CN116507334A - 骨髓增生异常综合征（mds）的生物标记物及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本披露涉及骨髓增生异常综合征(MDS)中输血依赖性的治疗。本披露涉及使用新型生物标记物来治疗有需要的MDS患者的输血依赖性的方法。本披露还涉及鉴定适合用剪接调节剂治疗的MDS患者和/或预测或监测MDS患者中的治疗功效的方法。在一些实施例中，本文披露的方法包括至少确定患者中异常连接与规范连接TMEM14C转录物的比率(TMEM14C AJ/CJ比率)。在一些实施例中，本文披露的方法包括基于患者的TMEM14C AJ/CJ比率施用治疗有效量的剪接调节剂(例如，化合物1)。还披露了治疗用途和组合物。
Description
本申请包含以ASCII格式以电子方式提交的序列表，并通过引用以其全文特此并入。所述ASCII副本创建于2021年10月27日，命名为15647_0016-00304_SL.txt，大小为21,994字节。
本申请要求2020年11月4日提交的美国临时申请号63/109,730和2021年9月1日提交的美国临时申请号63/260,837的权益和优先权，这两项申请的内容通过引用以其全文明确并入本文。
本披露涉及骨髓增生异常综合征(MDS)中输血依赖性的治疗。在一些实施例中，本披露提供了使用新型生物标记物来治疗有需要的MDS患者的输血依赖性的方法。在一些实施例中，本披露还提供了鉴定适合用剪接调节剂(例如化合物1)治疗的MDS患者和/或预测或监测MDS患者中的治疗功效的方法。在一些实施例中，本文披露的方法包括确定患者中异常连接与规范连接TMEM14C转录物的比率(TMEM14C AJ/CJ比率)。在一些实施例中，本文披露的方法包括基于患者的TMEM14C AJ/CJ比率施用治疗有效量的剪接调节剂(例如，化合物1)。还提供了治疗用途和组合物。
骨髓增生异常综合征(MDS)是与癌症相关并由骨髓中的异常造血细胞引起的血液学病症的集合。这些异常造血细胞形成过早死亡或被破坏的有缺陷的血细胞，导致细胞短缺。最常见的是，MDS导致红细胞短缺，但其他类型的血细胞可能受到影响。
患有MDS的患者经常发生严重贫血并需要频繁输血，这可能导致临床、健康相关的生活质量和经济后果(Balducci，Cancer[癌症].2006；106：2087-2094；Almeida等人LeukRes.[白血病研究]2017；52：50-57)。除了与铁毒性相关的并发症外，还可发生同种异体免疫、过敏反应和输血传播感染(Sanz等人Transfusion.[输血]2013；53：710-715；Kimura等人Blood Transfus.[输血]2014；12：103-106；Koutsavlis，Anemia.[贫血]2016；2016：8494738；Singhal等人Haematologica.[血液学]2017；102：2021-2029)。输血依赖性也可能对存活产生负面影响并影响身体、功能和社会福祉(Harnan等人Acta Haematol.[血液学学报]2016；136：23-42；Lucioni等人Am J Blood Res.[美国血液研究杂志]2013；3：246-259；Stauder等人Leukemia.[白血病]2018；32：1380-1392；Szende等人Health Qual LifeOutcomes.[健康和生活质量结果]2009；7：81)。例如，长期输血对患者来说可能很耗时，并且可能对患者及其家庭造成心理社会负担(Balducci，Cancer.[癌症]2006；106：2087-2094)。除了这些临床和健康相关的生活质量负担之外，输血依赖的患者也可能造成经济负担。长期输血依赖性与增加的卫生保健成本有关，尤其是对于需要较高输血频率的患者(DeZern等人Leuk Lymphoma.[白血病和淋巴瘤]2017；58：2649-2656)。
目前在美国批准了多种用于MDS相关适应证的药物疗法，包括胃肠外施用的称为促红细胞生成素刺激剂的重组促红细胞生成素药物；核苷类似物DNA甲基转移酶抑制剂(低甲基化剂)阿扎胞苷和地西他滨；罗特西普(luspatercept)，一种结合转化生长因子β超家族配体的重组融合蛋白；以及口服施用的免疫调节剂来那度胺。这些药物疗法可以诱导血液学改善，但不能治愈，并且还与治疗中出现的血细胞减少症和其他不良事件相关。因此，仍然需要改进的MDS治疗，特别是可以降低输血依赖性并使不希望的毒性最小化的那些。
越来越多的证据已经将各种人类疾病与RNA剪接失调相联系，这可导致差异性外显子包含/排除、内含子保留或隐蔽剪接位点的使用(Scotti和Swanson(2016)Nat RevGenet.[遗传学自然评论]17(1)：19-32；Seiler等人(2018)Cell Rep.[细胞报告]23(1)：282-96)。几项研究已记录癌细胞剪接概况中的以及自身剪接因子中的更改(Agrawal等人(2018)Curr Opin Genet Dev.[遗传与发育的最新观点]48：67-74)。总而言之，这些事件造成可能促成肿瘤形成或对疗法的抗性的功能改变(Zhang和Manley，Cancer Discov.[癌症发现]2013；3(11)：1228-1237；Siegfried和Karni，(2018)Curr Opin Genet Dev.[遗传与发育的最新观点]48：16-21)。
剪接因子基因如SF3B1、U2AF1和SRSF2的体细胞突变影响大约50％的MDS患者，并导致多种可变和异常mRNA剪接变化。突变的SF3B1与MDS中的环形铁粒幼红细胞表型有关，其特征通常在于血红素生物合成的缺陷和线粒体中的铁积累。在MDS患者中，特别是在携带SF3B1突变的那些患者中，也已经观察到参与血红素生物合成和铁代谢的基因(如TMEM14C、ABCB7和PPOX)的异常剪接(Shiozawa等人Nat Commun.[自然通讯]2018；9：3649)。已经在SF3B1突变细胞和患者中报道了ABCB7和PPOX的异常剪接和下调，并且可能导致有缺陷的红细胞生成(参见，例如，Shiozawa等人Nat Commun.[自然通讯]2018；9：3649，例如在图7e-g中；Darman等人Cell Reports.[细胞报告]2015；13：1033-1045，例如在图6D中；Nikpour等人Br J Haematol.[英国血液学杂志]2010；149(6)：844-854，例如在图1中)。此外，已报道剪接因子基因的突变是MDS和其他骨髓恶性肿瘤起源中的起始事件之一(Walter等人NEngl J Med.[新英格兰医学杂志]2012；366(12)：1090-1098；Yoshida和Ogawa，WileyInterdiscip Rev RNA.[威利跨学科评论RNA]2014；5(4)：445-459)。
