CN116547009A - 用于神经肌肉障碍和神经运动障碍的基因疗法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了筛选能够感染受试者的神经元或其亚区室的腺相关病毒(“AAV”)颗粒的衣壳编码核苷酸序列的方法，所述神经元涉及衍生自诱导多能干细胞或胚胎干细胞的神经元。本发明还提供了AAV衣壳、衣壳编码核苷酸序列、表达载体、病毒颗粒、细胞和试剂盒，其用于在治疗诸如痉挛的神经肌肉障碍或神经运动障碍的方法中使用。从所述方法产生的序列能够产生靶向选择诸如支配肌肉细胞的运动神经元的神经元群体的新的基因疗法，从而提供对于受试者能够是个性化的高特异性。

Description

用于神经肌肉障碍和神经运动障碍的基因疗法

技术领域

本发明总体上涉及用于筛选靶向确定的神经元群体(如运动神经元)的腺相关病毒(“AAV”)衣壳的方法，所述AAV衣壳可以用于开发用以治疗神经肌肉障碍和神经运动障碍(如痉挛)的基因疗法。

背景技术

神经系统障碍和疾病的症状是由脑和脊髓的神经元和回路的异常功能引起的。当前的治疗旨在靶向这种功能障碍，并且包括使用例如深部脑刺激、脊髓刺激或植入装置(如泵)进行局部药物递送的相对较新的功能神经外科领域。这些治疗成功的关键是所植入的装置在神经功能障碍区域中的位置。换句话说，治疗功能障碍的神经元至关重要。

植入装置的替代方案是插入基因来改变神经元的功能，即“基因疗法”。然而，无论是植入装置还是插入遗传物质，都仍然有特异性的问题：在植入装置的地方有许多不同类型的神经元，其全部会受到影响。

替代方案是使用专门针对涉及回路功能障碍的神经元的基因疗法。这可以通过组合三个因素来完成：(a)特定于神经元类型的启动子基因；(b)将遗传物质插入回路中的不同位置，即目的神经元投射的地方，使得此材料被转运回神经元细胞体以改变其功能；以及(c)增强病毒对特定神经元类型的趋向性。

重组腺相关载体(“rAAV”)是用于将遗传物质转移到细胞中的重要载体，并且尤其是在基因疗法应用中使用的主要病毒载体(Li和Sumulski,2020)。目前正在使用几种基于rAAV的基因疗法，如用于治疗脊髓性肌萎缩的Zolgensma和用于治疗视网膜营养不良亚型的Luxtern，并且当前正在临床试验中测试更多的基因疗法。

AAV是属于依赖细小病毒属(dependoparvovirus)的小病毒，含有单链DNA，可达约4.9Kb。AAV基因组含有三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3，其全部由一条mRNA翻译而来。在自然环境下，已经鉴定出多种AAV血清型，每种血清型都具有独特的衣壳基因序列，因此具有不同的趋向性，尽管野生血清型倾向于能够感染多种组织和细胞类型。这些血清型由数字表示：AAV1、AAV2等。

经由DNA重组方法对衣壳序列进行修饰可以产生非天然序列，其具有针对(towards或against)特定细胞或组织的定制特性和趋向性，并且逃避免疫系统(Vandenberghe等人,2009)。通常，可以通过两种方式对衣壳进行修饰，即现有衣壳DNA序列的随机诱变，或通过衣壳改组(即从多个衣壳取DNA序列并随机改组序列的部分以制造新的衣壳；Buning等人,2015)。这些方法产生了大量具有潜在有价值的特性的高度多样化的衣壳。当被包装成功能性病毒体时，可以在动物组织或在细胞培养物中对它们进行筛选，以选择靶向特定组织或细胞的衣壳。然后可以从头产生这些衣壳序列，并且在基因疗法中将其与具有治疗潜力的基因组合。

这种筛选衣壳文库以产生新型基因疗法载体的系统已经在动物中成功应用于AAV9衍生物，其在全身注射后可以穿过血脑屏障并感染神经元。以这种方式产生了诸如PhP.eB(综述于Bedbrook等人,2018中)的rAAV。在此系统中，将rAAV衣壳文库注射到实验动物中，然后收获靶细胞群体(在这种情况下为神经元)并对其进行测序(通过PCR或通过深度测序方法)以鉴定已经感染这些细胞的AAV衣壳的序列。然后可以从头合成这些序列，并且将其用于进一步的实验或在称为定向进化的过程中对其进行进一步轮次的诱变和筛选(以增加进化压力)(参见Li和Sumulski,2020)。这种类型的方法已经用于产生靶向多巴胺能神经元(Davidsson等人,2019)、横纹肌(Yang等人,2009)和视网膜部分(Dalkara等人,2013)的rAAV。也可以使rAAV衣壳进化以减少其对重要器官(如肝脏)的感染(Pulicherla等人,2011)。最后，rAAV衣壳的定向进化也可以用于靶向单独细胞类型的亚区室。例如，使rAAV2-Retro进化以靶向小鼠皮层神经元的突触末梢(Tervo等人,2016)。

体内研究已经表明，AAV衣壳的定向进化可以产生具有有用特性的载体，所述有用特性如穿过血脑屏障的能力和增加的向神经性(Deverman等人,2016和EP3044318B1)或针对多巴胺能神经元(Daviddson等人,2019)或心肌细胞(Yang等人,2009)等(关于综述，参见Li和Sumulski,2020)。定向进化涉及产生衣壳文库，即被经由易错PCR、衣壳改组或两者产生的随机衣壳序列衣壳化的AAV载体的混合物。然后将此文库施加至细胞系(例如Maheshri等人,2006)、未分化干细胞(Asuri等人,2012)，或最常见地在实验动物中施加(例如Devermann等人,2016；Li和Sumulski,2020；专利US8632764B2；US20170166926A1；US9701984B2)。此外，有来自一个小组的初步报告，该小组使用分化成心肌细胞的iPSC来产生向心性AAV。

尽管可以通过多种方式产生AAV衣壳文库，但对这些文库的筛选主要依赖于实验动物的使用。这种产生作为有效基因疗法载体的rAAV的方法的一个主要缺点是鉴定出的衣壳通常特定于动物的物种或甚至品系。因此，在筛选宿主(即小鼠)中开发的衣壳的许多改进的特征和功能不会容易地转移到非人灵长类动物和人中(Hordeaux等人,2018)。这可能代表了工程化衣壳尚未在临床和临床前研究中广泛替代野生型变体的主要原因(Davidsson等人,2019)。

可以如上所述治疗的神经系统障碍或病症的一个例子是痉挛。痉挛是患有多种神经系统障碍的人们所遭受的一种神经系统症状，所述神经系统障碍包括但不限于多发性硬化、卒中、创伤性脑损伤、脊髓损伤和脑瘫。据估计，痉挛影响世界各地约1200万人，其中约22％的患者由于病情而无法工作，几乎所有患者都报告他们的生活质量受到影响，并且约50％的患者报告他们的生活质量受到很大影响。痉挛是由运动神经元使肌肉过度兴奋而引起的，由于所述疾病，肌肉变得“过度兴奋”。

痉挛的当前治疗涉及口服药物(例如巴氯芬)、肌内注射麻痹剂(肉毒杆菌毒素)或手术插入泵以将药物(例如巴氯芬)直接递送到脊髓液中。口服药物通常是不足的，或者人们遭受显著的不良反应。保妥适(Botox)需要终身每年重复施用几次。保妥适通常只注射在有限数量的肌肉中，并且可能会有长期的不良反应。巴氯芬泵在缓解症状方面可以非常有效，然而，它们具有高度侵入性，因为它们需要手术干预来植入并重新填充，这每年发生2-4次，并且它们必须每6-7年更换一次。此外，在泵的6-7年的寿命中，1/3至1/2的患者将需要接受另外的手术来纠正问题。此外，每次手术都有明确的并发症发生率。

因此，迫切需要提供特定于特定神经元以治疗神经肌肉障碍和神经运动障碍(如痉挛)并且能够用于受试者(如人类受试者)的新型基因疗法载体。

具体实施方式

本发明包括设计用于改变靶向神经元的活性的基因疗法。这种治疗的成功需要有效感染(或“转导”)神经元，有时在肌内注射后。据诸位发明人所知，这在先前的治疗/发明的情况下一直是不可能的。在一些优选实施方案中，神经元是运动神经元。在其他优选实施方案中，神经元是感觉神经元、中间神经元或投射神经元。

为了实现这一点，本发明包括这样的技术平台，其基于它们有效感染特定种类的神经元(如运动神经元)的能力来鉴定新型腺相关病毒(AAV)衣壳。此平台使用分化成这些细胞类型的干细胞来筛选AAV衣壳文库，并且使用从这些筛选产生的序列来开发靶向选择神经元群体或其他人细胞或组织的新基因疗法。神经元可以在解剖学上、在功能上或经由基因表达来定义，或者通过参与疾病状态来定义(如帕金森病中的多巴胺能神经元)。

本发明还包括这样的治疗方法，其涉及将包含新型AAV衣壳的AAV注射到受试者的受影响肌肉中；这些AAV然后可以感染运动神经元的末梢，并且被转运到它们的细胞体中，导致外源转基因在支配该肌肉的运动神经元中特异性地表达，提供高特异性(参见图1)。

因此，本发明可以使得能够产生这样的病毒，其在肌内注射后进入运动神经元，随后改变运动神经元中的基因表达，目标是治愈、缓解患有影响运动神经元的疾病的患者的症状和/或提高所述患者的生活质量。

本发明还包括这样的治疗方法，其涉及将包含新型AAV衣壳的AAV注射到受试者的脑或脊髓中；这些AAV然后可以感染受试者的运动神经元、感觉神经元、中间神经元或投射神经元的末梢。

因此，本发明可以使得能够产生这样的病毒，其在颅内或椎管内肌内注射后进入这些神经元，随后改变这些神经元中的基因表达，目标是治愈、缓解患有影响这些神经元的疾病的患者的症状和/或提高所述患者的生活质量。

如上文所讨论，AAV衣壳具有微妙的细胞和物种趋向性水平的潜力，但是当前可用的筛选技术无法利用这种选择性并将其用于治疗益处。

本发明克服了这些缺点，并且允许在衍生自诱导多能干细胞(“iPSC”)或胚胎干细胞(“ESC”)的人细胞中筛选AAV衣壳文库。包括许多神经元亚型在内的人细胞可以在体外从iPSC或ESC衍生而来(Little等人,2019)。由于与在动物神经元中发现的相同细胞相比，这些神经元的遗传组成与人类患者的遗传组成更类似，因此据信，与实验动物相比，它们为筛选AAV文库提供了合适地多得多的底物。在一些实施方案中，神经元是运动神经元。虽然运动神经元可以衍生自人胚胎神经元，但此类神经元的供应有限，并且不是个性化的。相比之下，如在本发明的一些方面所教导的，从iPSC衍生神经元允许更多地供应也可以是个性化的运动神经元。

本发明还包括这样的病毒进化方法，所述病毒进化方法使用衍生自诱导的iPSC和ESC的神经元和体外筛选的组合来鉴定AAV衣壳编码核苷酸序列，其允许AAV衣壳可以经由注射更有效地感染神经元。在一些实施方案中，此方法允许鉴定AAV衣壳编码核苷酸序列，其允许AAV衣壳可以经由肌内注射更有效地感染运动神经元。

本发明还包括这样的技术平台，其通过将iPSC/ESC衍生的细胞培养物与使用微流室相组合来基于它们靶向神经元的单独区室(或亚区室)的能力而鉴定新型腺相关病毒(AAV)衣壳。本文描述了此技术平台的示例使用，其中可以筛选AAV衣壳文库有效感染运动神经元末梢的能力，但是可以使用所述系统来鉴定靶向许多神经元类型的衣壳。

此外，由于有效感染神经元的衣壳序列可能因受试者而异，因此本发明进一步包括这样的方法，其中可以从个体受试者取皮肤样品，将皮肤样品转化为干细胞，然后转化为神经元，并且使用来自患者的这些神经元来筛选有效的AAV载体，提供个性化的基因疗法方法(参见图2)。

本发明优于其他治疗，因为它可以只需要单次治疗。筛选方法允许发现新型衣壳，因此患者不会对包含它们的病毒颗粒有免疫力。在运动神经元的情况下，据信可以将rAAV递送到任何肌肉中(即甚至在手术室中在麻醉下难以进入肌肉)。衣壳可以具有降低的脱靶效应和并发症，因为注射只能施加至特定的有症状的肌肉。同时，如果有必要，可以向患者反复递送替代衣壳(例如到不同的肌肉)而不会发生免疫介导的排斥反应。

据信，本发明还可以应用于当前几乎没有或没有有效疗法的其他运动神经元障碍，以及应用于为神经系统障碍的起因的其他类型的神经元。

使用本文所述的方法开发的rAAV载体尤其适用于治疗神经肌肉/神经运动障碍，如痉挛、肌萎缩侧索硬化、肌张力障碍，允许经由肌内注射病毒载体而将遗传物质引入运动神经元中。例如，本文公开了本文所述的方法可以如何形成旨在缓解痉挛症状的基因疗法的基础的证明。

然而，本文所定义的筛选方法与所治疗的疾病无关，并且可以用于筛选有效靶向许多神经元类型的衣壳序列，因此无论神经元障碍(neuron disorder或“neuronaldisorder”)如何，在基因疗法方法中都可以是有效的。据诸位发明人所知，当前在文献中没有描述的方法/发明建议在衍生自干细胞的细胞上筛选AAV文库或产生个性化AAV载体以用于基因疗法。

现在将更详细地讨论本发明的一些具体方面。

筛选能够感染受试者的神经元的腺相关病毒(“AAV”)颗粒的衣壳编码核苷酸序列 的方法

在一个方面，本发明提供了筛选能够感染受试者的神经元的腺相关病毒(“AAV”)颗粒的衣壳编码核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(i)提供神经元群体，其中所述神经元衍生自诱导多能干细胞(“iPSC”)或胚胎干细胞(“ESC”)；

(ii)使群体与第一多个(或“文库”)测试AAV颗粒接触；

(iii)分离已经感染神经元的第一多个AAV颗粒；以及

(iv)确定已经感染神经元的第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列。

在另一个方面，本发明提供了筛选能够感染受试者的神经元的特定亚区室的腺相关病毒(“AAV”)颗粒的衣壳编码核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(i)提供神经元群体，其中所述神经元衍生自诱导多能干细胞(“iPSC”)或胚胎干细胞(“ESC”)；

(ii)使群体与第一多个(或“文库”)测试AAV颗粒接触；

(iii)分离已经感染神经元的特定亚区室的第一多个AAV颗粒；以及

(iv)确定已经感染神经元的第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列。

在另一个方面，本发明提供了筛选能够感染受试者的神经元的腺相关病毒(“AAV”)颗粒的衣壳编码核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(i)提供包含神经元的群体，

其中所述神经元衍生自诱导多能干细胞(“iPSC”)或胚胎干细胞(“ESC”)，并且其中所述神经元各自具有第一特定亚区室和第二特定亚区室；

(ii)这样放置所述神经元，使得第一特定亚区室和第二特定亚区室在远端彼此分开；

(iii)使第一特定亚区室与第一多个(或“文库”)测试AAV颗粒接触；

(iv)分离已经感染第二特定亚区室的第一多个AAV颗粒；以及

(v)确定已经感染神经元的第二特定亚区室的第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列。

在此方法中，第二特定亚区室是“靶”亚区室，并且在一些优选实施方案中，它是神经元的细胞体。在一些实施方案中，神经元群体是富集的神经元群体，其中群体内超过80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或者100％的总细胞是神经元。在一些实施方案中，在本文公开的筛选方法中确定的衣壳编码核苷酸序列可以用于进一步轮次的定向进化，以增加进化压力(病毒进化方法)。因此，在一些实施方案中，在确定已经感染神经元或神经元的特定亚区室的第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列之后，筛选方法进一步包括：

(i)使用第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列产生第二多个(或“文库”)测试AAV颗粒；

(ii)重复筛选方法的步骤，以便分离已经感染神经元或神经元的特定亚区室的第二多个AAV颗粒；以及

(iii)确定已经感染神经元或神经元的特定亚区室的第二多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列，

其中与第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列相比，第二多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列在感染神经元或神经元的特定亚区室方面更有效。

AAV颗粒感染神经元或神经元的特定亚区室的有效性可以通过对表达病毒DNA的神经元计数来确定。在一些情况下，多个运动神经元支配相同的靶标，例如在运动神经元的情况下为肌肉，并且可以对已经被AAV颗粒转导的这些神经元的比例计数。AAV颗粒感染神经元或神经元的特定亚区室的有效性也可以通过DNA测序或RT-PCR以查看神经细胞中的病毒DNA的“拷贝数”来确定。这将得到同一细胞被AAV颗粒感染的次数的估计值。

在一些实施方案中，第二多个测试AAV颗粒通过以下中的一种或多种产生：

i)对第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列进行随机诱变；

ii)对第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列进行改组；以及

iii)在第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列的VP1、VP2或VP3的不同区域插入长度为至多25个氨基酸的靶向或随机肽序列。

在一些情况下，神经元的亚区室是神经元细胞体、神经突、轴突或树突。在一些情况下，神经元的亚区室是轴突末梢(或“突触末梢”)。在一些情况下，第二亚区室是神经元细胞体。在一些情况下，在以上步骤(iii)中，在第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列的VP1、VP2或VP3的不同区域插入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸的靶向或随机肽序列。在一些情况下，这些另外的步骤可以重复1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。

