CN116554198A - 一种具有抗前列腺癌活性的hirsutinolide型倍半萜内酯及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抗前列腺癌活性的hirsutinolide型倍半萜内酯及其制备方法和应用，其具有式(Ⅰ)所示的化合物；其中，R1选自C1～10的烷基。本发明提供的hirsutinolide型倍半萜内酯具有显著的抗前列腺癌细胞增殖活性，其IC50值低。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物技术领域，尤其是涉及一种具有抗前列腺癌活性的hirsutinolide型倍半萜内酯及其制备方法和应用。
背景技术
前列腺癌(Prostate cancer)是发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤。前列腺癌是全世界最常见的男性癌症之一，每年有1,600,000例前列腺癌新发病例。前列腺癌治疗手段包括手术切除，药物治疗搭配等。临床上常用的治疗药物包括甾体和非甾体抗雄激素，例如醋酸环丙孕酮，比卡鲁胺和恩杂鲁胺，但是这几种药物的治疗效果有限，且均有不同的副作用。
因此，有必要开发一种新的抗前列腺癌的化合物。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明第一方面提出一种hirsutinolide型倍半萜内酯，本发明的hirsutinolide型倍半萜内酯具有高抗前列腺癌活性的效果。
本发明第二方面还提供一种hirsutinolide型倍半萜内酯的制备方法。
本发明第三方面还提供一种hirsutinolide型倍半萜内酯的应用。
根据本发明的第一方面实施例提供的一种hirsutinolide型倍半萜内酯或其药学上可接受的盐，具有式(Ⅰ)所示的化合物；
其中，R1选自C1～10的烷基。
根据本发明实施例的hirsutinolide型倍半萜内酯或其药学上可接受的盐，至少具有如下有益效果：
本发明提供的hirsutinolide型倍半萜内酯具有显著的抗前列腺癌细胞增殖活性，其IC50值低。
根据本发明的一些实施例，所述hirsutinolide型倍半萜内酯选自以下结构式中的一种：
根据本发明的第二方面实施例提供上述所述的hirsutinolide型倍半萜内酯的制备方法，包括如下步骤：
S1、将夜香牛粉碎，有机溶剂浸泡提取，提取液过滤、浓缩得到浸膏；
S2、用水分散浸膏后，依次采用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，除去萃取溶剂，分别得到氯仿部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位；
S3、采用正相硅胶的柱层析法对取氯仿部位进行分离，得到9组馏分，分别是Fr1-Fr9；
S4、采用Sephadex LH-20层析除去Fr4中色素，并得到3个部分，分别为Fr4A-Fr4C；
S5、对Fr4B部分利用反相硅胶和半制备HPLC进行纯化，分别得到式(Ⅰ-1)和式(Ⅰ-2)两个化合物。
根据本发明的一些实施例，步骤S1中，采用有机溶剂进行若干次浸泡提取，将若干次提取的提取液合并，过滤、浓缩得到浸膏。
根据本发明的一些实施例，步骤S3中，所述柱层析法的溶剂体系为正己烷：乙酸乙酯(100：1～1：0，v/v)和甲醇。
根据本发明的一些实施例，步骤S3中，所述正相硅胶的粒径为200～300目。
根据本发明的一些实施例，步骤S4中，所述Sephadex LH-20的粒径为100～200目。
根据本发明的一些实施例，步骤S5中，所述半制备HPLC的条件如下：
i流速3～5mL/min；
ii流动相70％-100％乙腈；
iii洗脱时间30min～90min；
ⅳC18色谱柱。
根据本发明的一些实施例，步骤S1中，所述有机溶剂为95％的乙醇。
根据本发明的一些实施例，步骤S2中，所述萃取的次数为3～10次。
本发明第三方面提供上述所述的hirsutinolide型倍半萜内酯在制备治疗和/或预防抗前列腺癌药物中的应用。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例1倍半萜内酯式(Ⅰ-1)化合物的HRESIMS谱图；
图2为本发明实施例1倍半萜内酯式(Ⅰ-1)化合物的IR谱图；
图3为本发明实施例1倍半萜内酯式(Ⅰ-1)化合物的UV谱图；
图4为本发明实施例1制备的倍半萜内酯式(Ⅰ-1)化合物的1H NMR谱图；
