CN116590219A - 一种干细胞来源的类原肠胚模型及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种干细胞来源的类原肠胚模型及其构建方法和应用。所述类原肠胚模型由人多能干细胞在体外构建得到，一定程度模拟了早期胚胎发育的生物学事件与胚胎的关键结构，如原始内胚层发育、双胚盘建立、羊膜腔和羊膜细胞的出现以及原条出现等，且在蛋白水平和转录组水平均得到验证，能够较好的复现围植入期到原肠胚阶段胚胎的关键特征，并且该模型可以批量诱导作为早期胚胎药物及环境毒物等的筛选模型，从而对某些临床孕早期患者的用药等提供安全性测试。

Description

一种干细胞来源的类原肠胚模型及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种多能干细胞来源的体外模拟人类围植入期类原肠胚模型及其诱导方法和应用。
背景技术
人类的生命从受精开始，精子和卵子结合形成合子。这种独特的全能细胞经历了连续的分裂和细胞分化，在第五天形成囊胚。囊胚主要由两个细胞群构成：内细胞团(ICM)和滋养外胚层(TE)。内细胞团在后期发育中形成胚胎本身和胚胎外组织，而滋养外胚层将进一步发育形成胎盘中的主要成分。胚胎植入前，内部细胞团开始分化为外胚层(EPI)和下胚层(HYPO)。植入后，EPI形成羊膜囊，HYPO形成卵黄囊，随后EPI出现原肠运动，建立具有三胚层的原肠胚。由于技术、伦理限制和样本数量有限等原因，我们对人类围植入期胚胎发育的研究较少。了解人类早期胚胎发育的机制对发育生物学以及再生医学都非常重要。现今我们对人类早期胚胎发育的认识大多来源于卡内基胚胎的组织学和解剖结构的研究，这个阶段仍有较多未知的领域需要探索。
目前，人类植入前和围植入期的胚胎发育研究获得了突破性的进展，研究人员已经能够在体外将人类胚胎培养到原肠发育前的胚胎第14天，或将人幼稚多能干细胞(human Pluripotent Stem Cells,nhPSC)诱导为植入前类胚体，结合单细胞多组学测序和荧光成像技术，为研究人类原肠胚发育开辟了新的途径，极大地拓展了对早期人类原肠胚发育的特征和机制的了解。虽然有研究尝试利用hPSC建立羊膜类器官或重建原始外胚层的早期发育过程，从三维层面去模拟植入后胚胎发育的过程，但该模型缺乏胚胎的关键结构(双层胚盘、卵黄囊)，并且未观察到人原始内胚层的大致发育过程，因此至今还未建立获得理想的围植入期至植入后类原肠胚的研究模型。
发明内容
本研究建立了将人多能干细胞(human Pluripotent Stem Cells,hPSC)诱导为类原肠胚的模型与方法，所述类原肠胚模型在体外构建得到，一定程度模拟了早期胚胎发育的生物学事件与胚胎的关键结构，如双层胚盘建立、羊膜腔和羊膜细胞的出现以及原条出现等，且在蛋白水平和转录组水平均得到验证，能够较好的复现围植入期到原肠胚阶段胚胎的关键特征，并且该模型可以批量诱导作为早期胚胎药物筛选模型，从而对某些临床孕早期患者的用药提供安全性测试。
在本发明所使用的人多能干细胞包括人诱导多能干细胞(human inducedPluripotent Stem Cells，hiPSCs)和人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells，hESCs)，所述人诱导多能干细胞和人胚胎干细胞均为已经建立的，能够通过公开途径购买得到的人诱导多能干细胞和人胚胎干细胞。在某一个特殊的实施例中，所述人诱导多能干细胞购自：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库，细胞名称为DYR0100，目录编号为SCSP-1301；所述人胚胎干细胞购自：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库，细胞名称为H1，目录编号为SCSP-301。
本发明的第一个目的是提供一种类原肠胚模型的构建方法，具体为将多能干细胞体外诱导为人类类原肠胚的模型，包括以下步骤，
(1)在多能干细胞长至80-90％汇合度时将细胞消化为单细胞，使用PBS(磷酸盐缓冲液)将细胞进行重悬，得到细胞悬液1；优选的，使用胰蛋白酶TrypLE Select将细胞消化为单细胞。
取细胞悬液1加入含有Y-27632的G1ER培养基进一步重悬细胞，得到细胞悬液2；
将细胞悬液2接种到提前使用抗黏附溶液包被的类胚体培养板中，离心；
培养第二天采用G1ER培养基换半液，每天换半液至培养直至形成原始内、外胚盘；
优选的，所述细胞悬液1与含有Y-27632的G1ER培养基的比例为：每包含7.5-9.0×104个细胞的细胞悬液1中加入2mL含有Y-27632的G1ER培养基；
优选的，所述细胞悬液2接种的每微孔细胞量为50-75个细胞；
优选的，所述离心为使用水平离心机800rpm离心2分钟；
