CN116568819A - 皂苷的修饰 - Google Patents

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Abstract

用于皂苷的酶促修饰的方法、由此制备的产品、所述产品的用途以及其他相关方面。所述皂苷可以是皂皮树属(Quillaja)物种的提取物，如皂树(Quillaja saponariaMolina)的提取物。

Description

皂苷的修饰
技术领域
本申请总体上涉及皂苷，尤其是用于皂苷的酶促修饰的方法、由此制备的产品、所述产品的用途以及其他相关方面。本申请进一步涉及葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶，尤其是突变的葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶，其可用于皂苷的酶促修饰的方法中。皂苷可获自皂皮树属(Quillaja)物种，包括可获自皂皮树属物种的提取物，例如皂树(Quillaja saponariaMolina)的提取物。
背景技术
皂苷是类固醇或萜类糖苷。它们具有广泛的用途，从灭火器泡沫到食品添加剂和免疫增强剂(Reichert,2019)。
皂皮树属提取物(E 999)目前已根据欧盟法规1129/2011获得欧洲食品安全局的批准，作为调味饮料(14.1.4)、苹果酒和梨酒(14.2.3)中的食品添加剂。皂皮树属提取物(E999)被描述为通过皂树或其他皂皮树属物种的磨碎内树皮或木材的水提法获得。它也被描述为含有许多由皂皮酸的苷组成的三萜皂苷。认为还含有糖——包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖和鼠李糖—以及单宁、草酸钙和其他微量组分。(EFSA Journal 2019 17(3):5622)
几十年来，皂苷作为免疫刺激剂一直受到关注(参见，例如，Hyslop,1969)。Quil A是一种皂苷级分，来源于皂树树皮的水提物(Dalsgaard,1974)。Quil A本身含有多种组分，其中四种最主要的Quil A级分通过反相色谱纯化，即QS-7、QS-17、QS-18和QS-21，尽管溶血活性和毒性各不相同，但均具有免疫刺激活性(Kensil,1991；Kensil,1995)。主要的皂苷级分QS-18被发现对小鼠具有高毒性，但皂苷级分QS-7和QS-21的毒性要小得多。QS-21比QS-7更丰富，是研究最广泛的皂苷佐剂(Ragupathi,2011)。
皂树树皮水/甲醇提取物的液相色谱/质谱分析揭示了100多种皂苷，其中许多已指定结构(Nyberg,2000；Nyberg,2003；Kite,2004)。
已经描述了柳叶皂皮树(A St.-Hil&Tul)Mart.提取物，其中各种组分的特性通过质谱法确定。柳叶皂皮树(Quillaja brasiliensis)提取物中的许多皂苷组分对应于皂树提取物中发现的皂苷(WWallace,2017；Wallace,2019)并且还显示柳叶皂皮树提取物具有免疫刺激作用(Cibulski,2018；Yendo,2017)。
佐剂系统01(AS01)是基于脂质体的佐剂，其包含两种免疫刺激剂，3-O-脱酰基-4’-单磷酰基脂质A(3D-MPL)和QS-21(Garcon,2011；Didierlaurent,2017)。3D-MPL是明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)脂多糖的无毒衍生物。AS01包含在疟疾疫苗(RTS，S-MosquirixTM)和带状疱疹疫苗(HZ/su-ShingrixTM)以及多种候选疫苗中。AS01注射导致动物模型中先天免疫的快速和瞬时激活。中性粒细胞和单核细胞在免疫后迅速募集到引流淋巴结(dLN)。此外，AS01诱导MHCII高树突状细胞(DC)的募集和激活，这是T细胞激活所必需的(Didierlaurent,2014)。对于AS01组分的作用机制也有一些数据可用。3D-MPL通过TLR4发出信号，刺激NF-KB转录活性和细胞因子的产生，并直接激活人类和小鼠的抗原呈递细胞(APC)(De Becker,2000；Ismaili,2002；Martin,2003；Mata-Haro,2007)。QS-21在小鼠中促进高抗原特异性抗体反应和CD8+ T细胞反应(Kensil,1998；Newman,1992；Soltysik,1995)和人类的抗原特异性抗体反应(Livingston,1994)。由于其物理特性，人们认为QS-21可能在体内充当危险信号(Lambrecht,2009；Li,2008)。尽管QS-21已被证明可以激活ASC-NLRP3炎症小体和随后的IL-1β/IL-18释放(Marty-Roix,2016)，参与皂苷的佐剂作用的确切分子途径尚待明确。
皂树的提取物是市售的，包括具有不同纯度的级分，例如Quil A、级分A、级分B、级分C、QS-7、QS-17、QS-18和QS-21。
在开发质量控制方法以提供降解的参考样品的过程中，已经描述了通过Revelation Aroma对Quil-A的酶促水解(Lecas,2021)。
皂苷的可获得性受到限制，尤其是那些从稀有植物中获得的皂苷或其中感兴趣的皂苷以相对低的量存在的情况下。此外，将某些皂苷与其他组分(尤其是可能具有相似结构的其他皂苷组分)分离可能很麻烦。因此，仍然需要可以提高感兴趣的皂苷的产量和/或促进去除不需要的皂苷组分的新方法。
海洋贫养杆菌(Modestobacter marinus)葡萄糖苷酶(Uniparc参考号UPI000260A2FA，Uniprot参考号I4EYD5)是一种天然存在的葡萄糖苷酶。仍然需要具有改进性质的进一步的葡萄糖苷酶。
黄色克雷伯氏菌(Kribbella flavida)鼠李糖苷酶(Uniparc参考号UPI00019BDB13，Uniprot参考号D2PMT)是一种天然存在的鼠李糖苷酶。仍然需要具有改进性质的进一步的鼠李糖苷酶。
发明内容
本发明提供了一种制备产物皂苷的方法，所述方法包括将起始皂苷酶促转化为产物皂苷的步骤。合适地，该方法使用本发明的多肽，例如工程化的葡萄糖苷酶多肽或工程化的鼠李糖苷酶多肽。
还提供了增加组合物中产物皂苷量的方法，所述方法包括将起始皂苷酶促转化为产物皂苷的步骤。合适地，该方法使用本发明的多肽，例如工程化的葡萄糖苷酶多肽或工程化的鼠李糖苷酶多肽。
还提供了减少组合物中起始皂苷量的方法，所述方法包括将起始皂苷酶促转化为产物皂苷的步骤。合适地，该方法使用本发明的多肽，例如工程化的葡萄糖苷酶多肽或工程化的鼠李糖苷酶多肽。
本发明还提供了糖苷酶用于将起始皂苷酶促转化为产物皂苷的用途。合适地，糖苷酶是本发明的多肽，例如工程化的葡萄糖苷酶多肽或工程化的鼠李糖苷酶多肽。
另外提供了一种用于鉴定具有β外切葡萄糖苷酶活性的候选酶的方法，包括选择包含例如由以下组成的酶：(i)根据SEQ ID No.262、208、63、229、250、5、101、207、169、247、302、324、319、9、240、325、338、850、879、868、826、804、888、881、891、816、827、857、853、842、814、886、885、838、829、808、828、870、873、844、882、874、825、824、823、810、894、849、803、890、841、832、830、845、871、837、883或809的氨基酸序列，或其功能变体；或(ii)根据SEQ ID No.262、208、63、229、250、5、101、207、169、247、302、324、319、9、240、325、338、850、879、868、826、804、888、881、891、816、827、857、853、842、814、886、885、838、829、808、828、870、873、844、882、874、825、824、823、810、894、849、803、890、841、832、830、845、871、837、883或809的氨基酸序列，或其功能变体。
还提供了一种用于鉴定具有α外切鼠李糖苷酶活性的候选酶的方法，所述方法包括选择包含以下，例如由以下组成的酶：根据SEQ ID No.992、1003、1052、1073、1017、1055、1075、1001、1007、1061、1079、1027、1039、1041、989、1053、1018、1066、1082、1076、993、1077、1046、1015、1063、1054、1074、1067或1033的氨基酸序列，或其功能变体。
还提供了工程化的葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶多肽，如下文进一步详述的(称为本发明的多肽)。
本发明提供了工程化的葡萄糖苷酶多肽，其包含以下，例如由以下组成：与SEQ IDNo.262的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或其功能片段，其中所述工程化的葡萄糖苷酶多肽包含至少一个来自以下的残基取代：
F44Y；
V60L；
G117A；
F170N；
V263G或V263L；
N351H或N351Q；
A355H、A355I、A355L、A355M、A355R、A355T或A355W；
A356P；
R357A、R357C、R357K、R357M或R357Q；
G362C；
T365A、T365N或T365S；
L367C；
V394R；
V395Y；
Q396E、Q396G、Q396N、Q396P、Q396R、Q396S或Q396Y；
F430W；
R435F；
V438T；
V440F；
F442M或F442Q；
G444T；
A473F或A473R；
L474C、L474I或L474V；
I475F；
L492C、L492G、L492H、L492I、L492N、L492Q、L492V、L492W或L492Y；
Q493F或Q493H；
P494H或P494I；
S495I、S495K或S495Q；
G496P或G496W；
D498A、D498E、D498F、D498I、D498K、D498L、D498N、D498P、D498R、D498S、D498T或D498V；
A502R；
M504G或M504R；
L507A或L507R；
T508M；
L529M；
F535P；
A536D或A536E；
A537R；
F541A、F541I、F541L、F541M或F541V；
L542I；
Q543G或Q543L；
E547L；和
Y585W。
本发明提供了工程化的鼠李糖苷酶多肽，其包含以下，例如由以下组成：与SEQ IDNo.1017的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或其功能片段，其中所述工程化的鼠李糖苷酶多肽包含至少一个来自以下的残基取代：
(i)A56C
(ii)A143P
(iii)Q181H、Q181R或Q181S
(iv)L214M
(v)G215S
(vi)F216M
(vii)G218D或G218N
(viii)K219G
(ix)A238M
(x)T252Y
(xi)T311W
(xii)V326C
(xiii)G357C
(xiv)S369C、S369I、S369K或S369M
(xv)I487M、I487Q或I487V
(xvi)K492N
(xvii)V499T
(xviii)G508S
(xix)R543C
(xx)L557Y
(xxi)G634A
(xxii)S635N
(xxiii)A690C和
(xxiv)Q921H。
本发明还提供了通过本文方法制备的皂苷、包含通过本文方法制备的产物皂苷的含有皂苷的组合物、包含所述皂苷或含有皂苷的组合物的佐剂组合物，以及使用所述皂苷或含有皂苷的组合物制备的佐剂组合物。还提供了本发明的皂苷或含有皂苷的组合物在制备佐剂组合物中的用途。
还提供了免疫原性组合物，其包含根据本发明的皂苷或含有皂苷的组合物和抗原或编码抗原的多核苷酸。还提供了包含(i)根据本发明的皂苷或含有皂苷的组合物和(ii)抗原或编码抗原的多核苷酸的试剂盒。
附图说明
图1皂树树皮粗水提物的HPLC色谱图
图2皂树树皮粗水提物的HPLC-UV色谱图
图3皂树树皮粗水提物的UPLC-UV色谱图
图4具有低含量2018组分的聚苯乙烯纯化的皂树QS-21皂苷提取物的UPLC-UV色谱图
图5具有低含量2018组分的皂树QS-21纯化皂苷提取物的UPLC-UV/MS色谱图
图6具有低含量2018组分的皂树QS-21纯化皂苷提取物的UPLC-UV/MS色谱图细节
图7A-7B具有低含量2018组分的皂树QS-21纯化皂苷提取物的1988(图7A)和2002(图7B)分子量离子的提取的质谱图
图8具有低含量2018组分的皂树QS-21纯化皂苷提取物的组合质心谱
图9具有低2018组分的皂树QS-21纯化皂苷提取物的UPLC-UV色谱图图10实施例4-2中QS-21标准中QS-18 2150(图A)和QS-21 1988(图B)组分含量的LCMS/MS色谱图
图11在实施例4-2中进行阴性对照处理后，QS-18 2150(图A)和QS-211988(图B)组分含量的LCMS/MS色谱图
图12实施例4-2中葡萄糖苷酶SEQ ID No.262处理后QS-18 2150(图A)和QS-211988(图B)组分含量的LCMS/MS色谱图
图13实施例4-4中粗树皮提取物(CBE)经葡萄糖苷酶SEQ ID No.262处理(上迹线)和阴性对照处理(下迹线)后的UV HPLC色谱图
图14在实施例6-1中进行阴性对照处理后，QS-17 2296(图A)和QS-182150(图B)组分含量的LCMS/MS色谱图
图15在实施例6-1中进行阴性对照处理后，去葡糖基-QS-17 2134(图A)和QS-211988(图B)组分含量的LCMS/MS色谱图
图16在实施例6-1中进行阴性对照处理后，QS-17 2310(图A)和QS-182164(图B)组分含量的LCMS/MS色谱图
图17实施例6-1中鼠李糖苷酶SEQ ID No.1017处理后QS-17 2296(图A)和QS-182150(图B)组分含量的LCMS/MS色谱图
图18实施例6-1中鼠李糖苷酶SEQ ID No.1017处理后去葡糖基-QS-172134(图A)和QS-211988(图B)组分含量的LCMS/MS色谱图
图19实施例6-1中鼠李糖苷酶SEQ ID No.1017处理后QS-172310(图A)和QS-182164(图B)组分含量的LCMS/MS色谱图
图20实施例6-2中经处理树皮提取物(TBE)经鼠李糖苷酶SEQ ID No.1017处理(上迹线)和阴性对照处理(下迹线)后的UV HPLC色谱图
图21实施例6-3中CBE经鼠李糖苷酶SEQ ID No.1017处理(上迹线)和阴性对照处理(下迹线)后的UV HPLC色谱图
图22实施例7中CBE经双酶处理后T0时(图A)和24小时时(图B)QS-211988组分含量的LCMS/MS色谱图
图23A-B实施例8中CBE的葡萄糖苷酶处理(图23a)和CBE的阴性对照处理(图23b)后的说明性UV HPLC色谱图
图24实施例9中CBE的鼠李糖苷酶处理(上迹线)和CBE的阴性对照处理(下迹线)后的说明性UV HPLC色谱图
图25来自实施例11的未处理和酶处理的CBE的1L规模的HPLC-UV色谱图
图26来自实施例11的未处理和酶处理的CBE在1L规模纯化后的UPLC-UV色谱图(完全采集)
图27来自实施例11的未处理的和酶处理的CBE在1L规模纯化后的UPLC-UV色谱图(缩放)
序列标识符的简要说明
Seq ID No.1：以下的氨基酸序列：费比恩塞伯林德纳氏酵母(Cyberlindnerafabianii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00049B1A8C，Uniprot参考号A0A061B3J2。
Seq ID No.2：以下的氨基酸序列：线状黄杆菌(Flavobacterium gilvum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0004E3EF7B，Uniprot参考号A0A085EII0。
Seq ID No.3：以下的氨基酸序列：力克阿尔吉杆菌(Algibacter lectus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00050EE490，Uniprot参考号A0A090X649。
Seq ID No.4：以下的氨基酸序列：Microbacterium azadirachtae葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0005ECB51E，Uniprot参考号A0A0F0LB94。
Seq ID No.5：以下的氨基酸序列：放线菌属细菌(Actinobacteria bacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006588DAD，Uniprot参考号A0A0J0UT37。
Seq ID No.6：以下的氨基酸序列：绿弯菌门细菌(Chloroflexi bacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0007968552，Uniprot参考号A0A136KWB3。
Seq ID No.7：以下的氨基酸序列：驹形杆菌(Komagataeibacter rhaeticus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002080410，Uniprot参考号A0A181C809。
Seq ID No.8：以下的氨基酸序列：拟杆菌属物种(Bacteroides sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0008211BFC，Uniprot参考号A0A1C5WEL8。
Seq ID No.9：以下的氨基酸序列：红紫红色链霉菌(Streptomycesrubrolavendulae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00085A2BD0，Uniprot参考号A0A1D8FZW3。
Seq ID No.10：以下的氨基酸序列：玫瑰色梭菌(Streptomycesrubrolavendulae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00098C60F6，Uniprot参考号A0A1S8KYM5。
Seq ID No.11：以下的氨基酸序列：未培养的细菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009CE0D4C，Uniprot参考号A0A1V5M6V6。
Seq ID No.12：以下的氨基酸序列：厚壁菌门细菌(Firmicutes bacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009D4127D，Uniprot参考号A0A1V6AN95。
Seq ID No.13：以下的氨基酸序列：絮状炭疽病菌(Anthracocystis flocculosa)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00045601AB，Uniprot参考号A0A061H1Z3。
Seq ID No.14：以下的氨基酸序列：布姆双歧杆菌(Bifidobacterium boum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0004FF77C7，Uniprot参考号A0A086ZKU2。
Seq ID No.15：以下的氨基酸序列：Jejuia pallidilutea葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00051EDBDE，Uniprot参考号A0A098LTR2。
Seq ID No.16：以下的氨基酸序列：流苏角囊藻(Ceratocystis fimbriata)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00062105AB，Uniprot参考号A0A0F8B2B0。
Seq ID No.17：以下的氨基酸序列：放线菌属细菌(Actinobacteria bacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006583AB1，Uniprot参考号A0A0J0UVW7。
Seq ID No.18：以下的氨基酸序列：红球菌属物种(Rhodococcus sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0007AABFAD，Uniprot参考号A0A143QAX3。
Seq ID No.19：以下的氨基酸序列：Valsa mali葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0007F2D02D，Uniprot参考号A0A194VF47。
Seq ID No.20：以下的氨基酸序列：未培养的拟杆菌属物种葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000821004D，Uniprot参考号A0A1C5WSI4。
Seq ID No.21：以下的氨基酸序列：塔伊艾森伯格菌(Eisenbergiella tayi)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00084089B2，Uniprot参考号A0A1E3ALT2。
Seq ID No.22：以下的氨基酸序列：链霉菌属物种(Streptomyces sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000978E914，Uniprot参考号A0A1V2MYI4。
Seq ID No.23：以下的氨基酸序列：厚壁菌门细菌(Firmicutes bacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009CBF21C，Uniprot参考号A0A1V5MH90。
Seq ID No.24：以下的氨基酸序列：软壁菌门细菌(Tenericutes bacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009D5B1F0，Uniprot参考号A0A1V6BAK3。
Seq ID No.25：以下的氨基酸序列：氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0004A87350，Uniprot参考号A0A067Z479。
Seq ID No.26：以下的氨基酸序列：链状双歧杆菌(Bifidobacteriumcatenulatum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00050787A2，Uniprot参考号A0A087B8Q8。
Seq ID No.27：以下的氨基酸序列：淡色生赤壳菌(Bionectria ochroleuca)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0005965863，Uniprot参考号A0A0B7K538。
Seq ID No.28：以下的氨基酸序列：拟立方藻属物种(Parcubacteria sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006377CA4，Uniprot参考号A0A0G0GD78。
Seq ID No.29：以下的氨基酸序列：酮酶还原微杆菌(Microbacteriumketosireducens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006228575，Uniprot参考号A0A0M2H276。
Seq ID No.30：以下的氨基酸序列：粪罗氏菌(Roseburia faecis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006C454B4，Uniprot参考号A0A173R3W4。
Seq ID No.31：以下的氨基酸序列：枯萎病菌(Kwoniella dejecticola)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0007F1D695，Uniprot参考号A0A1A6A050。
Seq ID No.32：以下的氨基酸序列：未培养的梭菌属物种葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0008232A70，Uniprot参考号A0A1C6C862。
Seq ID No.33：以下的氨基酸序列：Cyberlindnera jadinii葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000866CB30，Uniprot参考号A0A1E4S2F8。
Seq ID No.34：以下的氨基酸序列：拟杆菌门细菌(Bacteroidetes bacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009D3483D，Uniprot参考号A0A1V5G4W6。
Seq ID No.35：以下的氨基酸序列：疣微菌门细菌(Verrucomicrobia bacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009CC9AEA，Uniprot参考号A0A1V5Q4R4。
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Seq ID No.104：以下的氨基酸序列：杜鹃花镰孢菌(Fusarium euwallaceae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000FFFEFB2，Uniprot参考号A0A430LYA2。
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Seq ID No.106：以下的氨基酸序列：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000E69509，Uniprot参考号A0KLP6。
Seq ID No.107：以下的氨基酸序列：红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000B86CB，Uniprot参考号A4F7P9。
Seq ID No.108：以下的氨基酸序列：黑色链霉菌(Streptomyces sviceus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000180240E，Uniprot参考号B5I181。
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Seq ID No.110：以下的氨基酸序列：重氮营养哈特曼杆菌(Hartmannibacterdiazotrophicus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000C0221F1，Uniprot参考号A0A2C9D6I2。
Seq ID No.111：以下的氨基酸序列：庞氏单胞菌唾液弧菌(Pontimonassalivibrio)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000CEB5AB1，Uniprot参考号A0A2L2BPE2。
Seq ID No.112：以下的氨基酸序列：Cadophora sp.葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D5B9C38，Uniprot参考号A0A2V1CH24。
Seq ID No.113：以下的氨基酸序列：Meira miltonrushii葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D779558，Uniprot参考号A0A316V8S0。
Seq ID No.114：以下的氨基酸序列：苹果褐腐病菌(Monilinia fructigena)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000DC42E3D，Uniprot参考号A0A395IJW4。
Seq ID No.115：以下的氨基酸序列：威尼克外瓶霉(Hortaea werneckii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000F3E476C，Uniprot参考号A0A3M6XGS0。
Seq ID No.116：以下的氨基酸序列：网状链霉菌(Streptomyces netropsis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00101460D7，Uniprot参考号A0A445N7U0。
Seq ID No.117：以下的氨基酸序列：出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI001139C6A8，Uniprot参考号A0A4S9IFI0。
Seq ID No.118：以下的氨基酸序列：棒状曲霉(Aspergillus clavatus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000EA5CFF，Uniprot参考号A1CTN9。
Seq ID No.119：以下的氨基酸序列：密歇根棒状杆菌(Clavibactermichiganensis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001523037，Uniprot参考号A5CT94。
Seq ID No.120：以下的氨基酸序列：红色青霉(Penicillium rubens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001831CF5，Uniprot参考号B6H7R5。
Seq ID No.121：以下的氨基酸序列：Lachnoclostridium sp.葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000B365547，Uniprot参考号A0A1Y4NTL9。
Seq ID No.122：以下的氨基酸序列：红杆菌科细菌(Rhodobacteraceaebacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000C09BF88，Uniprot参考号A0A2D5IXB9。
Seq ID No.123：以下的氨基酸序列：脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0004B5EEF2，Uniprot参考号A0A2M9UUC4。
Seq ID No.124：以下的氨基酸序列：吲哚生曲霉(Aspergillus indologenus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D7FE1ED，Uniprot参考号A0A2V5IY78。
Seq ID No.125：以下的氨基酸序列：金氏酵母菌(Acaromyces ingoldii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D802B25，Uniprot参考号A0A316YR39。
Seq ID No.126：以下的氨基酸序列：苹果褐腐病菌(Monilinia fructigena)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000DC60823，Uniprot参考号A0A395J1U5。
Seq ID No.127：以下的氨基酸序列：木聚糖酶类芽孢杆菌(Paenibacillusxylanexedens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000F52D773，Uniprot参考号A0A3N6CA02。
Seq ID No.128：以下的氨基酸序列：豪氏放线菌(Actinomyces howellii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000F6DAAAE，Uniprot参考号A0A448HIG0。
Seq ID No.129：以下的氨基酸序列：内石弗里德曼氏菌(Friedmanniomycesendolithicus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00113D19DF，Uniprot参考号A0A4V5N9I4。
Seq ID No.130：以下的氨基酸序列：费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000EA8672，Uniprot参考号A1DNS0。
Seq ID No.131：以下的氨基酸序列：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000D7314B，Uniprot参考号A6V4K6。
Seq ID No.132：以下的氨基酸序列：柄篮状菌(Talaromyces stipitatus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00018E7266，Uniprot参考号B8MF24。
Seq ID No.133：以下的氨基酸序列：Aquimixticola soesokkakensis葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000A1A5FD7，Uniprot参考号A0A1Y5RVF8。
Seq ID No.134：以下的氨基酸序列：红杆菌目细菌(Rhodobacteralesbacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000C98D37C，Uniprot参考号A0A2D9YGV1。
Seq ID No.135：以下的氨基酸序列：Methylorubrum extorquens葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006F9793E，Uniprot参考号A0A2N9AS40。
Seq ID No.136：以下的氨基酸序列：产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000CF7C8，Uniprot参考号A0A2X2YBP0。
Seq ID No.137：以下的氨基酸序列：胆原体目细菌(Acholeplasmatalesbacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0008AEBEA3，Uniprot参考号A0A348NID6。
Seq ID No.138：以下的氨基酸序列：拟杆菌门细菌(Bacteroidetes bacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000EC3C979，Uniprot参考号A0A3B8VHE8。
Seq ID No.139：以下的氨基酸序列：肉梭菌(Clostridium carnis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000F637E38，Uniprot参考号A0A3P6K8E8。
Seq ID No.140：以下的氨基酸序列：黄色分枝杆菌(Mycolicibacteriumflavescens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000B93B5C9，Uniprot参考号A0A448HNB5。
Seq ID No.141：以下的氨基酸序列：解没食子酸链球菌(Streptococcusgallolyticus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000F6EFA71，Uniprot参考号A0A4V6LJ94。
Seq ID No.142：以下的氨基酸序列：小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000EB54CC，Uniprot参考号A1JNB7。
Seq ID No.143：以下的氨基酸序列：厌氧粘细菌属物种(Anaeromyxobacter sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000ED8A80，Uniprot参考号A7HFG4。
Seq ID No.144：以下的氨基酸序列：柄篮状菌(Talaromyces stipitatus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00018E7D70，Uniprot参考号B8MK55。
Seq ID No.145：以下的氨基酸序列：威尼克外瓶霉(Hortaea werneckii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000A2E3FAA，Uniprot参考号A0A1Z5SL14。
Seq ID No.146：以下的氨基酸序列：米卡弧菌属物种(Micavibrio sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000C529025，Uniprot参考号A0A2E2Q8X2。
Seq ID No.147：以下的氨基酸序列：Acidobacteriia细菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000CE6B996，Uniprot参考号A0A2N9MBS0。
Seq ID No.148：以下的氨基酸序列：杰基棒状杆菌(Corynebacterium jeikeium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000DA3A972，Uniprot参考号A0A2X4T570。
Seq ID No.149：以下的氨基酸序列：梭菌科细菌(Clostridiaceae bacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000E8D37A1，Uniprot参考号A0A353PZH8。
Seq ID No.150：以下的氨基酸序列：厌氧绳菌科细菌(Anaerolineaceaebacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000748C096，Uniprot参考号A0A3B9PA35。
Seq ID No.151：以下的氨基酸序列：Gymnopilus dilepis葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000FF41956，Uniprot参考号A0A409WSY0。
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Seq ID No.153：以下的氨基酸序列：Teredinibacter sp.葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0011696FAB，Uniprot参考号A0A509DWZ3。
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Seq ID No.155：以下的氨基酸序列：双色蜡蘑(Laccaria bicolor)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000164423D，Uniprot参考号B0D734。
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Seq ID No.158：以下的氨基酸序列：高卢蜜环菌(Armillaria gallica)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000BC209C3，Uniprot参考号A0A2H3E300。
Seq ID No.159：以下的氨基酸序列：小单孢菌属物种(Micromonospora sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D2EAE87，Uniprot参考号A0A2P8AV03。
Seq ID No.160：以下的氨基酸序列：产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000DA286EE，Uniprot参考号A0A2X5CJC5。
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Seq ID No.236：以下的氨基酸序列：肠共栖杆菌(Commensalibacter intestini)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000230E3BF，Uniprot参考号G6F370。
Seq ID No.237：以下的氨基酸序列：类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00024F07AC，Uniprot参考号H6CIT2。
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Seq ID No.239：以下的氨基酸序列：新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000392C3ED，Uniprot参考号J9VVK7。
Seq ID No.240：以下的氨基酸序列：嗜酸丙酸杆菌(Acidipropionibacteriumacidipropionici)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002988588，Uniprot参考号K7S596。
Seq ID No.241：以下的氨基酸序列：普雷沃菌属物种(Prevotella sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001B93465，Uniprot参考号C9PT75。
Seq ID No.242：以下的氨基酸序列：荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001D08095，Uniprot参考号D5ALU0。
Seq ID No.243：以下的氨基酸序列：橙色豆状金属菌(Stigmatella aurantiaca)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001E74370，Uniprot参考号E3FJ05。
Seq ID No.244：以下的氨基酸序列：Sphaerochaeta globosa葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002010060，Uniprot参考号F0RVK3。
Seq ID No.245：以下的氨基酸序列：球形球毛菌(Sphaerochaeta coccoides)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000207D78C，Uniprot参考号F4GH96。
Seq ID No.246：以下的氨基酸序列：新鞘脂菌属物种(Novosphingobium sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00020EFBCB，Uniprot参考号F6ICQ5。
Seq ID No.247：以下的氨基酸序列：少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000225331F，Uniprot参考号G1XH86。
Seq ID No.248：以下的氨基酸序列：乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000C6907，Uniprot参考号G6FFS4。
Seq ID No.249：以下的氨基酸序列：Phaeospirillum molischianum葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000255313A，Uniprot参考号H8FXH7。
Seq ID No.250：以下的氨基酸序列：海洋贫养杆菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002609C68，Uniprot参考号I4EW72。
Seq ID No.251：以下的氨基酸序列：西班牙糖丝菌(Saccharothrixespanaensis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00028AC337，Uniprot参考号K0K125。
Seq ID No.252：以下的氨基酸序列：阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00029BA293，Uniprot参考号K8DAK0。
Seq ID No.253：以下的氨基酸序列：苜蓿轮枝菌(Verticillium alfalfae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001BBDF1E，Uniprot参考号C9SVX1。
Seq ID No.254：以下的氨基酸序列：木聚糖拟杆菌(Bacteroidesxylanisolvens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001CCFD36，Uniprot参考号D6CY10。
Seq ID No.255：以下的氨基酸序列：比索菲拉铅贝特拉菌(Leadbetterellabyssophila)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001EBD98A，Uniprot参考号E4RUR0。
Seq ID No.256：以下的氨基酸序列：Sphaerochaeta globosa葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00020102A5，Uniprot参考号F0RYB6。
Seq ID No.257：以下的氨基酸序列：球形球毛菌(Sphaerochaeta coccoides)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000207D6A0，Uniprot参考号F4GLH6。
Seq ID No.258：以下的氨基酸序列：Haloplasma contractile葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000212252C，Uniprot参考号F7Q0Y2。
Seq ID No.259：以下的氨基酸序列：亚马逊硝化螺旋菌(Nitrospirillumamazonense)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002265447，Uniprot参考号G1Y4C7。
Seq ID No.260：以下的氨基酸序列：巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00023420B8，Uniprot参考号G8AWD9。
Seq ID No.261：以下的氨基酸序列：Phaeospirillum molischianum葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000255314F，Uniprot参考号H8FXJ8。
Seq ID No.262：以下的氨基酸序列：海洋贫养杆菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000260A2FA，Uniprot参考号I4EYD5。
Seq ID No.263：以下的氨基酸序列：Wickerhamomyces ciferrii(Wickerhamomyces ciferrii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000283EB8D，Uniprot参考号K0KVJ2。
Seq ID No.264：以下的氨基酸序列：粘球藻属物种(Gloeocapsa sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002A5D085，Uniprot参考号K9XKL8。
Seq ID No.265：以下的氨基酸序列：嗜热球形杆菌(Sphaerobacterthermophilus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001A3BCB6，Uniprot参考号D1C7U8。
Seq ID No.266：以下的氨基酸序列：木聚糖拟杆菌(Bacteroidesxylanisolvens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001CCEF1F，Uniprot参考号D6D4V2。
Seq ID No.267：以下的氨基酸序列：布氏普雷沃菌(Prevotella buccae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001F149E8，Uniprot参考号E6K4W5。
Seq ID No.268：以下的氨基酸序列：Grosmannia clavigera葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001FF1101，Uniprot参考号F0XBR0。
Seq ID No.269：以下的氨基酸序列：松杨栅锈菌(Melampsora larici-populina)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00020F9774，Uniprot参考号F4R4W2。
Seq ID No.270：以下的氨基酸序列：多糖普雷沃菌(Prevotellamultisaccharivorax)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002138E9C，Uniprot参考号F8N7G1。
Seq ID No.271：以下的氨基酸序列：耐锌链霉菌(Streptomyceszinciresistens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002255A63，Uniprot参考号G2G8K4。
Seq ID No.272：以下的氨基酸序列：Granulicella mallensis葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001D9FC40，Uniprot参考号G8NY42。
Seq ID No.273：以下的氨基酸序列：玉米赤霉菌(Gibberella zeae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00021F1FEE，Uniprot参考号I1RH94。
Seq ID No.274：以下的氨基酸序列：海洋贫养杆菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00026090A2，Uniprot参考号I4EYK6。
Seq ID No.275：以下的氨基酸序列：马蹄乳杆菌(Lactobacillus equicursoris)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002869F55，Uniprot参考号K0NRS8。
Seq ID No.276：以下的氨基酸序列：苹果炭疽菌(Colletotrichum fructicola)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002A93280，Uniprot参考号L2F9W0。
Seq ID No.277：以下的氨基酸序列：玫瑰色链孢囊菌(Streptosporangiumroseum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001BF8AF6，Uniprot参考号D2B261。
Seq ID No.278：以下的氨基酸序列：灰色李斯特菌(Listeria grayi)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019F252A，Uniprot参考号D7UX19。
Seq ID No.279：以下的氨基酸序列：意大利肠球菌(Enterococcus italicus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001F11EFF，Uniprot参考号E6LF07。
Seq ID No.280：以下的氨基酸序列：Fluviicola taffensis葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000203D9EA，Uniprot参考号F2IIT6。
Seq ID No.281：以下的氨基酸序列：福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00020CA641，Uniprot参考号F5N4W9。
Seq ID No.282：以下的氨基酸序列：放线菌属物种(Actinomyces sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002189080，Uniprot参考号F9EFW5。
Seq ID No.283：以下的氨基酸序列：大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00022EBE5A，Uniprot参考号G2X5V6。
Seq ID No.284：以下的氨基酸序列：游动放线菌属物种(Actinoplanes sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00023ED5A8，Uniprot参考号G8S0M0。
Seq ID No.285：以下的氨基酸序列：玉米赤霉菌(Gibberella zeae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000023EA29，Uniprot参考号I1S320。
Seq ID No.286：以下的氨基酸序列：Auricularia subglabra葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00027CE685，Uniprot参考号J0WV06。
Seq ID No.287：以下的氨基酸序列：印度硝化还原菌(Nitratireductorindicus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00028E86D6，Uniprot参考号K2N268。
Seq ID No.288：以下的氨基酸序列：粪热球菌(Thermoclostridiumstercorarium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002AD999E，Uniprot参考号L7VH66。
Seq ID No.289：以下的氨基酸序列：土芽孢杆菌属物种(Geobacillus sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002AF2DE3，Uniprot参考号L8A1S2。
Seq ID No.290：以下的氨基酸序列：未培养的细菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000327C3CC，Uniprot参考号M9ZC55。
Seq ID No.291：以下的氨基酸序列：模糊伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaambifaria)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000059ACE1，Uniprot参考号Q0BAK2。
Seq ID No.292：以下的氨基酸序列：米曲霉(Aspergillus oryzae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000676B8D，Uniprot参考号Q2UIR4。
Seq ID No.293：以下的氨基酸序列：假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00004269B5，Uniprot参考号Q66DJ0。
Seq ID No.294：以下的氨基酸序列：Wallemia ichthyophaga葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000331CC98，Uniprot参考号R9AF64。
Seq ID No.295：以下的氨基酸序列：洛佐延氏格拉氏菌(Glarea lozoyensis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003522404，Uniprot参考号S3DIM6。
Seq ID No.296：以下的氨基酸序列：罗里褐腐病菌(Moniliophthora roreri)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003BF753A，Uniprot参考号V2YU31。
Seq ID No.297：以下的氨基酸序列：解淀粉周氏酵母(Zhouia amylolytica)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003DBCB4F，Uniprot参考号W2ULL3。
Seq ID No.298：以下的氨基酸序列：尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003F362FF，Uniprot参考号W9NQQ3。
Seq ID No.299：以下的氨基酸序列：约翰逊黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00006EA168，Uniprot参考号A5FAA5。
Seq ID No.300：以下的氨基酸序列：水稻(Oryza sativa)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00002394F5，Uniprot参考号Q75I93。
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Seq ID No.368：以下的氨基酸序列：肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003DB6EFD，Uniprot参考号W1BBP5。
Seq ID No.369：以下的氨基酸序列：Enterobacter sp。葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003ED0A8E，Uniprot参考号W7P6Y1。
Seq ID No.370：以下的氨基酸序列：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00045BB507，Uniprot参考号X8JI88。
Seq ID No.371：以下的氨基酸序列：智人(Homo sapiens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000072C73，Uniprot参考号Q9H227。
Seq ID No.372：以下的氨基酸序列：未培养的细菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000DD5304，Uniprot参考号Q0GMU3。
Seq ID No.373：以下的氨基酸序列：嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterthermohydrosulfuricus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002CA9E4F，Uniprot参考号M8CQD9。
Seq ID No.374：以下的氨基酸序列：橙色豆状金属菌(Stigmatella aurantiaca)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000E297D8，Uniprot参考号Q091M8。
Seq ID No.375：以下的氨基酸序列：泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderiathailandensis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00006676B1，Uniprot参考号Q2T7C9。
Seq ID No.376：以下的氨基酸序列：假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000426E8F，Uniprot参考号Q665S2。
Seq ID No.377：以下的氨基酸序列：Togninia minima葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00032BF71F，Uniprot参考号R8BQM8。
Seq ID No.378：以下的氨基酸序列：线嘴壳(Ophiostoma piceae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00035213C2，Uniprot参考号S3BVJ8。
Seq ID No.379：以下的氨基酸序列：烧土火丝菌(Pyronema omphalodes)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003B117B7，Uniprot参考号U4LIL3。
Seq ID No.380：以下的氨基酸序列：Ogataea parapolymorpha葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001F76D1F，Uniprot参考号W1QIW0。
Seq ID No.381：以下的氨基酸序列：瑞士膜壳杆菌(Hymenobacter swuensis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003F2059F，Uniprot参考号W8F6U0。
Seq ID No.382：以下的氨基酸序列：约翰逊黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00006E8E1B，Uniprot参考号A5FEF5。
Seq ID No.383：以下的氨基酸序列：多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000012690B，Uniprot参考号P22505。
Seq ID No.384：以下的氨基酸序列：水稻(Oryza sativa)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000009D014，Uniprot参考号Q8L7J2。
Seq ID No.385：以下的氨基酸序列：水稻(Oryza sativa)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000E580F2，Uniprot参考号B8AVF0。
Seq ID No.386：以下的氨基酸序列：微绿球藻(Nannochloris)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000EA7F16F，Uniprot参考号A0A452CSM4。
Seq ID No.387：以下的氨基酸序列：盐嗜丝菌(Halothermothrix orenii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00006AE508，Uniprot参考号B8CYA8。
Seq ID No.388：以下的氨基酸序列：粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000018B2B4，Uniprot参考号Q7RWP2。
Seq ID No.389：以下的氨基酸序列：南极微球菌(Micrococcus antarcticus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000192BB5F，Uniprot参考号B9V8P5。
Seq ID No.390：以下的氨基酸序列：南极微小杆菌(Exiguobacteriumantarcticum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000285E79E，Uniprot参考号K0A8J9。
Seq ID No.391：以下的氨基酸序列：嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000BEB61，Uniprot参考号Q9RA61。
Seq ID No.392：以下的氨基酸序列：哈茨木霉(Trichoderma harzianum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00078BF747，Uniprot参考号A0A2T4AR08。
Seq ID No.393：以下的氨基酸序列：红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000006AA61，Uniprot参考号Q12715。
Seq ID No.394：以下的氨基酸序列：链霉菌属物种(Streptomyces sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000B411B，Uniprot参考号Q59976。
Seq ID No.395：以下的氨基酸序列：酿脓链球菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000C7E56，Uniprot参考号Q99YP9。
Seq ID No.396：以下的氨基酸序列：白车轴草(Trifolium repens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000012691B，Uniprot参考号P26205。
Seq ID No.397：以下的氨基酸序列：埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000006C8FF，Uniprot参考号Q8TGI8。
Seq ID No.398：以下的氨基酸序列：热纤黄孢菌(Hungateiclostridiumthermocellum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000126903，Uniprot参考号P26208。
Seq ID No.399：以下的氨基酸序列：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000219FE3E，Uniprot参考号F9ULH8。
Seq ID No.400：以下的氨基酸序列：根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003F2033A，Uniprot参考号A0A2I4PGZ0。
Seq ID No.401：密码子优化的DNA，其编码6xHis费比恩塞伯林德纳氏酵母(Cyberlindnera fabianii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00049B1A8C，Uniprot参考号A0A061B3J2。
