CN116585322B - Bet蛋白降解剂在预防和治疗视网膜退行性改变相关疾病中的应用 - Google Patents

Bet蛋白降解剂在预防和治疗视网膜退行性改变相关疾病中的应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及生物医药技术领域，具体涉及BET蛋白降解剂在预防和治疗视网膜退行性改变相关疾病药物中的应用。

Description

BET蛋白降解剂在预防和治疗视网膜退行性改变相关疾病中 的应用
相关申请的交叉引用
本申请要求于2023年1月16日提交中国专利局的申请号为CN202310077110.7、名称为“BET蛋白降解剂在预防和治疗视网膜退行性改变相关疾病中的应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体涉及一种BET蛋白抑制剂(尤其PROTAC降解剂dBET6)在预防和治疗视网膜退行性改变相关疾病药物中的应用。
背景技术
视网膜退行性疾病是一组以视网膜光感受器细胞死亡为核心病理改变的，可引起严重视力障碍甚至失明的眼底病，包括年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜色素变性、Stargardt病，视锥-视杆细胞营养不良等。
年龄相关性黄斑变性是全球首位不可逆致盲眼病，是最常见的严重危害视力健康视网膜退行性病变。人口老龄化直接导致年龄相关性黄斑变性的患病率逐年增加，已构成严重的社会公共卫生问题。年龄相关性黄斑变性多发生于50岁以上，视力表现为中央视觉下降或视物变形、模糊，随年龄病程加重，现代医学目前尚缺乏明确有效治疗手段。糖尿病性视网膜病变是一种累及眼睛的糖尿病并发症。它是由眼睛视网膜的血管损伤引起的。糖尿病性视网膜病变的早期阶段，可能不会出现症状。随着糖尿病性视网膜病变进展，可能会出现视力模糊、视野中出现黑暗或空白区域、视力减退等症状。视网膜色素变性是一种缓慢进展、双眼发病的视网膜以及视网膜色素上皮的变性，系不同基因突变所致的遗传性视网膜退行性眼病。症状包括夜盲和周边视力丧失。Stargardt病是最常見的遗传性青少年黄斑退化。疾病会导致进行性、严重的视力丧失。Stargardt病图像的特征是在早期和中期出现斑点，在晚期出现视网膜萎缩，这是由于感光细胞死亡枯竭所致。视杆细胞营养不良是一类遗传性眼病，主要影响视网膜的视锥细胞和视杆细胞。患者因视锥细胞和视杆细胞的退化，随着时间的推移视力下降。在儿童时期即可能出现视力下降和畏光症状。之后通常会出现中央视野盲点(暗点)、色觉丧失和周边视力丧失。大多数患者在成年中期失明。
BET(bromodomain and extraterminal domain)蛋白家族包含BRD2、BRD3、BRD4及BRDT蛋白。其中BRD2,3,4在哺乳动物中广谱表达，通过与组蛋白末端乙酰化赖氨酸结合可以促使染色质重塑因子和转录因子等相关蛋白富集于特定的基因转录位点,改变RNA聚合酶Ⅱ的活性,调控基因的表达,参与一系列重要生物活动过程,如细胞生长、细胞周期、炎症等。
PROTAC是双功能分子，由靶蛋白的配体、E3连接酶的配体和连接linker组成，可依赖泛素-蛋白酶体系统对靶蛋白进行降解。BET蛋白是控制炎症反应的关键蛋白，现有技术没有将靶向BET蛋白的PROTAC降解剂用于视网膜退行性改变相关疾病。有鉴于此，提出本申请
发明概述
为解决上述技术问题，本申请经探索发现，BET蛋白降解剂(BET蛋白溴区PROTAC降解剂dBET6)可在一小时内快速降解BET蛋白家族的BRD2,BRD3和BRD4，对光损伤诱导的光感受器细胞死亡、视网膜免疫细胞活化、视网膜结构损伤、视神经光反应损伤、视觉行为损伤有抑制作用，能治疗并改善视网膜退行性病变，且效果非常显著。因此BET蛋白PROTAC降解剂可用于治疗因视网膜退行病变造成的年龄相关性黄斑变性，视网膜色素变性，Stargardt病，视锥-视杆细胞营养不良、糖尿病视网膜病变，以及因视网膜免疫细胞异常活化引起的葡萄膜炎、结膜炎等。
具体的，本申请所采用的技术方案包括如下：