在本发明的神经元的亚区室在远端彼此分开的方面，以允许将神经元细胞体和神经突分开的方式培养神经元，使得rAAV文库可以施加至一者而不是另一者(如为了文库筛选的目的，使用微流室将轴突投射和突触末梢与神经元胞体分开)。

在本发明的神经元的亚区室在远端彼此分开的方面，可以将第一特定亚区室和第二特定亚区室分组在一个或多个容器的不同物理区域中。第一特定亚区室和第二特定亚区室可以通过轴突连接。在一些情况下，第一特定亚区室是神经突触末梢，并且第二特定亚区室是神经细胞体。

在本发明的神经元的亚区室在远端彼此分开的方面，可以将第一特定亚区室和第二特定亚区室分组在微流室的一个或多个容器的不同物理区域中。一个或多个容器可以进一步通过微流通道分开。一旦添加到微流室中，神经元便可以进一步生长。微流室可以是AXIS^TM轴突分离装置。

将AAV衣壳文库施加至神经元的一种组分(如轴突、树突、神经突或轴突末梢(或“突触末梢”))并从细胞的另一个区域(如细胞体)收获遗传物质允许鉴定和确定已经经由该特定途径成功感染这些细胞的AAV衣壳序列。

有几种文库变体可以用作起点，所述文库变体可以通过确定来自AAV的遗传序列并将它们与不同文库的AAV进行比较来评估。此外，可以优化i)将神经元暴露于AAV文库与ii)收获神经元以便分离已经感染神经元的AAV之间的时间(“孵育时间”)。

在一些实施方案中，可以将衍生自iPSC或ESC的多种类型的细胞添加到神经元群体中，以便使AAV衣壳朝向(towards或against)感染这些细胞类型中的一种或多种进化。从所有或一些这些细胞中单独(例如，仅运动神经元)或组合(例如，运动神经元和感觉神经元)收获遗传物质允许确定已经成功感染这些细胞的衣壳序列。

在一些实施方案中，此类另外的细胞可以是骨骼肌细胞、肌细胞或感觉神经元。另外的细胞可以是肌管。另外的细胞也可以是成肌细胞或肌纤维。另外的细胞可以是C2C12细胞。

在一些情况下，iPSC或ESC来源于受试者。在一些情况下，iPSC或ESC来源于受试者的皮肤样品。在一些情况下，iPSC或ESC衍生自受试者的成纤维细胞。在一些情况下，受试者是人类受试者。iPSC和ESC也可以从动物、人类受试者/患者或从细胞库获得。使用来自人类受试者或患者的iPSC筛选AAV衣壳文库允许鉴定感染来自该受试者或患者的神经元或其他细胞的衣壳序列。因此，可以使用此方法在个体化的基础上产生衣壳序列。

在一些情况下，步骤(i)包括从i)iPSC或ii)ESC衍生神经元的步骤。

在一些情况下，所述方法是筛选能够经由肌内注射感染受试者的神经元的腺相关病毒(“AAV”)颗粒的衣壳编码核苷酸序列的方法。

在一些情况下，神经元衍生自iPSC。在一些情况下，神经元衍生自ESC。在一些情况下，人iPSC可以比ESC更容易回收。

如本文所用，术语“神经元”包括神经元及其一个或多个部分(例如，神经元细胞体、轴突或树突)。如本文所用的术语“神经元”表示神经系统细胞，其包括中央细胞体或胞体，以及两种类型的延伸或投射：树突，通常凭此将大部分神经元信号传送给细胞体；和轴突，通常凭此将大部分神经元信号从细胞体传送给效应细胞(如靶神经元或肌肉)。神经元可以将来自组织和器官的信息传送给中枢神经系统(传入神经元或感觉神经元)，并且将来自中枢神经系统的信号传递给效应细胞(传出神经元或运动神经元)。其他神经元(称为中间神经元)连接中枢神经系统(脑和脊髓)内的神经元。其他神经元(称为投射(project或“projection”)神经元)将其轴突从神经系统的一个区域延伸到另一个区域。本文公开的筛选方法可以用于筛选能够感染此类神经元的腺相关病毒(“AAV”)颗粒的衣壳编码核苷酸序列。在一些优选实施方案中，神经元是运动神经元。在其他优选实施方案中，神经元是感觉神经元、中间神经元或投射神经元。

此外，如上文所体积，据信上述筛选方法可以用于筛选能够感染其他细胞类型(如感觉神经元、基底神经节投射神经元、多巴胺能神经元和肌肉组织)的AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列。

在一些情况下，本文所述的筛选方法包括提供多个测试AAV颗粒的步骤，已经例如通过直接肌内注射另外筛选了所述多个测试AAV颗粒感染肌肉细胞的能力。所述另外的筛选可以在筛选颗粒感染神经元的能力之前、之后或并行进行。

本文所述的方法可以在体内或在体外进行。

从人皮肤活检培养成纤维细胞

在一些实施方案中，在本文所述的筛选方法中使用的iPSC来源于人类测试受试者。在一些实施方案中，iPSC衍生自来自受试者的皮肤活检的成纤维细胞的培养物。

先前已经描述了一些允许从皮肤活检培养成纤维细胞的方法(Vangipuram M,Ting D,Kim S,Diaz R,Schüle B.Skin punch biopsy explant culture for derivationof primary human fibroblasts.J Vis Exp.2013；(77):e3779.发表于2013年7月7日.doi:10.3791/3779)。

在一些优选实施方案中，所述方法包括以下步骤中的一个或多个：

-在无菌条件下，将皮肤活检置于具有含有20％胎牛血清(FBS)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)的明胶包被的培养皿中。

-在解剖显微镜下，将活检切成大小约200-500μm的块。将2-3块活检转移到含有DMEM/20％ FBS的新的明胶包被的培养皿中。

-每2天更换一次培养基，直到成纤维细胞汇合。然后可以将细胞胰蛋白酶化，并且转移到新的培养容器中进行扩增。细胞可以在液氮中冷冻，或者可以用于衍生为IPSC。

从成纤维细胞产生IPSC

在一些实施方案中，在本文所述的筛选方法中使用的iPSC来源于人类测试受试者。在一些实施方案中，iPSC衍生自来自受试者的皮肤活检的成纤维细胞的培养物。

可以使用商业试剂盒(如来自ThermoFisher的CytoTune-IPS Sendai重编程试剂盒)将人成纤维细胞衍生为IPSC。进一步的细节可见于https://www.thermofisher.com/ order/catalog/product/A16517#/A16517和https://assets.thermofisher.com/TFS- Assets/LSG/manuals/cytotune_ips_2_0_sendai_reprog_kit_man.pdf。

这使用仙台病毒将山中因子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)引入体细胞类型中。这些因子在胚胎干细胞中高度表达，并且过表达诱导人和小鼠体细胞的多能性(参见Takahashi,K.,Yamanaka,S.A decade of transcription factor-mediatedreprogramming to pluripotency.Nat Rev Mol Cell Biol 17,183–193(2016).https:// doi.org/10.1038/nrm.2016.8)。有几种方法可允许从成纤维细胞产生IPSC，这可以依赖于将这些因子的某种组合引入成纤维细胞中。

在一些优选实施方案中，用于从成纤维细胞产生IPSC的方法包括以下步骤中的一个或多个：

-将成纤维细胞铺板至30％-60％汇合度。

-对于每种因子，按以下感染复数(MOI)完成转导：KOS MOI＝5，hc-Myc MOI＝5，hKlf4 MOI＝3。

-将适当体积的每个仙台病毒施加至成纤维细胞(第0天)，并且将细胞在37℃/5％CO2下孵育过夜。

-翌日(第1天)更换培养基，然后每2天更换一次，直到第7天。

-在第7天，将细胞胰蛋白酶化，计数，并且以约2x10^5个细胞/孔的密度重新铺板在玻连蛋白包被的6孔板上。

-在第8天，将培养基换成Essential 8培养基，此后每天更换一次。在最初转导后3-4周，IPSC集落应当生长到适当的大小。

-手动或通过使用化学离解收获IPSC集落，将其储存在液氮中，或者直接用于衍生为原代细胞类型。

-将iPSC维持在具有Essential 8培养基(Life Technologies)的Geltrex(LifeTechnologies)上，并且在37℃和5％二氧化碳下使用EDTA(Life Technologies，0.5mM)进行传代。在一些情况下，当与其他底物相比时，使用Geltrex可以增加细胞活力。在一些情况下，使用EDTA和Essential 8培养基对产生人IPSC特别有用，其中与其他离解方法相比，EDTA将细胞存活率提高约20％

使iPSC分化成四肢支配运动神经元

在一些实施方案中，使在所述方法中使用的iPSC和ESC分化成体细胞运动神经元。

先前已经在以下文献中描述了一些允许使iPSC或ESC分化成体细胞运动神经元的方法：

Wichterle,H.和Peljto,M.(2008),Differentiation of Mouse Embryonic StemCells to Spinal Motor Neurons.Current Protocols in Stem Cell Biology,5:1H.1.1-1H.1.9.doi:10.1002/9780470151808.sc01h01s5；

Journal of Neuroscience 2004年9月8日,24(36)7848-7858；DOI:10.1523/JNEUROSCI.1972-04.2004；以及

Amoroso MW,Croft GF,Williams DJ等人Accelerated high-yield generationof limb-innervating motor neurons from human stem cells.J Neurosci.2013；33(2):574-586.doi:10.1523/JNEUROSCI.0906-12.2013。

在一些优选实施方案中，允许使iPSC分化成四肢支配运动神经元的方法包括以下步骤中的一个或多个：

-将IPSC维持在由以下组成的培养基中：DMEM:营养混合物F-12(DMEM/F:12；Invitrogen)，具有悬浮的20％ Knockout血清替代品(Invitrogen)、110μMβ-巯基乙醇()、l-谷氨酰胺和非必需氨基酸(NEAA；Invitrogen)以及20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；Invitrogen)，补充有10μM Rho相关激酶抑制剂Y27632(Ascent Scientific)以增强单细胞存活、20ng/ml bFGF(Invitrogen)以增强生长以及10μm SB435142(SB；Sigma)和0.2μM LDN193189(LDN；Stemgent)用于神经化、Neurobasal、N2补充剂、B27补充剂和胰岛素。使用分散酶使细胞传代。在一些情况下，使用Neurobasal、N2补充剂、B27补充剂、胰岛素和/或分散酶导致细胞活力得到提高。

-在第0天，将类胚体(EB)转换到神经诱导培养基(具有l-谷氨酰胺；NEAA；青霉素/链霉素；肝素，2μg/ml；N2补充剂的DMEM/F:12(Invitrogen)以及1μM多索啡(Dorsomorphin)(Millipore)、2μM SB431542(Tocris Bioscience)和3μM CHIR99021(Miltenyi Biotec))中。两天后，添加全反式维甲酸(RA；1μm；Sigma)、抗坏血酸(0.4μg/ml；Sigma)和脑源性神经营养因子(10ng/ml；R&D)。在一些情况下，使用1μM多索啡、2μM SB431542和/或3μMCHIR99021导致细胞活力得到提高。

-在第8天，将培养物使用分散酶(GIBCO，1mg/ml)酶促离解，铺板到层粘连蛋白包被的板上，接下来用1μM维甲酸(Sigma)、抗坏血酸(0.4μg/ml；Sigma)和脑源性神经营养因子(10ng/ml；R&D)模式化7天。在一些情况下，此步骤导致细胞活力得到提高。

-在第14天，将脊髓MN前体用0.1μM嘌吗啡胺(Purmorphamine)再处理4天。在一些情况下，此步骤导致细胞活力得到提高。

-在第18天，将基础培养基换成Neurobasal(Invitrogen)，含有先前所有的因子并添加胰岛素样生长因子1(IGF-1)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)和睫状神经营养因子(CNTF)(R&D)加B27(Invitrogen)各10ng/ml以及0.1μM化合物E(Enzo Life Sciences)。在一些情况下，使用0.1μM化合物E导致细胞活力得到提高。

-在再约5天后，将EB用0.05％胰蛋白酶(Invitrogen)离解，铺板到聚赖氨酸/层粘连蛋白包被的盖玻片上，或者直接铺板到微流室的运动神经元区室中(参见图3)以用于在AAV筛选中使用。

使iPSC分化成骨骼肌纤维

在一些优选实施方案中，还将iPSC衍生为骨骼肌细胞(或“骨骼肌纤维”)，可以将其添加到在本文所述的筛选方法中使用的运动神经元群体中。

先前已经在以下文献中描述了一些允许使iPSC分化成肌纤维的方法：

Maffioletti,S.,Gerli,M.,Ragazzi,M.等人Efficient derivation andinducible differentiation of expandable skeletal myogenic cells from human ESand patient-specific iPS cells.Nat Protoc10,941–958(2015).https://doi.org/ 10.1038/nprot.2015.057。

在一些优选实施方案中，允许使iPSC分化成肌纤维的方法包括以下步骤中的一个或多个：

-将离解的IPSC集落在基质胶包被的培养皿上的含有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、0.1mM 2-巯基乙醇的极限必需培养基α中培养

-每天更换一次培养基，持续一周

-当100％汇合时，使用胰蛋白酶将细胞与基质胶分离，并且将其以1.2x10^4个细胞/cm²的密度重新铺板在塑料上。

-可以将细胞扩增和冷冻保存以备将来使用，或者用于成肌分化。

-为了衍生，将细胞以约1x10^5的密度铺板在35mm培养皿中的由含有5％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、50μM 2-巯基乙醇、5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的MegaCell DMEM组成的培养基中。

-在聚凝胺的存在下，以1、10和50的感染复数，用表达成肌细胞决定蛋白1(myoblast determination protein 1，MDP1)的慢病毒感染培养物。

-每天检查细胞，并且根据需要扩增培养物。

-通常在MDP1表达约3天后可辨认出肌管。可以将一些培养物固定，并且测试肌球蛋白重链的表达。

-任选地将剩余的培养物重新铺板到微流室的肌肉区室中(参见图3)。这些肌细胞通常在添加运动神经元后约5-7天被培养到肌肉区室中，此时运动神经元轴突应当已经开始进入肌肉区室。

-任选地将培养物保存约1-3周，以允许添加AAV衣壳文库。

产生AAV文库并将AAV衣壳文库施加至微流室中的神经元

可以通过以下方法产生多样化的衣壳文库：i)对天然存在的衣壳进行随机诱变，ii)对天然存在的衣壳进行改组，iii)在AAV衣壳的VP1、VP2或VP3的不同区域插入长度为至多25个氨基酸的靶向或随机肽序列，或iv)以上的组合。

为了产生文库，将随机化的衣壳序列克隆到含有AAV2反向末端重复(ITR；包装信号)和AAV rep基因的AAV骨架中。在另外的腺病毒基因的存在下，将这些DNA质粒转染到HEK293中，以促进AAV包装。从HEK293细胞和/或培养基中收获AAV病毒体，将其按照标准方法纯化和浓缩(例如Potter等人,2014https://dx.doi.org/10.1038％2Fmtm.2014.34；McClure等人,2011http://dx.doi.org/10.3791/3348)

在一些实施方案中，用于产生AAV文库的方法包括以下步骤中的一个或多个：

-在杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)中稀释纯化并浓缩的AAV文库，并且将其施加至微流体装置的肌肉室。

-在施加后2-10天，通过化学方法(即胰蛋白酶化)或机械方法(细胞刮擦)收获神经元细胞体。

-裂解神经元，并且可以将裂解物提交进行深度测序(如RNAseq)以直接检测在神经元中发现的衣壳序列，或者可以使用裂解物作为PCR模板(使用针对AAV衣壳保守区域的引物)。在对衣壳区域进行PCR后，将DNA片段克隆到DNA载体中，并且提交进行Sanger测序。

-使用保守区域的生物信息学分析从神经元收获的衣壳序列，并且可以从头合成高度富集的衣壳，然后可以对其进行进一步的诱变或重复体外筛选，以通过定向进化增加进化压力。

-定向进化可以重复几轮(约2-5轮)。在体外显示出有效逆向转运的衣壳序列可以用于产生用以在动物或人的体内使用的功能性病毒体。

包含可以导致神经元感染的衣壳序列的rAAV载体

在一个方面，本发明提供了通过本发明的筛选方法鉴定的AAV衣壳。在另一个方面，本发明提供了AAV衣壳编码核苷酸序列，其与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在另一个方面，本发明提供了AAV衣壳编码核苷酸序列，其与SEQ ID NO:11具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在另一个方面，本发明提供了AAV衣壳编码核苷酸序列，其与SEQ ID NO:13具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

在一些情况下，本文公开的核苷酸序列与野生型AAV载体相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个碱基对。

在一些情况下，本文公开的核苷酸序列与SEQ ID NO:13相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个碱基对。在一些情况下，本文公开的核苷酸序列与SEQ ID NO:13相差1-10、2-8或4-6个碱基对。

所述核苷酸可以用于开发涉及这样的病毒的基因疗法，所述病毒在肌内注射后进入神经元，随后改变神经元中的活性和/或基因表达。所述核苷酸也可以用于开发涉及这样的病毒的基因疗法，所述病毒在肌内注射后进入神经元，随后改变神经元中的活性和/或基因表达。

