CN116568334A - 用于将大分子递送至细胞中的内体逃逸结构域 - Google Patents

Abstract

本公开提供了包含通用内体逃逸结构域的化合物和组合物以及它们的应用，该应用包括用于将大分子递送至细胞中。

Description

用于将大分子递送至细胞中的内体逃逸结构域

相关申请的交叉引用

本申请根据《美国法典》第35卷第119条要求于2020年10月12日提交的美国临时申请序列号63/090,551以及于2021年6月8日提交的美国临时申请序列号63/208,416的优先权，这些申请的公开内容以引用方式并入本文。

关于联邦资助研究的声明

本发明是在政府支持下以美国国立卫生研究院(NIH)授予的授权号R21-CA25251、CA234740和NS11663完成的。政府对该发明享有一定权利。

技术领域

本公开提供了包含通用内体逃逸结构域的化合物和组合物以及它们的应用，该应用包括用于将大分子(siRNA、ASO、寡核苷酸、CRISPR DNA/RNA编辑酶、mRNA、DNA载体、蛋白质、肽、抗体、脂质纳米颗粒等)递送至细胞中。

背景技术

真核细胞包含几千种蛋白质，在进化过程中，选择这些蛋白质以在维持几乎所有细胞功能中起特定作用。并不令人惊讶的是，每个细胞以及整个生物体的生存力密切依赖于这些蛋白质的正确表达。通过氨基酸序列中的突变或缺失，或通过表达的变化引起蛋白水平的过表达或抑制，影响特定蛋白质功能的因素总是导致正常细胞功能的改变。此类改变通常直接导致多种遗传性和获得性病症。因此，靶向和选择性抑制、改变或增加基因表达或杀死包含导致细胞增殖性病症的突变的细胞的能力将有助于控制此类疾病和病症。

然而，实际上，这些试剂的直接细胞内递送是困难的。这主要是由于细胞的脂质双层质膜的生物利用度屏障，其通过限制肽、蛋白质、RNA、DNA、CRISPR和其他试剂的被动进入而有效地防止它们中大多数的摄取。即使试剂能够通过内体摄取机制被细胞摄取，由于内体脂质双层膜，试剂在细胞内的释放仍然是限速步骤(例如，参见图1)。

发明内容

本公开提供了用于将分子递送至细胞中的方法和组合物。本公开提供了包括内体逃逸结构域的组合物，该组合物表现出改善的从转运货物的内体的逃逸。特别地，本公开提供了通用内体逃逸结构域(uEED)组合物，该组合物包括连接至亲水性掩蔽物结构域，该亲水性掩蔽物结构域连接至货物分子并且进一步连接至将该亲水性掩蔽物结构域与疏水性结构域或阳离子结构域分开的生物可降解接头。本文描述了多种类型的uEED亚磷酰胺结构单元单体的合成、多种uEED多聚体的合成以及uEED多聚体到寡核苷酸的缀合。本公开还表征了uEED对血清酶的代谢稳定性，更重要的是，内体/溶酶体限制酶(例如，β-葡糖醛酸糖苷酶和其他葡糖苷酶)对uEED的选择性切割，该内体/溶酶体限制酶选择性地将亲水性掩蔽物结构域从疏水性结构域和/或阳离子结构域切割掉，从而选择性地激活内体内部的uEED。

在一个具体的实施方案中，本公开提供了一种单体化合物，该单体化合物包含：偶联剂结构域；疏水性结构域或阳离子电荷结构域；亲水性掩蔽物结构域；具有第一末端和第二末端的生物可降解接头，其中该内体可切割接头在该第一末端连接至该亲水性掩蔽物结构域，并且在该第二末端连接至该疏水性结构域或阳离子电荷结构域，或在该第二末端连接至第一接头；具有第一末端和第二末端的第一接头，其中该第一接头在该第一末端连接至该偶联剂结构域，并且在该第二末端连接至该疏水性结构域或阳离子电荷结构域，或连接至第二接头；任选地，具有第一末端和第二末端的第二接头，其中该第二接头在该第一末端连接至该疏水性结构域或阳离子电荷结构域，并且在该第二末端连接至该第一接头；任选地，具有第一末端和第二末端的第三和/或第四接头，其中该第一末端连接至该偶联剂结构域，其中该第二末端连接至用于固态合成的官能团。在另一个实施方案中，单体化合物具有式I、II、III或IV的结构：

或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中C¹是偶联剂结构域；HD¹是亲水性掩蔽物结构域；HD²是疏水性结构域或阳离子电荷结构域；L¹是生物可降解接头；L²是第二接头；L³是第一接头；L⁴是第三接头；L⁵是第四接头(其中L⁴和L⁵接头可具有不同数目的碳或其他原子)；R¹和R²为用于固态合成的官能团的保护；并且n¹是选自0或1的整数；n²是选自0至10或更大的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11等)。在另一个实施方案中，偶联剂结构域包括磷酸三酯基团或亚磷酰胺基团。在又一个实施方案中，亲水性掩蔽物结构域包括糖苷部分或蛋白质转导/细胞穿透肽。在另一个实施方案中，疏水性结构域或阳离子电荷结构域是包含伯、仲或叔氨基基团的任何官能团(或多个此类官能团)；脂质或源自其的单体单元；生育酚；疏水性低聚物或源自其的单体单元；疏水性聚合物或源自其的单体单元。在又一个实施方案中，疏水性结构域包括选自C8、C10、C12、C14、C16或C18脂质或它们的衍生物的脂质。在另一个实施方案中，疏水性结构域包括源自脂质的单体单元，该脂质选自脂肪酸、脂肪醇和任何其他具有至少两个碳单元的脂质分子。在又一个实施方案中，疏水性结构域包括选自聚甲基丙烯酰基、聚乙烯、聚苯乙烯、聚异丁烷、聚酯、多肽或它们的衍生物的疏水性聚合物。在另一个实施方案中，疏水性结构域包括一个或多个源自疏水性聚合物的单体单元，该疏水性聚合物选自：聚酯、聚醚、聚碳酸酯、聚酐、聚酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚砜、聚链烷、聚烯烃、聚炔烃、聚酐、聚原酸酯、N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、季铵改性的丙烯酸酯、季铵改性的甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、己内酯、丙交酯和戊内酯。在又一个实施方案中，疏水性结构域或阳离子电荷结构域包括1H-吲哚基团。在另一个实施方案中，生物可降解接头包括硫醚基团、氨基甲酸酯基团、酯基团、碳酸酯基团、脲基团或酶可切割肽键。在又一个实施方案中，生物可降解接头是内体可切割接头。在某个实施方案中，内体可切割接头包括氨基甲酸酯基团或腙基团。在另一个实施方案中，第一接头包括选自任选取代的(C₁-C₆)烷基、任选取代的(C₂-C₆)烯基、任选取代的(C₂-C₆)炔基或任选取代的(C₁-C₆)烷氧基。在另一个实施方案中，第一接头包括选自乙基、丙基、PEG₂、PEG₃和PEG₄的基团。在另一个实施方案中，第二接头选自任选取代的(C₁-C₆)烷基、任选取代的(C₂-C₆)烯基、任选取代的(C₂-C₆)炔基或任选取代的(C₁-C₆)烷氧基。在又一个实施方案中，第二接头包括选自乙基、丙基、PEG₂、PEG₃和PEG₄的基团。在另一个实施方案中，第三和第四接头选自任选取代的(C₁-C₆)烷基、任选取代的(C₂-C₆)烯基、任选取代的(C₂-C₆)炔基、任选取代的(C₁-C₆)烷氧基、尿苷基团和嘧啶基团。在某个实施方案中，第三和第四接头是(C₁-C₆)烷基或尿苷基团。在另一个实施方案中，用于固态合成的官能团或保护基团是酰胺和4,4'-二甲氧基三苯甲基基团。在又一个实施方案中，化合物具有选自以下的结构：

在某个实施方案中，本公开还提供了包含多个本文公开的单体化合物的多聚体化合物，其中多个单体化合物已经使用固态合成连接在一起以形成多聚体化合物。在另一个实施方案中，多聚体化合物连接至货物分子。在又一个实施方案中，货物分子选自小分子治疗剂、肽、蛋白质、单链寡核苷酸、双链寡核苷酸和蛋白质-寡核苷酸复合物，例如CRISPRDNA/RNA编辑、mRNA、DNA载体和脂质纳米颗粒。在另一个实施方案中，货物分子通过共价键、氢键或通过静电吸引连接至多聚体化合物。

在一个具体的实施方案中，本公开还提供了具有式VII的结构的多聚体化合物：

或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中C¹是偶联剂结构域；

HD¹、HD^1’、HD^1”和HD^1”’各自独立地为所选的亲水性结构域或阳离子掩蔽物结构域；HD²、HD^2’、HD^2”和HD^2”’各自独立地为所选的疏水性结构域或阳离子电荷结构域；L^1’是生物可降解接头；L²是第二接头；L³是第一接头；L⁴是第三接头；R³是H或用于货物分子的缀合柄；R⁴是H或用于货物分子的缀合柄；n²是选自0至10的整数；n³是选自0至10的整数；n⁴是选自0至10的整数；并且n⁵是选自0至10的整数；其中为n¹至n⁵指定的整数的总和为4至30，并且其中R³和R⁴中的至少一者是用于货物分子的缀合柄。在另一个实施方案中，偶联剂结构域包括磷酸三酯基团。在又一个实施方案中，亲水性掩蔽物结构域包括糖苷部分或蛋白质转导/细胞穿透肽。在另一个实施方案中，疏水性结构域或阳离子电荷结构域选自包含伯、仲或叔氨基基团的任何官能团；脂质或源自其的单体单元；生育酚；疏水性低聚物或源自其的单体单元；疏水性聚合物或源自其的单体单元。在又一个实施方案中，疏水性结构域中的一个或多个疏水性结构域包含选自C8、C10、C12、C14、C16或C18脂质或它们的衍生物的脂质，或包含单环、双环、三环或延长环结构的芳族化合物。在某个实施方案中，疏水性结构域中的一个或多个疏水性结构域包括源自脂质的单体单元，该脂质选自脂肪酸、脂肪醇和任何其他具有至少两个碳单元的脂质分子。在另一个实施方案中，疏水性结构域中的一个或多个疏水性结构域包括选自聚甲基丙烯酰基、聚乙烯、聚苯乙烯、聚异丁烷、聚酯、多肽或它们的衍生物的疏水性聚合物。在又一个实施方案中，疏水性结构域中的一个或多个疏水性结构域包括一个或多个源自疏水性聚合物的单体单元，该疏水性聚合物选自：聚酯、聚醚、聚碳酸酯、聚酐、聚酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚砜、聚链烷、聚烯烃、聚炔烃、聚酐、聚原酸酯、N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、季铵改性的丙烯酸酯、季铵改性的甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、己内酯、丙交酯和戊内酯。在某个实施方案中，疏水性结构域或阳离子电荷结构域中的一者或多者包括1H-吲哚基团。在另一个实施方案中，生物可降解接头包括硫醚基团、氨基甲酸酯基团、酯基团、碳酸酯基团、脲基团或酶可切割肽键。在又一个实施方案中，生物可降解接头是内体可切割接头。在另一个实施方案中，内体可切割接头包括氨基甲酸酯基团或腙基团。在又一个实施方案中，第一接头包括选自任选取代的(C₁-C₆)烷基、任选取代的(C₂-C₆)烯基、任选取代的(C₂-C₆)炔基或任选取代的(C₁-C₆)烷氧基。在另一个实施方案中，第一接头包括选自乙基、丙基、PEG₂、PEG₃和PEG₄的基团。在又一个实施方案中，第二接头选自任选取代的(C₁-C₆)烷基、任选取代的(C₂-C₆)烯基、任选取代的(C₂-C₆)炔基或任选取代的(C₁-C₆)烷氧基。在另一个实施方案中，第二接头包括选自乙基、丙基、PEG₂、PEG₃和PEG₄的基团。在又一个实施方案中，第三接头选自任选取代的(C₁-C₆)烷基、任选取代的(C₂-C₆)烯基、任选取代的(C₂-C₆)炔基、任选取代的(C₁-C₆)烷氧基、尿苷基团和嘧啶基团。在另一个实施方案中，第三接头是(C₁-C₆)烷基或尿苷基团。在又一个实施方案中，用于货物分子的缀合柄包括叠氮基团。在一个具体的实施方案中，用于货物分子的缀合柄包括以下结构：

其中x是选自1至15的整数；R为-OH或-CN。在另一个实施方案中，缀合柄包括末端叠氮化物。在另一个实施方案中，多聚体化合物连接至货物分子。在又一个实施方案中，货物分子选自小分子治疗剂、肽、蛋白质、单链寡核苷酸、双链寡核苷酸和蛋白质-寡核苷酸复合物。在另一个实施方案中，货物分子连接至多聚体化合物的缀合柄。

