CN116577395A - 基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测细菌的电化学传感器的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测细菌的电化学传感器的制备方法及应用，特点是包括以下步骤：1）将氨基功能化Fe3O4纳米粒子分散液中加入戊二醛溶液，室温反应清洗后，重新分散于叠氮基丙胺溶液中，搅拌6 h得叠氮基化Fe3O4纳米粒子分散液；2）将BPNS@AuNPs分散液中加入二茂铁和炔丙胺，反应获得信号单元；3）将CuCl2溶液添加到待检测细菌溶液中，孵育后加入信号单元和叠氮基化Fe3O4纳米粒子分散液，孵育后磁力分离并滴加到玻碳电极表面上，即得到基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测单细胞细菌的电化学传感器；优点是高灵敏度、高选择性以及操作简单快速。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测单细胞细菌的方法，尤其是涉及一种基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测细菌的电化学传感器的制备方法及应用。
背景技术
细菌性疾病是全球公共卫生的一个巨大负担，据预测，从现在到2050年，其可能导致1000万人死亡，并造成超过100万亿美元的全球经济损失。在某些特定情境中，对细菌的数量控制尤为严格。如欧盟食品安全委员会法规（EC）2073/2005规定一些菌种的活致病细胞必须完全从食物中消失，其中，大肠杆菌作为一种寄居于人的肠道的条件致病菌，其超过10个细胞即可引起急性肾功能衰竭。因此，寻找有效的手段实现对细菌的快速灵敏检测具有相当重要的意义。
目前，致病菌的主流检测方法是平板计数法和聚合酶链反应（PCR），然而，平板计数法需要长时间的、操作繁琐的细菌培养，难以实现快速、简便检测；PCR则需裂解细菌提取核酸后才可扩增分析，样品前处理过程复杂而易被污染，所需仪器价格昂贵，且无法区分活菌与死菌，易导致假阳性或假阴性结果。除此之外，由于目前方法灵敏度的限制，不能满足某些特定情境中的低浓度致病菌检测需求，很大程度上限制了它们的进一步发展。因此，开发快速、简便、准确、灵敏的单细胞细菌检测方法，是迫切需求。
快速扫描伏安法（FSV），是指电位扫描速率>100 V/s的伏安技术。与通常采用0.1V/s左右的常规伏安技术相比，FSV可以在更短的时间内在电化学信号标记物和电极之间传输电子，实现信号电流的有效放大。细菌体内铜稳态机制的研究表明，细菌可通过多种铜结合系统有效地结合Cu2+，并通过自身的氧化还原酶级联反应将Cu2+还原为Cu+，这就可以引发Cu+催化的各种特定的化学反应，如Cu+催化的点击化学反应（Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition reaction，CuAAC）。CuAAC反应具有良好的反应动力学、高的产率、温和的反应条件，仅需微量Cu+即可催化反应的快速、大量进行，完全可用于电化学传感器设计，实现目标识别、信号触发和信号放大。
近年来，二维黑磷（BP）作为导电性能良好的新型二维材料，其优异的还原性可原位还原氯金酸（HAuCl4）生成金纳米粒子（AuNPs），成为导电良好的、可负载大量电化学信号标记物的功能化二维纳米材料，适用于FSV。目前，国内外还没有公开任何关于基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测单细胞细菌的电化学传感器的相关报道，也没有电化学传感器对单细胞致病菌进行免扩增检测的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高灵敏度、高选择性以及操作简单快速的基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测细菌的电化学传感器的制备方法及应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测细菌的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备叠氮基化Fe3O4纳米粒子（Azide-Fe3O4）
