CN116594167A - 大视场高分辨光片照明成像系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大视场高分辨光片照明成像系统，包括：光源模块(S1)、第一调制模块(S2)、第一扫描模块(S3)、第二调制模块(S4)、第二扫描模块(S5)、激发模块(S6)以及探测模块(S7)。本发明提供了一种能保持亚细胞级分辨率、能有效要拓展光片照明视场至数个mm量级的大视场高分辨光片照明成像系统，本发明利用双折射晶体与位相调制技术，产生多束光，并利用空间光调制器对多光束独立操控，能实现物镜焦平面附近样本空间一次性数个毫米的大视场成像，可保持均匀的高轴向分辨率的同时显著拓展了成像视场，本发明能够为大尺度生物样本高分辨、高通量三维成像提供了技术基础。
Description
技术领域
本发明涉及光学显微成像技术领域，特别涉及一种大视场高分辨光片照明成像系统。
背景技术
生命个体是一个复杂的有机体。对生命个体的认知和了解，不仅仅需要对生物个体生命活动中的不同区域信息反应过程进行观察，还需要对特别区域进行细微高分辨记录。特别是脑科学成像，需要对全脑的神经元结构图谱进行绘制，更需要对跨越数个毫米甚至厘米量级的不同区域的神经元信号动态进行追踪成像。这就对观察的工具提出了大视野、高分辨、高通量、低损伤的要求。光片显微镜因此诞生。光片显微镜采用薄片激光去激发标记有荧光标记的样品，并在垂直光片端进行荧光探测成像。光片扫描显微镜由于具有高速三维层析成像，光损伤低等优点被广泛应用于透明生物样本的三维成像。然而由于光学显微镜视场和分辨率在光学原理上矛盾，亚细胞分辨率(1～5微米左右)视场很难超过1毫米。为了保持分辨率的同时增大照明视场，最常见的方法是将生物样本固定在二维位移台上，对特定小区域照明激发荧光成像后，移动样品，多次成像，最后将所成图像拼接还原得到大视场图像。这种方法的缺点是速度慢，拼接容易要求精度高，非常不利于高通量成像。
为了保持较高的轴向分辨率增大视场，近年来一些方法被提出来。文章(Takanezawa,S.,Saitou,T.&Imamura,T.Wide field light-sheet microscopy withlens-axicon controlled two-photon Bessel beam illumination.Nat Commun12,2979(2021))通过可变轴锥镜产生Bessel光束，并优化光传输效率，并结合双光子非线性荧光成像，实现600～1000um视场，轴向分辨率2～3um照明成像。其采用无衍射Bessel光束，产生许多旁瓣，每个旁瓣几乎分到的能量相等，虽然双光子非线性激发能有效抑制旁瓣的荧光效应影响，但是主瓣能量密度低，很难以再继续增大视场。
另一种解决大视场和轴向分辨率矛盾的方法是利用空间光调制器，在一个相机的曝光时间内，切换位相，实现小视场光片的分时拼接。能够实现较高的轴向分辨率提升视场(Gao L.Extend the field of view of selective plan illumination microscopy bytiling the excitation light sheet[J].Optics express,2015,23(5):6102-6111.)。其在0.35数值孔径的物镜下进行三次拼接，实现保持轴向分辨率0.85um视场从9.4um提升到28um,提升了三倍。一个大视野的成像，需要多次调节光片的位置，不同区域的光片激发仍然是分时进行，对生物活动反应观测的时间分辨率受限于空间光调制器的响应速度。对于确定的空间光调制器，大视场与高时空分辩成像是一个矛盾。
更换更高响应速度光束调控器件，可在一定程度上缓解上述矛盾。可调谐声学梯度折射率元件响应速度快(可达450千赫兹)，文章(Zong W,Zhao J,Chen X,et al.Large-field high-resolution two-photon digital scanned light-sheet microscopy[J].Cell research,2015,25(2):254-257.)，利用可调谐声学梯度折射率元件(TAG)轴向变焦，快速改变光束聚焦的焦平面位置，结合双光子激发，在保持2～3um的轴向分辨率下，能够快速获得50～500um可调谐成像视场，缓解了视场和高时空分辨率问题，但未能从根本上解决上述问题，并且可调谐声学梯度折射率元件屈光能力有限，难以获得更大的变焦范围实现得更大视场照明。
Voigt F F,Kirschenbaum D,Platonova E,et al.The mesoSPIM initiative:open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue[J].Naturemethods,2019,16(11):1105-1108.，利用mesoSPIM光片显微镜结合透明化技术，实现了2.8mm～28mm视场，轴向分辨率6.5um的成像。他们采用变焦透镜(ETL)，轴向移动光片焦平面，并只让相机相应的行像素曝光，实现大范围的高分辨成像。这种方法本质上，仍然是单次小视场成像，再利用单帧多次拼接，同样存在着上述的拼接的问题，另外变焦透镜线性响应速度慢，里面的液晶体容易受重力影响，变得不稳定导致较大的像差。
目前增大视场的方法主要可以分为以下几种方法：