某些小分子可以通过促进内含子保留和/或外显子跳跃来调节恶性细胞中的RNA剪接(Teng等人(2017)Nat Commun.[自然通讯]8：15522)。化合物1是与SF3b复合物结合并诱导可变剪接(alternative splicing)变化的小分子(Finci等人Genes Dev.[基因与发育]2018；32(3-4)：309-320；Lee等人Nat Med.[自然医学]2016；22(6)：672-678)。化合物1在一组人急性骨髓性白血病(AML)细胞系(包括突变U2AF1、SRSF2和SF3B1细胞)中显示出生长抑制活性，并且口服施用化合物1在表达突变SF3B1的白血病异种移植模型中诱导体内抗肿瘤活性(Seiler等人Nat Med.[自然医学]2018；24(4)：497-504)。化合物1也已在人中进行评估用于治疗骨髓癌，但在患者中显示出不一致的结果(NCT02841540；Steensma等人Blood[血液](2019)134(增刊1)：673)。
因此，需要使用剪接调节剂(如化合物1)的改进的疗法，以及用于鉴定最可能响应或受益于此类治疗的患者的方法。用于选择可能在治疗期间发展为非输血依赖性的MDS患者的基于生物标记物的策略将是特别期望的。此类策略可以为MDS患者提供治疗方案、改善治疗功效和/或改善生活质量。
本披露至少部分地基于以下令人惊讶的发现：尽管剪接调节剂(如化合物1)在骨髓癌的抗肿瘤反应方面显示出一些不一致的结果(NCT02841540；Steensma等人Blood[血液](2019)134(增刊1)：673)，但该化合物在降低MDS患者的红细胞输血依赖性方面出人意料地有效，这些患者表达升高比率的线粒体卟啉转运蛋白TMEM14C(一种参与红细胞生成的基因)的异常剪接转录物。TMEM14C的治疗前表达升高与用化合物1治疗的MDS患者的非输血依赖性相关。化合物1可减少或抑制MDS患者中的TMEM14C异常剪接。不受理论的束缚，似乎在用化合物1治疗后表现出非输血依赖性的MDS患者、特别是具有SF3B1突变的MDS患者，在用化合物1治疗之前可能具有高水平的TMEM14C异常转录物并且在治疗期间具有瞬时下调。
虽然SF3B1突变蛋白影响许多基因，包括ZDHHC16、SLTM、SNURF、ZNF561、TAK1、ZNF410等基因和其他参与血细胞合成和代谢的基因，但这些基因通常与非输血依赖性无关。相反，本披露集中于令人惊讶的发现：对某些MDS患者中TMEM14C异常剪接的调节使得那些患者在用剪接调节剂(如化合物1)治疗后对非输血依赖性特别敏感。特别地，异常连接与规范连接TMEM14C转录物的升高的治疗前比率(TMEM14C AJ/CJ比率)可用于鉴定在用化合物1治疗期间可能实现非输血依赖性的MDS患者。此类患者也可具有低水平的TMEM14C表达(例如，低于健康受试者中的水平)。在一些实施例中，单独的或与低水平TMEM14C表达组合的升高的TMEM14C AJ/CJ比率用作生物标记物以预测或确定患者是否可能响应或受益于化合物1的治疗。在一些实施例中，升高的TMEM14C AJ/CJ比率是超过对照(例如，未患有MDS的对照受试者)中的比率的TMEM14C AJ/CJ比率。在一些实施例中，使用一种或多种用于检测和定量核酸的方法(如本文所述的示例性方法中的任一种)测量升高的TMEM14C AJ/CJ比率。在一些实施例中，使用基于PCR的方法(如实时PCR(RT-PCR))测量升高的TMEM14C AJ/CJ比率。在一些实施例中，使用核酸条形码测量升高的TMEM14C AJ/CJ比率。在一些实施例中，升高的TMEM14C AJ/CJ比率是超过对照中的比率的比率，如通过核酸条形码所测量的。在一些实施例中，升高的TMEM14C AJ/CJ比率是大于约4，例如3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4或4.5的比率，如通过核酸条形码所测量的。
在一些实施例中，本披露提供了用作生物标记物的TMEM14C AJ/CJ比率，用于选择患者以治疗患有MDS的患者的输血依赖性，例如通过施用化合物1。TMEM14C AJ/CJ比率可单独评估或与一种或多种另外的生物标记物组合评估，以鉴定用于治疗的患者。例如，参与血红素生物合成和铁代谢的其他基因(包括ABCB7和/或PPOX)的异常剪接同样可增加某些MDS患者在用剪接调节剂(如化合物1)治疗后对非输血依赖性的易感性。
铁输出蛋白ABCB7的下调与在伴环形铁粒幼红细胞的MDS患者中观察到的增加的线粒体铁积累有关(Maio等人Haematologica[血液学]2019；104：1756-1767)。实验模型中ABCB7表达的丧失也已被证明可导致有缺陷的血红素生物合成、线粒体铁超负荷和红系祖细胞的细胞凋亡(Maio等人Haematologica[血液学]2019；104：1756-1767)。在一些实施例中，异常连接与规范连接ABCB7转录物的升高的治疗前比率(ABCB7 AJ/CJ比率)可用于鉴定在用化合物1治疗期间可能实现非输血依赖性的MDS患者，例如，当单独使用或与另一生物标记物(如升高的TMEM14C AJ/CJ比率)组合使用时。同样，PPOX可促进卟啉的线粒体转运(Shiozawa等人Nat Commun.[自然通讯]2018；9：3649)。在一些实施例中，异常连接与规范连接PPOX转录物的升高的治疗前比率(PPOX AJ/CJ比率)可用于鉴定在用化合物1治疗期间可能实现非输血依赖性的MDS患者，例如，当单独使用或与另一生物标记物(如升高的TMEM14C AJ/CJ比率)组合使用时。
在一些实施例中，剪接调节剂是具有式I的普拉二烯内酯(pladienolide)吡啶化合物或其药学上可接受的盐，本文称为“化合物1”：
(也称为(2S，3S，4E，6S，7R，10R)-7，10-二羟基-3，7-二甲基-12-氧代-2-[(2E，4E，6R)-6-(吡啶-2-基)庚-2，4-二烯-2-基]氧杂环十二-4-烯-6-基-4-甲基哌嗪-1-甲酸酯)。
在一些实施例中，本披露提供了使用新型生物标记物治疗患有MDS的患者的输血依赖性的方法。在一些实施例中，本披露还提供了鉴定适合用剪接调节剂(例如化合物1)治疗的MDS患者和/或预测或监测MDS患者中的治疗功效的方法。在一些实施例中，本文披露的方法包括确定患者中异常连接与规范连接TMEM14C转录物的比率(TMEM14C AJ/CJ比率)。在一些实施例中，本文披露的方法包括基于患者的TMEM14C AJ/CJ比率施用治疗有效量的剪接调节剂(例如，化合物1)。还披露了治疗用途和组合物。