因此，在另一个方面，本发明提供了腺相关病毒(“AAV”)表达载体，其包含通过本发明的筛选方法鉴定的AAV衣壳的衣壳核苷酸序列。在另一个方面，本发明提供了重组腺相关病毒(“AAV”)表达载体，其包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的衣壳编码核苷酸序列。在另一个方面，本发明提供了重组腺相关病毒(“AAV”)表达载体，其包含与SEQ ID NO:11具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的衣壳编码核苷酸序列。在另一个方面，本发明提供了重组腺相关病毒(“AAV”)表达载体，其包含与SEQ ID NO:13具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的衣壳编码核苷酸序列。

在一些实施方案中，表达载体能够改变受试者的靶向运动神经元的活性。在一些实施方案中，表达载体能够经由肌内注射改变受试者的靶向运动神经元的活性。在一些情况下，表达载体可以进一步包含第二衣壳编码核苷酸序列，其能够防止在受试者中调用免疫应答。

表达载体

如本文所用的表达载体是用于在细胞中转移和表达外来遗传物质的DNA分子。此类载体包括可操作地连接至编码待表达蛋白质的基因的启动子序列。“启动子”意指足以指导与其可操作地连接的DNA序列的转录的最小DNA序列。“启动子”还意在涵盖那些足以用于关于细胞类型特异性表达而言可控制的启动子依赖性基因表达的启动子元件；此类元件可以位于天然基因的5'或3'区域中。可替代地，表达载体可以是由于逆转录酶而经历逆转录成DNA的RNA分子。

表达载体还可以包括终止密码子和表达增强子。任何合适的载体、增强子和终止密码子都可以用于从根据本发明的表达载体表达基因产物，如Kv1钾通道。表达载体包括病毒载体，如AAV载体。

一般而言，本领域技术人员能够很好地构建用于重组基因表达的载体和设计方案。可以选择或构建合适的载体，除上述本发明的元件外，其还含有适当的调节序列，包括启动子序列、终止子片段、多腺苷酸化序列、标记基因和适当的其他序列。适用于在细胞中表达多肽的分子生物学技术是本领域熟知的。关于进一步的细节，参见例如MolecularCloning:a Laboratory Manual:第2版,Sambrook等人,1989,Cold Spring HarborLaboratory Press或Current Protocols in Molecular Biology,第二版,Ausubel等人编辑,John Wiley&Sons,(1995和定期增刊)。

本文所用的术语“可操作地连接”包括这样的情况，其中选择的基因和启动子以将基因的表达(即多肽编码)置于启动子的影响或控制下的方式共价连接。因此，如果启动子能够影响基因在细胞中转录成RNA，则启动子可操作地连接至基因。在适当的情况下，所得的RNA转录物然后可以被翻译成所需的蛋白质或多肽。启动子适用于实现可操作地连接的基因在哺乳动物细胞中的表达。优选地，哺乳动物细胞是人细胞。

AAV载体

载体是重组AAV载体。AAV载体是大小相对较小的DNA病毒，其可以以稳定且位点特异性的方式整合到它们感染的细胞的基因组中。它们能够感染广泛的细胞，而不会对细胞生长、形态或分化产生显著影响。已经对AAV基因组进行了克隆、测序和表征。它涵盖大约4700个碱基，并且在每个末端都含有大约145个碱基的反向末端重复(ITR)区域，所述区域用作病毒的复制起点。基因组的剩余部分被分为两个承载衣壳化功能的必要区域：基因组的左侧部分，其含有参与病毒复制和病毒基因表达的rep基因；以及基因组的右侧部分，其含有编码病毒的衣壳蛋白的cap基因。

可以使用本领域的标准方法来制备AAV载体。任何血清型的腺相关病毒都是合适的(参见例如Blacklow,"Parvoviruses and Human Disease"J.R.Pattison编辑(1988)的第165-174页；Rose,Comprehensive Virology 3:1,1974；P.Tattersall"The Evolutionof Parvovirus Taxonomy"in Parvoviruses(J R Kerr,S F Cotmore.M E Bloom,R MLinden,C R Parrish编辑)第5-14页,Hudder Arnold,London,UK(2006)；以及D E Bowles,J E Rabinowitz,R JSamulski"The Genus Dependovirus"(J R Kerr,S F Cotmore.M EBloom,R M Linden,C RParrish编辑)第15-23页,Hudder Arnold,London,UK(2006)，将其公开内容通过引用以其整体特此并入本文)。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利号6,566,118、6,989,264和6995006以及标题为“Methods for Generating High TiterHelper-free Preparation of Recombinant AAV Vectors”的国际专利申请公开号W0/1999/011764，将其的公开内容通过引用以其整体并入本文。

杂合载体的制备描述于例如PCT申请号PCT/US2005/027091中，将其公开内容通过引用以其整体并入本文。已经描述了使用来源于AAV的载体在体外和体内转移基因(参见例如国际专利申请公开号WO 1/18088和WO 93/09239；美国专利号4,797,368、6,596,535和5,139,941；以及欧洲专利号0488528，将其全部通过引用以其整体并入本文)。这些出版物描述了rep和/或cap基因被缺失并被目的基因替代的各种AAV来源的构建体，以及使用这些构建体在体外(转移到培养细胞中)或在体内(直接转移到生物体中)转移目的基因。可以通过以下方式来制备根据本发明的复制缺陷型重组AAV：将含有两侧为两个AAV反向末端重复(ITR)区域的目的核酸序列的质粒以及携带AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒共转染到被人辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系中。然后通过标准技术来纯化产生的AAV重组体。

在一些情形下，用于如本文所述的表达构建体的有用AAV载体包括被衣壳化到病毒颗粒(例如AAV病毒颗粒，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16)中的AAV载体。因此，本公开文本包括包含本文所述的任何载体的重组病毒颗粒(重组是因为它含有重组多核苷酸)。在一些优选实施方案中，AAV病毒颗粒是AAV2。在一些优选实施方案中，AAV病毒颗粒是AAV6。使用AAV6可以导致在肌内注射后运动神经元感染的功效得到提高。

在一些实施方案中，病毒载体含有编码报告蛋白(如荧光蛋白)的序列。在其他实施方案中，病毒载体缺少编码报告蛋白(如荧光蛋白)的序列。

在一些实施方案中，病毒载体另外包含编码病毒包装蛋白和包膜蛋白的基因。

表达载体可以进一步包含rep基因，任选地其中rep基因是AAV2 rep基因。表达载体可以进一步包含cap基因，任选地其中cap基因是AAV2 cap基因。表达载体可以进一步包含反向末端重复，任选地其中反向末端重复是AAV2反向末端重复。表达载体可以进一步包含编码病毒包装蛋白和/或包膜蛋白的基因。表达载体可以进一步包含调节基因，任选地其中调节基因是polyA。

进一步包含转基因的AAV载体

在一些实施方案中，表达载体进一步包含编码转基因产物的转基因，其中转基因产物能够改变受试者的靶向运动神经元的活性。在一些实施方案中，转基因产物能够经由肌内注射改变受试者的靶向运动神经元的活性。

在一些实施方案中，当向受试者施用表达载体时，基因产物能够改变神经元的兴奋性。在一些实施方案中，当向受试者施用表达载体时，基因产物能够降低神经元的超兴奋性。表达载体待携带的转基因取决于患者的症状。例如，在痉挛的情况下，有效载荷可以旨在缓解运动神经元的超兴奋性。在一些实施方案中，由病毒表达的转基因将改变神经元的电特性。这可以包括使用特定的启动子来最初驱动几种不同的转基因之一：简单地抑制神经元兴奋性(例如KCC2、Kv1)或完全阻断突触传递(例如破伤风毒素轻链)的转基因，或对患者口服的低剂量药物有反应使得可以通过剂量调整来控制症状的转基因(例如对例如氯氮平有反应的DREADD hM4Di、对例如uPSEM或伐尼克兰有反应的PSAM4-GlyR)。据诸位发明人所知，当前在文献中没有描述的方法建议肌内基因递送和改变神经元兴奋性的组合来治疗痉挛。

DREADD hM4Di是突变的毒蕈碱型乙酰胆碱受体，其可以结合合成配体(如氯氮平-N-氧化物)，导致神经元活性的沉默。KCC2是在神经元中发现的氯化钾转运蛋白，其可以从细胞中挤出氯离子，它们控制神经元的兴奋性。破伤风毒素轻链是破伤风毒素神经毒素的一部分，其可以特异性地切割突触小泡上的蛋白质(VAMP2)。VAMP2的切割防止突触小泡对接和神经递质释放。钾通道(如Kv1)可以特异性地降低神经元的兴奋性。在一些情况下，基因产物改变运动神经元兴奋性的能力可以通过受感染细胞上的电生理记录(膜片钳)来确定。可以记录受感染神经元对注入电流的反应(动作电位的频率)，测量为其频率/电流(f/I)曲线的一个或多个斜率，以便确定其兴奋性。这可以涉及上文列出的配体的剂量-反应曲线。

当向受试者施用表达载体时，转基因产物可以能够抑制神经元兴奋性。在一些实施方案中，转基因或转基因产物是KCC2转基因或转基因产物。作为神经元特异性氯化钾同向转运体的氯化钾转运蛋白成员5(KCC2)负责通过维持低细胞内氯离子浓度来在神经元中建立氯离子梯度。此转运蛋白表达减少的动物表现出严重的运动缺陷、癫痫样活动和痉挛。在一些实施方案中，KCC2转基因与SEQ ID NO:3具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或者KCC2转基因产物与SEQ ID NO:4具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

在一些实施方案中，转基因或转基因产物是Kv1转基因或转基因产物。Kv1钾通道是在系统发生上与果蝇Shaker通道有关的电压门控延迟整流钾通道。电压依赖性钾通道通过响应于电压而打开和关闭钾选择性孔隙来调节兴奋性。在许多情况下，当细胞内颗粒堵塞孔隙时，钾离子流可能会中断，这一过程称为快速失活。Kv1钾通道亚基具有六个推定的跨膜区段，并且构成完整通道的四个Kv1亚基中的每个亚基的第五个区段与第六个区段之间的环形成孔隙。在一些实施方案中，Kv1转基因与SEQ ID NO:5具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或者Kv1转基因产物与SEQ ID NO:6具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

当向受试者施用表达载体时，转基因产物可以能够阻断神经元的突触传递。在一些实施方案中，转基因或转基因产物是破伤风毒素轻链转基因或转基因产物。在一些实施方案中，破伤风毒素轻链转基因与SEQ ID NO:7具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或者破伤风毒素轻链转基因产物与SEQ ID NO:8具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

转基因产物可以是仅由合成配体激活的受体(receptor activated solely by asynthetic ligand，RASSL)或仅由设计药物激活的设计受体(designer receptorexclusively activated by designer drugs，DREADD)。RASSL和DREADD是一类化学基因工程蛋白，其允许在体内对G蛋白信号传导进行时空控制。在一些实施方案中，转基因或转基因产物是hM4Di转基因或转基因产物。在一些实施方案中，hM4Di转基因与SEQ ID NO:7具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或者hM4Di转基因产物与SEQ ID NO:8具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

在一些优选实施方案中，转基因可操作地连接至神经元特异性启动子。

可以以本领域技术人员已知的各种方式来比对和计算氨基酸或核苷酸序列同一性百分比，例如使用可公开获得的计算机软件，如ClustalW 1.82、T-coffee或Megalign(DNASTAR)软件。当使用这种软件时，优选地使用例如关于空位罚分和延伸罚分的默认参数。ClustalW 1.82的默认参数为：蛋白质空位开放罚分＝10.0，蛋白质空位延伸罚分＝0.2，蛋白质矩阵＝Gonnet，蛋白质/DNA ENDGAP＝-1，蛋白质/DNA GAPDIST＝4。

然后可以由多重比对将同一性百分比计算为(N/T)*100，其中N是两个序列共享相同残基的位置的数量，并且T是所比较的位置的总数量。可替代地，可以将同一性百分比计算为(N/S)*100，其中S是所比较的较短序列的长度。氨基酸/多肽/核酸序列可以从头合成，或者可以是天然氨基酸/多肽/核酸序列或其衍生物。

由于遗传密码的简并性，显然任何核酸序列都可以在基本上不影响由此编码的蛋白质的序列的情况下进行变化或改变，以提供其功能变体。合适的核苷酸变体是具有通过在序列内取代编码相同氨基酸的不同密码子从而产生沉默变化而改变的序列的核苷酸变体。其他合适的变体是具有同源核苷酸序列但包含通过以下方式改变的序列的全部或一部分的变体：用与它所取代的氨基酸具有类似的生物物理特性的侧链取代编码氨基酸的不同密码子以产生保守变化。例如，小的非极性疏水性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。大的非极性疏水性氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。

添加转基因产物以改变神经元活性

为了测试可以用于改变神经元活性的各种AAV转基因产物(或“货物”或“有效载荷”)，可以将基因克隆到含有AAV反向末端重复(ITR)以及通用或细胞类型靶向性启动子和常见调节元件(如土拨鼠肝炎病毒翻译后调节元件(Woodchuck post translationalregulatory element)和polyA)的AAV骨架中。

所使用的基因将取决于患者的需求，并且可以属于以下2类之一：(a)不依赖于配体的，其中兴奋性不断减弱；或(b)依赖于配体的，其中神经元兴奋性可以通过服用经批准的药物来调节。

在每个类别内，可以使用电生理技术在该患者的神经元上测试几种基因，以确定该患者的最佳选择。

在一些优选实施方案中，用于添加货物以改变神经元活性的方法可以包括以下步骤中的一个或多个：

-从头合成在本文所述的筛选方法中鉴定的衣壳序列，并且将其插入含有AAV2REP基因(Rep/Cap)的AAV辅助质粒中。

-将Rep/Cap质粒与AAV骨架和含有腺病毒辅助基因(如pHelper)的另外的质粒组合，并且瞬时转染到HEK293细胞中。

-使用标准方法纯化AAV颗粒，并且其可以用于体外或体内实验(例如Potter等人,2014https://dx.doi.org/10.1038％2Fmtm.2014.34；McClure等人,2011http:// dx.doi.org/10.3791/3348)。

病毒颗粒

本发明还包括制备AAV病毒颗粒的体外方法。在一个实施方案中，此方法涉及用如本文所述的病毒载体或表达载体转导哺乳动物细胞并且在细胞中表达颗粒形成所必需的病毒包装蛋白和包膜蛋白，以及在培养基中培养转导的细胞，使得细胞产生释放到培养基中的病毒颗粒。合适的哺乳动物细胞的例子是人胚肾(HEK)293细胞。

可以使用编码病毒颗粒形成和功能所需的所有病毒组分的单一表达载体。然而，很多时候，利用稳定地整合到宿主细胞中的多种质粒表达载体或单独表达盒来分离产生病毒载体颗粒的各种遗传组分。

在一些实施方案中，编码一种或多种病毒包装蛋白和包膜蛋白的表达盒已经被稳定地整合到哺乳动物细胞中。在这些实施方案中，用本文所述的病毒载体转导这些细胞足以导致病毒颗粒的产生，而无需添加其他表达载体。

在其他实施方案中，体外方法涉及使用多种表达载体。在一些实施方案中，所述方法包括用一种或多种编码颗粒形成所必需的病毒包装蛋白和包膜蛋白的表达载体转导哺乳动物细胞。

ssDNA AAV基因组含有两个开放阅读框Rep和Cap，其两侧为两个145个碱基的反向末端重复(ITR)，其对于互补DNA链的合成至关重要。Rep和Cap产生多种蛋白质(Rep78、Rep68、Rep52、Rep40，其是AAV生命周期所需的；以及VP1、VP2、VP3，其是衣壳蛋白)。转基因将被反式插入ITR与Rep和Cap之间。AAV2骨架是常用的，并且描述于Srivastava等人,J.Virol.,45:555-564(1983)中。指导病毒DNA复制(ori)、包装(pkg)和宿主细胞染色体整合(int)的顺式作用序列被包含在ITR内。AAV还需要含有来自腺病毒的基因的辅助质粒。这些基因(E4、E2a和VA)介导AAV复制。pAAV质粒的例子可以质粒编号112865或60958从Addgene(美国马萨诸塞州剑桥)获得。

在病毒颗粒释放后，可以收集包含病毒颗粒的培养基，并且任选地可以从培养基中分离病毒颗粒。任选地，可以浓缩病毒颗粒。

在产生和任选的浓缩后，可以例如通过在-80℃下冷冻来储存病毒颗粒，以准备好通过施用于细胞来使用和/或用于在疗法中使用。

本发明还提供了病毒颗粒，例如通过本文所述的方法产生的病毒颗粒。如本文所用，病毒颗粒包含包装在病毒包膜内的能够感染细胞(例如哺乳动物细胞)的DNA或RNA基因组。病毒颗粒可以是整合酶缺陷型的，例如它可以含有突变整合酶或者含有如本文所述的5'和/或3'LTR的改变。

在另一个方面，本发明提供了由如本文所述的衣壳编码核苷酸序列编码的衣壳。在一些方面，衣壳包含与SEQ ID NO:12、14、15或16具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在另一个方面，本发明提供了病毒颗粒，其包含由如本文所述的衣壳编码核苷酸序列编码的衣壳。在一些方面，衣壳包含与SEQ ID NO:12、14、15或16具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