优选的，所述抗黏附溶液为Anti-adhension rinsing Solution，所述类胚体培养板为Agreewell400TM培养皿。
优选的，步骤(1)处于植入后类原肠胚模型的构建方法的第0～3天。
(2)将(1)培养板各孔中的G1ER培养基弃去1/2～3/4体积后加入G2EE培养基培养，进行羊膜腔预诱导；加入培养基时可贴壁缓慢加入，防止已形成的类原肠胚从微孔中浮起后融合。
在某一个特殊的实施例中，培养板为Agreewell 400TM培养皿，培养板各孔中的G1ER培养基弃去3/4体积即1.75mL/孔。
优选的，步骤(2)处于植入后类原肠胚模型的构建方法的第4天。
(3)将(2)培养板各孔中的G2EE培养基弃去1/2～3/4体积后加入aG2EE培养基培养，诱导形成羊膜细胞；加入培养基时可贴壁缓慢加入防止已形成的类原肠胚从微孔中浮起后融合。
在某一个特殊的实施例中，培养板为Agreewell 400TM培养皿，培养板各孔中的G2EE培养基弃去3/4体积即1.75mL/孔。
优选的，步骤(3)处于植入后类原肠胚模型的构建方法的第5天。
(4)将(3)培养板各孔中的aG2EE培养基弃去1/2～3/4体积后加入bG2EE培养基培养；直至诱导得到羊膜细胞、原条细胞、原始生殖细胞，获得所述植入后类原肠胚模型。加入培养基时可贴壁缓慢加入，防止已形成的类原肠胚从微孔中浮起后融合。
在某一个特殊的实施例中，培养板为Agreewell 400TM培养皿，培养板各孔中的aG2EE培养基弃去3/4体积即1.75mL/孔。
优选的，步骤(4)处于植入后类原肠胚模型的构建方法的第6～7天。
进一步的，步骤(1)～(4)中所述培养的培养条件为：于温度为37℃、二氧化碳的体积浓度为5～6％的环境中培养。
进一步的，所述多能干细胞为诱导多能干细胞或胚胎干细胞；优选的，为人源诱导多能干细胞或胚胎干细胞。
进一步的，步骤(1)所述G1ER培养基的成分包含：
体积百分比为50％的G-1TM Plus卵裂球培养基、25％的Essential 8培养基和25％的RACL培养基；
所述RACL培养基包含体积百分比为95％-98.5％的基础培养基RPMI 1640(含有GlutaMAX)、体积百分比为1％的B27添加剂、体积百分比为0.5％的青霉素-链霉素双抗、0.1mM非必须氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇，100ng/mL重组人激活素A蛋白、20ng/mL重组人白细胞因子蛋白、3μM CHIR 99021。
含有Y-27632的G1ER培养基的成分包含：
体积百分比为50％的G-1TM Plus卵裂球培养基、25％的Essential 8培养基和25％的RACL培养基；所述RACL培养基包含95％-98.5％的基础培养基RPMI 1640(含有GlutaMAX)、体积百分比为1％的B27添加剂、体积百分比为0.5％的青霉素-链霉素双抗、0.1mM非必须氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇，100ng/mL重组人激活素A蛋白、20ng/mL重组人白细胞因子蛋白、3μM CHIR 99021、10μM Y-27632。
进一步的，步骤(2)所述G2EE培养基的成分包含：
体积百分比为50％的G-2TM Plus胚胎培养基、25％的Essential 8培养基和25％的EBB培养基；所述EBB培养基包含100％的Essential 6培养基、20ng/mL重组人骨形态发生蛋白4、10ng/mL重组人成纤维细胞生长因子2。
进一步的，步骤(3)所述aG2EE培养基的成分包含：
体积百分比为50％的G-2TM Plus胚胎培养基、25％的Essential 8培养基和25％的aEBB培养基；所述aEBB培养基包含100％的Essential 6培养基、100ng/mL重组人骨形态发生4蛋白、10ng/mL重组人成纤维细胞生长因子2。
进一步的，步骤(4)所述bG2EE培养基的成分包含：
体积百分比为50％的G-2TM Plus胚胎培养基、25％的Essential 8培养基和25％的bEBB培养基；所述bEBB培养基包含100％的Essential 6培养基、75ng/mL重组人骨形态发生4蛋白、10ng/mL重组人成纤维细胞生长因子2。
本发明的第二个目的是提供一种类原肠胚模型，采用前述的方法构建得到。
本发明的第三个目的是提供前述的类原肠胚模型，或源于该模型的组织或器官或其培养物在人类早期胚胎发育机制研究中的应用。
本发明的第四个目的是提供前述的类原肠胚模型，或源于该模型的组织或器官或其培养物在人类早期胚胎发育疾病的诊断策略和/或治疗策略中的应用。
本发明的第五个目的是提供前述的类原肠胚模型，或源于该模型的组织或器官或其培养物在筛选、验证、评价、评估或研究预防和/或治疗人类早期胚胎发育疾病药物的药效中的应用。