在附图和下面的描述中阐述了一个或多个实施方案的细节。从说明书和附图以及从权利要求书中，其他特征、目的和优点将是显而易见的。

附图说明

图1示出了试剂摄取的一般过程以及内体逃逸的困难和限速步骤。

图2示出了本公开的组合物通常如何工作的示意性示例。

图3A至图3E描绘了本公开的通用内体逃逸结构域(uEED)的激活。(A)描绘了通过酶(例如β-葡糖醛酸糖苷酶)在亲水性掩蔽物与疏水性核心之间的接头处切割亲水性掩蔽物。(B)描绘了CO₂残留在疏水性核心上的(A)的所得产物。(C)示出了CO₂从疏水性核心的自我牺牲。(D)描绘了激活的uEED。(E)描绘了疏水性核心插入内体膜，这导致货物不稳定并释放到细胞质中。

图4提供了亚磷酰胺uEED前体的实施方案，该前体使用固态合成制备，可用于产生本公开的uEED。如图所示，亚磷酰胺经由接头连接至疏水性核心，该接头经由生物可降解接头连接至亲水性掩蔽物。

图5提供了通过使用固态合成技术将亚磷酰胺uEED前体连接在一起而制备的uEED多聚体的实施方案。

图6示出了本公开的一个实施方案的示意图。该图提供了uEED以及连接至货物结构域的uEED多聚体(例如ASO、siRNA、LNP等)的单体结构。该图还描绘了切割接头以从疏水性核心释放亲水性掩蔽物。

图7示出了本公开的uEED单体的各种示例性构型和排列。

图8图解了如何将uEED单体(例如Qa、Qb、Qc和J)连接在一起以形成uEED多聚体，包括具有不同疏水性核心的uEED单体的各种组合。

图9提供了可用于制备本公开的uEED多聚体的亚磷酰胺uEED前体的结构的实施方案。

图10提供了已连接在一起以制备示例性uEED多聚体的uEED单体的结构的实施方案。

图11提供了包含已连接在一起以制备示例性uEED多聚体的不同疏水性核心的uEED单体的结构的实施方案。

图12提供了制备B-gluc-P-Qa亚磷酰胺uEED前体的合成路线。

图13提供了制备B-Gluc-U-Qa亚磷酰胺uEED前体的合成路线。

图14提供了制备半乳糖-P/U-Qa亚磷酰胺uEED前体的合成路线。

图15提供了B-Gluc-U-Qa uEED多聚体的合成。

图16提供了制备B-Gluc-P-Qb亚磷酰胺uEED前体的合成路线。

图17提供了制备B-Gluc-U-Qb亚磷酰胺uEED前体的合成路线。

图18提供了制备半乳糖-P/U-Qb亚磷酰胺uEED前体的合成路线。

图19提供了制备B-Gluc-P-Qc uEED亚磷酰胺前体的合成路线。

图20提供了制备B-Gluc-U-Qc uEED亚磷酰胺前体的合成路线。

图21提供了制备B-Gluc-P-J uEED亚磷酰胺前体的合成路线。

图22提供了制备B-Gluc-U-J uEED亚磷酰胺前体的合成路线。

图23提供了制备B-Gluc-P/U-J uEED亚磷酰胺前体的合成路线。

图24提供了说明本公开的uEED如何可用于促进所有类型的大分子(例如单链寡核苷酸、双链RNAi引发剂、蛋白质、肽和基因编辑组分、mRNA、DNA载体、脂质纳米颗粒等)的细胞内递送的图。所有细胞内大分子治疗剂(包括：siRNA、ASO、RNP、肽、蛋白质、mRNA、CRISPR、DNA载体、大合成分子等)都通过内吞作用被摄入细胞内。然而，＞99％仍被捕获在内体内。uEED直接解决了驱使大分子货物的内体逃逸到细胞的细胞质和细胞核中的这一问题。uEED可以与所有大分子治疗类别缀合。

图25提供了示出测试本公开的uEED如何递送测试分子(例如，GalNAc-siRNA-uEED、抗体siRNA-uEED缀合物(ARC)、脂质纳米颗粒-uEED(LNP))的图。

图26提供了示出预期本公开的uEED如何通过递送测试分子(例如，GalNAc-siRNA-uEED、抗体siRNA-uEED缀合物(ARC)、脂质纳米颗粒-uEED(LNP))在体内敲低或增加萤光素酶表达的图。

图27示出了包含本公开的uEED的组合结构，该uEED具有与货物结构域缀合的靶向结构域，该货物结构域与uEED结构域缀合。

图28示出了描绘Qd-uEED单体、多聚体和作用机制的示意图。Qd-uEED包括促进内体逃逸的阳离子结构域。

图29示出了包括Qd-uEED和Qa,b,c-uEED单体单元的uEED多聚体的示意图。

图30示出了Qd-s-uEED单体和示例性结构域的示意图。每个单体单元可包括多个阳离子电荷。

图31示出了Qd-s和Qd-p uEED单体亚磷酰胺的示例。

图32示出了示例性Qd-s uEED单体合成。

图33示出了Qa、Qb、Qc、Qj、Qd-s和Qd-p uEED单体亚磷酰胺的示例性结构。

图34示出了导致多个阳离子电荷暴露的葡糖醛酸糖苷酶激活Qd-p uEED的示例。

图35示出了导致多个阳离子电荷暴露的葡糖醛酸糖苷酶激活Qd-s uEED的示例。

图36提供了本公开的Qf uEED构建体的描绘。在该实施方案中，包含例如酯、氧实体的氨基的接头连接至脂质尾部，用于插入或组装到脂质纳米颗粒(LNP)中。

图37示出了经由去除亲水性结构域和暴露阳离子带电结构域来激活图36的QfuEED。

图38示出了本公开的Qf uEED的合成方案。

图39示出了本公开的Qf uEED的合成方案。

图40示出了本公开的Qf uEED的合成方案。

图41示出了在血清条件下连接至Qb uEED的siLuc的各个温育时间段的SDS PAGE凝胶。

图42示出了在具有β-葡糖醛酸糖苷酶的溶酶体条件下连接至Qb uEED的siLuc的各个时间段的SDS PAGE凝胶。

图43示出了在具有β-葡糖醛酸糖苷酶的溶酶体条件下连接至Qb uEED的siLuc的各个时间段的SDS PAGE凝胶。

图44A至图44C示出了本公开的Qe uEED实施方案。(A)示出了单体单元。(B)示出了多聚体和内体激活的示意图。(C)更详细地示出了单体Qe uEED。

图45示出了Qe uEED的合成方案。

图46示出了连接至Qd uEED构建体并用葡糖醛酸糖苷酶处理的寡聚物的结果。

图47提供了使用本公开的uEED的小鼠研究的图。

图48示出了来自小鼠研究的预测结果。

图49A至图49F提供了(A)合成中使用的Qa uEED构建体和偶联剂主链的描绘；(B)合成中使用的Qb uEED构建体和偶联剂主链的描绘；(C)合成中使用的Qc uEED构建体和偶联剂主链的描绘；(D)合成中使用的Qd uEED构建体和偶联剂主链的描绘；(E)合成中使用的Qe uEED构建体和偶联剂主链的描绘；和(F)J uEED构建体的描绘。

具体实施方式

如本文和所附权利要求书中所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。因此，例如，提及“货物”包括多个此类货物，并且提及“接头”包括提及一个或多个接头，等等。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的方法和材料可用于所公开的方法和组合物的实践中，但本文描述了示例性方法、装置和材料。

此外，除非另有说明，否则“或”的使用意味着“和/或”。类似地，“包含”和“包含”是可互换的，并且不旨在限制。

还应理解，在各种实施方案的描述使用术语“包含”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，实施方案可以替代地使用语言“基本上由……组成”或“由……组成”来描述。

提供上述和全文中讨论的出版物仅仅是因为它们的公开在本申请的提交日期之前。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明人无权凭借先前的公开而提前进行此类公开。此外，对于在一个或多个出版物中出现的与在本公开中明确定义的术语相似或相同的任何术语，在所有方面将以在本公开中明确提供的术语的定义为准。

术语“烯基”是指由碳原子和氢原子组成的有机基团，该有机基团在两个碳之间包含至少一个双共价键。通常，如本公开中所用的“烯基”是指包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或30个碳原子，或在前述值中的任何两个值之间或包括前述值中的任何两个值的任何范围的碳原子的有机基团。虽然C_2-烯基可与母链的碳形成双键，但三个或更多个碳的烯基基团可包含多于一个双键。在某些情况下，烯基基团将是共轭的，在其他情况下，烯基基团将不是共轭的，并且在又其他情况下，烯基基团可具有共轭的链段和非共轭的链段。另外，如果存在多于2个碳，则碳可以以线性方式连接，或者另选地如果存在多于3个碳，则碳也可以以支化方式连接，使得母链包含一个或多个仲、叔或季碳。除非另有说明，否则烯基可以是取代的或未取代的。

术语“烷基”是指由碳原子和氢原子组成的有机基团，该有机基团在碳之间包含单共价键。通常，如本公开中所用的“烷基”是指包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或30个碳原子，或在前述值中的任何两个值之间或包含前述值中的任何两个值的任何范围的碳原子的有机基团。其中如果存在多于1个碳，则碳可以以线性方式连接，或者另选地如果存在多于2个碳，则碳也可以以支化方式连接，使得母链包含一个或多个仲、叔或季碳。除非另有说明，否则烷基可以是取代的或未取代的。

术语“炔基”是指由碳原子和氢原子组成的有机基团，该有机基团在两个碳之间包含三共价键。通常，如本公开中所用的“炔基”是指包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或30个碳原子，或在前述值中的任何两个值之间或包含前述值中的任何两个值的任何范围的碳原子的有机基团。虽然C_2-炔基可与母链的碳形成三键，但三个或更多个碳的炔基基团可包含多于一个三键。其中如果存在多于3个碳，则碳可以以线性方式连接，或者另选地如果存在多于4个碳，则碳也可以以支化方式连接，使得母链包含一个或多个仲、叔或季碳。除非另有说明，否则炔基可以是取代的或未取代的。

如本文所用，术语“氨基”表示-N(R^N1)₂或N(＝NR^N1)(NR^N1)₂，其中每个R^N1独立地为H、OH、NO₂、N(R^N2)₂、SO₂OR^N2、SO₂R^N2、SOR^N2、N-保护基团、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、烷芳基、环烷基、烷基环烷基、杂环基(例如杂芳基)、烷基杂环基(例如烷基杂芳基)，或者两个R^N1组合形成杂环基，并且其中每个R^N2独立地为H、烷基或芳基。在一个实施方案中，氨基为-NH₂或-NHR^N1，其中R^N1独立地为OH、NO₂、NH₂、NR^N2 ₂、SO₂OR^N2、SO₂R^N2、SOR^N2、烷基或芳基，并且每个R^N2可为H、烷基或芳基。R^N1基团本身可以是未取代的或如本文所述取代的。

如本公开中所用，术语“芳基”是指具有仅包含碳作为环原子的离域π电子云的共轭平面环系统。出于本公开的目的，“芳基”包括1个至4个芳基环，其中当芳基大于1个环时，芳基环连接使得它们连接、稠合或它们的组合。芳基可以是取代的或未取代的，或者在多于一个芳基环的情况下，一个或多个环可以是未取代的，一个或多个环可以是取代的，或它们的组合。

该术语通常在官能团之前用符号“C_x-C_y”(其中x和y是整数，y＞x)表示，例如“C₁-C₁₂烷基”是指碳原子的数目范围。出于本公开的目的，由“C_x-C_y”指定的任何范围(其中x和y是整数，y＞x)不排除所表达的范围，而是包括所有可能的范围，其包括并落入由“C_x-C_y”指定的范围(其中x和y是整数，y＞x)内。例如，术语“C₁-C₄”提供了对1个至4个碳原子范围的明确支持，但还提供了对1个至4个碳原子所包括的范围的隐含支持，诸如1个至2个碳原子、1个至3个碳原子、2个至3个碳原子、2个至4个碳原子和3个至4个碳原子。

阳离子结构域包括蛋白质转导结构域(PTD；有时称为细胞穿透肽(CPP))、胍基团、伯胺、仲胺、叔胺、复合氨基基团和可电离的胺。在一个实施方案中，阳离子结构域(阳离子电荷结构域)可以在单个单元结构上包括多个阳离子电荷(例如，1个至10个、11个至20个、21个至50个或更多)(参见，例如，图34)。带正电荷的聚合物的示例包括聚(乙烯亚胺)(PEI)、精胺、亚精胺和聚(酰胺基胺)(PAMAM)。