Seq ID No.402：密码子优化的DNA，其编码6xHis线状黄杆菌(Flavobacteriumgilvum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0004E3EF7B，Uniprot参考号A0A085EII0。
Seq ID No.403：密码子优化的DNA，其编码6xHis力克阿尔吉杆菌(Algibacterlectus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00050EE490，Uniprot参考号A0A090X649。
Seq ID No.404：密码子优化的DNA，其编码6xHis Microbacterium azadirachtae葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0005ECB51E，Uniprot参考号A0A0F0LB94。
Seq ID No.405：密码子优化的DNA，其编码6xHis放线菌属细菌(Actinobacteriabacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006588DAD，Uniprot参考号A0A0J0UT37。
Seq ID No.406：密码子优化的DNA，其编码6xHis绿弯菌门细菌(Chloroflexibacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0007968552，Uniprot参考号A0A136KWB3。
Seq ID No.407：密码子优化的DNA，其编码6xHis驹形杆菌(Komagataeibacterrhaeticus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002080410，Uniprot参考号A0A181C809。
Seq ID No.408：密码子优化的DNA，其编码6xHis拟杆菌属物种(Bacteroidessp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0008211BFC，Uniprot参考号A0A1C5WEL8。
Seq ID No.409：密码子优化的DNA，其编码6xHis红紫红色链霉菌(Streptomycesrubrolavendulae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00085A2BD0，Uniprot参考号A0A1D8FZW3。
Seq ID No.410：密码子优化的DNA，其编码6xHis玫瑰色梭菌(Streptomycesrubrolavendulae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00098C60F6，Uniprot参考号A0A1S8KYM5。
Seq ID No.411：密码子优化的DNA，其编码6xHis未培养的细菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009CE0D4C，Uniprot参考号A0A1V5M6V6。
Seq ID No.412：密码子优化的DNA，其编码6xHis厚壁菌门细菌(Firmicutesbacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009D4127D，Uniprot参考号A0A1V6AN95。
Seq ID No.413：密码子优化的DNA，其编码6xHis絮状炭疽病菌(Anthracocystisflocculosa)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00045601AB，Uniprot参考号A0A061H1Z3。
Seq ID No.414：密码子优化的DNA，其编码6xHis布姆双歧杆菌(Bifidobacteriumboum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0004FF77C7，Uniprot参考号A0A086ZKU2。
Seq ID No.415：密码子优化的DNA，其编码6xHis Jejuia pallidilutea葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00051EDBDE，Uniprot参考号A0A098LTR2。
Seq ID No.416：密码子优化的DNA，其编码6xHis流苏角囊藻(Ceratocystisfimbriata)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00062105AB，Uniprot参考号A0A0F8B2B0。
Seq ID No.417：密码子优化的DNA，其编码6xHis放线菌属细菌(Actinobacteriabacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006583AB1，Uniprot参考号A0A0J0UVW7。
Seq ID No.418：密码子优化的DNA，其编码6xHis红球菌属物种(Rhodococcussp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0007AABFAD，Uniprot参考号A0A143QAX3。
Seq ID No.419：密码子优化的DNA，其编码6xHis Valsa mali葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0007F2D02D，Uniprot参考号A0A194VF47。
Seq ID No.420：密码子优化的DNA，其编码6xHis未培养的拟杆菌属物种葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000821004D，Uniprot参考号A0A1C5WSI4。
Seq ID No.421：密码子优化的DNA，其编码6xHis塔伊艾森伯格菌(Eisenbergiella tayi)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00084089B2，Uniprot参考号A0A1E3ALT2。
Seq ID No.422：密码子优化的DNA，其编码6xHis链霉菌属物种(Streptomycessp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000978E914，Uniprot参考号A0A1V2MYI4。
Seq ID No.423：密码子优化的DNA，其编码6xHis厚壁菌门细菌(Firmicutesbacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009CBF21C，Uniprot参考号A0A1V5MH90。
Seq ID No.424：密码子优化的DNA，其编码6xHis软壁菌门细菌(Tenericutesbacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009D5B1F0，Uniprot参考号A0A1V6BAK3。
Seq ID No.425：密码子优化的DNA，其编码6xHis氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0004A87350，Uniprot参考号A0A067Z479。
Seq ID No.426：密码子优化的DNA，其编码6xHis链状双歧杆菌(Bifidobacteriumcatenulatum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00050787A2，Uniprot参考号A0A087B8Q8。
Seq ID No.427：密码子优化的DNA，其编码6xHis淡色生赤壳菌(Bionectriaochroleuca)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0005965863，Uniprot参考号A0A0B7K538。
Seq ID No.428：密码子优化的DNA，其编码6xHis拟立方藻属物种(Parcubacteriasp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006377CA4，Uniprot参考号A0A0G0GD78。
Seq ID No.429：密码子优化的DNA，其编码6xHis酮酶还原微杆菌(Microbacterium ketosireducens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006228575，Uniprot参考号A0A0M2H276。
Seq ID No.430：密码子优化的DNA，其编码6xHis粪罗氏菌(Roseburia faecis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006C454B4，Uniprot参考号A0A173R3W4。
Seq ID No.431：密码子优化的DNA，其编码6xHis枯萎病菌(Kwonielladejecticola)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0007F1D695，Uniprot参考号A0A1A6A050。
Seq ID No.432：密码子优化的DNA，其编码6xHis未培养的梭菌属物种葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0008232A70，Uniprot参考号A0A1C6C862。
Seq ID No.433：密码子优化的DNA，其编码6xHis Cyberlindnera jadinii葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000866CB30，Uniprot参考号A0A1E4S2F8。
Seq ID No.434：密码子优化的DNA，其编码6xHis拟杆菌门细菌(Bacteroidetesbacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009D3483D，Uniprot参考号A0A1V5G4W6。
Seq ID No.435：密码子优化的DNA，其编码6xHis疣微菌门细菌(Verrucomicrobiabacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009CC9AEA，Uniprot参考号A0A1V5Q4R4。
Seq ID No.436：密码子优化的DNA，其编码6xHis拟杆菌门细菌(Bacteroidetesbacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009C6DE73，Uniprot参考号A0A1V6BV25。
Seq ID No.437：密码子优化的DNA，其编码6xHis横梗霉(Lichtheimia ramosa)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0004E051A9，Uniprot参考号A0A077WUK7。
Seq ID No.438：密码子优化的DNA，其编码6xHis蒙古双歧杆菌(Bifidobacteriummongoliense)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0005060F52，Uniprot参考号A0A087BWT7。
Seq ID No.439：密码子优化的DNA，其编码6xHis石垣弧菌(Vibrioishigakensis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000591CED9，Uniprot参考号A0A0B8NZY1。
Seq ID No.440：密码子优化的DNA，其编码6xHis厚膜孢子杆菌(Phaeomoniellachlamydospora)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00063B706F，Uniprot参考号A0A0G2HEV5。
Seq ID No.441：密码子优化的DNA，其编码6xHis Ardenticatena maritima葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006C04F59，Uniprot参考号A0A0M8K5H7。
Seq ID No.442：密码子优化的DNA，其编码6xHis陪伴粪球菌(Coprococcuscomes)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000197E031，Uniprot参考号A0A173WPC4。
Seq ID No.443：密码子优化的DNA，其编码6xHis独岛诺卡氏菌(Nocardioidesdokdonensis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0007DDBAB3，Uniprot参考号A0A1A9GNJ0。
Seq ID No.444：密码子优化的DNA，其编码6xHis未培养的梭菌属物种葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000822F7EB，Uniprot参考号A0A1C6EBC1。
Seq ID No.445：密码子优化的DNA，其编码6xHis维也纳醋杆菌(Acetobacteriumwieringae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000878EB40，Uniprot参考号A0A1F2PFB4。
Seq ID No.446：密码子优化的DNA，其编码6xHis软壁菌门细菌(Tenericutesbacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009D0A2C1，Uniprot参考号A0A1V5HNJ3。
Seq ID No.447：密码子优化的DNA，其编码6xHis软壁菌门细菌(Tenericutesbacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009CB8A73，Uniprot参考号A0A1V5UFI1。
Seq ID No.448：密码子优化的DNA，其编码6xHis未培养的细菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009CC90AF，Uniprot参考号A0A1V6CDT2。
Seq ID No.449：密码子优化的DNA，其编码6xHis狄氏副拟杆菌(Parabacteroidesdistasonis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0004D8E473，Uniprot参考号A0A078SYD0。
Seq ID No.450：密码子优化的DNA，其编码6xHis嗜冷双歧杆菌(Bifidobacteriumpsychraerophilum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0005006C6A，Uniprot参考号A0A087CJB0。
Seq ID No.451：密码子优化的DNA，其编码6xHis圆柱孢霉(Hebelomacylindrosporum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00059A3BA8，Uniprot参考号A0A0C2YJF2。
Seq ID No.452：密码子优化的DNA，其编码6xHis Brenneria goodwinii葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006579FEA，Uniprot参考号A0A0G4JRR8。
Seq ID No.453：密码子优化的DNA，其编码6xHis杯状曲霉(Aspergilluscalidoustus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00073C9E60，Uniprot参考号A0A0U5GN20。
Seq ID No.454：密码子优化的DNA，其编码6xHis纤细拟杆菌(Bacteroidesfinegoldii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006C6E0C3，Uniprot参考号A0A174BEZ2。
Seq ID No.455：密码子优化的DNA，其编码6xHis东滩变红杆菌(Altererythrobacter dongtanensis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0008153D6D，Uniprot参考号A0A1B2A943。
Seq ID No.456：密码子优化的DNA，其编码6xHis未培养的Anaerotruncus sp.葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0008206E7B，Uniprot参考号A0A1C6FWD9。
Seq ID No.457：密码子优化的DNA，其编码6xHis Candidatus firestone葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0008AC0E17，Uniprot参考号A0A1F5UJR6。
Seq ID No.458：密码子优化的DNA，其编码6xHis软壁菌门细菌(Tenericutesbacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009C6C8E4，Uniprot参考号A0A1V5HS22。
Seq ID No.459：密码子优化的DNA，其编码6xHis黏胶球形菌门细菌(Lentisphaerae bacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009CEE1AB，Uniprot参考号A0A1V5VBL2。
Seq ID No.460：密码子优化的DNA，其编码6xHis浮霉菌门细菌(Planctomycetesbacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009CAAB0A，Uniprot参考号A0A1V6FZ47。
Seq ID No.461：密码子优化的DNA，其编码6xHis蜜蜂假球菌(Pseudallescheriaapiosperma)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0004DD62AC，Uniprot参考号A0A084G332。
Seq ID No.462：密码子优化的DNA，其编码6xHis Nonlabens sediminis葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000507F00A，Uniprot参考号A0A090Q4N8。
Seq ID No.463：密码子优化的DNA，其编码6xHis Gynuella sunshinyii葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0005CC42CA，Uniprot参考号A0A0C5VDU3。
Seq ID No.464：密码子优化的DNA，其编码6xHis长孢轮枝菌(Verticilliumlongisporum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00063E4005，Uniprot参考号A0A0G4N9Q7。
Seq ID No.465：密码子优化的DNA，其编码6xHis纤维菌属物种(Cellulomonassp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00073C6CD3，Uniprot参考号A0A0V8TAB5。
Seq ID No.466：密码子优化的DNA，其编码6xHis Hungatella hathewayi葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006C024BB，Uniprot参考号A0A174FBX7。
Seq ID No.467：密码子优化的DNA，其编码6xHis中慢生根瘤菌属物种(Mesorhizobium sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000688E74D，Uniprot参考号A0A1C2DG64。
Seq ID No.468：密码子优化的DNA，其编码6xHis梭菌属物种(Clostridium sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000822FAB7，Uniprot参考号A0A1C6GRT5。
Seq ID No.469：密码子优化的DNA，其编码6xHis衣原体目细菌(Chlamydialesbacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009284E74，Uniprot参考号A0A1M3CSY6。
Seq ID No.470：密码子优化的DNA，其编码6xHis螺旋体属细菌(Spirochaetesbacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009CB461D，Uniprot参考号A0A1V5HUX3。
Seq ID No.471：密码子优化的DNA，其编码6xHis细菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009C92D6A，Uniprot参考号A0A1V5VHB9。
Seq ID No.472：密码子优化的DNA，其编码6xHis热袍菌门细菌(Thermotogaebacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009D12B86，Uniprot参考号A0A1V6H2W5。
Seq ID No.473：密码子优化的DNA，其编码6xHis蜜蜂假球菌(Pseudallescheriaapiosperma)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0004DCBED3，Uniprot参考号A0A084GGE2。
Seq ID No.474：密码子优化的DNA，其编码6xHis力克阿尔吉杆菌(Algibacterlectus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00050E0BE3，Uniprot参考号A0A090VF17。
Seq ID No.475：密码子优化的DNA，其编码6xHis卷缘桩菇(Paxillus involutus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0005B075C8，Uniprot参考号A0A0C9TWP5。
Seq ID No.476：密码子优化的DNA，其编码6xHis长孢轮枝菌(Verticilliumlongisporum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00063DF006，Uniprot参考号A0A0G4NA55。
Seq ID No.477：密码子优化的DNA，其编码6xHis Mucilaginibacter gotjawali葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00076F8EA4，Uniprot参考号A0A110B1H1。
Seq ID No.478：密码子优化的DNA，其编码6xHis均匀拟杆菌(Bacteroidesuniformis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006C0FFEF，Uniprot参考号A0A174IWW4。
Seq ID No.479：密码子优化的DNA，其编码6xHis粪球菌属物种(Coprococcussp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0008222B77，Uniprot参考号A0A1C5W0N6。
Seq ID No.480：密码子优化的DNA，其编码6xHis布劳特氏菌属物种(Blautiasp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006C36823，Uniprot参考号A0A1C6K2X5。
Seq ID No.481：密码子优化的DNA，其编码6xHis纤维菌属物种(Cellulomonassp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00092B3CD4，Uniprot参考号A0A1M3ELH4。
Seq ID No.482：密码子优化的DNA，其编码6xHis细菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009C85428，Uniprot参考号A0A1V5J984。
Seq ID No.483：密码子优化的DNA，其编码6xHis螺旋体属细菌(Spirochaetesbacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009CA1D5C，Uniprot参考号A0A1V5WHQ7。
Seq ID No.484：密码子优化的DNA，其编码6xHis软壁菌门细菌(Tenericutesbacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009C7041F，Uniprot参考号A0A1V6IJ57。
Seq ID No.485：密码子优化的DNA，其编码6xHis线状黄杆菌(Flavobacteriumgilvum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0004E2A41F，Uniprot参考号A0A085EG29。
Seq ID No.486：密码子优化的DNA，其编码6xHis力克阿尔吉杆菌(Algibacterlectus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0005102470，Uniprot参考号A0A090WWZ1。
Seq ID No.487：密码子优化的DNA，其编码6xHis Hydnomerulius pinastri葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0005B0F0AE，Uniprot参考号A0A0C9WDY0。
Seq ID No.488：密码子优化的DNA，其编码6xHis法尔辛诺卡氏菌(Nocardiafarcinica)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00065C2666，Uniprot参考号A0A0H5NWN2。
Seq ID No.489：密码子优化的DNA，其编码6xHis纤维质拟杆菌(Bacteroidescellulosilyticus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000760375B，Uniprot参考号A0A125MG18。
Seq ID No.490：密码子优化的DNA，其编码6xHis Fonsecaea erecta葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0007DF4250，Uniprot参考号A0A178ZBN2。
Seq ID No.491：密码子优化的DNA，其编码6xHis拟杆菌属物种(Bacteroidessp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0008209852，Uniprot参考号A0A1C5W9N9。
Seq ID No.492：密码子优化的DNA，其编码6xHis福赛斯坦纳菌(Tannerellaforsythia)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00086C34C1，Uniprot参考号A0A1D3UGH8。
Seq ID No.493：密码子优化的DNA，其编码6xHis芳香酯微杆菌(Microbacteriumesteraromaticum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00097E83BB，Uniprot参考号A0A1R4KI92。
Seq ID No.494：密码子优化的DNA，其编码6xHis细菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009D255E5，Uniprot参考号A0A1V5LJK9。
Seq ID No.495：密码子优化的DNA，其编码6xHis氢化白念珠菌(Candidatushydrogenedentes)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009C5A3CF，Uniprot参考号A0A1V5Z2L2。
Seq ID No.496：密码子优化的DNA，其编码6xHis拟杆菌门细菌(Bacteroidetesbacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009C55799，Uniprot参考号A0A1V6J4J8。
Seq ID No.497：密码子优化的DNA，其编码6xHis孤独青霉(Penicilliumsolitum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009D4067F，Uniprot参考号A0A1V6RQ41。
Seq ID No.498：密码子优化的DNA，其编码6xHis Weissella soli葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0008737AA2，Uniprot参考号A0A288Q8I2。
Seq ID No.499：密码子优化的DNA，其编码6xHis Acetatifactor muris葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000CAC57D4，Uniprot参考号A0A2K4ZN91。
Seq ID No.500：密码子优化的DNA，其编码6xHis卡西科拉棒孢霉(Corynesporacassiicola)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D237A4A，Uniprot参考号A0A2T2NYD4。
Seq ID No.501：密码子优化的DNA，其编码6xHis Meira miltonrushii葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D77C91D，Uniprot参考号A0A316V6M3。
Seq ID No.502：密码子优化的DNA，其编码6xHis脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00004E1F76，Uniprot参考号A0A380YVC7。
Seq ID No.503：密码子优化的DNA，其编码6xHis限制性马拉色菌(Malasseziarestricta)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000F0C30E8，Uniprot参考号A0A3G2SB79。
Seq ID No.504：密码子优化的DNA，其编码6xHis杜鹃花镰孢菌(Fusariumeuwallaceae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000FFFEFB2，Uniprot参考号A0A430LYA2。
Seq ID No.505：密码子优化的DNA，其编码6xHis阿伯达氏假单胞菌(Psathyrellaaberdarensis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0010251887，Uniprot参考号A0A4Q2E070。
Seq ID No.506：密码子优化的DNA，其编码6xHis嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000E69509，Uniprot参考号A0KLP6。
Seq ID No.507：密码子优化的DNA，其编码6xHis红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000B86CB，Uniprot参考号A4F7P9。
Seq ID No.508：密码子优化的DNA，其编码6xHis黑色链霉菌(Streptomycessviceus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000180240E，Uniprot参考号B5I181。
Seq ID No.509：密码子优化的DNA，其编码6xHis Naematelia encephala葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000A250F78，Uniprot参考号A0A1Y2AWB7。
Seq ID No.510：密码子优化的DNA，其编码6xHis重氮营养哈特曼杆菌(Hartmannibacter diazotrophicus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000C0221F1，Uniprot参考号A0A2C9D6I2。
Seq ID No.511：密码子优化的DNA，其编码6xHis庞氏单胞菌唾液弧菌(Pontimonas salivibrio)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000CEB5AB1，Uniprot参考号A0A2L2BPE2。
Seq ID No.512：密码子优化的DNA，其编码6xHis Cadophora sp.葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D5B9C38，Uniprot参考号A0A2V1CH24。
Seq ID No.513：密码子优化的DNA，其编码6xHis Meira miltonrushii葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D779558，Uniprot参考号A0A316V8S0。
Seq ID No.514：密码子优化的DNA，其编码6xHis苹果褐腐病菌(Moniliniafructigena)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000DC42E3D，Uniprot参考号A0A395IJW4。
Seq ID No.515：密码子优化的DNA，其编码6xHis威尼克外瓶霉(Hortaeawerneckii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000F3E476C，Uniprot参考号A0A3M6XGS0。
Seq ID No.516：密码子优化的DNA，其编码6xHis网状链霉菌(Streptomycesnetropsis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00101460D7，Uniprot参考号A0A445N7U0。
Seq ID No.517：密码子优化的DNA，其编码6xHis出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI001139C6A8，Uniprot参考号A0A4S9IFI0。
Seq ID No.518：密码子优化的DNA，其编码6xHis棒状曲霉(Aspergillusclavatus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000EA5CFF，Uniprot参考号A1CTN9。
Seq ID No.519：密码子优化的DNA，其编码6xHis密歇根棒状杆菌(Clavibactermichiganensis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001523037，Uniprot参考号A5CT94。
Seq ID No.520：密码子优化的DNA，其编码6xHis红色青霉(Penicillium rubens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001831CF5，Uniprot参考号B6H7R5。
Seq ID No.521：密码子优化的DNA，其编码6xHis Lachnoclostridium sp.葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000B365547，Uniprot参考号A0A1Y4NTL9。
Seq ID No.522：密码子优化的DNA，其编码6xHis红杆菌科细菌(Rhodobacteraceae bacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000C09BF88，Uniprot参考号A0A2D5IXB9。
Seq ID No.523：密码子优化的DNA，其编码6xHis脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0004B5EEF2，Uniprot参考号A0A2M9UUC4。
Seq ID No.524：密码子优化的DNA，其编码6xHis吲哚生曲霉(Aspergillusindologenus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D7FE1ED，Uniprot参考号A0A2V5IY78。
Seq ID No.525：密码子优化的DNA，其编码6xHis金氏酵母菌(Acaromycesingoldii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D802B25，Uniprot参考号A0A316YR39。
Seq ID No.526：密码子优化的DNA，其编码6xHis苹果褐腐病菌(Moniliniafructigena)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000DC60823，Uniprot参考号A0A395J1U5。
Seq ID No.527：密码子优化的DNA，其编码6xHis木聚糖酶类芽孢杆菌(Paenibacillus xylanexedens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000F52D773，Uniprot参考号A0A3N6CA02。
Seq ID No.528：密码子优化的DNA，其编码6xHis豪氏放线菌(Actinomyceshowellii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000F6DAAAE，Uniprot参考号A0A448HIG0。
Seq ID No.529：密码子优化的DNA，其编码6xHis内石弗里德曼氏菌(Friedmanniomyces endolithicus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00113D19DF，Uniprot参考号A0A4V5N9I4。
Seq ID No.530：密码子优化的DNA，其编码6xHis费希新萨托菌(Neosartoryafischeri)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000EA8672，Uniprot参考号A1DNS0。
Seq ID No.531：密码子优化的DNA，其编码6xHis铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000D7314B，Uniprot参考号A6V4K6。
Seq ID No.532：密码子优化的DNA，其编码6xHis柄篮状菌(Talaromycesstipitatus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00018E7266，Uniprot参考号B8MF24。
Seq ID No.533：密码子优化的DNA，其编码6xHis Aquimixticolasoesokkakensis葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000A1A5FD7，Uniprot参考号A0A1Y5RVF8。
Seq ID No.534：密码子优化的DNA，其编码6xHis红杆菌目细菌(Rhodobacteralesbacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000C98D37C，Uniprot参考号A0A2D9YGV1。
Seq ID No.535：密码子优化的DNA，其编码6xHis Methylorubrum extorquens葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006F9793E，Uniprot参考号A0A2N9AS40。
Seq ID No.536：密码子优化的DNA，其编码6xHis产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000CF7C8，Uniprot参考号A0A2X2YBP0。
Seq ID No.537：密码子优化的DNA，其编码6xHis胆原体目细菌(Acholeplasmatales bacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0008AEBEA3，Uniprot参考号A0A348NID6。
Seq ID No.538：密码子优化的DNA，其编码6xHis拟杆菌门细菌(Bacteroidetesbacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000EC3C979，Uniprot参考号A0A3B8VHE8。
Seq ID No.539：密码子优化的DNA，其编码6xHis肉梭菌(Clostridium carnis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000F637E38，Uniprot参考号A0A3P6K8E8。
Seq ID No.540：密码子优化的DNA，其编码6xHis黄色分枝杆菌(Mycolicibacterium flavescens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000B93B5C9，Uniprot参考号A0A448HNB5。
Seq ID No.541：密码子优化的DNA，其编码6xHis解没食子酸链球菌(Streptococcus gallolyticus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000F6EFA71，Uniprot参考号A0A4V6LJ94。
Seq ID No.542：密码子优化的DNA，其编码6xHis小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000EB54CC，Uniprot参考号A1JNB7。
Seq ID No.543：密码子优化的DNA，其编码6xHis厌氧粘细菌属物种(Anaeromyxobacter sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000ED8A80，Uniprot参考号A7HFG4。
Seq ID No.544：密码子优化的DNA，其编码6xHis柄篮状菌(Talaromycesstipitatus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00018E7D70，Uniprot参考号B8MK55。
Seq ID No.545：密码子优化的DNA，其编码6xHis威尼克外瓶霉(Hortaeawerneckii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000A2E3FAA，Uniprot参考号A0A1Z5SL14。
Seq ID No.546：密码子优化的DNA，其编码6xHis米卡弧菌属物种(Micavibriosp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000C529025，Uniprot参考号A0A2E2Q8X2。
Seq ID No.547：密码子优化的DNA，其编码6xHis Acidobacteriia细菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000CE6B996，Uniprot参考号A0A2N9MBS0。
Seq ID No.548：密码子优化的DNA，其编码6xHis杰基棒状杆菌(Corynebacteriumjeikeium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000DA3A972，Uniprot参考号A0A2X4T570。
Seq ID No.549：密码子优化的DNA，其编码6xHis梭菌科细菌(Clostridiaceaebacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000E8D37A1，Uniprot参考号A0A353PZH8。
Seq ID No.550：密码子优化的DNA，其编码6xHis厌氧绳菌科细菌(Anaerolineaceae bacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000748C096，Uniprot参考号A0A3B9PA35。
Seq ID No.551：密码子优化的DNA，其编码6xHis Gymnopilus dilepis葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000FF41956，Uniprot参考号A0A409WSY0。
Seq ID No.552：密码子优化的DNA，其编码6xHis玫瑰色库克菌(Kocuria rosea)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000F7105D4，Uniprot参考号A0A448R8N0。
Seq ID No.553：密码子优化的DNA，其编码6xHis Teredinibacter sp.葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0011696FAB，Uniprot参考号A0A509DWZ3。
Seq ID No.554：密码子优化的DNA，其编码6xHis黑曲霉(Aspergillus niger)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000EFB564，Uniprot参考号A2QS42。
Seq ID No.555：密码子优化的DNA，其编码6xHis双色蜡蘑(Laccaria bicolor)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000164423D，Uniprot参考号B0D734。
Seq ID No.556：密码子优化的DNA，其编码6xHis Pedosphaera parvula葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00017357F6，Uniprot参考号B9XH33。
Seq ID No.557：密码子优化的DNA，其编码6xHis超巨型单胞菌(Megamonashypermegale)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00042469F6，Uniprot参考号A0A239TGH2。
Seq ID No.558：密码子优化的DNA，其编码6xHis高卢蜜环菌(Armillariagallica)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000BC209C3，Uniprot参考号A0A2H3E300。
Seq ID No.559：密码子优化的DNA，其编码6xHis小单孢菌属物种(Micromonospora sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D2EAE87，Uniprot参考号A0A2P8AV03。
Seq ID No.560：密码子优化的DNA，其编码6xHis产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000DA286EE，Uniprot参考号A0A2X5CJC5。
Seq ID No.561：密码子优化的DNA，其编码6xHis Candidatus ozemobacter葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000DFAEF6C，Uniprot参考号A0A367ZIH8。
Seq ID No.562：密码子优化的DNA，其编码6xHis Coleophoma crateriformis葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000E399EE8，Uniprot参考号A0A3D8R2C2。
Seq ID No.563：密码子优化的DNA，其编码6xHis Apiotrichum porosum葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000FBC01E3，Uniprot参考号A0A427XHS2。
Seq ID No.564：密码子优化的DNA，其编码6xHis马无胆甾原体(Acholeplasmahippikon)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00068E4E50，Uniprot参考号A0A449BJ27。
Seq ID No.565：密码子优化的DNA，其编码6xHis壮观链霉菌(Streptomycesspectabilis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI001185F074，Uniprot参考号A0A516RGT1。
Seq ID No.566：密码子优化的DNA，其编码6xHis黑曲霉(Aspergillus niger)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000EFCED2，Uniprot参考号A2R8G2。
Seq ID No.567：密码子优化的DNA，其编码6xHis野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000D8BFA，Uniprot参考号B0RYA0。
Seq ID No.568：密码子优化的DNA，其编码6xHis副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019C9CD7，Uniprot参考号C2FDL2。
Seq ID No.569：密码子优化的DNA，其编码6xHis Bifiguratus adelaidae葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000BC490A3，Uniprot参考号A0A261XUH4。
Seq ID No.570：密码子优化的DNA，其编码6xHis细菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000CC31AE2，Uniprot参考号A0A2H5YYA1。
Seq ID No.571：密码子优化的DNA，其编码6xHis微小马杜拉放线菌(Actinomadura parvosata)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D26C9C6，Uniprot参考号A0A2P9IY35。
Seq ID No.572：密码子优化的DNA，其编码6xHis洋葱蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00024F22B8，Uniprot参考号A0A2Z5Y4P3。
Seq ID No.573：密码子优化的DNA，其编码6xHis耐久肠球菌(Enterococcusdurans)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000E020871，Uniprot参考号A0A377KJS3。
Seq ID No.574：密码子优化的DNA，其编码6xHis限制性马拉色菌(Malasseziarestricta)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000DD17A7D，Uniprot参考号A0A3G2S2J6。
Seq ID No.575：密码子优化的DNA，其编码6xHis Apiotrichum porosum葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000FA2DE87，Uniprot参考号A0A427XZQ0。
Seq ID No.576：密码子优化的DNA，其编码6xHis链单孢菌属物种(Streptomonospora sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0010355193，Uniprot参考号A0A4P6PWP5。
Seq ID No.577：密码子优化的DNA，其编码6xHis加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00119640A1，Uniprot参考号A0A558LH47。
Seq ID No.578：密码子优化的DNA，其编码6xHis黑曲霉(Aspergillus niger)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000EFD0AA，Uniprot参考号A2RAJ1。
Seq ID No.579：密码子优化的DNA，其编码6xHis Neosartorya fumigata葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000170BF91，Uniprot参考号B0XXG1。
Seq ID No.580：密码子优化的DNA，其编码6xHis挑剔真细菌(Eubacteriumeligens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001A5B234，Uniprot参考号C4Z6T5。
Seq ID No.581：密码子优化的DNA，其编码6xHis Bifiguratus adelaidae葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000BC64A75，Uniprot参考号A0A261XVM8。
Seq ID No.582：密码子优化的DNA，其编码6xHis细菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000CAA854E，Uniprot参考号A0A2H6EX57。
Seq ID No.583：密码子优化的DNA，其编码6xHis卡西科拉棒孢霉(Corynesporacassiicola)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D24EC2C，Uniprot参考号A0A2T2N5H9。
Seq ID No.584：密码子优化的DNA，其编码6xHis葡萄糖拟微基质菌(Pseudomicrostroma glucosiphilum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D77A0B7，Uniprot参考号A0A316UK83。
Seq ID No.585：密码子优化的DNA，其编码6xHis腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002DAAFCC，Uniprot参考号A0A380HD31。
Seq ID No.586：密码子优化的DNA，其编码6xHis限制性马拉色菌(Malasseziarestricta)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000F0C6B8E，Uniprot参考号A0A3G2S932。
Seq ID No.587：密码子优化的DNA，其编码6xHis Saitozyma podzolica葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000FBA70E2，Uniprot参考号A0A427YCL1。
Seq ID No.588：密码子优化的DNA，其编码6xHis Tremella mesenterica葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00102822B4，Uniprot参考号A0A4Q1BRC6。
Seq ID No.589：密码子优化的DNA，其编码6xHis节杆菌属物种(Arthrobactersp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000527506，Uniprot参考号A0JZ86。
Seq ID No.590：密码子优化的DNA，其编码6xHis Scheffersomyces stipitis葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000157388C，Uniprot参考号A3LRB0。
Seq ID No.591：密码子优化的DNA，其编码6xHis霍氏纤丝菌(Leptothrixcholodnii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001712E02，Uniprot参考号B1XZK8。
Seq ID No.592：密码子优化的DNA，其编码6xHis索氏菌属物种(Thauera sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000166883C，Uniprot参考号C4ZLL7。
Seq ID No.593：密码子优化的DNA，其编码6xHis Kosmotoga olearia葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00018494AB，Uniprot参考号C5CDW5。
Seq ID No.594：密码子优化的DNA，其编码6xHis肠罗氏菌(Roseburiaintestinalis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001CD671F，Uniprot参考号D4L3Y2。
Seq ID No.595：密码子优化的DNA，其编码6xHis马肠链球菌(Streptococcusequinus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001E0DC00，Uniprot参考号E0PDF8。
Seq ID No.596：密码子优化的DNA，其编码6xHis冠链球菌(Streptococcuscristatus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001F80C4B，Uniprot参考号E8JUK5。
Seq ID No.597：密码子优化的DNA，其编码6xHis纤维素纤维菌(Cellulosilyticum lentocellum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001D2DBBC，Uniprot参考号F2JLH3。
Seq ID No.598：密码子优化的DNA，其编码6xHis解没食子酸链球菌(Streptococcus gallolyticus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001C48657，Uniprot参考号F5WYI5。
Seq ID No.599：密码子优化的DNA，其编码6xHis普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonicigenium vulgare)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00021D443A，Uniprot参考号F9Y8Z7。
Seq ID No.600：密码子优化的DNA，其编码6xHis帕萨丽达姆斯帕萨孢菌(Spathaspora passalidarum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000228255D，Uniprot参考号G3AGX1。
Seq ID No.601：密码子优化的DNA，其编码6xHis Niastella koreensis葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00023F6F5F，Uniprot参考号G8T9J3。
Seq ID No.602：密码子优化的DNA，其编码6xHis纤维弧菌属物种(Cellvibriosp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000260108C，Uniprot参考号I3IDC0。
Seq ID No.603：密码子优化的DNA，其编码6xHis黄杆菌属物种(Flavobacteriumsp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000272D1E0，Uniprot参考号J1ACA0。
Seq ID No.604：密码子优化的DNA，其编码6xHis壳球孢菌(Macrophominaphaseolina)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00028E7FE1，Uniprot参考号K2S5D3。
Seq ID No.605：密码子优化的DNA，其编码6xHis Kosmotoga olearia葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00018483A2，Uniprot参考号C5CHI5。
Seq ID No.606：密码子优化的DNA，其编码6xHis Blautia obeum葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001CD5918，Uniprot参考号D4LRF6。
Seq ID No.607：密码子优化的DNA，其编码6xHis齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001E18CDA，Uniprot参考号E0Q541。
Seq ID No.608：密码子优化的DNA，其编码6xHis嗜热厌氧菌(Anaerolineathermophila)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001F55F8F，Uniprot参考号E8N5R8。
Seq ID No.609：密码子优化的DNA，其编码6xHis小球科里氏杆菌(Coriobacterium glomerans)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002050DA2，Uniprot参考号F2N7E4。
Seq ID No.610：密码子优化的DNA，其编码6xHis积磷小月菌(Microlunatusphosphovorus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000210C886，Uniprot参考号F5XJQ3。
Seq ID No.611：密码子优化的DNA，其编码6xHis链霉菌属物种(Streptomycessp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001C18877，Uniprot参考号G0Q1U8。
Seq ID No.612：密码子优化的DNA，其编码6xHis帕萨丽达姆斯帕萨孢菌(Spathaspora passalidarum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002282B61，Uniprot参考号G3AIV6。
Seq ID No.613：密码子优化的DNA，其编码6xHis洛佐延氏格拉氏菌(Glarealozoyensis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002402F4A，Uniprot参考号H0ET34。
Seq ID No.614：密码子优化的DNA，其编码6xHis Glaciozyma antarctica葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002633B36，Uniprot参考号I3UJK0。
Seq ID No.615：密码子优化的DNA，其编码6xHis节杆菌属物种(Arthrobactersp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00027DFD35，Uniprot参考号J7LN00。
Seq ID No.616：密码子优化的DNA，其编码6xHis假禾谷镰刀菌(Fusariumpseudograminearum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00028D698C，Uniprot参考号K3VMA9。
Seq ID No.617：密码子优化的DNA，其编码6xHis Hypocrea rufa葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000006AA61，Uniprot参考号C6GGC9。
Seq ID No.618：密码子优化的DNA，其编码6xHis扭矩瘤胃球菌(Ruminococcustorques)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001CDA964，Uniprot参考号D4M6W6。
Seq ID No.619：密码子优化的DNA，其编码6xHis齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001E17370，Uniprot参考号E0Q9Z7。
Seq ID No.620：密码子优化的DNA，其编码6xHis沙拉尼拟杆菌(Bacteroidessalanitronis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001FC71F6，Uniprot参考号F0R2D7。