1.扫描无衍射光束产生光片照明技术。这种无衍射光束包括Bessel光束和Airy光束，增大视场的同时必然导致旁瓣增加，更多的激光能量从主瓣转到旁瓣上。以Bessel光束光片为例，可以计算出旁瓣范围近似与Bessel光束长度(有效光片视场)成正比(Liang,Gao.Optimization of the excitation light sheet in selective planeillumination microscopy.[J].Biomedical optics express,2015.)。Bessel光片的有效视场由Bessel光束主瓣有效长度定义。由于Bessel光束能量每个瓣所带能量近似相等，意味着在光片厚度(决定光片显微镜轴向分辨率的主要参数)一定下，视场扩大N倍，旁瓣范围扩大N倍，主瓣能量减小N倍。单光子成像模式下，多的旁瓣会激发非焦平面荧光，不仅影响成像对比度，降低轴向分辨率，并且增加光毒性。在双光子模式成像模式下，激发的荧光效率与激发光的光强平方成正比，在同等条件下视场增大N倍，荧光强度将减小到原来的N-2，双光子光片的视场难以进一步提高。
2.利用变焦元件，改变光束聚焦的位置，实现更大视场照明。这些变焦元件包括，空间光调制器、可调谐声学梯度折射率元件、变焦透镜等，然而这些元件各自有不足，空间光调制器速度慢；调谐声学梯度折射率元件速度快，但是屈光能力有限；变焦透镜速度和变焦能力居中，但是工作能力不稳定，容易到来像差，这些方法大视场成像，需要后期图像拼接处理，扫描元件的不稳定性直接影响这后期的拼接效果。
综上所述，大视场高轴向分辨的光片显微镜对实时获取大组织生物样品的的动态结构信息具有重要意义。光束的有效长度，决定着光片显微镜的有效成像视场大小，光束厚度决定着光片显微镜的轴向分辨率。然而，目前的方法难以对数个毫米量级视场实时高分辨成像。针对上述问题，本发明提出一项解决的方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种大视场高分辨光片照明成像系统。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种大视场高分辨光片照明成像系统，包括：光源模块、第一调制模块、第一扫描模块、第二调制模块、第二扫描模块、激发模块以及探测模块；
所述光源模块发出的光束被分为两部分：反射部分和透射部分，反射部分进入所述第一调制模块，经过调制后进入所述第一扫描模块，产生的第一扫描光束进入所述激发模块，激发样品产生荧光；透射部分进入所述第二调制模块，经过调制后进入所述第二扫描模块，产生的第二扫描光束进入所述激发模块，激发样品产生荧光；样品被激发发出的荧光经所述探测模块收集成像；
所述第一调制模块和第一扫描模块构成系统的第一通道，所述第二调制模块和第二扫描模块构成系统的第二通道，第一通道输出的第一扫描光束与所述第二通道输出的第二扫描光束以相互垂直的方式进入所述激发模块。
优选的是，所述光源模块包括沿光路依次设置的激光器、准直扩束镜、光阑、半波片、光源双折射晶体、光源D形状半波片和光源分光镜；
所述激光器发出的激光依次经过所述准直扩束镜、光阑、半波片后进入所述光源双折射晶体，被分为两束光：寻常光o(002)和非寻常光e(001)，所述非寻常光e经过所述光源D形状半波片后变成与所述寻常光o平行的水平偏振光e，寻常光o和水平偏振光e射入所述光源分光镜，均被等比例分为透射光束和反射光束：记寻常光o被所述光源分光镜分为透射光o(022)和反射光o(021)，水平偏振光e被所述光源分光镜分为透射光e(012)和反射光e(011)；
反射光o(021)和反射光e(011)进入所述第一调制模块，透射光o(022)和透射光e(012)进入所述第二调制模块。
优选的是，所述第一调制模块包括沿光路依次设置的第一调制反射镜、第一光学相位调制器件、第一空间光调制器、第一透镜、第一调制D形半波片、第一调制双折射晶体和第二透镜；
所述光源模块出射的反射光e(011)和反射光o(021)经所述第一调制反射镜反射后垂直入射至所述第一光学相位调制器件，反射光e被均分为M束，每一束光能量相等，且相邻光束分开角度相等；反射光o也被均分为M束，每一束光能量相等，且相邻光束分开角度相等；从而形成2*M的光束阵列，并入射到所述第一空间光调制器上，所述第一空间光调制器被分成2*M个空间区域，每个空间区域独立对2*M的光束阵列中的对应光束施加相位调控，使得2*M的光束阵列中的每个光束含有唯一编码，获得2*M的调制光束；
所述2*M的调制光束经过所述第一透镜后，调制光束中来源于反射光e的部分进入所述第一调制D形半波片，由水平偏振变成垂直偏振,然后和调制光束中来源于反射光o的部分一起进入所述第一调制双折射晶体，合束为1*M的调制光束，经过第二透镜后进入所述第一扫描模块。
优选的是，所述第一扫描模块包括沿光路依次设置的第一x向扫描振镜、第一扫描透镜、第二扫描透镜、第一Z向扫描振镜、第三扫描透镜和第四扫描透镜；
所述第一调制模块输出的1*M的调制光束入射到所述第一x向扫描振镜上，然后经过所述第一扫描透镜、第二扫描透镜后投射到所述第一Z向扫描振镜上，
所述第一x向扫描振镜沿着x轴扫描光束，所述第一Z向扫描振镜沿着z向扫描光束，所述第一Z向扫描振镜出射的光束依次经过所述第三扫描透镜和第四扫描透镜(套筒透镜)后形成第一扫描光束，并入射到所述激发模块中。
优选的是，所述第二调制模块包括沿光路依次设置第二调制反射镜、第二光学相位调制器件、第二空间光调制器、第三透镜、第二调制D形半波片、第二调制双折射晶体和第四透镜；
所述光源模块出射的透射光o(022)和透射光e(012)经所述第二调制反射镜反射后垂直入射至所述第二光学相位调制器件，透射光e被均分为M束，每一束光能量相等，且相邻光束分开角度相等；透射光o也被均分为M束，每一束光能量相等，且相邻光束分开角度相等；从而形成2*M的光束阵列，并入射到所述第二空间光调制器上，所述第二空间光调制器被分成2*M个空间区域，每个空间区域独立对2*M的光束阵列中的对应光束施加相位调控，使得2*M的光束阵列中的每个光束含有唯一编码，获得2*M的调制光束；
