孔的至少一个侧壁的剩余部分延伸的长度大于至少一个侧壁的共用部分的长度。

在上述方面的另一示例中，至少一个通道由至少一个侧壁的一部分的端部与底层片之间的间隙形成。在示例中，可灌注单元阵列中的至少一个可灌注单元的相应培养孔或相应供应孔还包括远离底层片竖直延伸的阻隔壁，其中，至少一个通道还由阻隔壁与至少一个侧壁的共用部分之间的容积限定。在另一示例中，至少一个通道包括多个微通道，该多个微通道大小和形状确定为防止一个或多个胚状体从培养孔迁移至供应孔中。在又一示例中，测定板还包括在培养孔内的水凝胶。

在另一方面，本技术涉及一种方法，包括：将水凝胶引入测定板的可灌注单元的培养孔中，该培养孔经由至少一个通道与供应孔流体连通；通过培养孔将至少一个胚状体引入水凝胶中；将供给介质引入可灌注单元的供应孔中；以及倾斜测定板，从而经由至少一个通道使供给介质在培养孔和供应孔之间产生重力流动。在示例中，测定板在倾斜平台上倾斜。在另一示例中，至少一个胚状体的尺寸为直径大于100微米。在又一示例中，测定板包括多个可灌注单元，并且多个可灌注单元的子集彼此流体连接，并且供给介质响应于测定板的倾斜而流过可灌注单元的子集的可灌注单元中的每一个。在另一示例中，可灌注单元的子集中的单个可灌注单元包括一个或多个不同类型的胚状体。

在上述方面的另一示例中，水凝胶以液体形式引入培养孔中，并且当引入培养孔中时，经由至少一个通道使水凝胶的一部分流入供应孔中。在示例中，供应孔包括布置在供应孔的主要容积和通道之间的阻隔壁，并且水凝胶的一部分流入供应孔直到阻隔壁。在另一示例中，该方法还包括对培养孔中的类器官进行原位成像。

在另一方面，本技术涉及一种系统，包括：倾斜平台；以及测定板，该测定板位于倾斜平台上，测定板包括多个可灌注单元，可灌注单元中的每一个具有相应培养孔和相应供应孔，相应培养孔和相应供应孔经由至少一个通道彼此流体连接，该至少一个通道响应于测定板经由倾斜平台的倾斜而有助于液体在相应培养孔和相应培养孔之间的重力流动。在示例中，该系统还包括布置在相应培养孔的底表面内的水凝胶。在另一示例中，测定板还包括透明透气表面，该透明透气表面布置在测定板的下侧并且形成多个可灌注单元的底部。

附图说明

可以参照以下附图来更好理解本公开的许多方面。附图中的部件不一定按比例绘制，而是强调清楚示出本公开的原理。此外，在附图中，相同的附图标记在几个附图中表示相对应部件。

可以参照以下附图来更好理解本公开的许多方面。附图中的部件不一定按比例绘制，而是强调清楚示出本公开的原理。此外，在附图中，相同的附图标记在几个附图中表示相对应部件。

图1示出了根据本公开的各种实施例的起始微孔板的透视图的示例。

图2A示出了根据本公开的各种实施例的图1的起始微孔板的截面图的示例。

图2B示出了根据本公开的各种实施例的图1的起始微孔板的顶视图的示例。

图3示出了根据本公开的各种实施例的组合微孔板的透视图的示例。

图4A示出了根据本公开的各种实施例的图3的组合微孔板的顶视图。

图4B示出了根据本公开的各种实施例的图3的组合微孔板的截面图的示例。

图5示出了根据本公开的各种实施例的测定微孔板的透视图的示例。

图6示出了根据本公开的各种示例的图5的测定微孔板的顶视图的示例。

图7和图7A示出了根据本公开的各种实施例的图5的测定微孔板的实施例的截面图，示出了可灌注单元，可灌注单元具有经由通道流体连接到培养孔的供应孔。

图8示出了根据本公开的各种实施例的图7的将供应孔和培养孔连接的通道的详细视图的示例。

图9示出了根据本公开的各种实施例的图7的具有浅微通道的示例性通道。

图10示出了根据本公开的各种实施例的图7的具有竖直微通道的示例性通道。

图11和图11A示出了根据本公开的各种实施例的图5的测定微孔板的另一实施例的截面图，示出了将培养孔与供应孔流体连接的通道。

图12示出了根据本公开的各种实施例的图11的测定微孔板的可灌注单元的顶视图的示例。

图13示出了根据本公开的各种实施例的图11的测定微孔板的可灌注单元的截面图的示例，其中水凝胶沉积在培养孔的底部中并且延伸至供应孔中。

图14示出了根据本公开的各种实施例的图5的测定微孔板的顶视图的示例，该示例示出了不同条带构造。

图15示出了根据本公开的各种实施例的与图3的组合微孔板配合的图1的起始微孔板的透视图的示例。

图16示出了根据本公开的各种实施例的与图3的组合微孔板配合的图1的起始微孔板的截面图的示例。

图17示出了根据本公开的各种实施例的与图5的测定微孔板配合的图3的组合微孔板的透视图的示例。

图18A示出了根据本公开的各种实施例的与图7的测定微孔板配合的图3的组合板的截面图的示例。

图18B示出了根据本公开的各种实施例的与图11的测定微孔板配合的图3的组合板的截面图的示例。

图19示出了根据本公开的各种实施例的与图1的起始微孔板的给定孔中产生胚状体相关的时间序列的示例。

图20示出了根据本公开的各种实施例的与图3的组合板配合图1的起始微孔板以允许胚状体转移的示例性截面图。

图21示出了根据本公开的各种实施例的与图3的组合板配合的图1的起始微孔板以允许将胚状体转移至已经包括胚状体的组合板的孔中的示例性截面图。

图22示出了根据本公开的各种实施例的与图3的组合板配合的图1的起始微孔板以允许将多个胚状体转移至已经包括胚状体的组合板的孔中的示例性截面图。

图23A和图23B示出了根据本公开的各种实施例的与图11的测定微孔板配合的图3的组合板的示例截面图，其中胚状体从组合板转移至测定微孔板。

图24示出了根据本公开的各种实施例的定位在倾斜装置上的图5的测定微孔板的示例，该倾斜装置使测定微孔板绕轴线旋转以允许液体在供应孔和培养孔之间重力流动。

图25示出了根据本公开的各种实施例的使用机器人装置与图5的测定微孔板配合的图3的组合板的示例。

图26示出了根据本公开的各种实施例的与在如本文所述的细胞的生长和培养的各种阶段期间使用微孔板系统相关的示例性方法的流程图。

具体实施方式

本公开涉及使用根据各种实施例的微孔板系统在体外生长、培养、监测和分析胚状体、融合胚状体、球状体、类器官和/或其它多细胞体。特别地，不同类型的微孔板设计成在细胞生长和培养的各个阶段期间使用，以形成胚状体、融合胚状体、球状体、类器官和/或其它多细胞体。根据各种实施例，本公开的微孔板设计成通过以下方式来有助于细胞体的产生：具有一个或多个细胞的细胞培养物、具有一种或多种类型细胞的细胞培养物、细胞培养物的组合、将融合的细胞培养物埋入水凝胶中、以及细胞培养物在本公开的各种微孔板之间的转移。另外，在各种实施例中，微孔板系统可以用于生长直径为约25微米(μm)至4000μm的胚状体、融合胚状体、球状体、类器官和/或其它多细胞体。

本文描述了多孔微孔板，该多孔微孔板有助于3D组织培养，特别是细胞体(例如胚状体、融合胚状体、球状体、类器官或其它多细胞体)的生长和维持。本文所述的多孔微孔板可以是：起始板，该起始板有助于来自一个或多个单细胞(或多个单个解离的细胞)的3D细胞体的生长；组合板，该组合板能够使两个以上的细胞体融合；以及

测定板，该测定板包括一个或多个可灌注单元，从而提供尺寸适当的孔，以便除了提供新鲜介质的灌注以向细胞体供应营养物和从细胞体移除废物之外，还能够使细胞体生长。根据本公开的实施例，每个板可以与其它板(或其它类型的板)物理兼容，使得该每个板与其它板可以物理互连(例如配合在一起，例如，一个板相对于另一板倒置，其中一个板的每个相应孔与另一板的相对应孔流体连接)。

