CN116507362A - 包含抗原和tlr2激动剂的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了疫苗试剂盒和使用这类疫苗试剂盒用于疫苗接种的方法。

Description

包含抗原和TLR2激动剂的疫苗
发明领域
本发明涉及医学、免疫学和疫苗领域。本发明提供了能够刺激免疫系统例如对抗致病菌和病毒的疫苗试剂盒和组合物。本发明还提供了施用该疫苗的方法，以使个体获得对致病菌和病毒的免疫。
发明背景
需要有效和安全的新疫苗来预防由细菌和病毒感染引起的疾病。存在对新的佐剂和优化的施用以在接种疫苗后实现更好的免疫反应的需求。这类新疫苗需要有吸引力的特性组合，所述特性包括配制成产品时的强大免疫反应和低毒性。特别是在病毒感染领域，需要这类新疫苗，其中在病毒感染领域，在过去二十年里，几次MERS和SARS的爆发在几个国家蔓延。这类流行病也可能对招致病毒的个人产生严重影响，例如普遍地对旅行、医院、商业和社会有严重影响。
因此，需要有效和安全的新疫苗来预防由细菌感染和特别是病毒感染引起的疾病。
发明概述
本发明人发现，包含抗原和作为佐剂的TLR2激动剂的疫苗接种方法对冠状病毒具有良好的效果，特别是当与维生素(例如维生素A)组合时。
在第一方面，本发明提供了一种疫苗接种方法，其中包含抗原、Toll样受体2(TLR2)激动剂和至少一种可药用赋形剂的组合物用于肺施用或鼻内施用，并且其中在施用所述组合物之前或之后的三天内口服施用至少一次维生素A。
具体地，认为肺和鼻内施用促进免疫球蛋白向IgA的转换，IgA是一种专门用于包括肺和肠道在内的粘膜表面的免疫球蛋白。认为TLR2激动剂促进巨噬细胞的活化，导致增加的抗原呈递能力，增加的包括CD86在内的共刺激分子的表达，以及增加的细胞因子和趋化因子(包括干扰素)的产生和释放。因此，TLR2激动剂促进T细胞活化，这是成功诱导生产性中和B细胞反应的基础。
在第二方面，本发明提供了一种疫苗试剂盒，其包含：
-包含抗原、TLR2激动剂和至少一种可药用赋形剂的组合物，和
-标签，其告知所述组合物将用于通过共同施用维生素A进行疫苗接种。
在第三方面，本发明提供了一种疫苗试剂盒，其包含：
-第一组合物，其包含抗原、TLR2激动剂和至少一种可药用赋形剂，和
-包含维生素A的第二组合物。
在一个实施方案中，TLR2激动剂是式(I)的化合物或其可药用盐：
在另一个实施方案中，抗原是蛋白质或其多聚体、肽或其多聚体、减毒细菌或减毒病毒。蛋白质或肽的多聚体是指至少两个蛋白质或肽共价连接形成二聚体、三聚体、四聚体等。这类多聚体可能具有更好的抗原特性。
在另一个实施方案中，抗原是减毒的SARS-Cov-2或其组分。
在另一个实施方案中，抗原是来自SARS-Cov-2的刺突蛋白或其部分。
此外，与已知的疫苗组合物相比，根据本发明的疫苗接种方法显示出改进的特性，在个体接种疫苗后有效产生免疫反应，从而提供更好的保护以抵抗将来的细菌或病毒攻击。
附图简述
图1.维生素A在调节SIgA产生的适应性免疫中的多效性作用。这是适应性免疫系统产生IgA的概念性观点，显示了已知受维生素A调节的主要步骤。维生素几乎参与了生产线上的所有步骤，从抗原摄取到管腔中sIgA分泌。本文显示的主要机制包括通过上调将VA转化为RA的RALDH酶的表达来培养粘膜DC(CD103+DC)合成视黄酸，用肠归巢受体(α4β7整联蛋白和趋化因子受体CCR9)印迹T和B细胞，将T细胞分化为各种调节和效应T细胞亚群，使B细胞极化而有利于IgA+抗体分泌细胞(IgA+ASCs)，并最终将完整的sIgA分子转运跨过上皮细胞以在顶表面(apical surface)分泌。向上的黑色粗箭头表示RA促进的亚群(Treg、Th2、B细胞和(IgA+ASCs)，而向下的细虚线箭头表示其对Th17发育的阻断作用。
图2.免疫接种后针对刺突蛋白(Wuhan)、RBD(South Africa)和RBD(UK)的IgG滴度。在第28天获得样本。在第0天和第14天进行免疫接种。数据以几何平均值±几何SD表示。ID 366(第6组)除外。
图3.免疫接种后针对刺突蛋白(Wuhan)、RBD(South Africa)和RBD(UK)的IgA滴度。在第28天获得样本。在第0天和第14天进行免疫接种。数据以几何平均值±几何SD表示。ID 366(第6组)除外。
图4.BAL中针对刺突蛋白(Wuhan)、RBD(South Africa)和RBD(UK)的IgG滴度。终止实验时获得样本。在第0天和第14天进行免疫接种。数据以几何平均值±几何SD表示。ID366(第6组)除外。
图5.BAL中针对刺突蛋白(Wuhan)、RBD(South Africa)和RBD(UK)的IgA滴度。终止实验时获得样本。在第0天和第14天进行免疫接种。数据以几何平均值±几何SD表示。ID366(第6组)除外。
图6.来自实施例3的研究的各免疫小鼠的血清中的抗IgG。
图7.来自实施例3的研究的免疫组小鼠的平均抗IgG。
发明描述
免疫球蛋白A(IgA)是五种主要免疫球蛋白之一，在胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道的粘膜稳态中发挥着关键作用，在这一作用中作为免疫的主要抗体发挥功能。它是体内发现的第二丰富的免疫球蛋白类型，因此在对抗抗原的保护中起着至关重要的作用。
IgA是通过Ig的类别转换产生的，所述Ig的类别转换受多个过程调节。CD40-CD40L的结合和其他细胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-21的分泌促进Th2细胞的成熟，这促进向不同Ig亚型的类别转换。视黄酸是维生素A的代谢产物，其与IL-5和IL-6协同作用，以诱导IgA分泌。
维生素A(retinoid)是一种微量营养素，已知在几乎所有脊椎动物的膳食中都需要微量，因为它不能以维持生理健康的足够量来合成。因为已知维生素A和其代谢产物具有佐剂活性，其高浓度可以具有一些治疗作用。
视黄醇必须被细胞内酶，即，醇脱氢酶(ADH)氧化为视黄醛，然后被视黄醛脱氢酶(RALDH)不可逆地分解代谢为其生物活性形式的全反式视黄酸(从现在起称为RA)。这种生物活性代谢产物可以由许多已知具有这种转化所需的RALDH酶的细胞类型和组织合成，包括来自不同组织例如肠、肺、皮肤和它们的引流淋巴结的DC。
在20世纪80年代，已经发现维生素A控制IgA二聚体在上皮细胞中的跨细胞运输。在接下来的几十年里，进一步探讨了维生素A与固有层(lamina propria)中的几种免疫细胞和基质细胞相互作用的影响(图1)。