所述2*M的调制光束经过所述第三透镜后，调制光束中来源于透射光e的部分进入所述第二调制D形半波片，由水平偏振变成垂直偏振,然后和调制光束中来源于透射光o的部分一起进入所述第二调制双折射晶体，合束为1*M的调制光束，经过第四透镜后进入所述第二扫描模块。
优选的是，所述第二扫描模块包括沿光路依次设置的、第二x向扫描振镜、第五扫描透镜、第六扫描透镜、第二Z向扫描振镜、第七扫描透镜、扫描反射镜和第八扫描透镜；
所述第二调制模块输出的1*M的调制光束入射到所述第二x向扫描振镜上，然后经过所述第五扫描透镜、第六扫描透镜后投射到所述第二Z向扫描振镜上；
所述第二x向扫描振镜沿着x轴扫描光束，所述第二Z向扫描振镜沿着z向扫描光束，所述第二Z向扫描振镜出射的光束依次经过所述第七扫描透镜、扫描反射镜和第八扫描透镜后形成第二扫描光束，并入射到所述激发模块中。
优选的是，所述激发模块包括激发分光镜，沿所述激发分光镜的第一侧的光路依次设置的第五透镜、第一反射镜、第二反射镜、第三反射镜、第六透镜、第四反射镜和第一激发物镜，以及沿所述激发分光镜的第一侧的光路依次设置的第七透镜、第五反射镜、第八透镜、第六反射镜和第二激发物镜；待测的样品设置在所述第一激发物镜和第二激发物镜之间。
优选的是，所述第一扫描模块输出的第一扫描光束入射到所述激发分光镜后被等分为第一扫描反射光与第一扫描透射光，第一扫描反射光沿所述激发分光镜的第一侧的光路传输，依次经过所述第五透镜、第一反射镜、第二反射镜、第三反射镜、第六透镜、第四反射镜和第一激发物镜后，由所述第一激发物镜将光束会聚到样品的第一侧；
第一扫描透射光沿所述激发分光镜的第二侧的光路传输，依次经过所述第七透镜、第五反射镜、第八透镜、第六反射镜和第二激发物镜后，由所述第二激发物镜将光束会聚到样品的第二侧；
所述第二扫描模块输出的与所述第一扫描光束垂直的第二扫描入射到所述激发分光镜后，被等分为第二扫描反射光与第二扫描透射光，第二扫描透射光沿所述激发分光镜的第一侧的光路传输，依次经过所述第五透镜、第一反射镜、第二反射镜、第三反射镜、第六透镜、第四反射镜和第一激发物镜后，由所述第一激发物镜将光束会聚到样品的第一侧；
第二扫描反射光沿所述激发分光镜的第二侧的光路传输，依次经过所述第七透镜、第五反射镜、第八透镜、第六反射镜和第二激发物镜后，由所述第二激发物镜将光束会聚到样品的第二侧。
优选的是，所述探测模块包括沿光路方向依次设置的大视场物镜、聚光镜、滤光片和相机，所述大视场物镜位于样品上方，用以收集样品发出的荧光，所述大视场物镜收集的荧光经过聚光镜、滤光片后由所述相机采集并进行成像。
优选的是，所述第一光学相位调制器件和第二光学相位调制器件均为空间光调制器或衍射光学元件。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了一种能保持亚细胞级分辨率、能有效要拓展光片照明视场至数个mm量级的大视场高分辨光片照明成像系统，本发明利用双折射晶体与位相调制技术，产生多束光，并利用空间光调制器对多光束独立操控，能实现物镜焦平面附近样本空间一次性数个毫米的大视场成像，可保持均匀的高轴向分辨率的同时显著拓展了成像视场，本发明能够为大尺度生物样本高分辨、高通量三维成像提供了技术基础。
(2)现在利用无衍射光束如Bessel光束拓展视场的方法，想要保持高轴向分辨率拓展视场，会带来更多的旁瓣，使得主瓣能量密度降低，导致非焦平面旁瓣激发荧光，降低成像对比度，增加光漂白。本发明采用光学相位元件调制光束，产生横向距离可调多光束照明，避免离焦平面或者不同焦点之间荧光串扰，避免无衍射光束的旁瓣对生物样本的光损伤与光漂白，实现更高分辨率、更高对比度大视场成像。
(3)对于多光子非线性激发模式下的无衍射光束光片，增大视场增强旁瓣效应导致更多的激光能量被分散到旁瓣；在保持相同光束主瓣情况下，有效视场增大N倍，有效实现非线性激发的主瓣能量仅是总的入射能量的1/N，以双光子非线性激发为例，荧光激发效率与光强平方成正比，导致有效的双光子激发效率以N^2量级降低。旁瓣效应导致大视场下，非线性多光子激发荧光成为困难。本发明利用多光束调控技术，在物镜焦点空间产生多个高斯光片(也可以是旁瓣少的Bessel光片、Airy光片或其他类型光片)，有效提高了多光子非线性成像中激发光的能量利用率，避免或降低非线性激发中无衍射光片的旁瓣带来热效应对生物样本的损伤。实现如对鼠脑、类器官等大尺度生物样本的大视场、高分辨、无损伤、高通量三维多光子成像。
(4)现有的另一种保持高分辨，大视场成像的技术，采用细而短的光束扫描形成光片，分时小区域多次完成大尺度样本的结构信息采集，通过后期图像拼接处理复原大视场三维图像。对于大尺度数个毫米甚至厘米量级样品，往往需要较长的时间，非常不利于动态过程的捕捉。本发明采用多光片同时照明，通过一次性扫描可以获取数个毫米量级甚至厘米的视场动态信息，有利于观测大尺度样品不同功能区域的相互作用。有利于脑科学对全脑神经结构信息的高通量三维成像，有利于研究全脑神经元之间信号的传递、释放、接受过程，有利于绘制脑结构三维图谱。
附图说明
图1为本发明的大视场高分辨光片照明成像系统的结构示意图；
图2为本发明的系统中包含通道一的结构示意图；
图3为本发明的系统中包含通道二的结构示意图；
图4为本发明的光源双折射晶体分光示意图；
图5为本发明的光源分光镜的分光示意图；
图6为本发明的第一、第二光学相位调制器件的分光原理示意图；
图7为本发明的光束阵列分布图；
图8为本发明的第一、第二空间光调制器分区域调制光束示意图；
图9为本发明的第一、第二激发物镜后光片形成示意图。
附图标记说明：
S1—光源模块
01—激光器；02—准直扩束镜；03—光阑；04—半波片；05—光源双折射晶体；06—光源D形状半波片；07—光源分光镜；
S2—第一调制模块