文献中已经描述了几种阳离子脂质，其中许多是可商购的。在一些实施方案中，使用阳离子脂质N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵或“DOTMA”。(Felgner等人(Proc.Nat'l Acad.Sci.84,7413(1987)；美国专利号4,897,355)。其他合适的阳离子脂质包括，例如，可电离的阳离子脂质，诸如(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-15,18-二烯-1-胺(HGT5000)、(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-4,15-,18-三烯-1-胺(HGT5001)和(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-5,15-,18-三烯-1-胺(HGT5002)；C12-200(WO 2010/053572)、2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧戊环-4-基)-N,N-二甲基乙胺(DLinKC2-DMA)、2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧戊环-4-基)-N,N-二甲基乙胺“DLin-KC2-DMA”、(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,-10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基3-(1H-咪唑-4-基)丙酸酯“ICE”、(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-15,18-二烯-1-胺“HGT5000”、(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-4,15-,18-三烯-1-胺“HGT5001”和(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-5,15-,18-三烯-1-胺“HGT5002”、5-羧基精氨酰基-双十八烷基酰胺或“DOGS”、2,3-二油烯基氧基-N-[2(亚精酰氨基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵或“DOSPA”、1,2-二油酰-3-二甲基铵-丙烷或“DODAP”、1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷或“DOTAP”。设想的阳离子脂质还包括1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DSDMA”、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DODMA”、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLinDMA”、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLenDMA”、N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵或“DODAC”、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵或“DDAB”、N-(1,2-二肉豆蔻氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵或“DMRIE”、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧丁烷-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷或“CLinDMA”、2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3-氧杂戊基)-3-二甲基-1-(顺式,顺式-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷或“CpLinDMA”、N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄胺或“DMOBA”、1,2-N,N'-二油烯基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DOcarbDAP”、2,3-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷或“DLinDAP”、1,2-N,N'-二亚油烯基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLincarbDAP”、1,2-二亚油烯基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLinCDAP”、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环或“DLin-K-DMA”、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环或“DLin-K-XTC2-DMA”、或它们的混合物。合适的基于胆固醇的阳离子脂质包括，例如，DC-Chol(N,N-二甲基-N-乙基甲酰胺基胆固醇)、1,4-双(3-N-油烯基氨基-丙基)哌嗪。

还设想了阳离子脂质，诸如基于二烷基氨基的脂质、基于咪唑的脂质和基于胍的脂质。例如，还设想了使用阳离子脂质(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,-10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基3-(1H-咪唑-4-基)丙酸酯或“ICE”。

如本公开中所用，术语“环烯基”是指包含至少4个碳原子但不超过12个碳原子连接以使其形成环的烯烃。出于本公开的目的，“环烯基”包括1个至4个环烯基环，其中当环烯基大于1个环时，环烯基环连接使得它们连接、稠合或它们的组合。环烯基可以是取代的或未取代的，或者在多于一个环烯基环的情况下，一个或多个环可以是未取代的，一个或多个环可以是取代的，或它们的组合。

如本公开中所用，术语“环烷基”是指包含至少3个碳原子但不超过12个碳原子连接以使其形成环的烷基。出于本公开的目的，“环烷基”包括1个至4个环烷基环，其中当环烷基大于1个环时，环烷基环连接使得它们连接、稠合或它们的组合。环烷基可以是取代的或未取代的，或者在多于一个环烷基环的情况下，一个或多个环可以是未取代的，一个或多个环可以是取代的，或它们的组合。

如本文所用，术语“病症”通常旨在与术语“疾病”、“综合征”和“病况”(如在医学病况中)同义并与之可互换地使用，因为所有这些都反映了人体或动物体或其身体部位中的一个身体部位损害正常功能的异常状况通常通过区别体征和症状来表现。

如本文所用，术语“内体逃逸部分”表示增强内体内容物的释放或允许分子从内部细胞区室诸如内体逃逸的部分。内体逃逸部分通常使内体膜或溶酶体膜不稳定。在某些实施方案中，内体逃逸部分是疏水性结构域或阳离子结构域。

术语“糖苷”是指其中糖基通过其异头碳经由糖苷键与另一基团键合的分子。糖苷可以通过O-(O-糖苷)、N-(葡基胺)、S-(硫代糖苷)或C-(C-糖苷)糖苷键连接。经验式为C_m(H₂O)_n(其中m可不同于N，m和n＜36)。本文中的糖苷包括葡萄糖(右旋糖)、果糖(左旋糖)阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、碘糖、半乳糖、塔罗糖、半乳糖胺、葡糖胺、唾液酸、N-乙酰葡糖胺、磺基奎诺糖(6-脱氧-6-磺基-D-吡喃葡萄糖)、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、山梨糖醇、甘露糖醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、麦芽糊精、棉子糖、葡糖醛酸(葡糖苷酸)和水苏糖。糖苷可以为D型或L型、5个原子的环状呋喃糖形式、6个原子的环状吡喃糖形式、或无环形式、α-异构体(位于Haworth投影的碳原子平面下方的异头碳的-OH)、或β-异构体(位于Haworth投影的平面上方的异头碳的-OH)。糖苷在本文中用作包含3个至6个糖单元的单糖、二糖、多元醇或寡糖。在本公开的组合物和方法中特别使用的是可以被内体糖苷酶切割的糖苷。糖苷酶(有时称为糖苷水解酶)是水解糖苷键的已知酶。糖苷酶在EC 3.2.1中被分类为催化O-糖苷水解或S-糖苷水解的酶。

出于本公开的目的，当用作前缀诸如杂烷基、杂烯基、杂炔基或杂烃时，术语“杂-”是指一个或多个碳原子被非碳原子取代的作为母链的一部分的指定烃。此类非碳原子的示例包括但不限于N、O、S、Si、Al、B和P。如果杂基母链中存在多于一个非碳原子，则该原子可以是相同的元素，也可以是不同元素的组合，诸如N和O。在一个具体的实施方案中，“杂”-烃(例如，烷基、烯基、炔基)是指具有1个至3个C原子、N原子和/或S原子作为母链的一部分的烃。

如本文所用，术语“杂环”是指包含至少1个非碳环原子的环结构。出于本公开的目的，“杂环”包括1个至4个杂环环，其中当杂环大于1个环时，杂环环连接使得它们连接、稠合或它们的组合。杂环可以是芳族的或非芳族的，或者在多于一个杂环环的情况下，一个或多个环可以是非芳族的，一个或多个环可以是芳族的，或它们的组合。杂环可以是取代的或未取代的，或者在多于一个杂环环的情况下，一个或多个环可以是未取代的，一个或多个环可以是取代的，或它们的组合。通常，非碳环原子是N、O、S、Si、Al、B或P。在有一个以上非碳环原子的情况下，这些非碳环原子可以是相同的元素，或者是不同元素的组合，诸如N和O。杂环的示例包括但不限于：单环杂环，诸如氮丙啶、环氧乙烷、环硫乙烷、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、吡咯烷、吡咯啉、咪唑烷、吡唑烷、吡唑啉、二氧戊环、环丁砜2,3-二氢呋喃、2,5-二氢呋喃四氢呋喃、噻吩烷、哌啶、1,2,3,6-四氢吡啶、哌嗪、吗啉、硫代吗啉、吡喃、噻喃、2,3-二氢吡喃、四氢吡喃、1,4-二氢吡啶、1,4-二恶烷、1,3-二恶烷、二恶烷、高哌啶、2,3,4,7-四氢-1H-氮杂高哌嗪、1,3-二氧杂环庚烷、4,7-二氢-1,3-二氧杂环庚烷和六亚甲基氧化物；和多环杂环，诸如吲哚、二氢吲哚、异二氢吲哚、喹啉、四氢喹啉、异喹啉、四氢异喹啉、1,4-苯并二恶烷、香豆素、二氢香豆素、苯并呋喃、2,3-二氢苯并呋喃、异苯并呋喃、色烯、色满、异色满、氧杂蒽、吩恶噻、噻蒽、中氮茚、异吲哚、吲唑、嘌呤、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、菲啶、萘嵌间二氮杂苯、菲咯啉、吩嗪、吩噻嗪、吩恶嗪、1,2-苯并异恶唑、苯并噻吩、苯并恶唑、苯并噻唑、苯并咪唑、苯并三唑、硫代黄嘌呤、咔唑、咔啉、吖啶、吡咯里西啶和喹嗪。除了上述多环杂环以外，杂环包括多环杂环，其中两个或多个环之间的环稠合包括多于一个两个环共有的键和多于两个两个环共有的原子。此类桥接杂环的示例包括奎宁环、二氮杂双环[2.2.1]庚烷和7-氧杂双环[2.2.1]庚烷。

单独使用或作为后缀或前缀使用的术语“杂环基团”、“杂环部分”、“杂环的”或“杂环”是指已经从其中去除一个或多个氢的杂环。

术语“烃”是指仅包含碳和氢的原子基团。可用于本公开的烃的示例包括但不限于烷烃、烯烃、炔烃、芳烃和苄基。

如本文所用，术语“亲水性基团”或“亲水性结构域”表示赋予水亲和力并增加构建体在水中的溶解度的部分或结构域。亲水性基团可以是离子的或非离子的，并且包括带正电荷的部分、带负电荷的部分和/或可以参与氢键合相互作用的部分。

如本文所用，术语“非控制释放的赋形剂”是指与常规立即释放剂型相比，其主要功能不包括改变活性物质从剂型中释放的持续时间或位置的赋形剂。

术语“任选取代的”是指其中一个或多个氢原子可以被取代基取代的官能团，通常为烃或杂环。因此，“任选取代的”是指其中一个或多个氢原子被取代基取代的取代的官能团，或其中氢原子未被取代基取代的未取代的官能团。例如，任选取代的烃基团是指未取代的烃基团或取代的烃基团。

如本文所用，术语“肽”表示通过肽键连接的两个至约50个氨基酸残基。如本文所用，术语“多肽”表示通过肽键连接的50个或更多个氨基酸的链。此外，出于本公开的目的，术语“多肽”和术语“蛋白质”在本文的所有上下文中可互换地使用，除非另外提供，例如天然存在的或工程化的蛋白质。在本文提供的方法和组合物的范围内可以使用多种多肽。在某个实施方案中，多肽包含抗体或包含抗原结合位点的抗体片段。在其他实施方案中，多肽可以包括酶活性实体(例如，Cas蛋白)等。合成产生的多肽可包括非DNA天然编码的氨基酸(例如非天然存在的或非天然的氨基酸)的取代。非天然存在的氨基酸的示例包括D-氨基酸、具有与半胱氨酸的硫原子连接的乙酰氨基甲基基团的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、式NH₂(CH₂)_nCOOH(其中n为2至6)的ω氨基酸、中性非极性氨基酸诸如肌氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸和正亮氨酸。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的赋形剂”、“生理学上可接受的载体”或“生理学上可接受的赋形剂”是指药学上可接受的材料、组合物或溶媒，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。每种组分必须是“药学上可接受的”，意思是与药物制剂的其他成分相容。它还必须适用于与人和动物的组织或器官接触使用而无过度的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症，与合理的受益/风险比相称。“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的赋形剂”的示例可以在以下文献中找到：Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版；Lippincott Williams和Wilkins：Philadelphia,Pa.,2005；Handbook of Pharmaceutical Excipients，第5版；Rowe等人编撰，The Pharmaceutical Press and the American PharmaceuticalAssociation：2005；和Handbook of Pharmaceutical Additives，第3版；Ash和Ash编撰，Gower Publishing Company：2007；Pharmaceutical Preformulation and Formulation，Gibson编撰，CRC Press LLC：Boca Raton,Fla.,2004。

如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”表示通过核苷酸间桥连基团共价结合在一起的两个或更多个核苷酸和/或核苷。多核苷酸可以是线性的或环状的。此外，出于本公开的目的，术语“多核苷酸”是指寡核苷酸和较长序列两者，以及核苷酸的混合物，例如DNA和RNA的混合物或RNA和2'修饰的RNA的混合物。除非另有说明，术语“多核苷酸”包括由一条或多条链构成的多核苷酸。术语多核苷酸包括DNA、RNA(包括其双链和单链形式)、DNA/RNA杂交体等。

如本文所用，术语“保护基团”表示旨在保护官能团(例如，羟基、氨基或羰基)免于参与化学合成(例如，多核苷酸合成)期间的一个或多个不期望的反应的基团。如本文所用，术语“O-保护基团”表示旨在保护含氧(例如苯酚、羟基或羰基)基团免于参与化学合成期间的一个或多个不期望的反应的基团。如本文所用，术语“N-保护基团”表示旨在保护含氮(例如氨基或肼基)基团免于参与化学合成期间的一个或多个不期望的反应的基团。常用的O-保护基团和N-保护基团公开于Greene，“Protective Groups in Organic Synthesis”，第3版(John Wiley&Sons,New York,1999)，该文献以引用方式并入本文。示例性O-保护基团和N-保护基团包括酰基基团、芳酰基基团或氨基甲酰基基团，诸如甲酰基、乙酰基、丙酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻苯二甲酰、邻硝基苯氧基乙酰基、α-氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷氧基甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基、异丁酰基、苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、二甲基甲酰氨基和4-硝基苯甲酰基。