a. 将0.2~0.3 g FeCl3·6H2O、0.7~0.8 g NH4Ac和0.07~0.09 g柠檬酸钠添加到12~15 mL乙二醇中，在氮气氛围140~160 ℃下剧烈搅拌1 h后，将混合溶液转移到聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在190~210 ℃下加热17 h，即得Fe3O4纳米粒子；借助磁力清洁后，将获得的Fe3O4与150~200 μL乙氧基硅烷（APTES）一起分散在10~20 mL乙醇中，超声处理1h，然后在室温下搅拌6 h，借助磁力清洗后重新分散于10~20 mL水中，即获得氨基功能化Fe3O4纳米粒子（NH2-Fe3O4）分散液；
b. 在步骤（1）a得到的氨基功能化Fe3O4纳米粒子分散液中加入600~700 μL 2.5wt%戊二醛溶液，室温反应6 h；借助磁力清洗后，重新分散于2~5 mL水中并加入2~4 mL 2.5mg/mL叠氮基丙胺溶液中，于30~40 ℃下搅拌6 h；磁力清洗并用2~5 mL水重新分散后，即得叠氮基化Fe3O4纳米粒子（Azide-Fe3O4）分散液；
（2）制备信号单元BPNS@AuNPs-AFc&Alkyne
a. 将15~20 mL 0.2 mg/mL 黑磷纳米片（BPNS）溶液与2~5 mL 1 mg/mL HAuCl4·4H2O混合，室温下搅拌12~16 h，在5000~6000 ×g下离心并重新分散于1~5 mL无水乙醇中，即获得BPNS@AuNPs分散液；
b. 在步骤（2）a得到的BPNS@AuNPs分散液中加入300~500 μL 2~4 mg/mL二茂铁（AFc）和300~500 μL 1~3 mg/mL炔丙胺，37 ℃孵育12~16 h，在5000~6000 ×g下离心并重新分散于1~5 mL水中，即获得信号单元BPNS@AuNPs-AFc&Alkyne；
（3）细菌启动点击化学反应的电化学生物传感器的构建
将100~200 μL 10-4 mol/L CuCl2溶液添加到800~1000 μL 待检测细菌溶液中，37℃孵育20~40 min以进行Cu2+的还原后，加入100~200 μL信号单元BPNS@AuNPs-AFc&Alkyne和100~200 μL 叠氮基化Fe3O4纳米粒子（Azide-Fe3O4）分散液，37 ℃孵育30~120 min，磁力分离并滴加到玻碳电极（MGCE）表面上，即得到基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测单细胞细菌的电化学传感器。
上述基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测细菌的电化学传感器的应用，包括以下步骤：
（1）实际样品检测中的细菌分离和富集
将300~400 μL 1~5 μmol/L 待检测细菌适配体溶液（Aptamer）与100~200 μL 2~3mg/mL链霉亲和素磁珠溶液混合，室温下轻轻摇动孵育1~3 h，磁分离并用洗涤缓冲液Buffer I洗涤2~4次后，将所得的磁珠-Aptamer偶联物分散在200~300 μL的反应缓冲液中后，加入5~8 mL待测溶液并在37℃下孵育20~30 min，磁分离并重新分散在1~3 mL水中，实现待检测细菌的分离和富集；然后加入5~8 μL 1~5 kU/mL DNase I释放富集的细菌；
（2）快速扫描循环伏安技术检测细菌
以基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测单细胞细菌的电化学传感器为工作电极，铂电极为辅助电极，置入pH=7.2的PBS缓冲溶液，采用快速扫描伏安法（FSV），电位范围为-0.2~1.2 V，电位扫描速度为100~600 V/s，测定不同浓度Cu+条件下对应的氧化峰值电流，根据电流信号值计算获得待测检测细菌溶液中细菌浓度。
进一步，步骤（1）a中所述的洗涤缓冲液Buffer I的配方如下：50 mM Tris-HCl，2mM EDTA，1 M NaCl，0.05% Tween-20；所述的反应缓冲液的配方如下：20 mM HEPES，100 mMMgAC2，pH=7.2。
进一步，步骤（1）a中所述的细菌适配体（Aptamer）的序列为：5'-biotin-ACACCATAATATGCCGTAAGGAGAGGCCTGTTGGGAGCGCCGTAGAG-3'。
进一步，步骤（1）a中所述的待检测细菌为大肠杆菌。