在实施例中，测定板的可灌注单元可以包括通过间隙和/或通道互连的生长孔(或培养孔)和供应孔(或供给孔)。在实施例中，测定板可以包括通过两个以上通道互连的两个以上可灌注单元的阵列。

根据各种实施例，本文描述了组织培养试剂盒。根据各种实施例，组织培养试剂盒可以包括起始试剂盒、组合试剂盒和测定试剂盒。根据各种实施例，包括在本公开的组织培养微孔板的试剂盒中的测定微孔板设计用于生长和监测胚状体、融合胚状体、球状体、类器官和/或其它多细胞体。另外，本公开的测定微孔板设计成允许观察水凝胶中的类器官，该水凝胶可以与两种不同的液体接触以在水凝胶内产生浓度梯度。特别地，本公开的测定微孔板包括具有双孔(例如，供应孔和培养孔)的可灌注单元，该双孔彼此流体连接以允许液体响应于板的倾斜从一个孔灌注流动(perfusive flow)至另一个孔(重力流)。在各种实施例中，测定微孔板还提供透明密封层，该透明密封层形成用于可灌注单元阵列的底层。在各种实施例中，透明密封层可以为透气的，以支持将氧输送至类器官的表面。在各种实施例中，密封层包括透明观察窗。观察窗可以是适合于显微镜观察的窗，无论是明场、相衬、荧光、共焦、双光子显微镜成像模式还是本领域已知的其它显微镜成像模式。在一些实施例中，可灌注单元的每个生长孔可以包括透明观察窗。在各种实施例中，可灌注单元阵列中的可灌注单元的至少一个生长孔可以包括透明观察窗。

如本文所用的，“干细胞”是指未分化或部分分化(分别为亚全能(pluripotent)或多能(multipotent))的细胞，该未分化或部分分化细胞可以无限增殖并且分化成原代成体细胞、成体细胞或相同或不同细胞谱系的任何种类的分化组织。尽管存在本领域已知干细胞的其它来源(诸如来自脐带血)，但本文所述的干细胞可以是胚胎干细胞或通过重新编程形成以变成诱导多能干细胞。

如本文所用的，“胚胎状体”或“胚状体”是指细胞(例如，亚全能或多能干细胞)的三维聚集体。根据本公开的胚状体是悬浮结构，该悬浮结构可以响应细胞外诱因并且分化为三个胚层(内胚层、外胚层或中胚层)中的任何一个胚层的结构，并且可以埋入水凝胶或支架中以用于进一步分化为类器官。

如本文所用的，“类器官”是指在体外三维产生的器官的小型化和简化版本，该类器官示出了真实的微观解剖结构或反映了器官的一个或多个功能。如本文所述，类器官可以衍生于来自组织、胚胎干细胞或诱导亚全能干细胞的一种或几种细胞，由于该一种或几种细胞的自我更新和分化能力，该一种或几种细胞可以在三维培养中自我组织。类器官可以是指实现器官的一个或多个功能的细胞聚集体。

起始板

现在转至图1，示出了根据本公开的各种实施例的可以包括在组织培养微孔板的试剂盒中的起始微孔板100的示例。根据各种示例，起始微孔板100可以用作用于生长细胞的起始板，该细胞可以用于形成胚状体、融合胚状体、球状体、类器官和/或其它多细胞体。图1示出了根据本公开的各种实施例的起始微孔板100的透视图的示例，图2A示出了单行起始微孔板100的截面图的示例，并且图2B示出了起始微孔板100的顶视图的示例。

起始微孔板100包括孔板103，该孔板103具有用于在三维(3D)细胞生长介质中培养细胞的多个起始板孔106。在各种示例中，孔板103包括顶表面和与期望孔高度相对应的厚度。孔板103的部件可以通过任何合适的程序由任何合适的材料形成。在示例性实施例中，孔板103可以由诸如透明聚合物等聚合物和/或可以理解的其它材料形成。例如，聚合物可以包括聚苯乙烯、聚丙烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、环烯烃聚合物、环烯烃共聚物和/或可以理解的其它聚合物。孔板103可以不具有可移除/移动部件和/或可以诸如通过注射成型或3D打印等形成为单件，使得孔板103的所有结构(例如，孔)彼此一体形成。

如图1和图2A所示，起始板孔106优选呈行和列排列。起始板孔106中的每一个包括孔口109，该孔口109由从孔板103的顶表面延伸并且朝向起始板孔106的底表面延伸的壁形成。在一个实施例中，起始板孔106中的每一个的底表面可以延伸至孔板103的底部。可替代地，起始板孔106可以不如孔板103深。在一个实施例中，起始板孔106可以从没有底表面的孔板103的顶表面悬挂。起始板孔106可以包括适于培养细胞的形状。例如，起始板孔106可以包括U形孔、V形孔或可以理解的其它形状孔。在各种示例中，孔106为渐缩形，使得孔的顶部的直径或尺寸与孔的底部的直径或尺寸不同。

可以理解的是，可以引入任何合适的细胞以填充起始微孔板100的孔106。这些细胞可以包括干细胞(例如亚全能干细胞)、支持细胞等。可以通过任何合适的技术将细胞沉积在支架中，该技术包括生物油墨液滴印刷、微接触印刷、光刻、浸笔式纳米光刻和/或移液等。

此外，可以将一个或多个生长因子以液体介质的形式引入起始微孔板100的孔106中。合适的示例性生长因子包括血管生成素、骨形态发生蛋白(BMP)、睫状神经营养因子、集落刺激因子、肾上腺素、表皮生长因子、红细胞生成素、成纤维细胞生长因子、胶质衍生神经营养因子、肝细胞生长因子、胰岛素、类胰岛素生长因子、白介素、白血病抑制因子、角质细胞生长因子、神经调节蛋白、神经营养素、血小板衍生生长因子、转化生长因子、肿瘤坏死因子(α)、血管内皮生长因子等。

根据各种实施例，起始微孔板100与微孔板系统的组合微孔板300(图3)兼容，以有助于将一个或多个细胞从起始微孔板100转移至组合微孔板300。例如，起始微孔板100可以与组合微孔板300配合，以允许起始微孔板100的起始板孔106与组合微孔板300的相对应组合板孔303接合或者以其它方式互连。可以理解的是，例如，孔板309上的组合板孔303的定位可以与起始孔板103上的起始板孔106的定位成镜像，以允许组合板孔106与起始板孔106的对准配合。如下文进一步详述的，可以手动实现该处理或通过使用机器人装置来自动实现该处理。

在各种实施例中，起始板孔106各自包括相应配合套环112，该相应配合套环112远离孔板103的顶表面延伸，从而使相对应起始板孔106的壁从孔板103的顶表面延伸。起始微孔板100的起始板孔106的配合套环112的尺寸和形状确定为配合在组合微孔板300的孔口306内，或通过其它方式与该组合微孔板300的孔口306配合。因此，在各种示例中，配合套环112的尺寸(例如，周长或圆周)小于在孔板103的顶表面处的孔口405的尺寸(例如，周长、圆周)。在各种实施例中，配合套环112的尺寸和形状确定为与组合微孔板300的相对应组合板孔303形成过盈配合，以有助于无泄漏转移一个或多个细胞以及包括在相应起始板孔106中的任何相关联液体。在一些示例中，配合套环112还可以包括垫圈(例如，O形环)、垫圈阵列或可以位于配合的板之间以防止流体在配合的孔之间溢出的其它类型密封结构。

根据各实施例，起始微孔板100还包括对准引导件115a和对准接收孔118a，该对准引导件115a和对准接收孔118a设计成当将起始微孔板100与组合微孔板300配合时，有助于将起始微孔板100对准地置于组合微孔板300上。特别地，起始微孔板100的对准引导件115a可以包括例如销，该销的尺寸和形状确定为与包括在组合微孔板300上的对准接收孔118b(图3)对准和接合。如图3所示，组合微孔板300还包括对准引导件115b和对准接收孔118b。应当注意的是，尽管起始微孔板100和组合微孔板300的对准引导件115和对准孔118放置在图1和图3中示出为微孔板100、300的相对角部，以当起始微孔板100倒置并且置于组合微孔板300上方时允许适当接合，但对准引导件115和接收孔118的定位不局限于图1和图3所示的位置，而是可以定位在板上不干扰孔的任何位置处。