用于保护含羰基基团的示例性O-保护基团包括但不限于：缩醛、缩醛醇、1,3-二噻烷、1,3-二恶烷、1,3-二氧戊环和1,3-二硫戊环。

其他O-保护基团包括但不限于：取代的烷基、芳基和烷芳基醚(例如三苯甲基；甲硫基甲基；甲氧基甲基；苄氧基甲基；甲硅烷氧基甲基；2,2,2,-三氯乙氧基甲基；四氢吡喃基；四氢呋喃基；乙氧基乙基；1-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]乙基；2-三甲基甲硅烷基乙基；叔丁基醚；对氯苯基、对甲氧基苯基、对硝基苯基、苄基、对甲氧基苄基和硝基苄基)；甲硅烷基醚(例如三甲基甲硅烷基；三乙基甲硅烷基；三异丙基甲硅烷基、二甲基异丙基甲硅烷基；叔丁基二甲基甲硅烷基；叔丁基二苯基甲硅烷基；三苄基甲硅烷基；三苯基甲硅烷基；和二苯基甲基甲硅烷基)；碳酸酯(例如，甲基、甲氧基甲基、9-芴基甲基；乙基；2,2,2-三氯乙基；2-(三甲基甲硅烷基)乙基；乙烯基、烯丙基、硝基苯基；苄基；甲氧基苄基；3,4-二甲氧基苄基；和硝基苄基)。

其他N-保护基团包括但不限于手性助剂，诸如保护的或未保护的D、L或D，L-氨基酸诸如丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等；含磺酰基基团，诸如苯磺酰基、对甲苯磺酰基等；氨基甲酸酯形成基团诸如苄氧基羰基、对氯苄氧基羰基、对甲氧基苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基、对溴苄氧基羰基、3,4-二甲氧基苄氧基羰基、3,5-二甲氧基苄氧基羰基、2,4-二甲氧基苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、2-硝基-4,5-二甲氧基苄氧基羰基、3,4,5-三甲氧基苄氧基羰基、1-(对联苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苄氧基羰基、二苯甲氧基羰基、叔丁氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、9-戊基甲氧基羰基、环戊氧基羰基、金刚烷基氧基羰基、环己氧基羰基、苯硫基羰基等；烷芳基基团，诸如苄基、三苯基甲基、苄氧基甲基等；和甲硅烷基基团，诸如三甲基甲硅烷基等。有用的N-保护基团是甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、丙氨酰基、苯磺酰基、苄基、叔丁氧羰基(Boc)和苄氧羰基(Cbz)。

如本文所用，术语“控制释放的赋形剂”是指与常规立即释放剂型相比，其主要功能是改变活性物质从剂型中释放的持续时间或位置的赋形剂。

如本文所用，术语“受试者”是指动物，包括但不限于灵长类动物(例如，人、猴、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿类动物(例如，大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂等)、兔类动物、猪(例如，猪、小型猪)、马、犬、猫等。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换地使用。例如，哺乳动物受试者可以指人类受试者或患者。

术语“取代基”是指取代氢原子的原子或原子团。出于本发明的目的，取代基将包括氘原子。

关于烃、杂环等的术语“取代的”是指其中母链包含一个或多个取代基的结构。

如本文所用，术语“靶向部分”表示任何与受体或与给定靶细胞群相关的其他接受部分特异性结合或反应性缔合或复合的部分，或当与细胞接触或被细胞内吞时诱导内吞作用的部分。

术语“治疗上可接受的”是指那些化合物(或盐、前药、互变异构体、两性离子形式等)，其适用于与患者组织接触而无过度的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性，与合理的受益/风险比相称，并且对于其预期用途有效。

如本文所用，术语“治疗”是指改善与疾病或病症(例如，多发性硬化)相关的症状，包括预防或延迟疾病或病症症状的发作，和/或减轻疾病或病症的症状的严重度或频率。

关于烃、杂环等的术语“未取代的”是指其中母链不含取代基的结构。

由于细胞膜所施加的生物利用度限制，将功能性试剂递送至细胞的能力是有问题的。即，细胞的血浆脂质双层膜形成有效的屏障，其将分子的细胞内摄取限制为足够非极性且尺寸小于约500道尔顿的那些分子。以前增强蛋白质内化的努力集中在将蛋白质与受体配体融合(Ng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:10706-11,2002)或通过将它们包装到笼罩脂质体载体中(Abu-Amer等人，J.Biol.Chem.276:30499-503,2001)。然而，这些技术经常导致较差的细胞摄取和到内吞途径中的细胞内结合。此外，脂质体制剂可以是细胞毒性的。

所有细胞内大分子治疗剂(包括：siRNA、ASO、肽、蛋白质、大的合成分子、CRISPR、RNP、mRNA、RNA、DNA载体、LNP、NP等)都通过各种形式的内吞作用被细胞摄取。内体包括脂质双层膜屏障，其防止＞99％的大分子治疗剂逃逸内体进入细胞质和细胞核。因此，内体逃逸仍然是一个重要的技术问题，需要解决该问题以使得能够递送所有大分子治疗剂。包膜病毒还必须解决内体逃逸问题，并使用包含覆盖内部疏水性内体逃逸结构域的外部亲水性掩蔽物的蛋白质机器。

PTD/CPP已经用于将治疗性货物递送至培养的细胞中，在疾病的临床前模型中进行了研究，并且目前正在临床试验中。有超过100个公开的PTD/CPP递送结构域序列；然而，大多数公开的PTD/CPP已经使用染料标记的分子进行了研究。因此，排除细胞死亡，缺乏依赖于强的和良好控制的细胞表型的定量转导测定，该细胞表型可容易地定量以确定哪些PTD/CPP是最有效的并且细胞毒性最小的递送结构域。简言之，PTD/CPP递送大分子进入细胞质需要：(1)细胞缔合和通过内吞作用摄取；以及(2)从内体逃逸到细胞质中，这是限速递送步骤。

如上所述，即使有效摄取，从内体中逃逸仍然是所有递送试剂(包括PTD/CPP和LNP)将大分子货物递送至细胞质中的限速步骤。据估计，只有一小部分内体结合(细胞缔合)的TAT-PTD/CPP从巨胞饮体逃逸到细胞质中，可能少至或甚至少于1％。本公开提供了具有组合物的内体逃逸结构域，该组合物改善了转运货物从内体穿过内体脂质双层膜进入细胞的细胞质和细胞核的逃逸。

本公开提供了解决模拟病毒逃逸机制的内体逃逸问题的化合物。本公开的合成构建体包括外部亲水性掩蔽物结构域，其通过内体特异性可切割接头连接至合成疏水性核心和/或阳离子内体逃逸结构域。本文所述的化合物有时被称为通用内体逃逸结构域(uEED)，其结构域和排列方式如本文所述存在变化。

本公开提供了一种通用内体逃逸结构域(uEED)组合物，该组合物包括连接至可切割接头的亲水性掩蔽物结构域和连接至货物分子的阳离子和/或疏水性核心，其中可切割接头将亲水性掩蔽物结构域与阳离子掩蔽物结构域或疏水性结构域分开。然后阳离子结构域或疏水性结构域可与内体膜相互作用，并使膜不稳定，以允许将货物释放到细胞质中。本公开的化合物促进大分子的摄取和释放。

在本公开的方法和组合物中，连接至本公开的uEED的大分子货物经由靶向结构域通过微胞饮作用/内吞作用摄取，该靶向结构域诱导内吞作用或连接至经历内吞作用的受体。一旦被摄取并存在于内体中，uEED的可切割接头就在内体/溶酶体中被切割，以从疏水性结构域或阳离子结构域中释放亲水性结构域。然后，疏水性结构域或阳离子结构域插入内体脂质双层膜中并使内体脂质双层膜不稳定，从而在细胞内释放货物。图27和图28提供了包含本公开的uEED的示例性结构。

本公开提供了可用于细胞转导和细胞调节的化合物。货物可以是任何数量的不同分子实体，包括用于治疗疾病或病症的诊断剂和治疗剂，包括用于疾病治疗的小分子和生物制剂。在一个实施方案中，多结构域方法可用于将抗癌剂递送至肿瘤细胞，从而杀死肿瘤细胞。抗癌剂可以是肽、多肽、蛋白质、小分子试剂或抑制性核酸(例如siRNA、ASO、寡核苷酸、核酶等)。在另一个实施方案中，大分子货物可被递送至细胞或组织。大分子货物的示例包括CRISPR/Cas系统、gRNA、作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)等。

本公开提供了包括模块化组分的化合物，该模块化组分可操作地连接，使得每个“组分”或“结构域”可提供所需的生物功能。例如，化合物包括连接至疏水性结构域和/或阳离子结构域的接头和/或偶联剂结构域，其中疏水性结构域和/或阳离子结构域经由可切割接头连接至亲水性结构域。每个模块，例如接头和/或偶联剂、亲水性结构域、可切割接头和疏水性结构域或阳离子结构域对于胞内释放货物分子的特定目的是功能性的。

图7和图49提供了本公开的示例性单体化合物。如将要指出的，单体化合物包括类似的模块结构域。然而，结构域以不同的顺序排列。如图7所示，每个“单体化合物”包括亲水性掩蔽物结构域、疏水性结构域或阳离子结构域和一个或多个接头，其中存在至少一个接头，该接头可以被内体试剂诸如内体酶切割。待递送的试剂(即货物分子)连接至多个单体单元(“多聚体化合物”)。靶向部分可以连接至货物部分或亲水性结构域以促进复合物的内吞作用。

下式可用于描述本公开的uEED的模块化设计，并代表本公开的某些非限制性实施方案。在一个实施方案中，单体化合物具有式I、II、III、IV、V或VI的结构：

/>

或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中C¹是偶联剂结构域；HD¹是亲水性掩蔽物结构域；HD²是疏水性结构域或阳离子电荷结构域；L¹是生物可降解接头；L²是第二接头；L³是第一接头；L⁴是第三接头；L⁵是第四接头(其中L⁴和L⁵接头可具有不同数目的碳或其他原子)；R¹和R²为用于固态合成的官能团的保护；并且n¹是选自0或1的整数；n²是选自0至10或更大的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11等)。在另一个实施方案中，偶联剂结构域包括磷酸三酯基团或亚磷酰胺基团。在又一个实施方案中，亲水性掩蔽物结构域包括糖苷部分。在另一个实施方案中，疏水性结构域或阳离子电荷结构域是包含伯、仲或叔氨基基团的任何官能团(或多个此类官能团)；脂质或源自其的单体单元；生育酚；疏水性低聚物或源自其的单体单元；疏水性聚合物或源自其的单体单元。在又一个实施方案中，疏水性结构域包括选自C8、C10、C12、C14、C16或C18脂质或它们的衍生物的脂质。在另一个实施方案中，疏水性结构域包括源自脂质的单体单元，该脂质选自脂肪酸、脂肪醇和任何其他具有至少两个碳单元的脂质分子。在又一个实施方案中，疏水性结构域包括选自聚甲基丙烯酰基、聚乙烯、聚苯乙烯、聚异丁烷、聚酯、多肽或它们的衍生物的疏水性聚合物。在另一个实施方案中，疏水性结构域包括一个或多个源自疏水性聚合物的单体单元，该疏水性聚合物选自：聚酯、聚醚、聚碳酸酯、聚酐、聚酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚砜、聚链烷、聚烯烃、聚炔烃、聚酐、聚原酸酯、N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、季铵改性的丙烯酸酯、季铵改性的甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、己内酯、丙交酯和戊内酯。在又一个实施方案中，疏水性结构域或阳离子电荷结构域包括1H-吲哚基团。在另一个实施方案中，生物可降解接头包括硫醚基团、氨基甲酸酯基团、酯基团、碳酸酯基团、脲基团或酶可切割肽键。在又一个实施方案中，生物可降解接头是内体可切割接头。在某个实施方案中，内体可切割接头包括氨基甲酸酯基团或腙基团。在另一个实施方案中，第一接头包括选自任选取代的(C₁-C₆)烷基、任选取代的(C₂-C₆)烯基、任选取代的(C₂-C₆)炔基或任选取代的(C₁-C₆)烷氧基。在另一个实施方案中，第一接头包括选自乙基、丙基、PEG₂、PEG₃和PEG₄的基团。在另一个实施方案中，第二接头选自任选取代的(C₁-C₆)烷基、任选取代的(C₂-C₆)烯基、任选取代的(C₂-C₆)炔基或任选取代的(C₁-C₆)烷氧基。在又一个实施方案中，第二接头包括选自乙基、丙基、PEG₂、PEG₃和PEG₄的基团。在另一个实施方案中，第三和第四接头选自任选取代的(C₁-C₆)烷基、任选取代的(C₂-C₆)烯基、任选取代的(C₂-C₆)炔基、任选取代的(C₁-C₆)烷氧基、尿苷基团和嘧啶基团。在某个实施方案中，第三和第四接头是(C₁-C₆)烷基或尿苷基团。

在某些实施方案中，基于标准寡核苷酸固态合成参数设计uEED，这些参数包括C1＝具有P＝O或P＝S主链的磷酸三酯，R1＝二甲氧基三苯甲基(DMT)保护和离去基团，和R2＝亚磷酰胺。因为固态合成所需的主链不是直接作为uEED活性组分的一部分，所以任何固态合成参数都可以被包括，但未被描述，诸如肽合成、PMO合成、PNA合成等。