100—第一调制反射镜；101—第一光学相位调制器件；102—第一空间光调制器；103—第一透镜；104—第一调制D形半波片；105—第一调制双折射晶体；106—第二透镜；
S3—第一扫描模块
107—第一x向扫描振镜；108—第一扫描透镜；109—第二扫描透镜；110—第一Z向扫描振镜；111—第三扫描透镜；112—第四扫描透镜；
S4—第二调制模块
200—第二调制反射镜；201—第二光学相位调制器件；202—第二空间光调制器；203—第三透镜；204—第二调制D形半波片；205—第二调制双折射晶体；206—第四透镜；
S5—第二扫描模块
207—第二x向扫描振镜；208—第五扫描透镜；209—第六扫描透镜；210—第二Z向扫描振镜；211—第七扫描透镜；212—扫描反射镜；213—第八扫描透镜；
S6—激发模块
300—激发分光镜；301—第五透镜；302—第一反射镜；303—第二反射镜；304—第三反射镜；305—第六透镜；306—第四反射镜；307—第一激发物镜；
310—第七透镜；311—第五反射镜；312—第八透镜；313—第六反射镜；314—第二激发物镜；315—样品；
S7—探测模块
401—大视场物镜；402—聚光镜；403—滤光片；404—相机。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
参照图1-9，本发明提供一种大视场高分辨光片照明成像系统，包括：光源模块S1、第一调制模块S2、第一扫描模块S3、第二调制模块S4、第二扫描模块S5、激发模块S6以及探测模块S7；
光源模块S1发出的光束被分为两部分：反射部分和透射部分，反射部分进入第一调制模块S2，经过调制后进入第一扫描模块S3，实现光束扫描，产生的第一扫描光束进入激发模块S6，激发样品315产生荧光；透射部分进入第二调制模块S4，经过调制后进入第二扫描模块S5，实现光束扫描，产生的第二扫描光束进入激发模块S6，激发样品315产生荧光；样品315被激发发出的荧光经探测模块S7收集成像；
第一调制模块S2和第一扫描模块S3构成系统的第一通道，第二调制模块S4和第二扫描模块S5构成系统的第二通道，第一通道输出的第一扫描光束与第二通道输出的第二扫描光束以相互垂直的方式进入激发模块S6。
参照图1-3，本发明中，光源模块S1包括沿光路依次设置的激光器01、准直扩束镜02、光阑03、半波片04、光源双折射晶体05、光源D形状半波片06和光源分光镜07；
激光器01发出的激光依次经过准直扩束镜02、光阑03、半波片04后进入光源双折射晶体05，被分为两束光：寻常光o002和非寻常光e001，非寻常光e经过光源D形状半波片06后变成与寻常光o平行的水平偏振光e，寻常光o和水平偏振光e射入光源分光镜07，均被等比例分为透射光束和反射光束：记寻常光o被光源分光镜07分为透射光o022和反射光o021，水平偏振光e被光源分光镜07分为透射光e012和反射光e011；
反射光o021和反射光e011进入第一调制模块S2，透射光o022和透射光e012进入第二调制模块S4。
本发明中，第一调制模块S2包括沿光路依次设置的第一调制反射镜100、第一光学相位调制器件101、第一空间光调制器102、第一透镜103、第一调制D形半波片104、第一调制双折射晶体105和第二透镜106；
光源模块S1出射的反射光e011和反射光o021经第一调制反射镜100反射后垂直入射至第一光学相位调制器件101，反射光e被均分为M束，每一束光能量相等，且相邻光束分开角度相等；反射光o也被均分为M束，每一束光能量相等，且相邻光束分开角度相等；从而形成2*M的光束阵列，并入射到第一空间光调制器102上，第一空间光调制器102被分成2*M个空间区域，每个空间区域独立对2*M的光束阵列中的对应光束施加相位调控，使得2*M的光束阵列中的每个光束含有唯一编码，获得2*M的调制光束；
2*M的调制光束经过第一透镜103后，调制光束中来源于反射光e的部分进入第一调制D形半波片104，由水平偏振变成垂直偏振,然后和调制光束中来源于反射光o的部分一起进入第一调制双折射晶体105，合束为1*M的调制光束，经过第二透镜106后进入第一扫描模块S3。
本发明中，第一扫描模块S3包括沿光路依次设置的第一x向扫描振镜107、第一扫描透镜108、第二扫描透镜109、第一Z向扫描振镜110、第三扫描透镜111和第四扫描透镜112；
第一调制模块S2输出的1*M的调制光束入射到第一x向扫描振镜107上，然后经过第一扫描透镜108、第二扫描透镜109后投射到第一Z向扫描振镜110上，
第一x向扫描振镜107沿着x轴扫描光束，第一Z向扫描振镜110沿着z向扫描光束，第一Z向扫描振镜110出射的光束依次经过第三扫描透镜111和第四扫描透镜112后形成第一扫描光束，并入射到激发模块S6中。
本发明中，第二调制模块S4包括沿光路依次设置第二调制反射镜200、第二光学相位调制器件201、第二空间光调制器202、第三透镜203、第二调制D形半波片204、第二调制双折射晶体205和第四透镜206；
光源模块S1出射的透射光o022和透射光e012经第二调制反射镜200反射后垂直入射至第二光学相位调制器件201，透射光e被均分为M束，每一束光能量相等，且相邻光束分开角度相等；透射光o也被均分为M束，每一束光能量相等，且相邻光束分开角度相等；从而形成2*M的光束阵列，并入射到第二空间光调制器202上，第二空间光调制器202被分成2*M个空间区域，每个空间区域独立对2*M的光束阵列中的对应光束施加相位调控，使得2*M的光束阵列中的每个光束含有唯一编码，获得2*M的调制光束；
2*M的调制光束经过第三透镜203后，调制光束中来源于透射光e的部分进入第二调制D形半波片204，由水平偏振变成垂直偏振,然后和调制光束中来源于透射光o的部分一起进入第二调制双折射晶体205，合束为1*M的调制光束，经过第四透镜206后进入第二扫描模块S5。