Seq ID No.621：密码子优化的DNA，其编码6xHis共产拟杆菌(Bacteroidescoprosuis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00020E6D19，Uniprot参考号F3ZQ40。
Seq ID No.622：密码子优化的DNA，其编码6xHis波西多尼单胞菌(Marinomonasposidonica)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00020D4CC6，Uniprot参考号F6CWF6。
Seq ID No.623：密码子优化的DNA，其编码6xHis嗜热毛壳菌(Chaetomiumthermophilum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000227E8ED，Uniprot参考号G0SE64。
Seq ID No.624：密码子优化的DNA，其编码6xHis嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00022B9A15，Uniprot参考号G4L5K1。
Seq ID No.625：密码子优化的DNA，其编码6xHis类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00024F0867，Uniprot参考号H6CCZ8。
Seq ID No.626：密码子优化的DNA，其编码6xHis Turneriella parva葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000265AA4B，Uniprot参考号I4B8U7。
Seq ID No.627：密码子优化的DNA，其编码6xHis节杆菌属物种(Arthrobactersp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00027DFDB2，Uniprot参考号J7LQK9。
Seq ID No.628：密码子优化的DNA，其编码6xHis双孢蘑菇(Agaricus bisporus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00029074B1，Uniprot参考号K5W7V1。
Seq ID No.629：密码子优化的DNA，其编码6xHis鞭毛藻丛赤壳菌(Nectriahaematococca)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001B67634，Uniprot参考号C7YIP3。
Seq ID No.630：密码子优化的DNA，其编码6xHis木聚糖拟杆菌(Bacteroidesxylanisolvens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001A25287，Uniprot参考号D4VSZ0。
Seq ID No.631：密码子优化的DNA，其编码6xHis Sediminispirochaetasmaragdinae葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001DD9790，Uniprot参考号E1R331。
Seq ID No.632：密码子优化的DNA，其编码6xHis溶蛋白异常球菌(Deinococcusproteolyticus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001FC42E9，Uniprot参考号F0RPV2。
Seq ID No.633：密码子优化的DNA，其编码6xHis鞘氨醇杆菌属物种(Sphingobacterium sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002033A0A，Uniprot参考号F4C226。
Seq ID No.634：密码子优化的DNA，其编码6xHis氯酚鞘氨醇杆菌(Sphingobiumchlorophenolicum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001E54133，Uniprot参考号F6ET40。
Seq ID No.635：密码子优化的DNA，其编码6xHis Caloramator australicus葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00021CACC4，Uniprot参考号G0V3V5。
Seq ID No.636：密码子优化的DNA，其编码6xHis肠共栖杆菌(Commensalibacterintestini)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000230E3BF，Uniprot参考号G6F370。
Seq ID No.637：密码子优化的DNA，其编码6xHis类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00024F07AC，Uniprot参考号H6CIT2。
Seq ID No.638：密码子优化的DNA，其编码6xHis Nitrolancea hollandica葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002638AF3，Uniprot参考号I4EIA9。
Seq ID No.639：密码子优化的DNA，其编码6xHis新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000392C3ED，Uniprot参考号J9VVK7。
Seq ID No.640：密码子优化的DNA，其编码6xHis嗜酸丙酸杆菌(Acidipropionibacterium acidipropionici)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002988588，Uniprot参考号K7S596。
Seq ID No.641：密码子优化的DNA，其编码6xHis普雷沃菌属物种(Prevotellasp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001B93465，Uniprot参考号C9PT75。
Seq ID No.642：密码子优化的DNA，其编码6xHis荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001D08095，Uniprot参考号D5ALU0。
Seq ID No.643：密码子优化的DNA，其编码6xHis橙色豆状金属菌(Stigmatellaaurantiaca)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001E74370，Uniprot参考号E3FJ05。
Seq ID No.644：密码子优化的DNA，其编码6xHis Sphaerochaeta globosa葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002010060，Uniprot参考号F0RVK3。
Seq ID No.645：密码子优化的DNA，其编码6xHis球形球毛菌(Sphaerochaetacoccoides)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000207D78C，Uniprot参考号F4GH96。
Seq ID No.646：密码子优化的DNA，其编码6xHis新鞘脂菌属物种(Novosphingobium sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00020EFBCB，Uniprot参考号F6ICQ5。
Seq ID No.647：密码子优化的DNA，其编码6xHis少孢节丛孢菌(Arthrobotrysoligospora)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000225331F，Uniprot参考号G1XH86。
Seq ID No.648：密码子优化的DNA，其编码6xHis乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000C6907，Uniprot参考号G6FFS4。
Seq ID No.649：密码子优化的DNA，其编码6xHis Phaeospirillum molischianum葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000255313A，Uniprot参考号H8FXH7。
Seq ID No.650：密码子优化的DNA，其编码6xHis海洋贫养杆菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002609C68，Uniprot参考号I4EW72。
Seq ID No.651：密码子优化的DNA，其编码6xHis西班牙糖丝菌(Saccharothrixespanaensis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00028AC337，Uniprot参考号K0K125。
Seq ID No.652：密码子优化的DNA，其编码6xHis阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00029BA293，Uniprot参考号K8DAK0。
Seq ID No.653：密码子优化的DNA，其编码6xHis苜蓿轮枝菌(Verticilliumalfalfae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001BBDF1E，Uniprot参考号C9SVX1。
Seq ID No.654：密码子优化的DNA，其编码6xHis木聚糖拟杆菌(Bacteroidesxylanisolvens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001CCFD36，Uniprot参考号D6CY10。
Seq ID No.655：密码子优化的DNA，其编码6xHis比索菲拉铅贝特拉菌(Leadbetterella byssophila)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001EBD98A，Uniprot参考号E4RUR0。
Seq ID No.656：密码子优化的DNA，其编码6xHis Sphaerochaeta globosa葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00020102A5，Uniprot参考号F0RYB6。
Seq ID No.657：密码子优化的DNA，其编码6xHis球形球毛菌(Sphaerochaetacoccoides)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000207D6A0，Uniprot参考号F4GLH6。
Seq ID No.658：密码子优化的DNA，其编码6xHis Haloplasma contractile葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000212252C，Uniprot参考号F7Q0Y2。
Seq ID No.659：密码子优化的DNA，其编码6xHis亚马逊硝化螺旋菌(Nitrospirillum amazonense)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002265447，Uniprot参考号G1Y4C7。
Seq ID No.660：密码子优化的DNA，其编码6xHis巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00023420B8，Uniprot参考号G8AWD9。
Seq ID No.661：密码子优化的DNA，其编码6xHis Phaeospirillum molischianum葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000255314F，Uniprot参考号H8FXJ8。
Seq ID No.662：密码子优化的DNA，其编码6xHis海洋贫养杆菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000260A2FA，Uniprot参考号I4EYD5。
Seq ID No.663：密码子优化的DNA，其编码6xHis Wickerhamomyces ciferrii(Wickerhamomyces ciferrii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000283EB8D，Uniprot参考号K0KVJ2。
Seq ID No.664：密码子优化的DNA，其编码6xHis粘球藻属物种(Gloeocapsa sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002A5D085，Uniprot参考号K9XKL8。
Seq ID No.665：密码子优化的DNA，其编码6xHis嗜热球形杆菌(Sphaerobacterthermophilus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001A3BCB6，Uniprot参考号D1C7U8。
Seq ID No.666：密码子优化的DNA，其编码6xHis木聚糖拟杆菌(Bacteroidesxylanisolvens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001CCEF1F，Uniprot参考号D6D4V2。
Seq ID No.667：密码子优化的DNA，其编码6xHis布氏普雷沃菌(Prevotellabuccae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001F149E8，Uniprot参考号E6K4W5。
Seq ID No.668：密码子优化的DNA，其编码6xHis Grosmannia clavigera葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001FF1101，Uniprot参考号F0XBR0。
Seq ID No.669：密码子优化的DNA，其编码6xHis松杨栅锈菌(Melampsoralarici-populina)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00020F9774，Uniprot参考号F4R4W2。
Seq ID No.670：密码子优化的DNA，其编码6xHis多糖普雷沃菌(Prevotellamultisaccharivorax)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002138E9C，Uniprot参考号F8N7G1。
Seq ID No.671：密码子优化的DNA，其编码6xHis耐锌链霉菌(Streptomyceszinciresistens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002255A63，Uniprot参考号G2G8K4。
Seq ID No.672：密码子优化的DNA，其编码6xHis Granulicella mallensis葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001D9FC40，Uniprot参考号G8NY42。
Seq ID No.673：密码子优化的DNA，其编码6xHis玉米赤霉菌(Gibberella zeae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00021F1FEE，Uniprot参考号I1RH94。Seq ID No.674：密码子优化的DNA，其编码6xHis海洋贫养杆菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00026090A2，Uniprot参考号I4EYK6。
Seq ID No.675：密码子优化的DNA，其编码6xHis马蹄乳杆菌(Lactobacillusequicursoris)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002869F55，Uniprot参考号K0NRS8。
Seq ID No.676：密码子优化的DNA，其编码6xHis苹果炭疽菌(Colletotrichumfructicola)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002A93280，Uniprot参考号L2F9W0。
Seq ID No.677：密码子优化的DNA，其编码6xHis玫瑰色链孢囊菌(Streptosporangium roseum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001BF8AF6，Uniprot参考号D2B261。
Seq ID No.678：密码子优化的DNA，其编码6xHis灰色李斯特菌(Listeria grayi)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019F252A，Uniprot参考号D7UX19。
Seq ID No.679：密码子优化的DNA，其编码6xHis意大利肠球菌(Enterococcusitalicus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001F11EFF，Uniprot参考号E6LF07。
Seq ID No.680：密码子优化的DNA，其编码6xHis Fluviicola taffensis葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000203D9EA，Uniprot参考号F2IIT6。
Seq ID No.681：密码子优化的DNA，其编码6xHis福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00020CA641，Uniprot参考号F5N4W9。
Seq ID No.682：密码子优化的DNA，其编码6xHis放线菌属物种(Actinomycessp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002189080，Uniprot参考号F9EFW5。
Seq ID No.683：密码子优化的DNA，其编码6xHis大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00022EBE5A，Uniprot参考号G2X5V6。
Seq ID No.684：密码子优化的DNA，其编码6xHis游动放线菌属物种(Actinoplanes sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00023ED5A8，Uniprot参考号G8S0M0。
Seq ID No.685：密码子优化的DNA，其编码6xHis玉米赤霉菌(Gibberella zeae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000023EA29，Uniprot参考号I1S320。Seq ID No.686：密码子优化的DNA，其编码6xHis Auricularia subglabra葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00027CE685，Uniprot参考号J0WV06。
Seq ID No.687：密码子优化的DNA，其编码6xHis印度硝化还原菌(Nitratireductor indicus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00028E86D6，Uniprot参考号K2N268。
Seq ID No.688：密码子优化的DNA，其编码6xHis粪热球菌(Thermoclostridiumstercorarium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002AD999E，Uniprot参考号L7VH66。
Seq ID No.689：密码子优化的DNA，其编码6xHis土芽孢杆菌属物种(Geobacillussp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002AF2DE3，Uniprot参考号L8A1S2。
Seq ID No.690：密码子优化的DNA，其编码6xHis未培养的细菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000327C3CC，Uniprot参考号M9ZC55。
Seq ID No.691：密码子优化的DNA，其编码6xHis模糊伯克霍尔德氏菌(Burkholderia ambifaria)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000059ACE1，Uniprot参考号Q0BAK2。
Seq ID No.692：密码子优化的DNA，其编码6xHis米曲霉(Aspergillus oryzae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000676B8D，Uniprot参考号Q2UIR4。
Seq ID No.693：密码子优化的DNA，其编码6xHis假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00004269B5，Uniprot参考号Q66DJ0。
Seq ID No.694：密码子优化的DNA，其编码6xHis Wallemia ichthyophaga葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000331CC98，Uniprot参考号R9AF64。
Seq ID No.695：密码子优化的DNA，其编码6xHis洛佐延氏格拉氏菌(Glarealozoyensis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003522404，Uniprot参考号S3DIM6。
Seq ID No.696：密码子优化的DNA，其编码6xHis罗里褐腐病菌(Moniliophthoraroreri)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003BF753A，Uniprot参考号V2YU31。
Seq ID No.697：密码子优化的DNA，其编码6xHis解淀粉周氏酵母(Zhouiaamylolytica)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003DBCB4F，Uniprot参考号W2ULL3。
Seq ID No.698：密码子优化的DNA，其编码6xHis尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003F362FF，Uniprot参考号W9NQQ3。
Seq ID No.699：密码子优化的DNA，其编码6xHis约翰逊黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00006EA168，Uniprot参考号A5FAA5。
Seq ID No.700：密码子优化的DNA，其编码6xHis水稻(Oryza sativa)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00002394F5，Uniprot参考号Q75I93。
Seq ID No.701：密码子优化的DNA，其编码6xHis糖过丁基丙酮梭菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002B65681，Uniprot参考号M1MCD1。
Seq ID No.702：密码子优化的DNA，其编码6xHis红球菌属物种(Rhodococcussp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002D21DB1，Uniprot参考号N1MBN6。
Seq ID No.703：密码子优化的DNA，其编码6xHis模糊伯克霍尔德氏菌(Burkholderia ambifaria)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000059C0CD，Uniprot参考号Q0BCV8。
Seq ID No.704：密码子优化的DNA，其编码6xHis野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00005CE9E7，Uniprot参考号Q3BVH7。
Seq ID No.705：密码子优化的DNA，其编码6xHis弧菌茎杆菌(Caulobactervibrioides)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000C7604，Uniprot参考号Q9A6F8。
Seq ID No.706：密码子优化的DNA，其编码6xHis斯瓦尔巴德北极杆菌(Arcticibacter svalbardensis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000338772A，Uniprot参考号R9GRA7。
Seq ID No.707：密码子优化的DNA，其编码6xHis耐冷葡萄球菌(Winogradskyellapsychrotolerans)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00035A4604，Uniprot参考号S7VQ28。
Seq ID No.708：密码子优化的DNA，其编码6xHis Methyloglobulus morosus葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003C4ED6A，Uniprot参考号V5DXT8。Seq ID No.709：密码子优化的DNA，其编码6xHis无花果拟盘多毛孢(Pestalotiopsis fici)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003E05C04，Uniprot参考号W3WV37。
Seq ID No.710：密码子优化的DNA，其编码6xHis Capronia coronata葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000434E698，Uniprot参考号W9YNR7。
Seq ID No.711：密码子优化的DNA，其编码6xHis棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00001268FD，Uniprot参考号P48825。
Seq ID No.712：密码子优化的DNA，其编码6xHis那不勒斯栖热孢(Thermotoganeapolitana)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000DD5996，Uniprot参考号Q0GC07。
Seq ID No.713：密码子优化的DNA，其编码6xHis糖过丁基丙酮梭菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002B666E8，Uniprot参考号M1MJF4。
Seq ID No.714：密码子优化的DNA，其编码6xHis粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000006B001，Uniprot参考号O74799。
Seq ID No.715：密码子优化的DNA，其编码6xHis根瘤褐腐菌(Phaeosphaerianodorum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000161BD2B，Uniprot参考号Q0TXF6。
Seq ID No.716：密码子优化的DNA，其编码6xHis苛养木杆菌(Xylellafastidiosa Dixon)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00003806C8，Uniprot参考号Q3RGJ3。
Seq ID No.717：密码子优化的DNA，其编码6xHis粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000006A330，Uniprot参考号Q9P6J6。
Seq ID No.718：密码子优化的DNA，其编码6xHis斯瓦尔巴德北极杆菌(Arcticibacter svalbardensis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000337E887，Uniprot参考号R9GWD6。
Seq ID No.719：密码子优化的DNA，其编码6xHis盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioides)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003885717，Uniprot参考号T0KJI7。
Seq ID No.720：密码子优化的DNA，其编码6xHis未培养的细菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003C9E340，Uniprot参考号V5R1E8。
Seq ID No.721：密码子优化的DNA，其编码6xHis树木黄单胞菌(Xanthomonasarboricola)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003E06A61，Uniprot参考号W4S7I5。
Seq ID No.722：密码子优化的DNA，其编码6xHis尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00021EC697，Uniprot参考号X0A8X8。
Seq ID No.723：密码子优化的DNA，其编码6xHis多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00001108D0，Uniprot参考号P22073。
Seq ID No.724：密码子优化的DNA，其编码6xHis马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001BE5ADA，Uniprot参考号D1GCC6。
Seq ID No.725：密码子优化的DNA，其编码6xHis球菌发光杆菌(Ilumatobactercoccineus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002C04A25，Uniprot参考号M5A594。
Seq ID No.726：密码子优化的DNA，其编码6xHis农杆菌属物种(Agrobacteriumsp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000126912，Uniprot参考号P12614。
Seq ID No.727：密码子优化的DNA，其编码6xHis哈氏噬纤维菌(Cytophagahutchinsonii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000038ECF7，Uniprot参考号Q11P53。
Seq ID No.728：密码子优化的DNA，其编码6xHis暗色嗜热双歧杆菌(Thermobifida fusca)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00003C5CA4，Uniprot参考号Q47PF5。
Seq ID No.729：密码子优化的DNA，其编码6xHis Botryotinia fuckeliana葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000069E5E，Uniprot参考号Q9UVJ6。
Seq ID No.730：密码子优化的DNA，其编码6xHis噬琼胶菌(Agarivorans albus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00033994D2，Uniprot参考号R9PTK2。
Seq ID No.731：密码子优化的DNA，其编码6xHis肠球菌属物种(Enterococcussp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00038B7639，Uniprot参考号T0UDU2。
Seq ID No.732：密码子优化的DNA，其编码6xHis Salinispira pacifica葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003D8A7DC，Uniprot参考号V5WKT4。
Seq ID No.733：密码子优化的DNA，其编码6xHis木聚糖拟杆菌(Bacteroidesxylanisolvens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003ECF15E，Uniprot参考号W6P696。
Seq ID No.734：密码子优化的DNA，其编码6xHis尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000430029A，Uniprot参考号X0AB46。
Seq ID No.735：密码子优化的DNA，其编码6xHis海栖热袍菌(Thermotogamaritima)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000126906，Uniprot参考号Q08638B。
Seq ID No.736：密码子优化的DNA，其编码6xHis恒春新白蚁(Neotermeskoshunensis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000083EA8，Uniprot参考号Q8T0W7。
Seq ID No.737：密码子优化的DNA，其编码6xHis烟草靶斑病菌(Thanatephoruscucumeris)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002BF34B3，Uniprot参考号M5CHG9。
Seq ID No.738：密码子优化的DNA，其编码6xHis热纤黄孢菌(Hungateiclostridium thermocellum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000053581D，Uniprot参考号P14002。
Seq ID No.739：密码子优化的DNA，其编码6xHis Koribacter versatilis葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000D76A70，Uniprot参考号Q1IJ89。
Seq ID No.740：密码子优化的DNA，其编码6xHis Neosartorya fumigata葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00005203D8，Uniprot参考号Q4WLX5。
Seq ID No.741：密码子优化的DNA，其编码6xHis万古霉素拟无枝酸菌(Amycolatopsis vancoresmycina)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00032DB8C1，Uniprot参考号R1FKF0。
Seq ID No.742：密码子优化的DNA，其编码6xHis藤仓赤霉菌(Gibberellafujikuroi)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003519C76，Uniprot参考号S0EKU1。
Seq ID No.743：密码子优化的DNA，其编码6xHis长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000390F839，Uniprot参考号T2I2H5。
Seq ID No.744：密码子优化的DNA，其编码6xHis未培养的细菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003DFF0DA，Uniprot参考号W0FLD1。
Seq ID No.745：密码子优化的DNA，其编码6xHis木聚糖拟杆菌(Bacteroidesxylanisolvens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002D3D994，Uniprot参考号W6P9J9。
Seq ID No.746：密码子优化的DNA，其编码6xHis尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00042F8016，Uniprot参考号X0HA35。
Seq ID No.747：密码子优化的DNA，其编码6xHis两色高粱(Sorghum bicolor)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000A7F40，Uniprot参考号Q41290。
Seq ID No.748：密码子优化的DNA，其编码6xHis纤维素梭菌(Clostridiumcellulovorans)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000050B701，Uniprot参考号Q53EH2。
Seq ID No.749：密码子优化的DNA，其编码6xHis Dacryopinax primogenitus葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002C29EAA，Uniprot参考号M5G1U5。
Seq ID No.750：密码子优化的DNA，其编码6xHis放射根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000126913，Uniprot参考号P27034。
Seq ID No.751：密码子优化的DNA，其编码6xHis黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00006E0CC7，Uniprot参考号Q25BW5A。
Seq ID No.752：密码子优化的DNA，其编码6xHis成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000126905，Uniprot参考号Q59437。
Seq ID No.753：密码子优化的DNA，其编码6xHis微小念珠菌(Candidatusmicrothrix)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00033056C4，Uniprot参考号R4YWU4。
Seq ID No.754：密码子优化的DNA，其编码6xHis卡利德罗斯单胞菌(Chthonomonas calidirosea)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003427F29，Uniprot参考号S0ET37。
Seq ID No.755：密码子优化的DNA，其编码6xHis芸苔无色原体(Acholeplasmabrassicae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003B04208，Uniprot参考号U4KMR7。
Seq ID No.756：密码子优化的DNA，其编码6xHis多节哈尼亚菌(Chaniamultitudinisentens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003E13BD3，Uniprot参考号W0LJ28。
Seq ID No.757：密码子优化的DNA，其编码6xHis串珠状赤霉菌(Gibberellamoniliformis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003ECCF80，Uniprot参考号W7MW98。
Seq ID No.758：密码子优化的DNA，其编码6xHis尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0004305856，Uniprot参考号X0I2U8。
Seq ID No.759：密码子优化的DNA，其编码6xHis黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00006E0CC7，Uniprot参考号Q25BW5B。
Seq ID No.760：密码子优化的DNA，其编码6xHis黑麦(Secale cereale)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000A7EFC，Uniprot参考号Q9FYS3。
Seq ID No.761：密码子优化的DNA，其编码6xHis冈氏缺氧杆菌(Anoxybacillusgonensis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002C0273E，Uniprot参考号M5QUM2。
Seq ID No.762：密码子优化的DNA，其编码6xHis海栖热袍菌(Thermotogamaritima)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000126906，Uniprot参考号Q08638A。
Seq ID No.763：密码子优化的DNA，其编码6xHis深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00003C2ACC，Uniprot参考号Q2RP51。
Seq ID No.764：密码子优化的DNA，其编码6xHis那不勒斯栖热孢(Thermotoganeapolitana)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000B9013，Uniprot参考号Q60038。
Seq ID No.765：密码子优化的DNA，其编码6xHis微小念珠菌(Candidatusmicrothrix)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00032F466E，Uniprot参考号R4Z6M6。
Seq ID No.766：密码子优化的DNA，其编码6xHis绒毛瘤胃梭菌(Ruminiclostridium cellobioparum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00032874EC，Uniprot参考号S0FPI8。
Seq ID No.767：密码子优化的DNA，其编码6xHis芸苔无色原体(Acholeplasmabrassicae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003B0490C，Uniprot参考号U4KMV4。
Seq ID No.768：密码子优化的DNA，其编码6xHis肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003DB6EFD，Uniprot参考号W1BBP5。
Seq ID No.769：密码子优化的DNA，其编码6xHis Enterobacter sp。葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003ED0A8E，Uniprot参考号W7P6Y1。
Seq ID No.770：密码子优化的DNA，其编码6xHis立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00045BB507，Uniprot参考号X8JI88。
Seq ID No.771：密码子优化的DNA，其编码6xHis智人(Homo sapiens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000072C73，Uniprot参考号Q9H227。
Seq ID No.772：密码子优化的DNA，其编码6xHis未培养的细菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000DD5304，Uniprot参考号Q0GMU3。
Seq ID No.773：密码子优化的DNA，其编码6xHis嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002CA9E4F，Uniprot参考号M8CQD9。
Seq ID No.774：密码子优化的DNA，其编码6xHis橙色豆状金属菌(Stigmatellaaurantiaca)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000E297D8，Uniprot参考号Q091M8。
Seq ID No.775：密码子优化的DNA，其编码6xHis泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderia thailandensis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00006676B1，Uniprot参考号Q2T7C9。
Seq ID No.776：密码子优化的DNA，其编码6xHis假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000426E8F，Uniprot参考号Q665S2。
Seq ID No.777：密码子优化的DNA，其编码6xHis Togninia minima葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00032BF71F，Uniprot参考号R8BQM8。
Seq ID No.778：密码子优化的DNA，其编码6xHis线嘴壳(Ophiostoma piceae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00035213C2，Uniprot参考号S3BVJ8。
Seq ID No.779：密码子优化的DNA，其编码6xHis烧土火丝菌(Pyronemaomphalodes)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003B117B7，Uniprot参考号U4LIL3。
Seq ID No.780：密码子优化的DNA，其编码6xHis Ogataea parapolymorpha葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001F76D1F，Uniprot参考号W1QIW0。
Seq ID No.781：密码子优化的DNA，其编码6xHis瑞士膜壳杆菌(Hymenobacterswuensis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003F2059F，Uniprot参考号W8F6U0。
Seq ID No.782：密码子优化的DNA，其编码6xHis约翰逊黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00006E8E1B，Uniprot参考号A5FEF5。
Seq ID No.783：密码子优化的DNA，其编码6xHis多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000012690B，Uniprot参考号P22505。
Seq ID No.784：密码子优化的DNA，其编码6xHis水稻(Oryza sativa)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000009D014，Uniprot参考号Q8L7J2。
Seq ID No.785：密码子优化的DNA，其编码6xHis水稻(Oryza sativa)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000E580F2，Uniprot参考号B8AVF0。
Seq ID No.786：密码子优化的DNA，其编码6xHis微绿球藻(Nannochloris)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000EA7F16F，Uniprot参考号A0A452CSM4。
Seq ID No.787：密码子优化的DNA，其编码6xHis盐嗜丝菌(Halothermothrixorenii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00006AE508，Uniprot参考号B8CYA8。
Seq ID No.788：密码子优化的DNA，其编码6xHis粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000018B2B4，Uniprot参考号Q7RWP2。
Seq ID No.789：密码子优化的DNA，其编码6xHis南极微球菌(Micrococcusantarcticus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000192BB5F，Uniprot参考号B9V8P5。
Seq ID No.790：密码子优化的DNA，其编码6xHis南极微小杆菌(Exiguobacteriumantarcticum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000285E79E，Uniprot参考号K0A8J9。
Seq ID No.791：密码子优化的DNA，其编码6xHis嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000BEB61，Uniprot参考号Q9RA61。
Seq ID No.792：密码子优化的DNA，其编码6xHis哈茨木霉(Trichodermaharzianum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00078BF747，Uniprot参考号A0A2T4AR08。
Seq ID No.793：密码子优化的DNA，其编码6xHis红褐肉座菌(Hypocreajecorina)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000006AA61，Uniprot参考号Q12715。
Seq ID No.794：密码子优化的DNA，其编码6xHis链霉菌属物种(Streptomycessp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000B411B，Uniprot参考号Q59976。
Seq ID No.795：密码子优化的DNA，其编码6xHis酿脓链球菌葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000C7E56，Uniprot参考号Q99YP9。
Seq ID No.796：密码子优化的DNA，其编码6xHis白车轴草(Trifolium repens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000012691B，Uniprot参考号P26205。
Seq ID No.797：密码子优化的DNA，其编码6xHis埃默森篮状菌(Talaromycesemersonii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000006C8FF，Uniprot参考号Q8TGI8。
Seq ID No.798：密码子优化的DNA，其编码6xHis热纤黄孢菌(Hungateiclostridium thermocellum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000126903，Uniprot参考号P26208。
Seq ID No.799：密码子优化的DNA，其编码6xHis植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000219FE3E，Uniprot参考号F9ULH8。
Seq ID No.800：密码子优化的DNA，其编码6xHis根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003F2033A，Uniprot参考号A0A2I4PGZ0。
Seq ID No.801：以下的氨基酸序列：放射形双歧杆菌(Bifidobacteriumactinocoloniiforme)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000503B26C，Uniprot参考号A0A086YYS8。
Seq ID No.802：以下的氨基酸序列：嗜冷双歧杆菌(Bifidobacteriumpsychraerophilum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000502B461，Uniprot参考号A0A087CD28。
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Seq ID No.864：以下的氨基酸序列：壳多孢属物种(Stagonospora sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0007CECAD5，Uniprot参考号A0A178AER7。
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Seq ID No.868：以下的氨基酸序列：嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00018152EB，Uniprot参考号B5YC96。
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Seq ID No.870：以下的氨基酸序列：星状双歧杆菌(Bifidobacteriumasteroides)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00028BB1B6，Uniprot参考号K4IPD2。
Seq ID No.871：以下的氨基酸序列：Dactylellina haptotyla葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00035AE576，Uniprot参考号S8BQ60。
Seq ID No.872：以下的氨基酸序列：尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003F2D7DD，Uniprot参考号W9JF54。
Seq ID No.873：以下的氨基酸序列：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0005067FF9，Uniprot参考号A0A087BRY2。
Seq ID No.874：以下的氨基酸序列：苏密斯双岐杆菌(Bifidobacteriumtsurumiense)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0004105550，Uniprot参考号A0A087EK01。
Seq ID No.875：以下的氨基酸序列：棘状外瓶霉(Exophiala spinifera)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0005BF9DF9，Uniprot参考号A0A0D1YG50。
Seq ID No.876：以下的氨基酸序列：棘壳孢属物种(Pyrenochaeta sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0007CE7DBA，Uniprot参考号A0A178E5I1。
Seq ID No.877：以下的氨基酸序列：厚壁菌门细菌(Firmicutes bacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009CDA3F1，Uniprot参考号A0A1V6FLK2。
Seq ID No.878：以下的氨基酸序列：Cadophora sp.葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D5A9E68，Uniprot参考号A0A2V1B599。
Seq ID No.879：以下的氨基酸序列：尖顶羊肚菌(Morchella conica)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000F7330CD，Uniprot参考号A0A3N4L4M3。
Seq ID No.880：以下的氨基酸序列：动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000189C68F，Uniprot参考号B8DV42。
Seq ID No.881：以下的氨基酸序列：氮营养密螺旋体(Treponemaazotonutricium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00020ED2C9，Uniprot参考号F5YGD5。
Seq ID No.882：以下的氨基酸序列：嗜酸丙酸杆菌(Acidipropionibacteriumacidipropionici)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002988429，Uniprot参考号K7S0E5。
Seq ID No.883：以下的氨基酸序列：Salinispira pacifica葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003D93613，Uniprot参考号V5WNB6。
Seq ID No.884：以下的氨基酸序列：蒙古双歧杆菌(Bifidobacteriummongoliense)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000503588E，Uniprot参考号A0A087C760。
Seq ID No.885：以下的氨基酸序列：印度双歧杆菌(Bifidobacterium indicum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000499F5D1，Uniprot参考号A0A087VUW4。
Seq ID No.886：以下的氨基酸序列：短螺旋体(Brachyspira suanatina)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000659257F，Uniprot参考号A0A0G4K5C2。
Seq ID No.887：以下的氨基酸序列：Phialocephala scopiformis葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0007F2FD44，Uniprot参考号A0A194X8Q9。
Seq ID No.888：以下的氨基酸序列：未培养的微杆菌属物种)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000A2BB4A5，Uniprot参考号A0A1Y5P895。
Seq ID No.889：以下的氨基酸序列：大松针周孢霉(Periconia macrospinosa)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D5BC9BD，Uniprot参考号A0A2V1E673。
Seq ID No.890：以下的氨基酸序列：溃疡节杆菌(Arthrobacterulcerisalmonis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000F3DC30B，Uniprot参考号A0A3P5WTE2。
Seq ID No.891：以下的氨基酸序列：氯酚假单胞菌(Pseudarthrobacterchlorophenolicus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001664880，Uniprot参考号B8H9A2。
Seq ID No.892：以下的氨基酸序列：Haloplasma contractile葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002120C63，Uniprot参考号F7PUF3。
Seq ID No.893：以下的氨基酸序列：异旋孢腔菌(Cochliobolusheterostrophus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002B73341，Uniprot参考号M2ULB2。
Seq ID No.894：以下的氨基酸序列：微杆菌属物种(Microbacterium sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003DE58EA，Uniprot参考号W0Z818。
Seq ID No.895：密码子优化的DNA，其编码6xHis放射形双歧杆菌(Bifidobacterium actinocoloniiforme)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000503B26C，Uniprot参考号A0A086YYS8。
Seq ID No.896：密码子优化的DNA，其编码6xHis嗜冷双歧杆菌(Bifidobacteriumpsychraerophilum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000502B461，Uniprot参考号A0A087CD28。
Seq ID No.897：密码子优化的DNA，其编码6xHis柑橘青霉菌(Penicilliumitalicum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00052B8681，Uniprot参考号A0A0A2K704。
Seq ID No.898：密码子优化的DNA，其编码6xHis单端孢微杆菌(Microbacteriumtrichothecenolyticum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0005ED0AE6，Uniprot参考号A0A0M2HDB3。
Seq ID No.899：密码子优化的DNA，其编码6xHis未培养的梭菌属物种葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0008206F38，Uniprot参考号A0A1C6I6A3。
Seq ID No.900：密码子优化的DNA，其编码6xHis Bifiguratus adelaidae葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000BC57319，Uniprot参考号A0A261Y7Q8。
Seq ID No.901：密码子优化的DNA，其编码6xHis硫胺素类芽孢杆菌(Paenibacillus thiaminolyticus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000B3B73CD，Uniprot参考号A0A378ZIK3。
Seq ID No.902：密码子优化的DNA，其编码6xHis豆科植物微杆菌(Microbacterium lemovicicum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000F8FB9BA，Uniprot参考号A0A3S9WE68。
Seq ID No.903：密码子优化的DNA，其编码6xHis红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019923DC，Uniprot参考号C1A1N4。
Seq ID No.904：密码子优化的DNA，其编码6xHis Cutibacterium avidum葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00022C19B5，Uniprot参考号G4CZU8。
Seq ID No.905：密码子优化的DNA，其编码6xHis密歇根棒状杆菌(Clavibactermichiganensis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002C5A938，Uniprot参考号M5BD10。
Seq ID No.906：密码子优化的DNA，其编码6xHis微杆菌属物种(Microbacteriumsp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003DE3509，Uniprot参考号W0ZC23。
Seq ID No.907：密码子优化的DNA，其编码6xHis放射形双歧杆菌(Bifidobacterium actinocoloniiforme)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000507F38A，Uniprot参考号A0A086YZL4。
Seq ID No.908：密码子优化的DNA，其编码6xHis罗伊双歧杆菌(Bifidobacteriumreuteri)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000506119A，Uniprot参考号A0A087CR26。
Seq ID No.909：密码子优化的DNA，其编码6xHis费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0005A5CAC2，Uniprot参考号A0A0A8RX48。
Seq ID No.910：密码子优化的DNA，其编码6xHis烃氧微杆菌(Microbacteriumhydrocarbonoxydans)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0005EC18F9，Uniprot参考号A0A0M2HRU0。
Seq ID No.911：密码子优化的DNA，其编码6xHis假诺卡氏菌属物种(Pseudonocardia sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00094B6D3B，Uniprot参考号A0A1Q8KSV8。
