CN116574735A - 一种多核苷酸及其应用 - Google Patents
一种多核苷酸及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116574735A CN116574735A CN202310800487.0A CN202310800487A CN116574735A CN 116574735 A CN116574735 A CN 116574735A CN 202310800487 A CN202310800487 A CN 202310800487A CN 116574735 A CN116574735 A CN 116574735A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pem
- vector
- expression vector
- mab
- goi
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 22
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 51
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 47
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 23
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 75
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 5
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 5
- 101100006527 Penicillium crustosum claI gene Proteins 0.000 description 5
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 5
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 101100460704 Aspergillus sp. (strain MF297-2) notI gene Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 3
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000003116 impacting effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- -1 respectively Proteins 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 241001244729 Apalis Species 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000011965 cell line development Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000012516 mab select resin Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N methionine S-imide-S-oxide Natural products CS(=N)(=O)CCC(N)C(O)=O SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
- C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/46—Vector systems having a special element relevant for transcription elements influencing chromatin structure, e.g. scaffold/matrix attachment region, methylation free island
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种多核苷酸及其应用，属于基因工程技术领域。所述的多核苷酸的序列为SEQ ID NO.1。所述的多核苷酸可应用于构建蛋白表达载体，通过本发明的多核苷酸构建的载体的蛋白表达量提升，稳定性增加，利于细胞电转染；转染细胞株所产生的蛋白质量优于其他载体，有很好的实际应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种多核苷酸及其应用。
背景技术
近年来，蛋白质药物被应用于不同疾病的治疗，其中单克隆抗体（mAbs）是发展最快的一类。目前生物药领域主要使用的哺乳类宿主细胞包含CHO、NSO、SP2/0、HEK等，而在整个单株抗体则以CHO为主要宿主细胞。CHO细胞是生产这些蛋白质药物应用最广泛的细胞株，表达载体影响目标蛋白的表达量、表达稳定性与纯化后蛋白质量。
CHO细胞至少包括如下优点：（1）适合悬浮培养，符合工业大规模生产的需求；（2）糖型修饰与人相似，贴近天然mAbs的结构和功能；（3）外源基因可以稳定地整合到CHO细胞中达到高表达量；（4）非人源细胞，故人源病毒不能感染和扩增；（5）分泌低量的内源蛋白，有利于目的蛋白的分离纯化；（6）研究与药物开发应用历史完整，故目前的新药开发仍以CHO细胞为主要平台。
近几年的细胞株开发平台的发展过程中，CHO细胞也不断地被挑选与改造而衍生出多个细胞系，如DG44、DXB11、CHO-S、CHO-K1与CHOZN等。这些细胞系是经由人工挑选优化、突变筛选或基因工程的方式建立并用于不同的药物发展与平台应用。随着基因改造技术的进步与发现（如：Zinc finger、TALENT与CRISPR），根据应用需求可以为自有的野生型CHO细胞株进行各项改造已达到产量、提高稳定性或质量的升级。
宿主细胞主要提供蛋白质药物表达的部分平台，相应的表达株载体可进一步体现出其生产能力。故挑选适当且符合宿主细胞的载体细胞株构建十分重要。
现有的表达载体的构建策略包括如下步骤：启动子的挑选（猿猴空泡病毒40（SV40）、延伸因子-1α（EF-1α）和巨细胞病毒（CMV）等）；筛选基因的选择（谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase, GS）、L-氨基亚砜蛋氨酸（Methionine Sulphoximine，MSX）、二氢叶酸还原酶（dhfr）（MTX）和抗嘌呤霉素（Puromycin）基因等）；表基因调控元件的使用（UCOE和MAR等）；载体元件的排列（单顺反子载体、多启动子表达载体、IRES（内部核糖体进入位点）或Furin-2A（弗林蛋白酶-2A多肽）元件介导的三顺反子载体）。将上述启动子、终结子与筛选基因进行基础排列便形成原型载体。
除了以上数种必要元件，添加如UCOE和MAR的特殊基因组开放区于表达载体也是可应用的方向。基因组开放区具有如下特点：来源于真核生物，相关基因具稳定高表达的特性与基因组区间含大量的表基因修饰。这样的特点可有效率的构建符合蛋白质药物工业生产用细胞株，同时缩短蛋白质药物临床前研究的时间。将基因组开放区置入原型载体中便形成具高表达与稳定性的哺乳类细胞表达载体。
以下简单介绍几种较为常用的载体：
（1）ThermoFisher
pcDNA 系列载体：主要架构为启动子、终结子与筛选基因基本串联。试用多数哺乳类细胞表达，但稳定性较差。
pCHO-1.0：主要架构为启动子、终结子与筛选基因基本串联。该载体的特点是使用优化的启动子（重组）使其便于CHO细胞抗体药物的表达。
（2）Lonzo GS® Vectors system：主要架构为启动子、终结子与筛选基因。该筛选系统以GS筛选为主要筛选标记，载体进一步添加transposon等元件使细胞株开发效率提升。
（3）Merck UCOE® Expression Technology（Novagen）：主要架构为启动子、终结子与筛选基因。载体进一步添加UCOE元件并挑选不同的启动子进行搭配。用于提高表达量与提升稳定性，进而使细胞株开发效率提升。
如上所述，“表基因调控元件的使用（UCOE和MAR等）”目前为普遍使用的相似元件。该元件置于载体启动子前端进而增强目标基因表达与表达稳定性，目前主要应用范围是哺乳类动物细胞稳定细胞株构建。但是，传统载体用于稳定细胞株构建的过程需花费较高的人力、物力才能挑选高表达的细胞株；且传统载体构建的细胞株稳定性不佳。此外，构建稳定细胞株的最终目的为产生高质量蛋白，而传统载体构建的细胞株后期纯化的蛋白质量不佳。