发明原理：本发明利用细菌触发点击化学反应，构建了一种快速、简便、准确、灵敏的基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测单细胞细菌的电化学传感器。BP具有优异的还原性，原位还原HAuCl4生成AuNPs，通过金氨键将氨基二茂铁（AFc）和炔丙胺组装在AuNPs表面形成信号单元，作为传感器的信号单元，具有以下多种功能：（1）AFc作为电化学信号分子；（2）炔丙胺提供点击化学反应所需炔基；（3）BP具有高导电性，大比较面积，电化学信号分子和炔基负载量高，实现有效信号放大。检测目标物细菌存在时，其可以结合外源Cu2+，利用自身的氧化还原酶级联反应将Cu2+还原为Cu+并代谢出细胞外，触发信号单元与Azide-Fe3O4间的CuAAC反应。磁分离后一步吸附于MGCE表面，利用FSV检测电化学信号。细菌浓度越高，还原后的Cu+浓度越高，相同时间内CuAAC反应效率越高，吸附于MGCE表面的电化学信号分子越多，电流信号越大。
与现有技术相比，本发明的优点在于
（1）选择性高：利用具有高特异性、高亲和性的核酸适配体进行实际样品检测中的细菌分离和富集，实现细菌的特异性识别捕获；
（2）灵敏度高：利用单细胞致病菌将极微量Cu2+还原为Cu+，极微量Cu+引发快速、大量的CuAAC反应，捕获大量信号单元，实现信号一重放大。功能化二维纳米材料为BP负载大量AuNPs，每个AuNPs又可以负载大量电化学信号标记物，实现信号二重放大。采用FSV，将FSV、目标触发的点击化学反应和功能化二维纳米材料结合，能够有效实现信号的三重放大。首次实现电化学传感器对单细胞致病菌进行免扩增检测；
（3）操作方便：CuAAC反应完成后，由于四氧化三铁的磁性，制备的电化学传感器能够一步吸附，快速、方便，有助于实验的快速操作。
附图说明
图1为基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测单细胞细菌的电化学传感器的流程图；
图2为电化学信号强度与E.coli浓度的关系图；
图3为不同E.coli浓度与电流值线性关系图；
图4为该传感器分别对空白、106 CFU/mL哈氏弧菌、106 CFU/mL阴沟肠杆菌、106CFU/mL希瓦氏菌、106 CFU/mL创伤弧菌和106 CFU/mL副溶血弧菌、103 CFU/mL大肠杆菌和含103 CFU/mL大肠杆菌的混合细菌测得的电流信号图；
图5为电化学信号强度与单细胞水平E.coli的关系图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一、具体实施例
实施例1
一种基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测细菌的电化学传感器的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
（1）制备叠氮基化Fe3O4纳米粒子（Azide-Fe3O4）
a. 将0.25 g FeCl3·6H2O、0.75 g NH4Ac和0.08 g柠檬酸钠添加到13 mL乙二醇中，在氮气氛围150 ℃下剧烈搅拌1 h后，将混合溶液转移到聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在200 ℃下加热17 h，即得Fe3O4纳米粒子；借助磁力清洁后，将获得的Fe3O4与180 μL乙氧基硅烷（APTES）一起分散在15mL乙醇中，超声处理1 h，然后在室温下搅拌6 h，借助磁力清洗后重新分散于15 mL水中，即获得氨基功能化Fe3O4纳米粒子（NH2-Fe3O4）分散液；
b. 在步骤（1）a得到的氨基功能化Fe3O4纳米粒子分散液中加入650 μL 2.5 wt%戊二醛溶液，室温反应6 h；借助磁力清洗后，重新分散于3 mL水中并加入3 mL 2.5 mg/mL叠氮基丙胺溶液中，于35 ℃下搅拌6 h；磁力清洗并用3 mL水重新分散后，即得叠氮基化Fe3O4纳米粒子（Azide-Fe3O4）分散液；
（2）制备信号单元BPNS@AuNPs-AFc&Alkyne
a. 将18 mL 0.2 mg/mL 黑磷纳米片（BPNS）溶液与3 mL 1 mg/mL HAuCl4·4H2O混合，室温下搅拌14h，在5000~6000 ×g下离心并重新分散于3 mL无水乙醇中，即获得BPNS@AuNPs分散液；
b. 在步骤（2）a得到的BPNS@AuNPs分散液中加入400 μL 3 mg/mL二茂铁（AFc）和400 μL 1~3 mg/mL炔丙胺，37 ℃孵育12~16 h，在5000~6000 ×g下离心并重新分散于1~5mL水中，即获得信号单元BPNS@AuNPs-AFc&Alkyne；
（3）细菌启动点击化学反应的电化学生物传感器的构建