进一步的，所述人类早期胚胎发育疾病为药物引起的人类早期胚胎致畸。
本发明所述类原肠胚模型，为采用多能干细胞在体外诱导得到的最终状态类似于卡内基分期6期胚胎的模型。该模型可以批量诱导作为早期胚胎药物筛选模型，从而对某些临床孕早期患者的用药提供安全性测试。所述类原肠胚模型，或源于该类原肠胚模型的组织或器官或其培养物因为缺少滋养层等细胞类型，不能发育为个体。
本发明技术方案，具有如下优点：
特征1：人多能干细胞能够在12小时内完成聚球，诱导稳定性高，在持续的7天类原肠胚培养中具有稳定的细胞生长特性。
特征2：类原肠胚诱导在1天时开始发生原始内胚层和原始外胚层的谱系分离，出现原始内胚层类细胞，同时表达多能性(OCT4)和早期原始内胚层(OTX2、GATA6)的标记物，
特征3：在3天时出现胚胎典型的二胚盘结构，并且Epiblast侧细胞为OCT4、SOX2阳性柱状细胞，Hypoblast侧细胞为OTX2、GATA6、SOX17阳性立方细胞。
特征4：类原肠胚诱导在4-5天时Epiblast侧开始羊膜腔结构，并且出现部分羊膜细胞，呈现TFAP2a、CDX2阳性，OCT4弱阳性以及SOX2阴性。
特征5：类原肠胚诱导在6-7天时从Epiblast中分离出来的羊膜细胞进一步变薄，形成明显的鳞状羊膜上皮，呈现TFAP2a、CDX2等羊膜细胞标记物阳性和OCT4、SOX2等多能性标记物阴性。
特征6：类原肠胚诱导在6-7天时从Epiblast中分离出来部分T、EOMES阳性的细胞，并且多能性标记物(OCT4)进一步减弱，正在经历上皮间充质(EMT)的过程，符合原条产生的特征，证明植入后类原肠胚中开始启动原肠运动。
特征7：类原肠胚诱导在6-7天时出现少量原始生殖细胞，呈现出多能性标记物(OCT4、NANOG、NANOS3)、原始生殖细胞(SOX17、AP2C、BLIMP1)阳性以及特征性的SOX2阴性。
特征8：诱导培养7天后的类原肠胚最终状态类似于卡内基分期6期的胚胎。
特征9：该模型可以批量诱导作为早期胚胎药物筛选模型，从而对某些临床孕早期患者的用药提供安全性测试。
有益效果：该模型为体外研究人类早期胚胎发育提供了平台，旨在了解人类早期胚胎发育复杂性的研究，并为开发临床早期胚胎围植入期疾病治疗提供一个研究平台。
附图说明
图1是本发明一实施例提供的类原肠胚模型诱导1-7天的培养过程白光图，其中，图1A为由人诱导多能干细胞(hiPSCs)诱导植入后类原肠胚，图1B为人胚胎干细胞(hESCs)诱导植入后类原肠胚，标尺为100μm；
图2是由人诱导多能干细胞(hiPSCs)诱导植入后类原肠胚诱导3天和7天的取材过程白光图，标尺50μm和100μm；
图3是本发明一实施例提供的类原肠胚诱导1-7天的生长曲线图，每个点代表一个类囊胚的细胞量，每个时间点样本量不少于20个，其中，图3A为由人诱导多能干细胞(hiPSCs)诱导1-7天的生长曲线图，图3B为人胚胎干细胞(hESCs)诱导1-7天的生长曲线图；
图4是本发明一实施例提供的类原肠胚诱导1-3天原始内胚层出现到两胚盘结构出现过程IF，标尺为20μm；其中，图4A为GATA6和OCT4免疫荧光图，图4B为SOX2和SOX17免疫荧光图；
图5是本发明一实施例提供的类原肠胚诱导4-7天羊膜腔形成到羊膜细胞出现过程IF，标尺为20μm；其中，图5A为CDX2、OCT4和GATA6，图5B为SOX2、TFAP2a和SOX17；
图6是本发明一实施例提供的类原肠胚诱导7天原肠运动原条迁移过程IF，其中，图6A为OCT4+T+原肠运动细胞逐渐过度为T+EOMES+阳性的定形内胚层命运的细胞，最终分化为EOMES+定形内胚层细胞，图6B为OCT4+T+原肠运动细胞逐渐过度为T+MIXL1+阳性的中胚层命运的细胞，最终分化为MIXL1+中胚层细胞，标尺为50μm；
图7是本发明一实施例提供的生信分析结果，A图为类原肠胚诱导为7天时单细胞测序数据UMAP分群图，其中Epiblast为原始外胚层，Endoderm为原始内胚层，PrimitiveStreak为原条，Primitive Streak anlage Epiblast为原条原基外胚层，PGC为原始生殖细胞，Amnion为羊膜，Mesoderm为中胚层；B图为相关分群依据；
图8是本发明一实施例提供的类原肠胚模型加药应用的结果，A图为类原肠胚7天时对照组、二甲基亚砜、5μM THD和10μM THD的取材白光图以及DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色结果，标尺分别为200μm和100μm，B图为类原肠胚诱导7天时对照组、二甲基亚砜、5μM THD和10μM THD的单个类原肠胚细胞量，C图为类原肠胚诱导7天时对照组、二甲基亚砜、5μM THD和10μM THD的单个类原肠胚的体积。
具体实施方式