在一些实施例中，本披露提供了治疗患有MDS的患者的输血依赖性的方法，其包括向具有升高的TMEM14C AJ/CJ比率的输血依赖的MDS患者施用治疗有效量的化合物1。在一些实施例中，本披露提供了治疗患有MDS的患者的输血依赖性的方法，其包括：(a)确定该输血依赖的MDS患者具有升高的TMEM14C AJ/CJ比率；以及(b)向该患者施用治疗有效量的化合物1。在一些实施例中，本披露提供了鉴定适合用化合物1治疗的输血依赖的MDS患者的方法，其包括：(a)确定该患者具有升高的TMEM14C AJ/CJ比率；以及(b)鉴定该患者适合用化合物1治疗。在本文披露的方法的一些实施例中，患者或来自患者的生物样品具有低水平的TMEM14C表达。在一些实施例中，化合物1减少或抑制患者的TMEM14C异常剪接。
在一些实施例中，本披露提供了监测输血依赖的MDS患者中的治疗功效的方法，其包括：(a)确定该患者具有升高的TMEM14C AJ/CJ比率；(b)向该患者施用治疗有效量的化合物1；以及(c)确定施用后该患者的TMEM14C AJ/CJ比率，其中施用后该TMEM14C AJ/CJ比率的降低表明有效治疗。在一些实施例中，该TMEM14C AJ/CJ比率在步骤(c)之后保持升高，并且该方法还包括向该患者施用另外剂量的化合物1。在一些实施例中，该方法还包括向该患者施用另外剂量的化合物1直至该TMEM14C AJ/CJ比率不再升高。在本文披露的方法的一些实施例中，患者或来自患者的生物样品具有低水平的TMEM14C表达。在一些实施例中，化合物1减少或抑制患者的TMEM14C异常剪接。
在一些实施例中，确定升高的AJ/CJ比率包括从患者获得生物样品并确定样品中的TMEM14C AJ/CJ比率。TMEM14C的示例性规范序列是CCGGGGCCTTCGTGAGACCGGTGCAGGCCTGGGGTAGTCT(SEQ ID NO：1)(基因：TMEM14C；连接：chr6：10723474-10724802)。TMEM14C的示例性异常序列是CCGGGGCCTTCGTGAGACCGCTTG TTTTCTGCAGGTGCAG(SEQ ID NO：2)(基因：TMEM14C；连接：chr6：10723474-10724788)。Darman等人描述了另外的异常TMEM14C序列(Cell Reports.[细胞报告]2015；13：1033-1045，例如在表S5中)，将其通过引用并入本文用于披露此类序列。在一些实施例中，生物样品包括血液样品或骨髓样品。在一些实施例中，血液样品包括外周血或血浆。在一些实施例中，骨髓样品包括骨髓穿刺物或骨髓活检物。在一些实施例中，生物样品包括尿液样品。在一些实施例中，TMEM14C AJ/CJ比率通过测量患者或来自患者的生物样品中的RNA转录物来确定。在一些实施例中，测量RNA转录物包括核酸条形码和/或实时聚合酶链式反应(RT-PCR)。在一些实施例中，测量RNA转录物包括核酸条形码。
在一些实施例中，升高的TMEM14C AJ/CJ比率是超过对照(例如，未患有MDS的对照受试者)中的比率的比率。在一些实施例中，使用一种或多种用于检测和定量核酸的方法(如本文所述的示例性方法中的任一种)(例如，基于PCR的方法，如实时PCR(RT-PCR)、核酸条形码等)测量升高的TMEM14C AJ/CJ比率。在一些实施例中，升高的TMEM14C AJ/CJ比率是超过对照中的比率的比率，如通过核酸条形码所测量的。在一些实施例中，升高的TMEM14CAJ/CJ比率是大于约1、约2、约4、约10、约15、约20或约30的比率，例如，如通过RNA表达定量方法(如实时逆转录PCR或核酸条形码)所测量的。在一些实施例中，升高的TMEM14C AJ/CJ比率是大于约4的比率，如通过核酸条形码所测量的。
在一些实施例中，异常连接与规范连接ABCB7转录物的升高的治疗前比率(ABCB7AJ/CJ比率)可用于鉴定在用化合物1治疗期间可能实现非输血依赖性的MDS患者。
在一些实施例中，本披露提供了治疗患有MDS的患者的输血依赖性的方法，其包括向具有升高的ABCB7 AJ/CJ比率的输血依赖的MDS患者施用治疗有效量的化合物1。在一些实施例中，本披露提供了治疗患有MDS的患者的输血依赖性的方法，其包括：(a)确定该输血依赖的MDS患者具有升高的ABCB7 AJ/CJ比率；以及(b)向该患者施用治疗有效量的化合物1。在一些实施例中，本披露提供了鉴定适合用化合物1治疗的输血依赖的MDS患者的方法，其包括：(a)确定该患者具有升高的ABCB7 AJ/CJ比率；以及(b)鉴定该患者适合用化合物1治疗。
在一些实施例中，确定升高的AJ/CJ比率包括从患者获得生物样品并确定样品中的ABCB7 AJ/CJ比率。在一些实施例中，ABCB7 AJ/CJ比率通过测量患者或来自患者的生物样品中的RNA转录物来确定。在一些实施例中，升高的ABCB7 AJ/CJ比率是超过对照(例如，未患有MDS的对照受试者)中的比率的ABCB7 AJ/CJ比率。在一些实施例中，使用一种或多种用于检测和定量核酸的方法(如本文所述的示例性方法中的任一种)测量升高的ABCB7 AJ/CJ比率。在一些实施例中，使用基于PCR的方法(如实时PCR(RT-PCR))测量升高的ABCB7 AJ/CJ比率。在一些实施例中，使用核酸条形码测量升高的ABCB7 AJ/CJ比率。在一些实施例中，升高的ABCB7 AJ/CJ比率是超过对照中的比率的比率，如通过核酸条形码所测量的。
在一些实施例中，异常连接与规范连接PPOX转录物的升高的治疗前比率(PPOXAJ/CJ比率)可用于鉴定在用化合物1治疗期间可能实现非输血依赖性的MDS患者。
在一些实施例中，本披露提供了治疗患有MDS的患者的输血依赖性的方法，其包括向具有升高的PPOX AJ/CJ比率的输血依赖的MDS患者施用治疗有效量的化合物1。在一些实施例中，本披露提供了治疗患有MDS的患者的输血依赖性的方法，其包括：(a)确定该输血依赖的MDS患者具有升高的PPOX AJ/CJ比率；以及(b)向该患者施用治疗有效量的化合物1。在一些实施例中，本披露提供了鉴定适合用化合物1治疗的输血依赖的MDS患者的方法，其包括：(a)确定该患者具有升高的PPOX AJ/CJ比率；以及(b)鉴定该患者适合用化合物1治疗。