将150 μL 10-4 mol/L CuCl2溶液添加到900 μL 待检测细菌溶液中，37 ℃孵育30min以进行Cu2+的还原后，加入150 μL信号单元BPNS@AuNPs-AFc&Alkyne和150 μL 叠氮基化Fe3O4纳米粒子（Azide-Fe3O4）分散液，37 ℃孵育75 min，磁力分离并滴加到玻碳电极（MGCE）表面上，即得到基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测单细胞细菌的电化学传感器。
实施例2
同上述实施例1，其区别在于：
（1）制备叠氮基化Fe3O4纳米粒子（Azide-Fe3O4）
将0.2 g FeCl3·6H2O、0.7 g NH4Ac和0.07 g柠檬酸钠添加到12 mL乙二醇中，在氮气氛围140 ℃下剧烈搅拌1 h后，将混合溶液转移到聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在190 ℃下加热17 h，即得Fe3O4纳米粒子；借助磁力清洁后，将获得的Fe3O4与150μL乙氧基硅烷一起分散在10 mL乙醇中，超声处理1 h，然后在室温下搅拌6 h，借助磁力清洗后重新分散于10 mL水中；将氨基功能化Fe3O4纳米粒子分散液中加入600 μL 2.5 wt%戊二醛溶液，室温反应6 h；借助磁力清洗后，重新分散于2 mL水中并加入2 mL 2.5 mg/mL叠氮基丙胺溶液中，于30 ℃下搅拌6 h；磁力清洗并用2 mL水重新分散；
（2）制备信号单元BPNS@AuNPs-AFc&Alkyne
将15 mL 0.2 mg/mL 黑磷纳米片（BPNS）溶液与2 mL 1 mg/mL HAuCl4·4H2O混合，室温下搅拌12 h，在5000~6000 ×g下离心并重新分散于1 mL无水乙醇中，即获得BPNS@AuNPs分散液；将BPNS@AuNPs分散液中加入300 μL 4 mg/mL二茂铁（AFc）和300 μL 3 mg/mL炔丙胺，37 ℃孵育12 h，在5000~6000 ×g下离心并重新分散于1~5 mL水中，即获得信号单元BPNS@AuNPs-AFc&Alkyne；
（3）细菌启动点击化学反应的电化学生物传感器的构建
将100 μL 10-4 mol/L CuCl2溶液添加到800 μL 待检测细菌溶液中，37 ℃孵育20min以进行Cu2+的还原后，加入100 μL信号单元BPNS@AuNPs-AFc&Alkyne和100 μL 叠氮基化Fe3O4纳米粒子（Azide-Fe3O4）分散液，37 ℃孵育30min。
实施例3
同上述实施例1，其区别在于：
（1）制备叠氮基化Fe3O4纳米粒子（Azide-Fe3O4）
将0.3 g FeCl3·6H2O、0.8 g NH4Ac和0.09 g柠檬酸钠添加到15 mL乙二醇中，在氮气氛围160 ℃下剧烈搅拌1 h后，将混合溶液转移到聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在210 ℃下加热17 h，即得Fe3O4纳米粒子；借助磁力清洁后，将获得的Fe3O4与200 μL乙氧基硅烷（APTES）一起分散在20 mL乙醇中，超声处理1 h，然后在室温下搅拌6 h，借助磁力清洗后重新分散于20 mL水中；将氨基功能化Fe3O4纳米粒子分散液中加入700 μL 2.5 wt%戊二醛溶液室温反应6 h；磁力清洗后重新分散于5 mL水中并加入4 mL 2.5 mg/mL叠氮基丙胺溶液中，于40 ℃下搅拌6 h；磁力清洗并用5 mL水重新分散；
（2）制备信号单元BPNS@AuNPs-AFc&Alkyne
将20 mL 0.2 mg/mL 黑磷纳米片（BPNS）溶液与5 mL 1 mg/mL HAuCl4·4H2O混合，室温下搅拌16 h，在5000~6000 ×g下离心并重新分散于5 mL无水乙醇中，即获得BPNS@AuNPs分散液；将BPNS@AuNPs分散液中加入500 μL 2 mg/mL二茂铁（AFc）和500 μL 1 mg/mL炔丙胺，37 ℃孵育16 h，在5000~6000 ×g下离心并重新分散于1~5 mL水中，即获得信号单元BPNS@AuNPs-AFc&Alkyne；
（3）细菌启动点击化学反应的电化学生物传感器的构建
将200 μL 10-4 mol/L CuCl2溶液添加到1000 μL 待检测细菌溶液中，37 ℃孵育40 min以进行Cu2+的还原后，加入200 μL信号单元BPNS@AuNPs-AFc&Alkyne和200 μL 叠氮基化Fe3O4纳米粒子（Azide-Fe3O4）分散液，37 ℃孵育120 min。
具体实施例二
利用上述具体实施例1所制备的基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测单细胞细菌的电化学传感器检测单细胞细菌的方法，包括以下步骤：