本发明公开了一种将人多能干细胞诱导为类原肠胚模型的方法，本发明提供人多能干细胞诱导为类原肠胚模型的方法所用试剂、仪器、细胞系等均可由市场购得，所述人诱导多能干细胞购自：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库，细胞名称为DYR0100，目录编号为SCSP-1301；所述人胚胎干细胞购自：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库，细胞名称为H1，目录编号为SCSP-301。
(1)所述体外人多能干细胞诱导为类原肠胚所用培养液成分来源：
G-1TM Plus卵裂球培养基：10128，购自瑞典Vitrolife公司；
G-2TM Plus胚胎培养基：10132，购自瑞典Vitrolife公司；
Essential 8培养基：A1517001，购自美国Gibco公司；
Essential 6培养基：A1516401，购自美国Gibco公司；
RPMI 1640(含有GlutaMAX)：61870036，购自美国Gibco公司；
Anti-adhension rinsing溶液：07010，购自美国STEMCELL公司
B27添加剂：12587-010，购自美国Gibco公司；
非必须氨基酸，MEM非必需氨基酸，11140076，购自美国Gibco公司；
β-巯基乙醇：21985023，购自美国Gibco公司；
重组人骨形态发生蛋白4：314-BP，购自美国R&D Systems公司；
重组人白血病抑制因子：225-SC，购自美国R&D Systems公司；
重组人激活素A蛋白：338-AC，购自美国R&D Systems公司；
重组人成纤维细胞生长因子2：3718-FB，购自美国R&D Systems公司；
ROCK抑制剂：具体种类为Y27632，HY-10071，购自美国MCE公司；
CHIR99021：具体种类为Laduviglusib trihydrochloride，HY-10182B，购自美国MCE公司。
(2)G1ER培养基的配制：
体积百分比为50％的G-1TM Plus卵裂球培养基、25％的Essential 8培养基和25％的RACL培养基；所述RACL培养基包含体积百分比为98.5％的基础培养基RPMI 1640(含有GlutaMAX)、体积百分比为1％的B27添加剂、体积百分比为0.5％的青霉素-链霉素双抗、0.1mM非必须氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇，100ng/mL重组人激活素A蛋白、20ng/mL重组人白细胞因子蛋白、3μM CHIR 99021。
(3)含有Y-27632的G1ER培养基的配制：
体积百分比为50％的G-1TM Plus卵裂球培养基、25％的Essential 8培养基和25％的RACL培养基；所述RACL培养基包含98.5％的基础培养基RPMI 1640(含有GlutaMAX)、体积百分比为1％的B27添加剂、体积百分比为0.5％的青霉素-链霉素双抗、0.1mM非必须氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇，100ng/mL重组人激活素A蛋白、20ng/mL重组人白细胞因子蛋白、3μMCHIR 99021、10μM Y-27632。
(4)G2EE培养基的配制：
体积百分比为50％的G-2TM Plus胚胎培养基、25％的Essential 8培养基和25％的EBB培养基；所述EBB培养基包含100％的Essential 6培养基、20ng/mL重组人骨形态发生蛋白4、10ng/mL重组人成纤维细胞生长因子2。
(5)aG2EE培养基的配制：
体积百分比为50％的G-2TM Plus胚胎培养基、25％的Essential 8培养基和25％的aEBB培养基；所述aEBB培养基包含100％的Essential 6培养基以及多种细胞因子：100ng/mL重组人骨形态发生4蛋白、10ng/mL重组人成纤维细胞生长因子2。
(6)bG2EE培养基的配制：
体积百分比为50％的G-2TM Plus胚胎培养基、25％的Essential 8培养基和25％的bEBB培养基；所述bEBB培养基包含100％的Essential 6培养基以及多种细胞因子：75ng/mL重组人骨形态发生4蛋白、10ng/mL重组人成纤维细胞生长因子2。
实施例1由人诱导多能干细胞(iPSCs)诱导类原肠胚(一阶段)：0-3天，原始内、外胚盘形成
在人诱导多能干细胞DYR0100长至80-90％汇合度时使用TrypLE Select将细胞消化为单细胞，使用PBS将细胞进行重悬，得到细胞悬液1；
取含有9.0x104个细胞的细胞悬液1，加入2mL含有Y-27632的G1ER培养基重悬细胞，得到细胞悬液2；