遍在染色质开放元件（UCOE）是具有组织非特异性显性染色质重塑功能的DNA结构域，能使DNA不依赖于染色体插入位点，处于转录活性“开放”状态，自UCOE发现以来，已经得到广泛应用，研究证实在表达载体的启动子之前插入UCOE可以显著提高转基因转录的水平和稳定性，并且有效的保护启动子免受表观遗传沉默。但完整的UCOE序列分子量过大，不利于后期宿主细胞的电转染。
发明内容
本发明截取UCOE其中一段进行改造，使其保留原本的作用外更便于细胞电转染，此外在实验过程中还发现该载体转染的细胞株产生的蛋白质量优于其他载体。
一方面，本发明提供了一种多核苷酸。
所述的多核苷酸的序列为SEQ ID NO.1。
本发明还提供了前述的多核苷酸在构建表达载体中的应用。
一般地，所述的表达载体用于表达蛋白。
另一方面，本发明提供了包括前述的多核苷酸的表达载体。
所述的表达载体在插入目的序列前先插入前述的多核苷酸序列。
所述的表达载体上还可以包括CMV启动子。所述的CMV启动子为SEQ ID NO.3。
所述的表达载体上还包括开放性阅读框。
所述的表达载体可以用于表达HER2蛋白。
优选地，所述的表达载体可以是pEm载体。
优选地，所述的多核苷酸插入pEm的位置为ClaI /BsrGI。
优选地，所述的表达载体为如图1所示的质粒。
再一方面，本发明提供了前述的表达载体在制备基因工程细胞中的应用。
所述的表达载体在插入目的蛋白的表达序列后通过转染完成基因工程细胞的制备。
本发明同时提供了包括前述的表达载体的基因工程细胞。
所述的基因工程细胞可以是CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞或HEK细胞。
优选地，所述的基因工程细胞为CHO细胞。
优选地，所述的基因工程细胞用于表达蛋白。
又一方面，本发明提供了一种表达载体的构建方法。
所述的表达载体的构建方法中包括在载体中插入前述的多核苷酸。
又一方面，本发明提供了一种基因工程细胞的构建方法。
所述的基因工程细胞的构建方法中包括前述的表达载体的构建方法。
所述的基因工程细胞的构建方法中还包括在表达载体上插入目的蛋白的基因序列。
所述的表达载体通过转染完成基因工程细胞的构建。
又一方面，本发明提供了一种利用基因工程表达蛋白的方法。
所述的方法中包括前述的基因工程细胞的构建方法。
本发明同时提供了前述的多核苷酸通过基因工程在表达蛋白中的应用。
所述的多核苷酸用于构建蛋白表达载体，转染细胞后进行表达以获得目的蛋白。
本发明的有益效果：
1、通过本发明的多核苷酸构建的载体蛋白表达量提升，稳定性增加，利于细胞电转染。
2、本发明构建的载体转染的细胞株所产生的蛋白质量优于其他载体。
附图说明
图1为无元件引入的载体pEm。
图2为引入SEQ ID NO.1的载体pEm-SEQ ID NO.1。
图3为引入SEQ ID NO.2的载体pEm-SEQ ID NO.2。
图4为不同载体的小库筛选效率对比。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1表达载体的构建
合成DNA序列搭配pEm载体系统，经由载体构建的一系列过程，最终构建一个表达载体。具体包括如下步骤：
1、pEm载体系统具备启动子（CMV）加下游开放阅读框系统，其构建方式为：NCBI公开数据库获得启动子序列（SEQ ID NO.3）及开放阅读框序列，基因合成并添加相关酶切位点（HindIII、EcoRI、NotI、SalI）用于启动子和开放阅读框酶切酶连及启动子加开放阅读框与载体的酶切酶连。质粒图谱见图1。
2、SEQ ID NO.1人工合成。
3、pEm-SEQ ID NO.1载体的构建
分别对pEm载体启动子上游和SEQ ID NO.1进行酶切：
pEm空载双酶切体系（30µL）包含：pEm空载 2µg（5µL）、ClaI （品牌：ThermoScientific™，货号：ER0141）1µL、BsrGI（品牌：Thermo Scientific™，货号：ER0932） 1µL、10×buffer（品牌：Thermo Scientific™，购买限制性内切酶附送）3µL、ddH2O 20µL。37℃酶切1h。
SEQ ID NO.1双酶切体系（30µL）包含：SEQ ID NO.1 0.9µg（14µL）、ClaI 1µL、BsrGI 1µL、10×buffer 3µL、ddH2O 11µL。37℃酶切1h。
