CN116585490A - 一种微环境响应性免疫激活水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种微环境响应性免疫激活水凝胶及其制备方法和应用，属于水凝胶的制备技术领域。本发明公开的微环境响应性免疫激活水凝胶主要包括氧化海藻酸钠链(OSA‑β‑CD)、铁死亡诱导剂(醉茄素A前药(WA‑cRGD))和程序性细胞死亡配体1抗体(aPD‑L1)，其中氧化海藻酸钠链(OSA‑β‑CD)作为主链与程序性细胞死亡配体1抗体(aPD‑L1)通过钙离子(Ca2+)交联而成，所述铁死亡诱导剂负载于氧化海藻酸钠链(OSA‑β‑CD)的疏水空腔内。该水凝胶的主链为具有生物相容性、生物降解性的氧化海藻酸钠链，凝胶化快速、高效，可用于原位成胶。

Description

一种微环境响应性免疫激活水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于水凝胶的制备技术领域，涉及一种微环境响应性免疫激活水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
近些年来，外科手术是临床上治疗实体瘤最广泛的方法，但由于大多数实体瘤的高度浸润性，尽管对肿瘤进行了最大限度的安全切除，但仍未能彻底根除肿瘤细胞，并且残留的肿瘤细胞和术后免疫抑制微环境会引发肿瘤局部复发或远端转移，这将严重威胁患者的生命健康。因此，在手术切除肿瘤后施加辅助抗肿瘤治疗是必要的，可抑制手术腔内的残余肿瘤细胞生长，延长患者的生存期。常见的辅助治疗方案包括化疗和放疗。然而，这些治疗通常缺乏内在的肿瘤选择性，不能提供持续的保护，同时存在不良反应的风险。因此，开发新的辅助治疗方法来治疗切除的肿瘤具有临床意义，这种方法能够以可持续的方式选择性地清除手术腔中的肿瘤细胞。
免疫疗法是一种新型的抗肿瘤疗法，它能调动患者的免疫系统来识别和破坏肿瘤细胞。目前肿瘤免疫疗法的成功例子集中在细胞毒性T细胞(CTL)的激活和增强上，CTL是适应性抗肿瘤免疫反应中的中心效应细胞群体。由于CTL介导的适应性免疫的抗原特异性，活化的CTL可以高效和精确地选择性清除肿瘤细胞。此外，CTL依赖性适应性抗肿瘤免疫可以产生持久的全身免疫作用，以抑制原发性肿瘤的生长以及抑制转移性肿瘤侵袭和进展。这些优点使免疫疗法成为术后肿瘤治疗的有效策略，但其疗效仍受到手术部位多因素导致的免疫抑制微环境的阻碍，包括肿瘤特异性抗原暴露不足以及残留肿瘤细胞和T细胞之间的PD-1/PD-L1相互作用，这将严重损害局部T细胞的启动和效应功能。这些挑战需要新的治疗策略来重塑术后伤口免疫环境，以提高CTL介导的抗肿瘤作用的稳定性和持久性。
铁死亡是一种新定义的细胞程序性死亡模式，此种细胞死亡方式区别于凋亡、坏死、焦亡等，其特征是铁介导的过量脂质过氧化物的积累。在抗肿瘤治疗中铁死亡机制已经引起了研究者们的广泛兴趣，因为肿瘤细胞经常表现出细胞凋亡控制的丧失，从而对细胞凋亡诱导疗法具有内在的抵抗力。值得注意的是，最近的研究表明，发生铁死亡的细胞的质膜会经历一系列氧化修饰，并释放典型的损伤相关模式分子，如ATP和HMGB1。事实上，已经有大量证据表明，铁死亡参与CTL的肿瘤细胞杀伤作用，并为启动免疫识别和引发肿瘤特异性CTL介导的抗肿瘤免疫提供了潜在的靶点。因此，铁死亡和免疫疗法的战略结合已成为肿瘤术后治疗的一种有前途的方法。
水凝胶因其良好的生物相容性、可控降解性、组织粘附性和高效包覆治疗药物等优良的生物学特点，已被广泛用于肿瘤术后治疗以及组织修复等临床医学领域。一般来说，水凝胶是指亲水聚合物链形成的具有三维网状结构的高分子聚合物，其聚合物链和网状结构为药物的递送提供附着点。值得注意的是，具有原位、缓释、控释给药特性的水凝胶在抗肿瘤免疫治疗中具有巨大潜力，即水凝胶局部给药的特性增强了治疗药物的靶向性从而减少全身毒性，同时水凝胶缓释、控释特点减少了药物的使用剂量和频次从而提高患者的依从性，为肿瘤术后治疗提供了有效的解决方案。
因此，如何构建原位递送铁死亡诱导剂和PD-L1抗体免疫调节剂的水凝胶，通过诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡引发强大的CTL介导的免疫治疗，成为免疫治疗的新思路。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种微环境响应性免疫激活水凝胶；本发明的目的之二在于提供一种微环境响应性免疫激活水凝胶的制备方法；本发明的目的之三在于提供一种微环境响应性免疫激活水凝胶在制备激活抗肿瘤免疫效应的药物中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.一种微环境响应性免疫激活水凝胶，所述水凝胶包括氧化海藻酸钠链(OSA-β-CD)、铁死亡诱导剂和程序性细胞死亡配体，其中氧化海藻酸钠链(OSA-β-CD)作为主链与程序性细胞死亡配体1抗体(aPD-L1)通过钙离子(Ca2+)交联而成，所述铁死亡诱导剂负载于氧化海藻酸钠链(OSA-β-CD)的疏水空腔内；
所述氧化海藻酸钠链(OSA-β-CD)的结构式为：
其中x、m和n均为大于等于2的整数；
所述水凝胶中铁死亡诱导剂的含量为1.1～1.5mg/mL
所述铁死亡诱导剂为醉茄素A前药(WA-cRGD)，其中醉茄素A前药(WA-cRGD)的结构式为：
优选的，所述氧化海藻酸钠链(OSA-β-CD)按照如下方法制备：
将氧化海藻酸钠(OSA)分散在PBS缓冲溶液中，加入氨基化β-环糊精(NH2-β-CD)，室温下搅拌反应24h，转移到透析袋中透析，冷冻干燥后得到氧化海藻酸钠链(OSA-β-CD)。
进一步优选的，所述氧化海藻酸钠(OSA)与氨基化β-环糊精(NH2-β-CD)的质量比为1:0.4；
所述透析袋的截留分子量为3000DA。
进一步优选的，所述氧化海藻酸钠(OSA)按照如下方法制备：
将海藻酸钠分散在纯水中，加入高碘酸钠并在室温下避光搅拌6h，然后加入乙二醇以终止反应，转移到透析袋中，用水透析后冷冻干燥，得到氧化海藻酸钠(OSA)；
所述海藻酸钠和高碘酸钠的质量比为2:0.1，所述透析袋的截留分子量为1000DA。
进一步优选的，所述氨基化β-环糊精(NH2-β-CD)按照如下方法制备：
(1)将β-环糊精(β-CD)分散在纯水中，加入氢氧化钠至澄清，继续滴加对甲苯磺酰氯(TOS)的乙腈溶液，在室温下连续搅拌反应3h后用盐酸溶液调节至中性，形成混合溶液；
(2)将所述混合溶液在4℃冰箱中重结晶过夜，离心收集沉淀物，反复用丙酮进行重结晶、纯化和蒸馏水沉淀，真空冷冻干燥后得到TOS-β-CD；
(3)将所述TOS-β-CD分散在无水N,N二甲基甲酰胺(DMF)中，在氮气的保护下通过注射器滴加乙二胺，在60℃下加热搅拌反应12h，自然降至室温后，逐滴加入丙酮溶液中沉淀，过滤后用乙醇和丙酮洗涤沉淀，将沉淀物进行重结晶后进行透析，真空冷冻干燥后得到氨基化β-环糊精(NH2-β-CD)；
所述β-环糊精(β-CD)、甲苯磺酰氯(TOS)的摩尔比为1:1，所述TOS-β-CD和乙二胺的摩尔体积比为2.33:3，mmol:mL，所述重结晶后进行透析中重结晶时采用的是乙醇和丙酮作为溶剂、透析时采用的透析袋的截留分子量为500DA。
优选的，所述醉茄素A前药(WA-cRGD)按照如下方法制备：
(1)制备WA-S-S-OH：在氮气保护下，向醉茄素A和三光气中加入无水二氯甲烷溶解，在冰水浴中搅拌20min后在氮气的保护下逐滴加入4-二甲氨基吡啶的无水乙醇溶液，在冰水浴下持续搅拌反应0.5h，逐滴加入硫酸亚乙烯酯的无水四氢呋喃溶液，在室温下搅拌24h后，用盐酸溶液反复洗涤后收集有机相，用饱和盐水反复洗涤收集有机相，用纯水洗涤收集有机相后旋转蒸发干燥后通过硅胶柱色谱纯化，得到干燥WA-S-S-OH；
(2)制备WA-S-S-Mal：将所述WA-S-S-OH溶于无水二氯甲烷后加入6-马来酰亚胺己酸，在室温下搅拌混合均匀后加入二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，室温下搅拌反应2～3h后，用饱和氯化钠溶液反复洗涤收集有机相，旋转蒸发后干燥，硅胶柱色谱法纯化，干燥得到WA-S-S-Mal；
(3)制备醉茄素A前药(WA-cRGD)：将所述WA-S-S-Mal分散在PBS缓冲溶液中，加入cRGD，在室温下搅拌反应24h后，转移到透析袋中用去离子水透析，冷冻干燥得到醉茄素A前药(WA-cRGD)。
进一步优选的，步骤(1)中，所述醉茄素A、三光气、4-二甲氨基吡啶、硫酸亚乙烯酯的摩尔比为1.44:0.46:4.6:14.3，所述硅胶柱色谱纯化中采用体积比为5:1的二氯甲烷和乙酸乙酯混合液作为洗脱液；
步骤(2)中，所述WA-S-S-OH、6-马来酰亚胺己酸、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的质量比为100:30:15:10，所述硅胶柱色谱法纯化中采用的洗脱剂依次为二氯甲烷、体积分数为1～5％的二氯甲烷的甲醇溶液；
步骤(3)中，所述WA-S-S-Mal、cRGD的质量比为50:20，所述透析袋的截留分子量为500DA。
优选的，将所述铁死亡诱导剂负载于氧化海藻酸钠链(OSA-β-CD)的疏水空腔内的方法具体为：
将所述氧化海藻酸钠链(OSA-β-CD)溶于PBS缓冲溶液中，加入所述铁死亡诱导剂，在室温下搅拌反应6h后转移至透析袋中透析72h，冷冻干燥后即可将铁死亡诱导剂负载于氧化海藻酸钠链(OSA-β-CD)的疏水空腔内；
所述氧化海藻酸钠链(OSA-β-CD)与铁死亡诱导剂的质量比为10:1,所述透析袋的截留分子量为1500～3000DA。
2.上述微环境响应性免疫激活水凝胶的制备方法，所述方法具体为：
将所述铁死亡诱导剂负载于氧化海藻酸钠链(OSA-β-CD)的疏水空腔内，加入含有程序性细胞死亡配体1抗体(aPD-L1)的PBS缓冲溶液中，搅拌反应形成混合溶液，继续加入氯化钙(CaCl2)溶液，室温下搅拌成胶即可得到微环境响应性免疫激活水凝胶(Gel@WA-cRGD+aPD-L1)；
所述铁死亡诱导剂、氧化海藻酸钠链(OSA-β-CD)、程序性细胞死亡配体1抗体(aPD-L1)和氯化钙(CaCl2)的质量比为1.1:20:0.4:0.022。
3.上述微环境响应性免疫激活水凝胶在制备激活抗肿瘤免疫效应的药物中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了一种微环境响应性免疫激活水凝胶，主要包括氧化海藻酸钠链(OSA-β-CD)、铁死亡诱导剂(醉茄素A前药(WA-cRGD))和程序性细胞死亡配体1抗体(aPD-L1)，其中氧化海藻酸钠链(OSA-β-CD)作为主链与程序性细胞死亡配体1抗体(aPD-L1)通过钙离子(Ca2+)交联而成，所述铁死亡诱导剂负载于氧化海藻酸钠链(OSA-β-CD)的疏水空腔内。该水凝胶的主链为具有生物相容性、生物降解性的氧化海藻酸钠链，凝胶化快速、高效，可用于原位成胶。本发明的微环境响应性免疫激活水凝胶中环糊精与氧化海藻酸钠间通过席夫碱连接，可在肿瘤微环境酸响应下释放环糊精，其中环糊精中装载的醉茄素A前药(WA-cRGD)通过cRGD靶向肿瘤细胞，并在肿瘤细胞中谷胱甘肽(GSH)作用下断裂二硫键，释放出醉茄素(WA)；同时醉茄素A前药(WA-cRGD)具有靶向肿瘤细胞的功能，对正常细胞具有安全性。本发明的微环境响应性免疫激活水凝胶在肿瘤术后部位原位递送铁死亡诱导剂和PD-L1抗体免疫调节剂，通过诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡引发强大的细胞毒性T细胞(CTL)介导的免疫治疗，成为免疫治疗的新思路。另外本发明微环境响应性免疫激活水凝胶制备方法简单、容易操作，能够实现大批量制备，有助于拓展其应用前景。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为实施例1中不同产物的核磁共振氢谱；其中a为β环糊精(β-CD)、b为氨基化β环糊精(NH2-β-CD)、c为氧化海藻酸钠(OSA)、d为氧化海藻酸钠链(OSA-β-CD)、e为WA-S-S-OH、f为WA-S-S-Mal、g为醉茄素A前药(WA-cRGD)；
图2为实施例1中微环境响应性免疫激活水凝胶的制备过程示意图；
图3为实施例1中微环境响应性免疫激活水凝胶的作用机制示意图；
图4为实施例1中微环境响应性免疫激活水凝胶和对比实施例中制备的水凝胶的形貌和物理化学表征，其中a为氧化海藻酸钠链混合Ca2+前后的对比图、b为水凝胶的可注射性图片、c为实施例1中制备的水凝胶(Gel@WA-cRGD+aPD-L1)的SEM图像、d为不同浓度的实施例1中制备的水凝胶的杨氏模量(其中I的浓度1mg/ml、II的浓度为5mg/ml、III的浓度为10mg/ml、IV的浓度为20mg/ml)、e为不同水凝胶的流变力学分析(G'代表储存模量,G”代表损耗模量，I的浓度1mg/ml、II的浓度为5mg/ml、III的浓度为10mg/ml、IV的浓度为20mg/ml)、f为载药的水凝胶(对比实施例中制备的Gel@WA-cRGD水凝胶)与不载药的水凝胶(对比实施例中制备的Gel水凝胶)的流变力学分析、g和h分别为醉茄素A(WA)和aPD-L1在不同pH下的释放情况、i为对比实施例中制备的Gel水凝胶在体外环境中不同pH下的降解情况、j为对比实施例中制备的Gel水凝胶在体内的降解和药物释放行为的荧光成像、k为j中图像的荧光定量分析(其中Cy5是游离的Cy5、Gel@Cy5是将Cy5包在对比实施例中制备的Gel水凝胶中)；
图5为实施例1中微环境响应性免疫激活水凝胶在实体肿瘤诱导有效的免疫反应以抑制肿瘤的生长效果，其中a为B16F10荷瘤小鼠的治疗方案示意图，b为不同治疗后小鼠B16F10-luc肿瘤进展的生物发光图像，c为不同组小鼠B16F10肿瘤在治疗期间的大小变化，d为不同治疗后小鼠的生存率分析、e为不同治疗组小鼠的体重变化、f为不同治疗后肿瘤组织中GPX4活性的分析、g为不同治疗后肿瘤组织中MDA水平的分析、h为蛋白质印迹分析肿瘤中HMOX1、GPX4、CRT和HMGB1的表达水平、i为不同治疗后肿瘤组织的H&E和TUNEL染色(不同治疗中加入的水凝胶不同，I为对照组(Control，不添加任何水凝胶)、II中采用的是Gel水凝胶、III中采用的是Gel@aPD-L1水凝胶、IV中采用的是Gel@WA-cRGD水凝胶、V中采用的是Gel@WA-cRGD+aPD-L1水凝胶)。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
一种微环境响应性免疫激活水凝胶，具体制备方法如下所示：
1、制备氧化海藻酸钠链，具体方法如下所示：
(1)制备氨基化β环糊精(NH2-β-CD)：将31.7mmol的β-CD(使用1H NMR(400MHz，D2O，ppm)对其进行了表征，如图1中a所示)分散在300mL纯水中，加入氢氧化钠至溶液从乳白色变澄清；在冰浴条件下滴加对甲苯磺酰氯(TOS)的乙腈溶液(31.7mmol对甲苯磺酰氯(TOS)溶于18mL乙腈中形成)，在室温下连续搅拌3h进行反应后用盐酸溶液将pH调节至中性得到混合物溶液；将混合溶液在4℃冰箱中重结晶过夜，离心收集沉淀物并分散到丙酮溶液(以除去未反应的对甲苯磺酰氯)中进行多次重结晶、纯化和蒸馏水沉淀，真空冷冻干燥去除水分后获得TOS-β-CD；将TOS-β-CD(3.0g，2.33mmol)分散在无水N,N二甲基甲酰胺中，在氮气的保护下通过注射器滴加3mL乙二胺溶液，在60℃下加热搅拌反应12h后自然降至室温，滴加到丙酮中沉淀过滤后，用乙醇(50mL)和丙酮(50mL)洗涤沉淀两次得到沉淀物，将沉淀物再溶于水(2mL)中，并用乙醇和丙酮(150mL)重结晶，用透析袋(500Da，MWCO，Millipore)在去离子水中透析3天后通过真空冷冻干燥去除水分，得到NH2-β-CD(使用1H NMR(400MHz，D2O，ppm)对NH2-β-CD进行了表征，如图1中b所示)。
(2)制备氧化海藻酸钠(OSA)：将2g海藻酸钠分散在200mL纯水中，加入0.1g高碘酸钠并在室温下避光搅拌6h，然后加入2mL乙二醇以终止反应，转移到透析袋(1000Da，MWCO，Millipore)中用水透析三天，冷冻干燥后得到氧化海藻酸钠(OSA)(使用1H NMR(400MHz，D2O，ppm)对其进行了表征，如图1中c所示)。
(3)制备氧化海藻酸钠链(OSA-β-CD)：将1g氧化海藻酸钠(OSA)分散在50mL PBS缓冲溶液中，加入400mg氨基化β-环糊精(NH2-β-CD)，在室温下搅拌反应24h后，转移到透析袋(3000Da，MWCO，Millipore)中透析三天，冷冻干燥后得到氧化海藻酸钠链(OSA-β-CD)(使用1H NMR(400MHz，D2O，ppm)对其进行了表征，如图1中d所示)。
2、制备醉茄素A前药(WA-cRGD)，具体方法如下所示：
(1)制备WA-S-S-OH：将1.44mmol醉茄素A和0.46mmol三光气加入250mL三颈烧瓶中，在氮气保护下加入50mL无水二氯甲烷形成混合溶液，在冰水浴中搅拌20分钟后逐滴加入4-二甲氨基吡啶的无水乙醇溶液(将4.6mmol的4-二甲氨基吡啶溶解在10mL的无水乙醇中形成)，在冰水浴条件下持续搅拌0.5h，继续逐滴加入硫酸亚乙烯酯的无水四氢呋喃溶液(将14.3mmol硫酸亚乙烯酯溶于5mL无水四氢呋喃中形成)，在室温下搅拌反应24h后得到组产物，用50mL浓度为0.1M的盐酸溶液洗涤粗产物三次、再用50mL饱和盐水另外洗涤三次、最后用纯水再次洗涤(在洗涤过程中，每次只收集有机相，并通过旋转蒸发进行干燥)，用二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液(二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为5:1)作为洗脱液，通过硅胶柱色谱纯化提取的产物，干燥后得到WA-S-S-OH(使用1H NMR(400MHz，D2O，ppm)对其进行了表征，如图1中e所示)。
(2)制备WA-S-S-Mal：将100mg WA-S-S-OH溶于10mL无水二氯甲烷中，加入30mg6-马来酰亚胺己酸，在室温下搅拌24h，加入15mg二环己基碳二亚胺和10mg 4-二甲氨基吡啶，反应后，用50mL饱和氯化钠溶液洗涤混合物三次(每次仅收集有机相)，将得到的有机相在旋转蒸发器上干燥，并通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱液首先是100mL二氯甲烷，然后是1～5％的二氯甲烷的甲醇溶液)后，收集样品并干燥以得到WA-S-S-Mal(使用1H NMR(400MHz，D2O，ppm)对其进行了表征，如图1中f所示)。
(3)制备醉茄素A前药(WA-cRGD)：将50mg WA-S-S-Mal分散在10mL PBS缓冲溶液中，加入20mg cRGD后在室温下搅拌反应24h，转移到透析袋(500Da，MWCO，Millipore)中用去离子水透析3天，冷冻干燥醉茄素A前药(WA-cRGD)(使用1H NMR(400MHz，D2O，ppm)对其进行了表征，如图1中g所示)。
3、制备微环境响应性免疫激活水凝胶(Gel@WA-cRGD+aPD-L1)，具体方法如下所示：
(1)将500mg氧化海藻酸钠链(OSA-β-CD)分散在20mL PBS缓冲溶液中，加入50mg醉茄素A前药(WA-cRGD)，在室温下搅拌6h后转移到透析袋(其截留分子量为1500DA)中透析72h，冷冻干燥后即可将铁死亡诱导剂(醉茄素A前药(WA-cRGD))负载于氧化海藻酸钠链(OSA-β-CD)的疏水空腔内，即得到OSA@WA-cRGD。
(2)将20mgOSA@WA-cRGD溶于含400μg程序性细胞死亡配体1抗体(aPD-L1)的PBS缓冲液中，4℃下搅拌2h后形成混合溶液，向其中加入CaCl2溶液(10mM)，室温下搅拌成胶即可形成微环境响应性免疫激活水凝胶(Gel@WA-cRGD+aPD-L1)。
上述实施例1中微环境响应性免疫激活水凝胶(Gel@WA-cRGD+aPD-L1)的制备过程如图2所示。
对比实施例
制备不同类型的水凝胶，具体方法如下：
Gel水凝胶：将20mg实施例1中制备的氧化海藻酸钠(OSA)溶于1mL双蒸馏水中，加入CaCl2溶液(10mM)以形成Gel水凝胶。
Gel@WA-cRGD水凝胶:将20mg实施例1中制备的OSA@WA-cRGD溶于1mL双蒸馏水中，加入CaCl2溶液(10mM)以形成Gel@WA-cRGD水凝胶。
Gel@aPD-L1水凝胶：将20mg实施例1中制备的氧化海藻酸钠(OSA)溶于1mL双蒸馏水中，然后加入400μg aPD-L1，然后在4℃下搅拌2h形成混合溶液，将CaCl2溶液(10mM)添加到混合溶液中以形成Gel@aPD-L1水凝胶。
性能机理检测
本发明实施例1中在氧化海藻酸钠上修饰用于载药的环糊精，在环糊精疏水空腔内载入醉茄素A前药(WA-cRGD)，氧化海藻酸钠在CaCl2中的Ca2+作用下与交联形成水凝胶，这种水凝胶内包封aPD-L1，能够增强水凝胶的抗肿瘤免疫功能。将实施例1中制备的微环境响应性免疫激活水凝胶(Gel@WA-cRGD+aPD-L1)通过原位注射的方式将水凝胶注射入手术部位，该水凝胶中的醉茄素A前药和aPD-L1可持续释放到残余肿瘤部位促进抗肿瘤免疫治疗，醉茄素A通过诱导肿瘤细胞铁死亡，使肿瘤细胞释放出损伤相关模式分子和肿瘤相关抗原，增强残余肿瘤的免疫原性，并在aPD-L1协同作用下抑制肿瘤的适应性免疫抵抗，增强CTL介导的抗肿瘤免疫效应，其作用机制如图3所示，具体为：该水凝胶(Gel@WA-cRGD+aPD-L1)中的醉茄素A前药和程序性细胞死亡配体1抗体(aPD-L1)可持续释放到残余肿瘤部位，醉茄素A通过诱导肿瘤细胞铁死亡，使肿瘤细胞释放出损伤相关模式分子和肿瘤相关抗原，刺激抗原提呈细胞成熟，成熟的抗原提呈细胞将抗原呈递给T细胞，并刺激T细胞活化。由于肿瘤微环境中肿瘤细胞可通过PD-1/PD-L1结合抑制T细胞活性，造成免疫抑制，因此在aPD-L1协同作用下对PD-1/PD-L1免疫检查点进行阻断，抑制肿瘤的适应性免疫抵抗，增强CTL介导的抗肿瘤免疫效应。
上述实施例1制备的微环境响应性免疫激活水凝胶(Gel@WA-cRGD+aPD-L1)和对比实施例中制备的水凝胶的形貌、力学性能、药物释放、体内外降解情况如图4所示，其中a为氧化海藻酸钠链混合Ca2+前后的对比图、b为水凝胶的可注射性图片、c为实施例1中制备的水凝胶(Gel@WA-cRGD+aPD-L1)的SEM图像、d为不同浓度的实施例1中制备的水凝胶的杨氏模量(其中I的浓度1mg/ml、II的浓度为5mg/ml、III的浓度为10mg/ml、IV的浓度为20mg/ml)、e为不同水凝胶的流变力学分析(G'代表储存模量,G”代表损耗模量，I的浓度1mg/ml、II的浓度为5mg/ml、III的浓度为10mg/ml、IV的浓度为20mg/ml)、f为载药的水凝胶(对比实施例中制备的Gel@WA-cRGD水凝胶)与不载药的水凝胶(对比实施例中制备的Gel水凝胶)的流变力学分析、g和h分别为醉茄素A(WA)和aPD-L1在不同pH下的释放情况、i为对比实施例中制备的Gel水凝胶在体外环境中不同pH下的降解情况、j为对比实施例中制备的Gel水凝胶在体内的降解和药物释放行为的荧光成像、k为j中图像的荧光定量分析(其中Cy5是游离的Cy5、Gel@Cy5是将Cy5包在对比实施例中制备的Gel水凝胶中)。从图4可以看出，实施例1中制备的微环境响应性免疫激活水凝胶(Gel@WA-cRGD+aPD-L1)具有良好的生物相容性、生物降解性，能在肿瘤微环境中响应性释放铁死亡诱导剂。
实施例4
微环境响应性免疫激活水凝胶的抗肿瘤作用研究，具体如下所示：