将细胞悬液2接种到提前使用抗黏附溶液Anti-adhension rinsing Solution进行包被的Agreewell 400TM培养皿的一个孔中，使用水平离心机800rpm离心2分钟后，每微孔细胞量为75个细胞(Agreewell 400TM培养皿每孔有1200个微孔，即各微孔细胞量为9.0x104/1200＝75个)；
培养第2天采用G1ER培养基每天换半液至培养第3天，形成原始内、外胚盘。
实施例2由人诱导多能干细胞(hiPSCs)诱导类原肠胚(二阶段)：第4天，羊膜腔预诱导
将一阶段G1ER培养基弃去3/4体积/孔，即1.75mL/孔后贴壁缓慢加入二阶段G2EE培养基，防止已形成的类原肠胚从微孔中浮起后融合，进行羊膜腔预诱导。
实施例3由人诱导多能干细胞(hiPSCs)诱导类原肠胚(三阶段)：第5天，羊膜细胞诱导
将二阶段G2EE培养基弃去3/4体积/孔，即1.75mL/孔后贴壁缓慢加入三阶段aG2EE培养基，防止已形成的类原肠胚从微孔中浮起后融合，诱导形成羊膜细胞。
实施例4由人诱导多能干细胞(hiPSCs)诱导类原肠胚(四阶段)：第6-7天，羊膜细胞、原条细胞、原始生殖细胞诱导
将三阶段aG2EE培养基弃去3/4体积/孔，1.75mL/孔后贴壁缓慢加入四阶段bG2EE培养基，防止已形成的类原肠胚从微孔中浮起后融合，24小时后继续换液(bG2EE培养基)1.75mL，培养至第7天，诱导得到羊膜细胞、原条细胞、原始生殖细胞，获得所述植入后类原肠胚模型。
实施例5由人胚胎干细胞(hESCs)诱导类原肠胚，重复实施例1-4实验内容
(1)0-3天，原始内、外胚盘形成：
在人胚胎干细胞H1长至80-90％汇合度时使用TrypLE Select将细胞消化为单细胞，使用PBS将细胞进行重悬，得到细胞悬液1；
取含有9.0x104个细胞的细胞悬液1，加入2mL含有Y-27632的G1ER培养基重悬细胞，得到细胞悬液2；
将细胞悬液2接种到提前使用抗黏附溶液Anti-adhension rinsing Solution进行包被的Agreewell 400TM培养皿的一个孔中，使用水平离心机800rpm离心2分钟后，每微孔细胞量为75个细胞(Agreewell 400TM培养皿每孔有1200个微孔，即各微孔细胞量为9.0x104/1200＝75个)；
培养第2天采用G1ER培养基每天换半液至培养第3天，形成原始内、外胚盘。
(2)第4天，羊膜腔预诱导：
将一阶段G1ER培养基弃去3/4体积/孔，即1.75mL/孔后贴壁缓慢加入二阶段G2EE培养基，防止已形成的类原肠胚从微孔中浮起后融合，进行羊膜腔预诱导；
(3)第5天，羊膜细胞诱导：
将二阶段G2EE培养基弃去3/4体积/孔，即1.75mL/孔后贴壁缓慢加入三阶段aG2EE培养基，防止已形成的类原肠胚从微孔中浮起后融合，诱导形成羊膜细胞。
(4)第6-7天，羊膜细胞、原条细胞、原始生殖细胞诱导：
将三阶段aG2EE培养基弃去3/4体积/孔，1.75mL/孔后贴壁缓慢加入四阶段bG2EE培养基，防止已形成的类原肠胚从微孔中浮起后融合，24小时后继续换液(bG2EE培养基)1.75mL，培养至第7天，诱导得到羊膜细胞、原条细胞、原始生殖细胞，获得所述类原肠胚模型。
实施例6对由人诱导多能干细胞(hiPSCs)诱导类原肠胚的生物学特性进行验证说明
1.1诱导类原肠胚形态学观察
在正置荧光显微镜下观察实施例1～4中培养皿中诱导1-7天的类原肠胚模型，可见细胞生长较快，类原肠胚的体积逐渐增大，在3天时存在明显的两胚盘排列结构，4-5天时出现羊膜腔结构，4-7天时部分类原肠胚中出现卵黄囊结构。7天时类原肠胚的直径范围约为250-350μm。形态学观察结果如图1A和图2所示。
1.2诱导植入后类原肠胚生长曲线的测定
1.2.1生长曲线测定步骤
实施例1～4中培养皿中诱导1-7天的过程中，每24小时取材一次；
取材后使用4％多聚甲醛固定30分钟，弃固定液加入PBS进行清洗3遍，5分钟/遍；
接着使用5％牛血清白蛋白(含1％tTriton)室温下进行封闭4小时；
接着按照1:200的比例稀释DAPI后进行染色，室温下染色4小时；
弃DAPI稀释液后加入PBS洗3遍，5分钟/遍，将样品移入Chamber染色小室中，并且加入一定量配置好的碘海醇溶液进行透明化，在Chamber小室上轻盖载玻片后使用共聚焦显微镜拍摄；
拍摄后使用IMARIS软件调整参数后进行单样品计数，每个天数的样品有20-36个重复。
1.2.2生长曲线测定结果
连续测定7天，得到下述表1所示的生长曲线数据。
表1示出了连续测定7天所得到的生长曲线数据，每个天数的样品20-35个重复不等
基于表1中的细胞生长曲线数据，得到如图3A所示的诱导植入后类原肠胚生长曲线示意图。图3的横坐标为诱导培养时间(天数)，纵坐标为单个类原肠胚中细胞数目(个)。
参考表1中的生长曲线数据及图3A所示的生长曲线示意图，可以看出类原肠胚中的细胞稳步增殖，由初始0天时50-75/个的细胞量增长到7天时1040/个的细胞量。