图5为本发明实施例1倍半萜内酯式(Ⅰ-1)化合物的13C NMR谱图；
图6为本发明实施例1倍半萜内酯式(Ⅰ-1)化合物的DEPT 135谱图；
图7为本发明实施例1倍半萜内酯式(Ⅰ-1)化合物的HSQC谱图；
图8为本发明实施例1倍半萜内酯式(Ⅰ-1)化合物的1H-1H COSY谱图；
图9为本发明实施例1倍半萜内酯式(Ⅰ-1)化合物的HMBC谱图；
图10为本发明实施例1倍半萜内酯式(Ⅰ-1)化合物的ROESY谱图；
图11为本发明实施例1倍半萜内酯式(Ⅰ-1)化合物的ECD谱图；
图12为本发明实施例1倍半萜内酯式(Ⅰ-2)化合物的HRESIMS谱图；
图13为本发明实施例1倍半萜内酯式(Ⅰ-2)化合物的IR谱图；
图14为本发明实施例1倍半萜内酯式(Ⅰ-2)化合物的UV谱图；
图15为本发明实施例1倍半萜内酯式(Ⅰ-2)化合物的1H NMR谱图；
图16为本发明实施例1倍半萜内酯式(Ⅰ-2)化合物的13C NMR谱图；
图17为本发明实施例1倍半萜内酯式(Ⅰ-2)化合物的DEPT 135谱图；
图18为本发明实施例1倍半萜内酯式(Ⅰ-2)化合物的1H-1H COSY谱图；
图19为本发明实施例1倍半萜内酯式(Ⅰ-2)化合物的HMBC谱图；
图20为本发明实施例1倍半萜内酯式(Ⅰ-2)化合物的HSQC谱图；
图21为本发明实施例1倍半萜内酯式(Ⅰ-2)化合物的ECD谱图；
图22为本发明倍半萜内酯化合物在不同浓度下及紫杉醇(2nM)对前列腺癌细胞(PC-3)的细胞活力影响图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，并结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
本发明所采用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
1.实验仪器
超纯水是采用超纯水机IQ7000制备的。半制备HPLC是在waters1500(Waters,milford,USA)系列上进行的，检测器是waters2489紫外/可见光探测器(Waters,milford,USA)，色谱柱是OBD柱(250×10mm，5μm,milford,USA)。红外数据是采用赛默飞傅里叶转换IS5红外光谱仪(Thermo,Waltham,USA)测试得到的。紫外数据是采用岛津的紫外可见分光光度计UV-2600(Shimadzu,Kyoto,Japan)测试得到的。质谱数据是在AB SCIEXX500R QTOF质谱仪(AB SCIEX,Redwood,USA)上测试得到的。核磁共振数据由BrukerAVANCE NEO 500光谱仪(Bruker,Bremen,Germany)记录，以氘代氯仿为溶剂，化学位移值以氘代氯仿中氯仿的δ(ppm)表示。旋光度是采用色谱甲醇在20℃下通过MCP 200自动偏振计(Anton Paar,Graz,Austria)测定。CD数据是使用Chirascan Spectrometer(AppliedPhotophysics Ltd,Surrey,UK)色谱甲醇作为溶剂测试得到。Series 8000WJ二氧化碳培养箱、37℃恒温水浴锅、酶标仪和生物安全柜均是美国Thermo scientific品牌的。MS205DU电子天平是美国METTLER TOLEDO的。TD5A-WS低速离心机是中国湘仪仪器。
2.实验试剂和填料
质谱和色谱乙腈购自上海泰坦试剂有限公司；超纯水制备被用于HPLC；分子生物级DMSO和噻唑蓝(MTT)购自于美国Sigma-Aldrich，DMEM培养基、PBS缓冲液、青链霉素溶液(双抗)和0.4％台盼蓝溶液购自于美国的Gibco公司，胎牛血清FBS购自于美国BI公司。
柱层析填料包括正相硅胶(200-300，300-400目)采购于青岛海洋化工厂；小孔树脂(100-20/45)购自于美国的Fu Silysia Chemical Ltd；Sephadex LH-20(100-200目)购自于北京索莱宝能生物科技有限公司。硅胶板GF254购自于烟台化学工业研究所。氘代氯仿和色谱级乙腈购自于安耐吉。细胞系购买自美国ATCC。
3.植物来源
夜香牛植物于2022年6月采集于广西省，标本保存在五邑大学马兰芳楼204室。
实施例1
本实施例提供hirsutinolide型倍半萜内酯，结构式如下，制备方法如下：
S1、夜香牛地上部分共30.15kg，经粉碎机粉碎后称重得29.4kg，粉碎损耗0.75kg。第一次使用160L 95％乙醇浸没药材，第二、三次浸泡加入95％乙醇64L，每次浸泡7天，浸泡温度为25℃。过滤后，收集三次浸泡的滤液，采用旋转蒸发仪45℃下蒸干溶剂，得到浸膏2262g，提取率为7.69％。