（1）实际样品检测中的细菌分离和富集
将300~400 μL 1~5 μmol/L 待检测细菌适配体溶液（Aptamer）与100~200 μL 2~3mg/mL链霉亲和素磁珠溶液混合，室温下轻轻摇动孵育1~3 h，磁分离并用洗涤缓冲液Buffer I洗涤2~4次后，将所得的磁珠-Aptamer偶联物分散在200~300 μL的反应缓冲液中后，加入5~8 mL待测溶液并在37℃下孵育20~30 min，磁分离并重新分散在1~3 mL水中，实现待检测细菌的分离和富集；然后加入5~8 μL 1~5 kU/mL DNase I释放富集的细菌；其中洗涤缓冲液Buffer I的配方如下：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA，1 M NaCl，0.05% Tween-20；所述的反应缓冲液的配方如下：20 mM HEPES，100 mM MgAC2，pH=7.2；细菌适配体（Aptamer）的序列为：5'-biotin-ACACCATAATATGCCGTAAGGAGAGGCCTGTTGGGAGCGCCGTAGAG-3'；
（2）快速扫描循环伏安技术检测单细胞细菌
以基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测单细胞细菌的电化学传感器为工作电极，铂电极为辅助电极，置入pH=7.2的PBS缓冲溶液，采用快速扫描伏安法（FSV），电位范围为-0.2~1.2 V，电位扫描速度为100~600 V/s，测定不同浓度Cu+条件下对应的氧化峰值电流，根据电流信号值计算获得待测检测细菌溶液中细菌浓度。
具体实施例三
利用上述具体实施例1所制备的电化学传感器检测单细胞细菌的方法，包括以下步骤：
采用上述具体实施例1制备的电化学传感器为工作电极，铂丝电极为对电极；本工作基于BPNS优异的性能结合AuNPs、AFc、Alkyne制备信号单元，利用细菌代谢触发点击化学反应使得信号单元具有磁性，并利用磁性玻碳电极对磁性材料的吸附作用一步制备电化学传感器，实现对大肠杆菌的检测。在pH为7.2的PBS缓冲溶液中，测定一系列不同浓度的大肠杆菌对应的电化学信号强度大小，建立电化学信号强度与大肠杆菌之间的定量关系；根据定量关系即可测定未知样品中大肠杆菌浓度。
由图2可知，电化学信号强度随着大肠杆菌浓度的增加而增加。
由图3可知，不同浓度大肠杆菌的电化学信号（y）-浓度对数（x）呈线性关系，线性方程为y = 0.28*logx + 0.28，相关系数平方R2 = 0.998，线性关系良好，可以用于未知样品中大肠杆菌检测。
具体实施例四
特异性分析
如图4所示，利用具体实施例一制备的传感器分别对空白、106 CFU/mL哈氏弧菌、106 CFU/mL阴沟肠杆菌、106 CFU/mL希瓦氏菌、106 CFU/mL创伤弧菌和106 CFU/mL副溶血弧菌、103 CFU/mL大肠杆菌和含103 CFU/mL大肠杆菌的混合细菌测得的电化学信号图；从图中可以看出其他浓度高1000倍的细菌的信号强度与空白基本一致，大肠杆菌与包含大肠杆菌混合物样本的信号强度基本一致，这表明该电化学传感器在复杂样品中对目标物进行检测时具有高选择性。
具体实施例五
灵敏度分析
如图5所示，将细菌样本逐级稀释后，分别取出1、2、4、6和8个大肠杆菌细胞，利用具体实施例一制备的传感器进行电化学测试；从图中可以看出电化学信号响应随着大肠杆菌细胞数量的增加而增加，即使在单细胞水平也能观察到明显的电流信号，这表明该电化学传感器能够对单细胞细菌进行定量检测。
具体实施例六
为验证本方法在实际应用中的价值，在海水中加入大肠杆菌标准溶液作为实际样品，采用加标回收的方法对海水中不同浓度的大肠杆菌进行了检测，结果如表1所示。
表1 海水中大肠杆菌的检测结果（ , n = 5）
由表1可知，该方法相对标准偏差（RSD）小于8.7%，回收率为93.8% ~ 107.3%，结果令人满意。表明本发明对于海水中大肠杆菌的检测结果准确可靠。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测细菌的电化学传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）制备叠氮基化Fe3O4纳米粒子