本发明中，第二扫描模块S5包括沿光路依次设置的、第二x向扫描振镜207、第五扫描透镜208、第六扫描透镜209、第二Z向扫描振镜210、第七扫描透镜211、扫描反射镜212和第八扫描透镜213；
第二调制模块S4输出的1*M的调制光束入射到第二x向扫描振镜207上，然后经过第五扫描透镜208、第六扫描透镜209后投射到第二Z向扫描振镜210上；
第二x向扫描振镜207沿着x轴扫描光束，第二Z向扫描振镜210沿着z向扫描光束，第二Z向扫描振镜210出射的光束依次经过第七扫描透镜211、扫描反射镜212和第八扫描透镜213后形成第二扫描光束，并入射到激发模块S6中。
本发明中，激发模块S6包括激发分光镜300，沿激发分光镜300的第一侧的光路依次设置的第五透镜301、第一反射镜302、第二反射镜303、第三反射镜304、第六透镜305、第四反射镜306和第一激发物镜307，以及沿激发分光镜300的第一侧的光路依次设置的第七透镜310、第五反射镜311、第八透镜312、第六反射镜313和第二激发物镜314；待测的样品315设置在第一激发物镜307和第二激发物镜314之间；
第一扫描模块S3输出的第一扫描光束入射到激发分光镜300后被等分为第一扫描反射光与第一扫描透射光，第一扫描反射光沿激发分光镜300的第一侧的光路传输，依次经过第五透镜301、第一反射镜302、第二反射镜303、第三反射镜304、第六透镜305、第四反射镜306和第一激发物镜307后，由第一激发物镜307将光束会聚到样品315的第一侧；
第一扫描透射光沿激发分光镜300的第二侧的光路传输，依次经过第七透镜310、第五反射镜311、第八透镜312、第六反射镜313和第二激发物镜314后，由第二激发物镜314将光束会聚到样品315的第二侧；
第二扫描模块S5输出的与第一扫描光束垂直的第二扫描入射到激发分光镜300后，被等分为第二扫描反射光与第二扫描透射光，第二扫描透射光沿激发分光镜300的第一侧的光路传输，依次经过第五透镜301、第一反射镜302、第二反射镜303、第三反射镜304、第六透镜305、第四反射镜306和第一激发物镜307后，由第一激发物镜307将光束会聚到样品315的第一侧；
第二扫描反射光沿激发分光镜300的第二侧的光路传输，依次经过第七透镜310、第五反射镜311、第八透镜312、第六反射镜313和第二激发物镜314后，由第二激发物镜314将光束会聚到样品315的第二侧。
本发明中，探测模块S7包括沿光路方向依次设置的大视场物镜(亦可以称为介观物镜，是一种具有高分辨率和大视场的显微物镜，本发明中的大视场物镜的视场大于8mm，数值孔径达0.5，工作波段400nm～1000nm)401、聚光镜402、滤光片403和相机404，大视场物镜401位于样品315上方，用以收集样品315发出的荧光，大视场物镜401收集的荧光经过聚光镜402、滤光片403后由相机404采集并进行成像。
在优选的实施例中，第一光学相位调制器件101和第二光学相位调制器件201均为空间光调制器或衍射光学元件。
在优选的实施例中，第二扫描透镜109、第四扫描112、第六扫描透镜209、第八扫描透镜213均为套筒透镜。
在优选的实施例中，聚光镜402为套筒透镜。
以下分别以本发明的系统中包含通道一和通道二的光路进行其光路原理的详细说明，以便于对本发明的理解。
一、包含通道一的系统光路
(1)参照图2，激光器01发出的波长为488nm的连续线偏振激光本发明以此激光源为例，但也可以是不限于连续激光的脉冲激光，或其他波长的激光。依次经过准直扩束镜02准直、可调节通光口径的光阑03、半波片04后进入光源双折射晶体05；
参照图4，旋转半波片04快轴方向，使得出射光偏振与水平地面成45度角，光束000被分为两束光：水平偏振的寻常光o002和垂直偏振的非寻常光e001，此处双折射晶体，由于双折射效应将入射的光分成两束偏振方向相互正交的平行光束，分开的距离由双折射晶体长度决定，非寻常光e经过光源D形状半波片06后变成与寻常光o平行的水平偏振光e，寻常光o和水平偏振光e射入光源分光镜07，均被等比例分为透射光束和反射光束D形半波片04快轴方向与水平面成45度，参照图5：记寻常光o被光源分光镜07分为透射光o022和反射光o021，水平偏振光e被光源分光镜07分为透射光e012和反射光e011；
反射光o021和反射光e011进入第一调制模块S2，透射光o022和透射光e012进入第二调制模块S4。
(2)此处对进入第一调制模块S2后的光路进行说明：
光源模块S1出射的反射光e011和反射光o021经第一调制反射镜100反射后垂直入射至第一光学相位调制器件101光学相位调制器件含有特定的相位分布，可以是空间光调制器加载设定的相位，或是经过按特定分布进行工艺制作的光学衍射元件，如图6所示，反射光e被均分为6束即M＝6，此处仅以6为例进行说明，并不限于6束，分别为光束0111、光束0112、光束0113、光束0114、光束0115、光束0116，每一束光能量相等，且相邻光束分开角度相等；反射光o也被均分为6束，别为光束0211、光束0212、光束0213、光束0214、光束0215、光束0216每一束光能量相等，且相邻光束分开角度相等；参照图7；
从而形成2*6的光束阵列，并入射到第一空间光调制器102上其调制的偏振方向与入射光一致，水平方向取向，参照图8，第一空间光调制器102被分成2*6个空间区域，每个空间区域独立对2*6的光束阵列中的对应光束施加相位调控，使得2*6的光束阵列中的每个光束含有唯一编码，获得2*6的调制光束；