组合板

现在转至图3，示出了根据本公开的各种实施例的可以包括在组织培养微孔板的试剂盒中的组合微孔板300(例如，组合板)的透视图的示例。图4A示出了根据本公开的各种实施例的组合微孔板300的顶视图，并且图4B示出了根据各种实施例的组合微孔板300的截面图的示例。

根据各种示例，组合微孔板300可以用作用于生长细胞的板，该细胞可以用于形成与起始微孔板100的类器官类似的类器官。在其它各种示例中，组合微孔板300还可以用于组合或通过其它方式融合从一个或多个起始微孔板100转移的细胞(例如，胚状体)。可以理解的是，例如，可以经由一个或多个起始微孔板100将胚状体转移至组合微孔板300的给定孔303中，从而允许转移的胚状体旨在生长和产生球状体/类器官而彼此融合。

组合微孔板300包括孔板309，该孔板309具有用于在3D细胞生长介质中培养细胞的多个组合板孔303。在各种示例中，孔板309包括顶表面和与期望孔高度相对应的厚度。孔板309的部件可以通过任何合适的程序由任何合适的材料形成。在示例性实施例中，孔板309可以由诸如透明聚合物等聚合物形成。例如，聚合物可以包括聚苯乙烯、聚丙烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、环烯烃聚合物、环烯烃共聚物和/或可以理解的其它聚合物。孔板309可以不具有可移除/移动部件和/或可以诸如通过注射成型或3D打印或其它方法形成为单件，使得孔板309的所有结构(例如，隔间)彼此一体形成。

如图3和图4A所示，组合板孔303优选呈行和列排列。根据各种示例，可以理解的是，孔板309上的组合板孔303的定位与起始孔板103上的起始孔板106的定位成镜像，以允许组合板孔106与起始孔板106的对准配合。组合板孔303中的每一个包括孔口306，该孔口306由从组合板孔303的顶表面延伸至底表面的壁形成。在一个实施例中，起始板孔303中的每一个的底表面可以延伸至孔板309的底部。可替代地，组合板孔303可以不如孔板309深。组合板孔303可以包括适于培养细胞的形状。例如，组合板孔303可以包括U形孔、V形孔或可以理解的其它形状孔。在各种示例中，孔303为渐缩形，使得孔的顶部的直径或尺寸与孔的底部的直径或尺寸不同。

可以理解的是，可以引入任何合适的细胞来填充组合微孔板300的孔303。这些细胞可以包括干细胞(例如亚全能干细胞)、支持细胞等。在一些实施例中，可以通过任何合适的技术将细胞沉积在支架中，该技术包括生物油墨液滴印刷、微接触印刷、光刻、浸笔式纳米光刻和/或移液等。在其它实施例中，根据本公开的各种实施例，响应于将一个或多个起始微孔板100与组合微孔板300配合并且使起始微孔板100中的细胞转移至组合微孔板300，细胞可以沉积至组合微孔板300的孔中。例如，如将讨论的，可以将超声脉冲施加至配合的板，以减小与起始微孔板100中的细胞相关联的表面张力，从而允许细胞和任何相对应介质从起始微孔板100转移至组合微孔板300。

此外，可以将一个或多个生长因子以液体介质的形式引入组合微孔板300的孔303中。可能合适的示例性生长因子包括血管生成素、骨形态发生蛋白(BMP)、睫状神经营养因子、集落刺激因子、肾上腺素、表皮生长因子、红细胞生成素、成纤维细胞生长因子、胶质衍生神经营养因子、肝细胞生长因子、胰岛素、类胰岛素生长因子、白介素、白血病抑制因子、角质细胞生长因子、神经调节蛋白、神经营养素、血小板衍生生长因子、转化生长因子、肿瘤坏死因子(α)、血管内皮生长因子等。

根据各种实施例，组合微孔板300与组织培养微孔板的试剂盒的测定微孔板500(图5)兼容，以有助于将一个或多个细胞从组合微孔板300转移至测定微孔板500。在各种示例中，组合微孔板300可与测定微孔板500配合以有助于胚状体从组合微孔板300转移至测定微孔板500中。例如，组合微孔板300可以倒置并且置于测定微孔板500上方，以允许组合板孔303与测定微孔板500的可灌注单元503(图5)接合、配合或以其它方式互连。

在各种实施例中，组合板孔303各自包括相应配合套环312，该相应配合套环312远离孔板309的顶表面延伸，从而使相对应组合板孔303的壁从孔板309的顶表面延伸。组合微孔板300的孔303的配合套环312的尺寸和形状确定为配合在测定微孔板500的孔口内，或通过其它方式与该测定微孔板500的孔口配合。在优选实施例中，配合套环312的尺寸和配合确定为与测定微孔板500的相对应可灌注单元503形成过盈配合，以有助于无泄漏转移一个或多个细胞以及包括在相应组合板孔303中的任何相关液体。

根据各种实施例，组合微孔板300还包括对准引导件115b和对准接收孔118b，以有助于当将起始微孔板100与组合微孔板300配合时将起始微孔板100对准置于组合微孔板300上。另外，对准引导件115和对准接收孔118b还用于当将组合微孔板300与测定微孔板500配合时，有助于组合微孔板300在测定微孔板500上对准放置。特别地，对准引导件115的尺寸和形状可以确定为与包括在起始微孔板100和/或测定微孔板300上的接收孔118对准并且接合。

如图5所示，测定微孔板500还包括对准引导件115c和对准接收孔118c。应当注意的是，尽管组合微孔板300和测定微孔板500的对准引导件115和对准孔118放置在图5和图6中示出为微孔板300、500的相对角部，以当组合微孔板300倒置并且置于测定微孔板500上时允许适当接合，但对准引导件115和接收孔118的定位不局限于图3和图5所示的位置。

应当注意的是，尽管本公开论述了起始微孔板100和组合微孔板300，但基于给定应用，使用起始微孔板100的需要可以是可选的。例如，如果给定应用不需要不同类型细胞的组合，则可以使用组合微孔板300进行细胞的初始生长，而不额外需要在起始微孔板100中生长和/或培养细胞。在另一示例中，如果使用来自另一来源的胚状体开始培养，则起始板的使用可以是可选的。

测定板

现在转至图5，示出了根据本公开的各种实施例的示例性测定微孔板500的透视图。图6示出了根据本公开的各种示例的图5的测定微孔板500的顶视图的示例。可以理解的是，测定微孔板500与用于生长、培养、监测和测定胚状体、融合胚状体、球状体、类器官或其它多细胞体的培养和测定微孔板相对应。根据各种示例，测定微孔板500设计成支撑和生长类器官，该类器官的尺寸为直径在25微米至大于约100微米的范围内。

如图5所示，测定微孔板500包括孔板506，该孔板506具有多个可灌注单元503，以用于生长、培养、监测和测定胚状体、融合胚状体、球状体、类器官或其它多细胞体。在各种示例中，孔板506包括平面材料，该平面材料具有顶表面、底表面和与期望孔高度相对应的厚度。孔板506的部件可以通过任何合适的程序由任何合适的材料形成。在示例性实施例中，孔板506可以由诸如透明聚合物等聚合物和/或可以理解的其它材料形成。例如，聚合物可以包括聚苯乙烯、聚丙烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、环烯烃聚合物、环烯烃共聚物和/或可以理解的其它聚合物。孔板506可以不具有可移除/移动部件和/或可以诸如通过注射成型等形成为单件，使得孔板506的所有结构(例如，孔)彼此一体形成。

根据各种实施例，可灌注单元503包括培养孔509和供应孔512，该培养孔509和供应孔512经由至少一个通道515彼此流体连接，该至少一个通道515的尺寸和形状确定为响应于测定微孔板500的倾斜而有助于培养孔509和供应孔512之间的液体(例如，供给介质)的重力流动。在培养孔509和供应孔512之间交换介质移除有毒的副产物，并且向生长的类器官或其它组织培养物提供新鲜营养物。