粘膜免疫细胞的一个特殊特征是它们的独特粘膜印迹表型(mucosal-imprintingphenotype)，这是产生和分泌IgA抗体同种型的后续步骤所需的特性(图1)。这种特殊特性似乎需要在粘膜环境中存在RA。关于维生素A(或RA)对粘膜免疫反应调节的影响的关键发现是，RA在DC的分化中起着核心作用，并且粘膜DC可以将视黄醇代谢为视黄酸。
RA的另一个重要功能是促进DC依赖性自B细胞产生IgA抗体分泌细胞，并且这一过程受IgA诱导的细胞因子如IL-5/IL-6增强。事实上，来自几种动物模型和人类研究的不同证据链都一致认为，需要淋巴组织DC和其他非免疫细胞合成RA，以诱导B细胞中IgA表达。从这些研究中得出的结论是，RA作为一种特异性IgA同种型转换因子发挥作用，其促进IgA+抗体分泌细胞的分化，并在TGF-β存在时增强IgA产生。这种作用的有效性受到微环境中存在的IL-5或IL-6调节。
在第一方面，本发明提供了一种疫苗接种方法，其中包含抗原、TLR2激动剂和至少一种可药用赋形剂的组合物用于肺施用或鼻内施用，并且其中维生素A在施用所述组合物之前或之后的三天内口服施用至少一次。
在一个实施方案中，疫苗接种方法包括在施用所述组合物之前、同时或在施用后3天内口服施用维生素D。
在另一个实施方案中，疫苗接种方法包括在施用所述组合物前一周和施用所述组合物后两天之间的时间期间内口服施用维生素D。
在另一个实施方案中，疫苗接种方法包括在施用所述组合物前一天和施用所述组合物后两天之间的时间期间内至少一次口服施用所述维生素A。
在接种疫苗方法的另一个实施方案中，所述抗原是蛋白质或其多聚体、肽或其多聚体、减毒细菌或减毒病毒。
在疫苗接种方法的一个实施方案中，所述抗原是减毒的SARS-Cov-2或其组分。
在疫苗接种方法的另一个实施方案中，所述抗原是来自SARS-Cov-2的刺突蛋白或其部分。
在疫苗接种方法的又一个实施方案中，所述TLR2激动剂是式(I)的化合物或其可药用盐：
在疫苗接种方法的又一个实施方案中，所述TLR2激动剂是式(I)化合物的类似物，其中所述类似物是式(Ia)的化合物或其可药用盐、水合物、溶剂合物、互变异构体、对映异构体或非对映异构体：
其中X选自C＝O、-NR3CH2-、-CH2NR3-、-NR3(C＝O)-、-(C＝O)NR3-、C＝NOH和-CH(OH)-，且R2是式(II)或式(III)的糖：
其中R1选自烷基、杂烷基、环烷基、芳基和杂芳基部分，
其中烷基部分选自任选支化的C1-C6烷基，
其中杂烷基部分选自任选支化的或取代的C1-C6烷基，并且任选地包含一个或多个杂原子，
其中环烷基部分选自任选取代的C1-C6环烷基，并且任选地包含一个或多个杂原子，
其中芳基部分选自任选取代的C6芳环，
其中杂芳基部分选自任选取代的包含一个或多个杂原子的C1-C5芳环，
其中杂原子选自O、N、P和S，
其中取代基独立地选自烷基、OH、F、Cl、NH2、NH-烷基、NH-酰基、S-烷基、S-酰基、O-烷基和O-酰基，
其中酰基选自C1-C4任选支化的酰基，
其中R3选自H和Me，
其中R4选自H和Me，
其中Ra选自H和CR21R22R23，
其中R21、R22、R23，以及R5、R6、R7、R8、R9和R10独立地选自H、Me、NR11R12、NO2和OR11，
其中R23与式(II)中的R4一起、式(II)中的R4与R5一起、式(II)中的R5与R7一起、以及式(II)中的R7与R9一起独立地可以连接以表示键，以在每个基团连接的碳原子之间留下双键，
其中R21与R22一起、R5与R6一起、R7与R8一起、或R9与R10一起可以用羰基替换，
其中R11和R12独立地选自H和烷基，
其中R13选自H、OH和OCH3，
其中R14选自H和OH，
且其中R5、R6、R7、R8、R9或R10之一选自NR11R12和NO2，
条件是当R1是Et、R2是式(II)的糖、R13是H或OH、R14是H或OH、Ra是H、R4是Me、R5是H、R6是OH、R7是H、R8是NR11R12、R9是H，且R10是H，X可以不是C＝O。
条件是当R1是Et、R2是式(II)的糖、R13是H或OH、R14是H或OH、Ra是H、R4是Me、R5是OH、R6是H、R7是OH、R8是Me、R9是H，且R10是H，X可以不是C＝O。
条件是当R1是Et、R2是式(II)的糖、R13是H或OH、R14是H或OH、Ra是H、R4是Me、R5是OH、R6是H、R7是H、R8是NR11R12、R9是H，且R10是OH，X可以不是C＝O。
1.在疫苗接种方法的又另一个实施方案中，所述TLR2激动剂选自：
在第二方面，本发明提供了一种疫苗试剂盒，其包含：
-包含抗原、TLR2激动剂和至少一种可药用赋形剂的组合物，和
-标签，其告知所述组合物将用于通过共同施用维生素A进行疫苗接种。
在一个实施方案中，疫苗试剂盒包含进一步告知所述组合物将用于通过共同施用维生素D进行疫苗接种的所述标签。
在另一个实施方案中，疫苗试剂盒包含告知维生素D是口服施用的所述标签。
在疫苗试剂盒的另一个实施方案中，所述组合物用于肺或鼻内施用。
在疫苗试剂盒的另一个实施方案中，所述标签告知维生素A是口服施用的。
在第三方面，本发明提供了一种疫苗试剂盒，其包含：
-第一组合物，包含抗原、TLR2激动剂和至少一种可药用赋形剂，和
-包含维生素A的第二组合物。
在一个实施方案中，疫苗试剂盒具有所述第二组合物包含维生素D。
在另一个实施方案中，疫苗试剂盒包含含有维生素D的第三组合物。在另一个实施方案中所述第三组合物用于口服施用。
在另一个实施方案中，疫苗试剂盒具有适于肺或鼻内施用的所述第一组合物。
在另一个实施方案中，疫苗试剂盒具有适于口服施用的所述第二组合物。
在一个实施方案中，疫苗试剂盒具有所述抗原是蛋白质或其多聚体、肽或其多聚体、减毒细菌或减毒病毒。
在另一个实施方案中，疫苗试剂盒具有所述抗原是减毒的SARS-Cov-2或其组分。又在另一个实施方案中，疫苗试剂盒具有所述抗原是来自SARS-Cov-2的刺突蛋白或其部分。
在另一个实施方案中，疫苗试剂盒具有所述TLR2激动剂是式(I)的化合物或其可药用盐：
在另一个实施方案中，疫苗试剂盒具有所述TLR2激动剂是式(I)化合物的类似物，其中所述类似物是式(Ia)化合物或其可药用盐、水合物、溶剂合物、互变异构体、对映体或非对映异构体：
其中X选自C＝O、-NR3CH2-、-CH2NR3-、-NR3(C＝O)-、-(C＝O)NR3-、C＝NOH和-CH(OH)-，且R2是式(II)或式(III的糖:
其中R1选自烷基、杂烷基、环烷基、芳基和杂芳基部分，