综上可知，诱导类原肠胚细胞增殖速度较快，细胞生长活跃，细胞活性状态佳，细胞诱导稳定性高，体外诱导具有稳定的细胞生长特性。
1.3免疫荧光鉴定(Immunofluorescence，IF)
1.3.1免疫荧光鉴定过程
实施例1～4中培养皿中诱导1-7天的过程中，每24小时取材一次；
使用4％多聚甲醛固定30分钟，弃固定液加入PBST进行清洗3遍，5分钟/遍；
使用5％牛血清白蛋白(含1％tTriton)室温下进行封闭4小时；
弃封闭液，加入按比例稀释好的抗体，4℃孵育24小时；
弃一抗后加PBS(含1％Triton)清洗3遍，5分钟/遍，加入稀释好的二抗和DAPI，室温孵育4小时；
弃二抗后加PBS(含1％Triton)清洗3遍，5分钟/遍，将样品移入Chamber染色小室中，并且加入一定量配置好的碘海醇溶液进行透明化，在Chamber小室上轻盖载玻片后使用共聚焦显微镜拍摄。
1.3.2免疫荧光鉴定结果
免疫荧光鉴定结果如图4-图6所示。
诱导1天时出现了少量GATA6和OCT4双阳性的细胞，混于OCT4和SOX2阳性的原始外胚层中，代表原始内胚层的谱系开始分化；诱导2天时GATA6阳性的细胞开始增多，同时出现了SOX17阳性的细胞，并且该类型的细胞逐渐从原始外胚层中分离出来，进一步显示原始内胚层细胞增多；诱导3天时可见GATA6和SOX17阳性的原始内胚层细胞与OCT4和SOX2阳性的原始外胚层细胞完全分离，并且两种细胞类型间形成了排列整齐的两胚盘结构，其中原始外胚层细胞核呈现出柱状立体细胞，原始内胚层细胞核呈现出矮柱状细胞(图4)。
诱导4-5天时原始外胚层侧逐渐出现了一个腔状结构，符合羊膜腔的特征，并且出现了转录因子2a(TFAP2a)、CDX2和OCT4阳性且SOX2阴性的细胞，成为了早期羊膜细胞。诱导6-7天时出现TFAP2a、CDX2阳性且OCT4和SOX2阴性的成熟羊膜细胞，且细胞核的形态变得扁平，类似于成熟的鳞状羊膜上皮细胞(图5)。
诱导6-7天时OCT4阳性的柱状原始外胚层中出现了T、EOMES和MIXL1阳性的细胞，且OCT4阳性逐渐变弱，类似于原条细胞，证明类原肠胚开始发生上皮间充质转化(EMT)，开始原肠运动(图6)。
1.4 RNA测序鉴定
1.4.1 RNA测序鉴定步骤
实施例1～4中培养皿中对诱导第7天的类原肠胚进行取材；
移除培养基，用PBS(0.01M，PH7.4)洗涤类原肠胚至少两次，以去除旧的培养基和脱落的死细胞碎片，用2mL 0.24％Trypsin消化处理，放置37℃环境中消化3分钟，使用移液枪轻轻进行吹打，将类原肠胚吹打为单细胞后使用带有血清的培养基终止消化；
1000rpm离心5分钟，移除上清液。使用PBS进行重悬后转移至无酶的EP管中送测。
1.4.2 RNA测序鉴定结果
对诱导第7天的类原肠胚数据进行分析聚类，结果显示培养得到的类原肠胚共分为7大群，分别为原始外胚层、原始内胚层、原条原基细胞、原条、原始生殖细胞、羊膜和中胚层，并使用3个已知相关的特异marker共定位结果进行验证。其中POIU5F1、SOX2、DNMT3B定义原始外胚层；HNF4A、FOXA2、PDGFRA定义原始内胚层；使用TFAP2A、ISL1、ABCG2定义羊膜；使用TBXT、EOMES、MIXL1定义原条前体细胞和原条；使用HAND1、BMP4、SNAI2定义中胚层相关以及使用PRDM1、TFAP2C、NANOG定义原始生殖细胞(图7)。
实施例7对由人胚胎干细胞(hESCs)诱导类原肠胚的生物学特性进行验证说明
1.3 1.1诱导植入后类原肠胚形态学观察
在正置荧光显微镜下观察实施例5中培养皿中诱导1-7天的类原肠胚模型，可见细胞生长较快，类原肠胚的体积逐渐增大，在3天时存在明显的两胚盘排列结构，4-5天时出现羊膜腔结构，4-7天时部分类原肠胚中出现卵黄囊结构。7天时类原肠胚的直径范围约为250-350μm。形态学观察结果如图1B所示。
1.2诱导植入后类原肠胚生长曲线的测定
1.2.1生长曲线测定步骤
实施例5中培养皿诱导1-7天的过程中，每24小时取材一次；
取材后使用4％多聚甲醛固定30分钟，弃固定液加入PBS进行清洗3遍，5分钟/遍；
接着使用5％牛血清白蛋白(含1％Triton)室温下进行封闭4小时；
接着按照1:200的比例稀释DAPI后进行染色，室温下染色4小时；
弃DAPI稀释液后加入PBS洗3遍，5分钟/遍，将样品移入Chamber染色小室中，并且加入一定量配置好的碘海醇溶液进行透明化，在Chamber小室上轻盖载玻片后使用共聚焦显微镜拍摄；
拍摄后使用IMARIS软件设置调整参数后进行单样品计数，每个天数的样品有20-36个重复。
1.2.2生长曲线测定结果
连续测定7天，得到下述表1所示的生长曲线数据。
表2示出了连续测定7天所得到的生长曲线数据，每个天数的样品30-37个重复不等