2*6的调制光束经过第一透镜103后，调制光束中来源于反射光e的部分光束0111、光束0112、光束0113、光束0114、光束0115、光束0116进入第一调制D形半波片104半波片04快轴方向与水平方向成45度，偏振方向由水平偏振变成垂直偏振，然后和调制光束中来源于反射光o的部分一起进入第一调制双折射晶体105，光束实现空间重合，合束为1*6的调制光束此过程与图4分光过程互为逆过程，经过第二透镜106后进入第一扫描模块S3。
(3)第一调制模块S2输出的1*6的调制光束入射到第一x向水平扫描振镜上，然后经过第一扫描透镜108、第二扫描透镜109第一扫描透镜108、第二扫描透镜109形成中继透镜组后投射到第一Z向垂直扫描振镜上，
第一x向扫描振镜107沿着x轴扫描光束，第一Z向扫描振镜110沿着z向扫描光束，第一Z向扫描振镜110出射的光束依次经过第三扫描透镜111和第四扫描透镜112第三扫描透镜111和第四扫描透镜112形成中继透镜组后形成第一扫描光束，并入射到激发模块S6中。
(4)第一扫描模块S3输出的第一扫描光束入射到激发分光镜300后被等分为第一扫描反射光与第一扫描透射光，第一扫描反射光沿激发分光镜300的第一侧的光路传输，依次经过第五透镜301、第一反射镜302、第二反射镜303、第三反射镜304、第六透镜305、第四反射镜306和第一激发物镜307后，由第一激发物镜307将光束会聚到样品315的第一侧；
如图9所示，具有不同相位编码光束聚焦在第一激发物镜307平面不同距离处，聚焦位置的横向距离由光束分离角度与物镜焦距决定分离角度的灵活变化，可使焦点横向距离随意变化；聚焦位置距离焦平面的距离可由第一空间光调制器102施加的相位控制，第一x向扫描振镜107沿着x方向扫描光束，形成D1到Dn个光片激发样本光片的数量等于光束数，n＝M＝6；
同理，第一扫描透射光沿激发分光镜300的第二侧的光路传输，依次经过第七透镜310、第五反射镜311、第八透镜312、第六反射镜313和第二激发物镜314后，由第二激发物镜314将将具有分离角度的阵列光束会聚到样品315的第二侧；具有不同相位编码光束聚焦在第二激发物镜314平面不同距离处，聚焦位置的横向距离由光束分离角度与物镜焦距决定分离角度的灵活变化，可使焦点横向距离随意变化；聚焦位置距离焦平面的距离可由第一空间光调制器102施加的相位控制，第一x向扫描振镜107沿着x方向扫描光束，形成D1到Dn个光片激发样本光片的数量等于光束数，n＝M＝6；通道一中，双侧照明使得光片照明的视场增倍，可使光片视场拓展为传统单光束光片荧光显微镜视场的24倍。
(5)大视场物镜401位于样品315上方，样品315发出的荧光被大视场物镜401收集，然后经过聚光镜402、滤光片403滤除杂散光后由相机404采集并进行成像。
二、包含通道二的系统光路
(1)光源模块S1部分与上述包含通道一的系统光路部分相同，不再赘述。
(2)光源模块S1出射的透射光o022和透射光e012经第二调制反射镜200反射后垂直入射至第二光学相位调制器件201第二光学相位调制器件201含有特定的相位分布，可以是空间光调制器加载设定的相位，或是经过按特定分布进行工艺制作的光学衍射元件，透射光e被均分为6束即M＝6，此处仅以6为例进行说明，并不限于6束，分别为光束0121、光束0122、光束0123、光束0124、光束0125、光束0126，每一束光能量相等，且相邻光束分开角度相等；
透射光o也被均分为6束，分别为光束0221、光束0222、光束0223、光束0224、光束0225、光束0226，每一束光能量相等，且相邻光束分开角度相等；从而形成2*6的光束阵列，并入射到第二空间光调制器202上其调制的偏振方向与入射光一致，水平方向取向，第二空间光调制器202被分成2*6个空间区域，每个空间区域独立对2*6的光束阵列中的对应光束施加相位调控，使得2*6的光束阵列中的每个光束含有唯一编码，获得2*6的调制光束；
2*6的调制光束经过第三透镜203后，调制光束中来源于透射光e的部分即光束0121、光束0122、光束0123、光束0124、光束0125、光束0126进入第二调制D形半波片204半波片04快轴方向与水平方向成45度，由水平偏振变成垂直偏振,然后和调制光束中来源于透射光o的部分一起进入第二调制双折射晶体205，光束实现空间重合，合束为1*6的调制光束此过程与图4分光过程互为逆过程，经过第四透镜206后进入第二扫描模块S5。
(3)第二调制模块S4输出的1*6的调制光束入射到第二x向水平扫描振镜上，然后经过第五扫描透镜208、第六扫描透镜209第五扫描透镜208、第六扫描透镜209组成中继透镜后投射到第二Z向垂直扫描振镜上；
第二x向扫描振镜207沿着x轴扫描光束，第二Z向扫描振镜210沿着z向扫描光束，第二Z向扫描振镜210出射的光束依次经过第七扫描透镜211、扫描反射镜212和第八扫描透镜213后形成第二扫描光束，并入射到激发模块S6中。
(4)第二扫描模块S5输出的与第一扫描光束垂直的第二扫描入射到激发分光镜300后，被等分为第二扫描反射光与第二扫描透射光，第二扫描透射光沿激发分光镜300的第一侧的光路传输，依次经过第五透镜301、第一反射镜302、第二反射镜303、第三反射镜304、第六透镜305、第四反射镜306和第一激发物镜307后，由第一激发物镜307将光束会聚到样品315的第一侧；
如图9所示，具有不同相位编码光束聚焦在第一激发物镜307平面不同距离处，聚焦位置的横向距离由光束分离角度与物镜焦距决定分离角度的灵活变化，可使焦点横向距离随意变化；聚焦位置距离焦平面的距离可由第二空间光调制器202施加的相位控制，第二x向扫描振镜207沿着x方向扫描光束，形成D1到Dn个光片激发样本光片的数量等于光束数，n＝M＝6；