其中烷基部分选自任选支化的C1-C6烷基，
其中杂烷基部分选自任选支化的或取代的C1-C6烷基，并且任选地包含一个或多个杂原子，
其中环烷基部分选自任选取代的C1-C6环烷基，并且任选地包含一个或多个杂原子，
其中芳基部分选自任选取代的C6芳环，
其中杂芳基部分选自任选取代的包含一个或多个杂原子的C1-C5芳环，
其中杂原子选自O、N、P和S，
其中取代基独立地选自烷基、OH、F、Cl、NH2、NH-烷基、NH-酰基、S-烷基、S-酰基、O-烷基和O-酰基，
其中酰基选自C1-C4任选支化的酰基，
其中R3选自H和Me，
其中R4选自H和Me，
其中Ra选自H和CR21R22R23，
其中R21、R22、R23，以及R5、R6、R7、R8、R9和R10独立地选自H、Me、NR11R12、NO2和OR11，
其中R23与式(II)中的R4一起、式(II)中的R4与R5一起、式(II)中的R5与R7一起、以及式(II)中的R7与R9一起独立地可以连接以表示键，以在每个基团连接的碳原子之间留下双键，
其中R21与R22一起、R5与R6一起、R7与R8一起、或R9与R10一起可以用羰基替换，
其中R11和R12独立地选自H和烷基，
其中R13选自H、OH和OCH3，
其中R14选自H和OH，
且其中R5、R6、R7、R8、R9或R10之一选自NR11R12和NO2，
条件是当R1是Et、R2是式(II)的糖、R13是H或OH、R14是H或OH、Ra是H、R4是Me、R5是H、R6是OH、R7是H、R8是NR11R12、R9是H，且R10是H，X可以不是C＝O。
条件是当R1是Et、R2是式(II)的糖、R13是H或OH、R14是H或OH、Ra是H、R4是Me、R5是OH、R6是H、R7是OH、R8是Me、R9是H，且R10是H，X可以不是C＝O。
条件是当R1是Et、R2是式(II)的糖、R13是H或OH、R14是H或OH、Ra是H、R4是Me、R5是OH、R6是H、R7是H、R8是NR11R12、R9是H，且R10是OH，X可以不是C＝O。
又在另一个实施方案中，疫苗试剂盒具有所述TLR2激动剂选自：
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通用化学方法
本领域技术人员将认识到，用于本发明的TLR2激动剂可以以已知的方法以多种方式制备。以下路线仅仅是可用于合成式(I)化合物的一些方法的阐述。
在制备例如式(I)化合物的一种一般途径中，对红霉素A(erythromycin A)进行半合成操作以产生阿奇霉素(azithromycin)。用于这种转化的方法是已知的(US 3 478 014；US 4328 334；US 4 474 768,Glansdorp等人，2008)，但是这些途径或其他途径上的变化可能用于相同的目的。通过进一步的化学方法，如糖苷切割，去除碳霉糖(mycarose)/红霉糖(cladinose)和/或脱氧糖胺(desosamine)。简言之，在一个方法中，可以通过用酸处理去除糖。为了促进氨基糖的去除，首先需要氧化二甲胺以形成N-氧化物，然后通过热解将N-氧化物去除。然后可以通过酸降解去除生成的5-O糖和3-O糖。LeMahieu(1974)和Djokic,S.等人(1988)教授了合适的方法。最后，使用添加氨基糖的细菌菌株对该化合物进行生物转化。
本发明疫苗的一般用途
本文公开的本发明的疫苗接种方法和疫苗组合物可用于向个体提供对病毒的免疫力，特别是对呼吸道病毒的免疫力。
用于本发明的疫苗接种方法中的药物组合物
本发明还提供了包含药物组合物的疫苗接种试剂盒，所述药物组合物包含抗原和TLR2激动剂以及至少一种可药用赋形剂。本发明还涉及肺或鼻内组合物，其包含抗原和TLR2激动剂以及至少一种可药用赋形剂。
用于肺施用的药物组合物可以是液体或固体制剂，用于以汽化或气溶胶形式施用。气溶胶可以通过射流或网状喷雾器输送，其中与传统的射流喷雾器(jet nebulizer)相比，网状喷雾器(mesh nebulizer)具有更高的气溶胶化效率(aerosolizationefficiency)和更快速的施用。用于肺施用的固体制剂可以通过干粉吸入器递送。
疫苗接种方法可以由一段时间内的单次施用或多次施用组成。特别地，维生素A的口服施用可以由多次施用组成。
制剂可以方便地以合适剂型存在，所述合适剂型包括单位剂型，并且可以通过药学领域中众所周知的任何方法制备。这类方法包括使活性成分(抗原)和TLR2激动剂与至少一种赋形剂结合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或与这两者均匀紧密地结合来制备制剂。
取决于特定的疫苗接种和待接种的个体，以及施用途径，组合物可以以不同的剂量和/或频率施用。
药物组合物必须在制造和储存条件下是稳定的；因此，根据需要，应保存它们免于微生物如细菌和真菌的污染。在液体制剂如溶液、分散体和悬浮液的情况下，载体(carrier)可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、植物油和它们的合适混合物的溶剂或分散体介质。在固体制剂的情况下，通常通过将微粉化的活性颗粒与较大的载体颗粒(如乳糖或甘露醇)混合来制备干粉制剂。粉末的气溶胶化效率高度取决于载体特性，例如粒径分布、形状和表面特性。
用于本发明疫苗接种方法中的组合物包含至少一种可药用赋形剂，如载体、溶剂、推进剂、pH调节剂、稳定剂、表面活性剂、增溶剂、分散剂、防腐剂等。
应该理解的是，除了上述特别提到的成分之外，本发明的制剂还可以包括本领域常规的与所讨论的制剂类型有关的其他试剂。本领域技术人员将知道如何选择合适的制剂以及如何制备它(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版或更高版本)。本领域技术人员还将知道如何选择合适的施用途径和剂量。
TLR2激动剂的可药用盐包括由可药用无机或有机酸或碱形成的常规盐以及酸加成季铵盐。合适的酸盐的更具体的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、棕榈酸、苹果酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲苯磺酸、甲烷磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟基萘甲酸、氢碘酸、苹果酸、甾体酸(steroic acid)、单宁酸等。其他酸如草酸，虽然其本身不可药用，但可用于制备这样的盐，所述盐可用作获得本发明化合物和它们的可药用盐的中间体。合适的碱性盐的更具体的例子包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、N,N'-二苄基乙二胺、氯丙卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因的盐。