如上文在式I至VI中一般性描述的，uEED单体的每个结构域都可包括各种试剂。例如，亲水性掩蔽物结构域可以包括超过40种糖苷中的一种或多种糖苷，这些糖苷被内体限制性糖苷酶特异性地切割。这种设计避免了内体外部过早的uEED激活。在另一个实施方案中，内体可切割接头可以是作为CO₂或腙释放的自我牺牲型氨基甲酸酯或其他内体特异性可切割接头设计。在又一个实施方案中，疏水性核心内体逃逸结构域(EED)可以包括单环或多环芳族基序、脂质或烷基分子或CPP结构域。当使用阳离子结构域时，阳离子结构域可以是任何含氮(N)的伯、仲或叔氨基基团。在一个实施方案中，在内体切割和激活后，EED不包含任何残余的亲水性基序(电荷、羟基等)。

在一个具体的实施方案中，本公开提供了一种单体化合物，该单体化合物包含：偶联剂结构域；疏水性结构域或阳离子电荷结构域；亲水性结构域；具有第一末端和第二末端的内体可切割或可降解接头，其中该内体可切割或可降解接头在该第一末端连接至该亲水性掩蔽物结构域，并且在该第二末端连接至该疏水性结构域或阳离子电荷结构域，或在该第二末端连接至第一接头；具有第一末端和第二末端的第一接头，其中该第一接头在该第一末端连接至该偶联剂结构域，并且在该第二末端连接至该疏水性结构域或阳离子电荷结构域，或连接至第二接头；任选地，具有第一末端和第二末端的第二接头，其中该第二接头在该第一末端连接至该疏水性结构域或阳离子电荷结构域，并且在该第二末端连接至该第一接头；任选地，具有第一末端和第二末端的第三和/或第四接头，其中该第一末端连接至该偶联剂结构域，其中该第二末端连接至用于固态合成的官能团。

关于内体可切割或可降解接头，接头易受受试者体内存在的酶或环境的作用。此类酶包括但不限于酯酶、葡糖苷酶和肽酶。受试者体内的环境可以是溶酶体中的还原环境。可降解接头的示例包括但不限于硫醚基团、氨基甲酸酯基团、酯基团、碳酸酯基团、脲基团或酶可切割肽键。在一个具体的实施方案中，生物可降解接头是内体可切割接头。内体可切割接头可以是作为CO₂或腙释放的自我牺牲型氨基甲酸酯或其他内体特异性接头设计。

关于本文公开的化合物的偶联剂结构域，使用固态合成策略，将偶联剂结构域用于从单体单元形成多聚体。偶联剂结构域的示例包括但不限于磷酸三酯基团和亚磷酰胺基团。使用固态化学技术的化学合成分子可以使用本领域公知的方法完成，诸如以下文献所阐述的那些方法：Engels等人，Angew.Chem.Intl.Ed.,28:716-734(1989)。这些方法特别包括磷酸三酯、亚磷酰胺和H-膦酸酯聚合物合成方法。包含超过10种单体化合物的聚合物可以合成为若干片段，每个片段的长度至多达约10个单体。在一个具体的实施方案中，使用标准亚磷酰胺化学的聚合物支持的合成可用于制备本公开的化合物。

关于本文公开的化合物的亲水性掩蔽物结构域，该结构域包括正电荷部分或者在该部分暴露于某些pH环境(例如生理pH或酸性环境)时变成带正电荷。可用于亲水性掩蔽物结构域的部分的示例包括但不限于糖苷，包括但不限于β-葡糖醛酸、α/β半乳糖、N-乙酰基葡糖胺、唾液酸、木糖、N-乙酰基半乳糖胺、甘露糖、葡萄糖和其他糖苷。所述部分/结构域的目的是掩蔽疏水性结构域或阳离子电荷结构域，增加化合物在水性环境中的溶解度。由于存在超过40种被内体限制性糖苷酶特异性切割的糖苷，所以糖苷用于亲水性掩蔽物结构域提供了额外的功能性。

关于本文公开的化合物的疏水性结构域或阳离子结构域，疏水性结构域通常由单环或多环芳族基序、脂质或烷基分子组成，而阳离子结构域包括一个、通常多个伯-仲叔氨基基团。所有内体都由脂质双层屏障组成，其防止＞99％的大分子治疗剂逃逸内体进入细胞质和细胞核。因此，一旦通过去除内体内部的亲水性掩蔽物结构域而“暴露”疏水性结构域或阳离子结构域，疏水性结构域或阳离子结构域将与内体膜相互作用或整合入内体膜中，从而破坏膜完整性并促进连接的货物的内体逃逸。在一个具体的实施方案中，疏水性结构域和/或阳离子结构域包括这样的部分，其包括但不限于包括伯、仲或叔氨基基团的官能团；脂质或源自其的单体单元；生育酚；疏水性低聚物或源自其的单体单元；和疏水性聚合物或源自其的单体单元。也设想了其他分子，包括芳族化合物诸如吲哚和含氮芳族多环化合物。单体单元的示例源自脂质，该脂质选自脂肪酸、脂肪醇和任何其他具有至少两个碳单元的脂质分子。疏水性聚合物的示例包括但不限于聚甲基丙烯酰基、聚乙烯、聚苯乙烯、聚异丁烷、聚酯、多肽或它们的衍生物。聚酯、聚醚、聚碳酸酯、聚酐、聚酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚砜、聚链烷、聚烯烃、聚炔烃、聚酐、聚原酸酯、N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、季铵改性的丙烯酸酯、季铵改性的甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、己内酯、丙交酯和戊内酯。

本公开的uEED构建体提供了可操作地连接至uEED构建体的单体或聚合物的货物分子的递送。术语“可操作地连接”或“可操作地缔合”是指两个结构域(例如uEED和货物结构域)之间的功能性连接。

货物结构域可包括治疗剂和/或诊断剂。治疗剂的示例包括例如血栓溶解剂和杀灭疾病相关细胞(例如，包含细胞增殖性病症诸如赘生物或癌症的细胞)或抑制其生长或细胞分裂的抗细胞剂。有效的血栓溶解剂的示例是链激酶和尿激酶。

示例性治疗剂包括但不限于抗生素、抗增殖剂、雷帕霉素大环内酯、镇痛药、麻醉剂、抗血管生成剂、血管活性剂、抗凝剂、免疫调节剂、细胞毒性剂、抗病毒剂、抗血栓药物、抗体、神经递质、精神活性药物以及它们的组合。治疗剂的其他示例包括但不限于细胞周期控制剂；抑制细胞周期蛋白产生的试剂；细胞因子，包括但不限于白介素1至13和肿瘤坏死因子；抗凝血剂、抗血小板剂；TNF受体结构域等。通常，治疗剂是中性的或带正电荷的。在某些情况下，当治疗剂带负电荷时，可以使用另外的电荷中和部分(例如，阳离子肽)。

有效的抗细胞剂包括经典的化学治疗剂，诸如类固醇、抗代谢物、蒽环霉素、长春花生物碱、抗生素、烷化剂、表鬼臼毒素和抗肿瘤剂诸如新制癌菌素(NCS)、阿霉素和二脱氧胞苷；哺乳动物细胞毒素，诸如干扰素-α(IFN-α)、干扰素-βγ(IFN-βγ)、白介素-12(IL-12)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；植物、真菌和细菌来源的毒素，诸如核糖体失活蛋白、白树毒素、α-八叠球菌素、曲霉素、局限曲霉素、核糖核酸酶、白喉毒素、假单胞菌外毒素、细菌内毒素、细菌内毒素的脂质A部分、蓖麻毒素A链、去糖基化的蓖麻毒素A链和重组蓖麻毒素A链；以及放射性同位素。

如本文所用，货物结构域可以是(1)任何异源多肽或其片段；(2)任何多核苷酸(例如核酶、RNAi(siRNA、shRNA等)、反义分子、多核苷酸、寡核苷酸等)；(3)任何小分子；或(4)任何诊断剂或治疗剂，其能够与uEED连接或融合。例如，货物结构域可包括siRNA/siRNNRNAi触发剂、ASO、寡核苷酸(例如，引导RNA(gRNA)或编码gRNA的序列)、CRISPR DNA/RNA编辑、mRNA、DNA载体、脂质纳米颗粒、蛋白质、肽、大合成分子中的任一者或多者。任何此类货物结构域都可用于治疗本领域公认的疾病和病症，包括但不限于癌症、炎症、感染、自身免疫性疾病、疼痛病症、生长病症、抗增殖病症、干细胞疗法、遗传异常等。

术语“治疗性”以一般意义使用，并且包括治疗剂、预防剂和替代剂。治疗性分子的示例包括但不限于细胞周期控制剂；抑制细胞周期蛋白的试剂，诸如细胞周期蛋白G1和细胞周期蛋白D1基因的反义多核苷酸；生长因子，诸如表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、红细胞生成素、G-CSF、GM-CSF、TGF-α、TGF-β和成纤维细胞生长因子；细胞因子，包括但不限于白介素1至13和肿瘤坏死因子；抗凝血剂、抗血小板剂；抗炎剂；肿瘤抑制蛋白；凝血因子，包括因子VIII和因子IX、蛋白S、蛋白C、抗凝血酶III、血管性血友病因子、囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)和阴性选择性标记诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶。

此外，与uEED融合的货物结构域/分子可以是阴性选择性标记或“自杀”蛋白，诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)或胞嘧啶脱氨酶(CD)。可将此类连接至自杀蛋白的uEED施用于受试者，从而选择性转导肿瘤细胞。在用激酶转导肿瘤细胞后，将相互作用试剂，诸如更昔洛韦或阿昔洛韦或5-氟胞嘧啶(5-FC)施用于受试者，由此杀死转导的肿瘤细胞。

此外，货物分子可以是诊断剂，诸如显像剂。示例性诊断剂包括但不限于显像剂，诸如用于正电子发射断层扫描(PET)、计算机辅助断层扫描(CAT)、单光子发射计算机断层扫描、X射线、荧光透视和磁共振成像(MRI)的那些。在MRI中用作造影剂的合适材料包括但不限于钆螯合物，以及铁、镁、锰、铜和铬螯合物。可用于CAT和X射线的材料的示例包括但不限于碘基材料。

发射辐射的放射性显像剂(可检测的放射性标记)的合适示例例如为铟-111、锝-99或低剂量碘-131。与本公开的核酸构建体结合使用或作为辅助部分连接至本公开的核酸构建体的可检测标记或标志物可以是放射性标记、荧光标记、核磁共振活性标记、发光标记、发色团标记、用于PET扫描仪的正电子发射同位素、化学发光标记或酶标记。荧光标记包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、荧光素和若丹明。标记物可以是例如医用同位素，诸如但不限于锝-99、碘-123和碘-131、铊-201、镓-67、氟-18、铟-111等。

因此，应当理解，本公开不限于用于诊断和/或治疗任何特定疾病或病症的任何特定货物结构域。相反，货物结构域可以是本领域已知或使用的用于治疗或诊断疾病或病症的任何分子或试剂。

当货物结构域是多肽时，多肽可包括氨基酸的L-光学异构体或D-光学异构体或两者的组合。可用于本公开的多肽包括修饰的序列，诸如糖蛋白、反向-翻转多肽、D-氨基酸修饰的多肽等。多肽包括天然存在的蛋白质，以及重组或合成的那些。“片段”是多肽的一部分。术语“片段”是指多肽的一部分，其表现出至少一个有用的表位或功能结构域。术语“功能片段”是指保留多肽活性的多肽片段。功能片段的大小可以不同，从小至能够结合抗体分子的表位的多肽片段到能够参与细胞内表型变化的特征性诱导或编程的大多肽。“表位”是多肽中能够结合在与抗原接触时产生的免疫球蛋白的区域。受体配体的小表位可用于本发明的方法中，只要其保留与受体相互作用的能力。

在一些实施方案中，使用反向-翻转肽。“反向-翻转”是指氨基-羧基翻转以及一个或多个氨基酸的对映体变化(即左旋(L)至右旋(D))。多肽包含，例如，氨基酸序列的氨基-羧基翻转、包含一个或多个D-氨基酸的氨基-羧基翻转和包含一个或多个D-氨基酸的非翻转序列。稳定并保持生物活性的反向-翻转肽模拟物可以如以下文献所述设计：Brugidou等人(Biochem.Biophys.Res.Comm.214(2):685-693,1995)和Chorev等人(TrendsBiotechnol.13(10):438-445,1995)。

用化学偶联剂设计uEED单体，以便在固态合成仪上合成uEED多聚体。本公开的方法可控制uEED单体单元的最佳数目以及掺入单一类型的uEED单体或多种不同类型的uEED单体的能力，以产生结构上明确定义的多样化uEED多聚体文库，该多聚体文库能够优化多种给定类型的大分子货物的内体逃逸和递送。例如，siRNA(大约14kDa)的递送可能需要单个uEED六聚体，而LNP(大约100megaDa)的递送可能需要位于其表面的许多uEED十聚体。无论单体单元的数目或类型如何，所有uEED多聚体都基于相同的生物模拟设计原理。UEED还包含以任何所需数目与所有类别的大分子治疗剂缀合的基序。

