CN116569031A - 氧不敏感性电化学生物传感器及其使用方法 - Google Patents

氧不敏感性电化学生物传感器及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了用于检测分析物的试剂，其包含：酶，其包含葡萄糖氧化还原酶；选自刃天青、刃天青盐、试卤灵或试卤灵盐的至少一种电活性分子；以及至少一种金属配位络合物。

Description

氧不敏感性电化学生物传感器及其使用方法
相关申请
本申请要求享有2020年10月8日提交的美国临时专利申请号No.63/089,260和2021年10月8日提交的美国发明专利申请号No.17/497,422的优先权和权益，它们的内容整体并入本申请。
领域
本公开涉及电化学传感器，并且更具体地涉及用于电化学感测血糖水平的系统和方法。
背景
许多工业具有监测流体中特定成分的浓度商业需求。例如，患有糖尿病的患者必须每天仔细监测他们的血糖水平。可以得到允许人们便利地监测他们的血糖水平的许多系统。这类系统典型地包括用户施加血样的测试条和“读取”测试条以确定血液中葡萄糖水平的计量器。在可用于测量血糖水平的各种技术中，电化学技术特别合乎需求，因为可以仅需要非常少的血样来进行测量。一些常规小型化电化学测试条的一个特征是在工作电极和对电极二者上都存在单层生物试剂。然而，由于试剂层的生物学性质，难以可再现地制造具有完全相同灵敏度的每条带。最佳试剂组合物是通过促进电子在被分析的样品与电极及其连接的电路之间的自由流动而表现出增加的灵敏度的试剂组合物。血糖水平的准确测量对于许多用户的长期健康可能是至关重要的。因此，用于测量血糖水平的计量器和测试条应当是高度可靠的。某些计量器和测试条组合物已经显示出对氧的敏感性，因此影响整体性能。因此，对在测量系统和方法中对氧的敏感性降低的改进的生物试剂组合物存在需求。
概述
如下所述，本公开的特征在于用于电化学感测血糖水平的组合物和方法。
在一些方面，本公开提供了用于检测分析物的试剂，其包含：包含葡萄糖氧化还原酶的酶；选自刃天青、刃天青盐、试卤灵或试卤灵盐的至少一种电活性分子；以及至少一种金属配位络合物。
在一些实施方案中，所述葡萄糖氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶。在一些实施方案中，所述至少一种金属配位络合物包含钌配位络合物或锇配位络合物。在一些实施方案中，以0.01mM至约20mM的浓度提供所述至少一种电活性分子。在一些实施方案中，所述至少一种电活性分子包含以1mM至约3mM的浓度提供的刃天青或刃天青盐。在一些实施方案中，所述至少一种电活性分子包含以1mM至约4mM的浓度提供的试卤灵或试卤灵盐。在一些实施方案中，所述试剂还可以包含辅酶，该辅酶包含黄素腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
在一些方面，本公开提供了用于检测分析物的测试条，其包含：具有近侧区域和远侧区域的基底；在所述基底上形成的导电图形，该导电图形包括在所述条的所述近侧区域处置在所述基底上的至少一个电极、在所述测试条的所述远侧区域在导电区域处置在所述基底上的电气条状触点、以及使所述电极电连接到所述电气条状触点中的至少一些的导电迹线；以及与至少一个电极的至少一部分接触的试剂层，该试剂层包含：葡萄糖氧化还原酶；介体制剂，其包含独立地选自刃天青、刃天青盐、试卤灵或试卤灵盐的至少一种电活性分子；以及至少一种金属配位络合物。
在一些实施方案中，所述葡萄糖氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶。在一些实施方案中，所述至少一种金属配位络合物包含钌配位络合物或锇配位络合物。在一些实施方案中，以0.01mM至约20mM的浓度提供所述至少一种电活性分子。在一些实施方案中，所述至少一种电活性分子包含以1mM至约3mM的浓度提供的刃天青或刃天青盐。在一些实施方案中，所述至少一种电活性分子包含以1mM至约4mM的浓度提供的试卤灵或试卤灵盐。在一些实施方案中，所述试剂还可以包括辅酶，该辅酶包含黄素腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
在一些方面，本公开提供了用于测量体液成分的系统，其包含：用于检测分析物的测试条，该测试条包含：具有近侧区域和远侧区域的基底；在所述基底上形成的导电图形，该导电图形包括在所述条的所述近侧区域处置在所述基底上的至少一个电极、在所述测试条的所述远侧区域在导电区域处置在所述基底上的电气条状触点、以及使所述电极电连接到所述电气条状触点中的至少一些的导电迹线；以及与至少一个电极的至少一部分接触的试剂层，该试剂层包含：葡萄糖氧化还原酶；介体制剂，其包含至少一种独立地选自刃天青、刃天青盐、试卤灵或试卤灵盐的电活性分子；以及至少一种金属配位络合物；以及诊断计量器，该诊断计量器被配置以接收所述测试条并且电连接到所述电气条状触点。
在一些实施方案中，所述葡萄糖氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶。在一些实施方案中，所述至少一种金属配位络合物包含钌配位络合物或锇配位络合物。在一些实施方案中，以0.01mM至约20mM的浓度提供所述至少一种电活性分子。在一些实施方案中，所述至少一种电活性分子包含以1mM至约3mM的浓度提供的刃天青或刃天青盐。在一些实施方案中，所述至少一种电活性分子包含以1mM至约4mM的浓度提供的试卤灵或试卤灵盐。
附图简述