基于表2中的细胞生长曲线数据，得到如图3B所示的诱导类原肠胚生长曲线示意图。图3B的横坐标为诱导培养时间(天数)，纵坐标为单个类原肠胚中细胞数目(个)。
请参考表1中的生长曲线数据及图3所示的生长曲线示意图，可以看出类原肠胚中的细胞稳步增殖，由初始0天时50-75/个的细胞量增长到7天时986/个的细胞量。
综上可知，诱导类原肠胚细胞增殖速度较快，细胞生长活跃，细胞活性状态佳，细胞诱导稳定性高，体外诱导具有稳定的细胞生长特性。
实施例8一种人多能干细胞来源的体外类原肠胚诱导模型的应用
选用沙利度胺(Thalidomide)进行早期胚胎致畸的药物的模型测试。选用5μM、10μM两个梯度，并且增加空白对照组和二甲基亚砜组(沙利度胺溶解剂)进行测试。
在人诱导多能干细胞DYR0100长至80-90％汇合度时使用TrypLE Select将细胞消化为单细胞，使用PBS将细胞进行重悬，得到细胞悬液1；
取含有9.0x104个细胞的细胞悬液1，加入2mL含有Y-27632的G1ER培养基重悬细胞，再分别加入5μM、10μM的1‰沙利度胺二甲基亚砜溶液以及空白对照组总共4个组别，得到细胞悬液2；
将细胞悬液2重新接种到提前使用抗黏附溶液Anti-adhension rinsingSolution进行包被的Agreewell 400TM培养皿的一个孔中，使用水平离心机800rpm离心2分钟后，每微孔细胞量为50-75个细胞(Agreewell 400TM培养皿每孔有1200个微孔，即各微孔细胞量为9.0x104/1200＝75个)；
培养第二天采用G1ER培养基换半液，并分别加入5μM、10μM的1‰沙利度胺、二甲基亚砜溶液以及空白对照，每天换半液至培养第三天；
完成一阶段诱导时进行4个组别的取材，白光的记录后使用4％多聚甲醛固定30分钟，进行相关免疫荧光的染色用于验证统计；
培养至3天时，将一阶段G1ER培养基弃去1.75mL后贴壁缓慢加入二阶段G2EE培养基，并分别加入5μM、10μM的1‰沙利度胺、二甲基亚砜溶液以及空白对照，防止已形成的类原肠胚从微孔中浮起后融合；
培养至4天时，将二阶段G2EE培养基弃去1.75mL后贴壁缓慢加入三阶段aG2EE培养基，并分别加入分别含有5μM、10μM的1‰沙利度胺、二甲基亚砜溶液以及空白对照，防止已形成的类原肠胚从微孔中浮起后融合；
培养至5天时，将三阶段aG2EE培养基弃去1.75mL后贴壁缓慢加入四阶段bG2EE培养基并分别加入5μM、10μM的1‰沙利度胺、二甲基亚砜溶液以及空白对照，防止已形成的类原肠胚从微孔中浮起后融合，24小时后继续换液(bG2EE培养基)1.75mL，培养至第7天；
完成四阶段诱导时进行4个组别的取材，白光的记录后使用4％多聚甲醛固定30分钟，进行相关细胞核染色用于验证统计。
7天的取材白光结果中明显看出，加药组与对照组相比类原肠胚的体积减小，且内部缺乏腔化结构，通过使用DAPI染色进一步标记细胞核发现，与对照组相比，加药组类原肠胚内部呈现出相对无序的结构，无法形成羊膜腔和卵黄囊，仅发生了胚层分离(图8A)。
同时进一步对对照组和加药组的单个类原肠胚进行细胞量和体积的计数统计，发现随着加药浓度的增加，类原肠胚的细胞数量和体积减小，且与空白对照组和二甲基亚砜对照组相比有明显的统计学差异(图8B、C)。
可以看出所述的类原肠胚模型，或源于该模型的组织或器官或其培养物能够用于筛选、验证、评价、评估或研究预防和/或治疗人类早期胚胎发育疾病药物的药效。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。本发明说明书及其附图均为说明性而并非构成对权利要求的限制。本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。本发明说明书包含多项发明构思，诸如“优选地”、“根据一个优选实施方式”或“可选地”均表示相应段落公开了一个独立的构思，申请人保留根据每项发明构思提出分案申请的权利。在全文中，“优选地”所引导的特征仅为一种可选方式，不应理解为必须设置，故此申请人保留随时放弃或删除相关优选特征之权利。

Claims (10)

1.一种类原肠胚模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤，
(1)在多能干细胞长至80-90％汇合度时将细胞消化为单细胞，使用PBS将细胞进行重悬，得到细胞悬液1；
取细胞悬液1加入含有Y-27632的G1ER培养基进一步重悬细胞，得到细胞悬液2；
将细胞悬液2接种到提前使用抗黏附溶液进行包被的类胚体培养板中，离心；
培养第二天采用G1ER培养基换半液，每天换半液至培养直至形成原始内、外胚盘；
优选的，所述细胞悬液1与含有Y-27632的G1ER培养基的比例为：每包含7.5-9.0×104个细胞的细胞悬液1中加入2ml含有Y-27632的G1ER培养基；
优选的，所述细胞悬液2接种的每微孔细胞量为50-75个细胞；