Seq ID No.912：密码子优化的DNA，其编码6xHis夏块菌(Tuber aestivum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000BC13DF0，Uniprot参考号A0A292PKV5。
Seq ID No.913：密码子优化的DNA，其编码6xHis澳大利亚丙酸杆菌(Propionibacterium australiense)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000E5B4EA5，Uniprot参考号A0A383S7A9。
Seq ID No.914：密码子优化的DNA，其编码6xHis镰刀菌属物种(Fusarium sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI001004B2C9，Uniprot参考号A0A428T6E2。
Seq ID No.915：密码子优化的DNA，其编码6xHis鞭毛藻丛赤壳菌(Nectriahaematococca)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001B69B5C，Uniprot参考号C7ZBV0。
Seq ID No.916：密码子优化的DNA，其编码6xHis游动放线菌属物种(Actinoplanes sp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00023EBB15，Uniprot参考号G8S3E7。
Seq ID No.917：密码子优化的DNA，其编码6xHis极暗黄链霉菌(Streptomycesfulvissimus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003289BC6，Uniprot参考号N0CMW2。
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Seq ID No.927：密码子优化的DNA，其编码6xHis圆柱状核盘菌(Pyrenophorateres)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001ECDCBD，Uniprot参考号E3RFS2。
Seq ID No.928：密码子优化的DNA，其编码6xHis多异戊二烯戈登氏菌(Gordoniapolyisoprenivorans)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00024F2A26，Uniprot参考号H6MTQ7。
Seq ID No.929：密码子优化的DNA，其编码6xHis橙色豆状金属菌(Stigmatellaaurantiaca)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000E28E5D，Uniprot参考号Q08S21。
Seq ID No.930：密码子优化的DNA，其编码6xHis无花果拟盘多毛孢(Pestalotiopsis fici)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003E03A52，Uniprot参考号W3WZ03。
Seq ID No.931：密码子优化的DNA，其编码6xHis大双歧杆菌(Bifidobacteriummagnum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003B7B6EE，Uniprot参考号A0A087BEN9。
Seq ID No.932：密码子优化的DNA，其编码6xHis斯氏双歧杆菌(Bifidobacteriumstellenboschense)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000503F283，Uniprot参考号A0A087DFL8。
Seq ID No.933：密码子优化的DNA，其编码6xHis淡色生赤壳菌(Bionectriaochroleuca)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00059673EE，Uniprot参考号A0A0B7K316。
Seq ID No.934：密码子优化的DNA，其编码6xHis Hungatella hathewayi葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006C069F3，Uniprot参考号A0A174LVE3。
Seq ID No.935：密码子优化的DNA，其编码6xHis克雷伯罗科尼霉菌(Mycetocolareblochoni)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00097EB800，Uniprot参考号A0A1R4J2F9。
Seq ID No.936：密码子优化的DNA，其编码6xHis野野村菌属物种(Nonomuraeasp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009ABD7B3，Uniprot参考号A0A2P9IX34。
Seq ID No.937：密码子优化的DNA，其编码6xHis Coleophoma crateriformis葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000E391DF6，Uniprot参考号A0A3D8T9C2。
Seq ID No.938：密码子优化的DNA，其编码6xHis金黄色拟节杆菌(Paenarthrobacter aurescens)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000EC83AE，Uniprot参考号A1R2K1。
Seq ID No.939：密码子优化的DNA，其编码6xHis刚毛北里孢菌(Kitasatosporasetae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001F21F08，Uniprot参考号E4N4F6。
Seq ID No.940：密码子优化的DNA，其编码6xHis阿尔巴拟诺卡氏菌(Nocardiopsis alba)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00027E251E，Uniprot参考号J7L3Z8。
Seq ID No.941：密码子优化的DNA，其编码6xHis约氏红球菌(Rhodococcusjostii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000DBA338，Uniprot参考号Q0SCI4。
Seq ID No.942：密码子优化的DNA，其编码6xHis未培养的微生物)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003EC942D，Uniprot参考号W5X324。
Seq ID No.943：密码子优化的DNA，其编码6xHis墨西卡姆双岐杆菌(Bifidobacterium merycicum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0005084B63，Uniprot参考号A0A087BJ88。
Seq ID No.944：密码子优化的DNA，其编码6xHis斯氏双歧杆菌(Bifidobacteriumscardovii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0005018B5B，Uniprot参考号A0A087DGT3。
Seq ID No.945：密码子优化的DNA，其编码6xHis尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00021EC81E，Uniprot参考号A0A0C4DJL4。
Seq ID No.946：密码子优化的DNA，其编码6xHis Paraphaeosphaeria sporulosa葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0007CE199C，Uniprot参考号A0A177BXH1。
Seq ID No.947：密码子优化的DNA，其编码6xHis米状梭菌(Clostridium oryzae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009A50F8D，Uniprot参考号A0A1V4IY77。
Seq ID No.948：密码子优化的DNA，其编码6xHis卡西科拉棒孢霉(Corynesporacassiicola)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D22F5EB，Uniprot参考号A0A2T2N4T6。
Seq ID No.949：密码子优化的DNA，其编码6xHis静脉绒毛菌(Choiromycesvenosus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000F7332F8，Uniprot参考号A0A3N4J9R6。
Seq ID No.950：密码子优化的DNA，其编码6xHis红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000F550EC，Uniprot参考号A4F982。
Seq ID No.951：密码子优化的DNA，其编码6xHis委内瑞拉链霉菌(Streptomycesvenezuelae)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000204906E，Uniprot参考号F2R0Y2。
Seq ID No.952：密码子优化的DNA，其编码6xHis节杆菌属物种(Arthrobactersp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00027DFDB0，Uniprot参考号J7LVB1。
Seq ID No.953：密码子优化的DNA，其编码6xHis Thermobrachium celere葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00033420CB，Uniprot参考号R7RMQ6。
Seq ID No.954：密码子优化的DNA，其编码6xHis狭窄德雷克斯勒菌(Drechslerella stenobrocha)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003EA65B9，Uniprot参考号W7HT93。
Seq ID No.955：密码子优化的DNA，其编码6xHis最小双歧杆菌(Bifidobacteriumminimum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003B38542，Uniprot参考号A0A087BMR5。
Seq ID No.956：密码子优化的DNA，其编码6xHis嗜热双歧杆菌(Bifidobacteriumthermacidophilum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000409825E，Uniprot参考号A0A087E3K8。
Seq ID No.957：密码子优化的DNA，其编码6xHis Verruconis gallopava葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0005C0229F，Uniprot参考号A0A0D1X9G0。
Seq ID No.958：密码子优化的DNA，其编码6xHis壳多孢属物种(Stagonosporasp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0007CECAD5，Uniprot参考号A0A178AER7。
Seq ID No.959：密码子优化的DNA，其编码6xHis厚壁菌门细菌(Firmicutesbacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009D58C49，Uniprot参考号A0A1V6ALF9。
Seq ID No.960：密码子优化的DNA，其编码6xHis波氏块菌(Tuber borchii)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D50EED1，Uniprot参考号A0A2T6ZNU7。
Seq ID No.961：密码子优化的DNA，其编码6xHis尖顶羊肚菌(Morchella conica)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000F728167，Uniprot参考号A0A3N4KUR3。
Seq ID No.962：密码子优化的DNA，其编码6xHis嗜热网球菌(Dictyoglomusthermophilum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00018152EB，Uniprot参考号B5YC96。
Seq ID No.963：密码子优化的DNA，其编码6xHis积磷小月菌(Microlunatusphosphovorus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000210C01C，Uniprot参考号F5XL24。
Seq ID No.964：密码子优化的DNA，其编码6xHis星状双歧杆菌(Bifidobacteriumasteroides)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00028BB1B6，Uniprot参考号K4IPD2。
Seq ID No.965：密码子优化的DNA，其编码6xHis Dactylellina haptotyla葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00035AE576，Uniprot参考号S8BQ60。
Seq ID No.966：密码子优化的DNA，其编码6xHis尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003F2D7DD，Uniprot参考号W9JF54。
Seq ID No.967：密码子优化的DNA，其编码6xHis长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0005067FF9，Uniprot参考号A0A087BRY2。
Seq ID No.968：密码子优化的DNA，其编码6xHis苏密斯双岐杆菌(Bifidobacterium tsurumiense)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0004105550，Uniprot参考号A0A087EK01。
Seq ID No.969：密码子优化的DNA，其编码6xHis棘状外瓶霉(Exophialaspinifera)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0005BF9DF9，Uniprot参考号A0A0D1YG50。
Seq ID No.970：密码子优化的DNA，其编码6xHis棘壳孢属物种(Pyrenochaetasp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0007CE7DBA，Uniprot参考号A0A178E5I1。
Seq ID No.971：密码子优化的DNA，其编码6xHis厚壁菌门细菌(Firmicutesbacterium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0009CDA3F1，Uniprot参考号A0A1V6FLK2。
Seq ID No.972：密码子优化的DNA，其编码6xHis Cadophora sp.葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D5A9E68，Uniprot参考号A0A2V1B599。
Seq ID No.973：密码子优化的DNA，其编码6xHis尖顶羊肚菌(Morchella conica)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000F7330CD，Uniprot参考号A0A3N4L4M3。
Seq ID No.974：密码子优化的DNA，其编码6xHis动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000189C68F，Uniprot参考号B8DV42。
Seq ID No.975：密码子优化的DNA，其编码6xHis氮营养密螺旋体(Treponemaazotonutricium)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI00020ED2C9，Uniprot参考号F5YGD5。
Seq ID No.976：密码子优化的DNA，其编码6xHis嗜酸丙酸杆菌(Acidipropionibacterium acidipropionici)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002988429，Uniprot参考号K7S0E5。
Seq ID No.977：密码子优化的DNA，其编码6xHis Salinispira pacifica葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003D93613，Uniprot参考号V5WNB6。
Seq ID No.978：密码子优化的DNA，其编码6xHis蒙古双歧杆菌(Bifidobacteriummongoliense)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000503588E，Uniprot参考号A0A087C760。
Seq ID No.979：密码子优化的DNA，其编码6xHis印度双歧杆菌(Bifidobacteriumindicum)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000499F5D1，Uniprot参考号A0A087VUW4。
Seq ID No.980：密码子优化的DNA，其编码6xHis短螺旋体(Brachyspirasuanatina)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000659257F，Uniprot参考号A0A0G4K5C2。
Seq ID No.981：密码子优化的DNA，其编码6xHis Phialocephala scopiformis葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0007F2FD44，Uniprot参考号A0A194X8Q9。
Seq ID No.982：密码子优化的DNA，其编码6xHis未培养的微杆菌属物种)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000A2BB4A5，Uniprot参考号A0A1Y5P895。
Seq ID No.983：密码子优化的DNA，其编码6xHis大松针周孢霉(Periconiamacrospinosa)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000D5BC9BD，Uniprot参考号A0A2V1E673。
Seq ID No.984：密码子优化的DNA，其编码6xHis溃疡节杆菌(Arthrobacterulcerisalmonis)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI000F3DC30B，Uniprot参考号A0A3P5WTE2。
Seq ID No.985：密码子优化的DNA，其编码6xHis氯酚假单胞菌(Pseudarthrobacter chlorophenolicus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001664880，Uniprot参考号B8H9A2。
Seq ID No.986：密码子优化的DNA，其编码6xHis Haloplasma contractile葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002120C63，Uniprot参考号F7PUF3。
Seq ID No.987：密码子优化的DNA，其编码6xHis异旋孢腔菌(Cochliobolusheterostrophus)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002B73341，Uniprot参考号M2ULB2。
Seq ID No.988：密码子优化的DNA，其编码6xHis微杆菌属物种(Microbacteriumsp.)葡萄糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003DE58EA，Uniprot参考号W0Z818。
Seq ID No.989：以下的氨基酸序列：海洋红嗜热菌(Rhodothermus marinus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001A31108，Uniprot参考号D0MFR0。
Seq ID No.990：以下的氨基酸序列：冰城链霉菌(Streptomycesbingchenggensis)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001D90BFE，Uniprot参考号D7C463。
Seq ID No.991：以下的氨基酸序列：舌螺旋体(Spirosoma linguale)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001A3AEAC，Uniprot参考号D2QL60。
Seq ID No.992：以下的氨基酸序列：肠罗氏菌(Roseburia intestinalis)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001CD6D48，Uniprot参考号D4L2K8。
Seq ID No.993：以下的氨基酸序列：东方龙杆菌(Draconibacterium orientale)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000442EF22，Uniprot参考号X5DG83。
Seq ID No.994：以下的氨基酸序列：嗜酸链孢菌(Catenulispora acidiphila)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019E052B，Uniprot参考号C7QC24。
Seq ID No.995：以下的氨基酸序列：多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000005ADE1，Uniprot参考号Q8A916。
Seq ID No.996：以下的氨基酸序列：Opitutus terrae鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000172B2E3，Uniprot参考号B1ZRE4。
Seq ID No.997：以下的氨基酸序列：植物发酵乳酸杆菌(Lachnoclostridiumphytofermentans)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00015FE0BE，Uniprot参考号A9KJP8。
Seq ID No.998：以下的氨基酸序列：脱氮罗丹杆菌(Rhodanobacterdenitrificans)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00022DA3ED，Uniprot参考号M4NH01。
Seq ID No.999：以下的氨基酸序列：栖瘤胃普雷沃菌(Prevotella ruminicola)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001D07633，Uniprot参考号D5ETD9。
Seq ID No.1000：以下的氨基酸序列：土曲霉(Aspergillus terreus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000259E388，Uniprot参考号I0AZ41。
Seq ID No.1001：以下的氨基酸序列：粪短杆菌(Brachybacterium faecium)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001A461B6，Uniprot参考号C7MA58。
Seq ID No.1002：以下的氨基酸序列：约翰逊黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00006E4A0D，Uniprot参考号A5FCH3。
Seq ID No.1003：以下的氨基酸序列：水生拉奈拉菌(Rahnella aquatilis)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000245C507，Uniprot参考号H2IYR2。
Seq ID No.1004：以下的氨基酸序列：莫卡拉本双歧杆菌(Bifidobacteriummoukalabense)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003E4E711，Uniprot参考号W4N6H0。
Seq ID No.1005：以下的氨基酸序列：铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000353BD9F，Uniprot参考号S4BBS9。
Seq ID No.1006：以下的氨基酸序列：土芽孢杆菌属物种(Geobacillus sp.)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001789C0D，Uniprot参考号D3EED1。
Seq ID No.1007：以下的氨基酸序列：海洋贫养杆菌鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000260A2FE，Uniprot参考号I4EYD9。
Seq ID No.1008：以下的氨基酸序列：肝素足杆菌(Pedobacter heparinus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019EF0EE，Uniprot参考号C6XYM6。
Seq ID No.1009：以下的氨基酸序列：发酵双杆菌(Dyadobacter fermentans)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019B5915，Uniprot参考号C6VZL3。
Seq ID No.1010：以下的氨基酸序列：胶质类芽孢杆菌(Paenibacillusmucilaginosus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000212C156，Uniprot参考号F8FQQ3。
Seq ID No.1011：以下的氨基酸序列：类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus sp.)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003E2544D，Uniprot参考号W4D866。
Seq ID No.1012：以下的氨基酸序列：多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000005ADD2，Uniprot参考号A0A0P0FM19。
Seq ID No.1013：以下的氨基酸序列：橙色氯雷弗氏菌(Chloroflexusaurantiacus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00005BA60B，Uniprot参考号A9WDK5。
Seq ID No.1014：以下的氨基酸序列：粪热球菌(Thermoclostridiumstercorarium)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000B098C，Uniprot参考号Q9S3L0。
Seq ID No.1015：以下的氨基酸序列：莫卡拉本双歧杆菌(Bifidobacteriummoukalabense)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003E5C314，Uniprot参考号W4N6I2。
Seq ID No.1016：以下的氨基酸序列：多发寡源杆菌(Olsenella profusa)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003AE032C，Uniprot参考号U2USP4。
Seq ID No.1017：以下的氨基酸序列：黄色克雷伯菌(Kribbella flavida)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019BDB13，Uniprot参考号D2PMT5。
Seq ID No.1018：以下的氨基酸序列：弧菌茎杆菌(Caulobacter vibrioides)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000C7226，Uniprot参考号Q9A9K2。
Seq ID No.1019：以下的氨基酸序列：多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000005BA09，Uniprot参考号Q8A076。
Seq ID No.1020：以下的氨基酸序列：Rhodonellum psychrophilum鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003745394，Uniprot参考号U5BUY4。
Seq ID No.1021：以下的氨基酸序列：类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus sp.)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0004F6D660，Uniprot参考号A0A089M3T2。
Seq ID No.1022：以下的氨基酸序列：琼脂链状菌(Catenovulum agarivorans)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003ED860D，Uniprot参考号W7QMH5。
Seq ID No.1023：以下的氨基酸序列：食半乳佐贝氏菌(Zobelliagalactanivorans)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000217D8B1，Uniprot参考号G0L382。
Seq ID No.1024：以下的氨基酸序列：多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000005B845，Uniprot参考号Q8A1H5。
Seq ID No.1025：以下的氨基酸序列：木聚糖拟杆菌(Bacteroidesxylanisolvens)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001CD02E9，Uniprot参考号D6CYE5。
Seq ID No.1026：以下的氨基酸序列：氯酚假单胞菌(Pseudarthrobacterchlorophenolicus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00018E07C6，Uniprot参考号B8HAH3。
Seq ID No.1027：以下的氨基酸序列：嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001815896，Uniprot参考号B5YC64。
Seq ID No.1028：以下的氨基酸序列：Formosa agariphila鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00039231C1，Uniprot参考号T2KPL4。
Seq ID No.1029：以下的氨基酸序列：约氏红球菌(Rhodococcus jostii)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000DBA6EB，Uniprot参考号Q0S9T4。
Seq ID No.1030：以下的氨基酸序列：卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001D10896，Uniprot参考号D5GZ45。
Seq ID No.1031：以下的氨基酸序列：肝素足杆菌(Pedobacter heparinus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001B17DE6，Uniprot参考号C6XVU2。
Seq ID No.1032：以下的氨基酸序列：舌螺旋体(Spirosoma linguale)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001A3C989，Uniprot参考号D2QUA5。
Seq ID No.1033：以下的氨基酸序列：肝素足杆菌(Pedobacter heparinus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019EE3EB，Uniprot参考号C6XU05。
Seq ID No.1034：以下的氨基酸序列：胶质类芽孢杆菌(Paenibacillusmucilaginosus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003432C11，Uniprot参考号R9ULQ4。
Seq ID No.1035：以下的氨基酸序列：分离茎杆菌(Caulobacter segnis)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001BC0C05，Uniprot参考号D5VGD9。
Seq ID No.1036：以下的氨基酸序列：纤维质拟杆菌(Bacteroidescellulosilyticus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001969377，Uniprot参考号E2N9B1。
Seq ID No.1037：以下的氨基酸序列：肝素足杆菌(Pedobacter heparinus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001B17C60，Uniprot参考号C6Y153。
Seq ID No.1038：以下的氨基酸序列：Formosa agariphila鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000571C0C2，Uniprot参考号T2KNB2。
Seq ID No.1039：以下的氨基酸序列：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00004C6D41，Uniprot参考号Q5FJ31。
Seq ID No.1040：以下的氨基酸序列：Rhodopirellula baltica鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00001AC07D，Uniprot参考号Q7UYD5。
Seq ID No.1041：以下的氨基酸序列：Frankia inefficax鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001BF9A6C，Uniprot参考号E3IY10。
Seq ID No.1042：以下的氨基酸序列：阿氟曼链霉菌(Streptomyces scabiei)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001B7FF91，Uniprot参考号C9Z376。
Seq ID No.1043：以下的氨基酸序列：约翰逊黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00006E5F74，Uniprot参考号A5FC22。
Seq ID No.1044：以下的氨基酸序列：链霉菌属物种(Streptomyces sp.)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00034E666D，Uniprot参考号S2YWB5。
Seq ID No.1045：以下的氨基酸序列：荚膜酸杆菌(Acidobacterium capsulatum)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000198DF25，Uniprot参考号C1F149。
Seq ID No.1046：以下的氨基酸序列：琼脂链状菌(Catenovulum agarivorans)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003ED82D3，Uniprot参考号W7QYP5。
Seq ID No.1047：以下的氨基酸序列：粪短杆菌(Brachybacterium faecium)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001A461B7，Uniprot参考号C7MA59。
Seq ID No.1048：以下的氨基酸序列：产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000243A177，Uniprot参考号A0A0J9X262。
Seq ID No.1049：以下的氨基酸序列：皮氏几丁质菌(Chitinophaga pinensis)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001B24769，Uniprot参考号C7PA70。
Seq ID No.1050：以下的氨基酸序列：波特罗链霉菌(Streptomycesbottropensis)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002BCAF6B，Uniprot参考号M3FYL9。
Seq ID No.1051：以下的氨基酸序列：变异罕见小球菌(Subdoligranulumvariabile)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001966B28，Uniprot参考号D1PKC7。
Seq ID No.1052：以下的氨基酸序列：外壳微杆菌(Microbacterium testaceum)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001F8A51D，Uniprot参考号E8NDD8。
Seq ID No.1053：以下的氨基酸序列：Solibacter usitatus鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000053767B，Uniprot参考号Q01V09。
Seq ID No.1054：以下的氨基酸序列：玫瑰色链孢囊菌(Streptosporangiumroseum)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001A3EFE6，Uniprot参考号D2B240。
Seq ID No.1055：以下的氨基酸序列：α变形杆菌)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006CE1E82，Uniprot参考号A0A0N1BME3。
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Seq ID No.1057：以下的氨基酸序列：古氏副拟杆菌(Parabacteroidesgoldsteinii)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002CB9583，Uniprot参考号S0GSF0。
Seq ID No.1058：以下的氨基酸序列：海洋环杆菌(Cyclobacterium marinum)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00021B9B33，Uniprot参考号G0J630。
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Seq ID No.1060：以下的氨基酸序列：Lunatimonas lonarensis鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00032D8F6D，Uniprot参考号R7ZW70。
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Seq ID No.1063：以下的氨基酸序列：狄氏副拟杆菌(Parabacteroidesdistasonis)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000156F115，Uniprot参考号A6LBL4。
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Seq ID No.1072：以下的氨基酸序列：黄色克雷伯菌(Kribbella flavida)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019BFABB，Uniprot参考号D2PXQ4。
Seq ID No.1073：以下的氨基酸序列：阿氟曼链霉菌(Streptomyces scabiei)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001B80091，Uniprot参考号C9Z391。
Seq ID No.1074：以下的氨基酸序列：游动放线菌属物种(Actinoplanes sp.)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00023EC5D1，Uniprot参考号G8S540。
Seq ID No.1075：以下的氨基酸序列：不粘柄菌属物种(Asticcacaulis sp.)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003C3CD2B，Uniprot参考号V4NSJ1。
Seq ID No.1076：以下的氨基酸序列：黄色克雷伯菌(Kribbella flavida)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019BF65D，Uniprot参考号D2PT74。
Seq ID No.1077：以下的氨基酸序列：芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000BC760，Uniprot参考号Q93RE7。
Seq ID No.1078：以下的氨基酸序列：约翰逊黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00006E5FAB，Uniprot参考号A5FCG3。
Seq ID No.1079：以下的氨基酸序列：Lunatimonas lonarensis鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00032EEB9C，Uniprot参考号R7ZS84。
Seq ID No.1080：以下的氨基酸序列：马西艾森伯格菌(Eisenbergiellamassiliensis)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0004B2D794，Uniprot参考号A0A3E3IGR6。
Seq ID No.1081：以下的氨基酸序列：琼脂链状菌(Catenovulum agarivorans)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003ED7515，Uniprot参考号W7QF25。
Seq ID No.1083：密码子优化的DNA，其编码6xHis海洋红嗜热菌(Rhodothermusmarinus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001A31108，Uniprot参考号D0MFR0。
Seq ID No.1084：密码子优化的DNA，其编码6xHis冰城链霉菌(Streptomycesbingchenggensis)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001D90BFE，Uniprot参考号D7C463。
Seq ID No.1085：密码子优化的DNA，其编码6xHis舌螺旋体(Spirosomalinguale)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001A3AEAC，Uniprot参考号D2QL60。
Seq ID No.1086：密码子优化的DNA，其编码6xHis肠罗氏菌(Roseburiaintestinalis)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001CD6D48，Uniprot参考号D4L2K8。
Seq ID No.1087：密码子优化的DNA，其编码6xHis东方龙杆菌(Draconibacteriumorientale)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000442EF22，Uniprot参考号X5DG83。
Seq ID No.1088：密码子优化的DNA，其编码6xHis嗜酸链孢菌(Catenulisporaacidiphila)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019E052B，Uniprot参考号C7QC24。
Seq ID No.1089：密码子优化的DNA，其编码6xHis多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000005ADE1，Uniprot参考号Q8A916。
Seq ID No.1090：密码子优化的DNA，其编码6xHis Opitutus terrae鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000172B2E3，Uniprot参考号B1ZRE4。
Seq ID No.1091：密码子优化的DNA，其编码6xHis植物发酵乳酸杆菌(Lachnoclostridium phytofermentans)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00015FE0BE，Uniprot参考号A9KJP8。
Seq ID No.1092：密码子优化的DNA，其编码6xHis脱氮罗丹杆菌(Rhodanobacterdenitrificans)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00022DA3ED，Uniprot参考号M4NH01。
Seq ID No.1093：密码子优化的DNA，其编码6xHis栖瘤胃普雷沃菌(Prevotellaruminicola)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001D07633，Uniprot参考号D5ETD9。
Seq ID No.1094：密码子优化的DNA，其编码6xHis土曲霉(Aspergillus terreus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000259E388，Uniprot参考号I0AZ41。
Seq ID No.1095：密码子优化的DNA，其编码6xHis粪短杆菌(Brachybacteriumfaecium)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001A461B6，Uniprot参考号C7MA58。
Seq ID No.1096：密码子优化的DNA，其编码6xHis约翰逊黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00006E4A0D，Uniprot参考号A5FCH3。
Seq ID No.1097：密码子优化的DNA，其编码6xHis水生拉奈拉菌(Rahnellaaquatilis)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000245C507，Uniprot参考号H2IYR2。
Seq ID No.1098：密码子优化的DNA，其编码6xHis莫卡拉本双歧杆菌(Bifidobacterium moukalabense)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003E4E711，Uniprot参考号W4N6H0。
Seq ID No.1099：密码子优化的DNA，其编码6xHis铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000353BD9F，Uniprot参考号S4BBS9。
Seq ID No.1100：密码子优化的DNA，其编码6xHis土芽孢杆菌属物种(Geobacillus sp.)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001789C0D，Uniprot参考号D3EED1。
Seq ID No.1101：密码子优化的DNA，其编码6xHis海洋贫养杆菌鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000260A2FE，Uniprot参考号I4EYD9。
Seq ID No.1102：密码子优化的DNA，其编码6xHis肝素足杆菌(Pedobacterheparinus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019EF0EE，Uniprot参考号C6XYM6。
Seq ID No.1103：密码子优化的DNA，其编码6xHis发酵双杆菌(Dyadobacterfermentans)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019B5915，Uniprot参考号C6VZL3。
Seq ID No.1104：密码子优化的DNA，其编码6xHis胶质类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000212C156，Uniprot参考号F8FQQ3。
Seq ID No.1105：密码子优化的DNA，其编码6xHis类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus sp.)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003E2544D，Uniprot参考号W4D866。
Seq ID No.1106：密码子优化的DNA，其编码6xHis多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000005ADD2，Uniprot参考号A0A0P0FM19。
Seq ID No.1107：密码子优化的DNA，其编码6xHis橙色氯雷弗氏菌(Chloroflexusaurantiacus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00005BA60B，Uniprot参考号A9WDK5。
Seq ID No.1108：密码子优化的DNA，其编码6xHis粪热球菌(Thermoclostridiumstercorarium)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000B098C，Uniprot参考号Q9S3L0。
Seq ID No.1109：密码子优化的DNA，其编码6xHis莫卡拉本双歧杆菌(Bifidobacterium moukalabense)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003E5C314，Uniprot参考号W4N6I2。
Seq ID No.1110：密码子优化的DNA，其编码6xHis多发寡源杆菌(Olsenellaprofusa)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003AE032C，Uniprot参考号U2USP4。
Seq ID No.1111：密码子优化的DNA，其编码6xHis黄色克雷伯菌(Kribbellaflavida)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019BDB13，Uniprot参考号D2PMT5。
Seq ID No.1112：密码子优化的DNA，其编码6xHis弧菌茎杆菌(Caulobactervibrioides)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000C7226，Uniprot参考号Q9A9K2。
Seq ID No.1113：密码子优化的DNA，其编码6xHis多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000005BA09，Uniprot参考号Q8A076。
Seq ID No.1114：密码子优化的DNA，其编码6xHis Rhodonellum psychrophilum鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003745394，Uniprot参考号U5BUY4。
Seq ID No.1115：密码子优化的DNA，其编码6xHis类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus sp.)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0004F6D660，Uniprot参考号A0A089M3T2。
Seq ID No.1116：密码子优化的DNA，其编码6xHis琼脂链状菌(Catenovulumagarivorans)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003ED860D，Uniprot参考号W7QMH5。
Seq ID No.1117：密码子优化的DNA，其编码6xHis食半乳佐贝氏菌(Zobelliagalactanivorans)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000217D8B1，Uniprot参考号G0L382。
Seq ID No.1118：密码子优化的DNA，其编码6xHis多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000005B845，Uniprot参考号Q8A1H5。
Seq ID No.1119：密码子优化的DNA，其编码6xHis木聚糖拟杆菌(Bacteroidesxylanisolvens)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001CD02E9，Uniprot参考号D6CYE5。
Seq ID No.1120：密码子优化的DNA，其编码6xHis氯酚假单胞菌(Pseudarthrobacter chlorophenolicus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00018E07C6，Uniprot参考号B8HAH3。
Seq ID No.1121：密码子优化的DNA，其编码6xHis嗜热网球菌(Dictyoglomusthermophilum)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001815896，Uniprot参考号B5YC64。
Seq ID No.1122：密码子优化的DNA，其编码6xHis Formosa agariphila鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00039231C1，Uniprot参考号T2KPL4。
Seq ID No.1123：密码子优化的DNA，其编码6xHis约氏红球菌(Rhodococcusjostii)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000DBA6EB，Uniprot参考号Q0S9T4。
Seq ID No.1124：密码子优化的DNA，其编码6xHis卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001D10896，Uniprot参考号D5GZ45。
Seq ID No.1125：密码子优化的DNA，其编码6xHis肝素足杆菌(Pedobacterheparinus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001B17DE6，Uniprot参考号C6XVU2。
Seq ID No.1126：密码子优化的DNA，其编码6xHis舌螺旋体(Spirosomalinguale)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001A3C989，Uniprot参考号D2QUA5。
Seq ID No.1127：密码子优化的DNA，其编码6xHis肝素足杆菌(Pedobacterheparinus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019EE3EB，Uniprot参考号C6XU05。
Seq ID No.1128：密码子优化的DNA，其编码6xHis胶质类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003432C11，Uniprot参考号R9ULQ4。
Seq ID No.1129：密码子优化的DNA，其编码6xHis分离茎杆菌(Caulobactersegnis)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001BC0C05，Uniprot参考号D5VGD9。
Seq ID No.1130：密码子优化的DNA，其编码6xHis纤维质拟杆菌(Bacteroidescellulosilyticus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001969377，Uniprot参考号E2N9B1。
Seq ID No.1131：密码子优化的DNA，其编码6xHis肝素足杆菌(Pedobacterheparinus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001B17C60，Uniprot参考号C6Y153。
Seq ID No.1132：密码子优化的DNA，其编码6xHis Formosa agariphila鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000571C0C2，Uniprot参考号T2KNB2。
Seq ID No.1133：密码子优化的DNA，其编码6xHis嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00004C6D41，Uniprot参考号Q5FJ31。
Seq ID No.1134：密码子优化的DNA，其编码6xHis Rhodopirellula baltica鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00001AC07D，Uniprot参考号Q7UYD5。
Seq ID No.1135：密码子优化的DNA，其编码6xHis Frankia inefficax鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001BF9A6C，Uniprot参考号E3IY10。
Seq ID No.1136：密码子优化的DNA，其编码6xHis阿氟曼链霉菌(Streptomycesscabiei)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001B7FF91，Uniprot参考号C9Z376。
Seq ID No.1137：密码子优化的DNA，其编码6xHis约翰逊黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00006E5F74，Uniprot参考号A5FC22。
Seq ID No.1138：密码子优化的DNA，其编码6xHis链霉菌属物种(Streptomycessp.)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00034E666D，Uniprot参考号S2YWB5。
Seq ID No.1139：密码子优化的DNA，其编码6xHis荚膜酸杆菌(Acidobacteriumcapsulatum)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000198DF25，Uniprot参考号C1F149。
Seq ID No.1140：密码子优化的DNA，其编码6xHis琼脂链状菌(Catenovulumagarivorans)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003ED82D3，Uniprot参考号W7QYP5。
Seq ID No.1141：密码子优化的DNA，其编码6xHis粪短杆菌(Brachybacteriumfaecium)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001A461B7，Uniprot参考号C7MA59。
Seq ID No.1142：密码子优化的DNA，其编码6xHis产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000243A177，Uniprot参考号A0A0J9X262。
Seq ID No.1143：密码子优化的DNA，其编码6xHis皮氏几丁质菌(Chitinophagapinensis)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001B24769，Uniprot参考号C7PA70。
Seq ID No.1144：密码子优化的DNA，其编码6xHis波特罗链霉菌(Streptomycesbottropensis)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002BCAF6B，Uniprot参考号M3FYL9。
Seq ID No.1145：密码子优化的DNA，其编码6xHis变异罕见小球菌(Subdoligranulum variabile)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001966B28，Uniprot参考号D1PKC7。
Seq ID No.1146：密码子优化的DNA，其编码6xHis外壳微杆菌(Microbacteriumtestaceum)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001F8A51D，Uniprot参考号E8NDD8。
Seq ID No.1147：密码子优化的DNA，其编码6xHis Solibacter usitatus鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000053767B，Uniprot参考号Q01V09。
Seq ID No.1148：密码子优化的DNA，其编码6xHis玫瑰色链孢囊菌(Streptosporangium roseum)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001A3EFE6，Uniprot参考号D2B240。
Seq ID No.1149：密码子优化的DNA，其编码6xHisα变形杆菌)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0006CE1E82，Uniprot参考号A0A0N1BME3。
Seq ID No.1150：密码子优化的DNA，其编码6xHis Solitalea canadensis鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000247229E，Uniprot参考号H8KPI7。
Seq ID No.1151：密码子优化的DNA，其编码6xHis古氏副拟杆菌(Parabacteroides goldsteinii)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0002CB9583，Uniprot参考号S0GSF0。
Seq ID No.1152：密码子优化的DNA，其编码6xHis海洋环杆菌(Cyclobacteriummarinum)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00021B9B33，Uniprot参考号G0J630。
Seq ID No.1153：密码子优化的DNA，其编码6xHis Solibacter usitatus鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000533669，Uniprot参考号Q01TX2。
Seq ID No.1154：密码子优化的DNA，其编码6xHis Lunatimonas lonarensis鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00032D8F6D，Uniprot参考号R7ZW70。Seq ID No.1155：密码子优化的DNA，其编码6xHis豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000D713F2，Uniprot参考号Q1M7P3。
Seq ID No.1156：密码子优化的DNA，其编码6xHis玫瑰色链孢囊菌(Streptosporangium roseum)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001A3EBEB，Uniprot参考号D2AYU9。