通过示例性实施方案的非限制性实施例，参考所注释的多个附图，在下面的详细描述中进一步描述了本公开，其中在附图的数个视图中相同的附图标记代表类似的部件，并且其中：
图1A是根据本公开的一些实施方案的测试条的总截面图。
图1B是根据本公开的一些实施方案的测试条的基底上的导电图形的俯视图。
图2A和2B示例了根据本公开的一些实施方案的计量器。
图3是具有不同介体制剂的传感条的电子转移流和测量的电流作为葡萄糖浓度的函数的示意图。
图4是与非氧合血液的百分比偏差相对于以mmHg计的氧分压(pO2)水平的图，其比较了麦尔多拉蓝、刃天青和试卤灵。
图5是对于25mg/dL葡萄糖在不同pH水平与非氧合血液的百分比偏差相对于氧分压(pO2)的图，其比较了pH 6.5(正方形)、pH 7.2(圆形)和pH 7.7(三角形)。
图6是对于在20mg/dL葡萄糖中不同浓度的刃天青钠盐与非氧合血液的百分比偏差相对于氧分压(pO2)的图，其比较了1x(1.2mM)刃天青钠盐(正方形)、2x(2.4mM)刃天青钠盐(三角形)和3x(3.6mM)刃天青钠盐(圆形)。
尽管如上所鉴别的附图阐述了本公开的实施方案，但是如在讨论中所注释的，也想到了其他实施方案。本公开以代表而非限制的方式呈现了示例性实施方案。本领域技术人员可以设计出落入本公开的实施方案的原理的范围和精神内的许多其他变型和实施方案。
详细描述
以下描述仅提供示例性实施方案，不想限制本公开的范围、适用性或配置。相反，以下所述示例性实施方案的描述将为本领域技术人员提供使其能实施一个或多个示例性实施方案的描述。将会理解，在不脱离本公开的实施方案的精神和范围的情况下，可以对要素的功能和布置进行各种改变。
现在将参考附图更全面地描述主题内容，附图形成主题内容的一部分，并且以示例的方式显示了本公开的具体实施例方面和实施方案。然而，可以以各种不同的形式体现主题内容，因此，预想所涵盖或要求保护的主题内容被解释为不限于本申请中阐述的任何实例实施方案；提供实例实施方案仅是举例说明。因此，以下详细描述不打算以限制性意义来理解。
在可用于测量血糖或其他分析物水平的各种技术中，电化学技术特别合乎需求，因为可能仅需要非常少的血样来进行测量。一些常规小型化电化学测试条的一个特征是在工作电极与和对电极二者上存在单层生物试剂。然而，由于试剂层的生物学性质，难以可再现地制造具有完全相同灵敏度的每条带。最佳试剂组合物是通过促进电子在被分析的样品和电极及其连接电路之间的自由流动而表现出增加的灵敏度的试剂组合物。
某些计量器和测试条组合物已经显示出对氧的敏感性，因此影响整体性能。本公开涉及用于测量目的分析物(例如，葡萄糖)的电化学生物传感器的组合物。使用氯化六氨合钌作为主要电子转移介质的生物传感器在制造和储存方面具有优势，因为当与第二介体(例如8-二甲基氨基-2,3-苯并吩噁嗪半(氯化锌)盐(麦尔多拉蓝))偶联时，它们具有较高的氧化还原稳定性，背景电流信号的变化小。然而，这些生物传感器仍然可能受到氧分压的影响。因此，需要开发不受氧影响的制剂，其在不同温度和湿度下具有稳健的性能，对于长期储存是稳定的，并且适合于大规模生产。
在本公开中，所述试剂组合物包含促进葡萄糖氧化或还原的酶，例如氧化还原酶(例如，葡萄糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶)、转移酶(例如己糖激酶)。在一些实施方案中，所述酶可以与或不与辅因子(例如，黄素、烟酰胺、醌衍生物)、基于钌的氧化还原介体(例如，六氨合钌、双膦钌)和包含至少一种电活性分子(例如，刃天青、刃天青盐、试卤灵或试卤灵盐)的第二介体一起使用，其对血液中的氧的敏感性降低。在一些实施方案中，第二介体可以是显示对氧的敏感性改善的化学品。在一些实施方案中，所述至少一种电活性分子为刃天青钠盐或试卤灵钠盐。
特别地，可以选择所述第二介体的至少一种电活性分子，使得氧浓度分压≥75mmHg的氧合样品与氧浓度分压<75mmHg的非氧合样品的葡萄糖结果之间的百分比偏差在-1％和-10％之间。在一些实施方案中，百分比偏差可以在-1％与-8％之间。在一些实施方案中，百分比偏差可以在-1％与-6％之间。在一些实施方案中，所述至少一种电活性分子独立地选自刃天青、刃天青盐、试卤灵或试卤灵盐，并且导致百分比偏差在-1％与-10％之间。在一些实施方案中，所述至少一种电活性分子独立地选自刃天青、刃天青盐、试卤灵或试卤灵盐，并且导致百分比偏差在-1％与-8％之间。在一些实施方案中，所述至少一种电活性分子独立地选自刃天青、刃天青盐、试卤灵或试卤灵盐，并且导致百分比偏差在-1％与-6％之间。在一些实施方案中，选择第二介体的至少一种电活性分子，使得包含麦尔多拉蓝的测试条对氧的敏感性是本公开的测试条的2至11倍。在一些实施方案中，所述至少一种电活性分子选自刃天青、刃天青盐、试卤灵或试卤灵盐，使得包含麦尔多拉蓝的测试条对氧的敏感性是具有刃天青、刃天青盐、试卤灵或试卤灵盐的测试条的2至11倍。
在一些实施方案中，本公开的系统和方法可用于确定血样中的葡萄糖浓度以监测糖尿病患者。在一些实施方案中，葡萄糖浓度可用于确定奶或其他乳制品中乳糖的量。例如，在乳糖水解期间形成的葡萄糖的量与样品中存在的乳糖的量成正比。因此，乳品样品中的葡萄糖浓度可用于计算样品中乳糖的量。在一些实施方案中，本发明组合物可用于测试葡萄糖或任何其他分析物的许多其他诊断应用中。
系统概述
用于测量血糖的计量器可以包括用于测量患有I型或II型糖尿病的用户的血糖水平的便携式手持装置。典型地，用户购买与计量器接口的测试条。使用者使用刺血针从手指或其他区域抽取少量血液(几微升或更少)，并将血滴施加到所述条的暴露端上，该条具有用于血液的开放端口。将所述条插入计量器连接器端口，并且在血样与所述条上的试剂组合物之间发生化学和/或电化学反应，其由计量器测量以根据区域偏好确定以mg/dL或mmol/L计的血糖水平。