在一些实施例中，确定升高的AJ/CJ比率包括从患者获得生物样品并确定样品中的PPOX AJ/CJ比率。在一些实施例中，PPOX AJ/CJ比率通过测量患者或来自患者的生物样品中的RNA转录物来确定。在一些实施例中，升高的PPOX AJ/CJ比率是超过对照(例如，未患有MDS的对照受试者)中的比率的PPOX AJ/CJ比率。在一些实施例中，使用一种或多种用于检测和定量核酸的方法(如本文所述的示例性方法中的任一种)测量升高的PPOX AJ/CJ比率。在一些实施例中，使用基于PCR的方法(如实时PCR(RT-PCR))测量升高的PPOX AJ/CJ比率。在一些实施例中，使用核酸条形码测量升高的PPOX AJ/CJ比率。在一些实施例中，升高的PPOX AJ/CJ比率是超过对照中的比率的比率，如通过核酸条形码所测量的。
在一些实施例中，确定升高的AJ/CJ比率包括例如在来自患者的生物样品中确定多于一种AJ/CJ比率，例如两种、三种或更多种AJ/CJ比率。
在一些实施例中，确定升高的AJ/CJ比率包括确定TMEM14C AJ/CJ比率和ABCB7AJ/CJ比率。在一些实施例中，确定升高的AJ/CJ比率包括从患者获得生物样品并确定样品中的TMEM14C AJ/CJ比率和ABCB7 AJ/CJ比率。
在一些实施例中，确定升高的AJ/CJ比率包括确定TMEM14C AJ/CJ比率和PPOX AJ/CJ比率。在一些实施例中，确定升高的AJ/CJ比率包括从患者获得生物样品并确定样品中的TMEM14C AJ/CJ比率和PPOX AJ/CJ比率。
在一些实施例中，确定升高的AJ/CJ比率包括确定TMEM14C AJ/CJ比率、ABCB7 AJ/CJ比率和PPOX AJ/CJ比率。在一些实施例中，确定升高的AJ/CJ比率包括从患者获得生物样品并确定样品中的TMEM14C AJ/CJ比率、ABCB7 AJ/CJ比率和PPOX AJ/CJ比率。
在一些实施例中，MDS是伴多系发育异常的MDS(MDS-MLD)、伴单系发育异常的MDS(MDS-SLD)、伴环形铁粒幼红细胞的MDS(MDS-RS)、伴原始细胞过多的MDS(MDS-EB)、与孤立del(5q)相关的MDS或不能分类的MDS(MDS-U)。在一些实施例中，根据国际预后评分系统，MDS是具有中等-1风险或更低风险的MDS。在一些实施例中，根据国际预后评分系统，MDS是具有中等-2风险或更低风险的MDS。在一些实施例中，MDS是MDS-MLD。在一些实施例中，MDS是MDS-EB。在一些实施例中，MDS-EB是MDS-EB1或MDS-EB2。在一些实施例中，MDS是MDS-EB2。
在一些实施例中，患者或来自患者的生物样品包含与RNA剪接相关的一个或多个基因的突变。在一些实施例中，患者或来自患者的生物样品包含选自SF3B1、SRSF2、U2AF1和ZRSR2的一个或多个基因的突变。在一些实施例中，患者或来自患者的生物样品包含SF3B1的突变。在一些实施例中，SF3B1的突变包含在SF3B1中的位置E622、H662、K666、K700、R625或V701中的一个或多个处的突变或由其组成。在一些实施例中，SF3B1的突变包含在SF3B1中的位置H662、K700或R625中的一个或多个处的突变或由其组成。在一些实施例中，SF3B1的突变包含在SF3B1中的位置K700处的突变或由其组成。在一些实施例中，在位置K700处的突变是K700E和/或在位置R625处的突变是R625C。在一些实施例中，SF3B1的突变包含K700E和/或R625C。
在一些实施例中，将化合物1口服施用给患者。
在一些实施例中，将化合物1每天一次施用给患者。在一些实施例中，将化合物1按照给药5天/停药9天的给药方案每天一次施用给患者。在一些实施例中，将化合物1按照给药21天/停药7天的给药方案每天一次施用给患者。在一些实施例中，将化合物1按照连续给药方案每天一次施用给患者。在一些实施例中，将化合物1按照连续给药方案每天一次施用给患者，直到观察到不良事件或药物相关毒性(例如，皮疹、中性粒细胞减少症、血小板减少症)。在一些实施例中，例如在观察到不良事件或药物相关毒性事件后，将治疗假期(treatment holiday)并入每天一次给药方案中。在一些实施例中，在每天一次连续给药至少约5天后(例如，约5天后、约7天后、约14天后、约21天后或更多天后)并入治疗假期。在一些实施例中，将化合物1每天一次施用给患者，持续一个或多个28天周期。在一些实施例中，化合物1的治疗有效量是在施用当天以单剂量给予的约2mg至约20mg。在一些实施例中，化合物1的治疗有效量是在施用当天以单剂量给予的约2mg、约3.5mg、约5mg、约7mg、约10mg、约12mg、约14或约20mg。
在一些实施例中，将化合物1每天两次施用给患者。在一些实施例中，将化合物1按照给药5天/停药9天的给药方案每天两次施用给患者。在一些实施例中，将化合物1按照给药21天/停药7天的给药方案每天两次施用给患者。在一些实施例中，将化合物1按照连续给药方案每天两次施用给患者。在一些实施例中，将化合物1按照连续给药方案每天两次施用给患者，直到观察到不良事件或药物相关毒性。在一些实施例中，将治疗假期并入每天两次给药方案中。在一些实施例中，在每天两次连续给药至少约5天后(例如，约5天后、约7天后、约14天后、约21天后或更多天后)并入治疗假期。在一些实施例中，将化合物1每天两次施用给患者，持续一个或多个28天周期。在一些实施例中，化合物1的治疗有效量是在施用当天以两个分剂量给予的总共约2mg至约20mg。在一些实施例中，化合物1的治疗有效量是在施用当天以两个分剂量给予的约10mg、约15mg或约20mg。在一些实施例中，第一和第二剂量各自独立地为约2mg至约10mg。在一些实施例中，第一和第二剂量各自独立地为约5mg至约10mg。在一些实施例中，第一剂量为约2mg至约5mg，并且第二剂量为约7mg至约10mg。在一些实施例中，第一剂量为约7mg至约10mg，并且第二剂量为约2mg至约5mg。在一些实施例中，第一剂量为约10mg，并且第二剂量为约5mg。在一些实施例中，第一剂量为约5mg，并且第二剂量为约10mg。在一些实施例中，第一剂量和第二剂量各自为约5mg。在一些实施例中，第一剂量和第二剂量各自为约7.5mg。在一些实施例中，第一剂量和第二剂量各自为约10mg。
在一些实施例中，施用给患者的化合物1的剂量随时间减少。例如，在治疗开始时，化合物1可以以约10mg的剂量每天两次施用，即第一剂量和第二剂量各自为约10mg。在一些实施例中，第一剂量和第二剂量之间的间隔为约8至约16小时，例如约10小时至约14小时(例如约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时)。然后，例如在观察到不良事件或药物相关毒性事件后，可以减少这种每日给药一次或多次。在一些实施例中，第一剂量减少包括约5mg的第一剂量和约10mg的第二剂量，或反之亦然。在一些实施例中，第二或随后的剂量减少包括各自为约5mg的第一剂量和第二剂量。