胶回收获得两个线性的黏性末端片段，目的片段大小分别为10.3Kbp和4.1Kbp。
使用连接酶对载体和片段进行连接，具体条件如下：
SEQ ID NO.1酶切产物与pEm空载酶切产物按摩尔比5:1进行连接。酶连接体系（20µL）包含：ddH2O 3µL、T4 DNA连接酶（品牌：Thermo Scientific™，货号：EL0014）10µL、SEQID NO.1酶切产物2µL、pEm空载酶切产物5µL。酶连条件：反应体系在16℃条件下反应1h。
以上连接产物进行转化（DH5α），过夜培养后观察菌落形态，选择形状均匀一致的6个单菌落进行单克隆PCR验证。在验证其真实性后，挑选需要的单菌落进行扩繁，并小量抽提质粒。最终获得pEm-SEQ ID NO.1载体，质粒图谱见图2。
4、SEQ ID NO.2人工合成。
5、pEm-SEQ ID NO.2载体构建
分别对pEm载体启动子上游和SEQ ID NO.2进行双酶切。
pEm载体双酶切体系（30µL）包含：pEm载体 2µg（5µL）、ClaI 1µL、BsrGI 1µL、10×buffer 3µL、ddH2O 20µL。37℃酶切1h。
SEQ ID NO.2双酶切体系（30µL）包含：SEQ ID NO.2 0.9µg（14µL）、ClaI 1µL、BsrGI 1µL、10×buffer 3µL、ddH2O 11µL。37℃酶切1h。
胶回收获得两个线性的黏性末端片段，目的片段大小分别为10.3Kbp和1.3Kbp。
使用连接酶对SEQ ID NO.2酶切产物与pEm载体酶切产物 按摩尔比5:1进行连接。酶连接体系（20µL）包含：ddH2O 3µL、T4 DNA 连接酶10µL、SEQ ID NO.2酶切产物 2µL、pEm载体酶切产物 5µL。酶连条件：反应体系在16℃条件下反应1h。
以上连接产物进行转化（DH5α），过夜培养后观察菌落形态，选择形状均匀一致的6个单菌落进行单克隆PCR验证。在验证其真实性后，挑选需要的单菌落进行扩繁，并小量抽提质粒。最终获得pEm-SEQ ID NO.2载体。
6、单克隆抗体表达载体pEm-GOI（mAb）的构建
以测试蛋白为HER2（mAb-HC、mAb-LC）举例，具体构建过程如下：
6.1、通过基因合成方法准备GOI（mAb），即GOI（mAb-HC）和GOI（mAb-LC）
6.1.1 GOI（mAb-HC）的5'端设计切位为HindIII，3'端设计切位为EcoRI。
6.1.2 GOI（mAb -LC）的5'端设计切位为NotI，3'端设计切位为SalI。
6.1.3 GOI（mAb）设计应删除以下限制酶切位：HindIII、EcoRI、ApaLI、ApaI、BamHI、SalI、ScaI、NruI、SmaI、NotI、BglII、XhoI、XbaI、PvuI、BsrGI、ClaI。
6.2、建构GOI（mAb-HC）（SEQ ID NO.4）于pEm载体
6.2.1利用HindIII / EcoRI限制酶分别对pEm与GOI（mAb-HC）进行酶切，pEm载体和GOI（mAb-HC）双酶切体系（30µL）包含：pEm载体和GOI（mAb-HC）分别 2µg（5µL）、HindIII 1µL、EcoRI 1µL、10×buffer 3µL、ddH2O 20µL。37℃酶切1h。经琼脂糖凝胶电泳验证片段大小正确后，选择所需的片段条带进行胶回收。pEm回收片段大小10645bp，GOI（mAb-HC）回收片段大小1428bp。
6.2.2连接以上载体pEm与GOI（mAb-HC）的回收片段以构建pEm-GOI(mAb-HC)。使用连接酶对GOI（mAb-HC）酶切产物与pEm载体酶切产物按摩尔比5:1进行连接。酶连接体系（20µL）包含：DNA连接酶 10µL、GOI（mAb-HC）酶切产物3.5µL、pEm载体酶切产物 5.5µL。酶连条件：反应体系在16℃条件下反应1h。
6.2.3以上连接产物进行转化（DH5α），过夜培养后观察菌落形态，选择形状均匀一致的6个单菌落进行单克隆PCR验证。在验证其真实性后，挑选需要的单菌落进行扩繁，并小量抽提质粒。最终获得pEm-GOI（mAb-HC）。
6.3、建构GOI（mAb-LC）（SEQ ID NO.5）于pEm-GOI（mAb-HC）质粒