Seq ID No.1157：密码子优化的DNA，其编码6xHis狄氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000156F115，Uniprot参考号A6LBL4。
Seq ID No.1158：密码子优化的DNA，其编码6xHis毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003375A10，Uniprot参考号R9K6L6。
Seq ID No.1159：密码子优化的DNA，其编码6xHis皮氏几丁质菌(Chitinophagapinensis)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001A2F0FA，Uniprot参考号C7P9Y8。
Seq ID No.1160：密码子优化的DNA，其编码6xHis分离茎杆菌(Caulobactersegnis)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001BC0C15，Uniprot参考号D5VGC3。
Seq ID No.1161：密码子优化的DNA，其编码6xHis肝素足杆菌(Pedobacterheparinus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019EF6E1，Uniprot参考号C6Y145。
Seq ID No.1162：密码子优化的DNA，其编码6xHis肝素足杆菌(Pedobacterheparinus)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019EE1A9，Uniprot参考号C6Y2X3。
Seq ID No.1163：密码子优化的DNA，其编码6xHisδ变形菌属细菌(Deltaproteobacteria bacterium)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000C8D4928，Uniprot参考号A0A2D5SK32。
Seq ID No.1164：密码子优化的DNA，其编码6xHis土壤热杆菌(Thermobaculumterrenum)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019BFDCE，Uniprot参考号D1CHL4。
Seq ID No.1165：密码子优化的DNA，其编码6xHis Opitutus terrae鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI000172B62A，Uniprot参考号B1ZY35。
Seq ID No.1166：密码子优化的DNA，其编码6xHis黄色克雷伯菌(Kribbellaflavida)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019BFABB，Uniprot参考号D2PXQ4。
Seq ID No.1167：密码子优化的DNA，其编码6xHis阿氟曼链霉菌(Streptomycesscabiei)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0001B80091，Uniprot参考号C9Z391。
Seq ID No.1168：密码子优化的DNA，其编码6xHis游动放线菌属物种(Actinoplanes sp.)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00023EC5D1，Uniprot参考号G8S540。
Seq ID No.1169：密码子优化的DNA，其编码6xHis不粘柄菌属物种(Asticcacaulis sp.)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003C3CD2B，Uniprot参考号V4NSJ1。
Seq ID No.1170：密码子优化的DNA，其编码6xHis黄色克雷伯菌(Kribbellaflavida)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00019BF65D，Uniprot参考号D2PT74。
Seq ID No.1171：密码子优化的DNA，其编码6xHis芽孢杆菌属物种(Bacillussp.)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00000BC760，Uniprot参考号Q93RE7。
Seq ID No.1172：密码子优化的DNA，其编码6xHis约翰逊黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00006E5FAB，Uniprot参考号A5FCG3。
Seq ID No.1173：密码子优化的DNA，其编码6xHis Lunatimonas lonarensis鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI00032EEB9C，Uniprot参考号R7ZS84。
Seq ID No.1174：密码子优化的DNA，其编码6xHis马西艾森伯格菌(Eisenbergiella massiliensis)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0004B2D794，Uniprot参考号A0A3E3IGR6。
Seq ID No.1175：密码子优化的DNA，其编码6xHis琼脂链状菌(Catenovulumagarivorans)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0003ED7515，Uniprot参考号W7QF25。
Seq ID No.1176：密码子优化的DNA，其编码6xHis阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)鼠李糖苷酶，Uniparc参考号UPI0000184198，Uniprot参考号Q82PP4。
Seq ID No.1177：N-末端His-标签/接头
Seq ID No.1178：C-末端接头/His标签
Seq ID No.1179：以下的氨基酸序列：变体G1
Seq ID No.1180：以下的氨基酸序列：变体G2
Seq ID No.1181：以下的氨基酸序列：变体G3
Seq ID No.1182：以下的氨基酸序列：变体G4
Seq ID No.1183：以下的氨基酸序列：变体G5
Seq ID No.1184：密码子优化的DNA，其编码N-末端6xHis变体G1。
Seq ID No.1185：密码子优化的DNA，其编码N-末端6xHis变体G2。
Seq ID No.1186：密码子优化的DNA，其编码N-末端6xHis变体G3。
Seq ID No.1187：密码子优化的DNA，其编码N-末端6xHis变体G4。
Seq ID No.1188：密码子优化的DNA，其编码N-末端6xHis变体G5。
Seq ID No.1189：以下的氨基酸序列：变体R1
Seq ID No.1190：以下的氨基酸序列：变体R2
Seq ID No.1191：以下的氨基酸序列：变体R3
Seq ID No.1192：以下的氨基酸序列：变体R4
Seq ID No.1193：以下的氨基酸序列：变体R5
Seq ID No.1194：密码子优化的DNA，其编码C-末端6xHis变体R1。
Seq ID No.1195：密码子优化的DNA，其编码C-末端6xHis变体R2。
Seq ID No.1196：密码子优化的DNA，其编码C-末端6xHis变体R3。
Seq ID No.1197：密码子优化的DNA，其编码C-末端6xHis变体R4。
Seq ID No.1198：密码子优化的DNA，其编码C-末端6xHis变体R5。
具体实施方式
如前所述，皂苷是具有广泛用途的类固醇或萜类糖苷。目前获得合适数量和合适纯度的某些皂苷的方法是有限的。本发明人出人意料地发现，皂苷的酶促修饰可有助于提高感兴趣的皂苷的利用率和/或有助于去除不需要的皂苷组分。因此，本发明提供了对皂苷进行酶促修饰的方法、通过这种方法制备的产品、所述产品的用途以及相关方面。在本发明的方法中，起始皂苷(即被酶修饰的皂苷)被转化成产物皂苷(即由起始皂苷的酶促修饰产生的皂苷)。
本发明的工程化的葡萄糖苷酶多肽可用于皂苷的酶促修饰方法中。
本发明的工程化的鼠李糖苷酶多肽可用于皂苷的酶促修饰方法中。
目标
本发明可用于实现多个目标，例如：(i)提高可从给定起始材料获得的感兴趣皂苷的产率；(ii)拓宽适于获得感兴趣的皂苷的起始材料的范围；和/或(iii)从感兴趣的皂苷中方便地除去不需要的皂苷。
当分离感兴趣的皂苷的原料供应受限时，实现感兴趣的皂苷的最大产量显然是重要的。与提取和分离过程的效率无关(提取和分离过程通常适用于现有感兴趣的皂苷的最佳分离)，本发明可用于增加可从给定起始材料获得的感兴趣的皂苷的量。对原料中存在的其他皂苷进行酶促修饰以形成感兴趣的皂苷，可以增加可获得的感兴趣的皂苷的量。
皂苷可以从多种原料中获得。植物材料中特定皂苷的存在及其水平可能取决于一系列因素，例如植物物种、组织、年龄、季节、环境条件等。可以在相同物种的植物(例如树)之间观察到变异(参见例如WO2018057031)。与提取和/或分离感兴趣的皂苷相关的负担可能意味着感兴趣的皂苷的某些潜在来源在商业上是不可行的，因为感兴趣的皂苷以相对低的水平存在。对原料中存在的其他皂苷进行酶促修饰以形成感兴趣的皂苷，可以扩大用于获得感兴趣的皂苷的可行原料的范围。
众所周知，不同的皂苷可能具有不同的活性特征——积极/期望的活性和消极/不期望的活性。皂苷的某些用途需要高度的纯化，从其他皂苷中分离出感兴趣的皂苷，尤其是那些结构或物理性质相似的皂苷，可能很麻烦。这样的其他皂苷的酶促修饰可以改变它们的物理性质，从而有利于从感兴趣的皂苷中分离出来。皂苷的其他用途可能不需要高纯度本身，然而仍然需要在不使用繁琐的色谱方法的情况下除去或减少皂苷混合物中特定皂苷组分(或多种组分)的量。酶促修饰可促进皂苷混合物中特定皂苷组分的去除或减少，而无需色谱手段。
皂苷本发明的方法需要起始皂苷(即打算进行酶促修饰的皂苷)。起始皂苷可以是天然存在的皂苷(即自然界中发现的类固醇或萜类糖苷)或人工产生的皂苷(即非自然界中发现的类固醇或萜类糖苷)。
在一些实施方案中，起始皂苷是类固醇糖苷，在其他实施方案中，起始皂苷是萜类糖苷，尤其是三萜糖苷。
天然存在的起始皂苷可以通过提取获得，或者可以合成制备(完全或半合成)。
天然存在的起始皂苷包括可从满天星属(Gypsophilia)、肥皂草属(Saponaria)或皂皮树属植物获得的那些(Bomford，1992)。特别感兴趣的是可从皂皮树属物种的植物中获得的起始皂苷。感兴趣的特定起始皂苷包括可从柳叶皂皮树或皂树中获得的那些。在一个实施方案中，起始皂苷可从皂树获得，例如从皂树获得。在一个实施方案中，起始皂苷可从柳叶皂皮树获得，例如从柳叶皂皮树获得。
在某些实施方案中，起始皂苷是皂皮酸糖苷。在某些实施方案中，起始皂苷是商陆酸(phytolaccinic acid)糖苷。在某些实施方案中，起始皂苷是刺囊酸(echinocysticacid)糖苷。在某些实施方案中，起始皂苷是22-β-羟基化的皂皮酸糖苷。在某些实施方案中，起始皂苷是丝石竹皂苷元糖苷。
通过液相色谱/质谱分析皂树树皮的水/甲醇提取物揭示了超过100种皂苷(Nyberg,2000；Nyberg,2003；Kite,2004)。柳叶皂皮树提取物也有描述，其中柳叶皂皮树提取物中的许多皂苷组分对应于皂树提取物中发现的皂苷。(Wallace,2017；Wallace,2019)。
下文描述了特定的由皂皮酸衍生的起始皂苷和产物皂苷，它们按“家族”分组。每家族都有一个或多个共同的结构特征，这是该家族相对于其他家族的特征。每家族中的单个组分也显示出某些结构特征，这些特征是该组分相对于家族中其他组分的特征，包括：木糖或鼠李糖化学型——C3糖中存在木糖或鼠李糖残基；A或B异构体–A具有通过D-岩藻糖的4-位连接的酰基链，B具有通过D-岩藻糖的3-位连接的酰基链；V1和V2——C28糖中存在一个末端芹菜糖或木糖残基(在家族的其他成员中，该末端残基也可能不存在)。本文关注通常在皂树水提物中显著存在的组分，但是应当理解的是(i)家族的其他组分也存在，并且(ii)家族的不同组分的比例可能在家族之间和不同皂苷来源之间有所不同(Kite，2004)。所用的具体提取方法也可能影响所获得的不同组分的比例。
使用色谱技术可以分离A和B异构体。然而，在合适的溶剂条件下，这些异构体将恢复到平衡比例(参见例如Cleland，1996)。木糖和鼠李糖化学型通常紧密洗脱，根据色谱技术，鼠李糖化学型可能形成一个小峰，该小峰紧邻该家族的主峰之前或与其重叠。
本领域技术人员还将认识到，所述结构包含可电离基团，并且在适当的情况下可以以离解形式或盐的形式存在。结构通常显示为具有电离形式的葡糖醛酸盐部分，并且指示的分子量直接从显示的离子计算(对应于用负模式电喷雾质谱观察到的单同位素m/z)，然而，所有的非解离、解离和盐形式旨在被引用的定义所涵盖。理想的盐是药学上可接受的，但是非药学上可接受的盐在药物制造过程中或非药物用途中也是有用的。
可从皂树获得的起始皂苷包括：
-QS-18家族组分(即在QS-21家族组分的L-鼠李糖部分的C3位置具有β-O-吡喃葡萄糖基化的三萜糖苷)，例如：
-“QS-18 2150 A组分”，其为被鉴定为图2中QS-18主峰的一部分的三萜糖苷，并且具有2150的m/z，采用负模式电喷雾质谱法。QS-18 2150 A组分被认为在Kite 2004中被鉴定为峰76，并且对应于Nyberg 2000和Nyberg 2003中表征的A-异构体木糖化学型结构B4(芹菜糖异构体)和B6(木糖异构体)。QS-18 2150 A组分可由以下组成：QS-18 2150 A V1(即芹菜糖异构体)
和/或QS-18 2150 A V2(即木糖异构体)：
-“QS-18 2018 A组分”，其为鉴定为图2中QS-18主峰的一部分的三萜糖苷，并且具有2018的m/z，采用负模式电喷雾质谱。QS-18 A 2018组分被认为在Kite 2004鉴定为峰73，并对应于Nyberg 2000年和Nyberg 2003表征的A-异构体木糖化学型结构B2。QS-18 2018 A组分可由以下组成：QS-18 2018 A
-“QS-18 2164 A组分”，其为被鉴定为图2中QS-18主峰的一部分的三萜糖苷，并且具有2164的m/z，采用负模式电喷雾质谱法。QS-18 2164 A组分被认为在Kite 2004中被鉴定为峰74，并且对应于Nyberg 2000和Nyberg 2003中表征的A-异构体鼠李糖化学型结构B3(芹菜糖异构体)和B5(木糖异构体)。QS-18 2164 A组分可由以下组成：QS-18 2164 A V1(即芹菜糖异构体)
和/或QS-18 2164 A V2(即木糖异构体)：
-“QS-18 2150 B组分”，为三萜糖苷，m/z为2150，采用负模式电喷雾质谱法。QS-182150 B组分对应于Nyberg 2000和Nyberg 2003中表征的B-异构体木糖化学型结构B4a(芹菜糖异构体)和B6a(木糖异构体)。QS-18 2150 B组分可由以下组成：QS-18 2150 B V1(即芹菜糖异构体)
和/或QS-18 2150 B V2(即木糖异构体)：
-“QS-18 2018 B组分”，为三萜糖苷，m/z为2018，采用负模式电喷雾质谱法。QS-182018 B组分对应于在Nyberg 2000和Nyberg 2003中表征的B-异构体木糖化学型结构B2a。QS-18 2018 B组分可由以下组成：QS-18 2018 B
-“QS-18 2164 B组分”，为三萜糖苷，m/z为2164，采用负模式电喷雾质谱法。QS-182164 B对应于B-异构体鼠李糖化学型结构B3a(芹菜糖异构体)和B5a(木糖异构体)。QS-182164 B组分可由以下组成：QS-18 2164 B V1(即芹菜糖异构体)
和/或QS-18 2164 B V2(即木糖异构体)：
-去葡糖基-QS-17家族组分(即在QS-21家族组分的阿拉伯呋喃糖部分的C2位置具有α-O-鼠李糖基化但缺乏QS-17家族组分的糖基化的三萜糖苷)，例如：
-“去葡糖基-QS-17 2134 A组分”，为三萜糖苷，m/z为2134，采用负模式电喷雾质谱法。去葡糖基-QS-17 2134 A组分被认为在Kite 2004中被鉴定为峰75，并且对应于木糖化学型的A-异构体。去葡糖基-QS-17 2134 A组分可以由以下组成：去葡糖基-QS-17 2134A V1(即芹菜糖异构体)
和/或去葡糖基-QS-17 2134 A V2(即木糖异构体)：
-“去葡糖基-QS-17 2002 A组分”，为三萜糖苷，m/z为2002，采用负模式电喷雾质谱法。去葡糖基-QS-17 2002 A组分对应于A-异构体木糖化学型，并且可以由以下组成：去葡糖基-QS-17 2002 A：
-“去葡糖基-QS-17 2148 A组分”，为三萜糖苷，m/z为2148，采用负模式电喷雾质谱法。去葡糖基-QS-17 2148 A组分被认为在Kite 2004鉴定为峰70和72，并且对应于A-异构体鼠李糖化学型。去葡糖基-QS-17 2148 A组分可以由以下组成：去葡糖基-QS-17 2148A V1(即芹菜糖异构体)
和/或去葡糖基-QS-17 2148 A V2(即木糖异构体)：
-“去葡糖基-QS-17 2134 B组分”，为三萜糖苷，m/z为2134，采用负模式电喷雾质谱法。去葡糖基-QS-17 2134 B组分被认为在Kite 2004中被鉴定为峰67，并且对应于木糖化学型的B-异构体。去葡糖基-QS-17 2134 B组分可以由以下组成：去葡糖基-QS-17 2134B V1(即芹菜糖异构体)
和/或去葡糖基-QS-17 2134 B V2(即木糖异构体)：
-“去葡糖基-QS-17 2002 B组分”，为三萜糖苷，m/z为2002，采用负模式电喷雾质谱法。去葡糖基-QS-17 2002 B组分对应于木糖化学型的B-异构体，并且可以由以下组成：去葡糖基-QS-17 2002 B
-“去葡糖基-QS-17 2148 B组分”，为三萜糖苷，m/z为2148，采用负模式电喷雾质谱法。去葡糖基-QS-17 2148 B组分被认为在Kite 2004被鉴定为峰65，并且对应于鼠李糖化学型的B-异构体。去葡糖基-QS-17 2148 B组分可以由以下组成：去葡糖基-QS-17 2148B V1(即芹菜糖异构体)
和/或去葡糖基-QS-17 2148 B V2(即木糖异构体)：
-QS-17家族组分(即在L-鼠李糖部分的C3位置具有β-O-吡喃葡萄糖基化和在QS-21家族组分的阿拉伯呋喃糖部分的C2位置具有α-O-鼠李糖基的三萜糖苷)，例如：
-“QS-17 2296 A组分”，其为被鉴定为图2中QS-17主峰的一部分的三萜糖苷，并且具有2296的m/z，采用负模式电喷雾质谱法。QS-17 2296 A组分被认为在Kite 2004中被鉴定为峰59，并且对应于木糖化学型结构QS-III的A-异构体。QS-17 2296 A组分可由以下组成：QS-17 2296 A V1(即芹菜糖异构体)
和/或QS-17 2296 A V2(即木糖异构体)：
-“QS-17 2164 A组分”，其为被鉴定为图2中QS-17主峰的一部分的三萜糖苷，并且具有2164的m/z，采用负模式电喷雾质谱法。QS-17 2164 A组分被认为在Kite 2004鉴定为峰58，并且对应于A-异构体木糖化学类型。QS-17 2164 A组分可由以下组成：QS-17 2164 A
-“QS-17 2310 A组分”，其为被鉴定为图2中QS-17主峰的一部分的三萜糖苷，并且具有2310的m/z，采用负模式电喷雾质谱法。QS-17 2310 A组分被认为在Kite 2004中被鉴定为峰57，并且对应于鼠李糖化学型的A-异构体。QS-17 2310 A组分可由以下组成：QS-172310 A V1(即芹菜糖异构体)
和/或QS-17 2310 A V2(即木糖异构体)：
-“QS-17 2296 B组分”，为三萜糖苷，m/z为2296，采用负模式电喷雾质谱法。QS-172296 B组分对应于Kite 2004中的木糖化学型结构QS-III的B-异构体。QS-17 2296 B组分可由以下组成：QS-17 2296 B V1(即芹菜糖异构体)
和/或QS-17 2296 B V2(即木糖异构体)：
-“QS-17 2164 B组分”，为三萜糖苷，m/z为2164，采用负模式电喷雾质谱法。QS-172164 B组分对应于B-异构体木糖化学类型。QS-17 2164 B组分，并且可由以下组成：QS-172164 B
-“QS-17 2310 B组分”，为三萜，m/z为2310，采用负模式电喷雾质谱法。QS-172310 B组分对应于鼠李糖化学型的B-异构体。QS-17 2310 B组分可由以下组成：QS-172310 B V1(即芹菜糖异构体)
和/或QS-17 2310 B V2(即木糖异构体)；
-去阿拉伯呋喃糖基-QS-18家族组分(即在L-鼠李糖部分的C3位置具有β-O-吡喃葡萄糖基化但缺少QS-21家族组分的阿拉伯呋喃糖部分的三萜糖苷)。去阿拉伯呋喃糖基-QS-18家族组分在提取物中的含量相对较低，这意味着它们还没有经过详细的表征。从QS-21家族组分中分离去阿拉伯呋喃糖基-QS-18家族组分可能具有挑战性。去阿拉伯呋喃糖基-QS-18家族组分包括：
-去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 A组分(即图6中鉴定为“2018峰”一部分的三萜糖苷。合适地，本文所述的UPLC-UV/MS方法中的去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 A组分具有约4.5分钟的保留时间，采用负模式电喷雾质谱法时，峰的主要组分具有2018的m/z。去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 A组分也可以在本文所述的UPLC-UV方法中鉴定，保留时间约为5.8分钟。在Kite 2004中，认为去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 A组分被鉴定为峰90，并对应于木糖化学型的A-异构体。推定结构已通过MS/MS鉴定为主要的去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 A组分。去阿拉伯呋喃糖基-
QS-18 2018 A组分可由以下组成：去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018
A V1(即芹菜糖异构体)
和/或去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 A V2(即木糖异构体)：
-去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 1886A组分(即图6中鉴定为“2018峰”一部分的三萜糖苷。合适的是，本文所述的UPLC-UV/MS方法中的去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 1886A组分具有约4.5分钟的保留时间和1886的m/z，采用负模式电喷雾质谱法。去阿拉伯呋喃糖基-QS-181886A组分和对应于A-异构体木糖化学型也可以在本文所述的UPLC-UV方法中鉴定，保留时间约为5.8分钟。去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 1886A组分可由以下组成：
-去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032A组分(即图6中鉴定为“2018峰”一部分的三萜糖苷。合适的是，本文所述的UPLC-UV/MS方法中的去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032A组分具有约4.5分钟的保留时间和2032的m/z，采用负模式电喷雾质谱法。去阿拉伯呋喃糖基-QS-182032A组分对应于鼠李糖化学型的α-异构体，并且也可以在本文所述的UPLC-UV方法中鉴定，保留时间约为5.8分钟。去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032A组分可由组成：去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032A V1(即芹菜糖异构体)
和/或去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032A V2(即木糖异构体)：
-去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 B组分，为三萜糖苷，m/z为2018，采用负模式电喷雾质谱法。去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018B组分对应于木糖化学型的B-异构体。去阿拉伯呋喃糖基-QS-182018 B组分可由以下组成：去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 B V1(即芹菜糖异构体)
和/或去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 B V2(即木糖异构体)：
-去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 1886B组分，鉴定为三萜糖苷，m/z为1886，采用负模式电喷雾质谱法。去阿拉伯呋喃糖基-QS-181886B组分对应于B-异构体木糖化学型。去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 1886B组分可由以下组成：
-去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032B组分，为三萜糖苷，m/z为2032，采用负模式电喷雾质谱法。去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032B组分对应于鼠李糖化学型的B-异构体。去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032B组分可以由以下组成：去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032B V1(即芹菜糖异构体)
和/或去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032B V2(即木糖异构体)：
-乙酰化的去葡糖基-QS-17家族组分(即在阿拉伯呋喃糖部分的C2位置具有α-O-鼠李糖基化和QS-21家族组分的岩藻糖的C3位置乙酰化的三萜糖苷)，例如：
-“乙酰化的去葡糖基-QS-17 2176A组分”，为三萜糖苷，m/z为2176，采用负模式电喷雾质谱法。乙酰化的去葡糖基-QS-17 2176 A组分对应于木糖化学型的α-异构体。乙酰化的去葡糖基-QS-17 2176 A组分可以由以下组成：乙酰化的去葡糖基-QS-17 2176A V1(即芹菜糖异构体)
和/或乙酰化的去葡糖基-QS-17 2176 A V2(即木糖异构体)：
-“乙酰化的去葡糖基-QS-17 2044 A组分”，为三萜糖苷，m/z为2044，采用负模式电喷雾质谱法。乙酰化的去葡糖基-QS-17 2044 A组分对应于A-异构体木糖化学类型。乙酰化的去葡糖基-QS-17 2044 A组分可以由以下组成：乙酰化的去葡糖基-QS-17 2044 A
-“乙酰化的去葡糖基-QS-17 2190 A组分”，为三萜糖苷，m/z为2190，采用负模式电喷雾质谱法。乙酰化的去葡糖基-QS-17 2190 A对应于α-异构体鼠李糖化学类型。乙酰化的去葡糖基-QS-17 2190 A组分可以由以下组成：乙酰化的去葡糖基-QS-17 2190 A V1(即芹菜糖异构体)
和/或乙酰化的去葡糖基-QS-17 2190 A V2(即木糖异构体)：
与工程化的葡萄糖苷酶多肽直接相关的起始皂苷是那些具有可切割的葡萄糖残基的皂苷，然而，工程化的葡萄糖苷酶多肽可与能够切割其他糖残基的另外的酶结合使用。与工程化的葡萄糖苷酶多肽相关的特定起始皂苷包括：
-QS-18家族组分；
-QS-17家族组分；和
-去阿拉伯呋喃糖基-QS-18家族组分。
与工程化的鼠李糖苷酶多肽直接相关的起始皂苷是具有可切割的鼠李糖残基的那些，然而，工程化的鼠李糖苷酶多肽可与能够切割其他糖残基的另外的酶结合使用。与工程化的鼠李糖苷酶多肽相关的特定起始皂苷包括：
-去葡糖基QS-17家族组分；
-QS-17家族组分；和
-乙酰化的去葡糖基QS-17家族组分。
本发明的方法酶促修饰起始皂苷以提供产物皂苷。产物皂苷可以是天然存在的皂苷(即自然界中发现的类固醇或萜类糖苷，尽管产物皂苷本身是通过本发明的方法获得的)或人工产生的皂苷(即非自然界中发现的类固醇或萜类糖苷)。
在一些实施方案中，产物皂苷是类固醇糖苷，在其他实施方案中，产物皂苷是萜类糖苷，尤其是三萜糖苷。
天然存在的产物皂苷包括可从满天星属、肥皂草属或皂皮树属植物获得的那些(Bomford，1992)。特别感兴趣的是可从皂皮树属物种的植物中获得的产物皂苷。感兴趣的特定产物皂苷包括可从柳叶皂皮树或皂树中获得的那些。在一个实施方案中，产物皂苷可从皂树中获得。在一个实施方案中，产物皂苷可从柳叶皂皮树获得。
在某些实施方案中，产物皂苷是皂皮酸糖苷。
可从皂树获得的产物皂苷包括：
-QS-18家族组分(即在QS-21家族组分的L-鼠李糖部分的C3位置具有β-O-吡喃葡萄糖基化的三萜糖苷)，例如：
-“QS-18 2150 A组分”。QS-18 2150 A组分可由以下组成：QS-18 2150 A V1(即芹菜糖异构体)
和/或QS-18 2150 A V2(即木糖异构体)：
-“QS-18 2018 A组分”。QS-18 2018 A组分可由以下组成：QS-18 2018 A
-“QS-18 2164 A组分”。QS-18 2164 A组分可由以下组成：QS-18 2164 A V1(即芹菜糖异构体)
和/或QS-18 2164 A V2(即木糖异构体)：
-“QS-18 2150 B组分”。QS-18 2150 B组分可由以下组成：QS-18 2150 B V1(即芹菜糖异构体)
和/或QS-18 2150 B V2(即木糖异构体)：
-“QS-18 2018 B组分”。QS-18 2018 B组分可由以下组成：QS-18 2018 B
-“QS-18 2164 B组分”。QS-18 2164 B组分可由以下组成：QS-182164 B V1(即芹菜糖异构体)
和/或QS-18 2164 B V2(即木糖异构体)：
-去葡糖基-QS-17家族组分(即在QS-21家族组分的阿拉伯呋喃糖部分的C2位置具有α-O-鼠李糖基化的三萜糖苷)，例如：
-“去葡糖基QS-17 2134 A组分”。去葡糖基-QS-17 2134 A组分可以由以下组成：去葡糖基-QS-17 2134 A V1(即芹菜糖异构体)
和/或去葡糖基-QS-17 2134 A V2(即木糖异构体)：
-“去葡糖基QS-17 2002 A组分”。去葡糖基-QS-17 2002 A组分可以由以下组成：去葡糖基-QS-17 2002 A
-“去葡糖基QS-17 2148 A组分”。去葡糖基-QS-17 2148 A组分可以由以下组成：去葡糖基-QS-17 2148 A V1(即芹菜糖异构体)
和/或去葡糖基-QS-17 2148 A V2(即木糖异构体)：
-“去葡糖基QS-17 2134 B组分”。去葡糖基-QS-17 2134 B组分可以由以下组成：去葡糖基-QS-17 2134 B V1(即芹菜糖异构体)：
和/或去葡糖基-QS-17 2134 B V2(即木糖异构体)：
-“去葡糖基QS-17 2002 B组分”。去葡糖基-QS-17 2002 B组分可以由以下组成：去葡糖基-QS-17 2002 B
-“去葡糖基QS-17 2148 B组分”。去葡糖基-QS-17 2148 B组分可以由以下组成：去葡糖基-QS-17 2148 B V1(即芹菜糖异构体)
和/或去葡糖基-QS-17 2148 B V2(即木糖异构体)：
-QS-21家族组分，例如：
-“QS-21 1988 A组分”，其为被鉴定为图6中QS-21主峰的一部分的三萜糖苷，并且具有1988的m/z，采用负模式电喷雾质谱法。合适的是，本文所述的UPLC-UV/MS方法中的QS-21 1988 A组分具有约4.4分钟的保留时间和1988的m/z，采用负模式电喷雾质谱法。QS-211988 A组分被认为在Kite 2004中被鉴定为峰88，并且对应于Nyberg 2000和Nyberg 2003中表征的A-异构体木糖化学型结构S6(芹菜糖异构体)和S4(木糖异构体)。QS-21
1988 A组分可由以下组成：QS-21 1988 A V1(即芹菜糖异构体)
和QS-21 1988 A V2(即木糖异构体)：
-“QS-21 1856 A组分”，其为被鉴定为图6中QS-21主峰的一部分的三萜糖苷，并且具有1856的m/z，采用负模式电喷雾质谱法。合适的是，本文所述的UPLC-UV/MS方法中的QS-21 1856 A组分具有约4.4分钟的保留时间和1856的m/z，采用负模式电喷雾质谱法。QS-211856 A组分被认为在Kite 2004鉴定为峰86，并对应于Nyberg 2000和Nyberg 2003表征的A-异构体木糖化学型结构S2。QS-21 1856 A组分可由以下组成：
-“QS-21 2002 A组分”，其为被鉴定为图6中QS-21主峰的一部分的三萜糖苷，并且具有2002的m/z，采用负模式电喷雾质谱法。合适的是，本文所述的UPLC-UV/MS方法中的QS-21 2002 A组分具有约4.4分钟的保留时间和2002的m/z，采用负模式电喷雾质谱法。QS-212002 A组分被认为在Kite 2004中鉴定为峰85，并且对应于Nyberg 2000和Nyberg 2003中表征的结构S3和S5的α-异构体鼠李糖化学型。QS-21 2002 A组分可由以下组成：QS-212002 A V1(即芹菜糖异构体)
和QS-21 2002 A V2(即木糖异构体)：
-“QS-21 1988 B组分”，其为被鉴定为图6中B-异构体峰的一部分的三萜糖苷，并且具有1988的m/z，采用负模式电喷雾质谱法。合适的是，本文所述的UPLC-UV/MS方法中的QS-21 1988 B组分具有约4.0分钟的保留时间和1988的m/z，采用负模式电喷雾质谱法。QS-21 1988 B组分对应于Nyberg 2000和Nyberg 2003中表征的B-异构体木糖化学型结构S6a(芹菜糖异构体)和S4a(木糖异构体)。QS-21 1988 B组分可由以下组成：QS-21 1988B V1(即芹菜糖异构体)
和QS-21 1988 B V2(即木糖异构体)：
-“QS-21 1856 B组分”，其为被鉴定为图6中B-异构体峰的一部分的三萜糖苷，并且具有1856的m/z，采用负模式电喷雾质谱法。QS-21 1856 B组分对应于在Nyberg 2000和Nyberg 2003中表征的B-异构体木糖化学型结构S2a。QS-21 1856 B组分可由以下组成：
-“QS-21 2002 B组分”，为三萜糖苷，m/z为2002，采用负模式电喷雾质谱法。QS-212002 B组分对应于Nyberg 2000和Nyberg 2003表征的结构S3a和S5a的B-异构体鼠李糖化学型。QS-21 2002 B组分可由以下组成：QS-21 2002 B组分V1(即芹菜糖异构体)
和QS-21 2002 BV2(即木糖异构体)：
-去阿拉伯呋喃糖基-QS-21家族组分(即缺少QS-21家族组分的阿拉伯呋喃糖部分的三萜糖苷)。去阿拉伯呋喃糖基-QS-21家族组分在提取物中的含量相对较低，这意味着它们还没有经过详细的表征。去阿拉伯呋喃糖基-QS-21家族组分包括：
-去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 A组分(即图6中鉴定为“冻干峰”一部分的三萜糖苷。合适地，本文所述的UPLC-UV/MS方法中的去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 A组分具有约4.7分钟的保留时间，采用负模式电喷雾质谱法时，峰的主要组分具有1856的m/z。QS-211856 A组分被认为在Kite 2004中被鉴定为峰96。推定结构已通过MS/MS鉴定为主要的去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 A组分。去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 A组分可由以下组成：去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 A V1(即芹菜糖异构体)
和/或去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 A V2(即木糖异构体)：
-去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1712 A组分(即图6中鉴定为“冻干峰”一部分的三萜糖苷。合适的是，本文所述的UPLC-UV/MS方法中的去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1712 A组分具有约4.7分钟的保留时间和1712的m/z，采用负模式电喷雾质谱法。去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1712 A组分可由以下组成：去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1712 A
-去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870 A组分，为三萜糖苷，m/z为1870，采用负模式电喷雾质谱法。去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870 A组分可由以下组成：去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870 A V1(即芹菜糖异构体)
和/或去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870A V2(即木糖异构体)：
-去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 B组分，为三萜糖苷，m/z为1856，采用负模式电喷雾质谱法。去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856B组分可以由以下组成：去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 B V1(即芹菜糖异构体)
和/或去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 BV2(即木糖异构体)：
-去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1712B组分，为三萜糖苷，m/z为1712，采用负模式电喷雾质谱法。去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1712B组分可由以下组成：去阿拉伯呋喃糖基-QS-211712B
-去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870B组分，为三萜糖苷，m/z为1870，采用负模式电喷雾质谱法。去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870B组分可以由以下组成：去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870B V1(即芹菜糖异构体)
和/或去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870BV2(即木糖异构体)：
-乙酰化的QS-21家族组分(即在QS-21家族组分的岩藻糖的C3位置具有乙酰化的三萜糖苷)，例如：
-“乙酰化的QS-21 2030A组分”，为三萜糖苷，m/z为2030，采用负模式电喷雾质谱法。乙酰化的QS-21 2030A对应于A-异构体木糖化学类型。乙酰化的QS-21 2030A组分可以由以下组成：
乙酰化的QS-21 2030A V1(即芹菜糖异构体)
和/或乙酰化的QS-21 2030 A V2(即木糖异构体)：
-“乙酰化的QS-21 1898 A组分”，为三萜糖苷，m/z为1898，采用负模式电喷雾质谱法。乙酰化的QS-21 1898 A对应于A-异构体木糖化学类型。乙酰化的QS-21 1898 A组分可以由以下组成：乙酰化的QS-21 1898 A
-“乙酰化的QS-21 2044 A组分”，为三萜糖苷，m/z为2044，采用负模式电喷雾质谱法。乙酰化的QS-21 2044 A对应于鼠李糖化学型的α异构体。乙酰化的QS-21 2044 A组分可以由以下组成：乙酰化的QS-21 2044 A V1(即芹菜糖异构体)
和/或乙酰化的QS-21 2044 A V2(即木糖异构体)：
与工程化的葡萄糖苷酶多肽直接相关的产物皂苷是其中葡萄糖残基相对于起始皂苷已经被切割的那些。然而，工程化的葡萄糖苷酶多肽可与能够切割其他糖残基的另外的酶结合使用。与工程化的葡萄糖苷酶多肽相关的特定产物皂苷包括：
-去葡糖基-QS-17家族组分；
-QS-21家族组分；和
-去阿拉伯呋喃糖基-QS-21家族组分。
与工程化的鼠李糖苷酶多肽直接相关的产物皂苷是那些鼠李糖残基相对于起始皂苷已经被切割的产物皂苷。然而，工程化的鼠李糖苷酶多肽可以与能够切割其他糖残基的额外的酶结合使用。与工程化的鼠李糖苷酶多肽相关的特定产物皂苷包括：
-QS-18家族组分；
-QS-21家族组分；和
-乙酰化的QS-21家族组分。
本文使用的术语QS-18家族组分是指木糖化学型QS-18 2150组分(A和B异构体，以及芹菜糖和木糖异构体：QS-18 2150 A V1，QS-18 2150 A V2，QS-18 2150 B V1和QS-182150 B V2)，木糖化学型QS-18 2018组分(A和B异构体：QS-18 2018 A和QS-18 2018 B)，鼠李糖化学型QS-182164组分(A和B异构体，以及芹菜糖和木糖异构体：QS-18 2164 A V1，QS-18 2164 A V2，QS-18 2164 B V1和QS-18 2164 B V2)。
本文使用的术语去葡糖基-QS-17家族组分是指木糖化学型去葡糖基-QS-17 2134组分(A和B异构体，以及芹菜糖和木糖异构体：去葡糖基-QS-17 2134 A V1、去葡糖基-QS-17 2134 A V2、去葡糖基-QS-17 2134 B V1和去葡糖基-QS-17 2134 B V2)、木糖化学型去葡糖基-QS-17 2002组分(A和B异构体：去葡糖基-QS-17 2002 A和去葡糖基-QS-17 2002B)、鼠李糖化学型去葡糖基-QS-17 2148组分(A和B异构体，以及芹菜糖和木糖异构体：去葡糖基-QS-17 2148 A V1、去葡糖基-QS-17 2148 A V2，去葡糖基-QS-172148 B V1和去葡糖基-QS-17 2148 B V2)。
本文使用的术语QS-17家族组分是指木糖化学型QS-17 2296组分(A和B异构体，以及芹菜糖和木糖异构体：QS-17 2296 A V1、QS-17 2296 A V2、QS-17 2296 B V1和QS-172296 B V2)、木糖化学型QS-17 2164组分(A和B异构体：QS-17 2164 A和QS-17 2164 B)、鼠李糖化学型QS-172310组分(A和B异构体，以及芹菜糖和木糖异构体：QS-17 2310 A V1、QS-17 2310 A V2、QS-17 2310 B V1和QS-17 2310 B V2)。
本文使用的术语QS-21家族组分是指木糖化学型QS-21 1988组分(A和B异构体，以及芹菜糖和木糖异构体：QS-21 1988 A V1、QS-21 1988 A V2、QS-21 1988 B V1和QS-211988 B V2)、木糖化学型QS-21 1856组分(A和B异构体：QS-21 1856 A和QS-21 1856 B)、鼠李糖化学型QS-212002组分(A和B异构体，以及芹菜糖和木糖异构体：QS-21 2002 A V1，QS-21 2002 A V2，QS-21 2002 B V1和QS-21 2002 B V2)。
本文所用的术语去阿拉伯呋喃糖基-QS-18家族组分是指木糖化学型去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018组分(A和B异构体，以及芹菜糖和木糖异构体：去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 A V1、去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 A V2、去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 BV1和去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 B V2)、木糖化学型去阿拉伯呋喃糖基去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 1886A和去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 1886B)、鼠李糖化学型去阿拉伯呋喃糖基-QS-182032组分(A和B异构体，以及芹菜糖和木糖异构体：去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032AV1、去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032A V2、去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032B V1和去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032B V2)。
本文所用的术语乙酰化去葡糖基-QS-17家族组分是指木糖化学型乙酰化去葡糖基-QS-17 2176组分(芹菜糖和木糖异构体：乙酰化去葡糖基-QS-172176A V1和乙酰化去葡糖基-QS-17 2176A V2)、木糖化学型乙酰化去葡糖基-QS-17 2044A组分、鼠李糖化学型乙酰化去葡糖基-QS-17 2190组分(芹菜糖和木糖异构体：乙酰化去葡糖基-QS-17 2190A V1和乙酰化去葡糖基-QS-17 2190A V2)。
本文使用的术语去阿拉伯呋喃糖基-QS-21家族组分是指木糖化学型去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856组分(A和B异构体，以及芹菜糖和木糖异构体：去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856A V1、去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856A V2、去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 B V1和去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 B V2)、木糖化学型去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1712组分(A和B异构体：去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1712A和去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1712B)、鼠李糖化学型去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870组分(A和B异构体，以及芹菜糖和木糖异构体：去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870A V1、去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870A V2、去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870B V1和去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870B V2)。
本文使用的术语乙酰化QS-21家族组分是指木糖化学型乙酰化QS-212030组分(芹菜糖和木糖异构体：乙酰化的QS-21 2030A V1和乙酰化的QS-21 2030A V2)、木糖化学型乙酰化的QS-21 1898A组分、鼠李糖化学型乙酰化的QS-21 2044组分(芹菜糖和木糖异构体：乙酰化的QS-21 2044A V1和乙酰化的QS-21 2044A V2)。
起始材料
合适地，起始皂苷通过从起始材料中提取获得。起始材料可以是从满天星属、肥皂草属或皂皮树属(Bomford，1992)植物获得的植物材料，例如从皂皮树属物种植物获得的植物材料。特定的植物材料包括从柳叶皂皮树或皂树获得的材料。在一个实施方案中，植物材料获自皂树。在一个实施方案中，植物材料获自柳叶皂皮树。
提取可以来自完整的植物。备选地，可以从选定的植物组织中提取。所选植物组织的提取物可以来自包括木材或树皮在内的植物材料，例如来自木材或树皮的植物材料。在一些实施例中，提取来自包括树皮的植物材料，例如来自树皮的植物材料。
提取可以来自从成年植物获得的植物材料。备选地，提取可以来自从幼株获得的植物材料，例如少于5年生的植物，例如少于3年生的植物。(Schlotterbeck,2015；WO2018057031)
提取可以使用水或低级醇(例如甲醇或乙醇)作为溶剂，包括它们的混合物。在一个实施方案中，起始皂苷通过水提取获得(例如，使用包含至少80％v/v水，尤其是至少90％v/v水，例如至少95％v/v水的溶剂)。在一个实施方案中，起始皂苷通过甲醇提取获得(例如，使用包含至少80％v/v甲醇，尤其是至少90％v/v甲醇，例如至少95％v/v甲醇的溶剂)。在一个实施方案中，起始皂苷通过乙醇提取获得(例如，使用包含至少80％v/v乙醇，尤其是至少90％v/v乙醇，例如至少95％v/v乙醇的溶剂)。在一个实施方案中，起始皂苷通过甲醇/乙醇提取获得(例如，使用包含至少20％v/v甲醇，尤其是至少30％v/v甲醇，例如至少40％v/v甲醇和至少20％乙醇，尤其是至少30％v/v乙醇，例如至少40％v/v乙醇的溶剂)。在一个实施方案中，起始皂苷通过水/乙醇提取获得(例如，使用包含至少20％v/v水，尤其是至少30％v/v水，例如至少40％v/v水和至少20％乙醇，尤其是至少30％v/v乙醇，例如至少40％v/v乙醇的溶剂)。在一个实施方案中，起始皂苷通过水/甲醇提取获得(例如，使用包含至少20％v/v水，尤其是至少30％v/v水，例如至少40％v/v水和至少20％甲醇，尤其是至少30％v/v甲醇，例如至少40％v/v甲醇的溶剂)。
本发明的方法可应用于多种情况下的起始皂苷。起始皂苷可以是含有皂苷的组合物中的次要组分的形式(忽略溶剂，如果有的话)，例如植物材料提取物的次要组分。起始皂苷可以是含有皂苷的组合物中主要组分的形式，如植物材料提取物中的主要组分。起始皂苷可以是加工过的(例如部分纯化的)植物材料提取物中的次要组分的形式。起始皂苷可以是加工过的(例如部分纯化的)植物材料提取物中的主要组分的形式。在一些实施方案中，起始皂苷在酶促修饰时基本上被纯化。
纯化是指将一种组分与其他组分分离。因此，部分纯化意味着一种组分在某种程度上与其他组分分离。基本纯化是指一种组分与其他组分的基本分离，例如其中该组分构成至少50％w/w，尤其是至少70％，尤其是至少80％，例如至少90％的组分含量(分别为50％，70％，80％和90％的纯度)。就提取物而言，部分纯化是指起始皂苷在某种程度上与其他提取组分分离。就提取物而言，基本纯化是指起始皂苷与其他提取的组分基本分离，例如其中起始皂苷构成至少50％w/w，尤其是至少70％，尤其是至少80％，例如至少90％的提取组分含量。可以通过各种方法进行部分或基本纯化，包括色谱法、半透膜过滤、用选择性吸附剂如聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)等处理。
尽管起始皂苷可能是特定的化学实体，但在许多涉及通过提取获得皂苷的情况下，可能存在多种起始皂苷，这些皂苷被酶促修饰以提供其相应的产物皂苷。如上所述，对于单个皂苷，本发明可以在一定范围内加以必要的修正应用于多种起始皂苷。包含相关起始皂苷的多种起始皂苷可同时进行等效的酶促修饰。包含可区分的起始皂苷的多种起始皂苷可以同时(在超过一种酶的存在下)或连续(用单独的酶顺序处理)进行不同的酶促修饰。多种起始皂苷可包含相关的和可区分的起始皂苷。
本发明的方法可应用于以下组分形式的起始皂苷：
-粗提取物，如水和/或低级醇提取物，尤其是水提物；
-天然树皮提取物(CBE),如水和/或低级醇树皮提取物，尤其是树皮水提物；
-部分纯化的提取物，如水和/或低级醇提取物，尤其是水提物；
-部分纯化的树皮提取物，如水和/或低级醇树皮提取物，尤其是树皮水提物；
-PVPP处理的提取物，如PVPP处理的水和/或低级醇提取物，尤其是PVPP处理的水提物；
-PVPP处理的树皮提取物(TBE),如PVPP处理的水和/或低级醇树皮提取物，尤其是PVPP处理的树皮水提物；
-Quil A；
-级分A；
-级分B(见Nyberg 2003)；
-级分C；
-QS-7；
-QS-17；
-QS-18；或者
-QS-21。
本发明的方法可应用于组合物中的起始皂苷，该组合物包含：
-QS-7家族组分和QS-18家族组分；
-QS-7家族组分和QS-17家族组分；
-QS-17家族组分和QS-18家族组分；
-QS-7家族组分、QS-17家族组分和QS-18家族组分。
与其他QS家族一样，QS-7家族组分包含多种相关结构，包括木糖和鼠李糖化学型、木糖和芹菜糖异构体、A和B异构体：
/>
某些QS-7家族化合物可能缺乏葡萄糖或附接在β-D-岩藻糖(beta-D-fuc)上的鼠李糖。
酶促修饰
本发明提供了皂苷的酶促修饰。本发明设想的酶促修饰包括通过从起始皂苷中除去一个或多个糖残基将起始皂苷转化为产物皂苷。合适地，本发明中设想的酶促修饰是通过从起始皂苷中除去一个或多个糖残基将起始皂苷转化为产物皂苷。
在某些实施方案中，酶促修饰包括从起始皂苷中去除单个糖残基，即去除末端糖残基(“外切”作用)。在其他实施方案中，酶促转化包括从起始皂苷中去除多个糖残基，即在糖键而不是末端位置进行切割(“内切”作用)，从而去除通过所述糖键连接的多个糖残基(例如2、3或4个糖残基)。
可以除去的特定糖残基包括(例如由以下物质组成)：
-葡萄糖，尤其是末端葡萄糖，尤其是β-葡萄糖，例如来自皂皮酸糖苷的β-葡萄糖，例如下面强调的β-D-葡萄糖残基：
-鼠李糖，尤其是末端鼠李糖，尤其是α-鼠李糖，例如来自皂皮酸糖苷的α-鼠李糖，例如下面强调的α-L-鼠李糖残基：
/>
特别是
感兴趣的特定单糖酶促转化包括：
-QS-18家族组分到QS-21家族组分，例如：
○QS-18 2150组分(即QS-18 2150 A和/或QS-18 2150 B)到QS-21 1988组分，例如：
■QS-18 2150 A组分到QS-21 1988 A组分，如：
●QS-18 2150 A V1到QS-21 1988 A V1
●QS-18 2150 A V2到QS-21 1988 A V2
■QS-18 2150 B组分到QS-21 1988 B组分，如：
●QS-18 2150 B V1到QS-21 1988 B V1
●QS-18 2150 B V2到QS-21 1998B V2
■QS-18 2150 V1组分(即QS-18 2150 A V1和/或QS-18 2150 B V1)到QS-211988 V1组分，如：
●QS-18 2150 A V1到QS-21 1988 A V1
●QS-18 2150 B V1到QS-21 1988 B V1
■QS-18 2150 V2组分(即QS-18 2150 A V2和/或QS-18 2150 B V2)到QS-211988 V2组分，如：
●QS-18 2150 A V2到QS-21 1988 A V2
●QS-18 2150 B V2到QS-21 1988 B V2
○QS-18 2018组分(即QS-18 2018 A和/或QS-18 2018 B)到QS-21 1856组分，如：
■QS-18 2018 A组分到QS-21 1856 A组分
■QS-18 2018 B组分到QS-21 1856 B组分
○QS-18 2164组分(即QS-18 2164 A和/或QS-18 2164 B)到QS-21 2002组分，例如：
■QS-18 2164 A组分到QS-21 2002 A组分，如：
●QS-18 2164 A V1到QS-21 2002 A V1
●QS-18 2164 A V2到QS-21 2002 A V2
■QS-18 2164 B组分到QS-21 2002 B组分，如：
●QS-18 2164 B V1到QS-21 2002 B V1
●QS-18 2164 B V2到QS-21 2002 B V2
■QS-18 2164 V1组分(即QS-18 2164 A V1和/或QS-18 2164 B V1)到QS-212002 V1组分，如：
●QS-18 2164 A V1到QS-21 2002 A V1
●QS-18 2164 B V1到QS-21 2002 B V1
■QS-18 2164 V2组分(即QS-18 2164 A V2和/或QS-18 2164 B V2)到QS-212002 V2组分，如：
●QS-18 2164 A V2到QS-21 2002 A V2
●QS-18 2164 B V2到QS-21 2002 B V2
-去葡糖基-QS-17家族组分到QS-21家族组分，如：
○去葡糖基-QS-17 2134组分(即去葡糖基-QS-17 2134 A和/或去葡糖基-QS-172134 B)到QS-21 1988组分，如：
■去葡糖基-QS-17 2134 A组分到QS-21 1988 A组分，如：
●去葡糖基-QS-17 2134 A V1到QS-21 1988 A V1
●去葡糖基-QS-17 2134 AV2到QS-21 1988 A V2
■去葡糖基-QS-17 2134 B组分到QS-21 1988 B组分，例如：
●去葡糖基QS-17 2134 B V1到QS-21 1988 B V1
●去葡糖基QS-17 2134 B V2到QS-21 1988 B V2
■去葡糖基-QS-17 2134 V1组分(即去葡糖基-QS-17 2134 A V1和/或去葡糖基-QS-17 2134 B V1)到QS-21 1988 V1组分，例如：
●去葡糖基-QS-17 2134 A V1到QS-21 1988 A V1
●去葡糖基QS-17 2134 B V1到QS-21 1988 B V1
■去葡糖基-QS-17 2134 V2组分(即去葡糖基-QS-17 2134 A V2和/或去葡糖基-QS-17 2134 B V2)到QS-21 1988 V2组分，例如：
●去葡糖基-QS-17 2134 A V2到QS-21 1988 A V2
●去葡糖基QS-17 2134 B V2到QS-21 1988 B V2
○去葡糖基-QS-17 2002组分(即去葡糖基-QS-17 2002 A和/或去葡糖基-QS-172002 B)到QS-21 1856组分，如：
■去葡糖基QS-17 2002 A组分到QS-21 1856 A组分
■去葡糖基QS-17 2002 B组分到QS-21 1856 B组分
○去葡糖基-QS-17 2148组分(即去葡糖基-QS-17 2148 A和/或去葡糖基-QS-172148 B)到QS-21 2002组分，如：
■去葡糖基-QS-17 2148 A组分到QS-21 2002 A组分，如：
●去葡糖基-QS-17 2148 A V1到QS-21 2002 A V1
●去葡糖基-QS-17 2148 A V2到QS-21 2002 A V2
■去葡糖基-QS-17 2148 B组分到QS-21 2002 B组分，例如：
●去葡糖基QS-17 2148 B V1到QS-21 2002 B V1
●去葡糖基QS-17 2148 B V2到QS-21 2002 B V2
■去葡糖基-QS-17 2134 V1组分(即去葡糖基-QS-17 2134 A V1和/或去葡糖基-QS-17 2134 B V1)到QS-21 1988 V1组分，例如：
●去葡糖基-QS-17 2148 A V1到QS-21 2002 A V1
●去葡糖基QS-17 2148 B V1到QS-21 2002 B V1
■去葡糖基-QS-17 2134 V2组分(即去葡糖基-QS-17 2134 A V2和/或去葡糖基-QS-17 2134 B V2)到QS-21 1988 V1组分，如：
●去葡糖基-QS-17 2148 A V2到QS-21 2002 A V2
●去葡糖基QS-17 2148 B V2到QS-21 2002 B V2
-QS-17家族组分到QS-18家族组分，例如：
○QS-17 2296组分(即QS-17 2296 A和/或QS-17 2296 B)到QS-18 2150组分，例如：
■QS-17 2296 A组分到QS-18 2150 A组分，如：
●QS-17 2296 A V1至QS-18 2150 A V1
●QS-17 2296 A V2至QS-18 2150 A V2
■QS-17 2296 B组分到QS-18 2150 B组分，如：
●QS-17 2296 B V1到QS-18 2150 B V1
●QS-17 2296 B V2到QS-18 2150 B V2
■QS-17 2296V1组分(即QS-17 2296 A V1和/或QS-17 2296 B V1)到QS-18 2150V1组分，如：
●QS-17 2296 A V1至QS-18 2150 A V1
●QS-17 2296 B V1到QS-18 2150 B V1
■QS-17 2296 V2组分(即QS-17 2296 A V2和/或QS-17 2296 B V1)到QS-182150 V2组分，如：
●QS-17 2296 A V2至QS-18 2150 A V2
●QS-17 2296 B V2到QS-18 2150 B V2
○QS-17 2164组分(即QS-17 2164 A和/或QS-17 2164 B)到QS-18 2018组分，例如：
■QS-17 2164 A组分到QS-18 2018 A组分
■QS-17 2164 B组分到QS-18 2018 B组分
○QS-17 2310组分(即QS-17 2310 A和/或QS-17 2310 B)到QS-18 2164组分，例如：
■QS-17 2310 A组分到QS-18 2164 A组分，如：
●QS-17 2310 A V1到QS-18 2164 A V1
●QS-17 2310 A V2到QS-18 2164 A V2
■QS-17 2310 B组分到QS-18 2164 B组分，如：
●QS-17 2310 B V1到QS-18 2164 B V1
●QS-17 2310 B V2到QS-18 2164 B V2
■QS-17 2310 V1组分(即QS-17 2310 A V1和/或QS-17 2310 B V1)到QS-182164 V1组分，如：
●QS-17 2310 A V1到QS-18 2164 A V1
●QS-17 2310 B V1到QS-18 2164 B V1
■QS-17 2310 V2组分(即QS-17 2310 A V2和/或QS-17 2310 B V2)到QS-182164 V2组分，如：
●QS-17 2310 A V2到QS-18 2164 A V2
●QS-17 2310 B V2到QS-18 2164 B V2
-QS-17家族组分到去葡糖基-QS-17家族组分，如：
○QS-17 2296组分(即QS-17 2296 A和/或QS-17 2296 B)到去葡糖基-QS-172134组分，如：
■QS-17 2296 A组分到去葡糖基-QS-17 2134 A组分，如：
●QS-17 2296 A V1到去葡糖基-QS-17 2134 A V1
●QS-17 2296 A V2到去葡糖基-QS-17 2134 A V2
■QS-17 2296 B组分到去葡糖基-QS-17 2134 B组分，如：
●QS-17 2296 B V1到去葡糖基-QS-17 2134 B V1
●QS-17 2296 B V2到去葡糖基-QS-17 2134 B V2
■QS-17 2296 V1组分(即QS-17 2296 A V1和/或QS-17 2296 B V1)到去葡糖基-QS-17 2134 V1组分，如：
●QS-17 2296 A V1到去葡糖基-QS-17 2134 A V1
●QS-17 2296 B V1到去葡糖基-QS-17 2134 B V1
■QS-17 2296 V2组分(即QS-17 2296 A V2和/或QS-17 2296 B V1)到去葡糖基-QS-17 2134 V2组分，如：
●QS-17 2296 A V2到去葡糖基-QS-17 2134 A V2
●QS-17 2296 B V2到去葡糖基-QS-17 2134 B V2
○QS-17 2164组分(即QS-17 2164 A和/或QS-17 2164 B)到去葡糖基-QS-172002组分，如：
■QS-17 2164 A组分到去葡糖基-QS-17 2002 A
■QS-17 2164 B组分到去葡糖基-QS-17 2002 B
○QS-17 2310组分(即QS-17 2310 A和/或QS-17 2310 B)到去葡糖基-QS-172148组分，如：
■QS-17 2310 A组分到去葡糖基-QS-17 2148 A组分，如：
●QS-17 2310 A V1到去葡糖基-QS-17 2148 A V1
●QS-17 2310 A V2到去葡糖基-QS-17 2148 A V2
■QS-17的2310 B组分到QS-21，如：
●QS-17 2310 B V1到去葡糖基-QS-17 2148 B V1
●QS-17 2310 B V2到去葡糖基-QS-17 2148 B V2
■QS-17 2310 V1组分(即QS-17 2310 A V1和/或QS-17 2310 B V1)到去葡糖基-QS-17 2148V1组分，如：
●QS-17 2310 A V1到去葡糖基-QS-17 2148 A V1
●QS-17 2310 B V1到去葡糖基-QS-17 2148 B V1
■QS-17 2310 V2组分(即QS-17 2310 A V2和/或QS-17 2310 B V2)到去葡糖基-QS-17 2148 V2组分，如：
●QS-17 2310 A V2到去葡糖基-QS-17 2148 A V2
●QS-17 2310 B V2到去葡糖基-QS-17 2148 B V2
其他感兴趣的单糖酶促转化包括：
-去阿拉伯呋喃糖基-QS-18家族组分到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21家族组分，如：
○去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018组分(即去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 A和/或去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 B)到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856组分，如：
■去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 A组分到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 A组分，如：
●去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 A V1到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 A V1
●去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 A V2到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 A V2
■去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 B组分到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 B组分，如：
●去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 B V1到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 B V1