在一些实施例中，用化合物1治疗降低或消除患者的输血依赖性。在一些实施例中，与治疗前的次数或频率相比，用化合物1治疗使给予患者的输血次数或频率减少至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％或约60％。在一些实施例中，与治疗前的次数或频率相比，用化合物1治疗使给予患者的输血次数或频率减少至少约30％。在一些实施例中，与治疗前的次数或频率相比，用化合物1治疗使给予患者的输血次数或频率减少至少约60％。在一些实施例中，用化合物1观察到的输血次数或频率的减少大于用替代治疗观察到的减少。在一些实施例中，用化合物1观察到的输血之间的时间段长于用替代治疗观察到的输血之间的时间段。示例性的替代治疗包括来那度胺(参见，例如，List等人(N Engl J Med.[新英格兰医学杂志]2006；355(14)：1456-1465)、Fenaux等人(Blood.[血液]2011；118(14)：3765-3776)和罗特西普(参见，例如，Fenaux等人(N Engl J Med.[新英格兰医学杂志]2020；382(2)：140-151))。在一些实施例中，在至少连续56天(8周)的时间段内测量输血次数或频率的减少，其中该时间段在治疗开始后的任何时间开始。在一些实施例中，患者在至少连续56天(8周)的时间段内未接受任何输血，其中该时间段在治疗开始后的任何时间开始。在一些实施例中，在治疗的前24周期间在至少8周或更长时间的时间段内测量输血次数或频率的减少。在一些实施例中，在治疗的前24周期间，在至少12周或更长时间的时间段内测量输血次数或频率的减少。在一些实施例中，在治疗的前48周期间，在至少12周或更长时间的时间段内测量输血次数或频率的减少。在一些实施例中，在治疗的前24周期间，在至少16周或更长时间的时间段内测量输血次数或频率的减少。在一些实施例中，在治疗的前48周期间，在至少16周或更长时间的时间段内测量输血次数或频率的减少。在一些实施例中，输血包括红细胞(RBC)输血、血小板输血或两者。在一些实施例中，输血包括RBC输血。在一些实施例中，与治疗前的量相比，用化合物1治疗增加患者中骨髓铁粒幼红细胞的量。在一些实施例中，与治疗前的量相比，用化合物1治疗使患者中骨髓铁粒幼红细胞的量增加至少约10％、约20％、约30％或约40％。
附图说明
图1A-1C显示了入组患者的泳图(swimmer plot)及其按照基线时的疾病亚型和剪接体错义突变进行的治疗的持续时间：较低风险骨髓增生异常综合征(MDS)或慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)(图1A)、较高风险MDS或CMML(图1B)和急性骨髓性白血病(AML)(图1C)。颜色表示入组患者的剂量水平。*，CMML患者。缩写：QD，每天一次。
图2显示了第1周期第4天的化合物1的平均血浆浓度(ng/mL)(针对方案I描绘)。缩写：h，小时。
图3A-3C显示了用化合物1治疗的MDS患者的治疗前TMEM14C AJ/CJ和红细胞非输血依赖性(RBC TI)。图3A显示了箱线图，表明根据肿瘤适应证的治疗前TMEM14C AJ/CJ和研究中的RBC TI之间的关系。显示了AML、MDS或CMML的诊断。图3B显示了具有可用的治疗前TMEM14C AJ/CJ数据的MDS患者的接受者操作曲线(ROC)分析和排序。图3C显示了在治疗前TMEM14C AJ/CJ升高的MDS患者中化合物1治疗后的TMEM14C AJ/CJ比率。
图4显示了示例性研究设计(NCT02841540)。*，符合条件的患者具有足够的视力和器官功能，定义如下：肌酐≤1.7mg/dL或计算的肌酐清除率(CrCl)≥50mL/min；直接胆红素≤正常上限(ULN)的1.5倍；丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶(AST/ALT)≤ULN的3.0倍；白蛋白≥2.5mg/dL；正常的维生素A；以及视力矫正到20/40，除非是由于白内障。缩写：ALT，丙氨酸转氨酶；AML，急性骨髓性白血病；AST，天冬氨酸转氨酶；CMML，慢性骨髓单核细胞性白血病；CrCl，肌酐清除率；MDS，骨髓增生异常综合征；ULN，正常上限。
图5显示了热图，表明剪接标记物的相对表达的化合物1剂量依赖性调节。缩写：ES，外显子跳跃。
图6显示了残留样品中的RT-qPCR基因表达。箱线图表示患者子集的RT-qPCR基因表达。克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal Wallis)检验用于确定组间差异。针对第1周期第1天和第1周期第4天的TMEM14C AJ/CJ比率，RBC TI是与否的p值分别为0.055和0.025。缩写：RT-qPCR，定量逆转录PCR。
图7显示了经历RBC TI的患者中的突变。在用化合物1治疗的经历RBC TI期的患者的外周血中，在第1周期第1天在治疗前检测到突变。
图8A-8B显示了箱线图，表明在接受化合物1治疗的患者中，治疗前ABCB7表达(如通过RT-PCR测定的)与SF3B1突变(图8A)或研究中的RBC TI(图8B)之间的关系。“研究中的”RBC TI是指患者在参与研究时，例如在化合物1治疗时或在治疗随访期间经历的RBC TI。
具体实施方式
以下详细描述和实例说明了本披露的某些实施例。本领域技术人员将认识到，本披露的范围涵盖许多变化和修改。因此，某些实施例的描述不应视为限制本披露的范围。
为了更容易理解本披露，在整个详细描述中定义了某些术语。除非本文另有定义，否则与本披露结合使用的所有科学和技术术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
本文引用的所有参考文献(包括但不限于已公开和未公开的专利申请、授权专利和文献资料)通过引用并入本文，并由此成为本说明书的一部分。在引用的参考文献与本文的披露内容冲突的情况下，应以本说明书为准。
如本文所用，单词的单数形式也包括复数形式，除非上下文另有明确说明；作为示例，术语“一个、一种(a、an)”和“该(the)”应理解为单数或复数。举例来说，“一个要素”意指一个或多个要素。术语“或”应意指“和/或”，除非具体上下文另外指示。