根据各种实施例，培养孔509的尺寸和形状确定为支持沉积胚状体，该胚状体可以埋入在被引入培养孔509的水凝胶中。可以理解的是，例如，培养孔509可以认为是用于生长胚状体的培养孔。根据各种实施例并且根据测定板500上的孔的数量，培养孔509的尺寸可以在一个维度上高达6毫米(mm)，在一个维度上高达15mm，和/或可以理解的其它尺寸。另外，培养孔509和供应孔512的深度指定为使得测定微孔板500可以倾斜成允许在可灌注单元503内进行流体交换，而不使流体溢出每个可灌注单元503的相应培养孔509或供应孔512。

供应孔512可以用于供应供给介质和/或其它营养物，该供给介质和/或其它营养物可以用于供给定位在培养孔509中的生长类器官。另外，可以理解的是，供应孔512可以用于从类器官收获上清液。例如，供应孔512可以认为是包括供给介质和/或其它营养物的供应孔，该供给介质和/或其它营养物可以由培养孔509中生长的类器官使用。根据本公开的各种实施例，供应孔512的尺寸和形状确定为保持可以与培养孔509交换的流体。根据各种实施例并且根据测定板500上的孔的数量，供应孔512的尺寸可以在给定维度上高达6毫米(mm)，在给定维度上高达15mm，和/或可以理解的其它尺寸。应当注意的是，在一些示例中，供应孔512可以提供用于生长和培养类器官和/或其它多细胞体的环境，并且培养孔509可以用作供应孔以用于将营养物供应至供应孔512内的环境。

根据各种实施例，培养孔509和供应孔512的尺寸和形状可以彼此不同。例如，在一些示例中，培养孔509(在尺寸方面，例如直径或体积)大于供应孔512。在其它示例中，供应孔512大于培养孔509。在一些示例中，培养孔509包括与供应孔512的形状不同的形状。应当注意的是，尽管在本公开的培养孔509和供应孔512的示例中，将培养孔509示出为八边形，并且将供应孔512示出为正方形，但培养孔509和供应孔512的尺寸和形状不局限于示例图中所示的尺寸和形状。

如图5和图6中所示，可灌注单元503优选呈行和列排列。在各种实施例中，可以理解的是，测定微孔板500包括384孔式板，该384孔式板包括用于类器官或其它组织培养物的一百九十二(192)个培养孔509。然而，应当注意的是，测定微孔板500不局限于384孔式板，并且可以组织为条带或可以理解的其它类型构造。

根据各种实施例，培养孔509由培养孔口518a限定，该培养孔口518a由从孔板506的顶部延伸至培养孔509的底表面的一个或多个壁形成。类似地，供应孔512由供应孔口518b限定，该供应孔口由从孔板506的顶表面延伸至供应孔512的底表面的一个或多个壁限定。在各种实施例中，培养孔509定位在供应孔512附近，使得培养孔509和供应孔512共用侧壁519或共用培养孔509和供应孔512之间共用的壁的至少一部分。在各种示例中，培养孔509和供应孔512的共用侧壁519(或者培养孔509和供应孔512之间共用的壁的一部分)没有延伸从孔板506的顶表面至底表面的整个长度。

根据各种实施例，测定微孔板500还包括布置在孔板506的下侧的底层片521。底层片521附接至孔板506的下侧，形成了培养孔509和供应孔512的底表面。在各种示例中，可以理解的是，底层片521包括光学透明的观察窗，以允许对测定微孔板500中培养的类器官或其它组织培养物进行成像。观察窗可以是适合于显微镜观察的窗，无论是明场、相衬、荧光、共焦、双光子显微镜成像模式还是本领域已知的其它显微镜成像模式。

在各种示例中，底层片521可以包括透气片，该透气片构造成增加用于测定微孔板500中生长的类器官的氧供应。透气片可以由包括聚四氟乙烯(PTFE)、PEFP、聚酰亚胺和/或可以理解的其它材料的材料形成。根据各种示例，透气片可以具有约5微米至30微米的厚度。根据各种示例，透气片可以包括多个孔隙。在其它示例中，透气片可以允许分子扩散通过。可替代地，透气片可以包括一些其它厚度、孔隙直径和孔隙密度。

根据各种实施例，底层片521附接至培养孔509和供应孔512的侧壁的下侧，该培养孔509和供应孔512的侧壁从孔板506的顶表面延伸至底表面。根据各种示例，底层片521经由热联接、粘合剂和/或可以理解的其它附接方法附接至孔板506。

根据各种实施例，培养孔509与相邻供应孔512之间的流体连接以及经由测定微孔板500的倾斜来提供流体的连续重力流的能力允许类器官或其它多细胞体的提前供给。在各种示例中，可以将供给介质或其它营养物引入供应孔512中，并且经由通道515最终引入培养孔509中。在各种实施例中，可以通过抽吸将液体从孔(例如，供应孔512)中的一个孔中移除，而不干扰所关注孔中的环境。在各种示例中，可以理解的是，可灌注单元503的孔的流体连接还允许观察水凝胶中的组织培养物，该水凝胶可以与两种不同液体接触以在水凝胶内产生浓度梯度。

现在转至图7至图10，示出了根据本公开的各种实施例的测定微孔板500a的示例性视图。特别地，图7示出了测定微孔板500a的截面图，示出了将培养孔509与供应孔512流体连接的通道515。图7A示出了图7的测定微孔板500a的截面图的一部分的放大视图。如图7至图10所示，培养孔509和供应孔512的共用侧壁519的长度短于培养孔509和供应孔512的剩余侧壁的长度。特别地，共用侧壁519不延伸至由底层片521形成的培养孔509和供应孔512的底表面。这样，在共用侧壁519的端部和底层片521之间存在形成通道515的间隙。间隙的尺寸确定为防止类器官能够通过通道515迁移至供应孔512中。在各种非限制性示例中，间隙可以是约25微米至约4毫米高。

图8示出了由共用侧壁519的端部和底层片521的顶表面之间的间隙形成的通道515的示例的详细图。在各种示例中，共用侧壁519的端部可以包括在供应孔512和培养孔509之间的斜表面。如所讨论的，通道515在连接孔之间提供开口，以允许介质的灌注流动，从而从供应孔512中的介质向培养孔509中的组织培养物提供营养物，并且从培养孔509中移除潜在有毒副产物。

根据各种示例，供应孔512和培养孔509之间的通道515可以包括微通道。图9和图10示出了根据各种实施例的微通道的示例性构造。特别地，图9示出了具有浅微通道900(例如，900a、900b、900c)的示例性通道515的截面图的示例，其中，每个浅微通道900的宽度大于每个浅微通道900的高度。根据各种实施例，浅微通道900的宽度可以在25μm至约200μm宽的范围内。在各种非限制性示例中，浅微通道900的高度可以在约25μm至约200μm高的范围内。在其它非限制性示例中，浅微通道900的高度可以延伸供应孔512和培养孔509的一个或多个相对应壁的高度。在一些示例中，可以理解的是，包括一个或多个细胞的水凝胶可以被引入培养孔509中，并且可以填充孔的底部，并且流入孔连接部或浅微通道900中。

现在转至图10，示出了具有竖直微通道1000(例如，1000a、1000b、1000c)的示例性通道515的截面图的示例，该竖直微通道的高度大于每个竖直微通道1000的宽度。通道515通过分隔壁被分成多个微通道1000。根据各种实施例，竖直微通道1000的高度可以高达约100μm高。竖直微通道1000的宽度可以高达约50μm宽。在一些示例中，可以理解的是，当将包括一个或多个细胞的水凝胶引入给定培养孔509中时，水凝胶可以填充孔连接部或竖直微通道1000。

转至图11至图14，示出了根据本公开的各种实施例的测定微孔板500b的示例性视图。特别地，图11示出了测定微孔板500b的截面图，示出了将培养孔509与供应孔512流体连接的通道515。图11的测定微孔板500b示出了图7的测定微孔板500a的通道构造的可替代通道构造。