同理，第二扫描反射光沿激发分光镜300的第二侧的光路传输，依次经过第七透镜310、第五反射镜311、第八透镜312、第六反射镜313和第二激发物镜314后，由第二激发物镜314将将具有分离角度的阵列光束会聚到样品315的第二侧；具有不同相位编码光束聚焦在第二激发物镜314平面不同距离处，聚焦位置的横向距离由光束分离角度与物镜焦距决定分离角度的灵活变化，可使焦点横向距离随意变化；聚焦位置距离焦平面的距离可由第二空间光调制器202施加的相位控制，第二x向扫描振镜207沿着x方向扫描光束，形成D1到Dn个光片激发样本光片的数量等于光束数，n＝M＝6；通道二中，双侧照明使得光片照明的视场增倍，可使光片视场拓展为传统单光束光片荧光显微镜视场的24倍。
(5)大视场物镜401位于样品315上方，样品315发出的荧光被大视场物镜401收集，然后经过聚光镜402、滤光片403滤除杂散光后由相机404采集并进行成像。
可见，本发明的以上实例中，双通道双侧照明能够将单光束光片视场拓展48倍。
在一种实施例中，以如下的参数为例对本发明进行说明，但需要理解的是，并不限于如下的参数。
激光器01中，激光经过准直后光束直径为2mm，第一调制模块S2、第二调制模块S4调制模块放大倍率为1。第一扫描模块S3、第二扫描模块S5放大倍率为4。激发模块S6中，第五透镜301与第六透镜305组成的中继组放大倍率为1，第七透镜310与第八透镜312组成的中继组放大倍率为1。则光源模块S1到激发模块S6第一激发物镜307、第二激发物镜314入瞳处的放大倍率为4倍。以物镜Mitutyo,5x,NA＝0.14,f＝40mm为例，若需要光片视场为8mm,轴向分辨率为4um，则聚焦点离物镜焦平面最远距离为8mm，光束通过物镜的有效数值孔径为NAeff＝2mm*4/(2*48mm)＝0.083,光束聚焦腰斑半径约为0.61*0.488um/NAeff＝3.59um,光片有效长度约：2*π/0.488*3.59^2*48＝7.965mm，与预期目标视场大小基本一致。本发明以高斯光束为例，但不局限于高斯光束，可以是无衍射光束如Bessel光束与Airy光束。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (10)
1.一种大视场高分辨光片照明成像系统，其特征在于，包括：光源模块(S1)、第一调制模块(S2)、第一扫描模块(S3)、第二调制模块(S4)、第二扫描模块(S5)、激发模块(S6)以及探测模块(S7)；
所述光源模块(S1)发出的光束被分为两部分：反射部分和透射部分，反射部分进入所述第一调制模块(S2)，经过调制后进入所述第一扫描模块(S3)，产生的第一扫描光束进入所述激发模块(S6)，激发样品(315)产生荧光；透射部分进入所述第二调制模块(S4)，经过调制后进入所述第二扫描模块(S5)，产生的第二扫描光束进入所述激发模块(S6)，激发样品(315)产生荧光；样品(315)被激发发出的荧光经所述探测模块(S7)收集成像；
所述第一调制模块(S2)和第一扫描模块(S3)构成系统的第一通道，所述第二调制模块(S4)和第二扫描模块(S5)构成系统的第二通道，第一通道输出的第一扫描光束与所述第二通道输出的第二扫描光束以相互垂直的方式进入所述激发模块(S6)。
2.根据权利要求1所述的大视场高分辨光片照明成像系统，其特征在于，所述光源模块(S1)包括沿光路依次设置的激光器(01)、准直扩束镜(02)、光阑(03)、半波片(04)、光源双折射晶体(05)、光源D形状半波片(06)和光源分光镜(07)；
所述激光器(01)发出的激光依次经过所述准直扩束镜(02)、光阑(03)、半波片(04)后进入所述光源双折射晶体(05)，被分为两束光：寻常光o和非寻常光e，所述非寻常光e经过所述光源D形状半波片(06)后变成与所述寻常光o平行的水平偏振光e，寻常光o和水平偏振光e射入所述光源分光镜(07)，均被等比例分为透射光束和反射光束：记寻常光o被所述光源分光镜(07)分为透射光o和反射光o，水平偏振光e被所述光源分光镜(07)分为透射光e和反射光e；
反射光o和反射光e进入所述第一调制模块(S2)，透射光o和透射光e进入所述第二调制模块(S4)。
3.根据权利要求2所述的大视场高分辨光片照明成像系统，其特征在于，所述第一调制模块(S2)包括沿光路依次设置的第一调制反射镜(100)、第一光学相位调制器件(101)、第一空间光调制器(102)、第一透镜(103)、第一调制D形半波片(104)、第一调制双折射晶体(105)和第二透镜(106)；
所述光源模块(S1)出射的反射光e和反射光o经所述第一调制反射镜(100)反射后垂直入射至所述第一光学相位调制器件(101)，反射光e被均分为M束，每一束光能量相等，且相邻光束分开角度相等；反射光o也被均分为M束，每一束光能量相等，且相邻光束分开角度相等；从而形成2*M的光束阵列，并入射到所述第一空间光调制器(102)上，所述第一空间光调制器(102)被分成2*M个空间区域，每个空间区域独立对2*M的光束阵列中的对应光束施加相位调控，使得2*M的光束阵列中的每个光束含有唯一编码，获得2*M的调制光束；
所述2*M的调制光束经过所述第一透镜(103)后，调制光束中来源于反射光e的部分进入所述第一调制D形半波片(104)，由水平偏振变成垂直偏振,然后和调制光束中来源于反射光o的部分一起进入所述第一调制双折射晶体(105)，合束为1*M的调制光束，经过第二透镜(106)后进入所述第一扫描模块(S3)。
4.根据权利要求3所述的大视场高分辨光片照明成像系统，其特征在于，所述第一扫描模块(S3)包括沿
光路依次设置的第一x向扫描振镜(107)、第一扫描透镜(108)、第二扫描透镜(109)、第一Z向扫描振镜(110)、第三扫描透镜(111)和第四扫描透镜(112)；