改善或治疗神经肌肉障碍或神经运动障碍的方法

通过本文所述的筛选方法鉴定的AAV衣壳可以用于开发用以治疗各种病症或障碍的基因疗法。

因此，本发明的一个方面提供了改善或治疗受试者的神经肌肉病症或障碍或者神经运动病症或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗活性量的本发明的AAV表达载体或病毒颗粒。

本发明的另一个方面提供了改善或治疗受试者的神经肌肉障碍或神经运动障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗活性量的本发明的AAV表达载体或病毒颗粒，其中AAV表达载体或病毒颗粒包含通过本发明的筛选方法鉴定的AAV衣壳的衣壳编码核苷酸序列，并且其中在筛选方法中使用的iPSC或ESC来源于所述受试者。在一些实施方案中，在筛选方法中使用的iPSC或ESC来源于受试者的皮肤样品。

因此，在一些实施方案中，AAV衣壳对于受试者将是“个体化的”，并且治疗方法对于所治疗的受试者将是特异性的(“个性化的”)。一种测试从本发明的筛选方法鉴定的AAV衣壳的“个体化”的方式如下：

(i)从一种小鼠品系(例如，C57/Bl6)取IPSC，并且在这些细胞中进行AAV衣壳筛选。

(ii)在已经鉴定出可以感染这些C57/Bl6运动神经元的衣壳的遗传序列后，测试这些所述衣壳对在遗传上相同的小鼠(其他C57/Bl6小鼠)的体内感染或对在遗传上类似的小鼠(例如BALB/c和CD1)的体内感染。这些小鼠品系中的每一种都将接受AAV衣壳的肌肉注射。

(iii)检查每种品系中感染的运动神经元的数量。先前的研究表明，在一种品系中进化的AAV衣壳在其他品系中并不显示出有效的感染(Horeaux等人,2018)。如果对于在本发明的筛选方法中进化的AAV衣壳如此，则这将表明从个体患者进化的AAV衣壳对于基因疗法将是最有效的。

在一些实施方案中，所述方法涉及逆行感染神经元的AAV表达载体或病毒颗粒，为的是将遗传物质递送到神经元中，目的是治疗神经肌肉障碍或神经运动障碍或者影响运动或靶向神经元的障碍，以用于任何治疗目的。

在一些实施方案中，所述方法包括改变受试者的神经元的活性。

在一些实施方案中，肌内递送AAV表达载体或病毒颗粒，以便逆行感染受试者神经元的运动神经元并改变受试者的运动神经元的活性。

如本文所用，“逆向转运”或“逆行感染”意指在轴突末梢(或“突触末梢”)(即，在突触部分)摄取载体，并且通过轴突以与动作电位的传播方向相反的方向(因此是“逆向的”)转运并转运到神经元的细胞体中。随后，病毒核酸可以进入细胞核，在那里它可以被复制并变得具有转录和翻译活性。

当神经元细胞体和或轴突自身不可及，但是它们的末梢投射区域(包括突触)可用于递送遗传载体时，这种递送是有利的。因此，将能够逆向转运的遗传载体成功递送到这种末梢投射区域中将导致逆向转运和脆弱的投射神经元的感染。

一旦病毒被转运到神经元的细胞体中，病毒核酸便通常定位到细胞的细胞核中。根据本发明的一些实施方案，经历逆向转运到神经元细胞体中的腺相关病毒颗粒可以将其核酸内容物直接插入细胞核中。

本发明的实施方案涉及递送具有异源目的基因的基本上无毒的重组腺相关病毒载体，以便向神经元细胞体提供逆向基因递送，导致基因表达。

许多不同的神经系统疾病通过其对运动的影响而损害生活质量。从神经系统到肌肉的最终共同路径可能是运动神经元的路径，并且这些神经元在许多不同的障碍中受到影响，其中只有一些被分类为“运动神经元疾病”。在一些实施方案中，本发明的AAV表达载体能够通过以下方式治疗神经肌肉障碍或神经运动障碍：在肌内注射后进入运动神经元，随后改变运动神经元中的基因表达，导致治愈、缓解患有影响运动神经元的疾病的患者的症状和/或提高所述患者的生活质量。

如本文所用，“神经系统障碍”是指引起神经细胞或神经细胞群体的形态和/或功能异常的障碍。神经系统障碍可能导致受试者的正常神经系统功能受损或缺失或者存在异常的神经系统功能。例如，神经系统障碍可能是疾病、损伤和/或衰老的结果。形态和功能异常的非限制性例子包括神经细胞的物理退化和/或死亡、神经细胞的异常生长模式、神经细胞之间物理连接的异常、神经细胞对一种或多种物质(例如，神经递质)的产生不足或过度、神经细胞不能产生一种或多种它通常产生的物质、物质(例如，神经递质)的产生和/或以异常模式或在异常时间产生或传递电脉冲。

如本文所用，“神经运动障碍”是通常影响运动/大运动能力、姿势和精细运动能力的发育或获得性障碍。所述障碍是由中枢神经系统受损引起的。这可能是由于发育问题或者皮层、基底神经节、丘脑、小脑、脑干、脊髓或周围神经中的运动形成途径受损。在儿童中最常见的神经运动障碍包括脑瘫、肌营养不良和脊柱裂。在成人中最常见的神经运动障碍包括卒中、多发性硬化、帕金森病和创伤性损伤。损害可能是静态的(不会变得更糟)或进行性的。

在一些实施方案中，神经肌肉障碍或神经运动障碍是痉挛。如本文所用，“痉挛”是指某些肌肉连续或异常收缩的病症。这种收缩引起肌肉的僵硬或松紧，并且可能会干扰面部、四肢、躯干和/或括约肌的正常运动，导致例如言语、步态和/或膀胱和肠功能的缺陷。痉挛是在影响脑和/或脊髓功能的CNS的广泛障碍中发生的病症，所述障碍包括例如脑或脊髓的创伤性损伤、多发性硬化、脑瘫、卒中或其他病症。尽管存在潜在的病症，但当运动神经元的特性响应于所述病症而改变并过度产生电脉冲从而导致肌肉收缩过度时，会发生痉挛。损伤引起神经系统与肌肉之间信号平衡的变化，导致肌肉兴奋性增加。在脑和/或脊髓受损或无法正常发育的病症中发现痉挛；这些病症包括脑瘫、多发性硬化、脊髓损伤和包括卒中在内的获得性脑损伤。

已经产生了几种小鼠痉挛模型，并且可以使用这些模型验证本发明的表达载体治疗痉挛的能力。在一个实施方案中，可以如下测试表达载体治疗作为脊髓横断的结果的痉挛的能力(例如参见Yoshizaki等人,2020)：

(i)从在遗传上与用于体内痉挛实验的小鼠相同的小鼠取皮肤活检。

(ii)使用这些活检来产生IPSC，进而产生用于本文所述的AAV衣壳筛选方法的运动神经元，以选择最佳衣壳。

(iii)小鼠在胸腔水平接受脊髓横断。

(iv)通过行为观察(如改良Ashworth量表)或通过将EMG记录装置植入肌肉中来评估痉挛严重程度。

(v)在横断后，将小鼠分为三组：第1组接受使用来源于筛选方法并含有旨在减少运动神经元突触放电的基因的DNA序列的衣壳的AAV的肌内注射。第2组接受具有与第1组相同的衣壳但DNA会表达惰性蛋白(如GFP)的AAV的肌内注射。第3组接受具有含有与第1组相同的DNA序列的野生型衣壳的AAV(AAV6)的肌内注射。

(vi)在AAV肌内注射前后监测痉挛症状的改变。

此实验允许测试体外筛选方法是否产生在运动神经元感染方面比当前可用的AAV衣壳更有效的AAV衣壳(比较第1组和第3组)，以及病毒的DNA货物是否足以减轻痉挛症状(比较第1组和第2组)。

另一种潜在的动物模型是猪。在这种情况下，将从将要用于实验的动物获得皮肤活检，并且以与小鼠相同的方式进行筛选和实验。

在某些方面，本发明还提供了如本文所述的表达载体和病毒颗粒用于制造用以治疗人类或动物受试者的所述神经肌肉障碍或神经运动障碍的药物的用途、用于在治疗人类或动物受试者的所述神经肌肉障碍或神经运动障碍中使用的如本文所述的表达载体以及治疗所述神经肌肉障碍或神经运动障碍的方法，所述方法包括向有需要的个体施用如本文所述的表达载体和病毒颗粒。

施用和剂量

本文所述的病毒颗粒和表达载体可以以多种方式(如肌内、静脉内、颅内或椎管内)递送给受试者。在一些优选实施方案中，本文所述的所述颗粒和表达载体可以经由肌内注射递送给受试者。

特定的施用方法和部位将由医师决定，所述医师还将使用他/她的公知常识和熟练从业者已知的那些技术来选择施用技术。

在施用病毒颗粒后，接受个体可以表现出所治疗的疾病或障碍的症状减轻。例如，对于所治疗的个体，接受个体可以表现出改善的神经元放电、神经递质的突触释放、神经元的存活、生长或连接。

如本文在治疗病症的上下文中所用，术语“治疗”通常是指人的治疗和疗法，其中实现了一些所需的治疗效果(例如，抑制病症的进展)，并且包括降低进展速度、停止进展速度、消退病症、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施的治疗(即，预防、防范)。

可以以治疗有效量递送病毒颗粒。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指当根据所需的治疗方案施用时有效产生一些所需的治疗效果(与合理的效益/风险比相称)的病毒颗粒的量。

类似地，如本文所用的术语“预防有效量”是指当根据所需的治疗方案施用时有效产生一些所需的预防效果(与合理的效益/风险比相称)的病毒颗粒的量。

在本说明书的上下文中的“预防”不应当被理解为描述完全成功，即完全保护或完全防范。在本上下文中的预防而是指在检测到有症状的病症之前施用的措施，目的是通过帮助延迟、减轻或避免该特定病症来保持健康。

虽然可以单独使用(例如，施用)病毒颗粒，但通常优选将其例如与药学上可接受的载体或稀释剂一起作为组合物或配制品提供。在一些情况下，将病毒颗粒与包含腺病毒辅助基因的第二表达载体共施用，任选地其中腺病毒辅助基因是pHelper。

如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适用于在与讨论中的受试者(例如，人)的组织接触中使用而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症(与合理的效益/风险比相称)的化合物、成分、材料、组合物、剂型等。在与配制品的其他成分相容的意义上，每种载体、稀释剂、赋形剂等也必须是“可接受的”。

在一些实施方案中，组合物是包含如本文所述的病毒颗粒(作为唯一活性成分)和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂或者基本上由其组成或者由其组成的药物组合物(例如，配制品、制剂、药物)。

如WO 2008096268中所述，在采用病毒颗粒递送的基因疗法实施方案中，可以按照所施用的病毒颗粒的剂量来计算单位剂量。病毒剂量包括特定数量的病毒颗粒或噬斑形成单位(pfu)。对于涉及腺病毒的实施方案，特定的单位剂量包括10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³或10¹⁴个pfu。由于存在感染缺陷型颗粒，颗粒剂量可能略微更高(10至100倍)。

在一些实施方案中，可以将本发明的方法或治疗与其他疗法(无论是对症的还是改善病情的)组合。

术语“治疗”包括组合治疗和疗法，其中将两种或更多种治疗或疗法例如依序或同时组合。

例如，将用如本文所述的化合物治疗与一种或多种其他(例如，1、2、3、4种)药剂或疗法组合可能是有益的。

基于本文的公开文本，本领域技术人员将知晓联合治疗剂的适当例子。通常，联合治疗剂可以是本领域已知的任何被认为可以在治疗本文所述的疾病中产生治疗效果(受制于所治疗的个体的诊断)的药物。

药剂(即病毒颗粒，加上一种或多种其他药剂)可以同时或依序施用，并且可以按个体变化的剂量方案和经由不同途径施用。例如，当依序施用时，可以以紧密的间隔(例如，在5-10分钟的时间段内)或以更长的间隔(例如，相隔1、2、3、4个或更多个小时，或在必要时相隔甚至更长的时间段)施用药剂，精确的剂量方案与一种或多种治疗剂的特性相称。

试剂盒

本发明还提供了试剂盒，其包含如本文所述的AAV载体和同样本文所述的一种或多种病毒包装表达载体和包膜表达载体。在一些实施方案中，病毒包装表达载体是整合酶缺陷型病毒包装表达载体。

细胞

本发明还提供了细胞，其包含如本文所述的AAV载体。在一些实施方案中，此细胞是哺乳动物细胞，如人细胞。

***

本文的任何子标题仅出于便利而被包括，并不应被解释为以任何方式限制本公开文本。现在将参考以下非限制性附图和实施例进一步描述本发明。本领域技术人员根据这些内容将会想到本发明的其他实施方案。本文引用的所有参考文献的公开内容，因为本领域技术人员可以使用它们来实施本发明，因此通过交叉引用特此具体地并入本文。本申请要求2020年7月16日提交的英国专利申请2010981.5的优先权，将其内容以其整体并入本文。

附图说明

图1

治疗痉挛的治疗方法。将工程化的AAV载体注射到肌肉中感染控制该肌肉的运动神经元的末梢(1)。将病毒转运到脊髓中的运动神经元细胞体，在那里表达基因以缓解症状(2)。

图2

AAV衣壳筛选的示例“个性化方法”的示意图。示出了基因疗法治疗痉挛的潜在途径的示意图。(i)从患者取皮肤样品，(ii)使用样品产生iPS细胞和(iii)运动神经元。(iv)在体外针对这些运动神经元的末梢筛选AAV文库，并且(v)从运动神经元胞体中提取有效的逆行衣壳序列。(vi)使用合成的衣壳序列来在GMP设施中产生含有改变运动神经元活性的基因的AAV，其(vii)用于患者的肌内注射。

图3

运动神经元和肌肉细胞的微流控培养的示意图。

图4

(A)在干细胞衍生的神经元上测定AAV衣壳文库的一般方案。(B)用于AAV文库的先导感染的培养中的胚胎干细胞衍生的运动神经元(在Hb9启动子的控制下表达GFP)。(C)在2.2Kb处示出了衣壳条带的DNA琼脂糖凝胶，从运动神经元中收获DNA并经由PCR扩增

图5

(A)在体外从运动神经元和肌肉重建神经肌肉接头的示例方案。(B)穿过微流室中的中央微通道的神经突过程的荧光图像。(C)示出了延伸、分支和接触肌肉纤维的神经突过程的荧光图像。图A-C取自Mills等人,2018Molecular Metabolism 7:12-22。D)在干细胞衍生的运动神经元和神经肌肉接头的体外模型上筛选AAV衣壳文库的示例策略。

图6

微流体装置设置。

图7

将非逆行AAV限制到轴突区室中。

图8

将AAV衣壳文库施加至微流室的轴突区室并收获/所得衣壳序列的生物信息学。

图9

在微流体装置中生长的运动神经元中的AAVSeqA-tdTomato。

实施例

实施例1-鉴定感染运动神经元的衣壳序列

在干细胞衍生的神经元上测定AAV衣壳文库的一般方案示于图4A中。

使用本公开文本的方法，将AAV文库施加至在Hb9启动子的控制下表达GFP的小鼠胚胎干细胞衍生的运动神经元(图4B)。

如图4C所示，DNA琼脂糖凝胶显示在2.2kb处存在衣壳条带。从运动神经元中收获此DNA。

PCR和Sanger测序的组合将感染这些运动神经元的衣壳序列鉴定为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

预示实施例2-鉴定感染运动神经元的亚区室的衣壳序列

使用本公开文本的方法，可以扩展和调整此过程，使得可以鉴定AAV感染神经元的亚区室(例如，突触末梢或轴突)的能力。例如，可以使运动神经元在将神经元轴突与细胞体分开的微流室中生长。此外，可以将不同的细胞类型(例如神经肌肉接头)添加到此系统中以更接近地再现体内情况(示例方案示于图5A中)。如Mills等人,2018MolecularMetabolism 7:12-22中所述，神经突可以穿过微流室中的中央微通道(图5B和图5C)。

在神经肌肉接头的体外模型中在干细胞衍生的运动神经元上筛选AAV衣壳文库的一般策略示于图5D中。

筛选方法可以包括以下步骤：

i)从动物、人类受试者/患者或从细胞库获得iPSC或ESC(统称为“干细胞”)。在培养中，将这些干细胞衍生为特定种类的神经元或其他细胞(例如运动神经元、感觉神经元、多巴胺能神经元、肌肉组织)。

ii)使这些神经元在将神经元细胞体与其他细胞区室(即神经突、轴突)物理分开的培养系统(即微流室)中生长。

iii)可以将其他细胞类型(例如感觉神经元和肌细胞)添加到培养系统中，使得所述系统更接近地匹配体内环境。

iv)将AAV文库施加至培养系统的一个区室(即含有轴突但不含细胞体的区室)。

v)从单独的区室(例如含有神经元细胞体的区室)收获遗传物质，目的是鉴定已经经由(例如)突触末梢成功感染这些细胞的衣壳序列。

所获得的遗传序列可以进一步用于产生rAAV载体，其将此序列用于衣壳蛋白。这些载体可以用于进一步轮次的定向进化以增加进化压力，或者可以用于基因疗法的开发。

实施例3-在微流体装置中共培养运动神经元和肌肉细胞

在微流体装置中培养的运动神经元通过微流沟发出大量轴突并接触肌管(肌肉细胞)。这些运动神经元可以在培养中维持>一周(图6)。

按照用户手册说明书，将微型装置(Xona Microfluidics SND150)用乙醇消毒，洗涤并附着到玻璃基板上。为每个装置指定运动神经元(MN)培养区室和肌管培养区室。最初在37℃下将两个细胞培养区室用稀释的基质胶包被至少2h。

首先收获并接种作为永生化的小鼠成肌细胞细胞系的C2C12细胞(可从ATCC获得)。将成肌细胞以12x 10⁶个细胞/ml的密度重悬，并且将其用移液管移入肌肉培养区室(12ml)中；每个装置产生144,000个成肌细胞。在24h后，通过添加成肌细胞分化培养基(含有5％马血清的DMEM)开始成肌细胞分化。使成肌细胞分化48h，以形成多核纤维。在成肌细胞分化后，收获运动神经元，并且将其以15x 10⁶个细胞/ml的密度重悬。然后将运动神经元用移液管移入MN区室(12ml)中；每个装置产生180,000个MN。将装置在37℃下孵育2h，以促进细胞附着，然后添加其各自的培养基以填充装置。将20ng/ml的GDNF和BDNF添加到肌肉区室中，与使用20μl的区室之间的体积差的从肌肉区室流动到运动神经元区室的流体组合，导致神经突募集。

图6示出了在基质胶包被的区室中生长并且使轴突延伸通过微沟、分支并接触分化的肌管(右侧)的Hb9-mESC衍生的运动神经元(左侧)的荧光和亮场合并图像。

实施例4-将AAV颗粒限制到轴突室

将非逆行AAV(SEQ ID NO:13/14)施加至肌肉区室仅在肌肉区室中导致AAV感染，证明AAV颗粒并不穿过微流沟(图7)。

图7示出了同一运动神经元-微流体培养物的亮场(图7A)和荧光(图7B)图像。将编码红色荧光蛋白tdTomato的AAV6添加到轴突区室中。轴突区室中的非神经元细胞表达tdTomato，表明它们已经感染AAV。运动神经元区室中的细胞并不表达tdTomato，证明AAV本身并不穿过微流体屏障。

实施例5-在施加AAV衣壳文库后从运动神经元和肌肉细胞中收获衣壳序列

在将AAV衣壳文库施加至微流室的轴突侧后，可以经由PCR从运动神经元(经由逆向转运)和肌管(经由直接感染)中收获突变的衣壳序列。

将AAV6文库施加至微流体装置的肌肉室(图8A)。在施加后七天，通过胰蛋白酶化收获神经元细胞体。裂解神经元，并且将其用作PCR模板(使用针对AAV6衣壳保守区域的引物)。在对衣壳区域进行PCR(图8B)后，将DNA片段克隆到骨架载体中，并且将整个过程重复3次以增加进化压力。将衣壳区域的最终PCR产物克隆到DNA载体中，并且提交进行Sanger测序。使用生物信息学分析结果以得到高度富集的衣壳。在最后一轮中也裂解肌肉细胞，并且将其用作PCR模板(使用相同的特异性引物)，目的是找到运动神经元富集的也感染肌肉细胞的衣壳(图8C和8D)。生物信息学分析显示，当比较运动神经元和肌肉感染时，富集的衣壳上存在一些差异。

图8示出了将AAV衣壳文库施加至微流室的轴突区室并收获/所得衣壳序列的生物信息学。(图8A)实验设计。(图8B)从运动神经元或肌肉细胞收获的DNA上的AAV衣壳的代表性PCR。衣壳以约2Kb的条带指示。(图8C)从运动神经元收获的序列的生物信息学分析。每行是单独的序列，列中的黑线指示与亲本AAV6衣壳序列的差异。(图8D)同(图8C)，除了DNA从肌肉细胞中收获而来。

实施例6-体外测试运动神经元富集的衣壳序列在微流体装置中共培养运动神经 元和肌肉细胞

在生物信息学分析后，选择以更多频率(序列的8％)出现的衣壳，命名为序列A(SEQ ID NO:11/12)。

将序列A衣壳克隆回ITR2-REP2载体中，并且包装到表达td-Tomato荧光标记的AAV中。将AAVSeqA-tdTomato施加至微流体装置的肌肉室。在7天后，进行活体成像(图9)和荧光成像(图9)，显示运动神经元被表达tdTomato荧光标记的新序列A衣壳AAV病毒逆行感染。

图9示出了在微流体装置中生长的运动神经元中的AAVSeqA-tdTomato。被AAVSeqA-tdTomato病毒逆行感染的Hb9-mESC衍生的运动神经元的荧光图像。图9A示出了所有合并的荧光通道的合并图像。图9B示出了tdTomato信号，图9C示出了H9-GFP运动神经元，并且图9D示出了DAPI染色的细胞核。

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序列附录

从ES/iPSC衍生的运动神经元收获的衣壳序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGACTTGAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACGAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGATGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGAGGGTTCTCGAACCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGGTGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAACGTCCGGTAGAGCAGTCGCCACAAGAGCCAGACTCCTCCTCGGGCATTGGCAAGACAGGCCAGCAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTTGGTCAGACTGGCGACTCAGAGTCAGTCCCCGACCCACAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAACCCCCGCTGCTGTGGGACCTACTACAATGGCTTCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAATGCCTCAGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACATGGGCCTTGCCCACCTATAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAGTGCTTCAACGGGGGCCAGCAACGACAACCACTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGATTTCAACAGATTCCACTGCCATTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAATTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATCCAAGTCAAGGAGGTCACGACGAATGATGGCGTCACGACCATCGCTAATAACCTTACCAGCACGGTTCAAGTCTTCTCGGACTCGGAGTACCAGTTGCCGTACGTCCTCGGCTCTGCGCACCAGGGTTGCCTCCCTCCGTCCCCGGCGGACGTGTTCATGATTCCTCAGTACGGCTACCTAACGCTCAACAATGGCAGCCAGGCAGTGGGACGGTCATCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCATCGCAGATGCTGAGAACGGGCAATAACTTTACCTTCAGCTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAGAGCCTGGACCGGCTGATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTATTACCTGAACAGAACTCAGAATCAGTCCGGAAGTGCCCAATACAAGGACTTGCTGTTTAGCCGGGGGTCTCCAGCTGGCATGTCTGTTCAGCCCAAAAACTGGCTACCTGGACCCTGTTACCGGCAGCAGCGCGTTTCTAAAACAAAAACAGACAACAACAACAGCAACTTTACGTGGACTGGTGCTTCAAAATATAACCTTAATGGGCGTGAATCTATAATCAACCCTGGCACTGCTATGGCCTCACACAAAGACGACAAAGACAAGTTCTTTCCCATGAGCGGTGTCATGATTTTTGGAAAGGAGAGCGCGGGAGCTTCAAACACTGCATTGGACAATGTCATGATCACAGACGAAGAGGAAATCAAAGCCACTAACCCCGTGGCCACCGAAAGATTTGGGACTGTGGCAGTCAATCTCCAGAGCAGCAGCACAGACCCTGCGACCGGAGATGTGCATGTTATGGGAGCCTTACCTGGAATGGTGTGGCAAGACAGAGACGTATACCTGCAGGGTCCTATTTGGGCCAAAATTCCTCACACGGATGGACACTTTCACCCGTCTCCTCTCATGGGCGGCTTTGGACTTAAGCACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACGCCTGTTCCTGCGAATCCTCCGGCAGAGTTTTCGGCTACAAAGTTTGCATCATTCATCACCCAGTATTCCACAGGACAAGTGAGCGTGGAGATTGAATGGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAGTGCAGTATACATCTATCTATGCAAAATCTGCCAACGTTGATTTCACTGTGGACAACAATGGACTTTATACTGAGCCTCGCCCCATTGGCACCCGTTACCTCACCCGTCCCCTGTAA

从ES/iPSC衍生的运动神经元收获的衣壳序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGACTTGAAACCTGGAGCCCCGAAACGCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGATGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGAGGGTTCTCGAACCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGGTGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAACGTCCGGTAGAGCAGTCGCCACAAGAGCCAGACTCCTCCTCGGGCATTGGCAAGACAGGCCAGCAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTTGGTCAGACTGGCGACTCAGAGTCAGTCCCCGACCCACAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAACCCCCGCTGCTGTGGGACCTACTACAATGGCTTCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAATGCCTCAGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGATGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACATGGGCCTTGCCCACCTATAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAGTGCTTCAACGGGGGCCAGCAACGACAACCACTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGATTTCAACAGATTCCACTGCCATTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAATTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATCCAAGTCAAGGAGGTCACGACGAATGATGGCGTCACGACCATCGCTAATAACCTTACCAGCACGGTTCAAGTCTTCTCGGACTCGGAGTACCAGTTGCCGTACGTCCTCGGCTCTGCGCACCAGGGCTGCCTCCCTCCGTTCCCGGCGGACGTGTTCATGATTCCGCAGTACGGCTACCAAACGCTCAACAATGGCAGCCAGGCAGTGGGACGGTCATCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCATCGCAGATGCTGAGAACGGGCAATAACTTTACCATCAGCTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAGAGCCTGGACCGGCTGATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTATTACCTGAACAGAACTCAGAATCAGTCCGGAAGTGCCCAAAACAAGGACTTGCTGTTTAGCCGGGGGTCTCCAGCTGGCATGTCTGTTCAGCCCAAAAACTGGCTACCTGGACCGTGTTACCGGCAGCAGCGCGTTTCTAAAACATAAACAGACAACAACAACAGCAACTTTACCTGGACTGGTGCTTCAAAATATAACCTTAATGGGCGTGAATCTATAATCAACCCTGGCACTGCTATGGCCTCACACAAAGACGACAAAGACAAGTTCTTTCCCATGAGCGGTGTCATGATTTTTGGAAAGGAGAGCGCCGGAGCTTCAAACACTGCATTGGACAATGTCATGATCACAGACGAAGAGGAAATCAAAGCCACTAACCCCGTGGCCACCGAAAGATTTGGGACTGTGGCAGTCAATCTCCAGAGCAGCAGCACAGACCCTGCGACCGGAGATGTGCATGTTATGGGAGCCTTACCTGGAATGGCGTGGCAAGACAGAGACGTATACCTGCAGGGTCCTATTTGGGCCAAAATTCCTCACACGGATGGACACTTTCACCCGTCTCCTCTCATGGGCGGCTTTGGACTTAAGCACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACGCCTGTTCCTGCGAATCCTCCGGCAGAGTTTTCGGCTACAAAGTTTGCTTCATTCATCACCCAGTATTCCACAGGACAAGTGAGCGTGGAGATTGAATGGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAGTGCAGTATACATCTAACTATGCAAAATCTGCCAACGTTGATTTCACTGTGGACAACAATGGACTTTATACTGAGCCTCGCCCCATTGGCACCCGTTACCTCACCCGTCCCCTGTAA

KCC2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)

(GenBank：AF208159.1)

ATGCCCAACAACCTGACGGACTGCGAGGACGGCGATGGGGGAGCCAACCCGGGTGATGGCAACCCCAAGGAAAGCAGTCCCTTCATCAACAGCACCGACACAGAGAAGGGAAAGGAGTATGATGGCAAGAACATGGCCTTGTTTGAGGAGGAGATGGACACCAGCCCTATGGTGTCCTCCTTGCTCAGTGGCCTGGCCAACTACACCAACCTGCCCCAGGGAAGTAGGGAGCATGAAGAGGCAGAAAACAATGAGGGTGGAAAAAAGAAGCCGGTGCAGGCCCCACGCATGGGCACCTTCATGGGCGTGTACCTGCCGTGCCTGCAGAACATCTTTGGCGTCATCCTCTTCCTGCGGCTCACCTGGGTGGTGGGCATTGCAGGCATCATGGAGTCCTTCTGCATGGTGTTCATCTGCTGCTCCTGTACGATGCTCACGGCCATCTCCATGAGTGCAATTGCAACGAATGGTGTTGTGCCTGCTGGTGGCTCCTACTACATGATTTCCAGGTCTCTGGGCCCAGAGTTTGGGGGTGCCGTGGGCCTCTGCTTCTACCTGGGCACTACCTTTGCAGGAGCCATGTACATCCTGGGCACCATCGAAATCCTGCTGGCTTACCTCTTCCCAGCCATGGCCATCTTCAAGGCAGAAGATGCCAGTGGGGAGGCAGCAGCCATGCTGAACAACATGCGTGTTTACGGCACCTGTGTGCTCACCTGCATGGCCACTGTGGTGTTTGTGGGTGTCAAGTA

TGTCAACAAGTTTGCCCTTGTCTTCCTGGGTTGTGTCATCCTCTCCATCCTGGCC

ATCTATGCTGGGGTCATCAAGTCTGCCTTCGACCCACCCAACTTCCCGATCTGCC

TCCTGGGTAACCGCACGCTGTCTCGCCATGGCTTTGATGTCTGTGCCAAGCTGG

CTTGGGAAGGAAATGAGACGGTGACCACACGGCTATGGGGCCTTTTCTGCTCCT

CTCGCTTCCTCAACGCCACCTGTGATGAATACTTCACCCGAAACAATGTCACAG

AGATCCAGGGCATCCCTGGTGCTGCCAGTGGCCTCATCAAAGAGAACCTCTGGA

GCTCCTACCTGACCAAGGGCGTGATTGTGGAGAGGAGTGGGATGACCTCGGTG

GGCCTGGCCGATGGCACTCCTATCGACATGGACCACCCTTATGTCTTCAGTGAT

ATGACCTCCTACTTCACCCTGCTGGTTGGCATCTACTTCCCCTCAGTCACAGGGA

TCATGGCTGGTTCTAACCGCTCTGGGGACCTGAGGGATGCCCAGAAGTCAATCC

CCACTGGCACCATCCTGGCCATCGCCACCACCTCTGCTGTCTACATCAGCTCCGT

TGTTCTGTTTGGGGCCTGCATTGAGGGGGTCGTCCTGCGGGACAAGTTTGGCGA

AGCTGTGAATGGCAACCTCGTGGTGGGCACTCTGGCCTGGCCATCTCCATGGGT

AATTGTCATCGGATCCTTCTTCTCCACCTGTGGGCTGGGCTGCAGAGCCTCACG

GGGGCCCCACGCCTGCTGCAGGCCATCTCGAGGGATGGCATTGTGCCCTTCCTG

CAGGTCTTTGGCCATGGCAAGGCCAATGGAGAGCCGACCTGGGCCCTGCTCCTG

ACTGCCTGCATCTGCGAGATTGGCATCCTCATTGCATCCCTCGACGAGGTGGCC

CCCATCCTCTCTATGTTCTTCCTGATGTGCTACATGTTTGTGAATCTGGCCTGTG

CAGTGCAGACGCTGCTGAGGACACCCAACTGGAGGCCACGCTTTCGATATTACC

ACTGGACCCTCTCCTTCCTGGGCATGAGCCTCTGCCTGGCCCTCATGTTCATCTG

CTCCTGGTATTATGCACTGGTAGCCATGCTCATTGCTGGACTCATCTACAAGTAC

ATTGAGTACCGTGGGGCAGAGAAGGAGTGGGGCGATGGGATACGAGGTCTGTC

TCTCAGTGCGGCTCGCTATGCCCTCTTACGCCTGGAGGAAGGGCCCCCACACAC

CAAGAACTGGAGGCCACAGCTGCTGGTGCTGGTGCGTGTGGACCAAGACCAGA

ATGTGGTGCACCCCCAGCTGCTCTCACTGACCTCCCAGCTGAAGGCAGGGAAGG

GCCTGACCATCGTGGGCTCTGTCCTTGAGGGCACCTTTCTGGAAAATCATCCAC

AGGCCCAGCGGGCAGAAGAGTCTATCAGGCGCCTGATGGAGGCAGAGAAGGTG

AAGGGCTTCTGCCAGGTGGTGATCTCCTCCAACTTGCGTGATGGCGTGTCCCAT

CTGATCCAGTCCGGGGGCCTCGGGGGGCTGCAGCACAACACTGTGCTTGTTGGC

TGGCCCCGCAACTGGCGCCAGAAGGAAGATCATCAGACGTGGAGGAACTTCAT

TGAGCTGGTCCGGGAAACCACAGCTGGCCACTTAGCCCTGCTGGTCACCAAGAA

CGTTTCCATGTTTCCTGGGAACCCTGAGCGCTTCTCTGAGGGCAGCATCGACGTT

TGGTGGATTGTGCACGATGGAGGCATGCTCATGCTGCTGCCCTTCCTGCTGCGG

CACCACAAGGTCTGGCGGAAGTGCAAGATGCGTATCTTCACTGTGGCCCAGATG

GATGACAATAGCATCCAGATGAAGAAGGATCTGACCACATTTCTGTATCATTTA

CGCATCACTGCGGAGGTCGAGGTGGTGGAGATGCATGAGAGCGACATCTCAGC

TTACACCTATGAGAAGACGTTGGTGATGGAGCAGCGTTCCCAGATCCTCAAACA

GATGCATTTAACCAAGAATGAGCGGGAGCGGGAGATCCAGAGTATCACAGATG

AGTCACGAGGCTCAATCCGGAGAAAGAATCCAGCCAACACGCGGCTCCGCCTG

AACGTCCCAGAAGAGACGGCTGGTGACAGTGAAGAGAAGCCAGAGGAGGAGG

TGCAGCTGATCCACGATCAGAGTGCTCCCAGCTGCCCCAGCAGCTCCCCGTCCC

CAGGGGAGGAGCCTGAGGGGGAAGGGGAGACAGATCCGGAGAAGGTGCATCT

CACCTGGACCAAGGACAAGTCGGTGGCAGAGAAGAATAAGGGCCCCAGTCCTG

TCTCCTCTGAGGGCATCAAGGACTTCTTCAGCATGAAGCCGGAGTGGGAGAACT

TGAACCAGTCCAACGTGCGGCGCATGCACACGGCCGTGCGGCTGAACGAGGTC

ATCGTGAAGAAATCCCGGGACGCCAAGCTTGTTTTGCTCAACATGCCTGGGCCT

CCCCGCAACCGCAATGGTGATGAAAACTACATGGAGTTTCTCGAGGTCCTCACA

GAGCACCTGGACCGGGTGATGCTGGTCCGCGGTGGTGGCCGAGAGGTCATCAC

CATCTACTCCTGAGAACCAGGTCCTGCCACCCGGGCCCGAGCGCGCCCGGCCCG

CGGCTCCGGAGCCCTCGCCGCGCCCCCCGCCGCTGTCACCGTTTACATACAGAC

CCTGTGCCCGTGTCCTGGCCCCTTACCCCGCTGCCTGAAGCCCGGAGGCCACGC

CTGTTGGGGCTGATTCGGAGAGGGCGCCCCGCCGCGCAGAGACCAGAGCTCCTCAGTGCCAGTTTGGCCCCTGGGTCTTCGCTGCCCTTTTTCTAAGCCCGGCCTCGTCTCGCCGGAGGAGACGCTGCAATAAAGGTTGGGAGAAGGCGCGGAAAGGAGAGGAGCTGGGGCCTTGGGGACCCCCAGGTAGTCCATGCGGCCCATTCCTCCCCTTCCCACTCCCGCCGCGGTCCTCGCTCTGCGCTCCTCCGGCGCTGCTCCCTGGCTCCCGGCGGCCCGGAGGCCCGCGGGGTGGGAAGGCCGCGCTTGCCGTCTCCGCCGCCCCTTCTCGCCGAGCCGTGGGGCGCGGGCGGCCGAGCCTATACATAGTGTACAGGAGACATCGCGTGTATTTTTAACGTCCCCATATTTATGTGACTAGAAGCGCAACAGACTTCTCGCCATAGTCGAGCTCTCCCGCTGGGGGCACTGCGGGGAGGCGAGGCCTCGGGAAGCTGAATTTTCCTTGACGTCCAAGAGTTTGAGAGCGAAAGTGCTTTAGGCCCAGGCGGGGGTCGTGGCCTCGTTCCCTCGACACCTCCGTCCTGCTCTCGCCTCTTCGCCCTTTCCGCGCGCCCTTGGCTTCCCACCCTCCTCTCCAGTCCTTTTCCGAGATGAGGTGAGACAAGGGTCCAACTTTTCCTGGATTCGCCTCCCAGCGGACGTGAGCTTCCACTGCGGCTGCAGAGACGCGAGCAACCTCTTCTCATCGGCTCTTATGCAAGTTGGGGCCAGGATAGGGGAGGGGTGCTCCTCAAGAGGAAGAAACCGAGAGGCCCGCGCCCCACCGAGGAAGCCCCGCCCCGGTGCCTTCGCTGGGGAGCAGGCGTCTCTCCTCAGTCGGCTTGTCGCCTGCTCCCCGTATCCCATGGCTCCTCGCCAAAGACTGAAATTGTGGAGCTGGAGGGCGCCCCCTCCCCGGAGTTTCCTCCCTGGGACAAGTGAGGGAGGAGGGGGCCGATTCTGGTTTAGGGGCCGGACCCACTGAGAGGCCCCAGAGCCGCCCGTGATGTTCCTCCCCCGTCCCCATCTGGCAGCTCCTGTCTCGCCTGAGGGACCCAGCCGCCTTCTCCGTGCTCTGGGGCCGGGCCTCGCTGCTTAGCAGCGGCCTCTAGCTCCGTCTCCCGGGGACCTGGGCCTGAGGGAGGGCTGGAGTCAGCACGCGCTTTGTCCTTAGCGCCTGTCTGCTCTCCTCTAACTAGGACCCAGGGCCTTTGGCTTCCCCAGCTCATCCTTGGCCCTTCCGCTCCACCAGCCTGGTCTGAGGCGTGCTCTGTCCTTAGAGAAGGCGCGGTGGCCGGGTTCCCTTCCCCTAGGGCACATTACTAAGGGGGTCAGGCACTGCATGCTCGTTCCAGCACCATCTGGGACTGGGTACAGTACCTCCAGCCCCAGGGCCCTGACCTGCGCACCTAGCTTGACATCTCACGCACCTCCCAGAGCTGGCGCCACTGAGTAATCCGGACCTCACCACCTCTTTTCCTTTGAGCCCAAGGCAGAGCTAGAGCTGGAGCTGGCGCCACCCAGACAGCGTCAGGTGTGGCTGGGGTAGGTTTGGAGGTCTGCCAGTTACGCCAAGTCCCCTCTGAGATTCGATCAGGGGACTGGATAGATTCTTTCAGGTACTCAATCAGGAAGCTGGAGGTGTTAGACACCAGCCCCCTGCATCCTTCAGTAGACCTCCCTCTGAACACCACAGCCAGGTCCTGCCTTCTGGGGGCCTGAATATTCCAGAGCTGATGTGATGGGCTGTGCAGAAGGGGGCTGTATCAACATCAATTAGGGAACCAAAGTTGCACTATCTGGGCCCAGATTGTCTGGTTGGCAAGAGCAAAGTTTCCGTTGATGAAACAGACATCCCACAACAAAAACCCAAGTTTTCTGTGCTACATGTGCAATATTTGTTATGAATGTTATCACAAGTCATTCATCAAGTTATCTTTATAATCACTGTAGTTAGATGTTTCATGTCCATTCAAGTGACTTTTATTCTGAGTGCAATATTTCAATAGCCTTGTAGTGATAACTAGTGTTGCTTTTGTTTAGATGATCTATGTGCAGGGCAATGCAATGAAGTTGAAACCCCTTGGTAATAGGAGAGGTTGCAAACCAAATCAAGAGTATTTATTACTATTACTGCTATTATTATTAGGCCTGCCTTTAATTTTCAGTGTAAGTGTTCAGTATGCCGCATCCTGCCTCAGTATTGATCTTGTGTTCTTTGTGCCAATATGAAAAGGAGAGGGTTGGTTCTTTCCTTTATTGTTGAATGCTCCCATTTAATGCTTTATGGCTTTTACTGTATTACTTTTTTAGACTCCCGTCTGCACAAAATGCAATAAAAATAATTTTATTATAAAAAAAAAAA

KCC2基因产物的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)

MPNNLTDCEDGDGGANPGDGNPKESSPFINSTDTEKGKEYDGKNMALFEEEMDTSPMVSSLLSGLANYTNLPQGSREHEEAENNEGGKKKPVQAPRMGTFMGVYLPCLQNIFGVILFLRLTWVVGIAGIMESFCMVFICCSCTMLTAISMSAIATNGVVPAGGSYYMISRSLGPEFGGAVGLCFYLGTTFAGAMYILGTIEILLAYLFPAMAIFKAEDASGEAAAMLNNMRVYGTCVLTCMATVVFVGVKYVNKFALVFLGCVILSILAIYAGVIKSAFDPPNFPICLLGNRTLSRHGFDVCAKLAWEGNETVTTRLWGLFCSSRFLNATCDEYFTRNNVTEIQGIPGAASGLIKENLWSSYLTKGVIVERSGMTSVGLADGTPIDMDHPYVFSDMTSYFTLLVGIYFPSVTGIMAGSNRSGDLRDAQKSIPTGTILAIATTSAVYISSVVLFGACIEGVVLRDKFGEAVNGNLVVGTLAWPSPWVIVIGSFFSTCGAGLQSLTGAPRLLQAISRDGIVPFLQVFGHGKANGEPTWALLLTACICEIGILIASLDEVAPILSMFFLMCYMFVNLACAVQTLLRTPNWRPRFRYYHWTLSFLGMSLCLALMFICSWYYALVAMLIAGLIYKYIEYRGAEKEWGDGIRGLSLSAARYALLRLEEGPPHTKNWRPQLLVLVRVDQDQNVVHPQLLSLTSQLKAGKGLTIVGSVLEGTFLENHPQAQRAEESIRRLMEAEKVKGFCQVVISSNLRDGVSHLIQSGGLGGLQHNTVLVGWPRNWRQKEDHQTWRNFIELVRETTAGHLALLVTKNVSMFPGNPERFSEGSIDVWWIVHDGGMLMLLPFLLRHHKVWRKCKMRIFTVAQMDDNSIQMKKDLTTFLYHLRITAEVEVVEMHESDISAYTYEKTLVMEQRSQILKQMHLTKNEREREIQSITDESRGSIRRKNPANTRLRLNVPEETAGDSEEKPEEEVQLIHDQSAPSCPSSSPSPGEEPEGEGETDPEKVHLTWTKDKSVAEKNKGPSPVSSEGIKDFFSMKPEWENLNQSNVRRMHTAVRLNEVIVKKSRDAKLVLLNMPGPPRNRNGDENYMEFLEVLTEHLDRVMLVRGGGREVITIYS

Kv1基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)

(NM_000217XM_001133050)

AGAAATGGACCGAGCGGACCCGCCGCCGCACGCACCCTGCTCCACTCCAAGCTCCTAAGGGCTCCTGGCGCGCCGCGTAGCCTTGGCGAGGTCCGCGCTGGGGTGCGGAGAGCGAAGGGAACTGGAGAGCCATGTAGATCCAGGCTCTCGCCCGCCCGCCTCCTTCGGGATCGAATCAAGGGCTCCCATAGTGTTAGGAGGGGGCGAGAGTGCTGTTTATCGTCATTTGCCTCGGAGCTTCGAGAGAGGGTGGTATTTTGCTTTTCCGCCCCGCATCCTCCGGAACTCCCTGCACCGGAGAGAGGACGGCGTCTCCAGGTTGCTGGCAACCGGTGAGAATGGGGGTAGGGAAGGAACATTTTCGCCGTAGCTGCTCCGTAAAGCGATTGTCCAACTGAGAGGGGCGTCGGACGAGTGGACCAGGGCGGCGAGTTTGCCCGGCGCGTCTCGGATGCTGCTGCGGCGGCCGCCGCGGCTCCCGCCAGGGCACTGCAAAGACGACCTGCCGCATTCCCACTCGGGCTCTCCGCTGACTCAGCACCGCCCCTGCGCCAAGCCAGCCGGCCAGCGTGCATCGATCGCCCTGGTGGGAGCTTAGAAGGCGGCAGGCGAAGAGGGGTAGGAGGGGGGAGAGCCGAGGAGAAGCAGAGAGGGTGGCAGGCGTGGGGATCTGCCGAGCCGGCACTGCACCGGGTCCTAGGAAGGCTCTCGGAGGGGAGGGGAGGCCAGGGCGACCCCCGAAGCAATGGCCCAGTCCGCTAGAACGGCACTGCGTTAAGGCACCTGGGATCAGGAAGAAATATCTAAACAACAACAACAGAAAACCAACAAACCCCCAAACCCAAACCCAACCCTCTGCAAAAAGCTGCACCCGGCCCGCAGGCGAGGGGGATTCCAAACTGAGTGAAAGGCAGGGTGGAGGGGAAGGCAGCGAGAGGCAAAGTCGCAGATCTCCCGACCTGCTCGTGTTGAAGCACCTCCCCCTGGGCGTGAGGGAGACGCGCGCTCCGGTGGGGGGGCCGCTTGGGTCCCCCCCACCCCTGGTCCCTGGCTGCTTCCCACCCCGGGCTCTCTCCTGGCCTCCCACCCCCGCGCCCGGCTTCCACCATGACGGTGATGTCTGGGGAGAACGTGGACGAGGCTTCGGCCGCCCCGGGCCACCCCCAGGATGGCAGCTACCCCCGGCAGGCCGACCACGACGACCACGAGTGCTGCGAGCGCGTGGTGATCAACATCTCCGGGCTGCGCTTCGAGACGCAGCTCAAGACCCTGGCGCAGTTCCCCAACACGCTGCTGGGCAACCCTAAGAAACGCATGCGCTACTTCGACCCCCTGAGGAACGAGTACTTCTTCGACCGCAACCGGCCCAGCTTCGACGCCATCCTCTACTACTACCAGTCCGGCGGCCGCCTGCGGAGGCCGGTCAACGTGCCCCTGGACATGTTCTCCGAGGAGATCAAGTTTTACGAGTTGGGCGAGGAGGCCATGGAGAAGTTCCGGGAGGACGAGGGCTTCATCAAGGAGGAGGAGCGCCCTCTGCCCGAGAAGGAGTACCAGCGCCAGGTGTGGCTGCTCTTCGAGTACCCCGAGAGCTCGGGGCCCGCCAGGGTCATCGCCATCGTCTCCGTCATGGTCATCCTCATCTCCATCGTCATCTTTTGCCTGGAGACGCTCCCCGAGCTGAAGGATGACAAGGACTTCACGGGCACCGTCCACCGCATCGACAACACCACGGTCATCTACAATTCCAACATCTTCACAGACCCCTTCTTCATCGTGGAAACGCTGTGTATCATCTGGTTCTCCTTCGAGCTGGTGGTGCGCTTCTTCGCCTGCCCCAGCAAGACGGACTTCTTCAAAAACATCATGAACTTCATAGACATTGTGGCCATCATTCCTTATTTCATCACGCTGGGCACCGAGATAGCTGAGCAGGAAGGAAACCAGAAGGGCGAGCAGGCCACCTCCCTGGCCATCCTCAG

GGTCATCCGCTTGGTAAGGGTTTTTAGAATCTTCAAGCTCTCCCGCCACTCTAAG

GGCCTCCAGATCCTGGGCCAGACCCTCAAAGCTAGTATGAGAGAGCTAGGGCT

GCTCATCTTTTTCCTCTTCATCGGGGTCATCCTGTTTTCTAGTGCAGTGTACTTTG

CCGAGGCGGAAGAAGCTGAGTCGCACTTCTCCAGTATCCCCGATGCTTTCTGGT

GGGCGGTGGTGTCCATGACCACTGTAGGATACGGTGACATGTACCCTGTGACAA

TTGGAGGCAAGATCGTGGGCTCCTTGTGTGCCATCGCTGGTGTGCTAACAATTG

CCCTGCCCGTACCTGTCATTGTGTCCAATTTCAACTATTTCTACCACCGAGAAAC

TGAGGGGGAAGAGCAGGCTCAGTTGCTCCACGTCAGTTCCCCTAACTTAGCCTC

TGACAGTGACCTCAGTCGCCGCAGTTCCTCTACTATGAGCAAGTCTGAGTACAT

GGAGATCGAAGAGGATATGAATAATAGCATAGCCCATTATAGACAGGTCAATA

TCAGAACTGCCAATTGCACCACTGCTAACCAAAACTGCGTTAATAAGAGCAAGC

TACTGACCGATGTTTAAAAAACAAAGGCAAGCAAACAAAAAAGCCCCACTTAG

CAGCTCAAAAGACTTAAAAAACAAAACAGAAAACCTAGTGACTCATGTCACGC

TTTGTAGATACTTTACTAAGTAGACTTGGAATGCTCTATTTAACTGTCAATGCGT

TGTTGCATTGAGGATTTTGGGGGTGGTGAACCAGAAGCTTTCAAGATCCATGAC

AAAATAAACTATTTTCCTTTTATTAAAAAATGGGAAAAGAGAGAGTATTTTCTA

AAACTGGCTTAAAAAGATTCAGTCCACGAACTAGTCTAGGTAAAATAATAATCA

TATGCTTCCCCAAACTGAAACATTTTTAATGCTTTGGTTTCTTTAACTTTTTTAAA

AACTCAGAACAAGATGATCACTTAGAAATATGAAATTGAAATTCGCATGGGAC

TCCAGTAAAACATCTTTGCAAACTGCGTAGCACATTGAAGACAGTGCATCAGAT

GTATTATATGTAACATGATAGACCAGCCAAAATGGACAATGAATAGATATTTTT

ATTTCGATCAACTGAACTGCATATTACAAGGTGAAAAAAGAAAACTCCGATTAC

TTAAGACTGGTTCACAAAGCACCTTATAAATTGGATACTGGTCCTGATCTGTAG

GGATTTCCCCCTGGGCCCATTCTCTTTCTAATCCAGATTATTCTCTAAGAAAAAG

TTAACTGAATTAAATTAATTGATTCTTCTGCAGTGCCGCTAAATGGTCTCAACTG

CAGATGAGCCAAATACAGGTCTTTTCTCACCAGGCCTGCACTCCGACCCCTGGC

TTTCAGAACTGGATGTAAAACCTTAGCCTCCTTATTGCAAGAGAGCACAAATGA

AGTTAAATGTAAGCATGTTTGAATCTGATACAATTTATTTTATAATCGCATGCTG

AGAAGTTAACCCAGACAATAGGGGATAAGCTTAAGTTGAAATCGATTCTTCTAA

AAATAGATCCTTTTTCATTTGCATTCACCAAAAGTGCACTCCTCCATTTATTAAC

TATTTTATTAGTAAATAAAGTACTGTATTTAAGTGCATATGTTAGTCAGATGGG

AACAATAACTTTTTGGAGCTCAAAGCATGTTCTCTTATTCAGCATTATGGCCTAT

TTGACTAAGATGTACCTTGAATTAATTAATGCATGATTTCAGTAATAAAAATTTT

AAAAGTAATAAAAATTACAAGTCTGTGGGGTGAAAGGCCCAATAGAAATTATG

GGGGGTGGGGGTGGGGGCACTCAGTCAATTTTCCTGCCTTTGCTCAGGGAAATA

CCAGGTTTTTGTGCAGGTATAGGCGGAGAGAGGACCAATATGCCCATCCCTTAA

AGGGAAGCCATGTGAAAAACTCAATAAGTCATCAAAGTACATATAGCAACACC

TAAGAACAAGTATTCTTTCTAGCTGAAGACAAACACAAGCAACACAAACAAGC

AAACAAACAAACAAACAAAAAGGTGCAATACTGCATGTTTTTTGGTGCATTCTT

AGGATGTAAATGAAAATGTTTCTCTATTATATGCATCCGAAGCAGAGCTGATTT

TTTTTTCTTTGCAGTCATTCTTTGAAGTCTGTAGAGACTTCAGCCCTCCCCTTGA

GGCTCCCTGAAGAAACTAAACCAATTGATTTAATAGTTGCTTAGTGCCTTTATCC

TGTACCCACAGTGAACTGTAGAAAGTGCCTCCTTAACACAGCTGAGAAGTTAGG

TAGCAAAAGTGGGGAAGGGTTGGGGCACAGACCTTTTGCTTTTTCTTTTTCCATT

CTCGCTCTCTCATTTCACCACTGTGAGAAGACCACACCACCCTAAACCCTGGAG

AGGAGAGACCCAGGAGGGTGCTGTCTCTCTGGCCATCTACTAGCATTGGTCCCT

TTGACAGCCTGACGCTGGATGTGAACTGAGACCCATCTTTGAACTGGACATGAA

CTGTGAACTTGTTTTTTCCTCTCTCCACCAAAGCCAAGATAAACTTTTTGGGAAT

TTGTTTCCTATCGAGGGCCACTTTGGACACACAAGGCTTCCTCAGGTCCAGTGT

AGTGCTCCTGGCACCTTTCCTTATTTTTTTCTCTGTCGGTAACAGCACTTTGCAA

ATCTCTCTGACGGTCCAGTCTTTTCAGGCATTGTTGTGGATGTGGGAACACTCAG

TTCATAATAACCTTTCCTAGGCCTTCCCTCCTGGTCTACCCCTTTCAGATATTTCC

TGATGCCCCTATGATCTTCCCACCTGGCAGTCACTTCACAGGTTGAACATCTAAC

TTCTGCTGCCCCCCCGTTACCCAGCCCAGAGAATGGTGGGGACCCTGTTCCTGG

CTGAAAGAGAGCCACGGAACACAGGCCTCTGGAGCTCGGCAGCTGCCCACCGG

TGGAGAGGTACTCACAGCCTTTCAAAGGACCCTGAGGTGGGGAATCTTCATTCT

GCACTTAGCATGTGGCTGCCTGTTACCTGACATTCTGGCCCAGCTTCTTCTGAAA

ATCTGTCCTGCTTCTCCCACCCCTTTCCCCCATCCTGTCCTAGAACTAGCAGTGA

GGCAATCACCCTAGAAACTCGAGTTACACCCATTCTGGCTAACTCGATTAAAAG

AAAGAACATGGATATCTTATTTTCCTATGTGACTTTTGTGAATCTGTGAGATGAA

CACAACACACATCGTGGAAGATGAGGGGCCAAGAACTGCGCAGCATCCGACTA

CAGGGCATTAAACCCTCCCATGTGATGTCTCCTTCTCGTCTGAACCTTAACTCAT

TCTGGCGATTCCTTTCCTACTTGCTTAAAAATCCCCAATTAGGAAAAAAATGCC

AACCTCCTCCCAGGCTTGGGGTTATCTTGATCTTTCATTTCAACGTTGAGGTCTA

GTGCACACAGAACTTGAAACACCGCACTCTGTCAACAGCAATAATCCACTCAGT

ACTGTGGGATGGATGGGTTAATGGATGAGAAAACGGCACCAAGACTGACTTTG

GGTATTTGGTATATTTACCGTGGTTACACTCTGGACTGGTTGATTCTTCTGCATG

TGATATAGAAAAAAGTGCTGCATGCGGTGAACCTGTCAGTCTGGGACTGGGGG

TGAGTTGTTGTTATGAGTTTGGGGTGGTGTGAGGAAAGTGAATGCTGCTTAGCT

CATCTGTAGCTCATTGCAATGAATTCAGTAAGAATGGAGTACAGGGATTATCTG

TGTAGCATAGGCATGCAATGTTTGACCAAGCTCTTACCCTCGCACTGTAATGTG

TTGAAATGTCTTTGTAGACCTGAAGGTGCACTTAACAAAACTGCCTATTAAGGG

ATGACTATTTTTTGGTTTACTTATTCATATTTATTTTAGCAGCCTTTTTACCTTTT

CTTCCCCTTCCTAGGCATGGAGCTGTAACAGCTCATGTCCTGACTATGTGTTTTC

TCCAGAAGGAGAAGACTTCTGATGTGCTGATAGCTATAATTCCTCTCTTCCAGT

CTATTGGGGCCCTAGTTCAATAGGGTGGCAATAGAAGAGTTGGTCACACCAGG

GCTGTTAGCCATCCCAGAATCTCTGAAGTGGTTAACTCACCTGAAGTGATCTGA

ATCAGAGAGACCAAAGACATTCATTTCCTCTGTCCTCAGATTTCTAGAAGACAA

ATTCTAGCCAGGAAAACTTTCTGTTTTTGCATCTCCCTTTTCCCATTTGTGCCCA

ACTCCCCTTGCACTCCCTGGAGACTTGAGTTCTGATTTTCAGTTATATCAGCTCA

TTGGGAGTGTGTTCGTGGGTGAGCCTTGCAGAATCAGATAAACCAATAGCAAGT

CCTTCTCCAGGATTCTGGCCAGTGGGCAGTCATTTCCCTGAAATGAATTGTAGG

GCAGGTTTAGATTCCACTATGGTGGACGTGAAGCACAGGTGGTGTCACAATCTT

GATTTGCTTGAGAATTAAAAAAATACATGTAAATGGTAAATGAGGAATACATTT

TTTTAAAGTAGAAATTTGGTTTAGCCTATAAAAGGCCTTCTTCACATTGTGTATA

GTTACACGTTTTTCAAATTAGGTACCATCTAAAAGTCAATAAAAATAGTTTCCT

AGCCCTCTCATTTAATATAGGAGACCTCAAAACACATGCTTTTTAACAATTTTAC

ATTTTAATTCTTAGTTTGGTAGATTGGATTGAAAGAAAGGAGAAAGAACATTAG

CAGAAGGCACTTTCCCATTTTCTTCCAGGAATGACTTATTCCTGGGGTGGTGAG

AATTGGTGGGTGGTAACCATCCATAGTATAAAATTGTTAGAAAGAATATAAACT

GCCAAACAAGCATGTTATCTTCAGGCTTTTCCAAGCAAGAATGAAGTCTTTTGA

TGTTTATGTTCATTTTAAGAAGACAAACAAACTAAAATTTTAAGACCAGACACA

ACCCAAGTTGAATTGTGATCTCAGGAGGTGAACTCTCATTCACCATGTGGCATA

TTACTACCTGTATTTATATCATGGAATTTCAGGGTATATGTGAACATGTCTAGTA

TGACTCAGGTAAACCTTTAAAGAATGTATGTTACTTACCATTTTTGTAAAGAAG

CAAACAGGAGCTGAATTGTTAACCAAAACTGTTCCATTACCTTGGGTCACTGTG

CAAACTAATTCAGGGTACAGATATAAAGTTTAGAAGCCTTGGGATTAAATGCCA

GCCTCTTTGCTCAGGCAAAATGACCCTGGGCTTTCTTGGGAAGTCCAGCATGTA

TGTAAGGGGTGAGGCCCTGCTGACCTCAGGGCTTTTCGCTTTAAGGAGATTAAC

CCTAGTCACAGTGATTTTCATTTAGGAGCTAACTAGGAGTTTACTCTTTATGACG

TGAAACTTCAAAGAGTATAGAAAACTTTTGTACCACAATCAAAGAAGAAGAAA

TGGTGTATGGAAAGAAAACAAAACAAAACAAGAAATCTCTTGTAAAATATTCC

AGGTCAAAGTTGTCTCCTCTCCAAACCTTGCAGAAGCACCTTTCTTCTCTTCAGC

GCACTGTTTTGGGACTGTTTATGCAGCAGATGTAAGTAGACAACATGGACTCCATGTGACATGCCTCTAATAGTAAAGATAAAGTATTACTGAGGTTAAAAATAAAAATTGAGTAGTATTAATTTAAAGTGCACCATCAGGACAACAAACCATTTAAGCTGAAAAAACGCTATTTTATTTCTTGAGTTTGCCAGTTGCTTCCACCTTGAGTTAAGGACGTGTCTCATCTTCACCTACTGCGCATTCTCCCTTCTCTAACTGTGTAATATGTCAGGTCAAGGACATTGAATGTTATGAATTGAGAACCTAATTGATGCGCATAGTTTTCATCTATGCAATTTTACTTGCTTCTGTCACTTTACGATCTGTTCATATTTGGCATCAATTAAAGATACTTTTTAAGGATCTTATCAAGGAA

Kv1基因产物的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)

MTVMSGENVDEASAAPGHPQDGSYPRQADHDDHECCERVVINISGLRFETQLKTLAQFPNTLLGNPKKRMRYFDPLRNEYFFDRNRPSFDAILYYYQSGGRLRRPVNVPLDMFSEEIKFYELGEEAMEKFREDEGFIKEEERPLPEKEYQRQVWLLFEYPESSGPARVIAIVSVMVILISIVIFCLETLPELKDDKDFTGTVHRIDNTTVIYNSNIFTDPFFIVETLCIIWFSFELVVRFFACPSKTDFFKNIMNFIDIVAIIPYFITLGTEIAEQEGNQKGEQATSLAILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGLQILGQTLKASMRELGLLIFFLFIGVILFSSAVYFAEAEEAESHFSSIPDAFWWAVVSMTTVGYGDMYPVTIGGKIVGSLCAIAGVLTIALPVPVIVSNFNYFYHRETEGEEQAQLLHVSSPNLASDSDLSRRSSSTMSKSEYMEIEEDMNNSIAHYRQVNIRTANCTTANQNCVNKSKLLTDV

破伤风毒素轻链基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:7)

(GenBank：L19522.1)

GAATTCGCAATTAAGGAGATAATAGGTATGCCGATCACCATCAACAACTTCCGTTACTCCGACCCGGTTAACAACGACACCATCATCATGATGGAACCGCCGTACTGCAAAGGTCTAGACATCTACTACAAAGCCTTCAAAATCACCGACCGTATCTGGATCGTTCCGGAACGTTACGAATTTGGTACCAAACCGGAAGACTTCAACCCGCCGTCCTCCCTGATCGAAGGTGCTTCCGAATACTACGACCCGAACTACCTGCGTACCGACTCCGACAAAGACCGTTTCCTGCAGACCATGGTTAAACTGTTCAACCGTATCAAAAACAACGTTGCTGGTGAAGCTCTGCTGGACAAAATCATCAACGCTATCCCGTACCTGGGTAACTCCTACTCCCTGCTGGACAAATTCGACACCAACTCCAACTCCGTTTCCTTCAACCTGCTGGAACAGGATCCGTCCGGTGCTACCACCAAATCCGCTATGCTGACCAACCTGATCATCTTCGGTCCGGGTCCGGTTCTGAACAAAAACGAAGTTCGTGGTATCGTTCTGCGTGTTGACAACAAAAACTACTTCCCGTGCCGTGACGGTTTCGGTTCCATCATGCAGATGGCTTTCTGCCCGGAATACGTACCGACCTTCGACAACGTTATCGAAAACATCACCTCCCTGACCATCGGTAAATCCAAATACTTCCAGGACCCGGCTCTGCTGCTGATGCACGAACTGATCCACGTTCTGCACGGTCTGTACGGCATGCAGGTTTCCTCCCACGAAATCATCCCGTCCAAACAGGAAATCTACATGCAGCACACCTACCCGATCTCCGCTGAAGAGCTCTTCACCTTCGGTGGTCAGGACGCTAACCTGATCTCCATCGATATCAAAAACGACCTGTACGAAAAAACCCTGAACGACTACAAAGCTATCGCTAACAAACTGTCCCAGGTTACCTCCTGCAACGACCCGAACATCGACATCGACTCCTACAAACAGATCTATCAGCAGAAGTATCAGTTTGATAAGGATTCCAACGGCCAGTATATAGTGAACGAGGATAAGTTTCAGATACTGTATAACTCCATAATGTATGGCTTTACTGAGATAGAGCTGGGCAAGAAGTTTAACATAAAGACTCGCTTAAGCTATTTTTCCATGAACCACGATCCTGTGAAGATACCTAACCTGCTGGATGATACTATATATAACGATACTGAGGGCTTTAACATAGAGTCCAAGGATCTGAAGTCCGAGTATAAGGGCCAGAACATGAGGGTGAACACTAACGCCTTTAGGAACGTCGACGGTTCCGGTCTGGTTTCCAAACTGATCGGTCTGTGCAAAAAAATCATCCCGCCGACCAACATCCGTGAAAACCTGTACAACCGTACCGCTTAATTTAAAGCAGCTGCGATCGTAACTAAGTAATAAACGGTCGTAACACAACAATTGCATTCCGGGGTTTTATGTTTCAGGTTGGGGGTGGTAAGCTT

破伤风毒素轻链基因产物的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)

MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFNPPSSLIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGNSYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNKNEVRGIVLRVDNKNYFPCRDGFGSIMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALLLMHELIHVLHGLYGMQVSSHEIIPSKQEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIANKLSQVTSCNDPNIDIDSYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTEIELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNTNAFRNVDGSGLVSKLIGLCKKIIPPTNIRENLYNRTA

hM4Di基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:9)

ATGGCCAACTTCACACCTGTCAATGGCAGCTCGGGCAATCAGTCCGTGCGCCTGGTCACGTCATCATCCCACAATCGCTATGAGACGGTGGAAATGGTCTTCATTGCCACAGTGACAGGCTCCCTGAGCCTGGTGACTGTCGTGGGCAACATCCTGGTGATGCTGTCCATCAAGGTCAACAGGCAGCTGCAGACAGTCAACAACTACTTCCTCTTCAGCCTGGCGTGTGCTGATCTCATCATAGGCGCCTTCTCCATGAACCTCTACACCGTGTACATCATCAAGGGCTACTGGCCCCTGGGCGCCGTGGTCTGCGACCTGTGGCTGGCCCTGGACTGCGTGGTGAGCAACGCCTCCGTCATGAACCTTCTCATCATCAGCTTTGACCGCTACTTCTGCGTCACCAAGCCTCTCACCTACCCTGCCCGGCGCACCACCAAGATGGCAGGCCTCATGATTGCTGCTGCCTGGGTACTGTCCTTCGTGCTCTGGGCGCCTGCCATCTTGTTCTGGCAGTTTGTGGTGGGTAAGCGGACGGTGCCCGACAACCAGTGCTTCATCCAGTTCCTGTCCAACCCAGCAGTGACCTTTGGCACAGCCATTGCTGGCTTCTACCTGCCTGTGGTCATCATGACGGTGCTGTACATCCACATCTCCCTGGCCAGTCGCAGCCGAGTCCACAAGCACCGGCCCGAGGGCCCGAAGGAGAAGAAAGCCAAGACGCTGGCCTTCCTCAAGAGCCCACTAATGAAGCAGAGCGTCAAGAAGCCCCCGCCCGGGGAGGCCGCCCGGGAGGAGCTGCGCAATGGCAAGCTGGAGGAGGCCCCCCCGCCAGCGCTGCCACCGCCACCGCGCCCCGTGGCTGATAAGGACACTTCCAATGAGTCCAGCTCAGGCAGTGCCACCCAGAACACCAAGGAACGCCCAGCCACAGAGCTGTCCACCACAGAGGCCACCACGCCCGCCATGCCCGCCCCTCCCCTGCAGCCGCGGGCCCTCAACCCAGCCTCCAGATGGTCCAAGATCCAGATTGTGACGAAGCAGACAGGCAATGAGTGTGTGACAGCCATTGAGATTGTGCCTGCCACGCCGGCTGGCATGCGCCCTGCGGCCAACGTGGCCCGCAAGTTCGCCAGCATCGCTCGCAACCAGGTGCGCAAGAAGCGGCAGATGGCGGCCCGGGAGCGCAAAGTGACACGAACGATCTTTGCCATTCTGCTGGCCTTCATCCTCACCTGGACGCCCTACAACGTCATGGTCCTGGTGAACACCTTCTGCCAGAGCTGCATCCCTGACACGGTGTGGTCCATTGGCTACTGGCTCTGCTACGTCAACAGCACCATCAACCCTGCCTGCTATGCTCTGTGCAACGCCACCTTTAAAAAGACCTTCCGGCACCTGCTGCTGTGCCAGTATCGGAACATCGGCACTGCCAGGCGGGATCCACCGGTC

hM4Di基因产物的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)

MANFTPVNGSSGNQSVRLVTSSSHNRYETVEMVFIATVTGSLSLVTVVGNILVMLSIKVNRQLQTVNNYFLFSLACADLIIGAFSMNLYTVYIIKGYWPLGAVVCDLWLALDCVVSNASVMNLLIISFDRYFCVTKPLTYPARRTTKMAGLMIAAAWVLSFVLWAPAILFWQFVVGKRTVPDNQCFIQFLSNPAVTFGTAIAGFYLPVVIMTVLYIHISLASRSRVHKHRPEGPKEKKAKTLAFLKSPLMKQSVKKPPPGEAAREELRNGKLEEAPPPALPPPPRPVADKDTSNESSSGSATQNTKERPATELSTTEATTPAMPAPPLQPRALNPASRWSKIQIVTKQTGNECVTAIEIVPATPAGMRPAANVARKFASIARNQVRKKRQMAARERKVTRTIFAILLAFILTWTPYNVMVLVNTFCQSCIPDTVWSIGYWLCYVNSTINPACYALCNATFKKTFRHLLLCQYRNIGTARRDPPV

序列A的核苷酸序列(SEQ ID NO:11)

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGACTGGTGGGACTTGAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTTAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGATGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTGTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGAGGGTACTCGAACCTTTTGGTCTGGCTGAGGAAGGTGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAACGTCCGGTAGAGCAGTCGCCACAAGAGCCAGACTCCTCCTCGGGCATTGGCAAGACAGGCCAGCAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTTGGTCAGACCGGCGACTCAGAGTCAGTCCCCGACCCACAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAACCCCCGCTGCTGTGGGACCTACTACAATGGCTTCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAATGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAATGCCTCAGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACATGGGCCTTGCCCACCTATAACAACCACCTCTACAAGGAAATCTCCAGTGCTTCAACGGGGGCCAGCAACGACAACCACTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGATTTCAACAGATTCCACTGCCATTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAATTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATCCAAGTCAAGGAGGTCACGACGAATGATGGCGTCACGACCATCGCTAATAACCTTACCAGCACGGTTCAAGTCTTCTCGGACACGGAATACCAGTTGCCGTACGTCCTCGGCTCTGCGCACCAGGGCTGCCTCCCTCCGTTCCCGGCGGACGTGTTCATGATTCCGCAGTACGGCTACCTAACGCTCAACAATGGCAGCCAGGCAGTGGGACGGTCATCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCATCGCAGATGATGAGAACGGGCAATAACTTTACCTTCAGCTACACATTCGAGGACGCGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAGAGCCTGGACCGGCTGATGAATCCTCTCATCGACCAGTACTTGTATTACCTGAACAGAACTCAGAATCAGTCCGGAAGTGCCCAAAACAAGGACTTGCTGTTTAGCCGGGGGTCTCCAGCTGGCATGTCTGTTCAGCCCAAAAACTGGCTACCTGGACCCTGTTACCGGCAGCAGCGCGTTTCTAAAACAAAAACAGACAACAACAACAGCAACTTTACCTGGACTGGTGCTTCAAAATATAACCTTAATGGGCGTGAATCTATAATCAACCCTGGCACTGCTATGGCCTCACACAAAGACGACAAAGACAAGTTCTTTCCCATGAGCGGTGTCATGATTTTTGGAAAGGAGAGCGCCGGAGCTTCAAACACTGCATTGGACAATGTCATGATCACAGACGAAGAGGAAATCAAAGCCACTAACCCCGTGGCCACCGAAAGATTTGGGACTGTGGCAGTCAATCTCCAGAGCAGCAGCACAGACCCTGCGACCGGAGATGTGCATGTTATGGGAGCCTTACCTGGAATGGTGTGGCAAGACAGAGACGTATACTTGCAGGGTCCTATTTGGGCCAAAATTCCTCACACGGATGGACACTTTCACCCGTCTCCTCTCATGGGCGGCTTTGGACTTAAGCACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACGCCTGTTCCTGCGAATCCTCCGGCAGAGTTTTCGGCTACAAAGTTTGCTTCATTCATCACCCAGTATTCCACAGGACAAGTGAGCGTGGAGATTGAATGGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAGTGCAGTATACATCTAACTATGCAAAATCTGCCAACGTTGATTTCACTGTGGACAACAATGGACTTTATACTGAGCCTCGCCCCATTGGCACCCGTTACCTCACCCGTCCCCTGTAA

序列A的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)

MAADGYLPDWLEDNLSEGIRDWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAECQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPFGLAEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKEISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDTEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMMRTGNNFTFSYTFEDAPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDKDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNLQSSSTDPATGDVHVMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL

AAV6衣壳DNA序列(SEQ ID NO:13)

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGACTTGAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGATGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGAGGGTTCTCGAACCTTTTGGTCTGGTTGAGGAAGGTGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAACGTCCGGTAGAGCAGTCGCCACAAGAGCCAGACTCCTCCTCGGGCATTGGCAAGACAGGCCAGCAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTTGGTCAGACTGGCGACTCAGAGTCAGTCCCCGACCCACAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAACCCCCGCTGCTGTGGGACCTACTACAATGGCTTCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAATGCCTCAGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACATGGGCCTTGCCCACCTATAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAGTGCTTCAACGGGGGCCAGCAACGACAACCACTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGATTTCAACAGATTCCACTGCCATTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAATTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATCCAAGTCAAGGAGGTCACGACGAATGATGGCGTCACGACCATCGCTAATAACCTTACCAGCACGGTTCAAGTCTTCTCGGACTCGGAGTACCAGTTGCCGTACGTCCTCGGCTCTGCGCACCAGGGCTGCCTCCCTCCGTTCCCGGCGGACGTGTTCATGATTCCGCAGTACGGCTACCTAACGCTCAACAATGGCAGCCAGGCAGTGGGACGGTCATCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCATCGCAGATGCTGAGAACGGGCAATAACTTTACCTTCAGCTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAGAGCCTGGACCGGCTGATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTATTACCTGAACAGAACTCAGAATCAGTCCGGAAGTGCCCAAAACAAGGACTTGCTGTTTAGCCGGGGGTCTCCAGCTGGCATGTCTGTTCAGCCCAAAAACTGGCTACCTGGACCCTGTTACCGGCAGCAGCGCGTTTCTAAAACAAAAACAGACAACAACAACAGCAACTTTACCTGGACTGGTGCTTCAAAATATAACCTTAATGGGCGTGAATCTATAATCAACCCTGGCACTGCTATGGCCTCACACAAAGACGACAAAGACAAGTTCTTTCCCATGAGCGGTGTCATGATTTTTGGAAAGGAGAGCGCCGGAGCTTCAAACACTGCATTGGACAATGTCATGATCACAGACGAAGAGGAAATCAAAGCCACTAACCCCGTGGCCACCGAAAGATTTGGGACTGTGGCAGTCAATCTCCAGAGCAGCAGCACAGACCCTGCGACCGGAGATGTGCATGTTATGGGAGCCTTACCTGGAATGGTGTGGCAAGACAGAGACGTATACCTGCAGGGTCCTATTTGGGCCAAAATTCCTCACACGGATGGACACTTTCACCCGTCTCCTCTCATGGGCGGCTTTGGACTTAAGCACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACGCCTGTTCCTGCGAATCCTCCGGCAGAGTTTTCGGCTACAAAGTTTGCTTCATTCATCACCCAGTATTCCACAGGACAAGTGAGCGTGGAGATTGAATGGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAGTGCAGTATACATCTAACTATGCAAAATCTGCCAACGTTGATTTCACTGTGGACAACAATGGACTTTATACTGAGCCTCGCCCCATTGGCACCCGTTACCTCACCCGTCCCCTGTAA

AAV6氨基酸序列(SEQ ID NO:14)

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDKDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNLQSSSTDPATGDVHVMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL

由SEQ ID NO:1编码的衣壳的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANEQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPSPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQYKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDKDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNLQSSSTDPATGDVHVMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSIYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL

由SEQ ID NO:2编码的衣壳的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKRKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYQTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTISYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKT*TDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDKDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNLQSSSTDPATGDVHVMGALPGMAWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL

Claims (32)

1.一种筛选能够感染受试者的神经元的腺相关病毒(“AAV”)颗粒的衣壳编码核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(i)提供神经元群体，其中所述神经元衍生自诱导多能干细胞(“iPSC”)或胚胎干细胞(“ESC”)；

(ii)使所述群体与第一多个测试AAV颗粒接触；

(iii)分离已经感染所述神经元的第一多个AAV颗粒；以及

(iv)确定已经感染所述神经元的所述第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列。

2.一种筛选能够感染受试者的神经元的特定亚区室的腺相关病毒(“AAV”)颗粒的衣壳编码核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(i)提供神经元群体，其中所述神经元衍生自诱导多能干细胞(“iPSC”)或胚胎干细胞(“ESC”)；

(ii)使所述群体与第一多个测试AAV颗粒接触；

(iii)分离已经感染所述神经元的特定亚区室的第一多个AAV颗粒；以及

(iv)确定已经感染所述神经元的所述第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列。

3.一种筛选能够感染受试者的神经元的腺相关病毒(“AAV”)颗粒的衣壳编码核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(i)提供包含神经元的群体，

其中所述神经元衍生自诱导多能干细胞(“iPSC”)或胚胎干细胞(“ESC”)，并且其中所述神经元各自具有第一特定亚区室和第二特定亚区室；

(ii)这样放置所述神经元，使得所述第一特定亚区室和所述第二特定亚区室在远端彼此分开；

(iii)使所述第一特定亚区室与第一多个测试AAV颗粒接触；

(iv)分离已经感染所述第二特定亚区室的第一多个AAV颗粒；以及

(v)确定已经感染神经元的所述第二特定亚区室的所述第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其中：

(a)在步骤(ii)中，将所述第一特定亚区室和所述第二特定亚区室分组在一个或多个容器的不同物理区域中；和/或

(b)将所述第一特定亚区室和所述第二特定亚区室分组在微流室的一个或多个容器的不同物理区域中；和/或

(c)所述第一特定亚区室和所述第二特定亚区室通过轴突连接；和/或

(d)所述一个或多个容器进一步包含骨骼肌细胞和/或肌细胞和/或感觉神经元。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述神经元是运动神经元。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括，在所述确定步骤后：

(i)使用已经感染所述神经元的所述第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列产生第二多个测试AAV颗粒；

(ii)用所述第二多个测试AAV衣壳重复步骤(i)至(iii)，以便分离已经感染所述神经元的第二多个AAV颗粒；以及

(iii)确定已经感染所述神经元的所述第二多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列，其中与所述第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列相比，所述第二多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列在感染所述神经元方面更有效。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第二多个测试AAV颗粒通过以下中的一种或多种产生：

(i)对已经感染所述神经元的所述第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列进行随机诱变；

ii)对已经感染所述神经元的所述第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列进行改组；以及

iii)在已经感染所述神经元的所述第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列的VP1、VP2或VP3的不同区域插入长度为至多25个氨基酸的靶向或随机肽序列。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述iPSC或ESC来源于i)所述受试者，任选地人类受试者；和/或ii)所述受试者的皮肤样品；和/或iii)所述受试者的成纤维细胞。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(i)包括从iPSC或ESC衍生神经元的步骤。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法是筛选能够经由肌内注射感染受试者的神经元的腺相关病毒(“AAV”)颗粒的衣壳编码核苷酸序列的方法。

11.一种通过根据前述权利要求中任一项所述的筛选方法鉴定的腺相关病毒(“AAV”)衣壳编码核苷酸。

12.一种腺相关病毒(“AAV”)衣壳编码核苷酸序列，其与SEQ ID NO:11具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

13.一种腺相关病毒(“AAV”)衣壳编码核苷酸序列，其与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

14.一种重组腺相关病毒(“AAV”)表达载体，其包含根据权利要求11-13中任一项所述的衣壳编码核苷酸序列。

15.根据权利要求14所述的表达载体，其中所述表达载体进一步包含编码转基因产物的转基因，其中当向受试者施用所述表达载体时，所述转基因产物能够改变神经元的兴奋性，任选地其中当向受试者施用所述表达载体时，所述转基因产物能够降低神经元的超兴奋性。

16.根据权利要求15所述的表达载体，其中所述转基因产物：

(a)当向受试者施用所述表达载体时，能够抑制神经元兴奋性；

(b)当向受试者施用所述表达载体时，能够阻断神经元的突触传递；

(c)是仅由合成配体激活的受体(RASSL)；或者

(d)是仅由设计药物激活的设计受体(DREADD)。

17.根据权利要求14-16中任一项所述的表达载体，其中所述转基因或所述转基因产物是：(a)KCC2转基因或转基因产物，任选地其中：

(i)所述KCC2转基因与SEQ ID NO:3具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或者

(ii)所述KCC2转基因产物与SEQ ID NO:4具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或者

(b)Kv1转基因或转基因产物，任选地其中：

(i)所述Kv1转基因与SEQ ID NO:5具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或者

(ii)所述Kv1转基因产物与SEQ ID NO:6具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或者

(c)破伤风毒素轻链转基因或转基因产物，任选地其中：

(i)所述破伤风毒素轻链转基因与SEQ ID NO:7具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或者

(ii)所述破伤风毒素轻链转基因产物与SEQ ID NO:8具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或者

(d)hM4Di转基因或转基因产物，任选地其中：

(i)所述hM4Di转基因与SEQ ID NO:9具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或者

(ii)所述hM4Di转基因产物与SEQ ID NO:10具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

18.根据权利要求14-17中任一项所述的表达载体，其中所述表达载体是AAV2表达载体或AAV6表达载体。

19.根据权利要求14-18中任一项所述的表达载体，其中所述表达载体进一步包含：

(a)可操作地连接至所述转基因的神经元特异性启动子基因；和/或

(b)rep基因，任选地其中所述rep基因是AAV2 rep基因；和/或

(c)cap基因，任选地其中所述cap基因是AAV2 cap基因；和/或

(d)反向末端重复，任选地其中所述反向末端重复是AAV2反向末端重复；和/或

(e)编码病毒包装蛋白和/或包膜蛋白的基因。

20.根据权利要求14-19中任一项所述的表达载体，其中所述表达载体能够任选地经由肌内注射改变受试者的靶向神经元的活性。

21.一种制备病毒颗粒的体外方法，所述体外方法包括：

(i)用根据权利要求14-20中任一项所述的AAV表达载体转导哺乳动物细胞并且在所述细胞中表达颗粒形成所必需的病毒包装蛋白和包膜蛋白；以及

(ii)在培养基中培养所转导的细胞，使得所述细胞产生释放到所述培养基中的病毒颗粒。

22.一种病毒颗粒，其包含根据权利要求14-20中任一项所述的AAV表达载体。

23.一种改善或治疗受试者的神经肌肉障碍或神经运动障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗活性量的根据权利要求14-20中任一项所述的AAV表达载体或根据权利要求22所述的病毒颗粒。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述障碍是痉挛、肌萎缩侧索硬化、脊髓性肌萎缩或其他运动障碍如肌张力障碍。

25.根据权利要求23-24中任一项所述的方法，其中肌内、静脉内、颅内或椎管内递送所述AAV表达载体或所述病毒颗粒。

26.一种改善或治疗受试者的神经肌肉障碍或神经运动障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗活性量的根据权利要求14-20中任一项所述的AAV表达载体或根据权利要求22所述的病毒颗粒，其中所述AAV表达载体或所述病毒颗粒包含通过根据权利要求1-10中任一项所述的筛选方法鉴定的AAV衣壳的衣壳编码核苷酸序列，并且其中在所述筛选方法中使用的iPSC或ESC来源于所述受试者。

27.根据权利要求23-26中任一项所述的方法，其中在所述方法中使用的iPSC或ESC来源于所述受试者的皮肤样品。

28.根据权利要求23-27中任一项所述的方法，其中肌内递送所述AAV表达载体或所述病毒颗粒，以便逆行感染受试者神经元的神经元并改变受试者的所述神经元的活性。

29.根据权利要求14-20中任一项所述的AAV表达载体或根据权利要求22所述的病毒颗粒，其用于在根据权利要求23-28中任一项所述的方法中使用。

30.一种试剂盒，其包含根据权利要求14-20中任一项所述的AAV表达载体以及一种或多种病毒包装表达载体和包膜表达载体，所述一种或多种病毒包装表达载体和包膜表达载体编码在细胞中表达时颗粒形成所必需的病毒包装蛋白和包膜蛋白。

31.一种细胞，其包含根据权利要求14-20中任一项所述的AAV表达载体，任选地其中所述细胞是哺乳动物细胞，进一步任选地其中所述哺乳动物细胞是HEK293细胞。

32.一种衣壳，其包含与SEQ ID NO:12、15或16具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。