S2、10L纯水将浸膏混悬、分散，之后用等量氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别萃取5次，除去萃取溶剂，得到氯仿、乙酸乙酯、和正丁醇部位。
S3、取氯仿部位减压蒸馏称重有777.5g。采用正相硅胶(200-300目)4000g干法装柱层析对该部位进行粗步分离，溶剂体系为正己烷：乙酸乙酯(100：1-1：0，v/v)以及甲醇，分成9个部分，Fr1-Fr9。
S4、Fr4(30.5g)存在较多色素，采用Sephadex LH-20凝胶除去部分色素，并根据分子筛原理进行初步分段，体系为二氯甲烷：甲醇(1：1,v/v)，最后分成3个部分，分别为Fr4A-Fr4C。
S5、Fr4B样品利用反相硅胶和半制备HPLC进行纯化和鉴定，得到式(Ⅰ-1)和式(Ⅰ-2)化合物。
结构确证：
式(Ⅰ-1)化合物.无色油状；(c 0.1,CH3OH)；IR(KBr)νmax 3678,2971,1763,1055cm-1；UV(CH3OH)λmax(logε):217(4.32),285nm(4.03)；ECD(c 0.1,CH3OH)λmax(Δε)220(+6.72),292(+3.95)；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.05(d,J＝7.2Hz,1H),6.25(d,J＝8.0Hz,1H),5.89(s,1H),5.11(d,J＝12.9Hz,1H),5.04(d,J＝12.9Hz,1H),3.63(dd,J＝8.8,7.1Hz,1H),3.43(dd,J＝8.8,7.1Hz,1H),2.45(dd,J＝15.8,11.7Hz,1H),2.14(m,1H),2.11(m,1H),2.10(s,3H),1.98(m,1H),1.90(m,1H),1.87(m,1H),1.84(s,3H),1.80(d,J＝7.2Hz,3H),1.48(s,3H),1.20(t,J＝7.1Hz,3H),0.91(d,J＝6.9Hz,3H)；13C NMR(126MHz,CDCl3)δ170.3,167.8,167.3,150.6,146.5,138.5,129.7,128.5,127.1,111.2,80.2,68.4,56.5,55.7,42.6,39.9,36.0,33.2,27.6,20.9,17.0,15.6,14.5,12.0；HRESIMS m/z471.1987[M+Na]+(calcd for C24H32O8Na,471.1989).
式(Ⅰ-2)化合物.无色油状；(c 0.1,CH3OH)；IR(KBr)νmax 3649,2921,1763,1225cm-1；UV(CH3OH)λmax(logε):218(4.32),285nm(4.05)；ECD(c 0.1,CH3OH)λmax(Δε)221(+7.76),292(+6.71)；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.03(d,J＝6.8Hz,1H),6.23(d,J＝8.0Hz,1H),5.86(s,1H),5.07(d,J＝12.9Hz,1H),5.01(d,J＝12.9Hz,1H),3.55(dt,J＝8.8,6.0Hz,1H),3.34(dt,J＝8.8,6.0Hz,1H),2.43(dd,J＝15.8,11.7Hz,1H),2.13(m,1H),2.07(s,3H),2.06(m,1H),1.94(m,1H),1.89(m,1H),1.85(m,1H),1.82(s,3H),1.77(d,J＝6.8Hz,3H),1.73(ddd,J＝15.8,8.0,1.8),1.53(m,2H),1.46(s,3H),1.39(d,J＝7.3Hz,2H),0.92(t,J＝7.3Hz,3H),0.88(d,J＝6.8Hz,3H)；13C NMR(126MHz,CDCl3)δ170.2,167.9,167.3,150.7,146.6,138.5,129.7,128.5,127.1,111.0,80.3,68.4,60.5,55.7,42.9,40.0,36.0,33.1,32.2,27.5,20.9,19.7,17.0,14.5,14.0,12.0；HRESIMS m/z 499.2299[M+Na]+(calcd for C26H36O8Na,499.2302).