以下非限制性实施方案的列举进一步说明了本发明：
1.一种疫苗接种方法，其中包含抗原、TLR2激动剂和至少一种可药用赋形剂的组合物用于肺施用或鼻内施用，并且其中在施用所述组合物之前或之后的三天内口服施用至少一次维生素A。
2.根据实施方案1所述的疫苗接种方法，其中所述抗原是蛋白质或其多聚体、肽或其多聚体、减毒细菌或减毒病毒。
3.根据实施方案1或2所述的疫苗接种方法，其中所述TLR2激动剂是式(I)的化合物或其可药用盐：
4.根据实施方案1或2所述的疫苗接种方法，其中所述TLR2激动剂是式(I)化合物的类似物，其中所述类似物是式(Ia)的化合物或其可药用盐、水合物、溶剂合物、互变异构体、对映异构体或非对映异构体：
其中X选自C＝O、-NR3CH2-、-CH2NR3-、-NR3(C＝O)-、-(C＝O)NR3-、C＝NOH和-CH(OH)-，且R2是式(II)或式(III)的糖：
其中R1选自烷基、杂烷基、环烷基、芳基和杂芳基部分，
其中烷基部分选自任选支化的C1-C6烷基，
其中杂烷基部分选自任选支化的或取代的C1-C6烷基，并且任选地包含一个或多个杂原子，
其中环烷基部分选自任选取代的C1-C6环烷基，并且任选地包含一个或多个杂原子，
其中芳基部分选自任选取代的C6芳环，
其中杂芳基部分选自任选取代的包含一个或多个杂原子的C1-C5芳环，
其中杂原子选自O、N、P和S，
其中取代基独立地选自烷基、OH、F、Cl、NH2、NH-烷基、NH-酰基、S-烷基、S-酰基、O-烷基和O-酰基，
其中酰基选自C1-C4任选支化的酰基，
其中R3选自H和Me，
其中R4选自H和Me，
其中Ra选自H和CR21R22R23，
其中R21、R22、R23，以及R5、R6、R7、R8、R9和R10独立地选自H、Me、NR11R12、NO2和OR11，
其中R23与式(II)中的R4一起、式(II)中的R4与R5一起、式(II)中的R5与R7一起、以及式(II)中的R7与R9一起独立地可以连接以表示键，以在每个基团连接的碳原子之间留下双键，
其中R21与R22一起、R5与R6一起、R7与R8一起、或R9与R10一起可以用羰基替换，
其中R11和R12独立地选自H和烷基，
其中R13选自H、OH和OCH3，
其中R14选自H和OH，
且其中R5、R6、R7、R8、R9或R10之一选自NR11R12和NO2，
条件是当R1是Et、R2是式(II)的糖、R13是H或OH、R14是H或OH、Ra是H、R4是Me、R5是H、R6是OH、R7是H、R8是NR11R12、R9是H，且R10是H，X可以不是C＝O。
条件是当R1是Et、R2是式(II)的糖、R13是H或OH、R14是H或OH、Ra是H、R4是Me、R5是OH、R6是H、R7是OH、R8是Me、R9是H，且R10是H，X可以不是C＝O。
条件是当R1是Et、R2是式(II)的糖、R13是H或OH、R14是H或OH、Ra是H、R4是Me、R5是OH、R6是H、R7是H、R8是NR11R12、R9是H，且R10是OH，X可以不是C＝O。
5.根据实施方案4所述的疫苗接种方法，其中X选自-NR3CH2-和-CH2NR3，且R2是式(II):
6.根据任一实施方案4-5所述的方法，其中R1是甲基或乙基。
7.根据任一实施方案4-6所述的方法，其中R5、R6、R7或R8之一是NR11R12。
8.根据任一实施方案4-7所述的方法，其中R21、R22、R23，以及R5、R6、R7、R8、R9和R10独立地选自H、Me、NR11R12和OR11，
9.根据任一实施方案4-8所述的方法，其中R13和R14是OH。
10.根据任一实施方案4-9所述的方法，其中X选自-NR3CH2-和-CH2NR3，且R2是式(II):
且
其中R1是甲基或乙基，
其中R3选自H和Me，
其中R4是H，
其中Ra是-CR21R22R23，
其中R21、R22、R23，以及R5、R6、R7、R8、R9和R10独立地选自H、Me、NR11R12、NO2和OR11，
其中R11和R12独立地选自H和烷基，其中烷基部分选自任选支化的C1-C6烷基，
其中R13选自H、OH和OCH3，
其中R14选自H和OH，
且其中R5、R6、R7、R8、R9或R10之一是NR11R12。
11.根据任一实施方案4-10所述的方法，其中R2是根据式II的糖，其中Ra是H、R4是Me、R5是H、R6是OH、R7是H、R8是NR11R12、R9是H、且R10是H。
12.根据任一实施方案4-11所述的方法，其中R11和R12独立地选自H、Me和Et。
13.根据任一实施方案4-12所述的方法，其中X是–NR3CH2-。
14.根据任一实施方案4-13所述的方法，其中R1是Et。
15.根据任一实施方案4-14所述的方法，其中所述TLR2激动剂选自：
/>
/>
16.根据任一实施方案1-15所述的疫苗接种方法，其中在施用所述组合物之前、同时或在施用后3天内口服施用维生素D。
17.根据实施方案16所述的疫苗接种方法，其中在施用所述组合物前一周和施用所述组合物后两天之间的时间期间内口服施用维生素D。
18.根据任一实施方案1-17所述的疫苗接种方法，其中所述抗原是减毒的SARS-Cov-2或其组分。
19.根据任一实施方案1-18所述的疫苗接种方法，其中所述抗原是来自SARS-Cov-2的刺突蛋白或其部分。
20.根据任一实施方案1-19所述的疫苗接种方法，其中在施用所述组合物前一天和施用所述组合物后两天之间的时间期间内至少一次口服施用所述维生素A。
21.根据任一实施方案1-20所述的疫苗接种方法，其中所述组合物包含聚肌苷酸胞苷酸。
22.一种疫苗试剂盒，其包含：
-包含抗原、TLR2激动剂和至少一种可药用赋形剂的组合物，和
-标签，其告知所述组合物将用于通过共同施用维生素A进行疫苗接种。
23.根据实施方案22所述的疫苗试剂盒，其中所述抗原是蛋白质或其多聚体、肽或其多聚体、减毒细菌或减毒病毒。
24.根据任一实施方案22-23所述的疫苗试剂盒，其中所述TLR2激动剂是式(I)的化合物或其可药用盐：
25.根据任一实施方案22-23所述的疫苗试剂盒，其中所述TLR2激动剂是式(I)化合物的类似物，其中所述类似物是式(Ia)的化合物或其可药用盐、水合物、溶剂合物、互变异构体、对映异构体或非对映异构体：