在典型的电化学系统中，涉及葡萄糖的氧化或还原半电池反应产生或消耗电子。可以测量该电子流，条件是电子可以与工作电极相互作用，该工作电极与被分析的样品接触。通过也与样品接触的对电极完成电回路。化学反应发生在对电极处，并且该反应(氧化或还原)与工作电极处的反应相反。见，例如，Fundamentals Of Analytical Chemistry,第4版,D.A.Skoog和D.M.West；Philadelphia：Saunders College Publishing(1982),pp304-341。
测试条
测试条包括试剂层，该试剂层包含本申请中所述的试剂组合物中的至少一种。个体测试条还可以包括涉及与许多测试条相关联的数据或该个体条特定的数据的嵌入代码。在美国专利公开号No.2007/0015286中进一步描述了这种编码型条，通过引用将该专利文献的全部内容并入本申请。测试条可以包括用于接收用户的流体样品(例如血样)的样品室。可以使用美国专利号No.6,743,635中描述的材料和方法形成样品室和测试条，通过引用将该专利的全部内容并入本申请。因此，样品室可以包括在测试条的近端中的第一开口和用于使样品室通气的第二开口。可以设计样品室的尺寸以便能够通过第一开口吸入血样，并通过毛细管作用将血样保持在样品室中。测试条可以包括在近端处最窄的锥形部分，或者可以包括其他标记，以便使用户更容易定位第一开口并施加血样。
图1A示例了测试条10的实例实施方案的总截面图。特别地，图1A描绘了测试条10，其包括近端12、远端14，并且形成有沿着测试条10的整个长度延伸的基层16。基层16可以由电绝缘材料构成，并且具有足以为测试条10提供结构支撑的厚度。出于本公开的目的，“远侧”是指在正常使用期间测试条的远离流体源(例如，更靠近计量器)的部分，并且“近侧”是指在正常使用期间更靠近流体源(例如，对于葡萄糖测试条，具有一滴血液的指尖)的部分。基层16可以由电绝缘材料构成，并且具有足以为测试条10提供结构支撑的厚度。
如图1A中所示，测试条10的近端12包括样品接收位置，例如如上所述被配置以接收患者的流体样品的样品室20。样品室20可以部分地通过介电绝缘层18中的狭槽形成，介电绝缘层18在盖22与形成在基层16上的下面测量电极之间形成。因此，样品室20可以包括在测试条的近端中的第一开口(例如，样品接收位置)和用于使样品室20通气的第二开口。可以设计样品室20的尺寸以便能够通过第一开口吸入血样，并通过毛细管作用将血样保持在样品室20中。测试条10可以包括在近端12处最窄的锥形部分，或者可以包括其他标记以使用户更容易定位第一开口并施加血样。
参考图1B，根据本公开的实例实施方案，条带10可以包括处置在条带10的基层16上的导电图形。在一些实施方案中，可以通过激光烧蚀基层16的电绝缘材料以暴露下面的导电材料来形成导电图形。也可以使用其他方法，例如具有与控制电路的物理附接的插入导体。也可以使用其他方法将导电图形处置在基层上。导电图形可以包括在近端12附近处置在基层16上的多个电极15、在远端14附近处置在基层16上的多个电气条状触点19以及将电极15电连接到多个电气条状触点19的多个导电迹线17。
在一些实施方案中，校准代码可以包括在测试条上。在一些实施方案中，可以在靠近所述条的远端以第二多个电气条状触点的形式在测试条带上包括校准码。所述第二多个电触点可以被如此布置以致当所述条被插到计量器中时，它们提供可由计量器阅读的测试条批次特异的明显可辨别的校准代码。如上所述，可读代码可以读取为来自计量器中与来自该批次的测试条相关的板载存储器单元的存取数据(例如校准系数)的信号，甚或对应于个体测试条的信息。例如，如图1B中所示，测试条可以包括多个触点50形式的校准代码。
在一些实施方案中，试剂层90或试剂组合物可以被处置在所述条10的基层16上，其与导电图形的至少一个工作电极接触，如图1B中所示并在下面进一步描述。
血糖仪
图2A和图2B示例了用于测量血样中葡萄糖水平的计量器100的示例性图示。计量器100包括具有用于接收测试条的测试端口的壳体，以及被编程以执行方法和算法以确定测试样品或对照溶液中的葡萄糖浓度的处理器或微处理器，其如本公开中所公开。在一些实施方案中，计量器100具有允许其在用户执行葡萄糖测量时方便地握在用户的手中的尺寸和形状。计量器100可以包括前侧102、后侧104、左侧106、右侧108、顶侧110和底侧112。前侧102可以包括显示器114，例如液晶显示器(LCD)。底侧112可以包括条状连接器116，测试条可以插入条状连接器116以进行测量。计量器100还可以包括用于存储测试算法或测试数据的存储装置。计量器100的左侧106可以包括数据连接器418，可移除的数据存储装置120可根据需要插到该数据连接器418中。顶侧110可以包括一个或多个用户控件122，例如按钮，用户可以利用其控制计量器100，并且右侧108可以包括串行数据连接器(未显示)。
所述计量器可以是电池供电的，并且可以在不使用时保持在低功率睡眠模式，以便节省功率。当测试条插入计量器时，测试条上的第一多个电触点和第二多个电触点接触计量器中的对应电触点。第二多个电触点可以桥接计量器中的一对电触点，使得电流流过第二多个电触点的一部分。流过第二多个电触点的电流使计量器唤醒并进入活动模式。计量器还读取由第二多个提供的代码信息，然后可以识别例如要执行的特定测试或适当操作状态的确认。此外，计量器还可以基于特定代码信息将插入的条识别为测试条或检查条。如果计量器检测到检查条，则它执行检查条序列。如果计量器检测到测试条，则它执行测试条序列。