如图11和图13所示，培养孔509和供应孔512的共用侧壁519短于培养孔509和供应孔512的剩余侧壁。特别地，共用侧壁519不延伸至由底层片521形成的培养孔509和供应孔512的底表面。这样，在共用侧壁519的端部和底层片521之间存在形成通道515的间隙。间隙的尺寸确定为防止类器官能够迁移至供应孔512中。在各种非限制性示例中，间隙可以是约25μm至约200μm高。在其它非限制性示例中，间隙的高度可以延伸供应孔512和培养孔509的一个或多个相对应壁的高度。

与图7的测定微孔板500a相比，图11的测定微孔板500b包括与共用侧壁519平行的阻隔壁1100，该阻隔壁1100远离底层片521朝向孔板506的顶表面竖直延伸。在培养孔509和供应孔512之间提供流体连接的测定微孔板500b的通道515由共用侧壁519和培养孔509和供应孔512的底表面之间的间隙以及在阻隔壁1100和共用侧壁519之间形成的空间形成。如图13所示，在各种实施例中，沉积在培养孔509中的水凝胶1300可以流入供应孔512的一部分直到阻隔壁1100，从而防止水凝胶1300完全沉积至供应孔512中。

可以理解的是，图11A示出了图11的测定微孔板500b的放大视图的示例，并且示出了响应于测定微孔板500b的倾斜而使液体在培养孔509与供应孔512之间重力流动的示例。特别地，引入供应孔512的液体可以越过阻隔壁1100并且流入由共用侧壁519和底层片521形成的通道515中。同样，可以理解的是，培养孔509中的液体可以流过通道515并越过阻隔壁1100进入供应孔512。应当注意的是，虽然在图11至图13中将阻隔壁1100描述为定位在共用侧壁519的供应孔侧，但是在各种实施例中，阻隔壁1100可以定位在共用侧壁519的培养孔侧。

图12示出了测定微孔板500b的可灌注单元503的顶视图的示例。如图9和图10中所述，形成在测定微孔板500中的通道515可以包括微通道。在图12的示例中，通道515的由阻隔壁1100和共用侧壁519之间的空间形成的部分可以包括微通道1103，该微通道1103可以用于防止胚状体迁移至相邻孔中。在一些示例中，可以理解的是，通道515的由共用侧壁519和底层片521之间的间隙形成的部分可以包括浅微通道900或竖直微通道1000。

现在转向图14，可以理解的是，示出了测定微孔板500的顶视图的另一示例。特别地，图14示出示例性构造1400(例如，1400a、1400b、1400c、1400d、1400e、1400f)，其中多个可灌注单元503(例如，4、6、8、10、12个等)可以流体连接以允许经由多个可灌注单元503之间的重力流来交换介质。特别地，图14示出了如何可以将测定微孔板500构造成提供多种不同构造，在这些多种不同构造中，液体可以从埋在不同可灌注单元503内的环境中的多种不同的类器官或组织培养物交换。

例如，在一些实施例中，给定构造1400中的每个供应孔512和培养孔509可以包括在两个以上侧壁上的两个以上通道515，以允许流体流过不同可灌注单元503。换言之，不同可灌注单元503可以经由相邻可灌注单元503的供应孔512和培养孔509之间的通道515而彼此流体连接。这样，如果在具有两个连接的可灌注单元503的构造(例如，构造1400a)中的可灌注单元503的第一培养孔509包括第一类型的胚状体，并且在相同构造中的可灌注单元503的第二培养孔509包括第二类型的胚状体，则在两个胚状体之间交换相同流体。

接下来参照图15至图18B，示出了如何可以将微孔板系统的不同微孔板100、300、500彼此互连以便将一个或多个细胞从一个微孔板中的孔转移至另一个微孔板的孔中的示例。图15示出与组合微孔板300配合的起始微孔板100的透视图，并且图16示出与组合微孔板300配合的起始微孔板100的截面图。如关于图1和图3所述的，在一个实施例中，微孔板的试剂盒或系统包括与组合微孔板300(图3)兼容的起始微孔板100，以有助于将一个或多个细胞、胚状体、类器官或其它生物物质从起始微孔板100转移至组合微孔板300。在各种实施例中，微孔板500上的可灌注单元503的培养孔509(或供应孔512)的定位与组合微孔板300上的组合板孔303的定位成镜像，从而允许组合板孔303中的各个孔与可灌注单元503的培养孔509(或供应孔512)的相对应孔配合。如图15和图16所示，通过将起始微孔板100的配合套环112插入至组合板300的相对应组合板孔303中，使起始微孔板100与组合微孔板300配合。

例如，在一些实施例中，起始微孔板100可以倒置并且定位在组合微孔板300上，以允许起始微孔板100的起始板孔106与组合微孔板300的相对应组合板孔303接合或者以其它方式互连。

特别地，起始微孔板100的配合套环112布置在组合微孔板300的配合套环312内并且与该组合微孔板300的配合套环312接合。在各种示例中，起始微孔板100的配合套环112与组合微孔板300的配合套环312接合，以产生过盈配合，该过盈配合有助于将一个或多个细胞以及任何相关联液体从起始微孔板100的孔106无泄漏转移至组合微孔板的相对应孔106中。起始微孔板100与组合微孔板300的接合可以手动执行或者通过使用自动化系统、子系统或部件(诸如图25所示的机器人装置2500)来执行。

图17示出了与测定微孔板500配合的组合微孔板300的透视图。图18A示出了与测定微孔板500a配合的组合微孔板300的截面图，并且图18B示出了与测定微孔板500b配合的组合微孔板300的截面图。如关于图3和图5所述的，组合微孔板300与微孔板系统的测定微孔板500(图5)兼容，以有助于将一个或多个细胞从组合微孔板300转移至测定微孔板500。

如图17至图18B所示，组合微孔板300包括从组合微孔板300的组合板孔303延伸的配合套环312，该配合套环312的尺寸和形状确定为与测定微孔板500的可灌注单元503(图5)的相对应孔接合或以其它方式互连。根据各种示例，微孔板500上的可灌注单元503的培养孔509(或供应孔512)的定位与组合微孔板300上的组合板孔303的定位成镜像，从而允许组合板孔303中的相应组合板孔与可灌注单元503的培养孔509(或供应孔512)的相对应孔配合。此外，由于组合板300与起始微孔板100和测定微孔板500均兼容，因此在各种实施例中，起始板孔106定位成与测定微孔板500的培养孔509(或供应孔512)的构造相似。

在各种实施例中，组合板孔303各自包括相应配合套环312，该配合套环312远离孔板309的顶表面延伸，从而将相对应组合板孔303的孔口306定位在孔板309的顶表面上方。组合微孔板300的孔303的配合套环312的尺寸和形状确定为配合在测定微孔板500的孔口内或以其它方式与该在测定微孔板500的孔口配合。在各种实施例中，配合套环312的尺寸和配合确定为与测定微孔板500的相对应可灌注单元503形成过盈配合，以有助于无泄漏转移一个或多个细胞以及包括在相应组合板孔303中的任何相关联液体。根据各种实施例，组合微孔板300和测定微孔板500的配合可以手动执行或通过使用自动化系统、子系统或部件(诸如图25中所示的机器人装置2500)来执行。

现在转至图19至图23B，示出了根据本公开的各种实施例的微孔板系统可以如何用于关于胚状体、融合胚状体、球状体、类器官和/或其它多细胞体的生长和培养的示例。从图19开始，示出了与使用根据本公开的各种实施例的起始微孔板100来产生胚状体1903相关的示例性时间序列。为了说明目的，图19描绘了单个起始微孔板100的相邻孔1900a至1900d中的时间增量序列。在实验室应用中，在单个起始微孔板的各个孔中产生胚状体1903的各阶段可以基本相似(例如，可以在起始微孔板100的一个或多个孔中以基本平行的时间序列产生胚状体)。首先，如在时间增量1900a处所示的，包括一个或多个细胞的细胞悬浮液1901存在于起始微孔板100的起始孔106中。这些细胞可以包括干细胞(例如亚全能干细胞)、支持细胞等。可以通过任何合适的技术将细胞沉积在水凝胶/水凝胶支架中，该技术包括生物油墨液滴印刷、微接触印刷、光刻、浸笔式纳米光刻和/或移液等。