●去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 B V2到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 B V2
■去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 V1组分(即去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 AV1和/或去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 B V1)到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 V1组分，如：
●去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 A V1到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 A V1
●去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 B V1到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 B V1
■去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 V2组分(即去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018AV2和/或去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018B V2)到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 V2组分，如：
●去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 A V2到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 A V2
●去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2018 B V2到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 B V2
ο去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 1886组分(即去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 1886 A和/或去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 1886 B)到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1712组分，如：
■去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 1886 A组分到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1712 A
■去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 1886 B组分到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1712 Bο去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032组分(即去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032 A和/或去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032 B)到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870组分，如：
■去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032 A组分到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870 A组分，如：
●去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032 A V1到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870 A V1
●QS-18 2032 A V2到去阿拉伯呋喃糖基QS-21 1870 A V2
■去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032 B组分到QS-21，如：
●去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032 B V1到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870 B V1
●QS-17去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032 B V2到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870B V2
■去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032 V1组分(即去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032 AV1和/或去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032 B V1)到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870 V1组分，如：
●去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032 A V1到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870 A V1
●去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032 B V1到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870 B V1
■去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032 V2组分(即去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032 AV2和/或去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032 B V2)到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870 V2组分，如：
●去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032 A V2到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870 A V2
●去阿拉伯呋喃糖基-QS-18 2032 B V2到去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870 B V2
-乙酰化的去葡糖基-QS-17组分到乙酰化的QS-21家族组分，如：
○乙酰化的去葡糖基-QS-17 2176 A到乙酰化的QS-21 2030 A，如：
■乙酰化的去葡糖基-QS-17 2176 A V1到乙酰化的QS-21 2030 A V1
■乙酰化的去葡糖基-QS-17 2176 A V2到乙酰化的QS-21 2030 A V2
○乙酰化去葡糖基QS-17 2044 A到乙酰化QS-21 1898 A组分
○乙酰化的去葡糖基-QS-17 2190 A到乙酰化的QS-21 2044 A，如：
■乙酰化的去葡糖基-QS-17 2190 A V1到乙酰化的QS-21 2044 A V1
■乙酰化去葡糖基-QS-17 2190 A V2到乙酰化QS-21 2044 A V2。
酶促转化可平行应用于单一起始皂苷或多种起始皂苷。应当理解，根据起始材料的组成和所用的酶，工艺可以包括或由上述转化组成。此外，虽然一种方法可能限于使用单一酶来从(i)单一起始皂苷、(ii)起始皂苷家族、或(iii)多个起始皂苷家族中去除特定的糖残基或糖残基组；这些方法还可以使用多种酶来从(i)单一起始皂苷、(ii)起始皂苷家族、或(iii)多个起始皂苷家族中去除多个糖残基。涉及多种酶的方法可以串联进行(即在任何时候将单一酶应用于皂苷材料)或平行进行(即在任何时候将超过一种的酶应用于皂苷材料，例如两种或三种酶，尤其是两种酶)，或其组合。
涉及去除多个糖残基的方法可以包括从多个起始皂苷中去除单个(但不同的)糖残基和/或从特定起始皂苷中去除多个糖残基(例如2、3或4个残基，尤其是2或3个，尤其是2个残基)。从特定起始皂苷中去除多个糖残基可能涉及在单次切割中去除单个残基和/或去除多个残基的任意组合。
示例性方法可以包括以下(例如由以下组成)：从皂皮酸糖苷中去除葡萄糖和鼠李糖，尤其是α-鼠李糖残基和β-葡萄糖残基，例如α-L-鼠李糖残基和β-D-葡萄糖残基：
感兴趣的特定多糖酶促转化包括：
-QS-17家族组分到QS-21家族组分，如：
○QS-17 2296组分(即QS-17 2296 A和/或QS-17 2296 B)到QS-21 1988组分，例如：
■QS-17 2296 A组分到QS-21 1988 A组分，如：
●QS-17 2296 A V1至QS-21 1988 A V1
●QS-17 2296 A V2至QS-21 1988 A V2
■QS-17 2296 B组分到QS-21 1988 B组分，如：
●QS-17 2296 B V1到QS-21 1988 B V1
●QS-17 2296 B V2到QS-21 1988 B V2
■QS-17 2296V1组分(即QS-17 2296 A V1和/或QS-17 2296 B V1)到QS-21 1988V1组分，如：
●QS-17 2296 A V1至QS-21 1988 A V1
●QS-17 2296 B V1到QS-21 1988 B V1
■QS-17 2296 V2组分(即QS-17 2296 A V2和/或QS-17 2296 B V2)到QS-211988 V2组分，如：
●QS-17 2296 A V2至QS-21 1988 A V2
●QS-17 2296 B V2到QS-21 1988 B V2
○QS-17 2164组分(即QS-17 2164 A和/或QS-17 2164 B)到QS-21 1856组分，例如：
■QS-17 2164 A组分到QS-21 1856 A组分
■QS-17 2164 B组分到QS-21 1856 B组分
○QS-17 2310组分(即QS-17 2310 A和/或QS-17 2310 B)到QS-21 2002组分，例如：
■QS-17 2310 A组分到QS-21 2002 A组分，如：
●QS-17 2310 A V1到QS-21 2002 A V1
●QS-17 2310 A V2到QS-21 2002 A V2
■QS-17 2310 B组分到QS-21 2002 B组分，如：
●QS-17 2310 B V1到QS-21 2002 B V1
●QS-17 2310 B V2到QS-21 2002 B V2
■QS-17 2310 V1组分(即QS-17 2310 A V1和/或QS-17 2310 B V1)到QS-212002 V1，如：
●QS-17 2310 A V1到QS-21 2002 A V1
●QS-17 2310 B V1到QS-21 2002 B V1
■QS-17 2310 V2组分(即QS-17 2310 A V2和/或QS-17 2310 B V2)到QS-212002 V2，如：
●QS-17 2310 A V2到QS-21 2002 A V2
●QS-17 2310 B V2到QS-21 2002 B V2。
提取物可能含有皂苷组分的复杂混合物，因此当存在多种酶时，可能经历多次转化。例如，用合适的β-葡萄糖苷酶和α-鼠李糖苷酶平行处理的含有QS-17、QS-18和去葡糖基-QS-17组分的起始混合物可以经历转化，包括：
-QS-18家族组分到QS-21家族组分，尤其是QS-18 2150组分到QS-21 1988组分；
-去葡糖基-QS-17家族组分到QS-21家族组分，尤其是去葡糖基-QS-17 2134组分到QS-21 1988组分；
-QS-17家族组分到去葡糖基-QS-17家族组分到QS-21组分，尤其是QS-17 2296组分到去葡糖基-QS-17 2134组分到QS-21 1988组分；和
-QS-17家族组分到QS-18家族组分到QS-21家族组分，尤其是QS-17 2296组分到QS-18 2150组分到QS-21 1988组分。
酶选择
天然和人工糖苷酶的广泛的蛋白质或DNA数据库是可用的。可以选择和筛选候选酶，以评估在特定反应条件下实现特定转化的适合性。酶的适用性取决于许多因素，包括：
-目标糖(如葡萄糖、鼠李糖)
-目标糖异头物(α或β)；
-目标糖对映体(D或L)；
-目标糖位置(内或外)；和
-目标糖环境(例如，化学/物理，影响可及性和反应性)。
促进有效转化的其他因素包括：
-转化速率；
-环境敏感性-包括pH、温度、底物、产品和污染物浓度耐受性；和
-对靶糖的特异性，包括关于其他糖残基、其他异头物、其他糖残基位置，以及相同糖异头物的不同残基和底物内位置之间的特异性(如果存在多个这样的残基)。
本领域技术人员将会理解，酶所需的特异性水平和类型将取决于要实现的目标和一般环境。
QS-18家族组分向QS-21家族组分的转化需要展示β外切葡萄糖苷酶活性的酶。
QS-17家族组分向去葡糖基-QS-17家族组分的转化需要展示β外切葡萄糖苷酶活性的酶。
去葡糖基-QS-17家族组分向QS-21家族组分的转化需要展示α外切鼠李糖苷酶活性的酶。
QS-17家族组分向QS-18家族组分的转化需要展示α外切鼠李糖苷酶活性的酶。
可以注意到，许多感兴趣的皂树起始皂苷仅含有一个葡萄糖残基。许多感兴趣的皂树起始皂苷含有多个鼠李糖残基，因此对特定鼠李糖残基的选择性实际上更为重要。例如，去葡糖基-QS-17家族组分向QS-21家族组分或QS-17家族组分向QS-18家族组分的转化需要外切鼠李糖苷酶作用相对于内切鼠李糖苷酶作用的特异性。此外，相对于其他末端鼠李糖残基(例如，在鼠李糖化学型组分中)，在阿拉伯呋喃糖部分的C2位置的α-O-鼠李糖基化的鼠李糖苷酶特异性也可能是期望的。在某些实施方案中，可能需要从鼠李糖化学型组分中除去末端鼠李糖(单独或与阿拉伯呋喃糖部分C2位置的任何α-O-鼠李糖基化一起)，以更好地促进它们与木糖化学型组分的色谱分离。
在一个实施方案中，用单一酶对皂苷原料进行酶促修饰。单一酶可以是葡萄糖苷酶，尤其是β外切葡萄糖苷酶。单一酶葡萄糖苷酶可以是本发明的工程化的葡萄糖苷酶多肽。备选地，单一酶是鼠李糖苷酶，尤其是α外切鼠李糖苷酶。单一酶鼠李糖苷酶可以是本发明的工程化的鼠李糖苷酶多肽。
优选的酶是那些能有效地将起始皂苷酶促转化为所需产物皂苷，同时对存在的其他皂苷组分表现出有限的或没有不希望的转化的酶。
在一个实施方案中，皂苷原料经过超过一种的酶，例如两种或三种酶，尤其是两种酶的酶促修饰。超过一种酶的酶促修饰可以包括顺序/系列酶促修饰。备选地，由超过一种酶进行的酶促修饰可以包括同时/平行的酶促修饰。由至少三种酶进行的酶促修饰可以包括顺序/系列(由一种酶进行的修饰)和并行/平行(由至少两种其他酶进行的修饰)酶促修饰的组合，以任何顺序。在提供多种酶的情况下，这些酶可以是不同的蛋白质，或者可以是一种或多种融合蛋白的形式。
感兴趣的酶是葡萄糖苷酶，例如β外切葡萄糖苷酶。葡萄糖苷酶可以是本发明的工程化的葡萄糖苷酶多肽。另一种感兴趣的酶是鼠李糖苷酶，例如α外切鼠李糖苷酶。鼠李糖苷酶可以是本发明的工程化的鼠李糖苷酶多肽。感兴趣的酶组合包括那些包含葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶，尤其是β外切葡萄糖苷酶和α外切鼠李糖苷酶的酶组合，例如由其组成。可以如下进行涉及葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶，尤其是β外切葡萄糖苷酶和α外切鼠李糖苷酶的酶促修饰：依次用葡萄糖苷酶(例如β外切葡萄糖苷酶)接着用鼠李糖苷酶(例如α外切鼠李糖苷酶)，依次用鼠李糖苷酶(例如α外切鼠李糖苷酶)接着用葡萄糖苷酶(例如β外切葡萄糖苷酶)，或者方便地，同时用葡萄糖苷酶(例如β外切葡萄糖苷酶)和鼠李糖苷酶(例如α外切鼠李糖苷酶)。感兴趣的特定酶组合是包含本发明的工程化的葡萄糖苷酶和本发明的工程化的鼠李糖苷酶多肽的那些，例如由其组成的那些。
所用的酶通常是皂苷材料的外源酶，即不是通过提取获得的皂苷来源中天然存在的酶。
酶可以是天然的，即天然存在的糖苷酶，或者可以是非天然存在的糖苷酶。在一个实施方案中，葡萄糖苷酶是天然存在的葡萄糖苷酶(例如外切葡萄糖苷酶，如β外切葡萄糖苷酶)。在第二实施方案中，葡萄糖苷酶是非天然存在的葡萄糖苷酶(例如外切葡萄糖苷酶，如β外切葡萄糖苷酶)。在一个实施方案中，鼠李糖苷酶是天然存在的鼠李糖苷酶(例如外切型鼠李糖苷酶，如α外切型鼠李糖苷酶)。在第二实施方案中，鼠李糖苷酶是非天然存在的鼠李糖苷酶(例如外切型鼠李糖苷酶，如α外切型鼠李糖苷酶)。
酶可以相对于参照酶进行修饰(“工程化的”)。通过工程化而引入的点突变，无论是单个的还是组合的，都可以提供益处，例如增加的活性、增加的特异性、增加的稳定性、增加的表达等。证实酶特性的试验为本领域技术人员所熟知。例如，活性可以通过如实施例中所示的方法(参见实施例4-7)或类似的方法来定量。
不同的酶可能对环境条件表现出不同的敏感性，例如pH、温度、底物浓度、产物浓度、溶剂组成、污染物的存在等。在筛选具有所需活性的候选酶的过程中，可以考虑这些参数。
具有β葡萄糖苷酶活性的候选酶包括EC3.2.1.21中的那些。
感兴趣的β外切葡萄糖苷酶包括表7中描述的那些，尤其是SEQ ID No.262、208、63、229、250、5、101、207、169、247、302、324、319、9、240、325和338，及其功能变体。感兴趣的特定β外切葡萄糖苷酶包括SEQ ID No.262、208、63、229、250、5、101、207、169、247、302、324和319及其功能变体，例如SEQ ID No.262、208、63、229、250、5、101和207及其功能变体。
另一组感兴趣的β外切葡萄糖苷酶包括表9中描述的那些，尤其是SEQ ID No.850、879、868、826、804、888、881、891、816、827、857、853、842、814、886、885、838、829、808、828、870、873、844、882、874、825、824、823、810、894、849、803、890、841、832、830、845、871、837、883和809及其功能变体。感兴趣的特定β外切葡萄糖苷酶包括SEQ ID No.850、879、868、826、804、888、881、891、816、827、857、853、842、814、886、885、838、829、808、828、870、873、844、882、874、825、824、823、810、894、849、803、890和841及其功能变体，例如SEQ IDNos.850、879、868、826、804、888、881、891、816、827、857、853、842、814、886、885、838、829、808、828、870、873、844、882、874、825、824、823、810和894及其功能变体。
SEQ ID No.262及其功能变体是特别理想的β外切葡萄糖苷酶。在一个实施方案中，β外切葡萄糖苷酶包含以下，例如由以下组成：(i)SEQ ID.262；或(ii)其与SEQ ID262具有至少80％同一性的功能变体，尤其是至少90％，尤其是至少95％，例如至少96％，至少97％，至少98％，例如至少99％同一性；或(iii)SEQ ID.262的至少100个、尤其是至少200个、尤其是至少300个、例如至少400个、例如至少500个连续氨基酸的功能片段。
具有α鼠李糖苷酶活性的候选酶包括EC3.2.1.40中的酶。
感兴趣的α外切鼠李糖苷酶包括SEQ ID No.992、1003、1052、1073、1017、1055、1075、1001、1007、1061、1079、1027、1039、1041、989、1053、1018、1066、1082、1076、993、1077、1046、1015、1063、1054、1074、1067和1033及其功能变体感兴趣的特定α外切鼠李糖苷酶包括SEQ ID No.992、1003、1052、1073、1017、1055、1075、1001、1007、1061、1079、1027、1039、1041、989、1053、1018、1066、1082、1076、993和1077及其功能变体，例如SEQ IDNo.992、1003、1052、1073、1017、1055、1075、1001、1007、1061、1079、1027、1039、1041和989及其功能变体。
SEQ ID No.1017及其功能变体是特别理想的外切鼠李糖苷酶。在一个实施方案中，α外切鼠李糖苷酶包含以下，例如由以下组成：(i)SEQ ID.1017；或(ii)其与SEQID.1017具有至少80％同一性的功能变体，尤其是至少90％，尤其是至少95％，例如至少96％，至少97％，至少98％，例如至少99％同一性；或(iii)SEQ ID.1017的至少100个、尤其是至少200个、尤其是至少300个、例如至少400个、例如至少500个连续氨基酸的功能片段。
本申请中感兴趣的功能变体包括那些包含以下，例如由以下组成的变体：(i)与参考序列具有至少80％同一性的序列，尤其是至少90％，尤其是至少95％，例如至少96％，至少97％，至少98％，例如至少99％同一性；或(ii)参考序列的至少100个，尤其是至少200个，尤其是至少300个，例如至少400个，例如至少500个连续氨基酸的片段。
感兴趣的某些期望的功能变体包括包含相对于参考序列具有1至20个添加、缺失和/或取代，尤其是1至15个添加、缺失和/或取代，尤其是1至10个添加、缺失和/或取代，例如1至5个添加、缺失和/或取代的序列，例如由其组成的那些。
序列同一性的程度可以通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法、ClustalW程序或BLASTP算法，使用默认设置来确定。使用全局比对的算法(Needleman和Wunsch)是优选的。
“序列同一性百分比”、“同一性百分比”和“百分比相同的”在本文中用于指多核苷酸序列或多肽序列之间的比较，并通过在比较窗内比较两个最佳比对的序列来确定，其中为了两个序列的最佳比对，多核苷酸或多肽序列在比较窗内的部分与参考序列相比可以包含添加或缺失(即，缺口)。通过确定相同的核酸碱基或氨基酸残基在两个序列中出现的位置的数量，或者核酸碱基或氨基酸残基带缺口对齐以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中位置的总数，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比，来计算百分比。使用BLAST和BLAST 2.0算法进行最佳比对和序列同一性百分比的确定(参见例如Altschul,1990；Altschul,1997)。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站公开地获得。简而言之，BLAST分析包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中的相同长度的字比对时，该长度为W的短字匹配或满足一些正值阈值得分T。T称为邻域字得分阈值(Altschul，同上)。这些最初的邻域字命中点充当启动搜索以查找含有它们的较长HSP的种子。然后字命中点沿着每个序列在两个方向上延伸，直到可以增加累积比对得分为止。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。在以下情况下，将停止字命中点在每个方向上的延伸：累积比对得分从其最大实现值下降了数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分趋于零或更低；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认使用字长(W)11，期望值(E)10，M＝5，N＝-4并比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10、以及BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff,1989)。
在提供两个序列的百分同一性方面，许多其他算法是可用的，其功能类似于BLAST。可以进行用于比较的序列的最佳比对，例如通过Smith,1981的局部同源性算法，Needleman,1970的同源性比对算法，Pearson,1988的搜索相似性方法，通过这些算法的计算机化实现(GCG威斯康辛软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA)，或通过目测(一般参见Current Protocols in Molecular Biology,1995)。此外，序列比对和序列同一性百分比的确定可以采用GCG威斯康辛软件包(Accelrys，Madison WI)中的BESTFIT或GAP程序，使用提供的默认参数。ClustalW程序也适用于确定身份。
海洋贫养杆菌葡萄糖苷酶(Uniparc参考号UPI000260A2FA，Uniprot参考号I4EYD5-SEQ ID No.262)是一种天然存在的葡萄糖苷酶，其表现出β外切葡萄糖苷酶活性，并且例如能够将QS-18家族组分转化为QS-21家族组分。尽管野生型海洋贫养杆菌葡萄糖苷酶具有有效的活性，但发明人发现，通过引入一个或多个突变，可以改变其特性。
本发明提供了工程化的葡萄糖苷酶多肽，其包含以下，例如由以下组成：与SEQ IDNo.262的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或其功能片段，其中所述工程化的葡萄糖苷酶多肽包含至少一个来自以下的残基取代：
F44Y；
V60L；
G117A；
F170N；
V263G或V263L；
N351H或N351Q；
A355H、A355I、A355L、A355M、A355R、A355T或A355W；
A356P；
R357A、R357C、R357K、R357M或R357Q；
G362C；
T365A、T365N或T365S；
L367C；
V394R；
V395Y；
Q396E、Q396G、Q396N、Q396P、Q396R、Q396S或Q396Y；
F430W；
R435F；
V438T；
V440F；
F442M或F442Q；
G444T；
A473F或A473R；
L474C、L474I或L474V；
I475F；
L492C、L492G、L492H、L492I、L492N、L492Q、L492V、L492W或L492Y；
Q493F或Q493H；
P494H或P494I；
S495I、S495K或S495Q；
G496P或G496W；
D498A、D498E、D498F、D498I、D498K、D498L、D498N、D498P、D498R、D498S、D498T或D498V；
A502R；
M504G或M504R；
L507A或L507R；
T508M；
L529M；
F535P；
A536D或A536E；
A537R；
F541A、F541I、F541L、F541M或F541V；
L542I；
Q543G或Q543L；
E547L；和
Y585W。
葡萄糖苷酶将包含1至42个取代，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26至30或31至43个取代。
本发明还提供了工程化的葡萄糖苷酶多肽，其包含以下，例如由以下组成：与SEQID No.262的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或其功能片段，其中所述工程化的葡萄糖苷酶多肽包含至少一个来自以下的残基取代：
F44Y；
V263L；
N351H；
A355H、A355M或A355W；
R357M；
T365N；
L367C；
Q396R；
V438T；
F442Q；
L474C；
I475F；
L492V、L492N或L492H，
M504R；
L507R；和
F541I。
葡萄糖苷酶将包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个或所有十六个取代。
所述经工程化的葡萄糖苷酶多肽可包含以下，例如由以下组成：与SEQ ID No.262的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或其功能片段，其中所述工程化的葡萄糖苷酶多肽包含至少一个来自以下的残基取代：F44Y、V263L、A355W、R357M、T365N、L367C、Q396R、F442Q、L474C、I475F和F541I。
合适地，工程化的葡萄糖苷酶多肽包含以下，例如由以下组成：与SEQ ID No.262的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或其功能片段，其中所述工程化的葡萄糖苷酶多肽包含以下残基取代：F44Y、V263L、A355W、R357M、T365N、L367C、Q396R、F442Q、L474C、I475F和F541I。
本发明提供了一种多肽，其包含SEQ ID No.262序列的氨基酸序列，具有一至二十五个选自以下的突变：
(i)F44Y
(ii)V263L
(iii)N351H
(iv)A355H、A355I、A355L、A355M、A355R、A355T或A355W
(v)A356P
(vi)R357M
(vii)T365N
(viii)L367C
(ix)F442Q
(x)G443D
(xi)A473F
(xii)L474C
(xiii)I475F
(xiv)L492H、L492N、L492V
(xv)P494I
(xvi)G496P
(xvii)D498P
(xviii)M504R
(xix)L507R
(xx)F535P
(xxi)A537R
(xxii)F541I
(xxiii)L542I
(xxiv)E547L和
(xxv)E588K。
变体葡萄糖苷酶将包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或所有25个突变。
在一些实施方案中，工程化的葡萄糖苷酶不是包含具有1至25个选自以下的突变的、SEQ ID No.262的氨基酸序列的多肽：
(i)F44Y
(ii)V263L
(iii)N351H
(iv)A355H、A355I、A355L、A355M、A355R、A355T或A355W
(v)A356P
(vi)R357M
(vii)T365N
(viii)L367C
(ix)F442Q
(x)G443D
(xi)A473F
(xii)L474C
(xiii)I475F
(xiv)L492H、L492N、L492V
(xv)P494I
(xvi)G496P
(xvii)D498P
(xviii)M504R
(xix)L507R
(xx)F535P
(xxi)A537R
(xxii)F541I
(xxiii)L542I
(xxiv)E547L和
(xxv)E588K。
上述工程化的葡萄糖苷酶多肽在本文中也可称为“变体葡萄糖苷酶”的实例。
变体葡萄糖苷酶可以包含F44Y。
变体葡萄糖苷酶可以包含V60L。
变体葡萄糖苷酶可以包含G117A。
变体葡萄糖苷酶可以包含F170N。
变体葡萄糖苷酶可以包含V263G或V263L，尤其是V263L。
变体葡萄糖苷酶可以含有N351H或N351Q，尤其是N351H。
变体葡萄糖苷酶可以包含A355H、A355I、A355L、A355M、A355R、A355T或A355W。在一些实施方案中，变体葡萄糖苷酶包含A355H。在一些实施方案中，变体葡萄糖苷酶包含A355I。在一些实施方案中，变体葡萄糖苷酶包含A355L。在一些实施方案中，变体葡萄糖苷酶包含A355M。在一些实施方案中，变体葡萄糖苷酶包含A355R。在一些实施方案中，变体葡萄糖苷酶包含A355T。在一些实施方案中，变体葡萄糖苷酶包含A355W。
变体葡萄糖苷酶可以包含A356P。
变体葡萄糖苷酶可以包含R357A、R357C、R357K、R357M或R357Q，尤其是R357M。
变体葡萄糖苷酶可以包含G362C。
变体葡萄糖苷酶可以包含T365A、T365N或T365S，尤其是T365N。
变体葡萄糖苷酶可以包含L367C。
变体葡萄糖苷酶可以包含V394R。
变体葡萄糖苷酶可以包含V395Y。
变体葡萄糖苷酶可以包含Q396E、Q396G、Q396N、Q396P、Q396R、Q396S或Q396Y，尤其是Q396R。
变体葡萄糖苷酶可以包含F430W。
变体葡萄糖苷酶可以包含R435F。
变体葡萄糖苷酶可以包含V438T。
变体葡萄糖苷酶可以包含V440F。
变体葡萄糖苷酶可以包含F442M或F442Q，尤其是F442Q。
变体葡萄糖苷酶可以包含G443D。
变体葡萄糖苷酶可以包含G444T。
变体葡萄糖苷酶可以含有A473F或A473R，尤其是A473F。
变体葡萄糖苷酶可以包含L474C、L474I或L474V，尤其是L474C。
变体葡萄糖苷酶可以包含I475F。
变体葡萄糖苷酶可以包含L492C、L492G、L492H、L492I、L492N、L492Q、L492V、L492W或L492Y，尤其是L492H、L492N、L492V。在一些实施方案中，变体葡萄糖苷酶包含L492H。在一些实施方案中，变体葡萄糖苷酶包含L492N。在一些实施方案中，变体葡萄糖苷酶包含L492V。
变体葡萄糖苷酶可以包含Q493F或Q493H。
变体葡萄糖苷酶可以包含P494H或P494I，尤其是P494I。
变体葡萄糖苷酶可以包含S495I、S495K或S495Q。
变体葡萄糖苷酶可以含有G496P或G496W，尤其是G496P。
变体葡萄糖苷酶可以包含D498A、D498E、D498F、D498I、D498K、D498L、D498N、D498P、D498R、D498S、D498T或D498V，尤其是D498P。
变体葡萄糖苷酶可以包含A502R。
变体葡萄糖苷酶可以包含M504G或M504R，尤其是M504R。
变体葡萄糖苷酶可以包含L507A或L507R，尤其是L507R。
变体葡萄糖苷酶可以包含T508M。
变体葡萄糖苷酶可以包含L529M。
变体葡萄糖苷酶可以包含F535P。
变体葡萄糖苷酶可以包含A536D或A536E。
变体葡萄糖苷酶可以包含A537R。
变体葡萄糖苷酶可以包含有F541A、F541I、F541L、F541M或F541V，尤其是F541I。
变体葡萄糖苷酶可以包含L542I。
变体葡萄糖苷酶可以包含Q543G或Q543L。
变体葡萄糖苷酶可以包含E547L。
变体葡萄糖苷酶可以包含Y585W。
变体葡萄糖苷酶可以包含E588K。
变体葡萄糖苷酶可以包含R357M、T365N、A473F、L474C和I475F。
变体葡萄糖苷酶可以包含F44Y、R357M、T365N、F442Q、A473F、L474C和I475F。
变体葡萄糖苷酶可以包含F44Y、V263L、R357M、T365N、F442Q、A473F、L474C、I475F和F541I。
变体葡萄糖苷酶可以包含F44Y、V263L、A355W、R357M、T365N、L367C、Q396R、F442Q、L474C、I475F和F541I。
变体葡萄糖苷酶可包含F44Y、V263L、R357M、T365N、F442Q、L474C、I475F、F541I和选自由以下组成的列表的0至17个突变：
(iii)N351H
(iv)A355H、A355I、A355L、A355M、A355R、A355T或A355W
(v)A356P
(viii)L367C
(x)G443D
(xi)A473F
(xiv)L492H、L492N、L492V
(xv)P494I
(xvi)G496P
(xvii)D498P
(xviii)M504R
(xix)L507R
(xx)F535P
(xxi)A537R
(xxiii)L542I
(xxiv)E547L和
(xxv)E588K。
变体葡萄糖苷酶可包含“标签”，即允许多肽的分离和/或鉴定的氨基酸序列。例如，添加亲和标签在纯化中是有用的。可以使用的示例性亲和标签包括组氨酸(HIS)标签(例如，六组氨酸标签或6His标签)、FLAG标签和HA标签。标签可以位于N-末端或C-末端，并且可以直接连接或通过连接序列附接。SEQ ID No.1177提供了具有接头序列的示例性6XHis标签的序列，该接头序列可以附接在N-末端。SEQ ID No.1178提供了具有接头序列的示例性6XHis标签的序列，该接头序列可以附接在C-末端。
在某些实施方案中，一旦不再需要，例如在多肽被纯化后，本文所用的标签是可去除的，例如通过化学试剂或酶方法去除。
变体葡萄糖苷酶可包含1000个残基或更少，尤其是950个残基或更少，尤其是900个残基或更少，例如850个残基或更少。
变体葡萄糖苷酶可由以下组成：SEQ ID No.262的氨基酸序列，其具有选自由以下组成的列表中的1至25个突变：
(i)F44Y
(ii)V263L
(iii)N351H
(iv)A355H、A355I、A355L、A355M、A355R、A355T或A355W
(v)A356P
(vi)R357M
(vii)T365N
(viii)L367C
(ix)F442Q
(x)G443D
(xi)A473F
(xii)L474C
(xiii) I475F
(xiv) L492H、L492N、L492V
(xv)P494I
(xvi)G496P
(xvii)D498P
(xviii)M504R
(xix)L507R
(xx)F535P
(xxi)A537R
(xxii)F541I
(xxiii)L542I
(xxiv)E547L和
(xxv)E588K。
变体葡萄糖苷酶期望地表现出相对于SEQ ID No.262的至少1.05，尤其是至少2，尤其是至少10，例如至少50的FIOP(相对于亲本的倍数改进)。FIOP可以通过实施例4中描述的方法来测定。
黄色克雷伯氏菌鼠李糖苷酶(Uniparc参考号UPI00019BDB13，Uniprot参考号D2PMT5–本文的SEQ ID No.1017)是一种天然存在的鼠李糖苷酶，表现出α外切鼠李糖苷酶活性，并且例如能够将去葡糖基-QS-17家族组分转化为QS-21家族组分。尽管野生型黄色克雷伯氏菌鼠李糖苷酶具有有效的活性，但发明人发现，通过引入一个或多个突变，可以改变其特性。
本发明提供了工程化的鼠李糖苷酶多肽，其包含以下，例如由以下组成：与SEQ IDNo.1017的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或其功能片段，其中所述工程化的鼠李糖苷酶多肽包含至少一个来自以下的残基取代：
(i)A56C
(ii)A143P
(iii)Q181H、Q181R或Q181S
(iv)L214M
(v)G215S
(vi)F216M
(vii)G218D或G218N
(viii)K219G
(ix)A238M
(x)T252Y
(xi)T311W
(xii)V326C
(xiii)G357C
(xiv)S369C、S369I、S369K或S369M
(xv)I487M、I487Q或I487V
(xvi)K492N
(xvii)V499T
(xviii)G508S
(xix)R543C
(xx)L557Y
(xxi)G634A
(xxii)S635N
(xxiii)A690C和
(xxiv)Q921H。
因此，本发明提供了一种多肽，其包含SEQ ID No.1017序列的氨基酸序列，具有一至二十四个选自由以下组成的列表中的突变：
(i)A56C
(ii)A143P
(iii)Q181H、Q181R或Q181S
(iv)L214M
(v)G215S
(vi)F216M
(vii)G218D或G218N
(viii)K219G
(ix)A238M
(x)T252Y
(xi)T311W
(xii)V326C
(xiii)G357C
(xiv)S369C、S369I、S369K或S369M
(xv)I487M、I487Q或I487V
(xvi)K492N
(xvii)V499T
(xviii)G508S
(xix)R543C
(xx)L557Y
(xxi)G634A
(xxii)S635N
(xxiii)A690C和
(xxiv)Q921H。
此类多肽在本文中可被称为“变体鼠李糖苷酶”。
变体鼠李糖苷酶将包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十、二十一、二十二、二十三或所有二十四个突变。
变体鼠李糖苷酶可包含A56C。
变体鼠李糖苷酶可包含A143P。
变体鼠李糖苷酶可包含Q181H、Q181R或Q181S。在一些实施方案中，变体鼠李糖苷酶包含Q181H。在一些实施方案中，变体鼠李糖苷酶包含Q181R。在一些实施方案中，变体鼠李糖苷酶包含Q181S。
变体鼠李糖苷酶可包含L214M。
变体鼠李糖苷酶可包含G215S。
变体鼠李糖苷酶可包含F216M。
变体鼠李糖苷酶可包含G218D或G218N。在一些实施方案中，变体鼠李糖苷酶包含G218D。在一些实施方案中，变体鼠李糖苷酶包含G218N。
变体鼠李糖苷酶可包含K219G。
变体鼠李糖苷酶可包含A238M。
变体鼠李糖苷酶可包含T252Y。
变体鼠李糖苷酶可包含T311W。
变体鼠李糖苷酶可包含V326C。
变体鼠李糖苷酶可包含G357C。
变体鼠李糖苷酶可包含S369C、S369I、S369K或S369M。在一些实施方案中，变体鼠李糖苷酶包含S369C。在一些实施方案中，变体鼠李糖苷酶包含S369I。在一些实施方案中，变体鼠李糖苷酶包含S369K。在一些实施方案中，变体鼠李糖苷酶包含S369M。
变体鼠李糖苷酶可包含I487M、I487Q或I487V。在一些实施方案中，变体鼠李糖苷酶包含I487M。在一些实施方案中，变体鼠李糖苷酶包含I487Q。在一些实施方案中，变体鼠李糖苷酶包含I487V。
变体鼠李糖苷酶可包含K492N。
变体鼠李糖苷酶可包含V499T。
变体鼠李糖苷酶可包含G508S。
变体鼠李糖苷酶可包含R543C。
变体鼠李糖苷酶可包含L557Y。
变体鼠李糖苷酶可包含G634A。
变体鼠李糖苷酶可包含S635N。
变体鼠李糖苷酶可包含A690C。
变体鼠李糖苷酶可包含Q921H。
变体鼠李糖苷酶可包含A143P、L214M、K219G和Q921H。
变体鼠李糖苷酶可包含A143P、L214M、K219G、G357C和Q921H。
变体鼠李糖苷酶可包含A143P、L214M、G215S、G218N、K219G、G357C、G508S、G634A和Q921H。
变体鼠李糖苷酶可包含A143P、L214M、G215S、G218D、K219G、G357C、G508S、G634A、A690C和Q921H。
变体鼠李糖苷酶可包含A143P、L214M、G215S、K219G、G357C、G508S、G634A和Q921H和选自由以下组成的列表的1至16个突变：
(i)A56C
(iii)Q181H、Q181R或Q181S
(vi)F216M
(vii)G218D或G218N
(ix)A238M
(x)T252Y
(xi)T311W
(xii)V326C
(xiv)S369C、S369I、S369K或S369M
(xv)I487M、I487Q或I487V
(xvi)K492N
(xvii)V499T
(xix)R543C
(xx)L557Y
(xxii)S635N和
(xxiii)A690C。
变体鼠李糖苷酶可包含A143P、L214M、G215S、K219G、G357C、G508S、G634A、Q921H、G218D或G218N和选自由以下组成的列表的1至15个突变：
(i)A56C
(iii)Q181H、Q181R或Q181S
(vi)F216M
(ix)A238M
(x)T252Y
(xi)T311W
(xii)V326C
(xiv)S369C、S369I、S369K或S369M
(xv)I487M、I487Q或I487V
(xvi)K492N
(xvii)V499T
(xix)R543C
(xx)L557Y
(xxii)S635N和
(xxiii)A690C。
变体鼠李糖苷酶可包含“标签”，即允许多肽的分离和/或鉴定的氨基酸序列。例如，添加亲和标签在纯化中是有用的。可以使用的示例性亲和标签包括组氨酸(HIS)标签(例如，六组氨酸标签或6HIS标签)、FLAG标签和HA标签。标签可以位于N-末端或C-末端，并且可以直接连接或通过连接序列附接。SEQ ID No.1177提供了具有接头序列的示例性6XHis标签的序列，该接头序列可以附接在N-末端。SEQ ID No.1178提供了具有接头序列的示例性6XHis标签的序列，该接头序列可以附接在C-末端。
在某些实施方案中，一旦不再需要，例如在多肽被纯化后，本文所用的标签是可去除的，例如通过化学试剂或酶方法去除。
变体鼠李糖苷酶可包含1100个残基或更少，尤其是1050个残基或更少，尤其是1000个残基或更少，例如950个残基或更少。
变体鼠李糖苷酶可由以下组成：SEQ ID No.1017的氨基酸序列，其具有选自由以下组成的列表的1至24个突变：
(i)A56C
(ii)A143P
(iii)Q181H、Q181R或Q181S
(iv)L214M
(v)G215S
(vi)F216M
(vii)G218D或G218N
(viii)K219G
(ix)A238M
(x)T252Y
(xi)T311W
(xii)V326C
(xiii)G357C
(xiv)S369C、S369I、S369K或S369M
(xv)I487M、I487Q或I487V
(xvi)K492N
(xvii)V499T
(xviii)G508S
(xix)R543C
(xx)L557Y
(xxi)G634A
(xxii)S635N
(xxiii)A690C和
(xxiv)Q921H。
变体鼠李糖苷酶期望地表现出相对于SEQ ID No.1017的至少1.05，尤其是至少2，尤其是至少10，例如至少50的FIOP。FIOP可以通过实施例4中描述的方法来测定。
就功能变体而言，功能要求糖苷酶活性不会因序列变异而显著降低，通常在至少一组条件下的至少一个皂苷修饰反应中保持至少50％的糖苷酶活性，尤其是至少75％的活性，尤其是至少90％，例如至少100％的活性(活性由起始皂苷向产物皂苷的修饰速率决定)。以某种方式(例如转化速率；特异性，其可根据需要增加或减少；对环境条件的耐受性，例如pH、底物浓度、产物浓度、其他污染物等；热稳定性或化学稳定性；生产，例如在皂苷修饰之前或之后促进糖苷酶的表达或纯化)改善糖苷酶，可以产生变体。变体不需要在所有方面都进行改进，并且可以简单地展示相对于参考序列的不同的特征平衡。
糖苷酶通常为2000个氨基酸或更少，例如1500个氨基酸或更少。
合适的是，糖苷酶是可溶的。
糖苷酶可以被固定，例如通过附接到固体(例如聚合物)颗粒上。糖苷酶的固定化可以促进从反应混合物中分离，提高热稳定性和/或对环境条件的耐受性。
糖苷酶可以包含“标签”，即，允许分离和/或鉴定多肽的氨基酸序列。例如，添加亲和标签可用于纯化。可以使用的示例性亲和标签包括组氨酸(HIS)标签(例如，六组氨酸标签或6HIS标签)、FLAG标签和HA标签。标签可以位于N-末端或C-末端，并且可以直接连接或通过连接序列附接。SEQ ID No.1177提供了具有接头序列的示例性6XHis标签的序列，该接头序列可以附接在N-末端。SEQ ID No.1178提供了具有接头序列的示例性6XHis标签的序列，该接头序列可以附接在C-末端。
反应条件
可以使用任何合适的反应条件。最佳条件将取决于一系列因素，包括起始皂苷、产物皂苷、所用酶等的特性。
该反应需要用一种或多种糖苷酶处理一种或多种起始皂苷。可以将合适的糖苷酶加入到一系列形式的含有皂苷的组合物中，例如溶液(通常为水性的)、悬浮液(通常为水性的)或固体。糖苷酶可以是纯化的、部分纯化的(如澄清的细胞裂解物)或未纯化的形式(粗细胞裂解物或未裂解的细胞)。当源细胞(例如重组宿主细胞，如大肠杆菌)表达酶的程度足以使所需活性超过其他宿主细胞污染物产生的任何有害影响时，使用部分纯化或未纯化的形式可能是令人感兴趣的。理想地，糖苷酶以澄清的裂解物的形式加入。糖苷酶可以是新鲜制备的(例如澄清的裂解物)或取自储存，例如解冻的冷冻液体(例如澄清的裂解物)或重构的干燥材料(例如冻干的澄清的裂解物)。当平行使用多种糖苷酶时，这些酶通常在不同的宿主细胞中表达，以确保足够的过程控制。平行使用的多种糖苷酶可以一起加入或分开加入(以相同或不同的形式)。
糖苷酶可以使用蛋白质分泌系统，例如地衣芽孢杆菌产生。
存在的糖苷酶的重量可以在0.0001mg至25mg/ml、尤其是0.0001mg至5mg/ml、尤其是0.0001mg至1mg/ml、例如0.001mg至0.5mg/ml的范围内。当以干燥的澄清裂解物的形式提供时，存在的糖苷酶的重量可以在0.01mg至100mg裂解物/ml、尤其是0.01mg至30mg/ml、尤其是0.01mg至5mg/ml、例如0.01mg至1mg/ml的范围内。
可以使用任何合适的pH，尽管通常在pH 4至9之间，尤其是pH 5至8，尤其是pH 5.5至7.5，例如pH 5.5至6.5。当串联使用多种糖苷酶时，每种酶促修饰可以在不同的pH下进行，尽管为了方便起见，它们可以在相同的pH下进行。
缓冲液可以用来帮助控制pH。合适的缓冲液和合适的浓度可以从标准来源获得。通常使用无机盐缓冲液，例如磷酸钾、磷酸钠、乙酸钾、乙酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸钠等。合适的缓冲液浓度可以是10mM至500mM，尤其是25mM至250mM，尤其是50mM至100mM。可以使用约50mM，例如50mM或约100mM，例如100mM的缓冲液浓度。
可以使用任何合适的温度，尽管通常在10℃至60℃之间，尤其是15℃至50℃，尤其是15℃至45℃，例如20℃至42℃。
使反应充分进行的合适时间通常为长达10天，尤其是长达5天，尤其是长达3天。理想地，选择酶和反应条件，使得反应在长达2天，尤其是长达1天，尤其是长达18小时，例如12小时，例如长达6小时的时间内充分进行。
反应将在合适的溶剂中进行，通常是水或具有水混溶性助溶剂的水溶液，例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、四氢呋喃、乙二醇、甘油、1,3-丙二醇或乙腈。任何助溶剂的存在量应该不会对反应进程造成过度的损害，例如50％或更低的v/v，尤其是20％或更低，尤其是10％或更低，例如5％或更低，例如2％或更低(总计)。
该反应可以是均相或非均相的、单相的、两相的或多相的，存在颗粒、悬浮的分散固体和/或胶体胶束。理想的反应是单相的。
起始皂苷可以以0.001至100g/升，尤其是0.005至75g/升，尤其是0.01至50g/升，例如0.1至25g/升，例如1至10g/升的浓度存在。
该反应可以在各种操作模式下进行，例如分批模式、补料分批模式或连续模式。
该反应通常以能够提供商业量的产物皂苷的规模进行。分批反应体积可以是至少10ml,，尤其是至少100ml,，尤其是至少1L。分批反应体积可以是500ml至2000L，尤其是1L在1000L，尤其是10L至500L，例如25L至200L。
完成和质量平衡
理想的是，酶对起始皂苷向产物皂苷的转化而不是起始皂苷的其他转化具有足够的选择性。如本文所用，术语选择性是指至少25％(基于摩尔)的转化的起始皂苷产生预期的产物皂苷，尤其是至少50％，尤其是至少75％，例如至少90％(例如至少95％)。
选择性的概念也可以应用于将多种起始皂苷转化为多种产物皂苷的情况，使得至少25％的转化起始皂苷(基于摩尔)产生预期的产物皂苷，尤其是至少50％，尤其是至少75％，例如至少90％(例如至少95％)。
理想地，完成了起始皂苷向产物皂苷的转化。然而，转化速率、转化的特异性(包括非特异性转化的速率)、产物抑制、反应条件下起始皂苷的稳定性、反应条件下产物皂苷的稳定性等意味着转化可能不完全，或者期望(例如为了最大产率或为了获得产率和工艺时间之间的平衡)在完成之前停止转化。
酶的去除
当反应进行到所需程度时，可以通过变性或去除酶来停止反应。例如，可以将反应混合物的pH调节至约pH 3.5至4，尤其是pH 3.5至4，尤其是pH3.8，和/或加入足量的反溶剂或变性溶剂如乙腈。沉淀的酶可以通过过滤除去。
其化定义
术语“在先峰”是指本文所述HPLC-UV方法中紧邻QS-21主峰之前的峰(见图2)。
术语“m/z”是指单同位素峰的质荷比。除非另有说明，否则‘m/z’由负离子电喷雾质谱测定。
术语“离子丰度”是指在样品中测量的特定m/z的量，或者根据上下文需要在给定的峰中测量的特定m/z的量。指定m/z的质谱图可从本文所述的UPLC-UV/MS方法中的MS总离子色谱图中提取。质谱图绘制了信号强度对时间的曲线。离子丰度以积分峰的面积来衡量。指定m/z的面积/相对参考m/z的面积＝相对丰度。
术语“214nm处的UV吸光度”是指UV吸光度色谱图中积分峰的面积。(指定峰的面积)/(谱图中所有积分峰的面积)x 100＝指定峰的面积百分比。
术语“214nm处的UV吸光度和相对离子丰度”是指对共洗脱物质的给定m/z的百分比的估计。(给定UV峰的面积百分比)x(给定峰中感兴趣的m/z的相对离子丰度)/(给定峰中所有相对离子丰度的总和)＝给定UV峰中感兴趣的m/z的百分比，假设所有共洗脱物质都包含相对离子丰度。
术语“其中最丰富种类的单同位素是1988m/z”是指最丰富种类的单同位素，在每m/z具有最高响应的同位素组中的第一个峰是m/z 1987.9。最丰富种类可以通过使用本文所述的UPLC-UV/MS方法(负离子电喷雾)在整个总离子色谱图中创建组合光谱来确定。
术语“干燥的”是指基本上所有的溶剂都已被除去。干燥的提取物通常含有少于5％w/w的溶剂，尤其是少于2.5％(例如少于5％w/w的水，尤其是少于2.5％)。合适地，干燥的提取物将含有100ppm或更少的乙腈(w/w)。
此外，提供了一种生产皂苷组合物的方法，包括以下步骤：
(i)通过聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)吸附处理皂树的粗水提物；
(ii)用葡萄糖苷酶和/或鼠李糖苷酶对经处理的提取物进行酶促修饰；
(iii)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；和
(iv)用苯基树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物，得到皂苷组合物。
还提供了一种生产皂苷组合物的方法，包括以下步骤：
(i)通过聚乙烯聚吡咯烷酮吸附处理皂树的粗水提物；
(ii)用工程化的葡萄糖苷酶多肽对经处理的提取物进行酶促修饰；
(iii)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；和
(iv)用苯基树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物，得到皂苷组合物。
另外提供了一种生产皂苷组合物的方法，包括以下步骤：
(i)通过聚乙烯聚吡咯烷酮吸附处理皂树的粗水提物；
(ii)用工程化的鼠李糖苷酶多肽对经处理的提取物进行酶促修饰；
(iii)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；和
(iv)用苯基树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物，得到皂苷组合物。
还提供了一种生产皂苷组合物的方法，包括以下步骤：
(i)通过聚乙烯聚吡咯烷酮吸附处理皂树的粗水提物；
(ii)用工程化的葡萄糖苷酶和工程化的鼠李糖苷酶对经处理的提取物进行酶促修饰；
(iii)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；和
(iv)用苯基树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物，得到皂苷组合物。
典型地，粗水提物是树皮提取物。皂树粗水提物的水溶液中的QS-21主峰含量合适地为至少1g/L，例如至少2g/L，尤其是至少2.5g/L，尤其是至少2.8g/L(例如，通过相对于已知浓度的对照样品的UV吸光度测定)。
通过聚乙烯聚吡咯烷酮吸附纯化提取物的步骤包括用聚乙烯聚吡咯烷酮吸附剂如树脂处理提取物。通常，将提取物与聚乙烯聚吡咯烷酮树脂一起搅拌。提取物随后可以通过过滤与吸附有杂质的聚乙烯聚吡咯烷酮树脂分离。这一步通常去除多酚类杂质，如单宁。
使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化提取物的步骤通常使用乙腈和水作为溶剂，通常用合适的酸如乙酸酸化。合适的树脂的实例是Amberchrom XT20。可以使用等度条件进行色谱分析，尽管通常在溶剂梯度(连续的，例如线性的，或步进的)下操作，例如实施例中提供的那些。该方法的这一步骤通常除去非皂苷物质并富集所需的皂苷。每次聚苯乙烯色谱运行的规模通常在25-200g QS-21，例如在50-150g，尤其是在70-110g之间(量基于通过UV确定的在材料中的QS-21主峰含量)。
使用苯基树脂通过反相色谱法纯化提取物通常使用乙腈和水作为溶剂，通常用合适的酸如乙酸酸化。可以使用溶剂梯度(连续的，如线性的，或步进的)进行色谱分析，尽管通常在等度条件下操作。该方法的这一步骤提供了所需皂苷的最终纯化。可将选定的部分合并以使符合要求标准的材料产量最大化。每次苯基色谱运行的规模通常在4-40g QS-21，例如在10-30g，尤其是在13-21g之间(量基于通过UV确定的在材料中的QS-21主峰含量)。
该方法还包括除去溶剂以提供干燥的皂苷提取物的步骤。因此，本发明提供了一种生产皂苷组合物的方法，包括以下步骤：
(i)通过聚乙烯聚吡咯烷酮吸附处理皂树的粗水提物；
(ii)用葡萄糖苷酶和/或鼠李糖苷酶对经处理的提取物进行酶促修饰；
(iii)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；和
(iv)使用苯基树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；和
(v)除去溶剂以提供干燥的皂苷组合物。
本发明还提供了一种生产皂苷组合物的方法，包括以下步骤：
(i)通过聚乙烯聚吡咯烷酮吸附处理皂树的粗水提物；
(ii)用工程化的葡萄糖苷酶多肽对经处理的提取物进行酶促修饰；
(iii)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；和
(iv)使用苯基树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；和
(v)除去溶剂以提供干燥的皂苷组合物。
还提供了一种生产皂苷组合物的方法，包括以下步骤：
(i)通过聚乙烯聚吡咯烷酮吸附处理皂树的粗水提物；
(ii)用工程化的鼠李糖苷酶多肽对经处理的提取物进行酶促修饰；
(iii)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；和
(iv)使用苯基树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；和
(v)除去溶剂以提供干燥的皂苷组合物。
另外提供了一种生产皂苷组合物的方法，包括以下步骤：
(i)通过聚乙烯聚吡咯烷酮吸附处理皂树的粗水提物；
(ii)用工程化的葡萄糖苷酶多肽和工程化的鼠李糖苷酶多肽对经处理的提取物进行酶促修饰；
(iii)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；和
(iv)使用苯基树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；和
(v)除去溶剂以提供干燥的皂苷组合物。
为了提高干燥效率，可能需要采取进一步的浓缩提取物的步骤，例如通过使用合适的技术，例如反相色谱法(例如使用C8树脂)的捕获和释放，和/或在干燥步骤之前交换溶剂。
还提供了一种生产皂苷组合物的方法，包括以下步骤：
(i)通过聚乙烯聚吡咯烷酮吸附处理皂树的粗水提物；
(ii)用葡萄糖苷酶和/或鼠李糖苷酶对经处理的提取物进行酶促修饰；
(iii)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；和
(iv)使用苯基树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；
(v)任选地浓缩经修饰的提取物；
(vi)任选地交换溶剂；和
(vii)除去剩余的溶剂以提供干燥的皂苷组合物；
其中步骤(v)和(vi)可以任选地颠倒顺序或同时进行，尽管通常以所示的顺序。
还提供了一种生产皂苷组合物的方法，包括以下步骤：
(i)通过聚乙烯聚吡咯烷酮吸附处理皂树的粗水提物；
(ii)用工程化的葡萄糖苷酶多肽对经处理的提取物进行酶促修饰；
(iii)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；和
(iv)使用苯基树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；
(v)任选地浓缩经修饰的提取物；
(vi)任选地交换溶剂；和
(vii)除去剩余的溶剂以提供干燥的皂苷组合物；
其中步骤(v)和(vi)可以任选地颠倒顺序或同时进行，尽管通常以所示的顺序。
另外提供了一种生产皂苷组合物的方法，包括以下步骤：
(i)通过聚乙烯聚吡咯烷酮吸附处理皂树的粗水提物；
(ii)用工程化的鼠李糖苷酶多肽对经处理的提取物进行酶促修饰；
(iii)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；和
(iv)使用苯基树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；
(v)任选地浓缩经修饰的提取物；
(vi)任选地交换溶剂；和
(vii)除去剩余的溶剂以提供干燥的皂苷组合物；
其中步骤(v)和(vi)可以任选地颠倒顺序或同时进行，尽管通常以所示的顺序。
本发明提供了一种生产皂苷组合物的方法，包括以下步骤：
(i)通过聚乙烯聚吡咯烷酮吸附处理皂树的粗水提物；
(ii)用工程化的葡萄糖苷酶多肽和工程化的鼠李糖苷酶多肽对经处理的提取物进行酶促修饰；
(iii)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；和
(iv)使用苯基树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；
(v)任选地浓缩经修饰的提取物；
(vi)任选地交换溶剂；和
(vii)除去剩余的溶剂以提供干燥的皂苷组合物；
其中步骤(v)和(vi)可以任选地颠倒顺序或同时进行，尽管通常以所示的顺序。
还提供了一种生产皂苷组合物的方法，包括以下步骤：
(i)通过聚乙烯聚吡咯烷酮吸附处理皂树的粗水提物；
(ii)用葡萄糖苷酶和/或鼠李糖苷酶对经处理的提取物进行酶促修饰；
(iii)通过渗滤、超滤或透析纯化经修饰的提取物；
(iv)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；
(v)使用苯基树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；
(vi)使用C8树脂通过反相色谱法浓缩经修饰的提取物；
(vii)交换溶剂；和
(viii)除去剩余的溶剂以提供干燥的皂苷组合物。
还提供了一种生产皂苷组合物的方法，包括以下步骤：
(i)通过聚乙烯聚吡咯烷酮吸附处理皂树的粗水提物；
(ii)用工程化的葡萄糖苷酶多肽对经处理的提取物进行酶促修饰；
(iii)通过渗滤、超滤或透析纯化经修饰的提取物；
(iv)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；
(v)使用苯基树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；
(vi)使用C8树脂通过反相色谱法浓缩经修饰的提取物；
(vii)交换溶剂；和
(viii)除去剩余的溶剂以提供干燥的皂苷组合物。
另外提供了一种生产皂苷组合物的方法，包括以下步骤：
(i)通过聚乙烯聚吡咯烷酮吸附处理皂树的粗水提物；
(ii)用工程化的鼠李糖苷酶多肽对经处理的提取物进行酶促修饰；
(iii)通过渗滤、超滤或透析纯化经修饰的提取物；
(iv)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；
(v)使用苯基树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；
(vi)使用C8树脂通过反相色谱法浓缩经修饰的提取物；
(vii)交换溶剂；和
(viii)除去剩余的溶剂以提供干燥的皂苷组合物。
本发明提供了一种生产皂苷组合物的方法，包括以下步骤：
(i)通过聚乙烯聚吡咯烷酮吸附处理皂树的粗水提物；
(ii)用工程化的葡萄糖苷酶多肽和工程化的鼠李糖苷酶多肽对经处理的提取物进行酶促修饰；
(iii)通过渗滤、超滤或透析纯化经修饰的提取物；
(iv)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；
(v)使用苯基树脂通过反相色谱法纯化经修饰的提取物；
(vi)使用C8树脂通过反相色谱法浓缩经修饰的提取物；
(vii)交换溶剂；和
(viii)除去剩余的溶剂以提供干燥的皂苷组合物。
通过渗滤、超滤或透析纯化提取物的步骤适合地通过渗滤纯化，通常使用切向流。膜的合适实例是30kDa的截止值。该过程的这一步骤通常除去盐、糖和其他低分子量物质。
提取物的浓缩可以使用任何合适的技术进行。例如，可以使用捕获和释放方法进行浓缩，例如反相色谱法，尤其是使用C8树脂。反相色谱法通常使用乙腈和水作为溶剂，通常用合适的酸如乙酸酸化。色谱法通常在溶剂梯度下操作，皂苷提取物在低有机溶剂中被捕获，在高有机溶剂中被洗脱，尤其是步进的溶剂梯度。
可以使用任何合适的技术进行溶剂的交换，尤其是渗滤、超滤或透析，尤其是渗滤。溶剂交换可用于例如降低乙腈含量，如WO2014016374中所述。可以选择合适的膜以允许溶剂交换，同时保留皂苷提取物，例如1kDa膜。
通过除去溶剂进行的干燥可以通过任何合适的方式进行，尤其是通过冷冻干燥。在干燥过程中，皂苷提取物会发生降解，导致lyo杂质的形成。因此，希望在限制lyo杂质形成的条件下干燥，例如通过限制干燥温度和/或干燥时间。合适地，通过单一冷冻干燥过程除去溶剂。所需的干燥程度将取决于溶剂的性质，例如非药学上可接受的溶剂将理想地被高度除去，而一些药学上可接受的溶剂(如水)可能被较低程度地除去。
合适地，本发明的方法以25-1000g QS-21的规模进行，例如50-500g，尤其是100-500g(量基于通过UV确定的材料中QS-21主峰含量)。
提供了根据本发明制备的产物皂苷。提供了根据本发明制备的产物皂苷在制备药物中的用途。此外，提供了根据本发明制备的用作药物，尤其是用作佐剂的产物皂苷。还提供了包含根据本发明制备的产物皂苷的佐剂组合物。
提供了一种粗提取物(例如来自皂树属物种，尤其是皂树)，例如水和/或低级醇提取物，尤其是已经用葡萄糖苷酶处理过的水提物。还提供了粗提取物(例如来自皂树属物种，尤其是皂树)，例如水和/或低级醇提取物，尤其是已经用鼠李糖苷酶处理的水提物。还提供了粗提取物(例如来自皂树属物种，尤其是皂树)，例如水和/或低级醇提取物，尤其是已经用葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶处理的水提物。
提供了一种粗树皮提取物(例如来自皂树属物种，尤其是皂树)，例如水和/或低级醇提取物，尤其是已经用葡萄糖苷酶处理过的水提物。还提供了粗树皮提取物(例如来自皂树属物种，尤其是皂树)，例如水和/或低级醇提取物，尤其是已经用鼠李糖苷酶处理的水提物。还提供了粗皂苷提取物(例如来自皂树属物种，尤其是皂树)，例如水和/或低级醇提取物，尤其是已经用葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶处理的水提物。
提供了PVPP处理的提取物(例如来自皂树属物种，尤其是皂树)，例如水和/或低级醇提取物，尤其是已经用葡萄糖苷酶处理的水提物。还提供了PVPP处理的提取物(例如来自皂树属物种，尤其是皂树)，例如水和/或低级醇提取物，尤其是已经用鼠李糖苷酶处理的水提物。还提供了PVPP处理的提取物(例如来自皂树属物种，尤其是皂树)，例如水和/或低级醇提取物，尤其是已经用葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶处理的水提物。
提供了PVPP处理的树皮提取物(例如来自皂树属物种，尤其是皂树)，例如水和/或低级醇提取物，尤其是已经用葡萄糖苷酶处理的水提物。
还提供了PVPP处理的树皮提取物(例如来自皂树属物种，尤其是皂树)，例如水和/或低级醇提取物，尤其是已经用鼠李糖苷酶处理的水提物。还提供了PVPP处理的皂苷提取物(例如来自皂树属物种，尤其是皂树)，例如水和/或低级醇提取物，尤其是已经用葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶处理的水提物。