6.3.1再利用NotI/SalI限制酶分别对pEm-GOI（mAb-HC）与GOI（mAb- LC）进行酶切，pEm-GOI（mAb-HC）和GOI（mAb-LC）双酶切体系（30µL）包含：pEm-GOI（mAb-HC）和GOI（mAb-LC）分别2µg（5µL）、NotI 1µL、SalI 1µL、10×buffer 3µL、ddH2O 20µL。37℃酶切1h。经琼脂糖凝胶电泳验证片段大小正确后，选择所需的片段条带进行胶回收。pEm-GOI（mAb-HC）回收片段大小12030bp，GOI（mAb-LC）回收片段大小731bp。
6.3.2连接载体pEm-GOI（mAb-HC）与GOI（mAb-LC）以构建pEm-GOI(mAb)。使用连接酶对GOI（mAb-LC）酶切产物与pEm-GOI（mAb-HC）酶切产物 按Pmol=5:1进行连接。酶连接体系（20µL）包含：DNA连接酶 12.5µL、GOI（mAb-LC）酶切产物 6µL、 pEm-GOI（mAb-HC）载体酶切产物 6.5µL。酶连条件：反应体系在16℃条件下反应1h。
6.4、转化及Clone PCR验证pEm-GOI（mAb）质粒的真实性
于6.3.2步结束后的连接产物进行转化（DH5α），观察菌落形态，选择形状均匀一致的6个单菌落进行单克隆PCR验证。在验证其真实性后，挑选需要的两个单菌落进行扩繁，并抽提质粒pEm-GOI（mAb），琼脂糖凝胶电泳及Nanodrop 2000确定质粒浓度和质量。
6.5、目的基因测序
构建完成的pEm-GOI（mAb）表达载体测序验证插入目的DNA序列正确性。
6.6、稳定细胞系的建立，pEm-GOI（mAb）表达载体可以通过PvuI线性化
构建完成的pEm -GOI（mAb）表达载体通过PvuI酶切制备线性化质粒后，用无水乙醇进行沉降，回收的质粒进行浓度和质量检测。质粒回收浓度在1μg/μL左右，紫外光260/280比值在1.80-2.0左右，260/230比值在2左右，结果符合细胞转染的要求。
7、单克隆抗体表达载体pEm-SEQ ID NO.1-GOI（mAb）的构建
单克隆抗体表达载体pEm-SEQ ID NO.1-GOI（mAb）的构建方法与步骤6中pEm- GOI（mAb）相似，将步骤6中载体pEm更换为pEm-SEQ ID NO.1载体即可。
8、单克隆抗体表达载体pEm-SEQ ID NO.2-GOI（mAb）的构建
单克隆抗体表达载体pEm-SEQ ID NO.2-GOI（mAb）的构建方法与步骤6中pEm- GOI（mAb）相似，将步骤6中载体pEm更换为pEm-SEQ ID NO.2载体即可。
9、最终获取三个符合细胞转染要求的线性化质粒，即pEm-GOI（mAb）、pEm-SEQ IDNO.1-GOI（mAb）和pEm-SEQ ID NO.2-GOI（mAb）。
实施例2宿主细胞的培养
宿主细胞：CHO-K1（ATCC #CCL61），已驯化至EmCD CHO基础培养基（品牌：Eminence，货号：L10400.1000）中。
培养基：EmCD CHO 基础培养基+1%m/V HT（品牌：Gibco，货号：0010057DG，成分：10mM次黄嘌呤+1.6mM胸苷）+0.5%m/V抗结团剂（品牌：Gibco，货号：0010057DG）+6mM 谷氨酰胺。
培养条件：37℃，5%CO2，120 RPM（轴距为50mm）。
容器：125mL及250mL摇瓶。
电转染及稳定细胞株筛选：细胞转染应在宿主细胞CHO-K1复苏1.5周至3周内进行，宿主细胞活率在90%以上。传代过程中细胞密度控制在4×106cells/mL以下。在转染前48小时活化细胞，按照8×105-10×105cells/mL接种密度传代至带档板摇瓶中。转染前24小时，再次按照8×105-10×105cells/mL接种细胞使其转染当天应保证细胞密度控制在1.5×106-2.0×106cells/mL，细胞活率应大于95%，电转染参数如下表1：
表1
制备小库并加压筛选稳定细胞株
小库：细胞经转染后按一定密度进行96孔板铺板，孔内细胞群称为小库。
1、细胞转染48h后，取样进行细胞计数，用Octet检测上清蛋白表达量。
2、挑选高表达量实验组，将相同载体的细胞混合采用筛选培养基（EmCD CHO 基础培养基+1%HT（次黄嘌呤+胸苷）+0.5%抗结团剂+30μM L-甲硫氨酸亚砜亚胺+10 μg/mL 嘌呤霉素）进行96孔板铺板，分别按铺板密度10000 cells/ 200 μL/孔或15000 cells/ 200 μL/孔两个条件进行96孔板铺板，制备小库并加压筛选。培养条件：37℃，5%CO2，静置培养。
3、96孔板经培养2-3周后，显微镜下观察小库细胞生长情况。