在测试条序列中，计量器通过确认在任何这些电极之间没有低阻抗路径来验证工作电极、对电极以及填充检测电极(如果包括的话)。如果电极有效，则计量器向用户显示可以将样品施加到测试条上。然后，计量器在工作电极与对电极之间施加液滴检测电压，并通过检测工作电极与对电极之间的电流(即，当血样桥接工作电极和对电极时流过血样的电流)来检测流体样品，例如血样。为了检测样品室中存在足够的样品以及血样已经穿过试剂层并与试剂层中的化学和生物成分混合，计量器可以在填充检测电极之间施加填充检测电压并测量在填充检测电极之间流动的任何所产生的电流。如果该产生的电流在预定时间期限内达到足够的水平，则计量器向用户显示存在足够的样品并且其已经与试剂层混合。
计量器可以被编程以在最初检测血样之后等待预定的时间期限，以允许血样与试剂层反应，或者可以立即开始按顺序进行读数。在流体测量期限期间，计量器在工作电极与对电极之间施加测定电压，并对在工作电极与对电极之间流动的所产生的电流进行一次或多次测量。测定电压接近试剂层中制剂的氧化还原电位，并且所产生的电流与所测量的特定成分的浓度(例如，血样中的葡萄糖水平)相关。在一些实施方案中，工作电极和对电极在导电物质上产生。
试剂组合物
在一些实施方案中，提供了试剂组合物或试剂层，其用于测量样品中的葡萄糖水平的电化学传感器中。试剂组合物包括氧化还原酶、介质制剂和任选的辅酶。介体制剂包含至少一种电活性分子和至少一种配位络合物。本公开的试剂层可以提供准确度、灵敏度、分析范围和稳定性的改进。
在一些实施方案中，试剂层90或试剂组合物可以被处置在条10的基层16上，与导电图形的至少一个工作电极接触(图1B)。在一些实施方案中，试剂层的特征在于在工作电极和对电极两者上的单层生物试剂。使用单个试剂层可以提供所述条的简单制造，因为仅需要一个处置步骤来将材料涂覆到电极上。试剂层可以包括促进葡萄糖的氧化还原反应的酶，例如葡萄糖氧化还原酶，任选地辅酶，以及有助于在氧化还原反应和工作电极之间转移电子的一种或多种介体，例如铁氰化钾或六氨合钌。试剂层90还可以包括其他成分，例如缓冲物质(例如磷酸钾)、聚合物粘合剂(例如羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、微晶纤维素、聚环氧乙烷、羟乙基纤维素和/或聚乙烯醇)和表面活性剂(例如，Triton X-100或Surfynol 485)。利用这些化学成分，试剂层以以下方式与血样中的葡萄糖反应。葡萄糖氧化还原酶引发反应，该反应引发氧化还原级联。在一些实施方案中，葡萄糖氧化还原酶将葡萄糖氧化为葡萄糖酸并将铁氰化物还原为亚铁氰化物。当相对于对电极向工作电极施加适当的电压时，亚铁氰化物被氧化成铁氰化物，从而产生与血样中葡萄糖浓度相关的电流。如本领域技术人员将理解的，在不脱离本公开的范围的情况下，可以使用本领域中已知的条10的任何组合。
“样品”可以包括包含未知量的目的分析物(例如，葡萄糖)的组合物。典型地，用于电化学分析的样品是液体形式，并且优选地，样品是水性混合物。样品可以是生物样品，例如血液、尿液或唾液。样品可以是生物样品的衍生物，例如提取物、稀释物、滤液或重构沉淀物。样品可以是由牛奶和其他乳制品得到的样品。样品可以是由葡萄和葡萄酒以及其他酿酒产品得到的样品。
“氧化还原酶”可以包括促进底物氧化或还原的任何酶。氧化还原酶可以包括“氧化酶”的一种或多种，其促进氧化反应，其中分子氧是电子受体；“还原酶”，其促进还原反应，其中分析物被还原，并且分子氧不是分析物；或“脱氢酶”，其促进氧化反应，其中分子氧不是电子受体。见，例如，Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology,修订版,A.D.Smith,Ed.,New York：Oxford University Press(1997)pp.161,476,477和560，通过引用将其全部内容并入本申请。氧化还原酶的实例包括葡萄糖脱氢酶(GDH)、葡萄糖氧化酶胆固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶、甘油激酶、乳酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、醇氧化酶、尿酸酶等。在一些实施方案中，氧化还原酶可以是葡萄糖氧化还原酶，即促进葡萄糖氧化或还原的氧化还原酶。在本公开的一些实施方案中，氧化还原酶是GDH。
“辅酶”可以包括非蛋白质氧化还原假体。本公开的辅酶优选是与酶共价或非共价连接并且通过分析物的转化而改变(例如氧化或还原)的有机分子。辅酶的实例是黄素、烟酰胺和醌衍生物，例如：黄素核苷酸衍生物，如FAD、FADH2、FMN、FMNH2等；烟酰胺核苷酸衍生物，如NAD+、NADH、NADP+、NADPH；或泛醌如辅酶Q或PQQ。在本公开的一些实施方案中，辅酶是黄素核苷酸。
“介体”可以包括可以被氧化或还原并且可以在第一物质和第二物质之间转移一个或多个电子的物质。介体是电化学分析中的试剂，而不是目的分析物。在简单的系统中，在氧化还原酶通过其与适当的底物接触而被还原或氧化之后，介体经历与氧化还原酶的氧化还原反应。然后，该氧化或还原的介体在电极处经历相反的反应并再生至其原始氧化数。