如时间增量1900b所示，一旦细胞沉降并且在起始板孔106的底部处形成球体1902，则将交换介质(如箭头E所示)。新介质将包含适当的生长因子以产生期望胚状体。在一些示例中，介质将在培育期期间进行若干次交换以产生期望胚状体。可能合适的示例性生长因子包括血管生成素、骨形态发生蛋白(BMP)、睫状神经营养因子、集落刺激因子、肾上腺素、表皮生长因子、红细胞生成素、成纤维细胞生长因子、胶质衍生神经营养因子、肝细胞生长因子、胰岛素、类胰岛素生长因子、白介素、白血病抑制因子、角质细胞生长因子、神经调节蛋白、神经营养素、血小板衍生生长因子、转化生长因子、肿瘤坏死因子(α)、血管内皮生长因子等。

时间增量1900c示出了在给定培育期后在起始板孔106内产生的胚状体1903。最后，如时间增量1900d所示的，在将胚状体1903转移至组合板300之前，可以移除起始板孔106中的液体L的一部分。

图20至图22示出了根据本公开的各种实施例的可以如何将多个胚状体1903(例如1903a、1903b、1903c)引入相同组合板孔303中的示例。用于产生类器官的一些类型的应用需要使用不同生长因子产生的不同类型胚状体1903。这样，不同胚状体1903可以在不同起始微孔板100中产生，然后通过将不同起始微孔板100s与相同组合板300配合而转移至组合板的相同组合板孔303中。

图20示出了与组合板300配合的起始微孔板100a的示例性截面图，以允许将在起始微孔板100ba的起始板孔106a中产生的胚状体1903a转移至组合板300的组合板孔303中。图20示出了底部上的组合板300和组合板300顶部上的起始微孔板100a的组合，以允许胚状体1903转移至组合板300的组合板孔303中。

图21示出了与组合板300配合的起始微孔板100b的示例性截面图，以允许将在起始微孔板100b的起始板孔106b中产生的胚状体1903b转移至组合板300的组合板孔303中。在本示例中，胚状体1903a已经转移至组合板300的组合板孔303中。与图20相似，图21示出了在底部上的组合板300和在组合板300的顶部上的起始微孔板100b，以允许胚状体1903b转移至组合板300的容纳有胚状体1903a的组合板孔303中。

图22示出了与组合板300配合的起始微孔板100c的示例性截面图，以允许在起始微孔板100c的起始板孔106c中产生的胚状体1903c转移至组合板300的组合板孔303中。在本示例中，胚状体1903a、1903b已经转移至组合板300的组合板孔303中。图22示出了在底部上的组合板300和在组合板300的顶部上的起始微孔板100c，以允许胚状体1903c转移至组合板300的容纳有胚状体1903a、1903b的组合板孔303中。

在各种实施例中，在板操作期间，表面张力可以使液体和胚状体1903在起始板孔106中保持就位，使得起始板100可以相对于重力(引力)倒置或以一些其它方式定向。这样，可以将额外能量或物理搅动施加至板的配合布置，以使胚状体1903从起始板孔106释放，从而允许胚状体1903落入组合板孔303中。可以理解的是，额外能量或搅动可以是超声脉冲、机械脉冲、离心机中的旋转和/或其它类型的能量应用的形式。

可以理解的是，被引入组合板300的组合板孔303中的一个或多个细胞或胚状体1903可以在培育期间保留在组合板300中，以允许胚状体1903彼此融合并且根据期望生长。在该培育期间，可以将一个或多个生长因子以液体介质的形式引入组合微孔板300的孔303中。在一些实施例中，可以理解的是，胚状体1903可以埋入被引入组合板孔303中的水凝胶1300中。在其它示例中，在胚状体1903转移至测定微孔板500时该胚状体1903埋入水凝胶中。在一些示例中，胚状体1903可以不埋入水凝胶中。在培育期完成后，根据本公开的各种示例，胚状体1903可以转移至测定微孔板500。

图23A和图23B示出了根据本公开的各种实施例的胚状体1903如何可以引入测定微孔板500的可灌注单元503的培养孔509中的示例。如图23A和图23B所示，组合板300与测定微孔板500配合。图23A示出了与组合板孔300一起布置的液体和胚状体1903。如图23A所示，在板操作期间，诸如当起始板100相对于重力倒置或以一些其它方式定向时，表面张力可以将液体在组合板孔303中(围绕胚状体1903)保持就位。这样，如图23B所示，可以将额外能量或物理搅动施加至板的配合布置，以使胚状体1903从组合板孔303释放，从而允许胚状体1903落入测定微孔板500的相对应培养孔509中并且落至水凝胶1300上。额外能量或搅动可以是超声脉冲、机械脉冲、离心机中的旋转和/或可以理解的其它类型的能量应用的形式。

图24示出了根据本公开的各种实施例的布置在倾斜装置2400上的测定微孔板500的示例。根据各种示例，测定微孔板500可以置于倾斜装置2400的其它平坦表面的平台2403上。倾斜装置2400可以构造成使平台2403绕轴线摇摆或以其它方式倾斜，从而使测定微孔板500的一侧相对于测定微孔板500的相对侧的高度升高，并且有助于流体从可灌注单元503的供应孔512流至培养孔509，或反之亦然。倾斜装置2400可以包括常规倾斜系统，并且可以是手动或自动的。

现在转至图25，示出了根据本公开的各种示例的可以如何使用自动化系统、子系统或部件将微孔板系统的各种微孔板彼此配合的示例。特别地，图25示出了经由使用机器人装置2500将组合板300定位在测定微孔板500上方的示例。机器人装置2500可以构造成在物理空间中将根据本公开的一个或多个微孔板从一个位置平移至另一位置。根据各种示例，机器人装置2500可以在接收板(例如，测定微孔板500)上方操纵或以其它方式倒置转移板(例如，组合微孔板300)，然后根据上文所述的本公开的实施例使倒置的转移板与接收板配合。可以理解的是，尽管图25示出了使用机器人装置2500将组合板300配合至测定微孔板500，但是可以使用自动化系统、子系统或部件将起始微孔板100配合至组合板300。换言之，机器人装置2500可以用于将上述相应微孔板中的任意一个与如本文所述的微孔板中的相应其它微孔板配合。

可以理解的是，在各种示例中，机器人装置2500可以包括致动器或声波换能器，该致动器或声波换能器构造成将超声波或机械脉冲施加至定位在接收微孔板上方的转移微孔板，以使转移板的孔中的表面张力释放，以允许胚状体转移至接收板中。例如，一旦机器人装置2500实现转移板与接收板的适当对准和配合，机器人装置2500则可以将超声脉冲施加至转移板或两个配合的板以使细胞转移，从而使手动干预和操纵的需求最小化。

细胞

根据本公开的细胞可以包括干细胞(例如，亚全能干细胞)、支持细胞等。

根据本公开的细胞可以是哺乳动物细胞，特别是人、大鼠或小鼠细胞。细胞可以包括本领域技术人员已知的通常用于研究的各种永生化细胞系或原代细胞系(例如，HUVEC)。根据本公开的细胞可以是亚全能或多能干细胞(例如但不旨在局限于，胚胎干细胞、诱导亚全能干细胞或间充质干细胞)。在实施例中，根据本公开的干细胞可以是通过诸如或本领域已知的其它商业公司的渠道使技术人员可商购获得的小鼠干细胞或人干细胞。根据本公开的干细胞还可以是通过使用者利用根据本领域的任何数量的重编程方法和/或试剂盒从原代细胞源进行重编程的人、小鼠或大鼠(或另一种生物体)干细胞。

支持细胞可以是已知用于例如支持干细胞培养的那些支持细胞。在不旨在限制的情况下，这种细胞可以包括小鼠胚胎成纤维细胞、诱导亚全能干细胞(iPSC)系、胚胎干细胞系(例如，E5、E7等)、患者衍生类器官(例如，肠、肝、Ipsc衍生类器官等)、球状体、胚状体、类瘤异种移植物、各种生物体(例如，果蝇、斑马鱼等)或本领域已知的细胞。