因为任何给定的大分子治疗剂类别都可能对内体逃逸具有不同的最佳要求，所以uEED设计建立在能够经历固态合成(并存活)的uEED单体的合成上。该方法允许合成包含2个、3个、4个、5个、6个……至20个或更多个的任何数目的uEED单体单元的uEED多聚体集合。每个uEED多聚体包含用于与大分子治疗剂(例如货物)缀合的缀合柄(Click、HyNic、氨氧基等)。在固态合成后，将uEED脱保护以去除所有保护基团并通过HPLC纯化。

在某些实施方案中，uEED可连接至货物结构域，并且还可包括靶向部分。本公开提供了一种或多种靶向部分，其可以作为辅助部分，例如作为靶向辅助部分，连接至本文公开的uEED构建体。靶向部分基于其将本公开的构建体靶向至表达所选靶向部分的相应结合配偶体(例如，相应受体或配体)的期望或所选细胞群的能力来选择。靶向部分也基于其诱导内吞作用或连接至内吞的细胞表面蛋白的能力来选择。例如，本公开的构建体可以通过所选表皮生长因子(EGF)作为诱导内吞作用的靶向部分而靶向至表达表皮生长因子受体(EGFR)的细胞。

在一个实施方案中，靶向部分是受体结合结构域。在另一个实施方案中，靶向部分是选自以下项的蛋白或特异性结合该蛋白：胰岛素、胰岛素样生长因子受体1(IGF1R)、IGF2R、胰岛素样生长因子(IGF；例如IGF 1或2)、间充质上皮转移因子受体(c-met；也称为肝细胞生长因子受体(HGFR))、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子(EGF)、调蛋白、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、TNF-β、叶酸受体(FOLR)、叶酸、转移、转铁蛋白受体(TfR)、间皮素、Fc受体、c-kit受体、c-kit、整联蛋白(例如α4整联蛋白或β-1整联蛋白)、P-选择素、鞘氨醇-1-磷酸酯受体-1(S1PR)、透明质酸盐受体、白细胞功能抗原-1(LFA-1)、CD4、CD11、CD18、CD20、CD25、CD27、CD52、CD70、CD80、CD85、CD95(Fas受体)、CD106(血管细胞粘附分子1(VCAM1))、CD166(活化白细胞粘附分子(ALCAM))、CD178(Fas配体)、CD253(TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL))、ICOS配体、CCR2、CXCR3、CCR5、CXCL12(基质细胞衍生因子1(SDF-1))、白介素1(IL-1)、IL-1ra、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、CTLA-4、MART-1、gp100、MAGE-1、肝配蛋白(Eph)受体、粘膜地址素细胞粘附分子1(MAdCAM-1)、癌胚抗原(CEA)、Lewis^Y、MUC-1、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、癌抗原125(CA125)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、TAG-72抗原以及它们的片段。在另一个实施方案中，靶向部分是成红细胞白血病病毒致癌基因同源物(ErbB)受体(例如，ErbB1受体；ErbB2受体；ErbB3受体；和ErbB4受体)。

靶向部分还可选自铃蟾肽、胃泌素、胃泌素释放肽、肿瘤生长因子(TGF)诸如TGF-α和TGF-β、以及痘苗病毒生长因子(VVGF)。非肽基配体也可以用作靶向部分，并且可以包括例如类固醇、碳水化合物、维生素和凝集素。靶向部分也可选自肽或多肽，诸如促生长素抑制素(例如，具有核心序列环[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]的促生长素抑制素，并且其中例如，促生长素抑制素类似物的C末端为Thr-NH₂)、促生长素抑制素类似物(例如，奥曲肽和兰瑞肽)、铃蟾肽、铃蟾肽类似物或抗体，诸如单克隆抗体。

用作本公开的uEED构建体中的靶向辅助部分的其他肽或多肽可以选自KiSS肽和类似物、尾加压素II肽和类似物、GnRH I和II肽和类似物、地普奥肽、伐普肽、血管活性肠肽(VIP)、缩胆囊素(CCK)、含RGD的肽、黑素细胞刺激激素(MSH)肽、神经降压素、降钙素、来自抗肿瘤抗体的互补性决定区的肽、谷胱甘肽、YIGSR(嗜白细胞肽，例如P483H，其包含血小板因子-4(PF-4)的肝素结合区和富含赖氨酸的序列)、心房钠尿肽(ANP)、β-淀粉样肽，δ-阿片样拮抗剂(诸如ITIPP(psi))，膜联蛋白-V、内皮素、白三烯B4(LTB4)、趋化肽(例如，N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰-苯丙氨酸-赖氨酸(fMLFK)、GP IIb/IIIa受体拮抗剂(例如DMP444)、人中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂(EPI-HNE-2和EPI-HNE-4)、纤溶酶抑制剂、抗微生物肽、apticide(P280和P274)、血小板反应蛋白受体(包括类似物诸如TP-1300)、bitistatin、垂体腺苷酸环化酶I型受体(PAC1)、纤维蛋白α链、源自噬菌体展示文库的肽以及它们的保守取代物。

用作本公开的uEED构建体中的靶向部分的免疫反应性配体包括能够诱导内吞作用的抗原识别免疫球蛋白(也称为“抗体”)或其抗原识别片段。如本文所用，“免疫球蛋白”是指免疫球蛋白的任何公认类别或亚类，诸如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE。典型的是那些属于免疫球蛋白IgG类的免疫球蛋白。免疫球蛋白可以源自任何物种。然而，通常，免疫球蛋白是人、鼠或兔来源的。此外，免疫球蛋白可以是多克隆的或单克隆的，但通常是单克隆的。

本公开的靶向部分可以包括抗原识别免疫球蛋白片段。此类免疫球蛋白片段可以包括，例如Fab'、F(ab')₂、F_v或Fab片段、单结构域抗体、ScFv或其他抗原识别免疫球蛋白片段。Fc片段也可用作靶向部分。此类免疫球蛋白片段可通过例如蛋白水解酶消化，例如通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化、还原性烷基化或重组技术来制备。制备此类免疫球蛋白片段的材料和方法是本领域技术人员公知的。参见Parham,J.Immunology,131,2895,1983；Lamoyi等人，J.Immunological Methods,56,235,1983。

本公开的靶向部分包括本领域已知的但在本公开中未作为具体示例提供的那些靶向部分，其诱导内吞作用或被内吞。

可用于本公开的构建体和方法中的肽接头将通常包括至多达约20个或30个氨基酸，通常至多达约10个或15个氨基酸，并且还更经常地约1个至5个氨基酸。接头序列通常是柔性的，以便不将融合分子保持在单一刚性构象。接头序列可用于例如将一个结构域与另一个结构域隔开。例如，肽接头序列可以位于亲水性结构域与阳离子结构域之间。

本公开包括化合物的所有异构(例如，对映体、非对映体和几何(或构象))形式；例如，顺式和反式异构体，每个不对称中心的R和S构型，Z和E双键异构体，以及Z和E构象异构体。因此，本文设想本公开的化合物的单一立体化学异构体以及对映体、非对映体和几何(或构象)混合物。除非另有说明，本文涵盖本公开的化合物的所有互变异构形式。本公开包括本公开的所有药学上可接受的同位素标记的化合物，其中一个或多个原子被具有相同原子序数但原子质量或质量数不同于通常在自然界中发现的原子质量或质量数的原子替代。适用于包括在本公开的化合物中的同位素的示例包括氢的同位素，诸如²H和³H；碳的同位素，诸如¹¹C、¹³C和¹⁴C；氯的同位素，诸如³⁶Cl；氟的同位素，诸如¹⁸F；碘的同位素，诸如¹²³I和¹²⁵I；氮的同位素，诸如¹³N和¹⁵N；氧的同位素，诸如¹⁵O、¹⁷O和¹⁸O；磷的同位素，诸如³²P；和硫的同位素，诸如³⁵S。

源自适当碱的盐包括碱金属、碱土金属和铵盐。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。一类盐包括药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的盐”表示在合理的医学判断范围内适用于与人和低等动物的组织接触而无过度的毒性、刺激、过敏反应等，并且与合理的利益/风险比相称的盐。药学上可接受的盐是本领域公知的。例如，药学上可接受的盐描述于：Berge等人，J.Pharmaceutical Sciences 66:1-19,1977和Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use(编撰：P.H.Stahl和C.G.Wermuth)，Wiley-VCH，2008。盐可以在本文所述化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，或者通过使游离碱基与合适的有机酸反应而单独制备。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、双葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。

根据本公开的药物组合物可以被制备成包括本公开的化合物，使用载体、赋形剂和添加剂或助剂制成适用于向受试者施用的形式。常用的载体或助剂包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇和其他糖、滑石、乳蛋白、明胶、淀粉、维生素、纤维素以及它们的衍生物、动物和植物油、聚乙二醇和溶剂诸如无菌水、醇、甘油和多元醇。静脉内溶媒包括液体和营养补充剂。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。其他药学上可接受的载体包括水溶液、无毒赋形剂，包括盐、防腐剂、缓冲剂等，例如如以下文献中所述：Remington'sPharmaceutical Sciences，第15版；Easton：Mack Publishing Co.,1405-1412,1461-1487(1975)和The National Formulary XIV.，第14版，华盛顿：美国药物协会(1975)，这些参考文献的内容以引用方式并入本文。药物组合物的各种组分的pH和确切浓度根据本领域的常规技术进行调节。参见Goodman和Gilman，The Pharmacological Basis for Therapeutics(第7版)。

根据本公开的药物组合物可以局部或全身施用。“治疗有效剂量”是指预防、治愈或至少部分地阻止疾病或病症的症状(例如，抑制细胞增殖)所必需的根据本公开的融合多肽的量。当然，对该用途有效的量将取决于疾病的严重度以及受试者的体重和一般状况。通常，体外使用的剂量可以在用于原位施用药物组合物的量方面提供有用的指导，并且动物模型可以用于确定用于治疗特定病症的有效剂量。各种考虑描述于例如Langer，Science,249:1527,(1990)；Gilman等人(编撰)(1990)，这些文献中的每个文献以引用方式并入本文。

如本文所用，“施用治疗有效量”旨在包括将本公开的药物组合物给予或应用于受试者的方法，其允许组合物执行其预期的治疗功能。治疗有效量将根据各个因素而变化，诸如受试者的疾病程度、个体的年龄、性别和体重。可以调整给药方案以提供最佳治疗反应。例如，可以每天施用若干分份剂量，或者可以如治疗情况的紧急状态所指示的那样按比例减少剂量。

药物组合物可以以方便的方式施用，诸如通过注射(例如，皮下、静脉内、脑内、脊柱内、眼内等)、口服施用、吸入、透皮施用或直肠施用。取决于施用途径，药物组合物可以用材料包衣以保护药物组合物免受酶、酸和其他可能使药物组合物失活的天然条件的作用。药物组合物还可以肠胃外或腹膜内施用。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇以及它们的混合物中和在油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制剂可以包含防腐剂以防止微生物的生长。

适用于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散体和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。组合物将通常是无菌和流动的，以至于容易的可注射性存在的程度。通常，组合物在制造和储存条件下是稳定的，并且被保存以抵抗微生物诸如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适的混合物和植物油。例如，通过使用涂层诸如卵磷脂，在分散体的情况下通过保持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。微生物作用的预防可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，等渗剂，例如糖、多元醇诸如甘露醇、山梨醇或氯化钠用于组合物中。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。

无菌注射溶液可以通过将药物组合物以所需量与上述列举的成分中的一种成分或它们的组合一起掺入适当溶剂中来制备，根据需要，随后过滤灭菌。通常，通过将药物组合物掺入无菌溶媒中来制备分散体，该无菌溶媒包含基本分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。

药物组合物可以口服施用，例如，与惰性稀释剂或可吸收的可食用载体一起。药物组合物和其他成分也可包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，压制成片剂，或直接掺入受试者的饮食中。对于口服治疗施用，药物组合物可以与赋形剂混合，并以可吸收片剂、口含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等形式使用。此类组合物和制剂应包含至少1％重量的活性化合物。当然，组合物和制剂的百分比可以变化，并且可以方便地在单位重量的约5％至约80％之间。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以包含以下成分：粘合剂，诸如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；和甜味剂，诸如蔗糖、乳糖或糖精；或调味剂，诸如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料之外，它可以包含液体载体。各种其他材料可以作为包衣存在或以其他方式改变剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用虫胶、糖或两者包衣。糖浆或酏剂可以包含试剂、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的甲基和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂，诸如樱桃香料或橙子香料。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何材料应该是药学上纯的并且在所用的量下基本无毒。此外，药物组合物可以掺入缓释制剂和制剂中。

因此，“药学上可接受的载体”旨在包括溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。除了与药物组合物不相容的任何常规介质或试剂之外，考虑其在治疗组合物和治疗方法中的用途。补充的活性化合物也可以掺入组合物中。