“配位络合物”可以包括具有明确定义的配位几何形状(例如八面体或正方形平面几何形状)的络合物。与有机过渡金属络合物(其被定义为过渡金属通过σ键与至少一个碳原子键合的络合物)不同，配位络合物根据其几何形状进行定义。因此，配位络合物可以是有机过渡金属络合物(例如铁氰化物(III)及其还原的亚铁氰化物(II)对应物)，或其中除碳之外的非金属原子(例如包括氮、硫、氧和磷的杂原子)与过渡金属中心配位键合的络合物。例如，六氨合钌是具有明确定义的八面体几何形状的配位络合物，其中六个NH3配体(6个配体中的每个配体上的形式电荷为0)配位键合到钌中心。有机过渡金属络合物、配位络合物和过渡金属键合的更完整讨论可以在Collman等人,Principles and Applicationsof Organotransition Metal Chemistry(1987)和Miessler&Tarr,Inorganic Chemistry(1991)中找到，通过引用将它们的全部内容并入本申请。在本公开的一些实施方案中，配位络合物选自铁、钌和锇络合物。在一些实施方案中，配位络合物是六氨合钌。
“电活性分子”可以包括不含金属并且能够进行氧化或还原反应的有机分子。电活性分子可以表现为氧化还原类分子和介体。电活性分子的实例包括苯醌类和萘醌类、N-氧化物、亚硝基化合物、羟胺类、肟类、吩嗪类、吩噻嗪类、吩噁嗪类、靛酚类和吲达胺类。电活性分子的其他实例包括美国专利号No.5,520,786中描述的那些，通过引用将该专利的全部内容并入本申请。电活性分子的其他实例包括美国专利号No.8,062,490中描述的那些，通过引用将该专利的全部内容并入本申请。在一些实施方案中，电活性分子可以是盐形式(例如，钠、钾、钙、镁等)。在一些实施方案中，电活性分子可以是碱金属盐形式(例如，锂、钠、钾、铷、铯等)。
在本公开的一些实施方案中，至少一种电活性分子独立地选自吩嗪类、吩噻嗪类或吩噁嗪类或其盐(例如吩噁嗪鎓盐)。吩噁嗪类及其盐包括但不限于苯并吩噁嗪类及其相应的盐(即，苯并吩噁嗪鎓盐)。在一个实施方案中，所述至少一种电活性分子是吩噁嗪盐。
在本公开的一些实施方案中，至少一种电活性分子独立地选自7-羟基-3H-吩噁嗪-3-酮10-氧化物(刃天青)或刃天青盐。在一些实施方案中，至少一种电活性分子独立地选自7-羟基-3H-吩噁嗪-3-酮(试卤灵)或试卤灵盐。在一些实施方案中，刃天青盐或试卤灵盐可以是钠、钾、钙、镁或类似金属的盐。在一些实施方案中，刃天青盐或试卤灵盐可以是碱金属盐形式(例如锂、钠、钾、铷、铯或类似物)。在一些实施方案中，刃天青盐是7-羟基-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物钠盐(刃天青钠盐)。在一些实施方案中，试卤灵盐是7-羟基-3H-吩噁嗪-3-酮钠盐(试卤灵钠盐)。
在一个实施方案中，葡萄糖脱氢酶(GDH)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)包含氧化还原酶-辅酶组合。在另一个实施方案中，GDH和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)包含氧化还原酶-辅酶组合。在另一个实施方案中，氧化还原酶是葡萄糖氧化酶。此外，可以将包含电活性分子和配位络合物的介体制剂掺到具有氧化还原酶-辅酶的试剂层中。在一个实施方案中，将吩噁嗪盐(例如，刃天青钠盐)和钌络合物(例如，六氨合钌)与GDH-FAD组合。在另一个实施方案中，将吩噁嗪盐(例如刃天青钠盐)和钌络合物(例如六氨合钌)与GDH-NAD+组合。
在样品测试期间，GDH引发将葡萄糖氧化为葡萄糖酸并还原配位络合物(例如，将刃天青还原为试卤灵并将钌(III)还原为钌(II))的反应。当相对于对电极向工作电极施加适当的电压时，还原的配位络合物(例如，钌(II))被氧化(例如，钌(III))，从而产生与血样中的葡萄糖浓度相关的电流。然后计量器基于所测量的电流和校准数据(即，已向该计量器发信号通过所述代码获取从与测试条相关联的第二多个电触点读取的数据)计算葡萄糖水平。然后计量器向用户显示所计算的葡萄糖水平。
在一些实施方案中，本公开的试剂组合物在第二介体中的至少一种电活性分子(例如，独立地选自刃天青、刃天青盐、试卤灵或试卤灵盐)的宽浓度范围，例如，如约0.01mM至约20mM的浓度，保持对氧不敏感。在一些实施方案中，所述至少一种电活性分子可以以约1mM至约3mM的浓度提供。在一些实施方案中，所述至少一种电活性分子可以以约1mM至约2mM的浓度提供。在一些实施方案中，所述至少一种电活性分子为以约0.01mM至约20mM的浓度提供的刃天青或刃天青盐。在一些实施方案中，所述至少一种电活性分子为以约1mM至约3mM的浓度提供的刃天青或刃天青盐。在一些实施方案中，所述至少一种电活性分子为以约1mM至约2mM的浓度提供的刃天青或刃天青盐。在一些实施方案中，所述至少一种电活性分子为以约0.01mM至约4mM的浓度提供的试卤灵或试卤灵盐。在一些实施方案中，所述至少一种电活性分子为以约1mM至约4mM的浓度提供的试卤灵或试卤灵盐。在一些实施方案中，所述至少一种电活性分子为以约2mM至约3mM的浓度提供的试卤灵或试卤灵盐。