a. 将0.2~0.3 g FeCl3·6H2O、0.7~0.8 g NH4Ac和0.07~0.09 g柠檬酸钠添加到12~15mL乙二醇中，在氮气氛围140~160 ℃下剧烈搅拌1 h后，将混合溶液转移到聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在190~210 ℃下加热17 h，即得Fe3O4纳米粒子；借助磁力清洁后，将获得的Fe3O4与150~200 μL乙氧基硅烷一起分散在10~20 mL乙醇中，超声处理1 h，然后在室温下搅拌6 h，借助磁力清洗后重新分散于10~20 mL水中，即获得氨基功能化Fe3O4纳米粒子分散液；
b. 在步骤（1）a得到的氨基功能化Fe3O4纳米粒子分散液中加入600~700 μL 2.5 wt%戊二醛溶液，室温反应6 h；借助磁力清洗后，重新分散于2~5 mL水中并加入2~4 mL 2.5 mg/mL叠氮基丙胺溶液中，于30~40 ℃下搅拌6 h；磁力清洗并用2~5 mL水重新分散后，即得叠氮基化Fe3O4纳米粒子分散液；
（2）制备信号单元BPNS@AuNPs-AFc&Alkyne
a. 将15~20 mL 0.2 mg/mL 黑磷纳米片溶液与2~5 mL 1 mg/mL HAuCl4·4H2O混合，室温下搅拌12~16 h，在5000~6000 ×g下离心并重新分散于1~5 mL无水乙醇中，即获得BPNS@AuNPs分散液；
b. 在步骤（2）a得到的BPNS@AuNPs分散液中加入300~500 μL 2~4 mg/mL二茂铁和300~500 μL 1~3 mg/mL炔丙胺，37 ℃孵育12~16 h，在5000~6000 ×g下离心并重新分散于1~5mL水中，即获得信号单元BPNS@AuNPs-AFc&Alkyne；
（3）细菌启动点击化学反应的电化学生物传感器的构建
将100~200 μL 10-4 mol/L CuCl2溶液添加到800~1000 μL 待检测细菌溶液中，37 ℃孵育20~40 min以进行Cu2+的还原后，加入100~200 μL信号单元BPNS@AuNPs-AFc&Alkyne和100~200 μL 叠氮基化Fe3O4纳米粒子分散液，37 ℃孵育30~120 min，磁力分离并滴加到玻碳电极表面上，即得到基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测单细胞细菌的电化学传感器。
2.一种权利要求1所述制备方法得到的基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测细菌的电化学传感器的应用，其特征在于包括以下步骤：
（1）实际样品检测中的细菌分离和富集
将300~400 μL 1~5 μmol/L 待检测细菌适配体溶液与100~200 μL 2~3 mg/mL链霉亲和素磁珠溶液混合，室温下轻轻摇动孵育1~3 h，磁分离并用洗涤缓冲液Buffer I洗涤2~4次后，将所得的磁珠-Aptamer偶联物分散在200~300 μL的反应缓冲液中后，加入5~8 mL待测溶液并在37℃下孵育20~30 min，磁分离并重新分散在1~3 mL水中，实现待检测细菌的分离和富集；然后加入5~8 μL 1~5 kU/mL DNase I释放富集的细菌；
（2）快速扫描循环伏安技术检测单细胞细菌
以基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测单细胞细菌的电化学传感器为工作电极，铂电极为辅助电极，置入pH=7.2的PBS缓冲溶液，采用快速扫描伏安法，电位范围为-0.2~1.2 V，电位扫描速度为100~600 V/s，测定不同浓度Cu+条件下对应的氧化峰值电流，根据电流信号值计算获得待测检测细菌溶液中细菌浓度。
3.根据权利要求2所述的基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测细菌的电化学传感器的应用，其特征在于：步骤（1）a中所述的洗涤缓冲液Buffer I的配方如下：50 mMTris-HCl，2 mM EDTA，1 M NaCl，0.05% Tween-20；所述的反应缓冲液的配方如下：20 mMHEPES，100 mM MgAC2，pH=7.2。
4.根据权利要求2所述的基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测细菌的电化学传感器的应用，其特征在于：步骤（1）a中所述的细菌适配体的序列为：5'-biotin-ACACCATAATATGCCGTAAGGAGAGGCCTGTTGGGAGCGCCGTAGAG-3'。
5.根据权利要求2所述的基于目标触发点击化学和快速扫描伏安法检测细菌的电化学传感器的应用，其特征在于：步骤（1）a中所述的待检测细菌为大肠杆菌。
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