待小库细胞汇合度≥50%后，用Octet检测上清中HER2蛋白（重链SEQ ID NO.6，轻链SEQ ID NO.7）表达量，保留表达量相对较高的小库依次扩大至24孔板、6孔板、50mL摇管和125mL摇瓶培养。每阶段均用Octet检测上清中蛋白表达量，每个载体96孔板阶段分别检测约80-150个左右小库，全部扩大至24孔板培养。待24孔板小库细胞汇合度＞80%后，根据表达量保留约1/3 小库扩大至6孔板培养。待6孔板小库细胞汇合度＞80%后，根据表达量保留约1/2 小库扩大至50mL摇管培养。50mL摇管培养3-4天后，保留8个左右表达量和活细胞数较优的小库扩大至125mL摇瓶培养。
96孔板、24孔板和6孔板培养条件：37℃，5%CO2，静置培养。50mL摇管培养条件：37℃，5%CO2，180RPM（轴距50mm）。125mL摇瓶培养条件：37℃，5%CO2，120RPM（轴距50mm）。
最终筛选出的稳定细胞株进行流加培养评估见表2：
表2
其中，补料118A/B指补料A培养基和补料B培养基的混合物，补料A培养基为EmCDCHO118补料A培养基（品牌：Eminence，货号：P11810.0001），补料B培养基为EmCD CHO118补料B培养基（品牌：Eminence，货号：P11811.0001）。
流加培养后细胞上清采用OCTET（生物分子相互作用仪）检测表达量，检测结果见表3。
表3 小库细胞用于流加培养的表达数据
对于流加培养后的细胞上清进行蛋白纯化，纯化步骤如下：
（1）装柱：将Protein A填料（GE Mabselect SuRea LX 1mL）混匀，加到重力柱中，至柱高30mm，此时柱体积约有1mL。将重力柱固定，打开重力柱下端的堵头，使得保存液缓慢流出。
（2）再生：直至保存液快至柱面时，缓缓加入再生液（50mM氢氧化钠/1M氯化钠溶液）总共20mL至柱中，每次等到液面接近填料表面时加入10mL再生液，共计2次。注意每次加入时力度不要过大以免冲击柱面。时刻保持柱面上方有再生液。
（3）预平衡：直至再生液快至柱面时，缓缓加入平衡液（20mM磷酸缓冲溶液/150mM氯化钠；pH =7.0），总共20mL至柱中，每次等到液面下降至填料表面时加入10mL平衡液，共计2次。注意每次加入时力度不要过大以免冲击柱面。时刻保持柱面上方有平衡液。
（4）孵育：预平衡完毕后，用堵头堵住出液孔，再加入0.5mL平衡液，用移液器小心重悬填料，等填料上层平整后，缓慢加入待纯化上清（上样量不超过40mg蛋白/mL柱体积），室温下孵育30min。
（5）清洗柱子：孵育结束后，打开堵头，上清溶液在重力作用下，缓慢滴落（为提高回收率，可重复（4）操作1-2次）至收集容器中，用20mL平衡液清洗柱子，操作方式同（3）。
（6）洗脱待最后一次平衡液流干后，慢慢加入洗脱液（0.1M柠檬酸缓冲溶液；pH=3.5），分次加入，收集洗脱液。
（7）中和：调节洗脱液与中和液（1M三氨基甲烷（Tris））的比例，向样品洗脱液加入中和液，使终点pH控制在5.5±0.2范围内。
（8）过滤：将上一步骤溶液用0.22μm针式过滤器过滤。
（9）检测：用分光光度计检测过滤后溶液，记录浓度和纯化日期。
（10）再次清洗柱子：用20mL平衡液清洗柱子，操作方式同（3）。
（11）再次再生柱子：用20mL再生液清洗柱子，操作方式同（2）。
（12）保存：用5mL保存液清洗柱子，操作方式同（2），最后一次加5mL保存液（20%乙醇/150mM氯化钠溶液）将堵头堵上，盖上柱盖。重力柱保存在4℃重复使用。
纯化后样品进行-40℃保存。
质量分析
纯化后蛋白进行质量分析（包括带电性CEX及糖型N-Glycan）。
CEX检测：
利用HPLC（高效液相色谱）搭配弱阳离子色谱柱，取纯化后HER2蛋白，经梯度洗脱达到电荷异构体分离。检测结果见表4。
表4 小库细胞用于流加培养的目标蛋白质量数据：带电性
糖型N-Glycan检测：
将HER2蛋白用肽糖苷F酶对糖蛋白上的N-聚糖进行释放，并用2-AB等荧光试剂标记聚糖还原末端，衍生化后的聚糖在UPLC（超高效液相色谱）中产生荧光检测信号。其检测结果见表5。
表5 小库细胞用于流加培养的目标蛋白质量数据：糖型
图4结果显示SEQ ID NO.1引入的载体可提高小库筛选效率及表达的中位数，提高效率不仅大幅优于pEm载体，且优于引入SEQ ID NO.2的载体。经过挑选的最佳小库细胞于流加培养表达可达4.68 g/L（表1），与pEm及pEm- SEQ ID NO.2相比较，蛋白表达量显著提高。