在一些实施方案中，所述酶可以以约0.5g/L至约50g/L的浓度提供。在一些实施方案中，所述酶可以以约5g/L至约10g/L的浓度提供。在一些实施方案中，所述酶(例如，葡萄糖氧化酶)可以以约0.5g/L至约25g/L的浓度提供。在一些实施方案中，所述酶(例如，葡萄糖氧化酶)可以以约5g/L至约10g/L的浓度提供。在一些实施方案中，所述氧化还原酶-辅酶组合(例如GDH-FAD)可以以约100U/mL至约10,000U/mL的浓度提供。在一些实施方案中，所述氧化还原酶-辅酶组合可以以约1000U/mL至约5000U/mL的浓度提供。在一些实施方案中，所述氧化还原酶-辅酶组合可以以约1000U/mL至约2500U/mL的浓度提供。在一些实施方案中，所述氧化还原酶-辅酶组合可以以约2500U/mL至约5000U/mL的浓度提供。在一些实施方案中，钌络合物可以以约50mM至约500mM的浓度提供。在一些实施方案中，钌络合物可以以约100mM至约300mM的浓度提供。在一些实施方案中，钌络合物可以以约130mM至约170mM的浓度提供。在一些实施方案中，钌络合物(例如氯化六氨合钌)可以以约50mM至约175mM的浓度提供。
任选地，试剂组合物可以包括不直接参与电化学传感器中的任何氧化还原反应的惰性成分。这类惰性成分的实例包括粘合剂、增稠剂和缓冲成分。粘合剂可以包括膨润土、聚环氧乙烷、羧甲基纤维素、聚乙烯醇、聚丙烯酸、methocel、CMC、PEG和/或PEO。增稠剂可以包括二氧化硅和/或聚环氧乙烷。缓冲成分可以由一种或多种，例如两种、三种、四种或更多种不同的缓冲剂组成，其中缓冲成分在干燥形式的组合物储存期间稳定介体，使得在使用之前(例如在储存期间)几乎没有(如果有的话)介体被还原。如果在缓冲剂存在下，在给定的储存期内几乎没有(如果有的话)介体转化为还原形式，则认为缓冲剂稳定介体。合适的缓冲剂是在电化学测试中不引起背景信号随时间增加的缓冲剂。实例缓冲剂包括但不限于琥珀酸盐、TES、BES、ACES、HEPES、MOPS、磷酸盐、双-Tris丙烷和/或咪唑。背景信号是当将不含分析物的样品导入电化学测试系统时获得的信号。
此外，试剂组合物还可以包括湿润剂。在一些实施方案中，湿润剂与去污剂组合使用。可以添加湿润剂以促进试剂组合物均匀涂覆到电化学测试条上。还可以使用多种一种或多种试剂组合。所使用的试剂可以改善测定试剂的溶解以及增强毛细管填充条的芯吸特性。试剂包括本领域中已知的那些，例如聚合物、消泡剂和表面活性剂。目的表面活性剂/去污剂的代表性类型包括但不限于：Tritons、Macols、Tetronics、Silwets、Zonyls和Pluronics。合适的试剂包括Pluronic材料，其为聚环氧乙烷和聚氧化丙烯的嵌段共聚物。Pluronic材料的实例包括具有良好润湿性能的Pluronic P103和具有良好去污性能的Pluronic F87 Prill。Pluronic P103和F87 Prill二者还具有大于80℃的浊点温度，这是合乎需求的，因为这种性质避免了干燥过程期间组合物中的相变。
一些试剂组合物还可以包括一种或多种酶辅因子。目的酶辅因子包括二价金属阳离子，例如Ca2+和/或Mg2+。
还可以将稳定剂添加到试剂组合物中以辅助稳定酶并防止蛋白质变性。稳定剂还可以辅助稳定介体，特别是氧化的氧化还原介体的氧化还原状态。稳定剂的实例包括但不限于碳水化合物(例如蔗糖、海藻糖、甘露糖醇和乳糖)、氨基酸、蛋白质(例如BSA和白蛋白)和有机化合物，例如EDTA等，以及葡萄糖酸盐、钙、镁和/或谷氨酸盐。
还可以将粘度调节剂添加到试剂中以改变液体试剂流变性。这类试剂的实例包括聚(丙烯酸)、聚(乙烯醇)、葡聚糖和/或BSA。
在一些实施方案中，试剂层可以与血样中的葡萄糖反应，以便确定特定的葡萄糖浓度。
以下实施例提供了本公开的另外实施方案。
实施例1：麦尔多拉蓝、刃天青钠盐和试卤灵钠盐的氧敏感性比较
在介体制剂中用麦尔多拉蓝或刃天青钠盐或试卤灵钠盐制造了葡萄糖测试条，并通过安培法对其进行测试。将各种氧分压的血样施加到测试条上。非氧合血样用作对照。每个样品中葡萄糖的浓度相同。通过血气分析仪和葡萄糖分析仪分别测定了每个血液等分试样的氧分压和葡萄糖浓度。计算了氧合和非氧合样品的葡萄糖结果之间的百分比偏差。
图3是具有不同介体制剂(即刃天青和试卤灵)的传感器条的电子转移流和测量的电流作为葡萄糖浓度的函数的示意图。
图4是与非氧合血液的百分比偏差相对于以mmHg计的氧分压(pO2)水平的图，其比较了麦尔多拉蓝、刃天青钠盐和试卤灵钠盐，表明刃天青钠盐和试卤灵钠盐对氧的敏感性低于麦尔多拉蓝。特别地，平均而言，对于包含麦尔多拉蓝的测试条，氧浓度分压≥75mmHg的氧合样品与氧浓度分压<75mmHg的非氧合样品的葡萄糖结果之间的偏差为-16％；而对于包含刃天青钠盐和试卤灵钠盐的测试条，偏差分别为-1.6％和-6.0％。因此，包含刃天青钠盐或试卤灵钠盐的测试条对氧的敏感性分别比包含麦尔多拉蓝的测试条低10.2或2.7倍。
实施例2：在中性pH在25mg/dL葡萄糖下刃天青钠盐的氧效应
在介质制剂中在pH 6.5、7.2和7.7用1.2mM刃天青钠盐制造了葡萄糖测试条，并通过安培法对其进行了测试。将各种氧分压的血样施加到测试条上。非氧合血样用作对照。每个样品中葡萄糖的浓度相同。通过血气分析仪和葡萄糖分析仪分别测定了每个血液等分试样的氧分压和葡萄糖浓度。计算了氧合与非氧合样品的葡萄糖结果之间的百分比偏差。
图5是对于25mg/dL葡萄糖在不同pH水平，与非氧合血液的百分比偏差相对于氧分压(pO2)的图，其比较了pH 6.5(正方形)、pH 7.2(圆形)和pH 7.7(三角形)，显示在中性pH范围刃天青钠盐对氧不敏感。
实施例3：在20mg/dL葡萄糖下不同浓度的刃天青钠盐的氧效应
在介体制剂中用1.2mM、2.4mM和3.6mM刃天青钠盐制造了葡萄糖测试条，并通过安培法对其进行了测试。将各种氧分压的血样施加到测试条上。非氧合血样用作对照。每个样品中葡萄糖的浓度相同。通过血气分析仪和葡萄糖分析仪分别测定了每个血液等分试样的氧分压和葡萄糖浓度。计算了氧合与非氧合样品的葡萄糖结果之间的百分比偏差。