如本文所用，术语“化合物1”是指选自具有式I的化合物及其药学上可接受的盐的至少一种实体。此外，除非另有说明，否则“化合物1”可以是该(这些)化合物的一种或多种对映体、非对映体和/或几何(或构象)形式；例如，每个不对称中心的R和S构型，(Z)和(E)双键异构体以及(Z)和(E)构象异构体。除非另有说明，否则本文描绘的与互变异构形式共存的化合物在本披露的范围内。另外，除非另有说明，否则本文描绘的结构还意在包括仅在一个或多个同位素富集的原子存在下不同的化合物。例如，具有所描绘结构(除了氢被氘或氚替代，或者碳被13C-或14C-富集的碳替代)的化合物在本披露的范围内。此类化合物可用作例如生物测定中的分析工具或探针。除非另有说明，否则化合物1的施用或使用包括其与任何合适的媒介物或赋形剂组合施用或使用，例如为期望的施用途径配制。
式I可以由以下表示：
和/或化学名称(2S，3S，4E，6S，7R，10R)-7，10-二羟基-3，7-二甲基-12-氧代-2-[(2E，4E，6R)-6-(吡啶-2-基)庚-2，4-二烯-2-基]氧杂环十二-4-烯-6-基-4-甲基哌嗪-1-甲酸酯。
术语“药学上可接受的”意指经联邦管制机构或洲政府审批通过或可由其审批通过，或在美国药典或其他普遍公认药典中列出以用于动物且更特别地用于人。
“药学上可接受的盐”为保持母体化合物的所需生物活性且不赋予非所需毒理学作用的盐。这类盐的实例为：(a)与无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)形成的酸加成盐；以及与有机酸(例如，乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡萄糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、棕榈酸、海藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等)形成的盐；和(b)由元素阴离子(如氯、溴和碘)形成的盐。参见，例如，Haynes等人，“Commentary：Occurrence of Pharmaceutically AcceptableAnions and Cations in the Cambridge Structural Database[评论：剑桥结构数据库中药学上可接受的阴离子和阳离子的存在]，”J.Pharmaceutical Sciences[药物科学杂志]，第94卷，第10期(2005)，和Berge等人，“Pharmaceutical Salts[药用盐]”，J.Pharmaceutical Sciences[药物科学杂志]，第66卷，第1期(1977)，将其通过引用并入本文。
例如，化合物1的“治疗有效量”是足以实现特定规定目的(例如在向患者施用后产生治疗作用)的量。在MDS的情况下，治疗有效量的化合物1可降低患者的TMEM14C AJ/CJ比率、减少给予患者的输血次数或频率、增加患者中骨髓铁粒幼红细胞的数量、缓解MDS的一种或多种症状、和/或提供治疗功效的一些其他指标。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现期望的预防结果(例如防止或降低使患者变得依赖于输血的风险)的量。典型地，由于预防剂量在疾病之前或在疾病早期阶段时用于患者中，所以预防有效量将小于治疗有效量。
如本文所用，术语“治疗(treat或treatment)”或“治疗性(therapeutic)”(和语法上相关的术语)是指疾病的任何后果的任何改善，如输血依赖性的降低或消除、延长的存活期、较低发病率和/或由替代性治疗模式引起的副作用减轻。治疗操作(treatment act)涵盖但不需要疾病或其症状或后果的完全根除。例如，对患有MDS的患者的输血依赖性进行治疗包括减少给予患者的输血次数和/或频率，但不需要消除对输血的需要。治疗还可以指将化合物1施用给患者，例如输血依赖的MDS患者。治疗可用于防止、治愈、愈合、减轻、缓解、更改、补救、改善、缓和、改进或影响疾病、疾病的一种或多种症状或后果、或患疾病的倾向性，例如MDS或与MDS相关的输血依赖性。在一些实施例中，治疗降低或消除患者的输血依赖性。
术语“受试者”与“患者”在本文中可互换用于指任何动物，如任何哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物等。在一些实施例中，受试者或患者是哺乳动物。在一些实施例中，受试者或患者是人。
如本文所用，如果患者将在生物学上、医学上和/或生活质量上受益于治疗，则该患者“适于”或“需要”该治疗。在一些实施例中，适于用化合物1治疗的患者是具有特定TMEM14C AJ/CJ比率的输血依赖的MDS患者。在一些实施例中，TMEM14C AJ/CJ比率用作生物标记物，以预测或确定患者是否可能响应或受益于化合物1的治疗。在一些实施例中，患者具有升高的TMEM14C AJ/CJ比率，例如超过对照(例如，未患有MDS的对照受试者)中的比率的比率。在一些实施例中，使用一种或多种用于检测和定量核酸的方法(如本文所述的示例性方法中的任一种)测量升高的TMEM14C AJ/CJ比率。在一些实施例中，使用基于PCR的方法(如实时PCR(RT-PCR))测量升高的TMEM14C AJ/CJ比率。在一些实施例中，使用核酸条形码测量升高的TMEM14C AJ/CJ比率。在一些实施例中，升高的TMEM14C AJ/CJ比率是超过对照中的比率的比率，如通过核酸条形码所测量的。在一些实施例中，升高的TMEM14C AJ/CJ比率是大于约4的比率，如通过核酸条形码所测量的。在一些实施例中，患者或来自患者的生物样品具有低水平的TMEM14C表达。在一些实施例中，化合物1减少或抑制患者的TMEM14C异常剪接。
如本文所用，术语“剪接变体”是指跨越基因中两个外显子序列之间或跨越内含子-外显子边界的连接的核酸序列，其中该连接可以被可变剪接。可变剪接包括可变3′剪接位点选择(“3’ss”)、可变5′剪接位点选择(“5’ss”)、差异性外显子包含、外显子跳跃和内含子保留。
与给定基因组位置相关的某些剪接变体可称为野生型或“规范”剪接变体。野生型剪接变体是在人群中最常见的变体。表达为RNA转录物的这些剪接变体可称为“规范连接”或“CJ”转录物。TMEM14C的示例性规范序列是CCGGGGCCTTCGTGAGACCGGTGCAGGCCTGGGGTAGTCT(SEQ ID NO：1)(基因：TMEM14C；连接：chr6：10723474-10724802)。本文还提供了规范剪接位点的实例。参见，例如，SEQ ID NO：5(TMEM14C)和SEQ ID NO：6(ABCB7)中所示的“AG”规范3′剪接位点。Dolatshad等人描述了规范剪接位点的另外的非限制性实例(Leukemia.[白血病]2016；30：2322-2331，例如，在补充图2中)，将其通过引用并入本文用于披露此类位点。