式(Ⅰ-1)化合物根据HRESIMS(如图1)的分子离子峰471.1987[M+Na]+(C24H32O8Na的计算值，471.1989)，推测其分子式为C24H32O8，含有9个不饱和度。红外光谱(如图2)表明存在羟基(3678cm-1)、羰基(1763cm-1)和酯基(1055cm-1)官能团。通过在约217，285nm的UV光谱(如图3)处的强带证实了不饱和羰基和共轭内酯的存在。
1H(如图4)和13C NMR(如图5)的归属是通过DEPT(如图6)、HSQC(如图7)、1H-1H COSY(如图8)、和HMBC(如图9)光谱分析确定。δH 7.05(1H，d，J＝7.2Hz)、1.80(3H，d，J＝7.2Hz)和1.84(3H，s)处的特征共振质子信号表明存在tiglate(Tig)基团(δC 167.8、128.6、138.5、14.5和12.0)。δC 167.3、150.6、146.5、129.7的信号表示存在α，β-不饱和γ-内酯环。上述1H和13C NMR数据表明，化合物1是一种hirsutinolide型倍半萜内酯，与8β-(2-Methylacry-loyloxy)-hirsubinolide-13(O)-acetate的1H和13C NMR数据对比可以确定，式(Ⅰ-1)化合物是C-1位被乙氧基取代的hirsutinolide。此推断可由H-2″[δH 1.20(3H，t，J＝7.1Hz)]与H-1″α[δH 3.43(1H，dd，J＝8.8，7.1Hz)]和H-1″β[δH 3.63(1H，dd，J＝8.8，7.1Hz)]的1H-1H COSY相关性以及H-1α″和C-2″(δC 15.6)、C-1(δC 111.2)之间的HMBC相关性证实。
H-3α[δH 1.98(1H，m)]与H-1″α[δH 3.43(1H，dd，J＝8.8，7.1Hz)]、H3-15[δH 1.48
(3H，s)]之间的ROESY相关性(如图10)；H-8[δH 6.25(1H，d，J＝8.0Hz)]和H-9α[δH1.75(1H，ddd，J＝15.8，8.0，1.7Hz)]；H-9β[δH 2.45(1H，dd，J＝15.8，11.7Hz)和H3-14[δH0.91(3H，d，J＝6.9Hz)]表明H-1″α和H3-15是α导向，H3-14处于β取向，H-8和H-10处于α导向，这与夜香牛属天然存在的hirsutinolide型倍半萜内酯一致。且式(Ⅰ-1)化合物的ECD谱(如图11)在220，292nm展示了正Cotton效应与文献一致。因此，式(Ⅰ-1)化合物的相对构型被确定为1S,4R,8S,10R。
式(Ⅰ-2)化合物的HRESIMS(如图12)在m/z 499.2299处显示出分子离子峰[M+Na]+(计算值为499.2301)，对应于分子式C26H36O8，包括九个不饱和度。红外光谱(如图13)表明存在羟基(3649cm-1)、羰基(1763cm-1)和酯基(1225cm-1)官能团。紫外光谱(如图14)在约218、285nm处显示出强宽带，表明存在不饱和羰基和共轭内酯。其1H(如图15)，13C NMR(如图16)的信号归属是基于对化合物的DEPT(如图17)、HSQC(如图18)、1H-1H COSY(如图19)、HMBC(如图20)谱图的全面分析得到的。式(Ⅰ-2)化合物的1D NMR数据与式(Ⅰ-1)化合物的1D NMR相似，除了C-1″[δH 3.34(1H，dt，J＝8.8，6.0Hz)，3.55(1H、dt，J＝8.8，6.0Hz)]，C-2″[δH 1.53(2H,m),δC 32.2],C-3″[δH 1.39(2H,d,J＝7.3Hz),δC 19.7]和C-4″[δH 0.92(3H，t，J＝7.3Hz)，δC 14.0]。推断该化合物是C-1位被丁氧基所取代的hirsutinolide型倍半萜内酯，此推断可通过H-1″α[δH 3.34(1H，dt，J＝8.8，6.0Hz)]和H-1″β[δH 3.55(1H、dt，J＝8.8，6.0Hz]与H2-2″[δH 1.53(2H，m)]，H2-3″[δH 1.39(2H，d，J＝7.3Hz)]和H3-4″[δH 0.92(3H，t，J＝7.3Hz)]的1H-1H COSY相关性以及H-1″和C-1(δC 111.0)之间的HMBC相关性所证实。根据其化合物旋光度、ECD(如图21)数据和核磁数据与式(Ⅰ-1)化合物相似。推断出式(Ⅰ-2)化合物的相对构型与式(Ⅰ-1)化合物的相对构型相同。