图6是对于在20mg/dL葡萄糖中各种浓度的刃天青钠盐，与非氧合血液的百分比偏差相对于氧分压(pO2)的图，其比较了1x(1.2mM)刃天青钠盐(正方形)、2x(2.4mM)刃天青钠盐(三角形)和3x(3.6mM)刃天青钠盐(圆形)，显示一次性测试条的化学试剂层在宽浓度的刃天青钠盐范围内对氧保持不敏感。
本公开的示例性实施方案
在一些实施方案中，试剂层可以与血样中的葡萄糖反应，以便确定特定的葡萄糖浓度。试剂层包含氧化还原酶、辅酶和介体制剂。介体制剂包含至少一种电活性分子和至少一种配位络合物。所述至少一种电活性分子可以独立地选自吩噁嗪类或其盐。所述至少一种配位络合物可以独立地选自铁、锇或钌络合物。在一个实施方案中，所述至少一种电活性分子为吩噁嗪类或其盐，并且所述至少一种配位络合物为钌络合物。
在一些方面，本公开提供了用于检测分析物的试剂，其包含：葡萄糖氧化还原酶；介体制剂，其包含至少一种电活性分子，该电活性分子独立地选自刃天青、刃天青盐、试卤灵或试卤灵盐；以及至少一种金属配位络合物。在一些实施方案中，所述葡萄糖氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶。在一些方面，本公开还涉及辅酶。在一些实施方案中，所述辅酶为黄素腺嘌呤二核苷酸。在一些实施方案中，所述辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。在一些实施方案中，所述至少一种金属配位络合物为钌络合物或锇络合物。
在一些方面，本公开提供了用于检测分析物的测试条，其包含具有近侧区域和远侧区域的基底；在所述基底上形成的导电图形，该导电图形包括在所述条的所述近侧区域处置在所述基底上的至少一个电极、在所述测试条的所述远侧区域在导电区域处置在所述基底上的电气条状触点、以及将所述电极电连接到所述电气条状触点中的至少一些的导电迹线；以及与至少一个电极的至少一部分接触的试剂层，该试剂层包含葡萄糖氧化还原酶；介体制剂，其包含至少一种独立地选自刃天青、刃天青盐、试卤灵或试卤灵盐的电活性分子；以及至少一种金属配位络合物。在一些实施方案中，所述葡萄糖氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶。在一些方面，本公开还涉及辅酶。在一些实施方案中，所述辅酶为黄素腺嘌呤二核苷酸。在一些实施方案中，所述辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。在一些实施方案中，所述至少一种金属配位络合物为钌络合物或锇络合物。
在一些方面，本公开提供了用于检测分析物的试剂，该试剂包含刃天青钠盐或试卤灵钠盐。
在一些方面，本公开提供了用于测定体液成分的系统，该系统包含用于检测分析物的测试条，该测试条包含具有近侧区域和远侧区域的基底；在所述基底上形成的导电图形，该导电图形包括在所述条的所述近侧区域处置在所述基底上的至少一个电极、在所述测试条的所述远侧区域在导电区域处置在所述基底上的电气条状触点、以及将所述电极电连接到所述电气条状触点中的至少一些的导电迹线；以及与至少一个电极的至少一部分接触的试剂层，该试剂层包含葡萄糖氧化还原酶；介体制剂，其包含至少一种独立地选自刃天青、刃天青盐、试卤灵或试卤灵盐的电活性分子；以及至少一种金属配位络合物；以及诊断计量器，该诊断计量器被配置以接收所述测试条并且电连接到所述电气条状触点。在一些实施方案中，所述葡萄糖氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶。在一些方面，本公开还涉及辅酶。在一些实施方案中，所述辅酶为黄素腺嘌呤二核苷酸。在一些实施方案中，所述辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。在一些实施方案中，所述至少一种金属配位络合物为钌络合物或锇络合物。
在一些实施方案中，所述试剂层包含氧化还原酶、辅酶和介体制剂，其中所述氧化还原酶为葡萄糖氧化还原酶，并且所述辅酶选自黄素核苷酸和/或烟酰胺核苷酸。所述介体制剂包含至少一种电活性分子和至少一种配位络合物。所述至少一种电活性分子可以独立地选自吩噁嗪类或其盐，而所述至少一种配位络合物独立地选自铁、锇或钌络合物。在一个实施方案中，所述至少一种电活性分子为吩噁嗪类或其盐，并且所述至少一种配位络合物为钌络合物。
在一些实施方案中，所述试剂层包含氧化还原酶、辅酶和介体制剂，其中所述氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶(GDH)，并且所述辅酶选自黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD+)和/或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。所述介体制剂包含至少一种电活性分子和至少一种配位络合物。所述至少一种电活性分子可以为吩噁嗪类或其盐，并且所述至少一种配位络合物可以为钌络合物。在一个实施方案中，钌络合物为六氨合钌。
在另一个实施方案中，所述试剂层包含氧化还原酶、辅酶和介体制剂，其中所述氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶(GDH)，并且所述辅酶选自黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD+)和/或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。所述介体制剂包含至少一种电活性分子和至少一种配位络合物。所述至少一种电活性分子可以为吩噁嗪类或其盐，并且所述至少一种配位络合物可以为钌络合物。在一个实施方案中，所述至少一种电活性分子为刃天青或其盐。在一个实施方案中，所述至少一种电活性分子为试卤灵或其盐。