根据本说明书的一个方面,本申请首先提供一种BET蛋白降解剂在预防或治疗视网膜退行性改变相关疾病中的应用，或在制备预防或治疗视网膜退行性改变相关疾病的药物中的应用；或者如下多方面的应用：
BET蛋白PROTAC降解剂在对光损伤诱导的光感受器细胞死亡抑制中的应用；
BET蛋白PROTAC降解剂在视网膜免疫细胞活化抑制中的应用；
BET蛋白PROTAC降解剂在视网膜结构损伤抑制中的应用；
BET蛋白PROTAC降解剂在视神经光反应损伤抑制中的应用；
BET蛋白PROTAC降解剂在视觉行为损伤抑制中的应用。
进一步的，所述BET蛋白降解剂为PROTAC降解剂；
进一步优选的，所述PROTAC降解剂为dBET6。
根据本说明书的一个方面,本申请还提供一种BET蛋白降解剂在筛选或鉴定调控视网膜退行性改变相关疾病的候选抑制剂中的应用。
进一步的，所述筛选或鉴定为：通过分析候选分子对BET蛋白降解的影响，或者分析候选分子对PROTAC降解剂对BET蛋白降解的影响，进而可确定或筛选到候选的抑制剂。
根据本说明书的一个方面,本申请还提供一种预防或治疗视网膜退行性改变相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含BET蛋白降解剂；
进一步的，所述BET蛋白降解剂为PROTAC降解剂；
优选的，所述PROTAC降解剂为dBET6。
进一步的，所述所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
根据本说明书的一个方面,本申请还提供一种在体外或体内调控视网膜退行性改变相关疾病的方法，包括在体内或体外(比如体外动物模型或细胞模型)给予BET蛋白降解剂或包含BET蛋白降解剂的药物组合物的步骤；
优选的，所述调控为抑制、预防或治疗。
进一步的，所述BET蛋白降解剂为PROTAC降解剂；
优选的，所述PROTAC降解剂为dBET6。
根据本说明书的一个方面,本申请还提供一种筛选或鉴定调控视网膜退行性改变相关疾病的候选抑制剂方法，包括分析候选分子对BET蛋白降解的影响，或分析候选分子对PROTAC降解剂对BET蛋白降解的影响；
优选的，所述PROTAC降解剂为dBET6。
进一步的，上述任一所述的应用、方法或药物组合物中，所述BET蛋白包括：BRD2,BRD3和BRD4；
进一步的，上述任一所述的应用、方法或药物组合物中，所述视网膜退行性改变相关疾病包括：年龄相关性黄斑变性，视网膜色素变性，Stargardt病，视锥-视杆细胞营养不良、糖尿病视网膜病变以及因视网膜免疫细胞异常活化引起的葡萄膜炎和结膜炎。
相比于现有技术，本申请至少具有如下技术优势：
1)BET蛋白是控制炎症反应的关键蛋白，本申请首次提出BET蛋白PROTAC降解剂dBET6可用于预防或治疗视网膜退行性改变相关疾病。
2)本申请筛选并证实了降解剂dBET6可在一小时内快速降解小鼠视网膜中BET蛋白家族成员，包括BRD2，BRD3和BRD4，单次注射药效可持续24小时，对于视网膜退行性改变相关疾病具有极其显著的效果。
3)本申请采用光诱导视网膜损伤的小鼠模型，模拟多种视网膜退行性病变的发生、发展过程中共同的病理环节和炎症反应，包括光感受器细胞死亡，视网膜变薄，眼内促炎巨噬细胞聚集等现象；研究结果表明BET蛋白降解剂dBET6对光损伤诱导的光感受器细胞死亡，视网膜免疫细胞活化，视网膜结构损伤，视神经光反应损伤，视觉行为损伤均有有效抑制作用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1、小鼠视网膜各层组织OTC结果；
图2、视网膜蛋白提取与微量蛋白质电泳(WES)结果；
图3、小鼠视网膜组织病理学分析结果；
图4、免疫荧光染色以及蛋白免疫印记对小鼠视网膜中的促炎免疫细胞活化以及炎症因子的表达分析结果；
图5、小鼠视网膜功能ERG分析结果；
图6、小鼠视网膜视觉行为学分析结果；
图7、不同BET抑制剂对小鼠小胶质细胞系BV2的BET蛋白降解效果比较；
图8、不同BET抑制剂对小鼠光感受器细胞系661W的BET蛋白降解效果比较。
发明详述