其中X选自C＝O、-NR3CH2-、-CH2NR3-、-NR3(C＝O)-、-(C＝O)NR3-、C＝NOH和-CH(OH)-，且R2是式(II)或式(III)的糖：
其中R1选自烷基、杂烷基、环烷基、芳基和杂芳基部分，
其中烷基部分选自任选支化的C1-C6烷基，
其中杂烷基部分选自任选支化的或取代的C1-C6烷基，并且任选地包含一个或多个杂原子，
其中环烷基部分选自任选取代的C1-C6环烷基，并且任选地包含一个或多个杂原子，
其中芳基部分选自任选取代的C6芳环，
其中杂芳基部分选自任选取代的包含一个或多个杂原子的C1-C5芳环，
其中杂原子选自O、N、P和S，
其中取代基独立地选自烷基、OH、F、Cl、NH2、NH-烷基、NH-酰基、S-烷基、S-酰基、O-烷基和O-酰基，
其中酰基选自C1-C4任选支化的酰基，
其中R3选自H和Me，
其中R4选自H和Me，
其中Ra选自H和CR21R22R23，
其中R21、R22、R23，以及R5、R6、R7、R8、R9和R10独立地选自H、Me、NR11R12、NO2和OR11，
其中R23与式(II)中的R4一起、式(II)中的R4与R5一起、式(II)中的R5与R7一起、以及式(II)中的R7与R9一起独立地可以连接以表示键，以在每个基团连接的碳原子之间留下双键，
其中R21与R22一起、R5与R6一起、R7与R8一起、或R9与R10一起可以用羰基替换，
其中R11和R12独立地选自H和烷基，
其中R13选自H、OH和OCH3，
其中R14选自H和OH，
且其中R5、R6、R7、R8、R9或R10之一选自NR11R12和NO2，
条件是当R1是Et、R2是式(II)的糖、R13是H或OH、R14是H或OH、Ra是H、R4是Me、R5是H、R6是OH、R7是H、R8是NR11R12、R9是H，且R10是H，X可以不是C＝O。
条件是当R1是Et、R2是式(II)的糖、R13是H或OH、R14是H或OH、Ra是H、R4是Me、R5是OH、R6是H、R7是OH、R8是Me、R9是H，且R10是H，X可以不是C＝O。
条件是当R1是Et、R2是式(II)的糖、R13是H或OH、R14是H或OH、Ra是H、R4是Me、R5是OH、R6是H、R7是H、R8是NR11R12、R9是H，且R10是OH，X可以不是C＝O。
26.根据实施方案25所述的疫苗试剂盒，其中所述TLR2激动剂选自：
/>
/>
27.根据任一实施方案22-26所述的疫苗试剂盒，其中所述标签进一步告知所述组合物将用于通过共同施用维生素D进行疫苗接种。
28.根据任一实施方案22-27所述的疫苗试剂盒，其中所述组合物用于肺施用或鼻内施用。
29.根据任一实施方案22-28所述的疫苗试剂盒，其中所述标签告知维生素A是口服施用的。
30.根据任一实施方案27-29所述的疫苗试剂盒，其中所述标签告知维生素D是口服施用的。
31.根据任一实施方案22-30所述的疫苗试剂盒，其中所述抗原是减毒的SARS-Cov-2或其组分。
32.根据任一实施方案22-31所述的疫苗试剂盒，其中所述抗原是来自SARS-Cov-2的刺突蛋白或其部分。
33.一种疫苗试剂盒，其包含：
-第一组合物，包含抗原、TLR2激动剂和至少一种可药用赋形剂，和
-包含维生素A的第二组合物。
34.根据实施方案33所述的疫苗试剂盒，其中所述抗原是蛋白质或其多聚体、肽或其多聚体、减毒细菌或减毒病毒。
35.根据任一实施方案33-34所述的疫苗试剂盒，其中所述TLR2激动剂是式(I)的化合物或其可药用盐：
36.根据任一实施方案33-34所述的疫苗试剂盒，其中所述TLR2激动剂是式(I)化合物的类似物，其中所述类似物是式(Ia)的化合物或其可药用盐、水合物、溶剂合物、互变异构体、对映异构体或非对映异构体：
其中X选自C＝O、-NR3CH2-、-CH2NR3-、-NR3(C＝O)-、-(C＝O)NR3-、C＝NOH和-CH(OH)-，且R2是式(II)或式(III)的糖：
其中R1选自烷基、杂烷基、环烷基、芳基和杂芳基部分，
其中烷基部分选自任选支化的C1-C6烷基，
其中杂烷基部分选自任选支化的或取代的C1-C6烷基，并且任选地包含一个或多个杂原子，
其中环烷基部分选自任选取代的C1-C6环烷基，并且任选地包含一个或多个杂原子，
其中芳基部分选自任选取代的C6芳环，
其中杂芳基部分选自任选取代的包含一个或多个杂原子的C1-C5芳环，
其中杂原子选自O、N、P和S，
其中取代基独立地选自烷基、OH、F、Cl、NH2、NH-烷基、NH-酰基、S-烷基、S-酰基、O-烷基和O-酰基，
其中酰基选自C1-C4任选支化的酰基，
其中R3选自H和Me，
其中R4选自H和Me，
其中Ra选自H和CR21R22R23，
其中R21、R22、R23，以及R5、R6、R7、R8、R9和R10独立地选自H、Me、NR11R12、NO2和OR11，
其中R23与式(II)中的R4一起、式(II)中的R4与R5一起、式(II)中的R5与R7一起、以及式(II)中的R7与R9一起独立地可以连接以表示键，以在每个基团连接的碳原子之间留下双键，
其中R21与R22一起、R5与R6一起、R7与R8一起、或R9与R10一起可以用羰基替换，
其中R11和R12独立地选自H和烷基，
其中R13选自H、OH和OCH3，
其中R14选自H和OH，
且其中R5、R6、R7、R8、R9或R10之一选自NR11R12和NO2，
条件是当R1是Et、R2是式(II)的糖、R13是H或OH、R14是H或OH、Ra是H、R4是Me、R5是H、R6是OH、R7是H、R8是NR11R12、R9是H，且R10是H，X可以不是C＝O。
条件是当R1是Et、R2是式(II)的糖、R13是H或OH、R14是H或OH、Ra是H、R4是Me、R5是OH、R6是H、R7是OH、R8是Me、R9是H，且R10是H，X可以不是C＝O。
条件是当R1是Et、R2是式(II)的糖、R13是H或OH、R14是H或OH、Ra是H、R4是Me、R5是OH、R6是H、R7是H、R8是NR11R12、R9是H，且R10是OH，X可以不是C＝O。
37.根据实施方案36所述的疫苗试剂盒，其中所述TLR2激动剂选自:
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/>
38.根据任一实施方案33-37所述的疫苗试剂盒，其中所述第二组合物包含维生素D。
39.根据任一实施方案33-37所述的疫苗试剂盒，其中所述疫苗试剂盒包含含有维生素D的第三组合物。