将表达的蛋白质量进行质量分析（CEX及N-Glycan），SEQ ID NO.1引入的载体的蛋白质量结果完全符合现行抗体药物的范围（带电性：主峰55-60%；糖型：Man 3-5%），而其他两组数据均不符合要求。
Claims (14)
1.一种多核苷酸，其特征在于，序列为SEQ ID NO.1。
2.权利要求1所述的多核苷酸在构建表达载体中的应用。
3.包括权利要求1所述的多核苷酸的表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，还包括CMV启动子。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，还包括开放性阅读框。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为pEm载体。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述的多核苷酸插入pEm的位置为ClaI /BsrGI。
8.权利要求3-7任一项所述的表达载体在制备基因工程细胞中的应用。
9.包括权利要求3-7任一项所述的表达载体的基因工程细胞。
10.根据权利要求9所述的基因工程细胞，其特征在于，用于表达蛋白。
11.一种表达载体的构建方法，其特征在于，包括在载体中插入权利要求1所述的多核苷酸。
12.一种基因工程细胞的构建方法，其特征在于，包括权利要求11所述的表达载体的构建方法。
13.根据权利要求12所述的构建方法，其特征在于，还包括在表达载体上插入目的蛋白的基因序列。
14.一种利用基因工程表达蛋白的方法，其特征在于，包括权利要求12-13任一项所述的基因工程细胞的构建方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310800487.0A CN116574735B (zh) | 2023-07-03 | 2023-07-03 | 一种多核苷酸及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310800487.0A CN116574735B (zh) | 2023-07-03 | 2023-07-03 | 一种多核苷酸及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116574735A true CN116574735A (zh) | 2023-08-11 |
| CN116574735B CN116574735B (zh) | 2023-11-10 |
Family
ID=87545535
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310800487.0A Active CN116574735B (zh) | 2023-07-03 | 2023-07-03 | 一种多核苷酸及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116574735B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1334878A (zh) * | 1998-07-21 | 2002-02-06 | 科布尔药物有限公司 | 具有遍在染色质开放表达元件(ucoe)的聚核苷酸 |
| CN101260384A (zh) * | 1998-07-21 | 2008-09-10 | 密理博公司 | 具有遍在染色质开放表达元件(ucoe)的聚核苷酸 |
| US20100112640A1 (en) * | 1998-07-21 | 2010-05-06 | Michael Antoniou | Polynucleotide |
| CN104531699A (zh) * | 2014-10-09 | 2015-04-22 | 河南农业大学 | 一种增强外源基因表达的猪的ucoe调控元件片段 |
-
2023
- 2023-07-03 CN CN202310800487.0A patent/CN116574735B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1334878A (zh) * | 1998-07-21 | 2002-02-06 | 科布尔药物有限公司 | 具有遍在染色质开放表达元件(ucoe)的聚核苷酸 |