虽然本申请可以以许多不同的形式来实施，但在此公开的是验证本申请原理的其具体的举例说明性实施方式。应该强调的是，本申请不限于所举例说明的具体实施方式。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并不被解释为限制所描述的主题。
以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本申请而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
除非在下文中另有定义，本申请具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本申请。
术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方式。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方式，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方式组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本申请描述的实施方式能以不同于本申请描述或举例说明的其它顺序实施。
术语“和/或”视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组件中的每一个的具体公开。因此，如在本文中的短语例如“A和/或B”中所使用的术语“和/或”旨在包括A和B；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样地，如在短语例如“A、B和/或C”中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
术语“例如”和“即”仅作为实例使用，而无意于限制，并且不应当诠释为仅涉及在说明书中明确列举的那些项目。
术语“或更多”、“至少”、“超过”等，例如“至少一种”应当理解为包括但不限于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或超过所述值。还包括其间任何更大的数字或分数。
相反地，术语“不超过”包括小于所述值的每个值。例如，“不超过100个核苷酸”包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1和0个核苷酸。还包括其间任何更小的数字或分数。
术语“多个”、“至少两个”、“两个或更多个”、“至少第二个”等应当理解为包括但不限于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。还包括其间任何更大的数字或分数。
术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
如文本所述，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应当理解为包括所叙述范围内的任何整数的值，并且在适当时包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)。
如本文所用，术语“调控”总体上包含了上调或下调两个不同方向的意思，在某些情况下可以理解了抑制或增强，在某些情况下可以理解为降低或提高，在某些情况下可以理解为减少或增多等，具体解释不做限制，根据实际应用语境理解和解释。示例性的，在一些实施方式中，“调控视网膜退行性改变相关疾病”可以理解为“抑制视网膜退行性改变相关疾病”，进而实现疾病的预防或治疗效果。
如本文所用，术语“抑制”和“减少”可互换使用并且表示小于原来的任何变化。“减少”和“抑制”是相对的术语，需要在测量前和测量后间进行比较。“减少”和“抑制”包括完全消耗。
如本文所用，术语“治疗”是指在受试者上进行任何类型的干预或过程，或对该受试者施用活性剂，以达到逆转、减轻、改善、抑制、减缓或预防症状、并发症或状况或与疾病相关的生化指标的发作、进展、发展、严重或复发的目的。在一些实施方式中，“治疗”包括部分缓解；在另一个实施方式中，“治疗”包括完全缓解。