40.根据实施方案39所述的疫苗试剂盒，其中所述第三组合物用于口服施用。
41.根据任一实施方案33-40所述的疫苗试剂盒，其中所述第一组合物用于肺或鼻内施用。
42.根据任一实施方案33-41所述的疫苗试剂盒，其中所述第二组合物用于口服施用。
43.根据任一实施方案33-42所述的疫苗试剂盒，其中所述抗原是减毒的SARS-Cov-2或其组分。
44.根据任一实施方案33-43所述的疫苗试剂盒，其中所述抗原是来自SARS-Cov-2的刺突蛋白或其部分。
实验
TLR2测定法
在重组HEK-293-TLR细胞系上，使用Invivogen的细胞报告基因测定法，使用它们的标准测定条件，对样品和对照进行一式两份的测试。这些细胞系在功能上过度表达人TLR2蛋白以及作为分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase，SEAP)的报告基因。该报告基因的产生是由NFkB诱导型启动子驱动的。TLR报告细胞系的活化结果以光密度值(OD)给出。
每种供试品20μl用于在200μl的最终反应体积中刺激hTLR2报告细胞系。一式两份测试样品，至少测试了两个浓度20uM和10uM。
实施例1–化合物1的生成
az-AG的生成
阿奇霉素苷元是使用文献中描述的方法产生的(Djokic,S.等人,1988)。简而言之，阿奇霉素通过酸性去除3-O糖和5-O糖而转化为阿奇霉素苷元。5-O氨基糖首先被氧化和热解以促进裂解。
能够糖基化红霉素苷元(红霉内酯(erythronolide))的生物转化菌株的产生
红色糖多孢菌(S.erythraea)18A1(pAES52)的产生
如下生成含有angAI、angAII、angCVI、ang-orf14、angMIII、angB、angMI和angMII以及actII-ORF4 pactI/III表达系统的表达质粒pAES52(Rowe等人，1998)。
从美国典型培养物保藏中心(Manassas，Virginia，USA)获得的泛温链霉菌(S.eurythermus)ATCC23956菌株的粘粒文库中扩增安哥拉霉素(angolamycin)糖生物合成基因。将生物合成基因簇序列保藏为EU038272、EU220288和EU232693(Schell，2008)。
如之前所述(Schell，2008，ESI)，在载体pSG144中组装生物合成基因盒，添加顺序基因，直到获得糖生物合成所需的8个基因，产生质粒pAES52。
将pAES52转化入菌株18A1中(WO2005054265)。
将pAES52转化入红色糖多孢菌18A1
使用标准方法(Kieser等人2000，Gaisser等人1997)通过原生质体将pAES52转化入红色糖多孢菌18A1。将产生的菌株命名为ISOM-4522，其于2017年1月24日保藏于NCIMB，保藏号为：NCIMB 42718。
红色糖多孢菌SGT2(pAES54)的产生
如下生成含有angAI、angAII、angCVI、ang-orf14、angMIII、angB、angMI和angMII以及actII-ORF4 pactI/III表达系统的表达质粒pAES54(Rowe等人，1998)。
从美国典型培养物保藏中心(Manassas，Virginia，USA)获得的泛温链霉菌(S.eurythermus)ATCC23956菌株的粘粒文库中扩增安哥拉霉素糖生物合成基因。将生物合成基因簇序列保藏为EU038272、EU220288和EU232693(Schell，2008)。
如之前所述(Schell，2008，ESI)，在载体pSG144中组装生物合成基因盒，添加顺序基因，直到获得糖生物合成所需的8个基因，产生质粒pAES52。
质粒pAES54是通过连接含有actII-ORF4 pactI/III启动子系统的11541bp SpeI-NheI片段而制备的，并且从pAES52中切下8个ang基因，其具有来自pGP9的5087bp XbaI-SpeI片段，该片段含有安普霉素(apramycin)抗性基因、oriC、oriT用于转移入链霉菌和具有attP位点的phiBT1整合酶用于整合转化。(在连接过程中消除了相容的NheI和XbaI位点。)
然后将pAES54转化入红色糖多孢菌SGT2(Gaisser等人，2000，WO2005054265)。
将pAES54转化入红色糖多孢菌SGT2
使用标准方法将pAES54通过接合转移入红色糖多孢菌SGT2中。简言之，通过标准程序用pAES54转化大肠杆菌ET12567 pUZ8002，并铺板在具有安普霉素(50μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)和氯霉素(33μg/mL)选择的2TY平板上。将此平板在37℃孵育过夜。将来自此的菌落用于建立新鲜的液体2TY培养物，将其在37℃孵育直到达到对数后期。收获细胞，洗涤，并与红色糖多孢菌SGT2的孢子混合，铺展到R6平板上，并在28℃孵育。24小时后，在这些平板上覆盖1mL含有3mg安普霉素和2.5mg萘啶酮酸的无菌水，并在28℃再孵育5-7天。将该平板上的接合后个体(Exconjugants)转移到含有安普霉素(100μg/mL)的R6新鲜平板。
备选的生物转化菌株
备选地，BIOT-2945(Schell等人，2008)可以用作生物转化菌株，因为该菌株也将安哥拉糖胺(angolosamine)添加到红霉内酯。
阿奇霉素苷元的生物转化
用0.2mL菌株ISOM-4522的孢子原液接种含有SV2培养基(40mL)和8uL硫链丝菌肽(25mg/mL)的锥形烧瓶(250mL)，并在30℃孵育，并以300rpm和2.5cm的距离振荡48小时。
SV2培养基
准备含有EryPP培养基(7mL)的无菌带塞子的(bunged)falcon管(50mL)，并用来自不含抗生素的种子瓶的培养物接种(0.5mL/falcon管)。将falcon管在30℃孵育，并以300rpm和2.5cm的距离振荡24小时。
ERYPP培养基
24小时后，将阿奇霉素苷元(在DMSO中的0.5mM，50uL)添加到每个falcon管中，并以300rpm和2.5cm的距离继续孵育6天。
化合物1的分离
将整个肉汤调节至pH 9.5，并用一体积的乙酸乙酯提取两次。离心(3500rpm，25分钟)后通过抽吸收集有机层。将有机层合并，并在真空中还原，得到含有化合物1的棕色胶(brown gum)。将该提取物在乙酸乙酯(200ml)和氯化铵水溶液(20ml 50％浓缩溶液)之间分配。分离后，用另一体积(200ml)的氯化铵水溶液提取有机层。然后用氢氧化钠水溶液将合并的水层调节至pH 9.0，然后用一体积等量的乙酸乙酯提取两次。将有机层合并并在真空中还原为棕色固体。然后将该提取物应用于二氧化硅柱(silica column)上，并用以下物质逐步洗脱(以500ml批次洗脱)：