还提供了皂苷组合物，其包含至少93％的QS-21主峰和<0.25％的2018组分(根据在214nm的UV吸收)。合适地，其中最丰富种类的单同位素是1987.9m/z。理想的是，皂苷组合物包含至少98％的QS-21组(根据在214nm的UV吸收)。理想的是，提取物包含1％或更少的lyo杂质(根据在214nm的UV吸收)。理想的是，提取物包含1％或更少的QS-21组之外的最大峰(根据在214nm的UV吸收)。
还提供了皂苷组合物，根据在214nm的UV吸收，其包含至少98％的QS-21组、至少93％的QS-21主峰、0.25％的2018组分、1％或更少的QS-21组以外的最大峰，其中最丰富种类的单同位素为1987.9m/z。合适地，皂苷组合物包含<0.23％的2018组分，尤其是<0.21％的2018组分，尤其是<0.21％的2018组分，例如0.2％或更少的2018组分。
皂苷组合物理想地包含至少40％，例如至少50％，合适地至少60％，尤其是至少70％，理想地至少80％，例如至少90％(根据在214nm的UV吸收和根据相对离子丰度测定)QS-21 1988 A组分，QS-21 1856 A组分和/或QS-21 2002 A组分。在某些实施方案中，皂苷组合物包含至少40％，例如至少50％，尤其是至少60％，尤其是至少65％，例如至少70％的QS-21 1988A组分(根据在214nm的UV吸收和根据相对离子丰度测定)。在某些实施方案中，皂苷组合物包含90％或更少，例如85％或更少，或80％或更少的QS-21 1988 A组分(根据在214nm的UV吸收和根据相对离子丰度测定)。在某些实施方案中，皂苷组合物包含40％至90％的QS-21 1988 A组分，例如50％至85％的QS-21 1988 A组分，尤其是70％至80％的QS-21 1988 A组分(根据在214nm的UV吸收和根据相对离子丰度测定)。在某些实施方案中，皂苷组合物包含30％或更少，例如25％或更少的QS-21 1856 A(根据在214nm的UV吸收和根据相对离子丰度测定)。在某些实施方案中，皂苷组合物包含至少5％，例如至少10％的QS-211856 A(根据在214nm的UV吸收和根据相对离子丰度测定)。在某些实施方案中，皂苷组合物包含5％至30％的QS-21 1856 A，例如10％至25％的QS-21 1856 A(根据在214nm的UV吸收和根据相对离子丰度测定)。在某些实施方案中，皂苷组合物包含40％或更少，例如30％或更少，尤其是20％或更少，尤其是10％或更少的QS-21 2002 A组分(根据在214nm的UV吸收和根据相对离子丰度测定)。在某些实施方案中，皂苷组合物包含至少0.5％，例如至少1％的QS-21 2002A组分(根据在214nm的UV吸收和根据相对离子丰度测定)。在某些实施方案中，皂苷组合物含有0.5％至40％的QS-21 2002 A组分，例如1％至10％的QS-21 2002 A组分(根据在214nm的UV吸收和根据相对离子丰度测定)。
术语“lyo杂质”是指在图6中鉴定为“冻干峰”的三萜糖苷。合适地，本文所述的UPLC-UV/MS方法中的lyo杂质具有大约4.7分钟的保留时间，并且峰的主要组分具有1855.9的单同位素分子量。术语2018组分、QS-21主峰、QS-21组可以例如通过参考本文的实施例来理解。
本发明的皂苷组合物(即包含根据本发明制备的产物皂苷的组合物)可与其他佐剂组合，例如TLR4激动剂，尤其是脂多糖TLR4激动剂，例如脂质A衍生物，尤其是单磷酰脂质A，例如3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)。3D-MPL由葛兰素史克生物有限公司以“MPL”的名称出售，在整个文件中称为3D-MPL。参见例如美国专利号4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094。3D-MPL可以根据GB 2 220 211 A中描述的方法生产。在化学上，它是具有4、5或6个酰化链的3-脱酰化单磷酰基脂质A的混合物。
可用于本发明的其他TLR4激动剂包括吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)，例如以下中所描述：WO2008/153541或WO2009/143457或文献文章Coler RN等人(2011)Developmentand Characterization of Synthetic Glucopyranosyl Lipid Adjuvant System as aVaccine Adjuvant.PLoS ONE 6(1):e16333.doi:10.1371/journal.pone.0016333和AriasMA等人(2012)Glucopyranosyl Lipid Adjuvant(GLA),a Synthetic TLR4 Agonist,Promotes Potent Systemic and Mucosal Responses to Intranasal Immunizationwith HIVgp140.PLoS ONE 7(7):e41144.doi:10.1371/journal.pone.0041144。WO2008/153541或WO2009/143457通过引用并入本文，目的是定义可用于本发明的TLR4激动剂。
感兴趣的特定烷基葡糖胺磷酸酯(AGP)如下所述：
感兴趣的TLR4激动剂包括：
3-脱酰基单磷酰基六酰基脂质A。另一种感兴趣的TLR4激动剂是：
3-脱酰基单磷酰脂质A。
感兴趣的TLR4激动剂是dLOS(如Han,2014所述)：
佐剂的典型成人剂量将包含皂苷组合物，例如Q-21组合物，其量为1-100ug/人剂量。皂苷提取物可以以大约50ug的水平使用。合适范围的实例是40-60ug，合适的是45-55ug或49-51ug，例如50ug。在另一个实施方案中，人剂量包含约25ug水平的皂苷组合物，例如Q-21组合物。较低范围的实例包括20-30ug，合适的是22-28ug或24-26ug，例如25ug。与成人相比，儿童的人剂量可能会减少(例如减少50％)。
TLR4激动剂，如脂多糖，如3D-MPL，可以以1-100ug/人剂量的量使用。3D-MPL可以以大约50ug的水平使用。合适范围的实例是40-60ug，合适的是45-55ug或49-51ug，例如50ug。在另一个实施方案中，人剂量包含约25ug水平的3D-MPL。较低范围的实例包括20-30ug，合适的是22-28ug或24-26ug，例如25ug。与成人相比，儿童的人剂量可能会减少(例如减少50％)。
当佐剂中同时存在TLR4激动剂和皂苷组合物(如Q-21组合物)时，TLR4激动剂与皂苷的重量比合适地在1∶5至5∶1之间，合适地为1∶1。例如，当3D-MPL以50ug或25ug的量存在时，那么合适的QS-21也可以以50ug或25ug/人剂量的量存在。
佐剂也可以包含合适的载剂，例如乳剂(例如水包油乳剂，例如含有角鲨烯的水包油乳剂)或脂质体。
本发明提供了一种包含根据本发明的皂苷组合物的佐剂组合物。适宜地，佐剂组合物进一步包含TLR4激动剂。
脂质体
术语“脂质体”在本领域中是众所周知的，它定义了包含一个或多个包围水性空间的脂质双层的囊泡的一般类别。因此，脂质体由一个或多个脂质和/或磷脂双层组成，并且在其结构中可以包含其他分子，例如蛋白质或碳水化合物。因为脂质相和水相都存在，脂质体可以包封或截留水溶性物质、脂溶性物质和/或两亲性化合物。
脂质体的大小可以从30nm到几um不等，这取决于磷脂的组成和制备它们的方法。
用于本发明的脂质体适当地含有DOPC，或者基本上由DOPC和甾醇组成(含有皂苷和任选的TLR4激动剂)。
在本发明中，脂质体大小将在50nm至200nm的范围内，尤其是60nm至180nm，例如70-165nm。最理想的是，脂质体应该是稳定的，并且具有约100nm的直径，以允许通过过滤方便地灭菌。
脂质体的结构完整性可以通过诸如动态光散射(DLS)测量脂质体的大小(Z-平均直径，Zav)和多分散性的方法来评估，或者通过电子显微镜分析脂质体的结构来评估。在一个实施方案中，平均粒度在95和120nm之间，和/或多分散性(PdI)指数不超过0.3(例如不超过0.2)。
其他赋形剂
在另一个实施方案中，向佐剂组合物中加入缓冲液。液体制剂的pH值根据组合物的组分和对受试者给药的必要适宜性来调节。合适地，液体混合物的pH为至少4、至少5、至少5.5、至少5.8、至少6。液体混合物的pH可以小于9、小于8、小于7.5或小于7。在其他实施例中，液体混合物的pH在4和9之间，在5和8之间，例如在5.5和8之间。因此，pH将合适地在6-9之间，例如6.5-8.5。在特别优选的实施方案中，pH在5.8和6.4之间。合适的缓冲液可选自乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、马来酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐和TRIS。在一个实施方案中，缓冲液是磷酸盐缓冲液，例如Na/Na2PO4，Na/K2PO4或K/K2PO4。
缓冲液可以以至少6mM、至少10mM或至少40mM的量存在于液体混合物中。缓冲液可以以小于100mM、小于60mM或小于40mM的量存在于液体混合物中。
众所周知，对于肠胃外施用，溶液应该具有药学上可接受的渗透压，以避免细胞变形或溶解。药学上可接受的渗透压通常是指溶液的渗透压接近等渗或轻度高渗。合适地，组合物(当重构时，如果以干燥形式存在)将具有250至750mOsm/kg范围内的渗透压，例如，渗透压可以在250至550mOsm/kg范围内，如在280至500mOsm/kg范围内。在一个特别优选的实施方案中，渗透压可以在280至310mOsm/kg的范围内。渗透压可以根据本领域已知的技术来测量，例如通过使用可商购的渗透压计，例如可从Advanced Instruments Inc.(USA)获得的Model 2020。
“等渗剂”是一种生理上可耐受的化合物，它赋予制剂适当的张力，以防止水穿过与制剂接触的细胞膜的净流动。在一些实施方案中，用于组合物的等渗剂是盐(或盐的混合物)，便利地，该盐是氯化钠，适宜的浓度为约150nM。然而，在其他实施方案中，组合物包含非离子等渗剂，并且组合物中氯化钠的浓度小于100mM，例如小于80mM，例如小于50mM，例如小于40mM，小于30mM，尤其是小于20mM。组合物中的离子强度可以小于100mM，例如小于80mM，例如小于50mM，例如小于40mM或小于30mM。
在一个具体的实施方案中，非离子等渗剂是多元醇，例如蔗糖和/或山梨醇。山梨醇的浓度可以例如在大约3％和大约15％(w/v)之间，例如在大约4％和大约10％(w/v)之间。WO2012/080369中描述了包含免疫活性皂苷部分和TLR4激动剂的佐剂，其中等渗剂是盐或多元醇。
合适地，人剂量体积在0.05ml和1ml之间，例如在0.1ml和0.5ml之间，尤其是约0.5ml或0.7ml的剂量体积。所用组合物的体积可取决于递送途径和部位，皮内途径给予的剂量较小。单位剂量容器可以包含过量的物质，以允许在单位剂量施用过程中对物质进行适当的处理。
皂苷∶DOPC的比例通常在1∶50至1∶10(w/w)的数量级，合适地在1∶25至1∶15(w/w)之间，优选1∶22至1∶18(w/w)，例如1∶20(w/w)。
合适地，皂苷以较低反应原性的组合物存在，其中它被外源甾醇如胆固醇淬灭。Merck Index第13版第381页披露了胆固醇作为在动物脂肪中发现的天然甾醇。胆固醇的分子式为(C27H46O)，也称为(3β)-胆甾-5-烯-3-醇。
皂苷∶甾醇的比例通常在1∶100至1∶1(w/w)的数量级，合适地在1∶10至1∶1(w/w)之间，优选1∶5至1∶1(w/w)。适当地存在过量的甾醇，皂苷∶甾醇的比例至少为1∶2(w/w)。在一个实施方案中，皂苷∶甾醇的比例是1∶5(w/w)。在一个实施方案中，甾醇是胆固醇。
脂质体的量(脂质和甾醇的重量)通常在0.1mg至10mg/人剂量的组合物的范围内，尤其是0.5mg至2mg/人剂量的组合物。
在特别合适的实施方案中，用于本发明的脂质体包含DOPC和甾醇，尤其是胆固醇。因此，在特定的实施方案中，用于本发明的组合物包含脂质体形式的皂苷提取物，其中所述脂质体包含DOPC和甾醇，尤其是胆固醇。
感兴趣的特定佐剂的特征在于脂质体，其包含DOPC和胆固醇，以及根据本发明制备的TLR4激动剂和皂苷，尤其是3D-MPL和根据本发明制备的皂苷。
另一种感兴趣的佐剂的特征在于脂质体，其包含DOTAP和DMPC，以及TLR4激动剂和根据本发明制备的皂苷，尤其是dLOS和根据本发明制备的皂苷。
抗原
根据本发明制备的佐剂可以与免疫原或抗原结合使用。在一些实施方案中，提供了编码免疫原或抗原的多核苷酸。
佐剂可与免疫原或抗原分开施用给受试者，或者佐剂可在生产过程中或临时与免疫原或抗原组合，以提供用于组合施用的免疫原性组合物。
如本文所用，受试者是哺乳动物，例如啮齿动物、非人灵长类动物或人类。
因此，提供了制备免疫原性组合物的方法，所述组合物包含免疫原或抗原，或编码免疫原或抗原的多核苷酸，所述方法包括以下步骤：
(i)制备包含根据本发明制备的皂苷的佐剂组合物；
(ii)将佐剂与免疫原或抗原或编码免疫原或抗原的多核苷酸混合。
还提供了包含根据本发明制备的皂苷的佐剂在制备药物中的用途。合适地，药物包含免疫原或抗原，或编码免疫原或抗原的多核苷酸。
还提供了用作药物的包含根据本发明制备的皂苷的佐剂。合适地，药物包含免疫原或抗原，或编码免疫原或抗原的多核苷酸。
术语免疫原是指能够引发免疫反应的多肽。合适的免疫原是包含至少一个B或T细胞表位的抗原。引发的免疫反应可以是产生中和抗体的抗原特异性B细胞反应。引发的免疫反应可以是抗原特异性T细胞反应，其可以是全身和/或局部反应。抗原特异性T细胞反应可包括CD4+T细胞反应，例如涉及表达多种细胞因子(例如IFNγ、TNFα和/或IL2)的CD4+T细胞的反应。备选地，或另外地，抗原特异性T细胞反应包括CD8+T细胞反应，例如涉及表达多种细胞因子(例如IFNγ、TNFα和/或IL2)的CD8+T细胞的反应。
抗原可以来自(例如获得自)人类或非人类病原体，包括例如感染人类和非人类脊椎动物的细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生虫，或者来自癌细胞或肿瘤细胞。
在一个实施方案中，抗原是重组蛋白，例如重组原核蛋白。
可以提供多种抗原。例如，可提供多种抗原以加强引发的免疫反应(例如，确保强保护)，可提供多种抗原以扩大免疫反应(例如，确保针对一系列病原体菌株或在大部分受试者群体中的保护)，或可提供多种抗原以现时引发关于许多疾病的免疫反应(从而简化施用方案)。在提供多种抗原的情况下，这些酶可以是不同的蛋白质，或者可以是一种或多种融合蛋白的形式。
抗原可以以0.1至100ug/人剂量的量提供。
本发明可用于治疗或预防与上述一种或多种抗原相关的疾病或障碍。在一个实施方案中，所述疾病或病症选自疟疾、结核病、COPD、HIV和疱疹。
佐剂可以与免疫原或抗原分开施用，或者可以在生产过程中或临时与免疫原或抗原组合，以提供用于组合施用的免疫原性组合物。
灭菌
尤其是对于肠胃外施用，组合物应该是无菌的。灭菌可以通过各种方法进行，尽管通过无菌级过滤器过滤是方便的。在佐剂或免疫原性组合物的制备过程中，可进行多次灭菌，但通常至少在生产结束时进行。
“无菌级过滤器”是指在被有效过滤面积的激发水平大于或等于1x107/cm2的微生物激发后产生无菌流出物的过滤器。无菌级过滤器对于本发明领域的技术人员来说是众所周知的。为了本发明的目的，无菌级过滤器具有0.15-0.25μm的孔径，合适地为0.18-0.22μm，例如0.2或0.22μm。
无菌级过滤器的膜可以由技术人员已知的任何合适的材料制成，例如但不限于醋酸纤维素、聚醚砜(PES)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)。在本发明的一个具体实施方案中，本发明的一种或多种或所有过滤膜包含聚醚砜(PES)，尤其是亲水性聚醚砜。在本发明的一个具体实施方案中，本文所述方法中使用的过滤器是双层过滤器，尤其是具有内置预过滤器的无菌过滤器，其孔径大于最终过滤器的孔径。在一个实施例中，灭菌过滤器是双层过滤器，其中预过滤膜层具有0.3至0.5nm的孔径，例如0.35或0.45nm。根据进一步的实施例，过滤器包括不对称过滤膜，例如不对称亲水PES过滤膜。备选地，灭菌过滤层可以由PVDF制成，例如与不对称亲水PES预过滤膜层结合。
根据预期的医疗用途，材料应该是药物级的(例如注射级)。
本发明的条款
本发明通过以下条款来说明：
条款1.一种制备产物皂苷的方法，所述方法包括将起始皂苷酶促转化为产物皂苷的步骤。
条款2.一种增加组合物中产物皂苷的量的方法，所述方法包括将起始皂苷酶促转化为产物皂苷的步骤。
条款3.一种降低组合物中起始皂苷的量的方法，所述方法包括将起始皂苷酶促转化为产物皂苷的步骤。
条款4.如条款1至3中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷是天然存在的皂苷。
条款5.如条款1至3中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷是人工皂苷。
条款6.如条款1至5中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷是类固醇糖苷。
条款7.如条款1至6中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷是萜类糖苷。
条款8.如条款7所述的方法，其中所述起始皂苷是三萜糖苷。
条款9.如条款8所述的方法，其中所述起始皂苷是皂皮酸糖苷。
条款10.如条款1至4或6至9中任一项所述的方法，其中起始皂苷可从满天星属、肥皂草属或皂皮树属的植物获得。
条款11.如条款10所述的方法，其中所述起始皂苷可从皂皮树属物种获得。
条款12.如条款11所述的方法，其中所述起始皂苷可从柳叶皂皮树获得。
条款13.如条款12所述的方法，其中所述起始皂苷从柳叶皂皮树获得。
条款14.如条款11所述的方法，其中所述起始皂苷可从皂树中获得。
条款15.如条款14所述的方法，其中所述起始皂苷从皂树获得的。
条款16.如条款14或15所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-18家族组分。
条款17.如条款16所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-18 2150 A组分。
条款18.如条款17所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-18 2150 A V1。
条款19.如条款17所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-18 2150 A V2。
条款20.如条款16所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-18 2018 A组分。
条款21.如条款16所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-18 2164 A组分。
条款22.如条款21所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-18 2164 A V1。
条款23.如条款21所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-18 2164 A V2。
条款24.如条款16所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-18 2150 B组分。
条款26.如条款24所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-18 2150 B V1。
条款26.如条款24所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-18 2150 B V2。
条款27.如条款16所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-18 2018 B组分。
条款28.如条款16所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-18 2164 B组分。
条款29.如条款28所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-18 2164 B V1。
条款30.如条款28所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-18 2164 B V2。
条款31.如条款15所述的方法，其中所述起始皂苷是去葡糖基-QS-17家族组分。
条款32.如条款31所述的方法，其中所述起始皂苷是去葡糖基QS-17 2134 A组分。
条款33.如条款32所述的方法，其中所述起始皂苷是去葡糖基-QS-17 2134 A V1。
条款34.如条款32所述的方法，其中所述起始皂苷是去葡糖基-QS-17 2134 A V2。
条款35.如条款31所述的方法，其中所述起始皂苷是去葡糖基-QS-17 2002 A组分。
条款36.如条款31所述的方法，其中所述起始皂苷是去葡糖基-QS-17 2148 A组分。
条款37.如条款36所述的方法，其中所述起始皂苷是去葡糖基-QS-17 2148 A V1。
条款38.如条款36所述的方法，其中所述起始皂苷是去葡糖基-QS-17 2148 A V2。
条款39.如条款31所述的方法，其中所述起始皂苷是去葡糖基QS-17 2134 B组分。
条款40.如条款39所述的方法，其中所述起始皂苷是去葡糖基QS-17 2134 B V1。
条款41.如条款39所述的方法，其中所述起始皂苷是去葡糖基QS-17 2134 B V2。
条款42.如条款31所述的方法，其中所述起始皂苷是去葡糖基-QS-17 2002 B组分。
条款43.如条款31所述的方法，其中所述起始皂苷是去葡糖基-QS-17 2148 B组分。
条款44.如条款43所述的方法，其中所述起始皂苷是去葡糖基QS-17 2148 B V1。
条款45.如条款43所述的方法，其中所述起始皂苷是去葡糖基QS-17 2148 B V2。
条款46.如条款15所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-17家族组分。
条款47.如条款46所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-17 2296 A组分。
条款48.如条款47所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-17 2296 A V1。
条款49.如条款48所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-17 2296 A V2。
条款50.如条款46所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-17 2164 A组分。
条款51.如条款46所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-17 2310 A组分。
条款52.如条款51所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-17 2310 A V1。
条款53.如条款51所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-17 2310 A V2。
条款54.如条款46所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-17 2296 B组分。
条款55.如条款54所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-17 2296 B V1。
条款56.如条款54所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-17 2296 B V2。
条款57.如条款46所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-17 2164 B组分。
条款58.如条款46所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-17 2310 B组分。
条款59.如条款58所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-17 2310 B V1。
条款60.如条款58所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-17 2310 B V2。
条款61.如条款15所述的方法，其中所述起始皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-18家族组分。
条款62.如条款61所述的方法，其中所述起始皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-182018 A组分。
条款63.如条款62所述的方法，其中所述起始皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-182018 A V1。
条款64.如条款62所述的方法，其中所述起始皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-182018 A V2。
条款65.如条款61所述的方法，其中所述起始皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-181886A组分。
条款66.如条款61所述的方法，其中所述起始皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-182032A组分。
条款67.如条款65所述的方法，其中所述起始皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-182032A V1。
条款68.如条款65所述的方法，其中所述起始皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-182032A V2。
条款69.如条款61所述的方法，其中所述起始皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-182018 B组分。
条款70.如条款69所述的方法，其中所述起始皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-182018 B V1。
条款71.如条款69所述的方法，其中所述起始皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-182018 B V2。
条款72.如条款61所述的方法，其中所述起始皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-181886B组分。
条款73.如条款61所述的方法，其中所述起始皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-182032B组分。
条款74.如条款73所述的方法，其中所述起始皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-182032B V1。
条款75.如条款73所述的方法，其中所述起始皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-182032B V2。
条款76.如条款15所述的方法，其中所述起始皂苷是乙酰化的去葡糖基-QS-17家族组分。
条款77.如条款76所述的方法，其中所述起始皂苷是乙酰化的去葡糖基-QS-172176A组分。
条款78.如条款77所述的方法，其中所述起始皂苷是乙酰化的去葡糖基QS-172176A V1。
条款79.如条款77所述的方法，其中所述起始皂苷是乙酰化的去葡糖基QS-172176A V2。
条款80.如条款76所述的方法，其中所述起始皂苷是乙酰化的去葡糖基-QS-172044A组分。
条款81.如条款76所述的方法，其中所述起始皂苷是乙酰化的去葡糖基-QS-172190A组分。
条款82.如条款81所述的方法，其中所述起始皂苷是乙酰化的去葡糖基QS-172190A V1。
条款83.如条款81所述的方法，其中所述起始皂苷是乙酰化的去葡糖基QS-172190A V2。
条款84.如条款1至83中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是天然皂苷。
条款85.如条款1至83中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是人工皂苷。
条款86.如条款1至85中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是类固醇糖苷。
条款87.如条款1至85中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是萜类糖苷。
条款88.如条款87所述的方法，其中所述产物皂苷是三萜糖苷。
条款89.如条款88所述的方法，其中所述产物皂苷是皂皮酸糖苷。
条款90.如条款1至84或86至89中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷可从满天星属、肥皂草属或皂皮树属的植物获得。
条款91.如条款90所述的方法，其中所述产物皂苷可从皂皮树属物种获得。
条款92.如条款91所述的方法，其中所述产物皂苷可从柳叶皂皮树获得。条款93.如条款92所述的方法，其中所述产物皂苷可从皂树获得。
条款94.如条款16、31或93中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-21家族组分。
条款95.如条款17、32或94中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-21 1988A组分。
条款96.如条款18、33或95中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-21 1988A V1。
条款97.如条款19、34或95中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-21 1988A V2。
条款98.如条款20、35或94中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-21 1856A组分。
条款99.如条款21、36或94中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-21 2002A组分。
条款100.如条款22、37或99中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-212002 A V1。
条款101.如条款23、38或99中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-212002 A V2。
条款102.如条款24、39或94中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-211988 B组分。
条款103.如条款25、40或102中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-211988 B V1。
条款104.如条款26、41或102中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-211988 B V2。
条款105.如条款27、42或94中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-211856 B组分。
条款106.如条款28、43或94中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-212002 B组分。
条款107.如条款29、44或106中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-212002 B V1。
条款108.如条款30、45或106中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-212002 B V2。
条款109.如条款46或93所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-18家族组分。
条款110.如条款47或109所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-18 2150 A组分。
条款111.如条款48或110所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-18 2150 A V1。
条款112.如条款49或110所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-18 2150 A V2。
条款113.如条款50或109所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-18 2018 A组分。
条款114.如条款51或109所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-18 2164 A组分。
条款115.如条款52或114所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-18 2164 A V1。
条款116.如条款53或114所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-18 2164 A V2。
条款117.如条款54或109所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-18 2150 B组分。
条款118.如条款55或117所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-18 2150 B V1。
条款119.如条款56或117所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-18 2150 B V2。
条款120.如条款57或109所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-18 2018 B组分。
条款121.如条款58或120所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-18 2164 B组分。
条款122.如条款59或121所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-18 2164 B V1。
条款123.如条款60或121所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-18 2164 B V2。
条款124.如条款46或93所述的方法，其中所述产物皂苷是去葡糖基QS-17家族组分。
条款125.如条款47或124所述的方法，其中所述产物皂苷是去葡糖基-QS-17 2134A组分。
条款126.如条款48或125所述的方法，其中所述产物皂苷是去葡糖基-QS-17 2134A V1。
条款127.如条款49或125所述的方法，其中所述产物皂苷是去葡糖基-QS-17 2134A V2。
条款128.如条款50或124所述的方法，其中所述产物皂苷是去葡糖基QS-17 2002A组分。
条款129.如条款51或124所述的方法，其中所述产物皂苷是去葡糖基-QS-17 2148A组分。
条款130.如条款52或129所述的方法，其中所述产物皂苷是去葡糖基-QS-17 2148A V1。
条款131.如条款53或129所述的方法，其中所述产物皂苷是去葡糖基-QS-17 2148A V2。
条款132.如条款54或124所述的方法，其中所述产物皂苷是去葡糖基-QS-17 2134B组分。
条款133.如条款55或132所述的方法，其中所述产物皂苷是去葡糖基-QS-17 2134B V1。
条款134.如条款56或132所述的方法，其中所述产物皂苷是去葡糖基-QS-17 2134B V2。
条款135.如条款57或124所述的方法，其中所述产物皂苷是去葡糖基-QS-17 2002B组分。
条款136.如条款58或124所述的方法，其中所述产物皂苷是去葡糖基-QS-17 2148B组分。
条款137.如条款59或136所述的方法，其中所述产物皂苷是去葡糖基-QS-17 2148B V1。
条款138.如条款60或136所述的方法，其中所述产物皂苷是去葡糖基-QS-17 2148B V2。
条款140.如条款61或93所述的方法，其中所述产物皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-21家族组分。
条款140.如条款62或139所述的方法，其中所述产物皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 A组分。
条款141.如条款63或140所述的方法，其中所述产物皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 A V1。
条款142.如条款64或140所述的方法，其中所述产物皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 A V2。
条款143.如条款65或139所述的方法，其中所述产物皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1712A组分。
条款144.如条款66或139所述的方法，其中所述产物皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870A组分。
条款145.如条款67或144所述的方法，其中所述产物皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870A V1。
条款146.如条款68或144所述的方法，其中所述产物皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870A V2。
条款147.如条款69或139所述的方法，其中所述产物皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 B组分。
条款148.如条款70或147所述的方法，其中所述产物皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 B V1。
条款149.如条款71或147所述的方法，其中所述产物皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1856 B V2。
条款150.如条款72或139所述的方法，其中所述产物皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1712B组分。
条款151.如条款73或139所述的方法，其中所述产物皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870B组分。
条款152.如条款74或151所述的方法，其中所述产物皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870B V1。
条款153.如条款75或151所述的方法，其中所述产物皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-21 1870B V2。
条款154.如条款76或93所述的方法，其中所述产物皂苷是乙酰化的QS-21家族组分。
条款155.如条款77或154所述的方法，其中所述产物皂苷是乙酰化的QS-21 2030A组分。
条款156.如条款78或155所述的方法，其中所述产物皂苷是乙酰化的QS-21 2030AV1。
条款157.如条款79或155所述的方法，其中所述产物皂苷是乙酰化的QS-21 2030AV2。
条款158.如条款80或154所述的方法，其中所述产物皂苷是乙酰化的QS-21 1898A组分。
条款159.如条款81或155所述的方法，其中所述产物皂苷是乙酰化的QS-21 2044A组分。
条款160.如条款82或159所述的方法，其中所述产物皂苷是乙酰化的QS-21 2044AV1。
条款161.如条款83或159所述的方法，其中所述产物皂苷是乙酰化的QS-21 2044AV2。
条款162.如条款1至161中任一项所述的方法，其中单一起始皂苷被转化为单一产物皂苷。
条款163.如条款1至161中任一项所述的方法，其中多种起始皂苷被转化成多种产物皂苷。
条款164.如条款163所述的方法，其中所述多种起始皂苷包含QS-18家族组分，如条款18至31中任一项所述。
条款165.如条款163或164所述的方法，其中所述多种起始皂苷包含去葡糖基-QS-17家族组分，如条款33至46中任一项所述。
条款166.如条款163至165中任一项所述的方法，其中所述多种起始皂苷包含QS-17家族组分，如条款48至61中任一项所述。
条款167.如条款163至166中任一项所述的方法，其中所述多种起始皂苷包含去阿拉伯呋喃糖基-QS-18家族组分，例如条款63至76中任一项所述。
条款169.如条款163至167中任一项所述的方法，其中所述多种起始皂苷包含乙酰化的去葡糖基-QS-17家族组分，如条款78至84中任一项所述。
条款169.如条款1至4或6至168中任一项所述的方法，其中通过从起始原料提取获得所述起始皂苷。
条款170.如条款169所述的方法，其中通过从植物材料中提取获得所述起始皂苷。
条款171.如条款170所述的方法，其中通过从满天星属、肥皂草属或皂皮树属植物的植物材料提取获得所述起始皂苷。
条款172.如条款171所述的方法，其中通过从皂皮树属物种获得的植物材料提取获得所述起始皂苷。
条款173.如条款172所述的方法，其中通过从柳叶皂皮树获得的植物材料提取获得所述起始皂苷。
条款174.如条款172所述的方法，其中通过从皂树获得的植物材料提取获得所述起始皂苷。
条款175.如条款169至174中任一项所述的方法，其中通过从完整植物提取获得所述起始皂苷。
条款176.如条款169至174中任一项所述的方法，其中通过从选择的植物组织提取获得所述起始皂苷。
条款177.如条款176所述的方法，其中通过从包括木材或树皮在内的植物材料，如作为木材或树皮的植物材料提取获得所述起始皂苷。
条款178.如条款177所述的方法，其中通过从包括树皮在内的植物材料，如作为树皮的植物材料提取获得所述起始皂苷。
条款179.如条款169至188中任一项所述的方法，其中通过从成株植物获得的植物材料提取获得所述起始皂苷。
条款180.如条款169至179中任一项所述的方法，其中通过从幼小植物获得的植物材料提取获得所述起始皂苷。
条款181.如条款169至180中任一项所述的方法，其中通过用水和/或低级醇提取获得所述起始皂苷。
条款182.如条款181所述的方法，其中通过水提取获得所述起始皂苷。
条款183.如条款1至182中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷是含有皂苷的组合物中的次要组分，如植物材料提取物中的次要组分。
条款184.如条款1至182中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷是含有皂苷的组合物中的主要组分，如植物材料提取物中的主要组分。
条款185.如条款169至184中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷被部分纯化。
条款186.如条款169至184中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷被基本上纯化。
条款187.如条款169至184中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷呈Quil A组分的形式。
条款188.如条款169至184中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷呈级分A组分的形式。
条款189.如条款169至184中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷呈级分B组分的形式。
条款190.如条款169至184中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷呈级分C组分的形式。
条款191.如条款169至184中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷呈QS-7组分的形式。
条款192.如条款169至184中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷呈QS-17组分的形式。
条款193.如条款169至184中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷呈QS-18组分的形式。
条款194.如条款169至184中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷呈QS-21组分的形式。
条款195.如条款169至184中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷呈粗树皮提取物组分的形式。
条款196.如条款169至195中任一项所述的方法，其进一步包括从所述起始材料提取所述起始皂苷的步骤。
条款197.如权利要求1至194或196中任一项所述的方法，其进一步包括从提取的材料纯化所述起始皂苷的步骤。
条款198.如条款1至197中任一项所述的方法，其中所述酶促转化包括去除单一糖残基。
条款199.如条款198所述的方法，其中所述酶促转化包括去除葡萄糖残基。条款200.如条款199所述的方法，其中所述酶促转化包括去除β-葡萄糖残基。
条款201.如条款200所述的方法，其中所述酶促转化包括去除如下β-葡萄糖残基：
条款202.如条款198所述的方法，其中所述酶促转化包括去除鼠李糖残基。条款203.如条款202所述的方法，其中所述酶促转化包括去除α-鼠李糖残基。
条款204.如条款203所述的方法，其中所述酶促转化包括去除如下α-鼠李糖残基：
条款205.如条款1至197中任一项所述的方法，其中所述酶促转化包括去除多个糖残基。
条款206.如条款1至205中任一项所述的方法，其中所述方法包括多个酶促转化。
条款207.如条款206所述的方法，其中所述多个酶促转化连续进行。
条款208.如条款206所述的方法，其中所述多个酶促转化平行进行。
条款209.如条款206至208中任一项所述的方法，其中所述多个酶促转化包括以下，例如由以下组成：葡萄糖和鼠李糖的去除。
条款210.如条款209所述的方法，其中所述多个酶促转化包括以下，例如由以下组成：β-葡萄糖残基和α-鼠李糖残基的去除。
条款211.如条款210所述的方法，其中所述多个酶促转化包括以下，例如由以下组成：去除
条款212.如条款1至30、46至75、84至108、124至153或162至197中任一项的方法，其中由显示β外切葡萄糖苷酶活性的酶进行所述酶促转化。
条款213.如条款1至15、31至45、76至123或154至197中任一项所述的方法，其中由显示α外切鼠李糖苷酶活性的酶进行所述酶促转化。
条款214.如条款1至213中任一项所述的方法，其中所述糖苷酶是外部来源的。
条款215.如条款1至214中任一项所述的方法，其中所述酶促转化发生在细胞外环境中。
条款216.如条款1至215中任一项所述的方法，其中所述糖苷酶是重组产生的。
条款217.如条款1至216中任一项所述的方法，其中所述糖苷酶以裂解物的形式提供，例如澄清的裂解物，尤其是大肠杆菌裂解物或澄清的裂解物。
条款218.如条款1至217中任一项所述的方法，其进一步包括纯化所述产物皂苷的步骤。
条款219.如条款1至218中任一项所述的方法，其中所述酶促转化在pH 4至9下进行，尤其是pH 5至8，尤其是pH 5.5至7.5，例如pH 5.5至6.5。
条款220.如条款1至219中任一项所述的方法，其中所述酶促转化在10℃至60℃，尤其是15℃至50℃，尤其是15℃至45℃，例如20℃至42℃下进行。
条款221.如条款1至220中任一项所述的方法，其中所述酶促转化发生的时间长达2天，尤其是长达1天，尤其是长达18小时，例如12小时，例如长达6小时。
条款222.如条款1至221中任一项所述的方法，其中所述酶促转化发生在水或含有一种或多种水混溶性助溶剂的水性溶液中。
条款223.如条款1至222中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷以0.001至100g/升，尤其是0.005至75g/升，尤其是0.01至50g/升，例如0.1至25g/升，例如1至10g/升的浓度存在。
条款224.如条款1至223中任一项所述的方法，其中所述酶促转化以500ml至2000L，尤其是1L在1000L，尤其是10L至500L，例如25L至200L的分批反应体积进行。
条款225.如条款1至224中任一项所述的方法，其中存在的每种糖苷酶的重量在0.0001mg至25mg/ml、尤其是0.0001mg至5mg/ml、尤其是0.0001mg至1mg/ml、例如0.001mg至0.5mg/ml的范围内。
条款226.如条款1至225中任一项所述的方法，其中存在的每种糖苷酶的重量在0.01mg至100mg干燥澄清裂解物/ml、特别是0.01mg至30mg/ml、特别是0.01mg至5mg/ml、例如0.01mg至1mg/ml的范围内。
条款227.糖苷酶用于将起始皂苷酶促转化为产物皂苷的用途，例如在条款1至226中任一项所述的方法中。
条款228.如条款212或214至227中任一项所述的方法或用途，其中所述葡萄糖苷酶包含以下，例如由以下组成：根据SEQ ID No.262、208、63、229、250、5、101、207、169、247、302、324、319、9、240、325、338、850、879、868、826、804、888、881、891、816、827、857、853、842、814、886、885、838、829、808、828、870、873、844、882、874、825、824、823、810、894、849、803、890、841、832、830、845、871、837、883或809的氨基酸序列，或其功能变体。
条款229.一种用于鉴定具有β外切葡萄糖苷酶活性的候选酶的方法，所述方法包括选择酶，所述酶包含以下，或由以下组成：根据SEQ ID No.262、208、63、229、250、5、101、207、169、247、302、324、319、9、240、325、338、850、879、868、826、804、888、881、891、816、827、857、853、842、814、886、885、838、829、808、828、870、873、844、882、874、825、824、823、810、894、849、803、890、841、832、830、845、871、837、883或809的氨基酸序列的酶，或其功能变体。
条款230.一种鉴定具有β外切葡萄糖苷酶活性的酶的方法，所述方法包括测试糖苷酶，例如包含以下或由以下组成的酶从皂苷中去除葡萄糖的能力：根据SEQ ID No.262、208、63、229、250、5、101、207、169、247、302、324、319、9、240、325、338、850、879、868、826、804、888、881、891、816、827、857、853、842、814、886、885、838、829、808、828、870、873、844、882、874、825、824、823、810、894、849、803、890、841、832、830、845、871、837、883或809的氨基酸序列的酶，或其功能变体。
条款231.如条款227至230中任一项所述的用途或方法，其中所述酶包含以下或由以下组成：根据SEQ ID No.262、208、63、229、250、5、101、207、169、247、302、324、319、9、240、325或338的氨基酸序列或其功能变体。
条款232.如条款231所述的用途或方法，其中所述酶包含以下或由以下组成：根据SEQ ID No.262、208、63、229、250、5、101、207、169、247、302、324或319的氨基酸序列或其功能变体。
条款233.如条款232所述的用途或方法，其中所述酶包含以下或由以下组成：根据SEQ ID No.262、208、63、229、250、5、101或207的氨基酸序列或其功能变体。
条款234.如条款233所述的用途或方法，其中所述酶包含以下或由以下组成：根据SEQ ID No.262的氨基酸序列或其功能变体。
条款235.如条款234所述的用途或方法，其中所述酶是工程化的如条款260至355中任一项所述的葡萄糖苷酶多肽。
条款236.如条款227至230中任一项所述的用途或方法，其中所述酶包含以下，例如由以下组成：根据SEQ ID No.850、879、868、826、804、888、881、891、816、827、857、853、842、814、886、885、838、829、808、828、870、873、844、882、874、825、824、823、810、894、849、803、890、841、832、830、845、871、837、883或809的氨基酸序列，或其功能变体。
条款237.如条款236所述的用途或方法，其中所述酶包含以下，例如由以下组成：根据SEQ ID No.850、879、868、826、804、888、881、891、816、827、857、853、842、814、886、885、838、829、808、828、870、873、844、882、874、825、824、823、810、894、849、803、890或841的氨基酸序列，或其功能变体。
条款238.如条款237所述的用途或方法，其中所述酶包含以下，例如由以下组成：根据SEQ ID No.850、879、868、826、804、888、881、891、816、827、857、853、842、814、886、885、838、829、808、828、870、873、844、882、874、825、824、823、810或894的氨基酸序列，或其功能变体。
条款239.如条款213至227中任一项所述的方法或用途，其中所述鼠李糖苷酶包含以下，例如由以下组成：根据SEQ ID No.992、1003、1052、1073、1017、1055、1075、1001、1007、1061、1079、1027、1039、1041、989、1053、1018、1066、1082、1076、993、1077、1046、1015、1063、1054、1074、1067或1033的氨基酸序列，或其功能变体。
条款240.一种用于鉴定具有α外切鼠李糖苷酶活性的候选酶的方法，所述方法包括选择包含以下，例如由以下组成的酶：根据SEQ ID No.992、1003、1052、1073、1017、1055、1075、1001、1007、1061、1079、1027、1039、1041、989、1053、1018、1066、1082、1076、993、1077、1046、1015、1063、1054、1074、1067或1033的氨基酸序列，或其功能变体。
条款241.一种用于鉴定具有α外切鼠李糖苷酶活性的酶的方法，所述方法包括测试糖苷酶，例如包含以下，例如由以下组成的酶从皂苷中去除鼠李糖的能力：根据SEQ IDNo.992、1003、1052、1073、1017、1055、1075、1001、1007、1061、1079、1027、1039、1041、989、1053、1018、1066、1082、1076、993、1077、1046、1015、1063、1054、1074、1067或1033的氨基酸序列，或其功能变体。
条款242.如条款239至241中任一项所述的用途或方法，其中所述酶包含以下或由以下组成：根据SEQ ID No.992、1003、1052、1073、1017、1055、1075、1001、1007、1061、1079、1027、1039、1041、989、1053、1018、1066、1082、1076、993或1077的氨基酸序列，或其功能变体。
条款243.如条款242所述的用途或方法，其中所述酶包含以下或由以下组成：根据SEQ ID No.992、1003、1052、1073、1017、1055、1075、1001、1007、1061、1079、1027、1039、1041或989的氨基酸序列，或其功能变体
条款244.如条款243所述的用途或方法，其中所述酶包含以下或由以下组成：根据SEQ ID No.1017的氨基酸序列或其功能变体。
条款245.如条款243所述的用途或方法，其中所述酶是如条款376至463中任一项所述的工程化的鼠李糖苷酶多肽。
条款246.如条款228至245中任一项所述的用途或方法，其中所述功能变体包含与参考序列具有至少80％同一性的序列，尤其是至少90％，尤其是至少95％，例如至少98％，例如至少99％同一性。
条款247.如条款228至245中任一项所述的用途或方法，其中所述功能变体包含具有参考序列的至少100个、尤其是至少200个、尤其是至少300个、例如至少400个、例如至少500个连续氨基酸的片段的序列。
条款248.如条款228至245中任一项所述的用途或方法，其中所述功能变体包含相对于所述参考序列具有1至20个添加、缺失和/或取代的序列，尤其是1至15个添加、缺失和/或取代，尤其是1至10个添加、缺失和/或取代，例如1至5个添加、缺失和/或取代。条款249.如条款228至245中任一项所述的用途或方法，其中所述酶包含参考序列，例如由参考序列组成。
条款250.一种通过如条款1至226、228、231至239或242至249中任一项所述的方法制备的皂苷。
条款251.一种含有皂苷的组合物，其包含通过条款1至226、228、231至239或242至249中任一项的方法制备的产物皂苷。
条款252.如条款251所述的含有皂苷的组合物，其包含QS-21家族组分。
条款253.一种佐剂组合物，其包含如条款250至252中任一项所述的皂苷或含有皂苷的组合物。
条款254.一种使用如条款250至252中任一项所述的皂苷或含有皂苷的组合物制备的佐剂组合物。
条款255.如条款250至252中任一项所述的皂苷或含有皂苷的组合物在制备佐剂组合物中的用途。
条款256.一种免疫原性组合物，其包含如条款250至252中任一项所述的皂苷或含有皂苷的组合物和抗原。
条款257.一种免疫原性组合物，其包含如条款250至252中任一项所述的皂苷或含有皂苷的组合物以及编码抗原的多核苷酸。
条款258.一种试剂盒，其包括：
(i)如条款250至252中任一项所述的皂苷或含有皂苷的组合物
(ii)抗原。
条款259.一种试剂盒，其包括：
(i)如条款250至252中任一项所述的皂苷或皂苷组合物
(ii)编码抗原的多核苷酸。
条款260.一种工程化的葡萄糖苷酶多肽，其包含与SEQ ID No.262的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或其功能片段，其中所述工程化的葡萄糖苷酶多肽包含至少一个来自以下的残基取代：
F44Y；
V60L；
G117A；
F170N；
V263G或V263L；
N351H或N351Q；
A355H、A355I、A355L、A355M、A355R、A355T或A355W；
A356P；
R357A、R357C、R357K、R357M或R357Q；
G362C；
T365A、T365N或T365S；
L367C；
V394R；
V395Y；
Q396E、Q396G、Q396N、Q396P、Q396R、Q396S或Q396Y；
F430W；
R435F；
V438T；
V440F；
F442M或F442Q；
G444T；
A473F或A473R；
L474C、L474I或L474V；
I475F；
L492C、L492G、L492H、L492I、L492N、L492Q、L492V、L492W或L492Y；
Q493F或Q493H；
P494H或P494I；
S495I、S495K或S495Q；
G496P或G496W；
D498A、D498E、D498F、D498I、D498K、D498L、D498N、
D498P、D498R、D498S、D498T或D498V；
A502R；
M504G或M504R；
L507A或L507R；
T508M；
L529M；
F535P；
A536D或A536E；
A537R；
F541A、F541I、F541L、F541M或F541V；
L542I；
Q543G或Q543L；
E547L；和
Y585W。
条款261.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的一个。
条款262.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的两个。
条款263.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的三个。
条款264.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的四个。
条款265.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的五个。
条款266.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的六个。
条款267.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的七个。
条款268.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的八个。
条款269.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的九个。
条款270.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的十个。
条款271.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的十一个。
条款272.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的十二个。
条款273.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的十三个。
条款274.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的十四个。
条款275.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的十五个。
条款276.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的十六个。
条款277.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的十七个。
条款277.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的十八个。
条款278.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的十九个。
条款279.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的二十个。
条款280.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的二十一个。
条款281.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的二十二个。
条款282.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的二十三个。
条款283.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的二十四个。
条款284.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的二十五个。
条款285.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的二十六至三十个。
条款286.如条款260所述的多肽，其具有所述取代中的三十一至四十三个。
条款287.如条款260至286中任一项所述的多肽，其包含F44Y。
条款288.如条款260至287中任一项所述的多肽，其包含V60L。
条款289.如条款260至288中任一项所述的多肽，其包含G117A。
条款290.如条款260至289中任一项所述的多肽，其包含F170N。
条款291.如条款260至290中任一项所述的多肽，其包含V263G或V263L。
条款292.如条款291所述的多肽，其包含V263L。
条款293.如条款260至292中任一项所述的多肽，其包含N351H或N351Q。
条款294.如条款293所述的多肽，其包含N351H。
条款295.如条款260至294中任一项所述的多肽，其包含A355H、A355I、A355L、A355M、A355R、A355T或A355W。
条款296.如条款295所述的多肽，其包含A355H。
条款297.如条款295所述的多肽，其包含A355I。
条款298.如条款295所述的多肽，其包含A355L。
条款299.如条款295所述的多肽，其包含A355M。
条款300.如条款295所述的多肽，其包含A355R。
条款301.如条款295所述的多肽，其包含A355T。
条款302.如条款295所述的多肽，其包含A355W。
条款303.如条款260至302中任一项所述的多肽，其包含A356P。
条款304.如条款260至303中任一项所述的多肽，其包含R357A、R357C、R357K、R357M或R357Q。
条款305.如条款304所述的多肽，其包含R357M。
条款306.如条款260至305中任一项所述的多肽，其包含G362C。
条款307.如条款260至306中任一项所述的多肽，其包含T365A、T365N或T365S。
条款308.如条款307所述的多肽，其包含T365N。
条款309.如条款260至308中任一项所述的多肽，其包含L367C。
条款310.如条款260至309中任一项所述的多肽，其包含V394R。
条款311.如条款260至310中任一项所述的多肽，其包含V395Y。
条款312.如条款260至311中任一项所述的多肽，其包含Q396E、Q396G、Q396N、Q396P、Q396R、Q396S或Q396Y。
条款313.如条款312所述的多肽，其包含Q396R。
条款314.如条款260至313中任一项所述的多肽，其包含F430W。
条款315.如条款260至314中任一项所述的多肽，其包含R435F。
条款316.如条款260至315中任一项所述的多肽，其包含V438T。
条款317.如条款260至316中任一项所述的多肽，其包含V440F。
条款318.如条款260至317中任一项所述的多肽，其包含F442M或F442Q。
条款319.如条款318所述的多肽，其包含F442Q。
条款320.如条款260至319中任一项所述的多肽，其包含G444T。
条款321.如条款260至320中任一项所述的多肽，其包含A473F或A473R。
条款322.如条款321所述的多肽，其包含A473F。
条款323.如条款260至322中任一项所述的多肽，其包含L474C、L474I或L474V。
条款324.如条款323所述的多肽，其包含L474C。
条款325.如条款260至324中任一项所述的多肽，其包含I475F。
条款326.如条款260至325中任一项所述的多肽，其包含L492C、L492G、L492H、L492I、L492N、L492Q、L492V、L492W或L492Y。
条款327.如条款326所述的多肽，其包含L492H。
条款328.如条款326所述的多肽，其包含L492N。
条款329.如条款326所述的多肽，其包含L492V。
条款330.如条款260至329中任一项所述的多肽，其包含Q493F或Q493H。
条款331.如条款260至330中任一项所述的多肽，其包含P494I。
条款332.如条款260至331中任一项所述的多肽，其包含S495I、S495K或S495Q。
条款333.如条款260至332中任一项所述的多肽，其包含G496P或G496W。
条款334.如条款260至333中任一项所述的多肽，其包含G496P。