另外的剪接变体可称为“异常”剪接变体，其不同于规范剪接变体。表达为RNA转录物的这些剪接变体可称为“异常连接”或“AJ”转录物。TMEM14C的示例性异常序列是CCGGGGCCTTC GTGAGACCGCTTGTTTTCTGCAGGTGCAG(SEQ ID NO：2)(基因：TMEM14C；连接：chr6：10723474-10724788)。本文还提供了异常剪接位点的实例。参见，例如，SEQ ID NO：5(TMEM14C)和SEQ ID NO：6(ABCB7)中所示的“AG”隐蔽3′剪接位点。Dolatshad等人描述了异常剪接位点的另外的非限制性实例(Leukemia.[白血病]2016；30：2322-2331，例如，在补充图2中)，将其通过引用并入本文用于披露此类位点。
术语“AJ/CJ比率”是指特定基因或基因座(例如，TMEM14C)的异常连接与规范连接转录物的比率。术语“TMEM14C AJ/CJ比率”是指例如在患者或来自患者的样品中异常连接与规范连接TMEM14C转录物的比率。用于检测和定量核酸的示例性方法包括核酸条形码、纳米颗粒探针、原位杂交、微阵列、核酸测序和基于PCR的方法，包括实时PCR(RT-PCR)。在一些实施例中，TMEM14C AJ/CJ比率通过测量患者或来自患者的样品(例如血液样品、骨髓样品和/或尿液样品)中的RNA转录物来确定。在一些实施例中，测量RNA转录物包括核酸条形码和/或RT-PCR。在一些实施例中，使用核酸条形码确定TMEM14C AJ/CJ比率。
当用于描述患者或来自患者的样品中的TMEM14C AJ/CJ比率时，术语“升高的”意指异常连接与规范连接TMEM14C转录物的比率大于约0.1(例如，大于约0.1、约0.2、约0.5、约1、约2、约4、约10、约15、约20、约30或更大)，例如，如通过核酸条形码所测量的。在一些实施例中，升高的TMEM14C AJ/CJ比率是大于约4的比率，如通过核酸条形码所测量的(例如，使用在例如美国专利号8,519,115；美国专利号7,919,237；和Kulkarni(CurrentProtocols in Molecular Biology[现行分子生物学方案]，2011；94：25B.10.1-25B.10.17)中描述的测定(NanoString科技公司(NanoStringTechnologies)))。/>
当用于描述患者或来自患者的样品中的TMEM14C表达时，术语“低”意指该水平低于健康受试者中的水平。
如本文所用，术语“ABCB7”表示编码ATP结合盒亚家族B成员7、膜相关蛋白和ATP结合盒(ABC)转运蛋白超家族成员的基因。示例性ABCB7序列包括但不限于：ABCB7，转录物变体1(UCSC：uc004ebz.4；RefSeq：NM_004299.6)；ABCB7，转录物变体2(UCSC：uc004eca.4；RefSeq：NM_001271696.3)；ABCB7，转录物变体3(UCSC：uc010nlt.4；RefSeq：NM_001271697.3)；ABCB7，转录物变体4(UCSC：uc011mqn.3；RefSeq：NM_001271698.3)；和ABCB7，转录物变体5(UCSC：uc010nls.4；RefSeq：NM_001271699.3)。ABCB7的示例性引物序列包括例如正向引物AATGAACAAAGCAGATAATGATGCAGG(SEQ ID NO：7)和反向引物TCCCTGACTGGCGAGCACCATTA(SEQ ID NO：8)。参见，例如，Shiozawa等人Nat Commun.[自然通讯]2018；9(1)：3649，例如在补充表5中，将其通过引用并入本文用于披露此类引物序列。此类引物可用于检测ABCB7表达。本领域技术人员还可以设计引物来检测ABCB7的剪接变体。在一些实施例中，本文所述的引物用于检测患者或来自患者的样品中的ABCB7表达(例如，总ABCB7表达)。在一些实施例中，使用一种或多种用于检测和定量核酸的方法(如本文所述的示例性方法中的任一种)测量ABCB7表达。在一些实施例中，使用基于PCR的方法(如实时PCR(RT-PCR))测量ABCB7表达。
如本文所用，术语“PPOX”表示编码血红素生物合成的倒数第二酶的基因，该酶催化原卟啉原IX的6-电子氧化以形成原卟啉IX。示例性PPOX序列包括但不限于：PPOX，转录物变体1(RefSeq：NM_000309.5)；PPOX，转录物变体2(RefSeq：NM_001122764.3)；PPOX，转录物变体3(RefSeq：NM_001350128.2)；PPOX，转录物变体4(RefSeq：NM_001350129.2)；和PPOX，转录物变体5(RefSeq：NM_001350130.2)。PPOX的示例性引物序列包括例如正向引物GGCCCTAATGGTGCTATCTTTG(SEQ ID NO：9)和反向引物CTTCTGAATCCAAGCCAAGCTC(SEQ IDNO：10)。参见，例如，Shiozawa等人Nat Commun.[自然通讯]2018；9(1)：3649，例如在补充表5中，将其通过引用并入本文用于披露此类引物序列。此类引物可用于检测PPOX表达。本领域技术人员还可以设计引物来检测PPOX的剪接变体。在一些实施例中，本文所述的引物用于检测患者或来自患者的样品中的PPOX表达(例如，总PPOX表达)。在一些实施例中，使用一种或多种用于检测和定量核酸的方法(如本文所述的示例性方法中的任一种)测量PPOX表达。在一些实施例中，使用基于PCR的方法(如实时PCR(RT-PCR))测量PPOX表达。
如本文所用，术语“SF3B1”表示编码剪接因子3b蛋白复合物的亚基1的基因。剪接因子3b是U2小核核糖核蛋白复合物(U2snRNP)的组分，其在含有分支点位点的区域结合前体mRNA并参与剪接体在3′剪接位点(3′ss)处的早期识别和稳定。在一些实施例中，野生型人SF3B1蛋白如SEQ ID NO：3所示(GenBank登录号NP_036565，版本NP_036565.2)(Bonnal等人Nature Review Drug Discovery[自然评论药物发现]2012；11：847-859)或编码核酸序列如SEQ ID NO：4所示(GenBank登录号NM_012433，版本NM_012433.4)。