(2)将(1)培养板各孔中的G1ER培养基弃去1/2～3/4体积后加入G2EE培养基培养，进行羊膜腔预诱导；
(3)将(2)培养板各孔中的G2EE培养基弃去1/2～3/4体积后加入aG2EE培养基培养，诱导形成羊膜细胞；
(4)将(3)培养板各孔中的aG2EE培养基弃去1/2～3/4体积后加入bG2EE培养基培养；直至诱导得到羊膜细胞、原条细胞、原始生殖细胞，获得所述植入后类原肠胚模型。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述多能干细胞为诱导多能干细胞或胚胎干细胞；优选的，为人源诱导多能干细胞或胚胎干细胞。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述G1ER培养基的成分包含：体积百分比为50％的G-1TM Plus卵裂球培养基、25％的Essential 8培养基和25％的RACL培养基；
所述RACL培养基包含体积百分比为95％-98.5％的基础培养基RPMI 1640(含有GlutaMAX)、体积百分比为1％的B27添加剂、体积百分比为0.5％的青霉素-链霉素双抗、0.1mM非必须氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇，100ng/ml重组人激活素A蛋白、20ng/ml重组人白细胞因子蛋白、3μM CHIR 99021；
含有Y-27632的G1ER培养基的成分包含：
体积百分比为50％的G-1TMPlus卵裂球培养基、25％的Essential 8培养基和25％的RACL培养基；所述RACL培养基包含95％-98.5％的基础培养基RPMI 1640(含有GlutaMAX)、体积百分比为1％的B27添加剂、体积百分比为0.5％的青霉素-链霉素双抗、0.1mM非必须氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇，100ng/ml重组人激活素A蛋白、20ng/ml重组人白细胞因子蛋白、3μM CHIR 99021、10μM Y-27632。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述G2EE培养基的成分包含：体积百分比为50％的G-2TM Plus胚胎培养基、25％的Essential 8培养基和25％的EBB培养基；所述EBB培养基包含100％的Essential 6培养基、20ng/ml重组人骨形态发生蛋白4、10ng/ml重组人成纤维细胞生长因子2。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述aG2EE培养基的成分包含：体积百分比为50％的G-2TM Plus胚胎培养基、25％的Essential 8培养基和25％的aEBB培养基；所述aEBB培养基包含100％的Essential 6培养基、100ng/ml重组人骨形态发生4蛋白、10ng/ml重组人成纤维细胞生长因子2。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)所述bG2EE培养基的成分包含：
体积百分比为50％的G-2TM Plus胚胎培养基、25％的Essential 8培养基和25％的bEBB培养基；所述bEBB培养基包含100％的Essential 6培养基、75ng/ml重组人骨形态发生4蛋白、10ng/ml重组人成纤维细胞生长因子2。
7.一种类原肠胚模型，其特征在于，采用权利要求1所述的方法构建得到。
8.权利要求7所述的类原肠胚模型，或源于该模型的组织或器官或其培养物在人类早期胚胎发育机制研究中的应用。
9.权利要求7所述的类原肠胚模型，或源于该模型的组织或器官或其培养物在人类早期胚胎发育疾病的诊断策略和/或治疗策略中的应用。
10.权利要求7所述的类原肠胚模型，或源于该模型的组织或器官或其培养物在筛选、验证、评价、评估或研究预防和/或治疗人类早期胚胎发育疾病药物的药效中的应用；优选的，所述人类早期胚胎发育疾病为药物引起的人类早期胚胎致畸。
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相立峰: "人胚胎原肠前动态发育研究", 《中国博士论文库 医药卫生科技辑》, 30 April 2021 (2021-04-30), pages 3 *

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CN117757726A (zh) * 2022-09-19 2024-03-26 南京医科大学 一种类原肠胚干细胞系的构建方法及应用

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