为了易于施用和剂量的均匀性，将肠胃外组合物配制成剂量单位形式是特别有利的。如本文所用，“剂量单位形式”是指适合作为用于待治疗的受试者的单位剂量的物理上离散的单位；计算包含预定量药物组合物的每个单位以与所需的药物载体结合产生所需的治疗效果。本公开的剂量单位形式的说明涉及药物组合物的特征和要实现的特定治疗效果。

将主要药物组合物与合适的药学上可接受的载体以可接受的剂量单位配制，以便以有效量方便且有效地施用。在包含补充活性成分的组合物的情况下，剂量通过参考所述成分的常用剂量和施用方式来确定。

提供以下工作示例以说明而非限制本发明。这些示例中所用的科学方法的各种参数在下面详细描述，并提供了一般性实施本发明的指导。

实施例

亚磷酰胺uEED前体的合成。亚磷酰胺uEED前体使用固态亚磷酰胺技术以图12至图23、图32、图38至图40和图45中所示的合成路线和反应合成。

将亚磷酰胺uEED前体加工成uEED。β-葡糖苷酸甲酯保护基团的去除：将50μL亚磷酰胺uEED前体置于Eppendorf管中(DMF:H₂O为1:1)，随后添加100μL小鼠血清(具有高酯酶活性)，并将反应混合物在环境温度温育4小时。经计算得出甲酯基团在＜15分钟内被去除。用300μL乙腈处理反应混合物以使血浆蛋白沉淀。将样品离心10分钟，并通过离心蒸发干燥上清液以获得uEED多聚体。

B-葡糖醛酸糖苷酶测定。将未纯化的合成uEED多聚体溶解于40μL水中。向其中添加50μL NaOAc(pH 6)和10μL源自牛的β-葡糖醛酸糖苷酶(500U/mL，在0.2％ NaCl中)。将样品在37℃温育过夜。用乙腈(300μL)处理反应混合物，离心10分钟，用注射器过滤(0.2微米)上清液，并通过CombiFlash或ESI质谱分析进行分析。

通过CombiFlash和电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析uEED。在注射器过滤后，将β-葡糖醛酸糖苷酶处理的样品(200μL)注入C18 HPLC柱。使用B＝90％乙腈/水的溶剂梯度和50mM TEAA/水的A。收集级分，通过ESI-MS分析测定uEED水解。

为了测试Qa uEED的代谢稳定性，将Qa uEED与小鼠血清一起温育，该小鼠血清具有显著的和众所周知的代谢酶活性。用小鼠血清处理4小时后，通过C18 HPLC和ESI质谱分析对Qa uEED的Qa官能团进行分析。Qa uEED的葡糖醛酸部分在小鼠血清中是高度代谢稳定的，并且没有显示出代谢降解的迹象。

将RNA寡核苷酸递送至哺乳动物细胞中。为了测试uEED增强内体逃逸并因此在体外将RNA寡核苷酸治疗剂递送至细胞中的能力，经由点击缀合化学将包含末端叠氮化物的GalNAc靶向结构域缀合到萤光素酶siRNA过客(有义)链上的5'端BCN基团。然后将GalNAc-siRNA缀合物缀合到包含末端四嗪基团的各种uEED，该末端四嗪基团将驱动缀合到过客链上的3'反式环辛烯(TCO)基团。总之，这种单罐双重缀合方法允许位点选择性缀合和精确产生GalNAc-siRNA-uEED构建体，其中通过RNAi敲低荧光素酶报道基因，可以快速检测包含2个、4个、6个……至20个或更多个uEED单体的各种uEED多聚体的内体逃逸和递送至细胞质中是否增加。

来自ROSA26-Lox-Stop-lox(LSL)萤光素酶小鼠的原代鼠肝细胞在静脉注射施用Cre腺病毒前一周(或更长时间)预处理以重组出LSL DNA片段，从而组成性表达萤光素酶，按照标准方案分离并放入细胞培养物中。用上述各种GalNAc-Luc siRNA-uEED构建体处理铺在24孔板中的表达荧光素酶的肝细胞，并与匹配的uEED设计对照GalNAc-GFP siRNA-uEED构建体、对照GalNAc-siRNA Luc(无uEED)和未处理的肝细胞进行比较。通过酶标仪和IVIS成像测定监测经处理的肝细胞的萤光素酶RNAi敲低。所有实验均进行三次，并在三个独立的日期重复(生物的一式三份的一式三份)。预期各种GalNAc-Luc siRNA-uEED构建体将实现更有效的RNAi萤光素酶敲低，并因此需要与对照GalNAc-Luc siRNA(无uEED)相比更低的剂量。

将RNA寡核苷酸递送至动物模型中。为了在临床前动物模型中体内测试uEED增强内体逃逸和将RNA寡核苷酸治疗剂递送至组织中的能力，用各种GalNAc-Luc siRNA-uEED构建体相对于对照处理表达荧光素酶的临床前小鼠。

静脉注射施用Cre腺病毒预处理ROSA26-Lox-Stop-lox(LSL)荧光素酶小鼠以重组出LSL DNA片段，从而在肝细胞中组成性表达荧光素酶。从Cre腺病毒感染后一周开始，每天通过活体动物IVIS成像监测经处理的小鼠的组成型基线萤光素酶表达。为了获得所有动物的基线测量结果，将动物随机分组(n＝8只/组)，注射荧光素，并在处理前三天(第-2天、第-1天、第0天)通过活体动物IVIS生物发光成像测定。在第0天成像后，通过皮下或静脉注射施用包含2个、4个、6个……至20个或更多个uEED单体的GalNAc-Luc siRNA-uEED构建体处理小鼠，并与匹配的uEED设计对照GalNAc-GFP siRNA-uEED构建体、对照GalNAc-siRNA Luc(无uEED)和未处理小鼠进行比较。所有动物组在第1天、第2天、第3天、第5天、第7天、第14天、第21天、第28天(如果需要的话更长时间)注射荧光素后通过活体动物IVIS生物发光成像进行测定。

预期各种GalNAc-Luc siRNA-uEED构建体将实现更有效的RNAi萤光素酶敲低，并因此需要与对照GalNAc-Luc siRNA(无uEED)和对照GalNAc-GFP siRNA-uEED构建体相比更低的剂量。

将Qb6 uEED(6mer)缀合到萤光素酶(Luc)过客链的5'末端，然后与引导链双链体以形成siLuc-Qb6。将0.3nmol Qb6-siLuc5-cy3在50％人血清加50％盐水中于37℃温育。最终体积为20μL。样品与UREA凝胶上样缓冲液以1:1混合，然后上样于15％变性UREA-PAGE凝胶上，接着用亚甲蓝染色。在biorad chemidoc上成像(图41)。将siLuc-Qb6置于300mM pH5.0的乙酸钠缓冲液、β-葡糖醛酸糖苷酶(10U/μL)的溶酶体条件下，将0.25nmol Qb6-siLuc5寡聚物在37℃温育。最终体积为15μL。样品与UREA凝胶上样缓冲液以1:1混合，然后上样于15％变性UREA-PAGE凝胶上，接着用亚甲蓝染色。在biorad chemidoc上成像(图42和图43)。

合成T15(Qd-b)2作为单一寡聚物(无缀合)，在300mM pH 5.0的乙酸钠缓冲液、β-葡糖醛酸糖苷酶(10U/μL)的溶酶体条件下于37℃测试0.25nmol T15Qd2寡聚物的转化率1小时。最终体积为15μL。样品与UREA凝胶上样缓冲液以1:1混合，然后上样于15％变性UREA-PAGE凝胶上，接着用亚甲蓝染色。在biorad chemidoc上成像(图46)。经β-葡糖醛酸糖苷酶处理和转化的T15(Qd-b)2测试寡聚物迁移更慢，因为即使其通过切割6个葡糖醛酸而失去一些分子质量，其也获得了6个正电荷，中和了6个负共享的寡聚主链磷酸二酯，从而导致更少的电荷将寡聚物拉入凝胶中，因此迁移更慢。

产生了与siRNA或具有uEED的ASO缀合的GalNAc三聚体。使用＜ED50的剂量，进行GalNAc-siRNN和ASO缀合物+/-uEED的比较。给野生型Balb/C小鼠皮下注射GalNAc-siRNA和GalNAc-ASO缀合物。在施用前(第0天)以及第3天和第6天采集血液样品(图47)。通过ELISA分析血液中肝脏产生和分泌的TTR蛋白质和AT3蛋白质的水平。图48提供了估计和预期的结果，与对照相比，由于快速激活，其将显示出uEED缀合物更强的敲低。

附图提供了本公开的uEED构建体的许多变化，这些构建体不是限制性的，而仅是示例性的。此外，本文明确设想了每种构建体。另外，在附图中提供了许多合成方法；这些方法仅是示例性的而非限制性的。

已经描述了多个实施方案。然而，应当理解，在不背离本说明书的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，其他实施方案也在所附权利要求的范围内。

Claims (71)

1.一种单体化合物，所述单体化合物包含：

偶联剂结构域；

疏水性结构域或阳离子电荷结构域；

亲水性结构域；

具有第一末端和第二末端的生物可降解接头，其中所述生物可降解接头在所述第一末端连接至所述亲水性结构域，并且在所述第二末端连接至所述疏水性结构域或阳离子电荷结构域，或在所述第二末端连接至任选的第一接头；

具有第一末端和第二末端的所述任选的第一接头，其中所述第一接头在所述第一末端连接至所述偶联剂结构域，并且在所述第二末端连接至所述疏水性结构域或阳离子电荷结构域，或连接至任选的第二接头；

具有第一末端和第二末端的任选的第二接头，其中所述第二接头在所述第一末端连接至所述疏水性结构域或阳离子电荷结构域，并且在所述第二末端连接至所述第一接头；

任选地，具有第一末端和第二末端的第三和/或第四接头，其中所述第一末端连接至所述偶联剂结构域，其中所述第二末端连接至用于固态合成的官能团；

任选地，具有第一末端和第二末端的第五接头，其中所述第一末端连接至所述疏水性结构域或阳离子电荷结构域，其中所述第二末端连接至另外的疏水性结构域或阳离子电荷结构域。

2.根据权利要求1所述的单体化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述化合物具有式I、II、III、IV、V或VI的结构：

其中

C¹是所述偶联剂结构域；

HD¹是所述亲水性结构域；

HD²是所述疏水性结构域或阳离子电荷结构域；

L¹是所述生物可降解接头；

L²是所述任选的第二接头；

L³是所述任选的第一接头；

L⁴是所述任选的第三接头；

L⁵是所述任选的第四接头；

Lx是所述任选的第五接头；

R¹和R²是用于固态合成的保护基团或官能团；

n¹是选自0或1的整数；并且

n²是选自0至10的整数。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的单体化合物，其中所述偶联剂结构域包括磷酸三酯基团或亚磷酰胺基团。

4.根据前述权利要求中任一项所述的单体化合物，其中所述亲水性结构域包括糖苷部分。

5.根据前述权利要求中任一项所述的单体化合物，其中所述疏水性结构域或所述阳离子电荷结构域是包含芳族吲哚环；含氮的单环或多环环；伯、仲或叔氨基基团；脂质或由其衍生的单体单元；生育酚；疏水性低聚物或由其衍生的单体单元；疏水性聚合物或由其衍生的单体单元的任何官能团。

6.根据权利要求5所述的单体化合物，其中所述疏水性结构域包括选自C8、C10、C12、C14、C16或C18脂质或其衍生物的脂质。

7.根据权利要求5所述的单体化合物，其中所述疏水性结构域包括源自脂质的单体单元，所述脂质选自脂肪酸、脂肪醇和任何具有至少两个碳单元的其他脂质分子。

8.根据权利要求5所述的单体化合物，其中所述疏水性结构域包括疏水性聚合物。

9.根据权利要求5所述的单体化合物，其中所述疏水性结构域包括一个或多个源自疏水性聚合物的单体单元，所述疏水性聚合物选自由聚酯、聚醚、聚碳酸酯、聚酐、聚酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚砜、聚链烷、聚烯烃、聚炔烃、聚酐、聚原酸酯、N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、季铵改性的丙烯酸酯、季铵改性的甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、己内酯、丙交酯和戊内酯组成的组。

10.根据权利要求5所述的单体化合物，其中所述疏水性结构域或所述阳离子电荷结构域包含1H-吲哚基团；含氮的单环或多环芳族或非芳族化合物。

11.根据权利要求1或2所述的单体化合物，其中所述阳离子电荷结构域包括伯胺、仲胺、叔胺、季胺、复合胺基基团或可电离的胺。

12.根据权利要求11所述的单体化合物，其中所述阳离子电荷结构域包括二甲双胍基团、吗啉基团、哌嗪基团、吡啶基团、吡咯烷基团、哌啶、硫代吗啉、硫代吗啉氧化物、硫代吗啉二氧化物、咪唑、胍或肌酸。