条款335.如条款260至334中任一项所述的多肽，其包含D498A、D498E、D498F、D498I、D498K、D498L、D498N、D498P、D498R、D498S、D498T或D498V。
条款336.如条款335所述的多肽，其包含D498P。
条款337.如条款260至336中任一项所述的多肽，其包含A502R；
条款338.如条款260至337中任一项所述的多肽，其包含M504G或M504R。
条款339.如条款260至338中任一项所述的多肽，其包含M504R。
条款340.如条款260至339中任一项所述的多肽，其包含L507A或L507R。
条款341.如条款340所述的多肽，其包含L507R。
条款342.如条款260至341中任一项所述的多肽，其包含T508M。
条款343.如条款260至342中任一项所述的多肽，其包含L529M。
条款344.如条款260至343中任一项所述的多肽，其包含F535P。
条款345.如条款260至344中任一项所述的多肽，其包含A536D或A536E。
条款346.如条款260至345中任一项所述的多肽，其包含A537R。
条款347.如条款260至346中任一项所述的多肽，其包含F541A、F541I、F541L、F541M或F541V。
条款348.如条款347所述的多肽，其包含F541I。
条款349.如条款260至348中任一项所述的多肽，其包含L542I。
条款350.如条款260至349中任一项所述的多肽，其包含Q543G或Q543L。
条款351.如条款260至350中任一项所述的多肽，其包含E547L。
条款352.如条款260至351中任一项所述的多肽，其包含Y585W。
条款353.如条款260所述的多肽，其包含一个突变是T365N。
条款354.如条款260或265至353所述的多肽，其包含R357M、T365N、A473F、L474C和I475F。
条款355.如条款260或267至353所述的多肽，其包含F44Y、R357M、T365N、F442Q、A473F、L474C和I475F。
条款356.如条款260或269至353所述的多肽，其包含F44Y、V263L、R357M、T365N、F442Q、A473F、L474C、I475F和F541I。
条款357.如条款260至353所述的多肽，其包含F44Y、V263L、A355W、R357M、T365N、L367C、Q396R、F442Q、L474C、I475F和F541I中的至少一个残基取代。
条款358.如条款357所述的多肽，其包含F44Y、V263L、A355W、R357M、T365N、L367C、Q396R、F442Q、L474C、I475F和F541I。
条款359.如条款260至358中任一项所述的多肽，其包含与SEQ ID No.262的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或其功能片段，其中所述工程化的葡萄糖苷酶多肽包含至少一个来自以下的残基取代：
F44Y；
V263L；
N351H；
A355H、A355M或A355W；
R357M；
T365N；
L367C；
Q396R；
V438T；
F442Q；
L474C；
I475F；
L492V、L492N或L492H，
M504R；
L507R；和
F541I。
条款359.如条款260至358中任一项所述的多肽，其包含与SEQ ID No.262的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列。
条款360.如条款260至358中任一项所述的多肽，其包含与SEQ ID No.262的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
条款361.如条款260至358中任一项所述的多肽，其包含与SEQ ID No.262的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
条款362.如条款260至358中任一项所述的多肽，其包含与SEQ ID No.262的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列。
条款363.如条款260至358中任一项所述的多肽，其中所述功能变体包含具有SEQID No.262的至少100个、尤其是至少200个、尤其是至少300个、例如至少400个、例如至少500个连续氨基酸的片段的序列。
条款364.如条款260所述的多肽，其包含SEQ ID No.1179的氨基酸序列。
条款365.如条款260所述的多肽，其包含SEQ ID No.1180的氨基酸序列。
条款366.如条款260所述的多肽，其包含SEQ ID No.1181的氨基酸序列。
条款367.如条款260所述的多肽，其包含SEQ ID No.1182的氨基酸序列。
条款368.如条款260所述的多肽，其包含SEQ ID No.1183的氨基酸序列。
条款369.如条款260至368中任一项所述的多肽，其进一步包含亲和标签。
条款370.如条款369所述的多肽，其中所述亲和标签是多聚his标签，例如六聚his标签。
条款371.如条款369或370所述的多肽，其中所述亲和标签位于N-末端。
条款372.如条款371所述的多肽，其包含SEQ ID No.1177的氨基酸序列。
条款373.如条款369或370所述的多肽，其中所述亲和标签位于C-末端。
条款374.如条款373所述的多肽，其包含SEQ ID No.1178的氨基酸序列。
条款375.如条款260至374中任一项所述的多肽，其包含1000个残基或更少，特别是950个残基或更少，特别是900个残基或更少，例如850个残基或更少。
条款376.一种工程化的鼠李糖苷酶多肽，其包含与SEQ ID No.1017的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或其功能片段，其中所述工程化的鼠李糖苷酶多肽包含至少一个来自以下的残基取代：
(i)A56C
(ii)A143P
(iii)Q181H、Q181R或Q181S
(iv)L214M
(v)G215S
(vi)F216M
(vii)G218D或G218N
(viii)K219G
(ix)A238M
(x)T252Y
(xi)T311W
(xii)V326C
(xiii)G357C
(xiv)S369C、S369I、S369K或S369M
(xv)I487M、I487Q或I487V
(xvi)K492N
(xvii)V499T
(xviii)G508S
(xix)R543C
(xx)L557Y
(xxi)G634A
(xxii)S635N
(xxiii)A690C和
(xxiv)Q921H。
条款377.一种多肽，其包含SEQ ID No.1017序列的氨基酸序列，具有一至二十四个选自由以下组成的列表中的突变：
(i)A56C
(ii)A143P
(iii)Q181H、Q181R或Q181S
(iv)L214M
(v)G215S
(vi)F216M
(vii)G218D或G218N
(viii)K219G
(ix)A238M
(x)T252Y
(xi)T311W
(xii)V326C
(xiii)G357C
(xiv)S369C、S369I、S369K或S369M
(xv)I487M、I487Q或I487V
(xvi)K492N
(xvii)V499T
(xviii)G508S
(xix)R543C
(xx)L557Y
(xxi)G634A
(xxii)S635N
(xxiii)A690C和
(xxiv)Q921H。
条款378.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的一个。
条款379.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的两个。
条款380.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的三个。
条款381.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的四个。
条款382.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的五个。
条款383.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的六个。
条款384.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的七个。
条款385.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的八个。
条款386.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的九个。
条款387.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的十个。
条款388.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的十一个。
条款389.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的十二个。
条款390.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的十三个。
条款391.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的十四个。
条款392.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的十五个。
条款393.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的十六个。
条款394.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的十七个。
条款395.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的十八个。
条款396.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的十九个。
条款397.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的二十个。
条款398.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的二十一个。
条款399.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的二十二个。
条款400.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的二十三个。
条款401.如条款376或377所述的多肽，其具有所述取代中的二十四个。
条款402.如条款376至401中任一项所述的多肽，其包含A56C。
条款403.如条款376至402中任一项所述的多肽，其包含A143P。
条款404.如条款376至403中任一项所述的多肽，其包含Q181H、Q181R或Q181S。
条款405.如条款404所述的多肽，其包含Q181H。
条款406.如条款404所述的多肽，其包含Q181R。
条款407.如条款404所述的多肽，其包含Q181S。
条款408.如条款376至407中任一项所述的多肽，其包含L214M。
条款409.如条款376至408中任一项所述的多肽，其包含G215S。
条款410.如条款376至409中任一项所述的多肽，其包含F216M。
条款411.如条款376至410中任一项所述的多肽，其包含G218D或G218N。
条款412.如条款411所述的多肽，其包含G218D。
条款413.如条款411所述的多肽，其包含G218N。
条款414.如条款376至413中任一项所述的多肽，其包含K219G。
条款415.如条款376至414中任一项所述的多肽，其包含A238M。
条款416.如条款376至415中任一项所述的多肽，其包含T252Y。
条款417.如条款376至416中任一项所述的多肽，其包含T311W。
条款418.如条款376至417中任一项所述的多肽，其包含V326C。
条款419.如条款376至418中任一项所述的多肽，其包含G357C。
条款420.如条款376至419中任一项所述的多肽，其包含S369C、S369I、S369K或S369M。
条款421.如条款420所述的多肽，其包含S369C。
条款422.如条款420所述的多肽，其包含S369I。
条款423.如条款420所述的多肽，其包含S369K。
条款424.如条款420所述的多肽，其包含S369M。
条款425.如条款376至424中任一项所述的多肽，其包含I487M、I487Q或I487V。
条款426.如条款424所述的多肽，其包含I487M。
条款427.如条款424所述的多肽，其包含I487Q。
条款428.如条款424所述的多肽，其包含I487V。
条款429.如条款376至428中任一项所述的多肽，其包含K492N。
条款430.如条款376至429中任一项所述的多肽，其包含V499T。
条款431.如条款376至430中任一项所述的多肽，其包含G508S。
条款432.如条款376至431中任一项所述的多肽，其包含R543C。
条款433.如条款376至432中任一项所述的多肽，其包含L557Y。
条款434.如条款376至433中任一项所述的多肽，其包含G634A。
条款435.如条款376至434中任一项所述的多肽，其包含S635N。
条款436.如条款376至435中任一项所述的多肽，其包含A690C。
条款437.如条款376至436中任一项所述的多肽，其包含Q921H。
条款438.如条款376或377所述的多肽，其包含一个突变是K219G。
条款439.如条款376、377或381至401所述的多肽，其包含A143P、L214M、K219G和Q921H。
条款440.如条款376、377或382至401所述的多肽，其包含A143P、L214M、K219G、G357C和Q921H。
条款441.如条款376、377或386至401所述的多肽，其包含A143P、L214M、G215S、G218N、K219G、G357C、G508S、G634A和Q921H。
条款442.如条款376至401所述的多肽，其包含A143P、L214M、G215S、G218D、K219G、G357C、G508S、G634A、A690C和Q921H中的至少一个残基取代。
条款443.如条款442所述的多肽，其包含A143P、L214M、G215S、G218D、K219G、G357C、G508S、G634A、A690C和Q921H。
条款444.如条款376、377或385至401所述的多肽，其包含A143P、L214M、G215S、K219G、G357C、G508S、G634A和Q921H和选自由以下组成的列表的一至十六个突变：
(i)A56C
(iii)Q181H、Q181R或Q181S
(vi)F216M
(vii)G218D或G218N
(ix)A238M
(x)T252Y
(xi)T311W
(xii)V326C
(xiv)S369C、S369I、S369K或S369M
(xv)I487M、I487Q或I487V
(xvi)K492N
(xvii)V499T
(xix)R543C
(xx)L557Y
(xxii)S635N和
(xxiii)A690C。
条款445.如条款444所述的多肽，其包含G218D或G218N。
条款446.如条款376至445中任一项所述的多肽，其包含与SEQ ID No.1017的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列。
条款447.如条款376至445中任一项所述的多肽，其包含与SEQ ID No.1017的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
条款448.如条款376至445中任一项所述的多肽，其包含与SEQ ID No.1017的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
条款449.如条款376至445中任一项所述的多肽，其包含与SEQ ID No.1017的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列。
条款450.如条款376至445中任一项所述的多肽，其中所述功能变体包含具有SEQID No.1017的至少100个、尤其是至少200个、尤其是至少300个、例如至少400个、例如至少500个连续氨基酸的片段的序列。
条款451.如条款376所述的多肽，其包含SEQ ID No.1189的氨基酸序列。
条款452.如条款376所述的多肽，其包含SEQ ID No.1190的氨基酸序列。
条款453.如条款376所述的多肽，其包含SEQ ID No.1191的氨基酸序列。
条款454.如条款376所述的多肽，其包含SEQ ID No.1192的氨基酸序列。
条款455.如条款376所述的多肽，其包含SEQ ID No.1193的氨基酸序列。
条款456.如条款376至455中任一项所述的多肽，其进一步包含亲和标签。
条款457.如条款456所述的多肽，其中所述亲和标签是多聚his标签，例如六聚his标签。
条款458.如条款456或457所述的多肽，其中所述亲和标签位于N-末端。
条款459.如条款458所述的多肽，其包含SEQ ID No.1177的氨基酸序列。
条款460.如条款456或457所述的多肽，其中所述亲和标签位于C-末端。
条款461.如条款460所述的多肽，其包含SEQ ID No.1178的氨基酸序列。
条款462.如条款376至461中任一项所述的多肽，其包含1100个残基或更少，特别是1050个残基或更少，特别是1000个残基或更少，例如950个残基或更少。
条款463.如条款376至462中任一项的多肽，其由以下组成：SEQ ID No.1的氨基酸序列，其具有选自由以下组成的列表中的一至二十四个突变：
(i)A56C
(ii)A143P
(iii)Q181H、Q181R或Q181S
(iv)L214M
(v)G215S
(vi)F216M
(vii)G218D或G218N
(viii)K219G
(ix)A238M
(x)T252Y
(xi)T311W
(xii)V326C
(xiii)G357C
(xiv)S369C、S369I、S369K或S369M
(xv)I487M、I487Q或I487V
(xvi)K492N
(xvii)V499T
(xviii)G508S
(xix)R543C
(xx)L557Y
(xxi)G634A
(xxii)S635N
(xxiii)A690C和
(xxiv)Q921H。
条款464.一种多核苷酸，其包含编码如条款260至463中任一项所述的工程化的葡萄糖苷酶或工程化的鼠李糖苷酶多肽的序列。
本申请中所有参考文献(包括专利申请和授权的专利)的教导，在此尽可能完全引入作为参考。被定义为“包含”某些要素的组合物或方法或过程被理解为包括(分别)由那些要素组成的组合物、方法或过程。本文所用的“基本上由...组成”是指可以存在另外的组分，前提是它们不改变整体特性或功能。
就数值而言，术语“近似”、“大约”或“约”通常是指在所陈述值的正负10％内的值，尤其是在所陈述值的正负5％内，尤其是所陈述值。
贯穿说明书，包括权利要求书，其中在上下文允许的情况下，术语“包含”及其变体如“包括”应被解释为包括所陈述的一个或多个要素(例如整数)，而不必然排除任何其他要素(例如整数)。因此,“包含”X的组合物可以仅由X组成，或者可以包括一些另外的，例如X+Y
单词“基本上”不排除“完全”，例如，“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，可以从本发明的定义中省略“基本上”一词。
如本文所用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非所述内容另有清楚地指示。
如本文所用，ng指纳克，ug或μg指微克，mg指毫克，ml或mL指毫升，mM指毫摩尔。类似的术语，如um，应相应地解释。
除非特别说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不要求任何特定的混合顺序。因此，组分可以以任何顺序混合。如果有三种组分，那么两种组分可以彼此组合，然后该组合可以与第三组分组合，以此类推。
将参考以下非限制性实施例进一步描述本发明：
实施例
实施例1–皂树粗水提物的HPLC
通过使用C4柱和梯度洗脱的反相HPLC分离粗树皮提取物：流动相A-水/乙腈，7/3v/v，含0.15％三氟乙酸；流动相B-含0.15％三氟乙酸的乙腈。UV检测波长为214nm。
必要时用纯水稀释粗树皮提取物样品。添加聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP；60mg/mL)，将混合物搅拌约30分钟，然后离心以从上清液中分离PVPP树脂。
然后分析上清液以提供HPLC UV色谱图。
图1提供了HPLC UV色谱图的代表性实例。显示了对应于QS-21级分的峰。
实施例2–分析方法
HPLC-UV
设备
Waters Alliance 2690/2695分离模块
Waters 2487UV检测器或2996 PDA检测器
Vydac蛋白C4 4.6x250mm 5um柱
流动相A(MPA)-0.15％三氟乙酸的水/乙腈溶液(70:30 v/v)
流动相B(MPB)-0.15％三氟乙酸的乙腈溶液
表1-HPLC-UV线性梯度条件
时间 流速(ml/min) ％MPA ％MPB
0 1 100 0
30 1 78.6 21.4
33 1 14.3 85.7
注入40ul样品。UV检测设置为214nM。
使用空白进样作为参考，色谱图中峰的积分提供了总吸光度。将感兴趣的峰(例如QS-21主峰)与总吸光度进行比较，以百分比形式确定峰含量。
HPLC-UV方法也方便地用于确定QS-21主峰含量和在先峰与QS-21主峰的比值。
UPLC-UV
设备
Waters Acquity UPLC
Waters Acquity可调UV检测器
Waters Acquity BEH C18 2.1x100mm 1.7um柱
流动相A(MPA)-0.025％乙酸水/乙腈溶液(70:30v/v)
流动相B(MPB)-0.025％三氟乙酸水/乙腈溶液(30:70v/v)
表2-UPLC-UV线性梯度条件
时间 流速(ml/min) ％MPA ％MPB
0 0.5 88 12
10.2 0.5 65.7 34.3
11.2 0.5 10 90
13.2 0.5 10 90
柱温28摄氏度。注入10ul样品。UV检测设置为214nM。
使用空白进样作为参考，色谱图中峰的积分提供了总吸光度。将感兴趣的峰(例如QS-21主峰)与总吸光度进行比较，以百分比形式确定峰含量。
UPLC-UV方法也可方便地用于确定2018/QS-21比率。
UPLC-UV/MS
设备
Waters Acquity UPLC
Waters Acquity可调UV检测器
Waters单四极杆质谱检测器SQD1(扫描范围1400至2040M/Z)
Waters Acquity BEH C18 2.1x100mm 1.7um柱
流动相A(MPA)-0.025％三氟乙酸水/乙腈/异丙醇溶液(75:20:5 v/v)
流动相B(MPB)-0.025％三氟乙酸水/乙腈/异丙醇溶液(10:72:18 v/v)
表3-UPLC-UV/MS线性梯度条件
时间 流速(ml/min) ％MPA ％MPB
0 0.6 100 0
6.23 0.6 23 77
测试样品在水/乙腈(70:30v/v)中的0.2％乙酸溶液中制备。柱温55摄氏度。注入10ul样品。UV检测设置为214nM。
术语“QS-21组”是指在本文所述的UPLC-UV/MS方法中，从B-异构体到lyo杂质之前的峰所鉴定的三萜糖苷。虽然各次运行之间的保留时间略有不同，但QS-21组位于大约3.8分钟(QS-21B-异构体)到大约4.5分钟(在lyo杂质峰之前，含有去阿拉伯呋喃糖基-QS-211856 A组分)。
使用空白进样作为参考，对色谱图中在溶剂洗脱后0.5至约5.50分钟且不出现在空白中的峰进行积分。
通过在整个色谱图上组合TIC以创建组合光谱，来鉴定最丰富种类的单同位素。
QS-21 2002 A组分比QS-21 1988 A组分的比率是通过比较QS-21主峰内与QS-212002 A组分相关的离子电流和与QS-21 1988 A组分相关的离子电流来计算的。
图5提供了示例性皂苷提取物的色谱图。图6显示了包括QS-21组和杂质峰的区域的放大细节。
图7A和7B提供了示例性纯化的皂树皂苷提取物的QS-21 1988 A(图7A)和QS-212002 A(图7B)分子量离子的提取的质谱图。
实施例3–皂树粗水提物的纯化
用PVPP处理皂树材料的粗水提物(每升粗水提物1kg PVPP)，所述粗水提物具有0.064或更低的2018组分比QS-21主峰的比率以及0.4或更低的在先峰比QS-21主峰的比率。吸附后，过滤混合物，从液体中分离出PVPP和结合的杂质。
图2提供了皂树的粗水提物的示例性HPLC-UV色谱图(用于在先峰比QS-21主峰比率的确定和QS-21主峰含量)。
图3提供了皂树的粗水提物的示例UPLC-UV色谱图(用于2018组分比QS-21主峰比率的确定)。
浓缩过滤的液体并使用水和30kD Hellicon膜通过超滤/渗滤进一步纯化。
使用聚苯乙烯树脂(Amberchrom XT20)通过反相色谱纯化所得渗透物。
表4-反相色谱苯乙烯树脂度条件
洗脱剂A：5％乙腈和0.25％乙酸
洗脱剂B：90％乙腈和0.25％乙酸
柱：30 cm ID，约17.7至20.5 L体积
加载：50-110 g/注射。
合并级分以提供聚苯乙烯纯化的皂苷提取物，其组成为：
％QS-21主峰≥18％(根据HPLC)
和
2018组分/QS-21主峰比率≤0.054(根据UPLC-UV)。
图4提供了聚苯乙烯纯化的皂苷提取物合并物的UPLC-UV色谱图实例。
使用苯基树脂(EPDM)通过反相色谱进一步纯化组合的聚苯乙烯纯化级分合并物。
表5-反相色谱苯基树脂度条件
洗脱剂B：90％乙腈和0.25％乙酸
洗脱剂C：35.2％乙腈和0.25％乙酸
柱：45cm ID，约39.8至42.9L体积
加载：13-21g/注射
合并含有QS-21的级分以提供苯基纯化的皂苷提取物，其组成为：
％QS-21组≥98.5
％QS-21主峰≥94.5
％2018组分≤2.7％
QS-21组以外的主峰≤1％(根据UPLC-UV/MS)。
使用C8树脂(Lichroprep RP8)和以下条件，通过反相色谱的捕获和释放来浓缩组合的苯基纯化皂苷提取物：
加载到以24％乙腈和0.20％乙酸调节的柱中。
用60％乙腈和0.20％乙酸洗脱。
11cm柱，约0.87至0.97L体积
加载：50-142g/注射
使用超滤/渗滤和Pellicon 1kDa膜对C8浓缩皂苷提取物进行溶剂交换，以将乙腈含量降低至低于21％。
然后在单一步骤中冻干所得的溶剂交换的皂苷提取物，以提供最终纯化的皂苷提取物产品。
使用实施例3中所述的方法可以一致地提供纯化的皂树皂苷提取物，该皂树皂苷提取物在QS-21主峰和2018组分方面具有确定的含量，呈现出与图5至9中所示的色谱图相当的色谱图。
实施例4–用于QS-18去葡糖基化为QS-21的葡萄糖苷酶的筛选
方法
酶选择
作用于糖苷键的水解酶家族(E.C.3.2.1.-)(“糖苷水解酶”(GH)或“糖苷酶”)目前包含约100万个成员，在包含聚糖和多糖的分子中具有广泛的活性。典型的QS-18家族分子含有许多这样的糖苷键，在直链四糖上的α-L-鼠李糖和支链末端β-D-葡萄糖之间存在1-3键，将QS-18家族与QS-21家族区分开。β-葡糖苷酶，即具有外切β-1,3-葡糖苷酶活性的酶(例如3.2.1.21和3.2.1.58)对该键的特异性水解将因此将QS-18家族组分转化为QS-21家族组分。最初使用CAZy(碳水化合物活性酶)数据库(www.cazy.com)鉴定了具有外切-β-1,3-葡萄糖苷酶活性的糖苷水解酶家族的特定成员，GH家族1、3和5据称拥有具有所需外切-β-1,3活性的酶成员。获得了来自GH家族1、3和5的由CAZy注释的所有序列，并为每一个构建了单独策划的隐马尔可夫模型谱，然后通过用HMMER(Eddy，1998)软件搜索2.09亿蛋白质成员Uniprot(www.uniprot.org)知识库，将该模型谱用于鉴定其他家族酶。在总计22,594个序列中，使用这种方法分别从GH家族1、3和5中鉴定出12,049、9,278和1,267个代表。然后使用MMSeqs2(Hauser，2016)对每组酶序列进行聚类，使用默认的聚类工作流程和参数，最小序列同一性和覆盖率分别为30％和80％。在初始聚类产生具有超过1000个成员的聚类的情况下，以更高的50％或70％同一性执行第二子聚类，以确保来自这些更大聚类的不同样本被更突出地表示。然后检查所有聚类，并从每个聚类中选择具有注释质量偏好、已知实验活性、来自蛋白质数据库(www.wwpdb.org)的现有三维结构或Uniprot注释的已知嗜极生物的样本。最终选择了400种不同的候选酶。使用基于密码子优化编码的专有遗传算法，制备编码连接到N-末端6xHis标签和Tev切割位点的每种所选酶的多核苷酸序列(插入正常起始甲硫氨酸N-末端的His标签接头的氨基酸序列，在SEQ ID No.1177中提供)。
候选酶和多核苷酸序列的细节总结在下表6中。
表6–葡萄糖苷酶候选序列
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实验4-1-在pH 7.5和室温下用纯化的QS-18(0.04mg/ml)筛选用于去葡糖基化的葡萄糖苷酶
将核苷酸序列亚克隆到pET24b+中用于表达。将10uL大肠杆菌细胞(OneBL21(DE3)化学感受态大肠杆菌)转移到96孔PCR板的每个孔中(在冰上预冷冻)。向DNA中加入10uL高压灭菌水，通过移液重悬，并将1uL质粒DNA(15-30ng)转移到感受态细胞中。加入后，立即用移液管混合所得混合物。通过将板放在热循环仪中于42℃热激30秒钟对细胞进行热激，然后直接转移到冰浴中2分钟。将100uL无菌溶原性肉汤(LB)加入到每个含有转化细胞的孔中。将每个板的内容物转移到预先用400uL LB等分的96-深孔板中，将板在37℃和85％湿度下振荡孵育1小时。生长后，将含有100ug/mL卡那霉素的500uL无菌LB加入到含有细胞的板中，并且将板在37℃下培养过夜(18小时)，湿度控制在85％。
向1000mL过夜表达培养基补充添加1mL 50m g/mL卡那霉素和20mL 50％v/v甘油(最终50ug/mL卡那霉素和1％甘油)。96孔测定块2mL板等分，每孔380uL培养基。添加来自转化板的预接种物(20uL)。将板适当密封，并在37℃以300振荡培养2小时。2小时后，温度降至20℃并继续培养20小时。
将液体培养物在4℃下离心10分钟。弃去上清液，将板印迹在吸收材料上以除去残留物，并将板冷冻在-80℃下。
根据以下方案制备裂解缓冲液：
1.将硫酸多粘菌素B(0.5mg/mL)悬浮在pH 7.5的100mM磷酸钾中
2.超声处理混合物，直到硫酸多粘菌素B溶解
3.加入溶菌酶(1mg/mL)和benzonase(0.1uL/mL裂解缓冲液)
从-80℃冰箱中取出每个细胞沉淀板的2份拷贝，并允许解冻。将200uL裂解缓冲液加入到细胞沉淀板的一份拷贝的每个孔中。将板在室温下振荡10分钟。将190uL细胞沉淀/裂解缓冲液转移到相应的新鲜细胞沉淀板上。这些板在室温下振荡孵育2小时。通过离心(10分钟，4℃)澄清裂解物。
通过类似于实施例3的方法获得QS-18，在苯基处理后收集含QS-18的苯基级分(对应于关键组分的m/z的存在通过MS确认，然后苯基级分不经进一步处理使用)。通过用100mM磷酸钾pH 7.5稀释QS-18水溶液(约1mg/mL)至0.2mg/mL来制备QS-18溶液。将40uL澄清的裂解物转移到新鲜的96孔PCR板中。将10uL QS-18溶液加入裂解物的每个孔中，最终浓度为0.04mg/mL。室温下振荡孵育20小时，用50uL MeCN淬灭，室温下振荡10分钟。使用WatersAcquity H class与Waters Xevo Tandem Quadrupole(TQD)质谱仪联用，通过LC-MS/MS对样品进行分析。
LCMS/MS 3分钟法
酶活性计算如下：
利用表达无关蛋白的质粒的阴性对照反应的平均％转化为0.42％，标准偏差(S.D.)为0.10％。％转化>0.72％，即高于阴性对照>3S.D.的候选酶被认为是阳性命中，列于下表7中。QS-21标准的样品结果显示在图10中，阴性对照的样品结果显示在图11中，用SEQ ID No.262的葡萄糖苷酶处理的样品结果显示在图12中。
实验4-2-在pH 6和30℃下用纯化的QS-18(1mg/ml)筛选用于去葡糖基化的葡萄糖苷酶
以与上述实验4-1相同的方式制备裂解物，除了裂解缓冲液是在100mM磷酸钾缓冲液pH 6中制备的。通过将QS-18溶解在100mM磷酸钾缓冲液pH 6(2mg/mL)中来制备QS-18溶液。
将12uL澄清的裂解物转移到新鲜的96孔PCR板中。加入12uL QS-18溶液(最终浓度为1mg/mL)，将板密封并过夜(30℃)孵育18小时。在用25uL MeCN淬灭并振荡10分钟(RT)后，使用实验4-1中描述的LC-MS/MS方案分析样品，并以类似方式测定酶活性。
阴性对照反应的平均％转化为0.38％，标准偏差(S.D.)为0.06％。表7列出了％转化>0.56％，即高于阴性对照>3S.D.的序列。
实验4-3-在pH 7和30℃下在粗树皮提取物(1∶2000稀释度)中用QS-18筛选用于去葡糖基化的葡萄糖苷酶
根据以下程序制备裂解物。
将50uL 50％v/v甘油转移到平底96孔板的每个孔中。将来自实验4-1的过夜培养板的每个孔中的50uL(以LB计)通过移液管吸取进行转移并混合。然后用箔密封覆盖板，并在-80℃下冷冻，作为转化体的甘油原液。将甘油原液从-80℃冰箱中取出并解冻。通过将5mL LB移液到50mL管中制备过夜培养物，其中卡那霉素作为选择标记，最终浓度为50μg/mL。用10μL甘油原液接种培养物，并在37℃振荡培养过夜。
通过用移液管将25mL Terrific Broth(TB)移入250mL锥形瓶来制备烧瓶培养物，其中卡那霉素作为选择标记，最终浓度为50μg/mL。使用分光光度计测量过夜培养物OD600，并计算起始OD～0.1的初始接种体体积。接种培养物，并在37℃下振荡培养至OD～0.6。
用1mM IPTG诱导培养物，并通过振荡将温度降低至20℃。然后将培养物孵育过夜。以单个1mL等分试样(在2mL试管中)收获培养物。将1mL等分试样以13000g离心3分钟，弃去上清液。将沉淀物冷冻在-20℃。
根据以下方案制备裂解缓冲液：
-将硫酸多粘菌素B(0.5mg/mL)和溶菌酶(1mg/mL)悬浮在50mM磷酸盐缓冲液，0.3MNaCl，pH 8中。
-加入Benzonase(20U/mL)和0.05％吐温-20。
将1mL裂解缓冲液加入来自1mL培养物等分试样的沉淀中。将裂解的样品在室温下振荡孵育2小时。通过在4℃下以13000g离心5分钟来澄清裂解物。
将通过皂树的水提取获得的并且含有至少2.80mg/ml QS-21(根据HPLC-UV)的粗树皮提取物(CBE)在pH 7的50mM磷酸钾缓冲液中以1∶400稀释。将100ul稀释的CBE加入到400ul的每种裂解物中，得到1∶2000ul的最终稀释度。
当稀释的CBE加入到裂解物中时，溶液涡旋约5秒，然后取80ul样品并用160ul甲醇(MeOH)淬灭。这被用作时间0样品。然后让反应溶液和对照在30℃下振荡。1小时后以与时间0样品相同的方式取样。使用实验4-1中描述的方案通过LCMS/MS分析样品，并以类似的方式测定酶活性。
酶活性计算为粗树皮提取物中存在的QS-18的％转化：
其中
实验4-4-筛选用于将粗树皮提取物(1∶20稀释)中的QS-18去葡糖基化为QS-21的葡萄糖苷酶
如实验4-2中制备裂解物。
通过在搅拌下滴加2M NaOH将粗树皮提取物(CBE)调节至pH 6。将25uL澄清的裂解物转移到反应板中，加入22.5ul pH 6的100mM磷酸钾缓冲液，加入2.5ul pH 6的CBE。密封反应板，在25℃振荡孵育18小时，然后加入50uL乙腈(MeCN)淬灭。将淬灭的反应板重新密封，并在20℃振荡孵育10分钟。将反应板离心(10分钟，4℃)，并通过UV HPLC用以下方法分析：
UV方法EM2020N435545v1_2
使用该色谱，三个重要的峰显而易见：左峰(保留时间约为2.30-2.35分钟)主要包含QS-17家族组分；中间峰(保留时间约为2.37-2.42分钟)主要包含QS-18家族组分和去葡糖基-QS-17家族组分；右峰(保留时间约为2.44-2.50分钟)主要包含QS-21家族组分。MS/MS支持峰鉴定。
酶活性计算为粗树皮提取物中存在的中间峰的％转化：
其中
图13提供了葡萄糖苷酶SEQ ID No.262处理后和阴性对照的示例性色谱图。
结果
表7
N.T.表示未测试
基于通过LCMS/MS对QS-18 2150和QS-21 1988组分的检测(实施例4-1、4-2和4-3)，或者对中间峰(主要是QS-18家族和去葡糖基-QS-17家族)和右峰(主要是QS-21家族)的UV HPLC定量(实施例4-4)，实施例4表明，可以通过筛选一组候选酶(400种中的38种，9.5％)来鉴定许多合适的葡萄糖苷酶。葡萄糖苷酶能够在一定范围的pH、起始材料浓度和起始材料纯度下将QS-18家族组分转化为QS-21家族组分。
虽然某些候选酶在测试条件下没有表现出显著的转化，但这可能是由于酶表达、条件适合性(即酶可能在其他条件下发挥作用)或基本缺乏所需的酶活性的问题。
实施例5–用于QS-18去葡糖基化为QS-21的另外葡萄糖苷酶的筛选
方法
酶选择
基于与活性位点模型的氨基酸相似性选择另外的候选葡萄糖苷酶，所述活性位点模型基于来自实施例4的阳性命中。
最终选择了94种另外的候选酶。制备密码子优化的多核苷酸序列，其编码与N-末端6xHis标签相连的每种选择的酶。另外的候选酶和多核苷酸序列的细节总结在下表8中。
表8–另外的葡萄糖苷酶候选序列
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实验5-1-在pH 7.5和30℃下用纯化的QS-18(0.04mg/ml)筛选用于去葡糖基化的另外葡萄糖苷酶
94个另外的基因连同阳性对照(编码SEQ ID No.262的DNA)和阴性对照以与上述实验4-1相同的方式进行转化、表达、裂解和反应，除了反应在30℃孵育18小时外。
根据实验4-1中的程序通过LCMS/MS分析样品。所有显示％转化至少为3的酶的结果如表9所示。
实验5-2-在pH 6和35℃下在粗树皮提取物(80％)中用QS-18筛选用于去葡糖基化的另外葡萄糖苷酶
如实验4-2所述，在pH 6下裂解板。将40uL澄清的裂解物转移到反应板上。
通过在搅拌下滴加2M NaOH将CBE的pH调节至pH 6。向反应板的每个孔中加入160uL pH 6的CBE。密封反应板，并在35℃振荡孵育18小时。
通过向反应板的每个孔中加入200uL MeCN(2％乙酸(AcOH)，1mg/mL苯己酮)来淬灭反应板。将淬灭的反应板重新密封，并在20℃振荡孵育10分钟。然后将反应板离心(10分钟，4℃)。
将200μl从淬灭板的每个孔转移到新的96孔板的相应孔中，并密封。用实验4-4的方法通过UV HPLC分析该板。
实验5-3-在pH 6和35℃下在经处理的树皮提取物(80％)中用QS-18筛选用于去葡糖基化的另外葡萄糖苷酶
重复实验5-1，在pH 6用经处理的树皮提取物(TBE)代替CBE。通过PVPP处理和浓缩从CBE制备TBE，以提供具有约4g/L的QS-21浓度的TBE。通过在搅拌下滴加2M NaOH将TBE的pH调节至6。
表9
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基于通过LCMS/MS对QS-18 2150和QS-21 1988组分的检测(实施例5-1)，或者对中间峰(主要是QS-18家族和去葡糖基-QS-17家族)和右峰(主要是QS-21家族)的UV HPLC定量(实施例5-2和5-3)，实施例5表明，可以通过筛选一组候选酶来鉴定许多合适的葡萄糖苷酶，并且表明与先前鉴定的合适的葡萄糖苷酶相似的候选酶(94种中的51种，54％)更可能也是合适的。葡萄糖苷酶能够在一定范围的pH、起始材料浓度和起始材料纯度下将QS-18家族组分转化为QS-21家族组分。
同样，虽然某些候选酶在测试条件下没有表现出显著的转化，但这可能是由于酶表达、条件适合性(即酶可能在其他条件下发挥作用)或基本缺乏所需的酶活性的问题。
实施例6–用于QS-17去鼠李糖基化为QS-18的鼠李糖甘酶的筛选
方法
酶选
QS-17家族组分向QS-18家族组分的转化涉及位于分子酰基链部分的末端的α-L-阿拉伯呋喃糖和α-L-鼠李糖之间的1,2糖苷键的水解。如CAZy(碳水化合物活性酶)数据库(www.cazy.com)所注释的，来自家族78和106的糖苷水解酶表现出切割该键所必需的外切-α-1,2鼠李糖苷酶活性(3.2.1.40)。获得了来自GH家族78和106的由CAZy注释的所有序列，并为每一个构建了单独策划的隐马尔可夫模型谱，然后通过用HMMER(Eddy，1998)软件搜索2.09亿蛋白质成员Uniprot(www.uniprot.org)知识库，将该模型谱用于鉴定其他家族酶。总共鉴定了11,749个序列：分别来自GH家族78和106的10,653和1096个代表。然后使用MMSeqs2(Hauser，2016)对每组酶序列进行聚类，使用默认的聚类工作流程和参数，最小序列同一性和覆盖率分别为30％和80％。在初始聚类产生具有超过1000个成员的聚类的情况下，以更高的50％或70％同一性执行第二子聚类，以确保来自这些更大聚类的不同样本被更突出地表示。然后检查所有聚类，并从每个聚类中选择具有注释质量偏好、已知实验活性、来自蛋白质数据库(www.wwpdb.org)的现有三维结构或Uniprot注释的已知嗜极生物的样本。最终选择了94种不同的候选酶。使用基于密码子优化编码的专有遗传算法，制备编码连接到C-末端6xHis标签和Tev切割位点的每种选择的酶的多核苷酸序列(插入终止密码子的N-末端的接头His标签的氨基酸序列在SEQ ID No.1178中提供)。
候选酶和多核苷酸序列的细节总结在下表10中。
表10–鼠李糖苷酶候选序列
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实验6-1-用于经处理的树皮提取物(2％)中皂苷的去鼠李糖基化的鼠李糖苷酶的筛选
以与实验4-1相同的方式亚克隆、转化、表达和裂解对应于SEQ ID 989至1082的合成核苷酸序列，除了用200μl裂解缓冲液裂解单细胞沉淀板外。
通过用9体积100mM磷酸钾pH 7.5稀释1体积来制备经处理的树皮提取物(TBE)溶液。将40uL澄清的裂解物转移到新鲜的96孔PCR板中。将10uL 10倍稀释的TBE溶液添加到每个裂解物孔中，使最终浓度为2％(1/50)。将板在30℃下振荡培养18小时，用50uL MeCN+2％AcOH淬灭，并在室温下振荡10分钟，然后离心(10分钟，4℃)以除去颗粒。使用实验4-1的方法通过LCMS/MS分析样品。监测以下MS-MS转换，以观察从起始皂苷到产物去鼠李糖基化皂苷的鼠李糖损失。
图14至19提供了阴性对照处理和鼠李糖苷酶SEQ ID No.1017处理后的示例性色谱图。
数据表示为鼠李糖基化的起始皂苷比去鼠李糖基化的产物的TIC峰面积比百分比(PAR％)。
测量在QS-17 2296组分的阿拉伯呋喃糖部分的C2位置的α-O-鼠李糖基化的去除活性，以产生QS-18 2150组分；去葡糖基-QS-17 2134产生QS-21 1988组分并且QS-17 2310组分产生QS-18 2164。
没有检测到去除C3糖鼠李糖的活性，这由对QS-18 2164组分没有影响来证明(QS-18 2164/QS-21 1988比率没有改变)。此外，没有观察到连接到岩藻糖C2位置的C28糖鼠李糖的内切切割。
表11
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实验6-2-用于经处理的树皮提取物(25％)中皂苷的去鼠李糖基化的鼠李糖苷酶的筛选
按照实验6-1的方法表达和裂解鼠李糖苷酶的子集。
通过添加NaOH(2M)将经处理的树皮提取物(TBE)溶液的pH值调节至7.4。将75uL澄清的裂解物转移到新鲜的96孔PCR板中。将25uL TBE溶液(pH 7.4)加入到裂解物的每个孔中，达到25％的最终浓度。将板在30℃下振荡培养19.5小时。
用100uL MeCN+2％ AcOH淬灭，并在室温下振荡10分钟，然后离心(10分钟，4℃)以除去颗粒。使用实验4-4的方法通过UV HPLC分析样品。使用该色谱，三个重要的峰显而易见：左峰(保留时间约为2.30-2.35分钟)主要包含QS-17家族组分；中间峰(保留时间约为2.37-2.42分钟)主要包含QS-18家族组分和去葡糖基-QS-17家族组分；右峰(保留时间约为2.44-2.50分钟)主要包含QS-21家族组分。MS/MS支持峰鉴定。
在QS-17家族组分的阿拉伯呋喃糖部分的C2位置的α-O-鼠李糖基化的酶介导的水解由于QS-18家族组分的形成而导致左峰的减少和中间峰的增加。去葡糖基-QS-17家族组分的阿拉伯呋喃糖部分的C2位置处的α-O-鼠李糖基化的酶介导的水解由于QS-21家族组分的形成而导致中间峰减少和右峰增加。
确定每个峰的相对百分比。对于在这些条件下有活性的酶，观察到左峰减少，同时中间峰和右峰增加。下表12提供了鼠李糖苷酶的测试子集的结果。
表12
图20显示了SEQ ID No.1017处理和阴性对照的UV HPLC色谱图的实例。
实验6-3-用于粗树皮提取物(80％)中皂苷的去鼠李糖基化的鼠李糖苷酶的筛选
按照实验6-1的方法表达和裂解选择的变体。
通过添加NaOH(2M)将粗树皮提取物(CBE)溶液的pH值调节至7.4。将20uL澄清的裂解物转移到新鲜的96孔PCR板中。将80uL CBE溶液(pH 7.4)加入到裂解物的每个孔中，达到80％的最终浓度。将板在30℃下振荡培养19.5小时
用100uL MeCN+2％ AcOH淬灭，并在室温下振荡10分钟，然后离心(10分钟，4℃)以除去颗粒。使用实验4-4的方法通过UV HPLC分析样品。
使用该色谱，三个重要的峰显而易见：左峰(保留时间约为2.30-2.35分钟)主要包含QS-17家族组分；中间峰(保留时间约为2.37-2.42分钟)主要包含QS-18家族组分和去葡糖基-QS-17家族组分；右峰(保留时间约为2.44-2.50分钟)主要包含QS-21家族组分。MS/MS支持峰鉴定。
在QS-17家族组分的阿拉伯呋喃糖部分的C2位置的α-O-鼠李糖基化的酶介导的水解由于QS-18家族组分的形成而导致左峰的减少和中间峰的增加。去葡糖基-QS-17家族组分的阿拉伯呋喃糖部分的C2位置处的α-O-鼠李糖基化的酶介导的水解由于QS-21家族组分的形成而导致中间峰减少和右峰增加。
确定每个峰的相对百分比。对于在这些条件下有活性的酶，观察到左峰减少，同时中间峰和右峰增加。下表13提供了鼠李糖苷酶的测试子集的结果：
表13
图21显示了SEQ ID No.1017处理和阴性对照的UV HPLC色谱图的实例。
基于通过LCMS/MS对QS-17 2296、QS-17 2310、QS-18 2150、QS-18 2164、去葡糖基-QS-17 2134和QS-21 1988组分的检测(实施例6-1)，或对QS-17、QS-18和QS-21峰的UVHPLC定量(实施例6-2和6-3)，实施例6显示，可通过筛选一组候选酶来鉴定许多鼠李糖苷酶(在实施例6-1中，94种中的29种，31％达到4.5或更低的QS-17PAR％)。在一系列起始材料浓度和起始材料纯度下，鼠李糖苷酶能够将QS-17家族组分转化为QS-18家族组分，将去葡糖基-QS-17家族组分转化为QS-21家族组分。
同样，虽然某些候选酶在测试条件下没有表现出显著的转化，但这可能是由于酶表达、条件适合性(即酶可能在其他条件下发挥作用)或基本缺乏所需的酶活性的问题。
实施例7-粗树皮提取物50％)中皂甘的去葡糖基化和去鼠李糖基化
方法
在发酵罐中培养表达葡萄糖苷酶SEQ ID No.262(作为His-标记的酶，DNA SEQ IDNo.662)和单独表达鼠李糖苷酶SEQ ID no.1017(作为His-标记的形式，DNA SEQ IDNo.1111)的大肠杆菌细胞，分离、裂解、澄清并冻干所得裂解物以产生含有每种表达的酶的粉末。
将500uL CBE与500uL体积乙酸钠缓冲液(50mM，pH 6)混合(该缓冲液含有30g/L含葡萄糖苷酶的冻干粉末和3g/L含鼠李糖苷酶的冻干粉末)，并在37℃孵育24小时。
通过加入等体积的MeOH淬灭反应，并使用实验4-1的方法通过LC-MS/MS分析，监测下表中的转换
表14
MRM
QS-18 2150 1074.49>836.355
QS-18 2164 1081.495>843.365
QS-17 2296 1147.515>836.355
QS-17 2310 1154.525>843.365
QS-21 1988 993.46>755.33
QS-21 2002 1000.47>762.34
去阿拉伯呋喃糖基QS-18 2018 1008.465>836.355
去葡糖基QS-17 2134 1066.49>755.33
结果
图22提供了在T0时(图A)和24小时时(图B)QS-21 1988组分含量的示例性LCMS/MS色谱图。所有受监测组分的结果总结如下：
表15
在阿拉伯呋喃糖部分的C2位置具有α-O-鼠李糖基化的组分被降低到检测限以下，而具有葡萄糖部分的组分在处理24小时后显示出>78％的降低。选择性鼠李糖和葡萄糖水解的相应产物显示出显著增加。
实施例8-用于粗树皮提取物中皂苷的去葡糖基化的葡萄糖苷酶变体的筛选
方法
使用分子生物学技术制备编码野生型海洋贫养杆菌葡萄糖苷酶(SEQ ID No.262)中突变的遗传变体文库，制备与位于N-末端的His标签连接的酶。在400ul表达培养基中培养单一单克隆集落，并表达蛋白质。将细胞沉淀在200ul相关缓冲液中裂解(表16)。
将裂解物在相关缓冲液中适当稀释，以使裂解物加载量达到所示的％加载量(1％加载量相当于在200ul反应中使用2ul原始裂解物)。在一些实验中，鼠李糖苷酶在筛选反应期间也存在(并且在对照中也存在，消除了对结果的任何影响)。
通过水提取皂树获得的粗树皮提取物(CBE)，其含有至少2.80mg/ml的QS-21(根据HPLC-UV)。通过在搅拌下滴加2M NaOH将CBE的pH调节至pH 6。加入相关浓度的相关葡萄糖苷酶。将适当相对体积的pH 6CBE(160ul(80％)或150ul(75％))加入反应板的每个孔中。密封反应板，并在相关温度下振荡过夜孵育18至22小时。
通过向反应板的每个孔中加入200uL MeCN(2％ AcOH，1mg/mL苯己酮)来淬灭反应板。将淬灭的反应板重新密封，并在20℃振荡孵育10分钟。然后将反应板离心(10分钟，4℃)。
将200μl从淬灭板的每个孔转移到新的96孔板的相应孔中，并密封。使用以下方法通过UV HPLC分析该板：
UV方法EM2020N435545v2_2
阴性对照(不表达测试酶的裂解物)和阳性对照(表达亲本对照-野生型或以前的变体，视情况而定)。葡萄糖苷酶相对于亲本的倍数改进(FIOP)计算(较短方法)如下：
％右峰＝100*右峰面积/(右峰面积+左峰面积)
计算阴性对照(每板)的平均右峰面积％，并从所有孔中减去，以给出每个孔的高于平均阴性对照的右峰增加％
计算每板阳性对照的右峰平均增加％
FIOP＝观察到的右峰增加％除以平均阳性对照增加
结果
图23提供了用酶处理CBE后和阴性对照的说明性色谱图。
表16
/>
TBD＝待确定
FIOP-相对于亲本(即前面的酶)的倍数改进，累积FIOP是前面几轮的乘积，名义上是相对于原始野生型(WT)起点的倍数改进(然而，由于条件在各轮之间变化，WT不用作对照，累积FIOP不是直接测量，而是估计)。以下突变与至少在一个实例中证明活性提高的酶相关：
F44Y；
V60L；
G117A；
F170N；
V263G或V263L；
N351H或N351Q；
A355H、A355I、A355L、A355M、A355R、A355T或A355W；
A356P；
R357A、R357C、R357K、R357M或R357Q；
G362C；
T365A、T365N或T365S；
L367C；
V394R；
V395Y；
Q396E、Q396G、Q396N、Q396P、Q396R、Q396S或Q396Y；
F430W；
R435F；
V438T；
V440F；
F442M或F442Q；
G444T；
A473F或A473R；
L474C、L474I或L474V；
I475F；
L492C、L492G、L492H、L492I、L492N、L492Q、L492V、L492W或L492Y；
Q493F或Q493H；
P494H或P494I；
S495I、S495K或S495Q；
G496P或G496W；
D498A、D498E、D498F、D498I、D498K、D498L、D498N、D498P、D498R、D498S、D498T或D498V；
A502R；
M504G或M504R；
L507A或L507R；
T508M；
L529M；
F535P；
A536D或A536E；
A537R；
F541A、F541I、F541L、F541M或F541V；
L542I；
Q543G或Q543L；
E547L；和
Y585W。
实施例9-用于粗树皮提取物中皂苷的去鼠李糖基化的鼠李糖苷梅变体的筛选
方法
使用分子生物学技术制备编码野生型黄色克雷伯氏菌鼠李糖苷酶(SEQ IDNo.1017)中突变的遗传变体文库，制备与位于C-末端的His标签连接的酶。在400ul表达培养基中培养单一单克隆集落，并表达蛋白质。将细胞沉淀在200ul相关缓冲液中裂解(表17)。
将裂解物在相关缓冲液中适当稀释，以使裂解物加载量达到所示的％加载量(1％加载量相当于在200ul反应中使用2ul原始裂解物)。
将通过水提取皂树获得的并且包含至少2.80mg/ml的QS-21(根据HPLC-UV)的粗树皮提取物(CBE)通过在搅拌下滴加2M NaOH调节至pH 6。加入相关浓度的相关葡萄糖苷酶。将适当相对体积的pH 6CBE(160ul(80％)或150ul(75％))加入反应板的每个孔中。密封反应板，并在相应的温度和时间下孵育。
通过向反应板的每个孔中加入200uL MeCN(2％ AcOH，1mg/mL苯己酮)来淬灭反应板。将淬灭的反应板重新密封，并在20℃振荡孵育10分钟。然后将反应板离心(10分钟，4℃)。
将200μl从淬灭板的每个孔转移到新的96孔板的相应孔中，并密封。用实施例4中描述的方法通过UV HPLC分析该板。
使用该色谱，三个重要的峰显而易见：左峰(保留时间约为2.30-2.35分钟)主要包含QS-17家族组分；中间峰(保留时间约为2.37-2.42分钟)主要包含QS-18家族组分和去葡糖基-QS-17家族组分；右峰(保留时间约为2.44-2.50分钟)主要包含QS-21家族组分。MS/MS支持峰鉴定。
酶活性计算为粗树皮提取物中存在的左峰的％转化：
其中
/>
图24提供了CBE和阴性对照酶处理后的说明性色谱图。
表17
R1(SEQ ID No.1189)-K219G
R2(SEQ ID No.1190)-A143P、L214M、K219G、Q921H；
R3(SEQ ID No.1191)-A143P、L214M、K219G、G357C、Q921H
R4(SEQ ID No.1192)-A143P、L214M、G215S、G218N、K219G、G357C、G508S、G634A、Q921H
R5(SEQ ID No.1193)-A143P、L214M、G215S、G218D、K219G、G357C、G508S、G634A、A690C、Q921H
结果
表18
FIOP-相对于亲本(即前面的酶)的倍数改进，累积FIOP是前面几轮的乘积，名义上是相对于原始WT起点的倍数改进(然而，由于条件在各轮之间变化，WT不用作对照，累积FIOP不是直接测量，而是估计)。
以下突变与至少在一个实例中证明活性提高的酶相关：
(i)A56C
(ii)A143P
(iii)Q181H,Q181R或Q181S
(iv)L214M
(v)G215S
(vi)F216M
(vii)G218D或G218N
(viii)K219G
(ix)A238M
(x)T252Y
(xi)T311W
(xii)V326C
(xiii)G357C
(xiv)S369C、S369I、S369K或S369M
(xv)I487M、I487Q或I487V
(xvi)K492N
(xvii)V499T
(xviii)G508S
(xix)R543C
(xx)L557Y
(xxi)G634A
(xxii)S635N
(xxiii)A690C和
(xxiv)Q921H。
实施例10-使用工程化的酶对粗树皮提取物(50％)中皂苷的去葡糖基化和去鼠李 糖基化
方法
将来自表达葡萄糖苷酶(来自实施例8WT葡萄糖苷酶和经工程化的葡萄糖苷酶多肽G1至G5)和鼠李糖苷酶(来自实施例9WT鼠李糖苷酶和经工程化的鼠李糖苷酶多肽R1至R5)的澄清细胞裂解物的冻干粉末溶解于pH 5.8的200mM乙酸钠水溶液中，以4倍于最终反应浓度制备酶溶液，如表19和20所示。
将每种葡萄糖苷酶溶液与等体积的pH 5.8的200mM乙酸钠水溶液合并，并分别与等体积的pH 5.8的含有2mg/ml鼠李糖苷酶R5的200mM乙酸钠水溶液合并。这是足以在4小时内实现相关鼠李糖部分完全水解的鼠李糖苷酶加载量。
将每种鼠李糖苷酶溶液与等体积的pH 5.8的200mM乙酸钠水溶液合并，并分别与等体积的pH 5.8的含有2mg/ml葡萄糖苷酶G5的200mM乙酸钠水溶液合并。这是足以在4小时内实现相关葡萄糖部分完全水解的葡萄糖苷酶加载量。
用2M氢氧化钠将CBE调节至pH 6.0至6.2，并向酶溶液中加入等体积以制备反应混合物(即反应混合物中50％的CBE浓度)，葡萄糖苷酶和/或鼠李糖苷酶的浓度如表19和20所示。将反应混合物加热至35℃，加热时间如表19和20所示，之后通过加入等体积的含有2％乙酸的MeCN来淬灭反应，并在离心(10分钟，4℃)之前在室温下振荡10分钟以除去颗粒。使用实验4-4的方法通过UV HPLC分析样品。
结果
表19和20显示了左、中间和右峰的组成变化。取决于伴侣酶的存在或不存在，组成由于酶的作用而改变。在这些条件下，反应程度与酶浓度和反应时间成比例。表格显示了酶浓度和反应时间的数据，提供了同等程度的反应。由每个变体引入的突变导致的改进等于酶浓度变化的倍数x时间(即，倍数改进＝前面的变体的(酶浓度x时间)÷后面的变体的(酶浓度x时间))。通过单个倍数改进的乘积来计算相对于原始酶变体的累积倍数改进。葡萄糖苷酶G5显示出相比于WT葡萄糖苷酶约800倍改进。鼠李糖苷酶R5显示出相比于野生型鼠李糖苷酶约30倍改进。
发现变体G5和R5在从25℃到40℃的反应条件范围内、从pH 5到7(对于pH 5.4到6.2保持>80％的相对活性，对于pH 5.2到7保持>50％的相对活性)以及CBE加载的范围至少为150％(通过在更小的体积中重溶冻干的CBE实现)时表现出活性。
/>
实施例11-使用工程化的酶对粗树皮提取物(50％)中皂甘的去葡糖基化和去鼠李 糖基化
方法
将来自表达来自实施例8的工程化的葡萄糖苷酶多肽G3和工程化的鼠李糖苷酶多肽R2的澄清细胞裂解物的冻干粉末溶解在pH 5.8的200mM乙酸钠水溶液中至3g/L(葡萄糖苷酶)和2g/L(鼠李糖苷酶)的浓度。对于1L反应，将200mM乙酸钠缓冲液(700mL)装入搅拌的反应器中。在持续搅拌下，加入葡萄糖苷酶酶粉末(2.1g)和鼠李糖苷酶酶粉末(1.4g)，并搅拌30分钟，直到所有的酶粉末悬浮。将得到的酶溶液(700mL)深度过滤(nom.3-9μm)然后无菌过滤(0.2μm)。
将含有4.1g/L QS-21的CBE(700mL)进行深度过滤，然后进行无菌过滤(0.2μm)，其中在先峰的比率为0.25，2018/QS-21的比率为0.054至0.057。
将过滤的CBE(500mL)装入搅拌的反应器中，加热至37℃，用2M氢氧化钠将pH调节至6.0至6.2。然后将酶溶液(500mL)加入反应器，溶液在37℃搅拌5小时。
5小时后，在适度搅拌下向反应混合物中逐渐加入冰醋酸，以调节pH至约pH 3.8(目标范围pH 3.5至4.0)。
然后类似于实施例3中提供的方法纯化酶处理的CBE。
结果
通过在214nm的UV吸收测定，纯化的皂苷提取物含有至少98％的QS-21组、至少93％的QS-21主峰、0.2％的2018组分、1％或更少的QS-21组以外的最大峰，其中最丰富种类的单同位素为1987.9m/z。
基于QS-21浓度和样品体积，QS-21的质量增加表明经酶处理的CBE增加了2.6-3.0x。％QS-21(作为皂苷的％)的增加显示出3.0-3.1x的增加。
由于经酶处理的材料的皂苷分布得到改进，获得了更高的回收率，同时保持在所需的规格范围内(尤其是在聚苯乙烯和苯基树脂色谱中，其中可以回收更大比例的QS-21)。发现总的双酶处理与常规(非酶处理)方法相比，产量增加了约5.2-5.3倍。
图25提供了未经处理和经酶处理的CBE的示例性HPLC-UV色谱图。
图26(完全采集)和图27(放大)提供了从未经处理和经酶处理的CBE获得的纯化材料的示例性UPLC-UV色谱图。
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Claims (36)

1.一种制备产物皂苷的方法，所述方法包括将起始皂苷酶促转化为所述产物皂苷的步骤。
2.一种增加组合物中产物皂苷的量的方法，所述方法包括将起始皂苷酶促转化为所述产物皂苷的步骤。
3.一种降低组合物中起始皂苷的量的方法，所述方法包括将所述起始皂苷酶促转化为产物皂苷的步骤。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷是皂皮酸糖苷。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷可从皂树获得。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述起始皂苷从皂树获得的。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-18家族组分。
8.如权利要求5或6所述的方法，其中所述起始皂苷是去葡糖基-QS-17家族组分。
9.如权利要求5或6所述的方法，其中所述起始皂苷是QS-17家族组分。
10.如权利要求5或6所述的方法，其中所述起始皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-18家族组分。
11.如权利要求5或6所述的方法，其中所述起始皂苷是乙酰化的去葡糖基-QS-17家族组分。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷可从皂树获得。
13.如权利要求7、8或12中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-21家族组分。
14.如权利要求9或12所述的方法，其中所述产物皂苷是QS-18家族组分。
15.如权利要求9或12所述的方法，其中所述产物皂苷是去葡糖基QS-17家族组分。
16.如权利要求10或12所述的方法，其中所述产物皂苷是去阿拉伯呋喃糖基-QS-21家族组分。
17.如权利要求11或12所述的方法，其中所述产物皂苷是乙酰化的QS-21家族组分。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中单一起始皂苷被转化为单一产物皂苷。
19.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中多种起始皂苷被转化成多种产物皂苷。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中通过从植物材料中提取获得所述起始皂苷。
21.如权利要求20所述的方法，其中通过水提取获得所述起始皂苷。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述酶促转化包括通过葡萄糖苷酶去除β-葡萄糖残基。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述葡萄糖苷酶包含以下，例如由以下组成：根据SEQ IDNo.262、208、63、229、250、5、101、207、169、247、302、324、319、9、240、325、338、850、879、868、826、804、888、881、891、816、827、857、853、842、814、886、885、838、829、808、828、870、873、844、882、874、825、824、823、810、894、849、803、890、841、832、830、845、871、837、883或809的氨基酸序列，或其功能变体。
24.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述酶促转化包括通过鼠李糖苷酶去除α-鼠李糖残基。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述鼠李糖苷酶包含以下，例如由以下组成：根据SEQ IDNo.992、1003、1052、1073、1017、1055、1075、1001、1007、1061、1079、1027、1039、1041、989、1053、1018、1066、1082、1076、993、1077、1046、1015、1063、1054、1074、1067或1033的氨基酸序列，或其功能变体。
26.糖苷酶用于将起始皂苷酶促转化为产物皂苷的用途，例如在权利要求1至24中任一项所述的方法中。
27.一种通过如权利要求1至26中任一项所述的方法制备的皂苷。
28.通过如权利要求1至26中任一项所述的方法制备的皂苷在制备佐剂中的用途。
29.一种包含如权利要求27所述的皂苷的佐剂组合物。
30.一种免疫原性组合物，其包含如权利要求27所述的皂苷和抗原或编码抗原的多核苷酸。
31.一种试剂盒，其包括：
(i)如权利要求27所述的皂苷；和
(ii)抗原或编码抗原的多核苷酸。
32.一种工程化的葡萄糖苷酶多肽，所述工程化的葡萄糖苷酶多肽包含与SEQ IDNo.262的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或其功能片段，其中所述工程化的葡萄糖苷酶多肽包含至少一个来自以下的残基取代：
F44Y；
V60L；
G117A；
F170N；
V263G或V263L；
N351H或N351Q；
A355H、A355I、A355L、A355M、A355R、A355T或A355W；
A356P；
R357A、R357C、R357K、R357M或R357Q；
G362C；
T365A、T365N或T365S；
L367C；
V394R；
V395Y；
Q396E、Q396G、Q396N、Q396P、Q396R、Q396S或Q396Y；
F430W；
R435F；
V438T；
V440F；
F442M或F442Q；
G444T；
A473F或A473R；
L474C、L474I或L474V；
I475F；
L492C、L492G、L492H、L492I、L492N、L492Q、L492V、L492W或L492Y；
Q493F或Q493H；
P494H或P494I；
S495I、S495K或S495Q；
G496P或G496W；
D498A、D498E、D498F、D498I、D498K、D498L、D498N、D498P、D498R、D498S、D498T或D498V；
A502R；
M504G或M504R；
L507A或L507R；
T508M；
L529M；
F535P；
A536D或A536E；
A537R；
F541A、F541I、F541L、F541M或F541V；
L542I；
Q543G或Q543L；
E547L；和
Y585W。
33.如权利要求32所述的多肽，其包含SEQ ID No.1183的氨基酸序列。
34.一种工程化的鼠李糖苷酶多肽，所述工程化的鼠李糖苷酶多肽包含与SEQ IDNo.1017的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或其功能片段，其中所述工程化的鼠李糖苷酶多肽包含至少一个来自以下的残基取代：
(i)A56C
(ii)A143P
(iii)Q181H、Q181R或Q181S
(iv)L214M
(v)G215S
(vi) F216M
(vii)G218D或G218N
(viii)K219G
(ix) A238M
(x)T252Y
(xi)T311W
(xii)V326C
(xiii)G357C
(xiv)S369C、S369I、S369K或S369M
(xv)I487M、I487Q或I487V
(xvi)K492N
(xvii)V499T
(xviii)G508S
(xix)R543C
(xx)L557Y
(xxi)G634A
(xxii)S635N
(xxiii)A690C和
(xxiv)Q921H。
35.如权利要求34所述的多肽，其包含SEQ ID No.1193的氨基酸序列。
36.一种多核苷酸，其包含编码如权利要求32至35中任一项所述的工程化的葡萄糖苷酶或工程化的鼠李糖苷酶多肽的序列。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN116694536A (zh) * 2023-07-28 2023-09-05 内蒙古昆明卷烟有限责任公司 一种氯酚假节杆菌bjy-3及其在降解尼古丁中的应用

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