溶剂 己烷 EtOAc MeOH NH4OH水溶液
A 0.499 0.499 0 0.002
B 0.250 0.748 0 0.002
C 0 0.998 0 0.002
D 0 0.988 0.01 0.002
E 0 0.978 0.02 0.002
F 0 0.968 0.03 0.002
G 0 0.958 0.04 0.002
化合物1主要在F和G中。将这些溶剂合并，并在真空中还原，以产生含有化合物1的棕色固体。然后通过制备型HPLC(C18 Gemini NX柱，Phenomenex，20mM乙酸铵和乙腈作为溶剂)纯化该物质。将含有目标化合物的级分合并并干燥，然后在C18 SPE柱上脱盐。
实施例2–COVID-19疫苗在小鼠中的功效
本研究的目的是评估新型COVID-19疫苗在hACE2转基因小鼠中的功效。
斯德哥尔摩地区动物伦理委员会批准了55只雌性AC70 hACE2转基因小鼠包括在该研究中(2020-2021年)。将动物分为7组，每组7或8只动物，如下用疫苗免疫：
·第1组:10μg三聚刺突蛋白+10μg聚肌苷酸胞苷酸(poly I:C)+40μg维生素A；皮下施用(n＝7)
·第2组:无疫苗(n＝8)
·第3组:100μg三聚刺突蛋白+10μg聚肌苷酸胞苷酸+40μg维生素A；皮下施用(n＝8)
·第4组:10μg三聚刺突蛋白+10μg聚肌苷酸胞苷酸+40μg维生素A；鼻内施用(n＝8)
·第5组:80μg三聚刺突蛋白+10μg聚肌苷酸胞苷酸+40μg维生素A；鼻内施用(n＝8)
·第6组:10μg三聚刺突蛋白+10μg聚肌苷酸胞苷酸+40μg维生素A；气管内(intratracheal)施用(n＝8)
·第7组:80μg三聚刺突蛋白+10μg聚肌苷酸胞苷酸+40μg维生素A；气管内施用(n＝8)
表1.处理组
聚肌苷酸胞苷酸获自Invitrogen(vac-pic)。
SARS-CoV-2三聚刺突蛋白获自Icosagen。
对动物称重并在第0天和第14天(第3-7组)或第15天(第1组)进行免疫接种。在第28天，通过鼻内施用给动物接种1.875x 105TCID50 SARS-CoV-2。每天对动物称重并监测其健康状况的变化，直到第38-39天，然后对其实施安乐死。根据该实验的伦理许可，体重减轻20％或健康状况严重下降的动物在实验期结束前实施安乐死。
在第-3天、第14天、第28天和结束时采集血样用于分离血清。在结束时进行血液采样后，对动物实施安乐死，并进行支气管肺泡灌洗和收集液体(BAL)。切除脾脏、肺和气管，并将脾脏、肺(下呼吸道)和气管(上呼吸道)的一部分保存在RNALater和TRIzol中，用于分析病毒滴度。将肺和颅骨(用于脑组织和鼻咽组织)保存在4％甲醛中进行组织病理学分析。
一只动物(ID 343，第3组)在第0天接受了不完全(imperfect)的皮下剂量。
一只动物(ID 366，第6组)由于缺乏测试项，没有接受第一次免疫接种。三只动物(ID 371、373和375，第7组)在第一次免疫后死亡：一只动物因麻醉过量死亡，其余两只动物因气管内施用技术引起的并发症而安乐死。一只动物(ID 341，第3组)在第二次免疫后发现死亡，原因是未能将IsoCage正确插入支架(rack)导致缺氧。
接种疫苗本身没有过度影响动物的体重。在第0天至第14天之间，第7组中动物的体重出现了明显的小幅度下降；然而，在第二次疫苗接种后，所有组的体重都普遍增加。
在未接种疫苗的动物中施用SARS-CoV-2导致体重显著下降；到第32天，动物的体重已降至其接种前体重的85.7±0.7％。疫苗接种显著影响了感染引起的体重下降，所有疫苗接种组的相对体重都没有明显下降。然而，第6组中的一只动物(ID 366)显示体重明显下降，与未接种疫苗的动物相似。如上所述，这只动物只接受了一次免疫接种(第14天)。
另外，接种疫苗组之间的体重差异也是明显的。第1组(低剂量皮下施用)和第4组(低剂量鼻内施用)的相对体重显著低于第5、6和7组。
接种疫苗没有明显影响动物的健康状况，对呼吸功能没有可观察到的影响。相比之下，接种SARS-CoV-2与自接种后4天的健康状况恶化有关。动物表现为驼背、竖毛和活动减少。两只动物表现出攻击性的迹象，两只动物有异常的运动行为，即后腿站立和前后摇晃。由于健康状况恶化以及体重减轻，第2组的动物在第32天实施了安乐死。
接种疫苗的动物的明显健康状况几乎没有变化。第6组中的一只动物(ID 366)在第32天出现症状，因此被安乐死。第32天或第34天，第1组中的三只动物因出现驼背、竖毛、运动增加、僵硬和震颤而被安乐死。其余接种疫苗的动物没有明显的症状。
接种疫苗显著提高了存活。未接种疫苗的动物的中位生存期为4天，这与所有其他组的动物的生存期显著不同。第1组动物的中位生存期为6天；剩余的接种组生存期不确定，因为动物在实验结束日被实施了安乐死，而不是因为健康状况下降。
在第28天检测所有接种组针对刺突蛋白(Wuhan)和刺突蛋白受体结合域RBD(South Africa和U.K.)的循环IgG滴度；增加是剂量依赖性的，接受高剂量刺突蛋白的动物表现出更强的免疫反应。相比之下，仅在通过鼻内或气管内途径接种疫苗的组中检测到针对刺突蛋白和RBD的IgA滴度。特别地，鼻内施用与IgA滴度的显著增加有关。与IgG相比，没有明显的剂量依赖性。
在接种疫苗的动物的结束时BAL样本中检测IgG和IgA抗体滴度。通过气管内和鼻内途径接种疫苗的动物明显有最强的反应，并且剂量依赖性反应是明显的。IgG反应占主导地位，尤其是针对刺突蛋白和RBD(U.K.)。
在接种疫苗的动物的支气管肺泡灌洗液中观察到不同水平的中和抗体滴度。皮下施用与最低水平的中和抗体有关，只有3只动物表现出低滴度或部分滴度。通过鼻内或气管内途径接种的动物显示出较高水平的中和抗体滴度；高剂量鼻内施用后检测到最高水平的中和抗体滴度。
在所有未接种疫苗的对照动物的BAL中都能检测到SARS-CoV-2病毒，这表明了成功的感染。在三只接受皮下疫苗接种的动物中检测到低病毒滴度，但在通过鼻内或气管内施用进行疫苗接种的动物中不可检测到病毒滴度。