可以使用本领域已知的标准介质和技术(例如，介质包括DMEM(Dulbecco’smodified eagle medium)、干细胞介质、mTeSR^TM或其变体、胎牛血清、以及小鼠iPSC的白血病抑制因子)来进行不同培养阶段的各种细胞/细胞体的培养。本领域同样已知和描述有干细胞分化成内胚层、外胚层和中胚层谱系的原代细胞，并且可以根据本公开的方法使用。

水凝胶/支架

水凝胶和/或支架可以用于本文所述的微孔板、系统、试剂盒和方法中，以有助于本文所述的细胞体的3D培养、生长和测定。

在实施例中，本文所述的水凝胶或支架可以包括(由Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物；/>Life Sciences)。在其它方面，本文所述的水凝胶或支架可以包括一种或多种细胞外基质组分，例如胶原蛋白或纤连蛋白、生物墨水、明胶、/>纤维素基水凝胶、或其它可以理解的水凝胶或支架。在一些示例中，可以使用无支架溶液。

方法

本文描述了组织培养的方法，特别是使用本文所述微孔板的3D组织培养的方法。图26示出根据各种实施例的与本公开的微孔板系统的使用相关的示例性方法。

在操作2603处，可以在细胞生长介质存在的情况下，在起始板的一个或多个孔中培养一个或多个细胞一段时间，以便在起始板的一个或多个孔中形成一个或多个球状体和/或胚状体。

在操作2606处，在确定起始板100中球状体/胚状体生长的期望阶段后，可以将一个或多个球状体和/或胚状体转移至组合板300。组合板可以在一个或多个孔303中包括一个或多个球状体和/或胚状体，该一个或多个孔303与起始板100中的存在细胞的一个或多个孔303相对应。可以通过以下方式来促进(有助于)该转移：通过将起始板100和组合板300配合在一起，并且相对于组合板300倒置起始板100，使得通过重力驱动的流体流将起始板100的一个或多个孔303中的细胞体转移至组合板300。例如，倒置的起始微孔板100的起始孔106的阵列可以与非倒置的组合微孔板300的组合孔103的阵列对准，并且配合套环112、312可以彼此接合以使板彼此配合。在一些实施例中，通过搅动配合的板中的一个或多个，还可以有助于将细胞体从一个板转移至另一板。这种搅动可以为手动地(例如，通过使用者将配合的板从一侧向另一侧摇动)，或者可以通过倾斜或摇摆装置2400和/或其它设备(例如，将超声能量施加至配合的板中的一个或多个的超声波发生器)来完成。

在操作2609处，在转移后，可以开始组合板300中的培养，使得一个或多个孔中的组合细胞体可以融合在一起，或通过某种期望方式使组合细胞体的发育进展至期望点。

在操作2612处，在培养的第二期望阶段，然后可以将融合细胞体或以其它方式发育的细胞体从组合板300的一个或多个相应孔303转移至测定板500的一个或多个相应孔509、512。可以通过以下方式来促进这种转移：通过将结合板300和测定板500配合在一起，并且相对于测定板500倒置结合板300，使得通过重力驱动的流动将流体流驱动至测定板500的一个或多个相应孔509、512中。在一些实施例中，还可以通过搅动配合的板中的一个或多个来促进将细胞体从一个板转移至另一板。这种搅动可以手动完成(例如，通过使用者将配合的板从一侧向另一侧摇动)，或者可以利用设备(例如将超声能量施加至配合的板中的一个或多个的超声波发生器)来完成。

在实施例中，可以通过被动方式(诸如在如果细胞体的密度允许的情况下，则由于重力下落)或例如通过移液(例如，手动或机器人)或本领域已知的其它合适设备/方法将细胞体埋入水凝胶中的主动处置，将细胞体埋入布置在测定板500的孔的底部中的水凝胶中。在不旨在限制的情况下，在水凝胶/支架中沉积或以其它方式埋入细胞体的其它合适方法还可以包括生物油墨液滴印刷、微接触印刷、光刻、浸笔式纳米光刻和/或移液等。

在操作2615处，在埋入测定板500的可灌注单元的生长孔509中的水凝胶后，可以通过驱动穿过测定板500的可灌注单元503的微通道和/或间隙的流体流将具有新鲜营养物(葡萄糖、氨基酸、生长因子、激素等)的新鲜介质从供应孔512输送至培养孔509。可以通过以下方式来进一步促进这种流体流动：通过在使用者期望的时间段内以使用者期望的时间间隔来手动倾斜板，或者通过诸如通过将测定板500置于自动倾斜或摇摆装置2400(该自动倾斜或摇摆装置2400可以存在或不存在于组织培养箱中)上的其它方法。此后，可以继续完成开发或实验处理。

在本文所述方法的另外实施例中，通过搅动配合的板中的一个或多个，可以进一步促进细胞体从一个板转移至另一板(例如起始板到组合板、组合板到测定板、或起始板到测定板)。这种搅动可以为手动地(例如，通过使用者将配合的板从一侧向另一侧摇动)，或者可以利用设备(例如将超声能量施加至配合的板中的一个或多个的超声波发生器)来完成。

在实施例中，根据本公开的方法利用干细胞，在起始板中的培养可以包括利用典型试剂的典型培养方案以维持亚全能性或多能性。可以根据利用本领域已知试剂的本领域已知方案，在起始板和/或组合板中开始朝向胚状体、融合胚状体、球状体、类器官和/或其它多细胞体的分化。这种分化方案和试剂为本领域已知的，并且由于是本领域技术人员的普通知识所以在此处省略。

根据本公开的方法的实施例，可以根据利用本领域已知试剂的本领域已知方案在起始板或组合板中培养亚全能或多能细胞，以形成胚状体。在胚状体形成后，可以使用细胞外诱因来触发细胞体朝向类器官分化，或者细胞体可以在分化前与其它细胞体融合。这种分化可以发生在起始板、组合板和/或测定板中。在某些方面，胚状体可以埋入测定板的水凝胶/支架中，然后朝向类器官分化至测定板中，或者可以在其它板中发生从胚状体到类器官的转变，其中仅最终类器官埋入测定板的水凝胶中。

干细胞的发育阶段，从干细胞培养和维持，到胚状体形成，再到分化成类器官，可以发生于从起始板到组合板到测定板，或步骤/板的其它组合/排列。

系统

本文还描述了系统。根据本公开的系统可以包括如本文所述的两种以上类型的微孔板100、300、500。根据本公开的系统可以包括如本文所述的三种类型的微孔板100、300、500。

如本文所述的系统还可以包括摇摆或倾斜装置2400。这种装置可以具有平坦表面，该平坦表面构造成接收如本文所述的微孔板，该微孔板与可以绕轴线“倾斜”微孔板的电机可操作连接，从而使一侧相对于相对侧的高度升高，并且促进流体从可灌注单元503的供应孔512流动至培养孔509，或反之亦然。

如本文所述的系统还可以包括机器人装置2500，该机器人装置2500构造成在物理空间中将根据本公开的一个或多个微孔板从一个位置平移至另一位置。如本文所述的机器人装置2500还可以构造成相对于第二微孔板倒置微孔板，并且将两个板配合在一起。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。还应将理解的是，诸如在常用词典中定义的那些术语应当解释为具有的含义与该术语在说明书和相关领域的上下文中的含义一致，并且除非在本文明确定义，否则不应当以理想化或过于正式的意义来解释。

如本文所用，术语“约”、“近似”、“在或约”和“基本”是指所讨论的量或值可以是如权利要求中所述或本文教导的提供等同结果或效果的精确值或值。即，应当理解的是，量、尺寸、配方、参数以及其它量和特性不是并且不需要是精确的，而是可以根据需要为近似和/或更大或更小，反映出公差、转换系数、四舍五入、测量误差等以及本领域技术人员已知的其它因素，使得获得等同的结果或效果。在一些情况下，无法合理确定提供等同结果或效果的值。在这种情况下，通常理解的是，如本文所用的，除非另外指明或推断，否则“约”和“在或约”是指所指示标称值为指定值的±20％、±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％或±5％，例如，约1”是指0.8”至1.2”、0.8”至1.15”、0.9”至1.1”、0.91”至1.09”、0.92”至1.08”、0.93”至1.07”、0.94”至1.06”、或0.95”至1.05”的范围。应当理解的是，除非另外具体说明，否则当在数量值之前使用“约”、“近似”或“在或约”时，参数还包括具体数量值本身。