所述第一调制模块(S2)输出的1*M的调制光束入射到所述第一x向扫描振镜(107)上，然后经过所述第一扫描透镜(108)、第二扫描透镜(109)后投射到所述第一Z向扫描振镜(110)上，
所述第一x向扫描振镜(107)沿着x轴扫描光束，所述第一Z向扫描振镜(110)沿着z向扫描光束，所述第一Z向扫描振镜(110)出射的光束依次经过所述第三扫描透镜(111)和第四扫描透镜(112)后形成第一扫描光束，并入射到所述激发模块(S6)中。
5.根据权利要求4所述的大视场高分辨光片照明成像系统，其特征在于，所述第二调制模块(S4)包括沿光路依次设置第二调制反射镜(200)、第二光学相位调制器件(201)、第二空间光调制器(202)、第三透镜(203)、第二调制D形半波片(204)、第二调制双折射晶体(205)和第四透镜(206)；
所述光源模块(S1)出射的透射光o和透射光e经所述第二调制反射镜(200)反射后垂直入射至所述第二光学相位调制器件(201)，透射光e被均分为M束，每一束光能量相等，且相邻光束分开角度相等；透射光o也被均分为M束，每一束光能量相等，且相邻光束分开角度相等；从而形成2*M的光束阵列，并入射到所述第二空间光调制器(202)上，所述第二空间光调制器(202)被分成2*M个空间区域，每个空间区域独立对2*M的光束阵列中的对应光束施加相位调控，使得2*M的光束阵列中的每个光束含有唯一编码，获得2*M的调制光束；
所述2*M的调制光束经过所述第三透镜(203)后，调制光束中来源于透射光e的部分进入所述第二调制D形半波片(204)，由水平偏振变成垂直偏振,然后和调制光束中来源于透射光o的部分一起进入所述第二调制双折射晶体(205)，合束为1*M的调制光束，经过第四透镜(206)后进入所述第二扫描模块(S5)。
6.根据权利要求5所述的大视场高分辨光片照明成像系统，其特征在于，所述第二扫描模块(S5)包括沿光路依次设置的、第二x向扫描振镜(207)、第五扫描透镜(208)、第六扫描透镜(209)、第二Z向扫描振镜(210)、第七扫描透镜(211)、扫描反射镜(212)和第八扫描透镜(213)；
所述第二调制模块(S4)输出的1*M的调制光束入射到所述第二x向扫描振镜(207)上，然后经过所述第五扫描透镜(208)、第六扫描透镜(209)后投射到所述第二Z向扫描振镜(210)上；
所述第二x向扫描振镜(207)沿着x轴扫描光束，所述第二Z向扫描振镜(210)沿着z向扫描光束，所述第二Z向扫描振镜(210)出射的光束依次经过所述第七扫描透镜(211)、扫描反射镜(212)和第八扫描透镜(213)后形成第二扫描光束，并入射到所述激发模块(S6)中。
7.根据权利要求6所述的大视场高分辨光片照明成像系统，其特征在于，所述激发模块(S6)包括激发分光镜(300)，沿所述激发分光镜(300)的第一侧的光路依次设置的第五透镜(301)、第一反射镜(302)、第二反射镜(303)、第三反射镜(304)、第六透镜(305)、第四反射镜(306)和第一激发物镜(307)，以及沿所述激发分光镜(300)的第一侧的光路依次设置的第七透镜(310)、第五反射镜(311)、第八透镜(312)、第六反射镜(313)和第二激发物镜(314)；待测的样品(315)设置在所述第一激发物镜(307)和第二激发物镜(314)之间。
8.根据权利要求7所述的大视场高分辨光片照明成像系统，其特征在于，所述第一扫描模块(S3)输出的第一扫描光束入射到所述激发分光镜(300)后被等分为第一扫描反射光与第一扫描透射光，第一扫描反射光沿所述激发分光镜(300)的第一侧的光路传输，依次经过所述第五透镜(301)、第一反射镜(302)、第二反射镜(303)、第三反射镜(304)、第六透镜(305)、第四反射镜(306)和第一激发物镜(307)后，由所述第一激发物镜(307)将光束会聚到样品(315)的第一侧；
第一扫描透射光沿所述激发分光镜(300)的第二侧的光路传输，依次经过所述第七透镜(310)、第五反射镜(311)、第八透镜(312)、第六反射镜(313)和第二激发物镜(314)后，由所述第二激发物镜(314)将光束会聚到样品(315)的第二侧；
所述第二扫描模块(S5)输出的与所述第一扫描光束垂直的第二扫描入射到所述激发分光镜(300)后，被等分为第二扫描反射光与第二扫描透射光，第二扫描透射光沿所述激发分光镜(300)的第一侧的光路传输，依次经过所述第五透镜(301)、第一反射镜(302)、第二反射镜(303)、第三反射镜(304)、第六透镜(305)、第四反射镜(306)和第一激发物镜(307)后，由所述第一激发物镜(307)将光束会聚到样品(315)的第一侧；
第二扫描反射光沿所述激发分光镜(300)的第二侧的光路传输，依次经过所述第七透镜(310)、第五反射镜(311)、第八透镜(312)、第六反射镜(313)和第二激发物镜(314)后，由所述第二激发物镜(314)将光束会聚到样品(315)的第二侧。
9.根据权利要求8所述的大视场高分辨光片照明成像系统，其特征在于，所述探测模块(S7)包括沿光路方向依次设置的大视场物镜(401)、聚光镜(402)、滤光片(403)和相机(404)，所述大视场物镜(401)位于样品(315)上方，用以收集样品(315)发出的荧光，所述大视场物镜(401)收集的荧光经过聚光镜(402)、滤光片(403)后由所述相机(404)采集并进行成像。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的大视场高分辨光片照明成像系统，其特征在于，所述第一光学相位调制器件(101)和第二光学相位调制器件(201)均为空间光调制器或衍射光学元件。
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