13.根据权利要求11所述的单体化合物，其中所述阳离子电荷结构域包括季胺。

14.根据前述权利要求中任一项所述的单体化合物，其中所述生物可降解接头包括硫醚基团、氨基甲酸酯基团、酯基团、碳酸酯基团、脲基团或酶可切割肽键。

15.根据前述权利要求中任一项所述的单体化合物，其中所述生物可降解接头是内体可切割接头。

16.根据权利要求15所述的单体化合物，其中所述内体可切割接头包括氨基甲酸酯基团或腙基团。

17.根据前述权利要求中任一项所述的单体化合物，其中所述第一接头包括选自任选取代的(C₁-C₆)烷基、任选取代的(C₂-C₆)烯基、任选取代的(C₂-C₆)炔基或任选取代的(C₁-C₆)烷氧基的基团。

18.根据权利要求17所述的单体化合物，其中所述第一接头包括选自乙基、丙基、PEG₂、PEG₃和PEG₄的基团。

19.根据前述权利要求中任一项所述的单体化合物，其中所述第二接头选自任选取代的(C₁-C₆)烷基、任选取代的(C₂-C₆)烯基、任选取代的(C₂-C₆)炔基或任选取代的(C₁-C₆)烷氧基的基团。

20.根据权利要求19所述的单体化合物，其中所述第二接头包括选自乙基、丙基、PEG₂、PEG₃和PEG₄的基团。

21.根据前述权利要求中任一项所述的单体化合物，其中所述第三和第四接头选自任选取代的(C₁-C₆)烷基、任选取代的(C₂-C₆)烯基、任选取代的(C₂-C₆)炔基、任选取代的(C₁-C₆)烷氧基、尿苷基团和嘧啶基团的基团。

22.根据权利要求21所述的单体化合物，其中所述第三和第四接头是(C₁-C₆)烷基或尿苷基团。

23.根据前述权利要求中任一项所述的单体化合物，其中所述用于固态合成的官能团或保护基团是酰胺和/或4,4'-二甲氧基三苯甲基基团。

24.根据前述权利要求中任一项所述的单体化合物，其中所述化合物具有选自以下的结构：

以及

25.一种多聚体化合物，所述多聚体化合物包含多种根据前述权利要求中任一项所述的单体化合物，其中所述多种单体化合物已经使用固态合成连接在一起以形成多聚体化合物。

26.根据权利要求25所述的多聚体化合物，其中所述多聚体化合物连接至货物分子。

27.根据权利要求26所述的多聚体化合物，其中所述货物分子选自小分子治疗剂、肽、蛋白质、单链寡核苷酸、双链寡核苷酸和蛋白质-寡核苷酸复合物组成的组。

28.根据权利要求26或权利要求27所述的多聚体化合物，其中所述货物分子通过共价键、通过氢键或通过静电吸引连接至所述多聚体化合物。

29.一种具有式VII的结构的多聚体化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：

其中

C¹是偶联剂结构域；

HD¹、HD^1’、HD^1”和HD^1”’各自独立地为所选的亲水性结构域；

HD²、HD^2’、HD^2”和HD^2”’各自独立地为所选的疏水性结构域或阳离子电荷结构域；

L¹是生物可降解接头；

L²是第二接头；

L³是第一接头；

L⁴是第三接头；

R³是H或用于货物分子的缀合柄；

R⁴是H或用于货物分子的缀合柄；

n²是选自0至10的整数；

n³是选自0至10的整数；

n⁴是选自0至10的整数；并且

n⁵是选自0至10的整数；

其中n¹至n⁵所规定的整数总和是4至30，并且

其中R³和R⁴中的至少一者是用于货物分子的缀合柄。

30.根据权利要求29所述的多聚体化合物，其中所述偶联剂结构域包括磷酸三酯基团。

31.根据权利要求29或权利要求30所述的多聚体化合物，其中所述亲水性掩蔽物结构域包括糖苷部分。

32.根据权利要求29至31中任一项所述的多聚体化合物，其中所述疏水性结构域或所述阳离子电荷结构域选自包含伯、仲或叔氨基基团；脂质或由其衍生的单体单元；生育酚；疏水性低聚物或由其衍生的单体单元；疏水性聚合物或由其衍生的单体单元的任何官能团。

33.根据权利要求32所述的多聚体化合物，其中一个或多个所述疏水性结构域包括选自C8、C10、C12、C14、C16或C18脂质或其衍生物的脂质。

34.根据权利要求32所述的多聚体化合物，其中一个或多个所述疏水性结构域包括源自脂质的单体单元，所述脂质选自脂肪酸、脂肪醇和任何其他具有至少两个碳单元的脂质分子。

35.根据权利要求32所述的多聚体化合物，其中一个或多个所述疏水性结构域包括选自聚甲基丙烯酸、聚乙烯、聚苯乙烯、聚异丁烷、聚酯、多肽或其衍生物的疏水性聚合物。

36.根据权利要求32所述的多聚体化合物，其中一个或多个所述疏水性结构域包括一个或多个源自疏水性聚合物的单体单元，所述疏水性聚合物选自由聚酯、聚醚、聚碳酸酯、聚酐、聚酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚砜、聚链烷、聚烯烃、聚炔烃、聚酐、聚原酸酯、N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、季铵改性的丙烯酸酯、季铵改性的甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、己内酯、丙交酯和戊内酯组成的组。

37.根据权利要求32所述的多聚体化合物，其中所述疏水性结构域或所述阳离子电荷结构域中的一者或多者包括1H-吲哚基团。

38.根据权利要求32所述的多聚体化合物，其中所述阳离子电荷结构域包括伯胺、仲胺、叔胺、季胺、复合胺基基团或可电离的胺。

39.根据权利要求38所述的多聚体化合物，其中所述阳离子电荷结构域包括二甲双胍基团、吗啉基团、哌嗪基团、吡啶基团、吡咯烷基团、哌啶、硫代吗啉、硫代吗啉氧化物、硫代吗啉二氧化物、咪唑、胍或肌酸。

40.根据权利要求38所述的多聚体化合物，其中所述阳离子电荷结构域包括季胺。

41.根据权利要求29至40中任一项所述的多聚体化合物，其中所述生物可降解接头包括硫醚基团、氨基甲酸酯基团、酯基团、碳酸酯基团、脲基团或酶可切割肽键。

42.根据权利要求29至41中任一项所述的多聚体化合物，其中所述生物可降解接头是内体可切割接头。

43.根据权利要求42所述的多聚体化合物，其中所述内体可切割接头包括氨基甲酸酯基团或腙基团。

44.根据权利要求29至43中任一项所述的多聚体化合物，其中所述第一接头包括选自任选取代的(C₁-C₆)烷基、任选取代的(C₂-C₆)烯基、任选取代的(C₂-C₆)炔基或任选取代的(C₁-C₆)烷氧基的基团。

45.根据权利要求44所述的多聚体化合物，其中所述第一接头包括选自乙基、丙基、PEG₂、PEG₃和PEG₄的基团。

46.根据权利要求29至45中任一项所述的多聚体化合物，其中所述第二接头选自任选取代的(C₁-C₆)烷基、任选取代的(C₂-C₆)烯基、任选取代的(C₂-C₆)炔基或任选取代的(C₁-C₆)烷氧基的基团。

47.根据权利要求46所述的多聚体化合物，其中所述第二接头包括选自乙基、丙基、PEG₂、PEG₃和PEG₄的基团。

48.根据权利要求29至47中任一项所述的多聚体化合物，其中所述第三接头选自任选取代的(C₁-C₆)烷基、任选取代的(C₂-C₆)烯基、任选取代的(C₂-C₆)炔基、任选取代的(C₁-C₆)烷氧基、尿苷基团和嘧啶基团的基团。

49.根据权利要求48所述的多聚体化合物，其中所述第三接头是(C₁-C₆)烷基或尿苷基团。

50.根据权利要求29至49中任一项所述的多聚体化合物，其中所述用于货物分子的缀合柄包括叠氮基团。

51.根据权利要求29至50中任一项所述的多聚体化合物，其中所述用于货物分子的缀合柄包括以下结构：

其中

x是选自1至15的整数；并且

R为-OH或-CN。

52.根据权利要求29至51中任一项所述的多聚体化合物，其中所述多聚体化合物连接至货物分子。

53.根据权利要求52所述的多聚体化合物，其中所述货物分子选自由小分子治疗剂、肽、蛋白质、单链寡核苷酸、双链寡核苷酸和蛋白质-寡核苷酸复合物组成的组。

54.根据权利要求52或权利要求53所述的多聚体化合物，其中所述货物分子连接至所述多聚体化合物的所述缀合柄。

55.根据权利要求1所述的单体化合物或根据权利要求29所述的多聚体化合物，还包含连接至所述化合物的靶向部分。

56.根据权利要求55所述的单体化合物或多聚体化合物，其中所述靶向结构域连接至所述亲水性结构域。

57.根据权利要求56所述的单体化合物或多聚体化合物，其中所述靶向化合物引起内吞作用或被细胞内吞。

58.根据权利要求55至58中任一项所述的单体化合物或多聚体化合物，其中所述靶向部分特异性结合选自以下项的蛋白：胰岛素、胰岛素样生长因子受体1(IGF1R)、IGF2R、胰岛素样生长因子(IGF；例如IGF 1或2)、间充质上皮转移因子受体(c-met；也称为肝细胞生长因子受体(HGFR))、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子(EGF)、调蛋白、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、TNF-β、叶酸受体(FOLR)、叶酸、转移、转铁蛋白受体(TfR)、间皮素、Fc受体、c-kit受体、c-kit、整联蛋白(例如α4整联蛋白或β-1整联蛋白)、P-选择素、鞘氨醇-1-磷酸酯受体-1(S1PR)、透明质酸盐受体、白细胞功能抗原-1(LFA-1)、CD4、CD11、CD18、CD20、CD25、CD27、CD52、CD70、CD80、CD85、CD95(Fas受体)、CD106(血管细胞粘附分子1(VCAM1))、CD166(活化白细胞粘附分子(ALCAM))、CD178(Fas配体)、CD253(TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL))、ICOS配体、CCR2、CXCR3、CCR5、CXCL12(基质细胞衍生因子1(SDF-1))、白介素1(IL-1)、IL-1ra、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、CTLA-4、MART-1、gp100、MAGE-1、肝配蛋白(Eph)受体、粘膜地址素细胞粘附分子1(MAdCAM-1)、癌胚抗原(CEA)、Lewis^Y、MUC-1、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、癌抗原125(CA125)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、TAG-72抗原以及它们的片段。

59.根据权利要求55至58中任一项所述的单体化合物或多聚体化合物，其中所述靶向部分是成红细胞白血病病毒癌基因同源物(ErbB)受体。

60.根据权利要求55至58中任一项所述的单体化合物或多聚体化合物，其中所述靶向部分是抗体或抗体片段，或结合细胞表面受体的配体。

61.一种将货物部分递送至细胞的方法，所述方法包含使所述细胞与构建体接触，所述构建体包含引起内吞作用或被内吞的靶向部分，其中所述靶向部分连接至根据权利要求1所述的单体化合物的亲水性结构域或根据权利要求29所述的多聚体单元的一个或多个亲水性结构域，其中所述单体单元或多聚体单元连接至所述货物结构域。

62.根据权利要求61所述的方法，其中所述货物部分为小分子治疗剂、肽、蛋白质、单链寡核苷酸、双链寡核苷酸和蛋白质-寡核苷酸复合物。

63.根据权利要求61所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。

64.根据权利要求63所述的方法，其中所述细胞是癌细胞并且所述货物是抗癌剂。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述抗癌剂是小分子化学治疗剂。

66.根据权利要求64所述的方法，其中所述抗癌剂是生物抗癌剂。

67.根据权利要求61所述的方法，其中所述货物是多核苷酸或寡核苷酸。

68.根据权利要求61所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。

69.根据权利要求61所述的方法，其中所述细胞是干细胞。

70.根据权利要求61所述的方法，其中所述细胞是体细胞。

71.一种化合物，所述化合物包含：

靶向结构域；

货物结构域；

偶联剂结构域；

疏水性结构域或阳离子电荷结构域；

亲水性结构域；

具有第一末端和第二末端的生物可降解接头，其中所述生物可降解接头在所述第一末端连接至所述亲水性结构域，并且在所述第二末端连接至所述疏水性结构域或阳离子电荷结构域，或在所述第二末端连接至任选的第一接头；

具有第一末端和第二末端的所述任选的第一接头，其中所述第一接头在所述第一末端连接至所述偶联剂结构域，并且在所述第二末端连接至所述疏水性结构域或阳离子电荷结构域，或连接至任选的第二接头；

具有第一末端和第二末端的任选的第二接头，其中所述第二接头在所述第一末端连接至所述疏水性结构域或阳离子电荷结构域，并且在所述第二末端连接至所述第一接头；

任选地，具有第一末端和第二末端的第三和/或第四接头，其中所述第一末端连接至所述偶联剂结构域，其中所述第二末端连接至用于固态合成的官能团；

任选地，具有第一末端和第二末端的第五接头，其中所述第一末端连接至所述疏水性结构域或阳离子电荷结构域，其中所述第二末端连接至另外的疏水性结构域或阳离子电荷结构域；

其中所述靶向结构域连接至所述亲水性结构域或所述货物结构域；并且

其中所述货物结构域连接至所述偶联剂结构域。