| CN101260384A (zh) * | 1998-07-21 | 2008-09-10 | 密理博公司 | 具有遍在染色质开放表达元件(ucoe)的聚核苷酸 |
| US20100112640A1 (en) * | 1998-07-21 | 2010-05-06 | Michael Antoniou | Polynucleotide |
| CN104531699A (zh) * | 2014-10-09 | 2015-04-22 | 河南农业大学 | 一种增强外源基因表达的猪的ucoe调控元件片段 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116574735B (zh) | 2023-11-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0330191B1 (en) | DNA encoding CD40 | |
| CN102197136B (zh) | 通过终止密码子连读的多肽同种型的细胞表面展示 | |
| Hou et al. | High-throughput ClonePix FL analysis of mAb-expressing clones using the UCOE expression system | |
| CN107828738A (zh) | 一种dna甲基转移酶缺陷型cho细胞系及其制备方法及应用 | |
| TWI449788B (zh) | 轉型酵母菌之方法 | |
| KR20100014724A (ko) | 숙주 세포에서 재조합 단백질의 발현을 증강시키기 위한 재조합 발현 벡터 요소(ｒＥＶＥ) | |
| MXPA03010626A (es) | Plataformas a base de cromosomas. | |
| CN107893073B (zh) | 一种筛选谷氨酰胺合成酶缺陷型hek293细胞株的方法 | |
| CN108085337B (zh) | 一种gs表达系统细胞株的筛选方法 | |
| CN114085841B (zh) | 一种cho细胞基因nw_003614092.1内稳定表达蛋白质的位点及其应用 | |
| CN114058625B (zh) | 一种cho细胞基因nw_003613781.1内稳定表达蛋白质的位点及其应用 | |
| WO2023093007A1 (zh) | 一种cho细胞基因nw_003614889.1内稳定表达蛋白质的位点及其应用 | |
| WO2023093005A1 (zh) | 一种cho细胞基因nw_003613756.1内稳定表达蛋白质的位点及其应用 | |
| CN113355360A (zh) | 一种gs基因敲除cho-k1细胞株的构建方法及悬浮细胞单克隆化 | |
| CN107760650B (zh) | 一种改造的cho细胞及其用途 | |
| CA2306229C (en) | Positive-negative selection for homologous recombination | |
| CN110551693A (zh) | 抗生素筛选hek细胞的方法 | |
| CN116574735B (zh) | 一种多核苷酸及其应用 | |
| CN111662907A (zh) | 一种敲除诱导多能干细胞nans基因的方法和应用 | |
| CN102392047A (zh) | 一种适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体及其应用 | |
| EP3733850A1 (en) | Chimeric promoter with high transcriptional activity in t-cells | |
| CN110684795A (zh) | 紫色红曲菌comp50904_c4基因过表达菌株的构建方法 | |
| US9752159B2 (en) | Stable expression system for eukaryotic cells | |
| CN114540352A (zh) | 一种多核苷酸、载体元件及表达载体和宿主细胞及应用 | |
| CN109402096B (zh) | 一种aid酶突变体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |