CN116520546A - 一种上转换和下转换双模结构光照明显微成像系统 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种上转换和下转换双模结构光照明显微成像系统，该系统主要包括：第一结构光产生模块，用于产生第一结构光，第一结构光用于下转化发光的激发；第二结构光产生模块，用于产生第二结构光，第二结构光用于上转化发光的激发；二维扫描模块，用于实现结构光在显微物镜焦平面的扫描；成像和探测模块，对待成像样品被激发出的荧光信号进行探测。本申请针对光学显微成像技术中成像深度有限且深层成像下分辨率低的问题，结合近红外二区成像技术、上转换发光技术以及结构光照明显微成像等技术优势，可同时实现深层成像、高分辨率成像，且能有效保证图像质量。

Description

一种上转换和下转换双模结构光照明显微成像系统

技术领域

本申请涉及到生物光学领域，具体而言，涉及一种上转换和下转换双模结构光照明显微成像系统。

背景技术

近年来，生命科学的发展对生物成像提出了新的要求：由表层成像逐渐向深层成像进发。相较于可见光波段的荧光(390～780nm)，近红外二区波段(1000～1700nm)荧光在生物组织传播的过程中，组织对光的散射相对较弱且具有较强的组织穿透能力；且生物组织内源性分子在该波段内的自发荧光相对较弱：因此，生物组织在近红外二区波段内的成像效果，具有成像深度大、分辨率高以及背景噪声弱等优势。因此，研制近红外二区成像技术及成像系统，并将其应用到生命科学领域的研究具有重要的科学意义和应用价值。

常见的荧光发光材料为下转换发光材料，其材料特性主要体现为材料吸收一个短波长的光子而向外辐射一个长波长的光子；相反的，上转换发光材料的特征主要体现为材料同时吸收多个长波长的光子而向外辐射一个短波长的光子。生物的内源性分子，其荧光激发绝大多数为下转换发光，故采用上转换材料标记生物样品，可进一步消除背景光的干扰以改善图像质量。进一步地，将激发波长和发射波长均位于近红外二区的上转换和下转换材料应用于生物成像过程，可有效提高成像深度，且有利于近红外二区成像系统范围的拓展。

然而，对于远场成像，图像分辨率不可避免地会受到光学衍射极限的制约，即同时受荧光发射波长以及物镜数值孔径的限制。与波长位于可见光波段及近红外一区波段的荧光相比，位于近红外二区波段的荧光具有更长的波长，导致传统近红外二区成像技术的图像分辨率往往在微米量级。此外，随着成像深度的增加，生物组织对光的散射和吸收将会严重降低图像分辨率，这将不利于分辨深层组织内部细节，进而无法深入分析和研究彼此之间的联系。

近红外二区荧光成像技术的成像方式，包括明场成像以及点扫描成像方式；上述两种成像方式都能在近红外二区波段内获取生物样品图像信息且有一定效果，但同时也有着各自问题与不足，分别主要表现为：前者图像分辨率不是很理想，后者光路设计和系统配置相对复杂且时间分辨率有限；同样地，由于光学衍射极限的限制，上述两种成像技术均无法很好满足深层组织下高分辨率的成像需求。

发明内容

本申请实施例提供了一种上转换和下转换双模结构光照明显微成像系统，以至少解决现有技术中成像深度有限并且深层成像下分辨率低的问题。

根据本申请的一个方面，提供了一种上转换和下转换双模结构光照明显微成像系统，包括：第一结构光产生模块，用于产生第一结构光，所述第一结构光用于下转化发光的激发；第二结构光产生模块，用于产生第二结构光，所述第二结构光用于上转化发光的激发；二维扫描模块，用于实现结构光在显微物镜焦平面的扫描；成像和探测模块，用于对待成像样品被激发出的荧光信号进行探测。

进一步地，所述第一结构光产生模块和所述第二结构光产生模块均包括：空间光调制器或者微透镜阵列，所述空间光调制器用于对光进行相位调制，或者，所述微透镜阵列用于产生点阵式照明光场。

进一步地，所述第一结构光产生模块和所述第二结构光产生模块均包括：激光器，用于发出特定波长的激发光；偏振分束器，用于对所述激发光进行偏振分束；所述空间光调制器用于对经过所述偏振分束器的光进行相位调制。

进一步地，所述待成像样品被激发出的荧光信号波长位于近红外二区波段内。

进一步地，所述二维扫描模块包括二维扫描振镜或声光偏转器。

进一步地，所述第一结构光产生模块和所述第二结构光产生模块均包括：扩束器，用于在所述激发光进行入所述偏振分束器之前对所述激发光进行扩束。

进一步地，所述第一结构光产生模块和所述第二结构光产生模块均包括：半波片，用于对其入射光的偏振方向进行调整，设置于所述扩束器和所述空间光调制器之间，或者，设置在所述扩束器和所述微透镜阵列之间。

进一步地，所述第一结构光产生模块和所述第二结构光产生模块均包括：其中，从所述空间光调制器或者所述微透镜阵列射出的光依次经过所述两个平凸透镜中的一个平凸透镜、空间滤波器及过所述两个平凸透镜中的另一个平凸透镜后入射到二维扫描模块上。

进一步地，所述第一结构光产生模块和/或所述第二结构光产生模块包括多个激光器的情况下，所述多个激光器发出的激发光通过各自对应的二色向镜和/或反射镜沿同一光路发射，其中，所述多个激光器中的每个激光器发出的激发光的波长不同。

进一步地，所述成像和探测模块包括：三维载物台，用于放置待成像样品，并进行三个维度的调节；显微物镜，将激发光聚焦于待成像样品上；近红外相机，用于探测待成像样品被激发出的荧光信号。

进一步地，所述成像和探测模块包括：两个平凸透镜，将来自所述二维扫描模块的出射导引至二色向镜。

进一步地，所述成像和探测模块包括：所述二色向镜，用于激发光的方向控制，并将荧光信号中残余的激发光滤掉。

进一步地，所述成像和探测模块包括：滤光片，用于滤除荧光信号中的杂散光。

在本申请实施例中，采用了第一结构光产生模块，用于产生第一结构光，所述第一结构光用于下转化发光的激发，；第二结构光产生模块，用于产生第二结构光，所述第二结构光用于上转化发光的激发，；二维扫描振镜，用于实现结构光在显微物镜焦平面的扫描；成像和探测模块，对样品被激发出的荧光信号进行探测。通过本申请解决了现有技术中成像深度有限且深层成像下分辨率低的问题，可有效改善并优化光学显微成像技术的成像深度、深层成像下图像分辨率并保证图像质量。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1是根据本申请实施例所述的成像系统的构成示意图。

附图标记说明：

图1中：1-980nm激光器，2-850nm激光器，3-785nm激光器，4-第一带通滤光片，5-第二带通滤光片，6-第三带通滤光片，7-第一反射镜，8-第一二色向镜，9-第二二色向镜，10-第一扩束器，11-第一半波片，12-第一偏振分束器(例如，偏振分束立方)，13-第一空间光调制器，14-第二反射镜，15-第一平凸透镜，16-第一空间滤波器，17-第二平凸透镜，18-1550nm激光器，19-第四带通滤光片，20-第二扩束器，21-第二半波片，22-第二偏振分束器(例如，偏振分束立方)，23-第三反射镜，24-第四反射镜，25-第二空间光调制器，26-第五反射镜，27-第三平凸透镜，28-第二空间滤波器，29-第四平凸透镜，30-第三二色向镜，31-二维扫描振镜，32-第六反射镜，33-第五平凸透镜，34-第六平凸透镜，35-第四二色向镜，36-显微物镜，37-三维高精度载物台，38-滤光片，39-套筒透镜，40-近红外相机，41-二维扫描振镜连接线，42-近红外相机连接线，43-计算机。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。

在本实施例中提供了一种上转换和下转换双模结构光照明显微成像系统，包括：第一结构光产生模块，用于产生第一结构光，第一结构光用于下转化发光的激发；第二结构光产生模块，用于产生第二结构光，第二结构光用于上转化发光的激发；二维扫描模块，用于实现结构光在显微物镜焦平面的扫描；成像和探测模块，对样品被激发出的荧光信号进行探测。

在本实施例的系统中，不仅综合近红外二区成像技术及结构光照明显微成像技术，而且同时将上转换发光与下转换发光整合于同一系统，一方面解决了现有成像技术中成像深度有限并且深层成像下分辨率低的问题，获得深层下的高分辨率、高质量的成像效果；另一方面也使得本系统有更广阔的应用场景。结构光的产生可以通过空间光调制器或者微透镜阵列来实现。第一结构光产生模块和第二结构光产生模块均包括：空间光调制器或者微透镜阵列，空间光调制器用于对光进行相位调制，或者微透镜阵列用于产生点阵式结构光照明光场。较于微透镜阵列，空间光调制器更具优势：它能够根据具体需求灵活设计相位图形文件，产生预设的结构化照明光场(不限于点阵列)，并且可重复使用。

第一结构光产生模块和第二结构光产生模块还可以包括：激光器，用于发出激发光；偏振分束器，用于对激发光进行偏振分束。此时空间光调制器用于对经过偏振分束器的光进行相位调制。需指出的是，样品被激发出的荧光信号的波长在近红外二区波段内。

其中，二维扫描模块包括二维扫描振镜或声光偏转器。在以下实施例中，以二维扫描振镜为例进行说明。

在可选实施方式中，还可以在第一结构光产生模块和第二结构光产生模块中增加如下至少之一的模块以提高系统的性能：例如，扩束器，用于在激发光进行入偏振分束器之前对激发光进行扩束；或者，半波片，用于对其入射光的偏振方向控制，可设置于扩束器和空间光调制器之间，或者，设置在扩束器和微透镜阵列之间。又例如，还可以增加空间滤波器和两个平凸透镜，其中，从空间光调制器或者微透镜阵列射出的光依次经过其中一个平凸透镜、空间滤波器及另一平凸透镜后入射到二维扫描振镜上。激光器至少有两个，多个激光器有利于扩大本系统的使用场景。在第一结构光产生模块和/或第二结构光产生模块包括多个激光器的情况下，多个激光器发出的激发光通过二色向镜和/或反射镜沿同一光路发射，其中，多个激光器中的每个激光器发出的激发光的波长不同。

成像和探测的模块构成可以根据具体实施情况来确定，例如，在一个可选实施方式中，成像和探测模块可以包括：三维高精度载物台，用于放置待成像样品；显微物镜，将激发光聚焦于待成像样品上；近红外相机，用于探测待成像样品被激发而出射的荧光信号。

在一个比较优的实施方式中，为了提高性能，成像和探测模块需包括以下器件以保证其性能；二色向镜，用于激发光的方向控制，并将荧光信号中残余的激发光进一步滤除。滤光片，用于滤除荧光信号中的杂散光。作为一种可选实施方式，所述成像和探测模块可包括：另外两个平凸透镜组成的4f系统，依次实现光束的中继。

本实施例提出的近红外二区上转换及下转换双模态结构光照明显微成像系统以及成像方法，综合了近红外二区成像技术、上转换发光以及结构光照明显微成像技术的优势，可同时实现深层、高空间分辨率成像，将在生物医学、生命科学等领域研究中发挥重要作用。本实施例采用不同波段的激光配合两个空间光调制器分别产生用于下转换激发的结构光以及用于上转换激发的结构光，通过二维扫描振镜实现各结构光在样品面的快速扫描，配合高速高灵敏近红外相机，可进行对生物组织的活体、实时成像。此外，本实施例采用的空间光调制器和近红外相机在可见光波段波段及近红外区波段均有响应，使本实施例可应用于生物样品的多波段成像，进而获取样品内部更多信息。

下面对一个可选实施例的成像系统进行说明，该成像系统主要包括：用于下转换激发的结构光产生模块(即第一结构光产生模块)A、用于上转换激发的结构光产生模块(即第二结构光产生模块)B、二色向镜、二维扫描振镜C、平面反射镜、成像与探测模块D，数据线41/42及计算机43。

用于上转换激发的结构光产生模块A和下转换激发的结构光产生模块B，可分别产生用于上转换激发的结构光和用于下转换激发的结构光，上述两模块产生的结构光经过二色向镜合束后入射至二维扫描振镜C；二维扫描振镜C的反射光经过反射镜反射后，随即依次穿过成像和探测模块中的两个平凸透镜33/34，之后被二色向镜35反射并进入显微物镜36，最终聚焦于安置在三维高精度位移台37的样品以此激发标记于其中的下转换荧光探针或者上转换荧光探针进而向外出射荧光。出射的荧光信号将沿显微物镜36原路返回并首先穿过长通二色向镜35，接着经一片带通滤光片38以进一步滤除残余的激发光，而后经套管筒镜39成像于近红外探测器的芯片并被其探测；通过控制振镜C可实现结构光在X-Y平面的扫描；同时，近红外探测器在二维扫描振镜扫描的每一位置，将采集一张样品的原始图像(例如，相机可以在其每一扫描位置均采集一张原始图像)，后续这些原始图像经计算机43进行图像重构后，即可得到被测样品的高分辨率图像。

本实施例中使用的用于下转换激发的结构光产生模块A，可以包括波长依次为785nm、850nm和980nm的三个单模连续型激光器1/2/3、带通滤光片4/5/6、平面反射镜7、二色向镜8/9、第一激光扩束器10、半波片11、偏振分束器12、空间光调制器13、平凸透镜15/17、空间滤波器16等元器件。在用于下转换激发的结构光产生模块中，二色向镜的具体类型根据光路的走向来确定；所用的半波片、偏振分束在光波长为700-1100nm范围内均具有95％以上的透射率及可靠的工作效果；所用的空间光调制器在光波长为700-1100nm范围内具有良好相位调制效果；所用反射镜在光波长为700-1100nm范围内均具有95％以上的透射率；所用平凸透镜均为消色差胶合透镜，在工作波段700-1100nm内具有95％以上的透射率。

本实施例中使用的用于上转换激发的结构光产生模块B，可以包括波长为1550nm的单模连续型激光器18、带通滤光片19、激光扩束器20、半波片21、偏振分束器22、平面反射镜23/24、空间光调制器25、平凸透镜27/29、空间滤波器28等元器件。在用于上转换激发的结构光产生模块中，所用的半波片、偏振分束在光波长为1100-1650nm范围内均具有95％以上的透射率及可靠的工作效果；所用的空间光调制器在光波长为1100-1650nm范围内具有良好相位调制效果；所用反射镜在光波长为1100-1650nm范围内均具有95％以上的透射率；所用平凸透镜均为平凸透镜，在其工作波段1100-1650nm内具有95％以上的透射率。

本实施例中的成像和探测模块D，可以包括平凸透镜33/34、二色向镜35、显微物镜36、三维高精度位移台37、滤光片38、套管筒镜39以及近红外相机40。

本系统中模块以外的二色向镜，为短通二色向镜，配合平面反射镜，实现上转换激发光路与下转换激发光路的光束合束以及之后光束的引导；二维扫描振镜为高速扫描振镜，以保证系统的时间分辨率，且二维扫描振镜的X轴和Y轴反射镜均在波段700-1650nm内具有95％以上的反射率，以保证入射光的利用效率。

本实施例中的成像和探测模块D所用显微物镜为水浸物镜，工作波段为380-1500nm；所用滤光片的工作波段根据具体实验需求进行选择；所用三维高精度位移台，在XY平面内的移动精度不小于1μm且行程不少于5mm，在Z方向的移动精度不大于1μm且行程不少于10mm，以保证样品准确聚焦与移动；所用近红外相机950-1600nm范围内均具有80％以上的量子效率，可有效保证荧光信号的探测效率和信号强度。整个成像系统中，空间光调制器、二维扫描振镜、近红外相机及三维高精度位移台，均通过数据线与计算机连接，通过控制程序实现通信与控制，以保证系统的集成度及稳定性。

在本实施例中，下转换发光结构光照明显微成像实验与上转换发光结构光照明显微成像实验，不可同时进行。成像和探测模块D中，二色向镜与滤光片根据具体实验可进行切换：例如，当需要进行下转换发光结构光照明显微成像实验时，光路中的二色向镜切换为长通二色向镜，滤光片应为长波通滤光片或者相应波段的带通滤光片；当需要进行上转换发光结构光照明显微成像实验时，光路中二色向镜切换为短通二色向镜，滤光片应为短波通滤光片或者相应波段的带通滤光片。

切换滤光片的目的如下：

(1)上转换发光时，激发光的波长大于发射光(即荧光)波长，所用二色向镜为短通二色向镜(波长小于特定波长的光允许被透射通过二色向镜，波长大于该特定波长的光不被允许通过而在二色向镜界面发生反射，特定波长的大小取决于所用二色向镜的参数)，进而滤出得到荧光；

(2)下转换发光时，激发光的波长小于发射光(即荧光)波长，所用二色向镜为长通二色向镜(波长大于特定波长的光允许被透射通过二色向镜，波长小于该特定波长的光不被允许通过而在二色向镜界面发生反射，特定波长的大小取决于所用二色向镜的参数)，进而滤出得到荧光；

(3)受工艺限制，二色向镜无法将激发光完全滤除：滤光片的作用是为了进一步滤除荧光中残余的激发光，滤光片参数的确定由荧光波长决定。

综合(1)(2)(3)可知，由于上转换发光与下转换发光过程中，荧光与激发光波长之间关系不一样，所以需要切换滤光片模块(二色向镜与滤光片的组合)，来实现对上转换发光以及下转换发光过程中样品出射荧光的探测；如果样品中同时标记有上转换发光与下转换发光的荧光染料，上转换发光与下转换发光是可以同时发生的，只不过在探测荧光的过程中，需要切换滤光片模块(二色向镜与滤光片的组合)，实现对各自过程中荧光的探测。

本实施例的目的是为了同时实现深层、高分辨率的成像效果，因此，将上转换发光与下转换发光整合在一个系统中是为了使得系统有更大的应用空间(样品中的染料，就可以为上转换发光与下转换发光的荧光染料)，对于样品中所要使用的染料将会有更多的选择空间；此外，生物体中的自发荧光过程通常为下转换发光过程，如果选用上转换发光技术，就能够进一步改善图像质量。

对于激发光的选择，本实施例分别采用近红外波段连续型激光器作为激发光(其中，波长依次为785nm、850nm及980nm的激光器用作下转换发光的激发光源，波长为1550nm的激光器用作上转换发光的激发光源)，分别通过空间光调制器对各入射光进行相位调制，可产生具有一定空间分布的照明光场，借助二维扫描振镜来实现照明光场在样品面的快速扫描，以激发样品中的近红外二区上转换或下转换荧光探针进而出射近红外二区荧光信号，最终荧光信号被近红外相机所探测。通过采集被测样品多幅原始图像并进行图像重构，最终可获得被测样品在深层下的高分辨率图像。

图1是根据本申请实施例的成像系统的构成示意图，下面结合图1对本实施例进行说明。

参考图1中所示，本实施例系统主要包括：(A)用于下转换激发的结构光产生模块，(B)用于上转换激发的结构光产生模块，(C)二维扫描振镜，(D)成像与探测模块，二色向镜、平面反射镜，数据线及计算机等。

本实施例中，用于上转换激发的三个激光器的开关状态，由被测生物样品所用的荧光探针的吸收波长所决定；在选择激光器时，应尽可能选择出射光为线偏振光的激光器，以充分利用激光能量。

本实施例中不同位置处光束尺寸的确定，主要有以下考虑：(1)第一空间光调制器13与第二空间光调制器25对应的液晶窗片均为长方形，为获得更为理想的相位调制效果，需保证入射光的光束直径不小于各液晶窗片的短边，因此，需合理选择并确定第一扩束器及第二扩束器的参数；(2)用于上转换激发的结构光及用于下转换激发的结构光均要经二维扫描振镜31的扫描，因此，各结构光的空间尺寸要与二维扫描振镜31的X轴及Y轴镜面的尺寸相匹配；可通过控制第一平凸透镜15与第二平凸透镜17的焦距之比，以及第三平凸透镜27与第四平凸透镜29的焦距之比来对二维扫描振镜31的X轴及Y轴镜面的入射光束尺寸进行控制。

用于下转换激发的结构光以及用于上转换激发的结构光的产生，具体分别通过在第一空间光调制器13以及第二空间光调制器25上加载预设的相位图形文件来实现。在上述产生过程中，由于衍射的存在，需对第一空间光调制器13以及第二空间光调制器25反射的衍射光束进行空间滤波：故需分别在第一平凸透镜15的后焦点(即第二消色差平凸透镜17的前焦点)位置以及在第三平凸透镜27的后焦点(即第四消色差平凸透镜29的前焦点)位置设置定制的第一空间滤波器16以及第二空间滤波器28，滤除衍射不充分的零级衍射光，从而分别保证用于下转换激发的结构光以及用于上转换激发的结构光的质量。

第一空间光调制器13与第二空间光调制器25，亦可根据需要将其替换为微透镜阵列，从而在焦平面产生点阵列式照明光场；但相较于微透镜阵列，第一空间光调制器13与第二空间光调制器25更具优势：它能够根据具体需求灵活设计相位图形文件，产生预设的结构化照明光场(不限于点阵列)，并且可重复使用。此外，系统所用二维扫描振镜31，亦可根据具体情况，替换成两个单轴声光偏转器组成的二维扫描单元，以进一步提高系统的成像速度。

实验样品放置于三维高精度载物台37上，可在X和Y两个维度实现精细调节，选取感兴趣的目标成像区域；此外，三维高精度载物台37，亦可实现Z方向的调节，进行快速精准对焦，获取样品不同深度下的图像。

标记于生物样品内部的近红外二区荧光探针，发光方式主要包括上转换发光及下转换发光，均需具备量子效率高、发光强度高且稳定、生物兼容性好且在生物体内不团簇等特点，可根据特定成像场景和需求进行合理选择或者定制。

本实施例第一空间光调制器13与第二空间光调制器25分别为产自日本Hamamatsu型号为X15213-07和美国Meadowlark Optics型号为E19*12-500-1200-HDM8的液晶空间光调制器，可分别在1550nm、500-1200nm波段具有良好光能利用效率；近红外相机40选用的是普林斯顿仪器生产的NIRvana HS近红外相机，具有高速、高灵敏度与低噪声等特点，且在近红外二区波段有着较高的量子效率。

第一偏振分束器12与第二偏振分束器22可分别分离得到偏振方向为水平方向的出射光，从而第一空间光调制器13与第二空间光调制器25对各自入射光的相位调制效果；通过分别调整第一半波片11和第二半波片21的角度，可实现对第一偏振分束器12与第二偏振分束器22的入射光光强的调节和控制。

此外，本系统中所选用的其他光学元件，在近红外二区波段均具有较高的透过率或者反射率，以保证近红外二区荧光信号在光路传输过程中的损耗尽可能小，从而最大化地发挥近红外二区系统在成像深度方面的优势。

根据结构光照明显微成像技术原理，为实现重构图像空间分辨率最大化的提升，需保证所产生的结构化照明光场的空间频率尽可能地接近本成像系统的衍射极限且，为此，需对加载于空间光调制器上的相位图形文件进行预先设计以及优化。

本实施例的近红外二区上转换及下转换双模态结构光照明显微成像系统在进行成像时，对应的具体工作流程则包括如下部分：

首先，980nm激光器1出射激光穿过第一带通滤光片4后，被第一反射镜7反射至第一二色向镜8后表面(透射面)；850nm激光器2出射激光穿过第二带通滤光片5后，入射至第一二色向镜8前表面(反射面)；980nm激光器1出射激光在第一二色向镜8的后表面发生透射后，与被第一二色向镜8反射的850nm激光器2出射的光束汇合并共同入射至第二二色向镜9后表面(反射面)并发生反射。785nm激光器3出射激光经第三带通滤光片6入射至第二二色向镜9前表面(透射面)并发生透射，而后与被第二二色向镜9后表面(反射面)反射的980nm激光及850nm激光器出射的光束汇合。上述三束不同波长的激光在合束后，经第一扩束器10进行准直和扩束；然后依次穿过第一半波片11与第一偏振分束器12后入射至第一空间光调制器13并受到相位调制；第一空间光调制器13的反射光束入射至第二反射镜14并发生反射，第二反射镜14的反射光依次通过第一平凸透镜15，第一空间滤波器16以及第二平凸透镜17后，入射至第三二色向镜30的后表面(透射面)并发生透射：至此，得到用于下转换激发的结构光。其中，第一二色向镜8为长波通二色向镜，第二二色向镜9与第三二色向镜30为短波通二色向镜。

然后，1550nm激光器18出射激光依次穿过第四带通滤光片4后，经第二扩束器20进行准直和扩束；然后依次穿过第二半波片21与第二偏振分束器22后入射至第三反射镜23后反射至第四反射镜24，第四反射镜24的反射光入射至第二空间光调制器25并受到相位调制之后发生反射；第二空间光调制器25的反射光束入射至第五反射镜26并发生反射，第五反射镜26的反射光依次通过第三平凸透镜27，第二空间滤波器28以及第四平凸透镜29后，入射至第三二色向镜30后表面(反射面)：至此，得到用于下转换激发的结构光。

接着，用于下转换激发的结构光被第三二色向镜30后表面(反射面)反射，与被第三二色向镜30前表面(透射面)透射的用于下转换激发的结构光汇合，之后入射至二维扫描振镜31内的X轴反射镜及Y轴反射镜。二维扫描振镜31的反射光入射至第六反射镜32并发生反射；依次穿过第五平凸透镜33，第六平凸透镜34后，入射至第四二色向镜35并被其反射后，均匀地充满显微物镜36的入瞳，然后由入瞳进入显微物镜36并被其聚焦于样品面，进而激发标记于生物样品内部的近红外二区上转换发光或下转换发光的荧光探针。

最后，生物样品中被激发出的近红外二区荧光信号经显微物镜36原路返回并穿过第四二色向镜35，接着经滤光片38进一步滤除激发光，最后由套筒透镜39将荧光信号成像于近红外相机40的探测芯片上，并由近红外相机40记录样品荧光图像。采集多幅原始图像，并通过计算机程序进行图像重构与数据处理，即可得到高分辨率的重构图像。

二维扫描振镜31和近红外相机40分别通过二维扫描振镜连接线41和近红外相机连接线42与计算机43连接，二者的同步与控制通过内置于计算机43的数据采集卡实现；除此以外，第一空间光调制器13、第二空间光调制器25以及三维高精度载物台37分别由安装于计算机43的软件进行单独控制和调节。

相较于现有的相关技术，本实施例具有以下优势：

(1)本实施例可选用响应波段较宽的探测器和空间光调制器，使之对可见光波段以及近红外二区波段的荧光信号均有响应：因此，本实施例可对同一样品出射的不同波段荧光信号进行成像，通过多波段成像的方式，可获取样品内部的更多信息；

(2)本实施例中，二维扫描振镜配合空间光调制器，实现结构化照明光场在样品面的快速扫描，可有效减小空间光调制器帧率低对系统时间分辨率的不利影响，使系统具有更快的成像速度：因此，本实施例具有更高的时间分辨率，可应用于生物样品的在体、实时、快速成像；

(3)本实施例结合近红外二区成像、上转换发光等技术手段，能有效减少组织对光的吸收与散射，抑制背景噪声对图像质量的影响：因此，本实施例可以获得更深的成像深度(不小于1mm)，有助于探索研究更多生命现象；

(4)与常见的基于宽场成像模式的近红外二区成像系统相比，本实施例提出一种结合近红外二区成像技术与结构光照明显微成像技术的成像手段，能充分发挥两种成像技术的优势；特别的，结构光照明技术的引入，相较于宽场成像方式，可提高最终图像的分辨率：因此，本实施例可在更深成像深度下，对样品实现更高分辨率的成像效果；

(5)本实施例所提出的成像系统，无须经过复杂修改和调整，即可与多种成像技术相结合(贝塞尔光束、偏振显微成像技术等)进而开展不同技术领域的研究，具有很强的兼容性和灵活性。

此外，相较于市面上商业的近红外二区成像系统，本实施例具有更深的成像深度、更弱的生物组织损伤以及更高的时空分辨率，操作方式灵活且性能稳定。

通过上述实施例的一种近红外二区成像系统与成像方法，同时实现深层、高分辨率、高质量的成像效果，能够更好地服务于生命科学等领域的研究。上述实施例兼具近红外二区成像技术、上转换发光以及结构光照明显微成像技术的优势，可有效对生物组织等样品实现深层、高空间分辨率的成像效果。

需要说明的是，在附图的流程图示出的步骤可以在诸如一组计算机可执行指令的计算机系统中执行，并且，虽然在流程图中示出了逻辑顺序，但是在某些情况下，可以以不同于此处的顺序执行所示出或描述的步骤。

在本实施例中，提供一种电子装置，包括存储器和处理器，存储器中存储有计算机程序，处理器被设置为运行计算机程序以执行以上实施例中的方法。

上述程序可以运行在处理器中，或者也可以存储在存储器中(或称为计算机可读介质)，计算机可读介质包括永久性和非永久性、可移动和非可移动媒体可以由任何方法或技术来实现信息存储。信息可以是计算机可读指令、数据结构、程序的模块或其他数据。计算机的存储介质的例子包括，但不限于相变内存(PRAM)、静态随机存取存储器(SRAM)、动态随机存取存储器(DRAM)、其他类型的随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、电可擦除可编程只读存储器(EEPROM)、快闪记忆体或其他内存技术、只读光盘只读存储器(CD-ROM)、数字多功能光盘(DVD)或其他光学存储、磁盒式磁带，磁带磁磁盘存储或其他磁性存储设备或任何其他非传输介质，可用于存储可以被计算设备访问的信息。按照本文中的界定，计算机可读介质不包括暂存电脑可读媒体(transitory media)，如调制的数据信号和载波。

这些计算机程序也可装载到计算机或其他可编程数据处理设备上，使得在计算机或其他可编程设备上执行一系列操作步骤以产生计算机实现的处理，从而在计算机或其他可编程设备上执行的指令提供用于实现在流程图一个流程或多个流程和/或方框图一个方框或多个方框中指定的功能的步骤，对应与不同的步骤可以通过不同的模块来实现。该电子装置中还可以包括一个软件模块构成的装置或系统，该装置或系统中的模块与上述实施例中的步骤相对应。

以上仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

Claims (11)

1.一种上转换和下转换双模结构光照明显微成像系统，其特征在于，包括：

第一结构光产生模块，用于产生第一结构光，所述第一结构光用于下转化发光的激发；

第二结构光产生模块，用于产生第二结构光，所述第二结构光用于上转化发光的激发；

二维扫描模块，用于实现结构光在显微物镜焦平面的扫描；

成像和探测模块，对待成像样品被激发出的荧光信号进行探测。

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述第一结构光产生模块和所述第二结构光产生模块均包括：

空间光调制器或者微透镜阵列，所述空间光调制器用于对光进行相位调制，或者，所述微透镜阵列用于产生点阵式照明光场。

3.根据权利要求2所述的系统，其特征在于，所述第一结构光产生模块和所述第二结构光产生模块均包括：

激光器，用于发出特定波长的激发光；

偏振分束器，用于对所述激发光进行偏振分束；

所述空间光调制器用于对经过所述偏振分束器的光进行相位调制。

4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述待成像样品被激发出的荧光信号波长位于近红外二区波段内。

5.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述二维扫描模块包括二维扫描振镜或声光偏转器。

6.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述第一结构光产生模块和所述第二结构光产生模块均包括：

扩束器，用于在所述激发光进行入所述偏振分束器之前对所述激发光进行扩束。

7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述第一结构光产生模块和所述第二结构光产生模块均包括：

半波片，用于对其入射光的偏振方向进行调整，设置在所述扩束器和所述空间光调制器之间，或者，设置在所述扩束器和所述微透镜阵列之间。

8.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述第一结构光产生模块和所述第二结构光产生模块均包括：

空间滤波器和两个平凸透镜，其中，从所述空间光调制器或者所述微透镜阵列射出的光依次经过所述两个平凸透镜中的一个平凸透镜、空间滤波器及过所述两个平凸透镜中的另一个平凸透镜后入射到所述二维扫描模块上。

9.根据权利要求3所述的系统，所述第一结构光产生模块和/或所述第二结构光产生模块包括多个激光器的情况下，所述多个激光器发出的激发光通过各自对应的二色向镜和/或反射镜沿同一光路发射，其中，所述多个激光器中的每个激光器发出的激发光的波长不同。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的系统，其特征在于，所述成像和探测模块包括：

三维载物台，用于放置所述待成像样品，并进行三个维度的调节；

显微物镜，将激发光聚焦于所述待成像样品上以此激发所述待成像样品向外出射荧光信号；

近红外相机，用于探测所述待成像样品被激发出的所述荧光信号。

11.根据权利要求10所述的系统，其特征在于，所述成像和探测模块包括以下至少之一：

两个平凸透镜，将来自所述二维扫描模块的出射导引至二色向镜；

所述二色向镜，用于激发光的方向控制，并将所述荧光信号中残余的激发光滤掉；

滤光片，用于滤除所述荧光信号中的杂散光。