在另一个实施方案中，所述试剂层包含氧化还原酶、辅酶和介体制剂，其中所述氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶(GDH)，并且所述辅酶选自黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD+)和/或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。所述介体制剂包含至少一种电活性分子和至少一种配位络合物。所述至少一种电活性分子可以独立地选自刃天青或其盐或试卤灵或其盐，并且所述至少一种配位络合物可以素钌络合物。在一个实施方案中，所述至少一种配位络合物为六氨合钌。
考虑本申请中公开的本公开的说明书和实施，本公开的其他实施方案对本领域技术人员而言将是显而易见的。意图本说明书和实施例仅被认为是举例说明，如下权利要求表示本公开的真实范围和精神。

Claims (20)

1.用于检测分析物的试剂，其包含：
包含葡萄糖氧化还原酶的酶；
选自刃天青、刃天青盐、试卤灵或试卤灵盐的至少一种电活性分子；以及
至少一种金属配位络合物。
2.根据权利要求1所述的试剂，其中所述葡萄糖氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶。
3.根据权利要求1所述的试剂，其中所述至少一种金属配位络合物包含钌络合物或锇络合物。
4.根据权利要求1所述的试剂，其还包含辅酶，该辅酶包含黄素腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
5.根据权利要求1-5任一项所述的试剂，其中所述至少一种电活性分子以0.01mM至约20mM的浓度提供。
6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂，其中所述至少一种电活性分子包含以1mM至约3mM的浓度提供的刃天青或刃天青盐。
7.根据权利要求1-5任一项所述的试剂，其中所述至少一种电活性分子包含以1mM至约4mM的浓度提供的试卤灵或试卤灵盐。
8.用于检测分析物的测试条，其包含：
基底，该基底具有近侧区域和远侧区域；
在所述基底上形成的导电图形，该导电图形包括在所述基底的所述近侧区域处置在所述基底上的至少一个电极、在所述基底的所述远侧区域在导电区域处置在所述基底上的电气条状触点、以及将所述至少一个电极电连接到所述电气条状触点中的至少一些的导电迹线；以及
试剂层，该试剂层接触至少一个电极的至少一部分，所述试剂层包含：
葡萄糖氧化还原酶；
介体制剂，其包含独立地选自刃天青、刃天青盐、试卤灵或试卤灵盐的至少一种电活性分子；以及
至少一种金属配位络合物。
9.根据权利要求8所述的测试条，其中所述葡萄糖氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶。
10.根据权利要求8所述的测试条，其中所述至少一种配位络合物包含钌络合物或锇络合物。
11.根据权利要求8所述的测试条，其还包含辅酶，该辅酶包含黄素腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
12.根据权利要求8-11任一项所述的测试条，其中所述至少一种电活性分子以0.01mM至约20mM的浓度提供。
13.根据权利要求8-11任一项所述的测试条，其中所述至少一种电活性分子包含以1mM至约3mM的浓度提供的刃天青或刃天青盐。
14.根据权利要求8-11任一项所述的测试条，其中所述至少一种电活性分子包含以1mM至约4mM的浓度提供的试卤灵或试卤灵盐。
15.用于测定体液成分的系统，其包含：
用于检测分析物的测试条，其包含：
基底，该基底具有近侧区域和远侧区域；
在所述基底上形成的导电图形，该导电图形包括在所述基底的所述近侧区域处置在所述基底上的至少一个电极、在所述基底的所述远侧区域在导电区域处置在所述基底上的电气条状触点、以及将所述至少一个电极电连接到所述电气条状触点中的至少一些的导电迹线；以及
试剂层，该试剂层接触至少一个电极的至少一部分，所述试剂层包含：
葡萄糖氧化还原酶；
介体制剂，其包含独立地选自刃天青、刃天青盐、试卤灵或试卤灵盐的至少一种电活性分子；以及
至少一种金属配位络合物；以及
诊断计量器，其被配置以接收所述测试条并且电连接到所述电气条状触点。
16.根据权利要求15所述的系统，其中所述葡萄糖氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶。
17.根据权利要求15所述的系统，其中所述至少一种配位络合物包含钌络合物或锇络合物。
18.根据权利要求15-17任一项所述的系统，其中所述至少一种电活性分子以0.01mM至约20mM的浓度提供。
19.根据权利要求15-17任一项所述的系统，其中所述至少一种电活性分子包含以1mM至约3mM的浓度提供的刃天青或刃天青盐。
20.根据权利要求15-17任一项所述的系统，其中所述至少一种电活性分子包含以1mM至约4mM的浓度提供的试卤灵或试卤灵盐。
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