将C57BL/6小鼠(雌性，6周)在12h的黑暗/光照周期中，在25℃、RT下饲养，将B16F10-luc细胞皮下注射到C57BL/6小鼠中，并将荷瘤小鼠随机分为5组，每组7只(不同治疗中加入的水凝胶不同，其中I为对照组(Control，不添加任何水凝胶)、II中采用的是Gel水凝胶、III中采用的是Gel@aPD-L1水凝胶、IV中采用的是Gel@WA-cRGD水凝胶、V中采用的是Gel@WA-cRGD+aPD-L1水凝胶)。当肿瘤生长到约200mm3时，麻醉小鼠，然后通过手术切除肿瘤。保留约5％的肿瘤，以表示切除后的残余肿瘤。肿瘤切除后，将不同的水凝胶前体样品注射入伤口，并将10mM无菌氯化钙溶液喷洒到水凝胶前体溶液上进行原位凝胶化，然后缝合以闭合伤口。其次，每三天使用数字卡尺测量一次肿瘤的尺寸，并使用公式Vtumor＝L×W2/2(L：肿瘤的纵向直径，W：肿瘤的横截面直径)计算肿瘤体积。最后，在治疗21天后，对小鼠实施安乐死，收集肿瘤和主要器官，并用PBS洗涤3次。将主要器官和肿瘤包埋在石蜡切片中，然后用H&E和TUNEL试剂盒染色。检测结果如图5所示，其中a为B16F10荷瘤小鼠的治疗方案示意图，b为不同治疗后小鼠B16F10-luc肿瘤进展的生物发光图像，c为不同组小鼠B16F10肿瘤在治疗期间的大小变化，d为不同治疗后小鼠的生存率分析、e为不同治疗组小鼠的体重变化、f为不同治疗后肿瘤组织中GPX4活性的分析、g为不同治疗后肿瘤组织中MDA水平的分析、h为蛋白质印迹分析肿瘤中HMOX1、GPX4、CRT和HMGB1的表达水平、i为不同治疗后肿瘤组织的H&E和TUNEL染色(I为对照组(Control，不添加任何水凝胶)、II中采用的是Gel水凝胶、III中采用的是Gel@aPD-L1水凝胶、IV中采用的是Gel@WA-cRGD水凝胶、V中采用的是Gel@WA-cRGD+aPD-L1水凝胶)。从图5可以看出，本发明实施例1制备的微环境响应性免疫激活水凝胶Gel@WA-cRGD+aPD-L1具有抗肿瘤效应。
综上所述，本发明公开了一种微环境响应性免疫激活水凝胶，水凝胶的主链为具有生物相容性、生物降解性的氧化海藻酸钠链。本发明公开的微环境响应性免疫激活水凝胶是基于海藻酸钠与Ca2+相互作用交联形成，凝胶化快速、高效，可用于原位成胶。水凝胶中环糊精与氧化海藻酸钠链间通过席夫碱连接，可在肿瘤微环境酸响应下释放环糊精。环糊精中装载的WA-cRGD前药通过cRGD靶向肿瘤细胞，并在肿瘤细胞中GSH作用下断裂二硫键，释放出WA。WA-cRGD前药具有靶向肿瘤细胞的功能，对正常细胞具有安全性。本发明的微环境响应性免疫激活水凝胶原位递送铁死亡诱导剂和PD-L1抗体免疫调节剂，通过诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡引发强大的CTL介导的免疫治疗，成为免疫治疗的新思路。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种微环境响应性免疫激活水凝胶，其特征在于，所述水凝胶包括氧化海藻酸钠链、铁死亡诱导剂和程序性细胞死亡配体，其中氧化海藻酸钠链作为主链与程序性细胞死亡配体1抗体通过钙离子交联而成，所述铁死亡诱导剂负载于氧化海藻酸钠链的疏水空腔内；
所述氧化海藻酸钠链的结构式为：
其中x、m和n均为大于等于2的整数；
所述水凝胶中铁死亡诱导剂的含量为1.1～1.5mg/mL
所述铁死亡诱导剂为醉茄素A前药，其中醉茄素A前药的结构式为：
2.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述氧化海藻酸钠链按照如下方法制备：
将氧化海藻酸钠分散在PBS缓冲溶液中，加入氨基化β-环糊精，室温下搅拌反应24h，转移到透析袋中透析，冷冻干燥后得到氧化海藻酸钠链。
3.根据权利要求2所述的水凝胶，其特征在于，所述氧化海藻酸钠与氨基化β-环糊精的质量比为1:0.4；
所述透析袋的截留分子量为3000DA。
4.根据权利要求3所述的水凝胶，其特征在于，所述氧化海藻酸钠按照如下方法制备：
将海藻酸钠分散在纯水中，加入高碘酸钠并在室温下避光搅拌6h，然后加入乙二醇以终止反应，转移到透析袋中，用水透析后冷冻干燥，得到氧化海藻酸钠；
所述海藻酸钠和高碘酸钠的质量比为2:0.1，所述透析袋的截留分子量为1000DA。
5.根据权利要求2所述的水凝胶，其特征在于，所述氨基化β-环糊精按照如下方法制备：