本公开的各种方面进一步详细描述：
1.预防/治疗应用
如本申请实施例1-7所述，通过采用OCT、视网膜组织病理、视网膜蛋白免疫印迹分析以及视网膜电生理对视网膜光损伤模型的研究，发现BET蛋白PROTAC降解剂dBET6对视网膜光感受器细胞凋亡、视网膜炎症反应及其导致的视网膜退行性病变相关的形态及功能改变具有防治作用，且效果十分的显著。因此可以得出BET蛋白PROTAC降解剂在预防和治疗视网膜退行性改变相关疾病中的应用。
此外，本申请应用方面还可以包括如下特定方面：
BET蛋白PROTAC降解剂在对光损伤诱导的光感受器细胞死亡抑制中的应用；
BET蛋白PROTAC降解剂在视网膜免疫细胞活化抑制中的应用；
BET蛋白PROTAC降解剂在视网膜结构损伤抑制中的应用；
BET蛋白PROTAC降解剂在视神经光反应损伤抑制中的应用；
BET蛋白PROTAC降解剂在视觉行为损伤抑制中的应用。
如本文所用，术语“BET蛋白降解剂”是指通过结合BET蛋白蛋白，对其进行降解的制剂，在本申请的一些实施例中所述降解剂为“PROTAC降解剂”，术语“PROTAC降解剂”是指双功能分子，可依赖泛素-蛋白酶体系统对靶蛋白进行降解，其通过利用连接酶(如E3连接酶)来诱导泛素化，并使所关注的蛋白质降解。Protac化合物通常被设计成具有三个部分：1)与泛素连接酶结合并且/或者调节泛素连接酶的配体/分子；2)与所关注的靶蛋白结合以进行蛋白水解的小分子；和3)将这两种分子连接在一起的接头。因此Protac是通过允许配体/分子与泛素连接酶结合，从而将所关注的蛋白质的靶标募集至连接酶以进行泛素化并最终进行蛋白水解和降解来发挥作用。
本申请中PROTAC降解剂不做限制，只是本申请一些具体实施例中发现,PROTAC是BET蛋白溴区PROTAC降解剂dBET6时，其治疗效果最优。dBET6是一种具有良好的细胞通透性的BET bromodomains PROTAC降解剂，与BRD4结合的IC50值为14nM，具有抗肿瘤活性。dBET6的具体结构式如下：
目前降解剂dBET6多是用于抗肿瘤研究中，本申请首次证明dBET6降解剂能够非常有效的预防/治疗视网膜退行性疾病。
所述如本文所用，术语“视网膜退行性改变相关疾病”是指以视网膜光感受器细胞死亡为核心病理改变的，可引起严重视力障碍甚至失明的眼底病，包括但不限于：年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、Stargardt病、视锥-视杆细胞营养不良、糖尿病视网膜病变以及因视网膜免疫细胞异常活化引起的葡萄膜炎和结膜炎等，本申请不做限制。
如本文所用，术语“年龄相关性黄斑变性”又称为老年性黄斑变性,是黄斑区结构的病理性衰老改变。年龄相关性黄斑变性多发生于50岁以上，视力表现为中央视觉下降或视物变形、模糊，随年龄病程加重。
如本文所用，术语“糖尿病性视网膜病变”是指一种累及眼睛的糖尿病并发症，由眼睛视网膜的血管损伤引起的。糖尿病性视网膜病变的早期阶段，可能不会出现症状。随着糖尿病性视网膜病变进展，可能会出现视力模糊、视野中出现黑暗或空白区域、视力减退等症状。
如本文所用，术语“视网膜色素变性”是一种缓慢进展、双眼发病的视网膜以及视网膜色素上皮的变性，系不同基因突变所致的遗传性视网膜退行性眼病。症状包括夜盲和周边视力丧失。
如本文所用，术语“Stargardt病”是最常見的遗传性青少年黄斑退化，疾病会导致进行性、严重的视力丧失。Stargardt病图像的特征是在早期和中期出现斑点，在晚期出现视网膜萎缩，这是由于感光细胞死亡枯竭所致。
如本文所用，术语“视杆细胞营养不良”是一类遗传性眼病，主要影响视网膜的视锥细胞和视杆细胞。患者因视锥细胞和视杆细胞的退化，随着时间的推移视力下降。在儿童时期即可能出现视力下降和畏光症状。之后通常会出现中央视野盲点(暗点)、色觉丧失和周边视力丧失。大多数患者在成年中期失明。
2.药物组合物
在已知BET蛋白PROTAC降解剂可用于预防和治疗视网膜退行性改变相关疾病后，本领域可将该有效成分制备成相应的药物组合物，该药物组合物包含BET蛋白降解剂。
在一些实施方式中，所述药物组合物中的BET蛋白降解剂为PROTAC降解剂；
在一些具体的实施方式中，所述药物组合物中的PROTAC降解剂为dBET6。
另一些实施方式中，所述药物组合物进一步还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。
术语“药学上可接受”是指载体、稀释剂、赋形剂和/或其盐在化学和/或物理上与制剂中的其他成分相容，并且与接受者在生理学上相容。
术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性剂相容的载体和/或赋形剂，其在本领域中是公知的(参见例如，Remington’sPharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR，19th ed.Pennsylvania:MackPublishing Company，1995)，并且包括但不限于pH调节剂，表面活性剂，佐剂和离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
3.抑制/预防/治疗方法
在已知上述应用的基础上，本领域可以将上述有效剂量的药物组合物施用于受试者或个体等，从实现疾病的抑制/预防/治疗。
术语“施用”是指对受试者或体内、体外或离体细胞、组织和器官给予药物、前药或其它剂或治疗性处理的行为。对人体的示例性施用途径可以是通过脑、眼部(经眼)、口腔(口服)、皮肤(局部或透皮)、鼻腔(经鼻)、肺(吸入)、口腔粘膜(经颊)、耳朵、直肠、阴道、通过注射(例如，静脉内、皮下、瘤内、腹膜内等)等等。
可施用含有本文所述的药物组合物以进行预防性/治疗性处理。在治疗应用中，向已经罹患相应疾病的患者施用组合物，其量足以治愈或至少部分地阻止疾病的症状。对此用途有效的量将取决于疾病的严重程度和病程、先前的治疗、患者的健康状况、体重和对药物的响应以及治疗临床医生的判断。
在预防应用中，向易患或以其它方式有患该特定疾病、病症或疾患风险的患者施用含有本文所述的药物组合物。这种量被定义为“预防有效量或剂量”。在这种用途中，精确的量还取决于患者的健康状态、体重等。当用于患者时，这种用途的有效量将取决于疾病、病症或疾患的严重程度和病程、先前的治疗、患者的健康状况和对药物的响应以及治疗临床医生的判断。
术语“有效剂量”、“有效量”或“治疗有效剂量”是当单独使用或与另一治疗剂组合使用时保护受试者免于疾病发作或者促进疾病消退的任何量，所述疾病消退的证据为疾病症状的严重性降低、疾病无症状期的频率和持续期间增加或防止由于疾病折磨导致的损伤或残疾。可以使用熟练从业人员已知的各种方法评估治疗剂促进疾病消退的能力，例如在临床试验期间在人受试者中评估、在用于预测在人体中的效力的动物模型系统中评估或通过在体外测定法中测定试剂的活性评估。
术语“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方式中，个体或受试者是人。“受试者”可以是“患者”–患者是需要治疗的人类受试者，可以是患有视网膜退行性疾病如年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、Stargardt病、视锥-视杆细胞营养不良、糖尿病视网膜病变或因视网膜免疫细胞异常活化引起的葡萄膜炎和结膜炎的个体，处于发生视网膜退行性疾病如年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、Stargardt病、视锥-视杆细胞营养不良、糖尿病视网膜病变或因视网膜免疫细胞异常活化引起的葡萄膜炎和结膜炎的风险的受试者。
当然，上述“个体”或“受试者”也可以是动物或细胞模型，当是这类模型时，该方法并不属于专利法意义上的疾病治疗，尤其对于细胞模型而言。
在一些实施方式中，所述施用方式可以是该药物组合物的单独给药施用；
在另一些实施方式中，所述施用方式也可以是与其他药物或治疗方案联合施用，在此不作限制。
4.筛选/鉴定方法
当获知PROTAC降解剂通过降解BET蛋白用于预防和治疗视网膜退行性改变相关疾病后，可据此建立疾病模型或候选药物的的筛选/鉴定方法。
可以理解，候选药物的筛选/鉴定可以是通过如下步骤实现：
当将候选分子与BET蛋白混合后，通过观察和分析分析候选分子对BET蛋白降解的影响，进而可用于评价候选分子是否可用于视网膜退行性改变相关疾病的抑制，进而筛选到候选药物。
或者，在PROTAC降解剂与BET蛋白相互作用后，通过添加候选分子，观察和分析候选分子是否影响PROTAC降解剂对BET蛋白的降解，来评价候选分子是否可用于视网膜退行性改变相关疾病的抑制，进而筛选到候选分子药物。
不做限制，上述候选分子可以是各种类型的化合物，包括但不限于各类的大分子化合物或小分子化合物。
本申请通过附图和如下实施例进一步描述，所述的附图和实施例只是为了例证本申请的特定实施方案，不应理解为以任何方式限制本申请范围之意。
实施例1、光损伤造模、dBET6给药及视网膜解剖取材
本方案通过对小鼠进行白光照射，剂量为15000流明，时间为2小时，建立视网膜损伤变性小鼠疾病模型。方案包括对照组，光照组，光照dBET6给药组三组。dBET6购买于selleck，货号为：S8762。dBET6的配置溶剂为：5％DMSO,30％ Polyoxy ethylene300,5％Tween80；小鼠为5-7周龄雄性Balb/c小鼠。
1)对照组：腹腔注射与dBET6给药组等体积的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)。
2)光照组：在光照1小时前以及光照后24小时，两次腹腔注射与dBET6给药组等体积的溶剂。
3)光照dBET6给药组：在光照1小时前以及光照后24小时，两次腹腔注射dBET6，每次剂量为10mg/kg/只小鼠。
在光照48小时后，对所有小鼠进行脱颈法处死，用一只手撑开小鼠眼睑使其眼球突出，另一只手持镊子插入眼眶，从眼球下向上用力，将眼球连同视神经一起取出。将其放入装有PBS的10cm细胞培养皿中，在体式显微镜下进行解剖大致过程如下：用眼科剪去除漂浮在PBS中的连接在眼球上的眼外肌和结缔组织。在角巩缘作一小切口，左手持镊从切口伸入夹住角膜，右手持眼科剪，顺势沿角巩缘将眼球剪开，分成两部分，眼球前极部(角膜、虹膜、晶状体)和后视杯(巩膜，脉络膜，视网膜)。用镊子将视网膜从后视杯上剥离下来，装入预先标记好样品名称及取材日期等信息的离心管，放入液氮中速冻，待同一批材料取完后进行后续操作。
光损伤(LD，light damage)导致视网膜退行性病变，视网膜变薄，感光细胞死亡。OCT(Optical coherence tomography，光学相干断层扫描)是一种非侵入式、可在活体上对视网膜进行高分辨率断层成像的手段。其非侵入式的特点为动态记录视网膜病变的诊断、评估药物疗效提供了良好的技术支持。如图1所示，采用OCT可对小鼠视网膜各层组织进行高分辨率观察，由外而内可见以下主要结构：视网膜色素上皮细胞(RPE)、视网膜外段(OS)、视网膜内段(IS)、外核层(ONL)、外丛状层(OPL)、内核层(INL)、内丛状层(IPL)及节细胞层(GCL)。白光照射后2天，采用OCT对视网膜结构进行成像以及小鼠眼球组织的TUNEL染色。如图1及图4的光照组(LD+vehicle)与对照组(CTRL,control)相比，白光照射诱发严重的以光感受器细胞损伤为主要病理表现的视网膜退行性改变，主要表现为白光照射后2天ONL严重损伤，感光细胞大量凋亡。
实施例2、视网膜蛋白提取与微量蛋白质电泳(WES)实验
本实施例向装有小鼠视网膜样品的离心管中加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液200μl，并将组织蛋白放入新芝超声仪，连接冰水循环，设置超声能量60％，总时间1min，2秒开、2秒关。使组织细胞充分裂解后，4℃离心机，12000rpm，离心10min，将蛋白上清与与其他物质沉淀分开，取上清部分，加入标好信息的离心管中。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对蛋白上清进行浓度测定，并取蛋白终浓度为1μg/μl蛋白样品进行微量蛋白质电泳实验。微量蛋白质电泳实验的详细步骤按照厂家(Protein Simple)提供的说明书进行，使用protein simple Wes仪器及其自带软件进行蛋白定量分析。