任何比率、浓度、量和其它数值数据可以在本文中以范围格式表示。为了方便和简洁而使用这种范围格式，因此，应该以灵活的方式解释为不仅包括明确列举为范围界限的数值，而且包括该范围内包含的所有单个数值或子范围，如同明确列举每个数值和子范围。为了说明，“约0.1％至约5％”的浓度范围应解释为不仅包括明确列举的约0.1wt％至约5wt％的浓度，而且包括在所示范围内的单个浓度(例如，1％、2％、3％和4％)和子范围(例如，0.5％、1.1％、2.2％、3.3％和4.4％)。在所述范围包括一个或两个限值的情况下，本公开中同样包括排除这些所包括限值中的一个或两个的范围，例如，短语“x至y”包括从‘x’至‘y’的范围以及大于‘x’并且小于‘y’的范围。该范围还可以表示为上限，例如‘约x、y、z以下’，并且应当解释为包括‘约x’、‘约y’和‘约z’的具体范围以及‘小于x’、‘小于y’和‘小于z’的范围。同样，短语‘x、y、z以上’应解释为包括‘约x’、‘约y’和‘约z’的特定范围以及‘大于x’、‘大于y’和‘大于z’的范围。在一些方面，术语“约”可以包括根据数值的有效数字的传统舍入。另外，短语“约‘x’至‘y’”包括“约‘x’至约‘y’”。

术语“基本”是指允许与描述性术语的偏差，该偏差不会对预期目的产生负面影响。本文所用的所有描述性术语隐含理解为由词语“基本”修饰，即使描述性术语未由词语“基本”明确修饰。

尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料同样可用于本公开的实践或测试，但现在描述适用于本文所公开的各种方法和材料。为了简洁和/或清楚，可能不详细描述本领域公知的功能或结构。

除非另外具体说明，否则诸如短语“X、Y或Z中的至少一个”等析取语言应与上下文一起理解，该上下文通常用于呈现项、术语等可以是X、Y或Z或其任何组合(例如，X、Y和/或Z)。因此，这种析取语言通常不旨在并且不应当暗示某些实施例需要分别存在X中的至少一个、Y中的至少一个或Z中的至少一个。

应当强调的是，本公开的上述实施例仅仅是为了清楚理解本公开的原理而阐述的实施方式的可能示例。在基本不偏离本公开的精神和原理的情况下，可以对上述一个或多个实施例进行许多变化和变型。所有这些变型和变化旨在包括在本公开的范围内并且由所附权利要求保护。

Claims (20)

1.一种用于生长类器官的组织培养试剂盒，所述组织培养试剂盒包括：

组合板，所述组合板包括孔阵列；以及

测定板，所述测定板包括可灌注单元阵列，每个可灌注单元包括彼此流体连接的相应培养孔和相应供应孔，所述可灌注单元阵列的定位与所述组合板的所述孔阵列的定位成镜像，从而允许所述可灌注单元阵列中的相应可灌注单元与所述组合板的所述孔阵列配合。

2.根据权利要求1所述的组织培养试剂盒，其中，所述孔阵列包括第一孔阵列，并且所述组织培养试剂盒还包括：

起始板，所述起始板包括第二孔阵列，所述起始板的所述第二孔阵列的定位与所述组合板的所述第一孔阵列的定位成镜像，从而允许所述第一孔阵列中的相应孔与所述第二孔阵列中的相应孔配合。

3.根据权利要求2所述的组织培养试剂盒，其中，所述起始板的所述第二孔阵列的各个孔包括相应起始板配合套环，所述相应起始板配合套环的尺寸和形状确定为与所述第一孔阵列的各个孔的相应组合板配合套环形成过盈配合。

4.根据权利要求3所述的组织培养试剂盒，其中，所述相应起始板配合套环的尺寸小于所述相应组合板配合套环的尺寸。

5.根据权利要求2所述的组织培养试剂盒，其中，所述起始板与所述组合板配合以允许将一个或多个细胞从所述第一孔阵列中的相应孔转移至所述第二孔阵列中的相对应孔。

6.根据权利要求1所述的组织培养试剂盒，其中，所述孔阵列中的各个孔包括相应组合板配合套环，所述组合板配合套环的尺寸和形状确定为与所述可灌注单元阵列中的相应可灌注单元的相应孔的相应第三开口产生过盈配合。

7.根据权利要求1所述的组织培养试剂盒，其中，所述组合板与所述测定板配合以允许将一个或多个细胞从所述孔阵列的相对应孔转移至所述测定板的相应培养孔中。

8.根据权利要求1所述的组织培养试剂盒，其中，所述组合板和所述测定板各自包括相应对准销和相应对准接收孔。

9.根据权利要求1所述的组织培养试剂盒，其中，所述组合板在与所述测定板互连时相对于所述测定板倒置。

10.根据权利要求1所述的组织培养试剂盒，其中，所述测定板还包括形成所述可灌注单元阵列的底表面的光学透明观察表面。

11.根据权利要求10所述的组织培养试剂盒，其中，所述光学透明观察表面为透气的。

12.一种用于在组织培养板之间转移一个或多个细胞的方法，所述方法包括：

将倒置的具有第一孔阵列的第一板对准在非倒置的具有第二孔阵列的第二板上，所述一个或多个细胞包括在所述第一孔阵列的至少一个孔中；

通过将倒置的所述第一板的所述第一孔阵列与非倒置的所述第二板的所述第二孔阵列互连，使倒置的所述第一板与非倒置的所述第二板配合；以及

搅动配合的板以将所述第一孔阵列的所述至少一个孔中包括的所述一个或多个细胞转移至所述第二孔阵列的相对应至少一个孔中。

13.根据权利要求12所述的方法，还包括：

将所述第一板中的所述一个或多个细胞在生长介质中培养第一培育期；以及

在所述第一培育期后倒置所述第一板。

14.根据权利要求12所述的方法，其中，搅动所述配合的板包括将超声脉冲施加至所述第一板，以使所述至少一个孔中的所述一个或多个细胞落入所述第二板的所述相对应至少一个孔中。

15.根据权利要求12所述的方法，其中，还包括在使所述第一孔阵列与所述第二孔阵列配合之前，将水凝胶添加至所述第二孔阵列的所述至少一个孔。

16.根据权利要求12所述的方法，其中，所述第二板的所述至少一个孔包括至少一个其它细胞，将所述第一板的所述至少一个孔中的所述一个或多个细胞转移至所述第二板的所述至少一个孔中，以与所述至少一个其它细胞形成至少一个类器官。

17.根据权利要求12所述的方法，还包括：

将所述第二板的所述第二孔中的所述一个或多个细胞培养第二培育时间；

将所述第二板倒置；

将所述第二板与非倒置的第三板配合；以及

搅动配合的所述第二板和非倒置的所述第三板，以将所述一个或多个细胞从所述第二板的所述至少一个孔转移至非倒置的所述第三板的至少一个培养孔中。

18.一种用于培养类器官的测定板，所述测定板包括：

孔板，所述孔板包括可灌注单元阵列，单个可灌注单元包括经由至少一个通道与供应孔流体连接的培养孔，所述至少一个通道的尺寸和形状确定为允许通过所述至少一个通道使液体在所述培养孔和所述供应孔之间重力流动；以及

底层片，所述底层片布置在所述孔板的下侧上，形成用于所述可灌注单元阵列的底层。

19.根据权利要求18所述的测定板，其中，所述底层片包括光学透明观察窗。

20.根据权利要求18所述的测定板，其中，所述底层片为透气的，从而允许氧气流至在所述可灌注单元的一个或多个中生长的细胞聚集体。