实施例2
进行抗前列腺癌活性实验，步骤如下：
(1)实验方法
将PC-3细胞以5×104个细胞/孔的密度接种在96孔细胞板中，并在37℃和5％CO2下孵育24小时。将含有具有一系列浓度梯度的不同化合物的新鲜培养基添加到每个孔中，并在培养箱中培养72小时。然后将200μL MTT溶液(0.5mg/mL)添加到PC-3细胞中4小时。之后，移除旧的培养基，向每个孔中添加150μL二甲基亚砜。在酶标仪中摇晃15分钟后，在570nm处测量光密度。通过GraphPad Prism 8.0软件计算每种化合物的细胞存活率和IC50值。
(2)实验结果
本发明的hirsutinolide型倍半萜内酯具有显著的抗前列腺癌细胞增殖活性(如图22)，式(Ⅰ-1)化合物和式(Ⅰ-2)化合物的IC50值分别为29.9±1.46μM，8.5±0.68μM。
上面结合本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (10)
1.一种hirsutinolide型倍半萜内酯或其药学上可接受的盐，其特征在于，具有式(Ⅰ)所示的化合物；
其中，R1选自C1～10的烷基。
2.根据权利要求1所述的hirsutinolide型倍半萜内酯或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述hirsutinolide型倍半萜内酯选自以下结构式中的一种：
3.根据权利要求1或2所述的hirsutinolide型倍半萜内酯的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将夜香牛粉碎，有机溶剂浸泡提取，提取液过滤、浓缩得到浸膏；
S2、用水分散浸膏后，依次采用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，除去萃取溶剂，分别得到氯仿部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位；
S3、采用正相硅胶的柱层析法对取氯仿部位进行分离，得到9组馏分，分别是Fr1-Fr9；
S4、通过Sephadex LH-20层析法，除去Fr4色素，并得到3个部分，分别为Fr4A-Fr4C；
S5、对Fr4B部分利用反相硅胶和半制备HPLC进行纯化，分别得到式(Ⅰ-1)和式(Ⅰ-2)两个化合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，采用有机溶剂进行若干次浸泡提取，将若干次提取的提取液合并，过滤、浓缩得到浸膏。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述柱层析法的溶剂体系为正己烷：乙酸乙酯(100：1～1：0，v/v)和甲醇。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述正相硅胶的粒径为200～300目。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述Sephadex LH-20的孔径为100目～200目。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中，所述半制备HPLC的条件如下：
i流速3～5mL/min；
ii流动相70％-100％乙腈；
iii洗脱时间30min～90min；
ⅳC18色谱柱。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述有机溶剂为95％的乙醇。
10.权利要求1或2所述的hirsutinolide型倍半萜内酯在制备治疗和/或预防抗前列腺癌药物中的应用。
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