小鼠接受溶剂DMSO或dBET6治疗，剂量为10mg/kg，腹腔注射。采用WES进行视网膜BET蛋白分析。结果如图2所示，小鼠腹腔注射dBET6 1小时后能有效降解视网膜BET蛋白家族成员(BRD2,BRD3,BRD4)，单次药效持续24小时。
实施例3、视网膜形态分析
dBET6治疗及光照后第2天，本实施例用0.1％戊巴比妥钠麻醉小鼠，托吡卡胺散瞳后，采用小动物OCT(Heidelberg Engineering)对各组小鼠视网膜形态进行活体观察和比较。
结果表明：白光照射前1小时，小鼠接受溶剂DMSO或dBET6治疗，剂量为10mg/kg，腹腔注射。光照后2天，采用OCT进行视网膜结构分析。如图1所示，dBET6治疗显著抑制了视网膜光损伤的发生，主要表现为ONL形态维持完好。
实施例4、视网膜组织病理
本实施例进行小鼠眼球组织的HE染色、免疫组化和免疫荧光染色。取眼球，放在PBS里洗一遍，利用注射器在角巩膜缘处刺开一小口，有利于固定液的进入；将眼球放在2mlEP管中，加入1ml FAS眼球固定液，室温固定过夜；脱水：将固定后的眼球依次置于50％、60％、70％、80％、90％、95％乙醇各1次，每次30min，无水乙醇两次，每次30min；透明：将脱水后的眼球依次置于无水乙醇:二甲苯＝1:1溶液15min，二甲苯两次，每次15min；浸蜡：将眼球组织依次置于低熔点蜡I 55℃30min，低熔点蜡II 55℃90min，高熔点蜡60℃90min；包埋：根据眼球纵切的方向，将眼球沿角膜视神经轴方向水平摆放，先加一层薄薄的蜡托住眼球，待下层蜡凝固后缓慢加入剩余蜡将包埋框均匀填充，等待蜡完全凝固后置于负20℃冰箱冷冻过夜后即可进行切片；切片：利用石蜡切片机进行切片，每张厚度为8μm，将石蜡切片置于40℃水浴锅中摊片；挑选切好的切片置于玻片夹中，烘箱60℃烘干2h；烘干的玻片置于负20℃保存。
图3结果表明，未接受光照的正常对照组小鼠视网膜各层结构完整，而光损伤模型对照组小鼠表现为ONL层细胞减少，厚度变薄，细胞排列紊乱。此外，采用TUNEL进行视网膜光感受器细胞活性分析结果(图3)显示，未接受光照的正常对照组小鼠的视网膜各层未见红色荧光信号，光损伤模型对照组小鼠视网膜的RPE和ONL可见显著大量的红色荧光信号，dBET6处理组小鼠仅在ONL可见少量的红色荧光信号。这一结果明确提示了dBET6具有显著的抑制光感受器细胞凋亡的作用。
实施例5、视网膜光感受器细胞活性分析
本实施例进行小鼠眼球组织的TUNEL染色。取小鼠眼球冰冻切片放在PBS中洗去包埋剂OCT，洗三次，10min/次；通透：用组化笔在组织周围画个圈防止液体流走，在组织上覆盖20μg/ml的蛋白酶K，室温静置10min，通透完成用PBS洗去多余的蛋白酶K，洗三次，5min/次；标记：按照产品说明书(Vazyme，#A113)配制平衡液和反应液，先在组织上覆盖平衡液，室温静置10min，然后吸走多余的平衡液，在组织上覆盖反应液，37℃反应60min。反应结束后吸走多余的反应液，用PBS洗三次，10min/次。用DAPI(1：1000)染核，室温静置10min。最后用PBS洗三次，10min/次，加上封片剂和盖玻片封片，在显微镜下观察。
采用免疫荧光染色以及蛋白免疫印记对小鼠视网膜中的促炎免疫细胞活化以及炎症因子的表达进行分析，结果(图4)表明，光损伤模型对照组小鼠的视网膜中活化的免疫细胞明显增多，炎症因子表达增多，而dBET6处理组的视网膜中活化的免疫细胞跟光损伤模型对照组相比则显著减少，炎症因子表达下降。这一结果提示dBET6具有显著的抑制炎症反应的作用。
实施例6、视网膜功能分析