(1)将β-环糊精分散在纯水中，加入氢氧化钠至澄清，继续滴加对甲苯磺酰氯的乙腈溶液，在室温下连续搅拌反应3h后用盐酸溶液调节至中性，形成混合溶液；
(2)将所述混合溶液在4℃冰箱中重结晶过夜，离心收集沉淀物，反复用丙酮进行重结晶、纯化和蒸馏水沉淀，真空冷冻干燥后得到TOS-β-CD；
(3)将所述TOS-β-CD分散在无水N,N二甲基甲酰胺中，在氮气的保护下通过注射器滴加乙二胺，在60℃下加热搅拌反应12h，自然降至室温后，逐滴加入丙酮溶液中沉淀，过滤后用乙醇和丙酮洗涤沉淀，将沉淀物进行重结晶后进行透析，真空冷冻干燥后得到氨基化β-环糊精；
所述β-环糊精、甲苯磺酰氯的摩尔比为1:1，所述TOS-β-CD和乙二胺的摩尔体积比为2.33:3，mmol:mL，所述重结晶后进行透析中重结晶时采用的是乙醇和丙酮作为溶剂、透析时采用的透析袋的截留分子量为500DA。
6.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述醉茄素A前药按照如下方法制备：
(1)制备WA-S-S-OH：在氮气保护下，向醉茄素A和三光气中加入无水二氯甲烷溶解，在冰水浴中搅拌20min后在氮气的保护下逐滴加入4-二甲氨基吡啶的无水乙醇溶液，在冰水浴下持续搅拌反应0.5h，逐滴加入硫酸亚乙烯酯的无水四氢呋喃溶液，在室温下搅拌24h后，用盐酸溶液反复洗涤后收集有机相，用饱和盐水反复洗涤收集有机相，用纯水洗涤收集有机相后旋转蒸发干燥后通过硅胶柱色谱纯化，得到干燥WA-S-S-OH；
(2)制备WA-S-S-Mal：将所述WA-S-S-OH溶于无水二氯甲烷后加入6-马来酰亚胺己酸，在室温下搅拌混合均匀后加入二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，室温下搅拌反应2～3h后，用饱和氯化钠溶液反复洗涤收集有机相，旋转蒸发后干燥，硅胶柱色谱法纯化，干燥得到WA-S-S-Mal；
(3)制备醉茄素A前药：将所述WA-S-S-Mal分散在PBS缓冲溶液中，加入cRGD，在室温下搅拌反应24h后，转移到透析袋中用去离子水透析，冷冻干燥得到醉茄素A前药。
7.根据权利要求6所述的水凝胶，其特征在于，步骤(1)中，所述醉茄素A、三光气、4-二甲氨基吡啶、硫酸亚乙烯酯的摩尔比为1.44:0.46:4.6:14.3，所述硅胶柱色谱纯化中采用体积比为5:1的二氯甲烷和乙酸乙酯混合液作为洗脱液；
步骤(2)中，所述WA-S-S-OH、6-马来酰亚胺己酸、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的质量比为100:30:15:10，所述硅胶柱色谱法纯化中采用的洗脱剂依次为二氯甲烷、体积分数为1～5％的二氯甲烷的甲醇溶液；
步骤(3)中，所述WA-S-S-Mal、cRGD的质量比为50:20，所述透析袋的截留分子量为500DA。
8.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，将所述铁死亡诱导剂负载于氧化海藻酸钠链的疏水空腔内的方法具体为：
将所述氧化海藻酸钠链溶于PBS缓冲溶液中，加入所述铁死亡诱导剂，在室温下搅拌反应6h后转移至透析袋中透析72h，冷冻干燥后即可将铁死亡诱导剂负载于氧化海藻酸钠链的疏水空腔内；
所述氧化海藻酸钠链与铁死亡诱导剂的质量比为10:1,所述透析袋的截留分子量为1500～3000DA。
9.权利要求1～8任一项所述微环境响应性免疫激活水凝胶的制备方法，其特征在于，所述方法具体为：
将所述铁死亡诱导剂负载于氧化海藻酸钠链的疏水空腔内，加入含有程序性细胞死亡配体1抗体的PBS缓冲溶液中，搅拌反应形成混合溶液，继续加入氯化钙溶液，室温下搅拌成胶即可得到微环境响应性免疫激活水凝胶；
所述铁死亡诱导剂、氧化海藻酸钠链、程序性细胞死亡配体1抗体和氯化钙的质量比为1.1:20:0.4:0.022。
10.权利要求1～8任一项所述微环境响应性免疫激活水凝胶在制备激活抗肿瘤免疫效应的药物中的应用。
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