组织病理学分析揭示所有组的呼吸道炎症变化。然而，令人感兴趣的是，在未接种疫苗的动物中，下呼吸道(气管、隆脊(carina)和肺)的炎症细胞浸润没有检测到或者以较低严重程度检测到。在第1组(LD皮下施用(s.c.))中，观察到血管周围到支气管旁和肺泡到间质的炎症细胞浸润程度更高，在第5组(HD i.n.)和第7组(HD i.t.)中稍高。在未接种疫苗的对照中仅观察到最小的变化。相比之下，在皮下注射测试项的组中，观察到小动脉中炎性细胞浸润和减小的管腔以及细支气管碎片的程度最高。在接受鼻内或气管内免疫的动物中观察到的这些变化程度较低，而在未接种疫苗的对照中没有观察到这些变化。由于未接种疫苗的对照组炎症最小，炎性变化可能是疫苗驱动的抗病毒免疫反应的证据。
值得注意的是，在中枢神经系统，即纹状体中也观察到了炎性变化，这可能解释了在一些动物中观察到的异常运动行为。在未接种疫苗的动物和通过皮下途径接种疫苗的动物的脑膜和实质中观察到梨状皮层的神经元坏死以及血管周围炎性细胞浸润。在其余组中没有观察到这些变化，这表明气管内或鼻内施用疫苗防止病毒浸入中枢神经系统。
来自该研究的结果如下表2-3和图2-5所示。
表2.绝对体重(g)的描述性统计，显示了平均值、平均值的标准误(SEM)和动物数量(N)。动物在第0天和第14天接种疫苗，并在第28天感染
表3.感染SARS-CoV-2后，相对体重(％)的描述性统计，显示了平均值、平均值的标准误(SEM)和动物数量(N)
总之，鼻内接种1.875x 105TCID50 SARS-CoV-2导致体重下降和健康状况恶化，导致感染后四天内在实验期结束前(pre-term)实施安乐死。这与下呼吸道病毒滴度增加有关。鼻内施用和气管内施用三聚刺突蛋白(10–80μg)、聚肌苷酸胞苷酸(10μg)和全反式视黄酸(ATRA)(40μg)对健康状况没有总体影响。接种疫苗的动物表现出剂量依赖性血清学反应，全身和局部产生抗刺突蛋白和RBD的IgG和IgA抗体，以及局部产生中和抗体。这与肺缺乏病毒复制、抑制SARS-CoV-2驱动的脑炎以及阻止covid-19疾病进展有关。
总而言之，该研究表明，鼻内和气管内接种SARS-CoV-2三聚刺突蛋白(10-80μg)、聚肌苷酸胞苷酸(10μg)和维生素A两次，完全保护免于1.875x 105TCID50 SARS-CoV-2感染。
实施例3–使用偶联至珠的刺突蛋白以及佐剂和维生素A的COVID-19疫苗
本研究的目的是在BALB/c小鼠中评估针对COVID-19的新型疫苗的免疫原性。
测试项1:SARS-CoV-2刺突蛋白和式(I)化合物。
测试项2:SARS-CoV-2刺突蛋白。
测试项3:骨化三醇(Calcitriol)(维生素D)、ATRA(维生素A)混合物。小心地准备和处理该混合物，因为它是非常光敏感的。测试项3的浓度是100μg/mL骨化三醇和20mg/mLATRA。
称重20只6-7周龄的雌性BALB/c小鼠，并将其分为四组，每组5只动物，如下所示：
表4.
第1、2和4组(腹膜内(i.p.)注射，100μL x 15只动物)，每只小鼠施用100ng骨化三醇和20μg ATRA。
第1组和第2组(皮下(s.c.)施用或鼻内(i.n.)施用，25μL x 10只动物)，每只小鼠施用100ng骨化三醇和20μg ATRA。
第4组(i.n.施用，25μL x 5只动物)，每只小鼠施用100ng骨化三醇和20μg ATRA。
在第0、10和20天通过皮下或鼻内递送对动物进行免疫接种。第1组、第2组和第4组在免疫前即刻，腹膜内注射20微克ATRA和100纳克骨化三醇(测试项3)。在第0天(免疫前)、第10天、第20天和第30天采集血样(150μL)，用于血清分离和随后的血清学评估。将血样倒置10次，在室温放置30分钟，然后在4℃以2000x g离心10分钟。然后将血清等分放入Eppendorf管中，并在-20℃储存，直到进一步分析。
来自第30天从第2组(刺突蛋白、ISR50和维生素A&D)和第3组(刺突蛋白和ISR50)收集的血清的抗IgG反应显示了也施用维生素A和D的积极作用。图6和图7显示了来自各组动物的血清中的抗IgG(分别为各小鼠和平均值)。
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本申请中提及的所有参考文献，包括专利和专利申请，均通过引用尽可能充分地并入本文作为参考。

Claims (15)

1.一种疫苗接种方法，其中包含抗原、TLR2激动剂和至少一种可药用赋形剂的组合物用于肺施用或鼻内施用，并且其中在施用所述组合物之前或之后的三天内口服施用至少一次维生素A。
2.根据权利要求1所述的疫苗接种方法，其中所述抗原是蛋白质或其多聚体、肽或其多聚体、减毒细菌或减毒病毒。
3.根据权利要求1或2所述的疫苗接种方法，其中所述TLR2激动剂是式(I)的化合物或其可药用盐：
4.根据权利要求1-3中任一项所述的疫苗接种方法，其中在施用所述组合物之前、同时或在施用后3天内口服施用维生素D。
5.根据权利要求4所述的疫苗接种方法，其中在施用所述组合物前一周和施用所述组合物后两天之间的时间期间内口服施用维生素D。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的疫苗接种方法，其中所述抗原是减毒的SARS-Cov-2或其组分。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的疫苗接种方法，其中所述抗原是来自SARS-Cov-2的刺突蛋白或其部分。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的疫苗接种方法，其中在施用所述组合物前一天和施用所述组合物后两天之间的时间期间内至少一次口服施用所述维生素A。
9.一种疫苗试剂盒，其包含：
-包含抗原、TLR2激动剂和至少一种可药用赋形剂的组合物，和
-标签，其告知所述组合物将用于通过共同施用维生素A进行疫苗接种。
10.根据权利要求9-12中任一项所述的疫苗试剂盒，其中所述组合物用于肺施用或鼻内施用。
11.根据权利要求9-11中任一项所述的疫苗试剂盒，其中所述标签进一步告知所述组合物将用于通过共同施用维生素D进行疫苗接种。
12.一种疫苗试剂盒，其包含：
-第一组合物，包含抗原、TLR2激动剂和至少一种可药用赋形剂，和
-包含维生素A的第二组合物。
13.根据权利要求12所述的疫苗试剂盒，其中所述第一组合物是用于肺或鼻内施用的。
14.根据权利要求9-13中任一项所述的疫苗试剂盒，其中所述抗原是来自SARS-Cov-2的刺突蛋白或其部分。
15.根据权利要求9-14中任一项所述的疫苗试剂盒，其中所述TLR2激动剂是式(I)的化合物或其可药用盐：
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