dBET6治疗及光照后第2天，本实施例用0.1％戊巴比妥钠麻醉小鼠，托吡卡胺散瞳后，小鼠角膜涂上羟甲基纤维素保湿，将小鼠放在ERG仪器(Diagnosys Celeris)上，两个电极分别接触小鼠两个角膜，用不同强度的闪光刺激小鼠。仪器自动记录小鼠的a波和b波。
采用ERG对视网膜功能进行分析，结果如图5所示：与正常对照组小鼠相比，光损伤模型对照组小鼠的a-wave和b-wave振幅显著降低，dBET6处理组的a-wave和b-wave振幅跟光损伤模型对照组相比则显著升高，说明dBET6对视网膜的光感受器细胞和视网膜双极细胞功能都具有保护，从而保护视网膜功能。
实施例7、视觉行为学分析
小鼠放在一个完全封闭的箱体中，提供恒定的旋转速度(12°/s)和恒定的黑白条纹对比度(99.72％)。使用四台显示器来模拟条纹，可以通过盒子上方的相机来观察小鼠的行为。首先顺时针检查，然后逆时针检查。该仪器(Striatech)的软件使用一种特殊的算法来测量不同参数下小鼠的行为得分。测试后，记录参数。
小鼠视网膜视觉行为学分析结果如图6所示，该结果表明，光损伤模型对照小鼠的视觉行为显著下降，而dBET6处理组的视觉行为跟光损伤模型对照组相比则显著升高。这两个结果提示dBET6具有保护视网膜功能的显著效应。
综上所述，通过采用OCT、视网膜组织病理、视网膜蛋白免疫印迹分析以及视网膜电生理对视网膜光损伤模型的研究，提示dBET6对视网膜光感受器细胞凋亡、视网膜炎症反应及其导致的视网膜退行性病变相关的形态及功能改变具有防治作用，且效果十分显著。
实施例8、dBET6与其他BET抑制剂的效果比较
在小鼠小胶质细胞系BV2和小鼠光感受器细胞系661W中分别加入100nM的dBET1、dBET6、ARV825和1μM的JQ1处理2小时，2小时后收集细胞提取蛋白质进行WB分析。其中dBET1、dBET6、ARV825为BET的PROTAC降解剂，均导致泛素化介导的BET蛋白降解；JQ1为BET竞争性抑制剂，理论上不降解BET蛋白，而是通过与BET底物结合，竞争性抑制BET对底物的作用。
结果如图7和8所示，无论是针对细胞系BV2还是661W，在同样浓度和同样时间的处理下，dBET6对BRD4的降解效果显著优于另外两种PROTAC抑制剂dBET1和ARV825。对于BRD2的降解，dBET6和ARV825表现相似效果，但都显著优于dBET1。在光感受器细胞661W中，dBET6和ARV825对于BRD3的降解效果类似，均显著优于dBET1。在BV2细胞中，与竞争性抑制剂JQ1相比，dBET6显著降低了BRD2,BRD4的蛋白水平；在661W细胞中，与竞争性抑制剂相比，dBET6显著降低了BRD2,BRD3，BRD4的蛋白水平。前述对本申请的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本申请限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本申请的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本申请的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本申请的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (2)

1.BET蛋白降解剂的如下应用：
在制备预防或治疗视网膜退行性改变相关疾病药物中的应用；
所述BET蛋白降解剂为PROTAC降解剂；所述PROTAC降解剂为dBET6。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述BET蛋白包括：BRD2, BRD3和BRD4；所述视网膜退行性改变相关疾病包括：年龄相关性黄斑变性，视网膜色素变性，Stargardt病，视锥-视杆细胞营养不良、糖尿病视网膜病变以及因视网膜免疫细胞异常活化引起的葡萄膜炎和结膜炎。
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Title
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