在一些实施例中，SF3B1突变在蛋白质或核酸水平上被确定为不同于SEQ ID NO：3所示的人野生型SF3B1蛋白质的氨基酸序列或SEQ ID NO：4所示的编码核酸序列的SF3B1序列。在一些实施例中，一个或多个SF3B1突变包括点突变(例如错义或无义突变)、插入和/或缺失。在一些实施例中，一个或多个SF3B1突变包括体细胞突变。在一些实施例中，一个或多个SF3B1突变包括杂合突变或纯合突变。示例性SF3B1突变包括在SF3B1中的位置E622、H662、K666、K700、R625或V701中的一个或多个处的突变。在一些实施例中，SF3B1的突变包含在SF3B1中的位置H662、K700或R625中的一个或多个处的突变或由其组成。在一些实施例中，SF3B1的突变包含在SF3B1中的位置K700处的突变或由其组成。在一些实施例中，在位置K700处的突变是K700E。在一些实施例中，在位置R625处的突变是R625C。在一些实施例中，SF3B1的突变包含K700E和/或R625C。
可以使用本领域已知的任何方法在蛋白质或核酸水平上确定剪接体蛋白中的突变，例如SF3B1、SRSF2、U2AF1和/或ZRSR2中的一个或多个突变(例如SF3B1中的一个或多个突变)的检测。存在多种用于检测、定量和测序核酸或其编码的蛋白质的方法，并且每种方法可以适用于检测本文披露的实施例中的突变(例如，SF3B1突变)。示例性方法包括定量核酸的测定，如原位杂交、微阵列、核酸测序、基于PCR的方法(包括实时PCR(RT-PCR))、全外显子组测序、单核苷酸多态性分析、深度测序、靶向基因测序或其任何组合。在一些实施例中，前述技术和程序根据例如Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2000))中描述的方法进行。
如本文所用，术语“骨髓增生异常综合征”或“MDS”是指由形成不良的血细胞或不能正常工作的血细胞引起的血液障碍。MDS的特征可在于以下中的一个或多个：无效的血细胞生成、进行性血细胞减少症、进展为急性白血病或具有受损形态的细胞骨髓的风险、以及成熟(骨髓生成障碍)。通常与MDS相关的症状包括但不限于贫血、血小板减少症、中性粒细胞减少症、血细胞减少症、两系血细胞减少症(bicytopenia)(两种缺陷型细胞)和全血细胞减少症(三种缺陷型细胞)。
如本文所用，术语“MDS患者”是指已根据世界卫生组织(WHO)2008分类(在Vardiman等人Blood[血液]2009；114(5)：937-951中综述)诊断为MDS的患者。在一些实施例中，使用身体检查和/或一种或多种诊断测试进行或确认诊断。本文描述了用于诊断MDS的示例性测试，包括血液测试、外周(循环)血涂片、骨髓穿刺和活检、分子测试、细胞遗传学(染色体)分析和免疫表型分析。MDS患者可以是输血依赖的或非输血依赖的。
MDS可基于所涉及的血细胞类型(例如，红细胞、白细胞、血小板)分为亚型。MDS的亚型(例如，根据WHO 2008分类的那些)在本文中描述并且包括：伴单系发育异常的MDS(MDS-SLD)、伴多系发育异常的MDS(MDS-MLD)、伴环形铁粒幼红细胞的MDS(MDS-RS)、伴原始细胞过多的MDS(MDS-EB)、与孤立del(5q)相关的MDS和不能分类的MDS(MDS-U)。
伴单系发育异常的MDS(MDS-SLD)可包括和/或被称为伴单系发育异常的难治性血细胞减少症(RCUD)、难治性贫血(RA)、难治性中性粒细胞减少症(RN)和/或难治性血小板减少症(RT)。MDS-SLD通常涉及一种血细胞类型(例如红细胞、白细胞、血小板)，其数量少且在显微镜下出现异常。在一些实施例中，MDS-SLD的血液发现结果包括以下中的一种或多种：单系血细胞减少症或两系血细胞减少症，无或罕见原始细胞(＜1％)。偶尔可观察到两系血细胞减少症；然而，全血细胞减少症的病例通常被分类为MDS-U。在一些实施例中，MDS-SLD的骨髓发现结果包括以下中的一种或多种：单系发育异常、≥10％的受影响谱系的细胞发育异常、＜5％的原始细胞和＜15％的红系前体细胞是环形铁粒幼红细胞。
伴多系发育异常的MDS(MDS-MLD)可包括和/或被称为伴多系发育异常的难治性血细胞减少症(RCMD)。MDS-MLD通常涉及两种或三种异常血细胞类型。在一些实施例中，MDS-MLD的血液发现结果包括以下中的一种或多种：一种或多种血细胞减少症、无或罕见原始细胞(＜1％)、无奥氏小体(Auer rod)和＜1×109/升单核细胞。在一些实施例中，MDS-MLD的骨髓发现结果包括以下中的一种或多种：两种或更多种髓系细胞(例如中性粒细胞和/或红系前体细胞和/或巨核细胞)中≥10％发育异常、＜5％的原始细胞、无奥氏小体和＜15％的环形铁粒幼红细胞。
伴环形铁粒幼红细胞的MDS(MDS-RS)可包括和/或被称为伴环形铁粒幼红细胞的难治性贫血(RARS)。MDS-RS通常涉及少量的一种或多种血细胞类型。MDS-RS的典型特征是骨髓中现有的红细胞通常含有称为环形铁粒幼红细胞的过量铁环。通常，至少15％的铁粒幼红细胞是环形铁粒幼红细胞。在一些实施例中，MDS-RS的血液发现结果包括以下中的一种或多种：贫血和无原始细胞。在一些实施例中，MDS-RS的骨髓发现结果包括以下中的一种或多种：仅红系细胞发育异常和≥15％的红系前体细胞是环形铁粒幼红细胞。
伴原始细胞过多的MDS(MDS-EB)具有至少两种类型。在1型(MDS-EB1)和2型(MDS-EB2)两者中，三种类型的血细胞(红细胞、白细胞或血小板)中的任一种都可能偏低，并且在显微镜下出现异常。在血液和骨髓中经常发现非常不成熟的血细胞(原始细胞)。
MDS-EB1可包括和/或被称为伴原始细胞过多的难治性贫血-1(RAEB-1)。在一些实施例中，MDS-EB1的血液发现结果包括以下中的一种或多种：一种或多种血细胞减少症、＜5％的原始细胞、无奥氏小体和＜1×109/升单核细胞。在一些实施例中，MDS-EB1的骨髓发现结果包括以下中的一种或多种：单系或多系发育异常、5％-9％的原始细胞和无奥氏小体。在一些实施例中，在MDS-EB1中，原始细胞占骨髓细胞的5％-9％或血液细胞的2％-4％。在一些实施例中，如果骨髓成髓细胞百分比为＜5％而血液中存在2％-4％的成髓细胞，则将MDS分类为MDS-EB1；然而，如果骨髓成髓细胞百分比为＜5％且血液中存在1％的成髓细胞，则将MDS分类为MDS-U。
MDS-EB2可包括和/或被称为伴原始细胞过多的难治性贫血-2(RAEB-2)。在一些实施例中，MDS-EB2的血液发现结果包括以下中的一种或多种：一种或多种血细胞减少症、5％-19％的原始细胞、奥氏小体和＜1×109/升单核细胞。在一些实施例中，MDS-EB2的骨髓发现结果包括以下中的一种或多种：单系或多系发育异常、10％-19％的原始细胞和奥氏小体。在一些实施例中，在MDS-EB2中，原始细胞占骨髓细胞的10％-19％和/或血液细胞的5％-19％。具有奥氏小体和血液中＜5％成髓细胞以及骨髓中＜10％成髓细胞的病例通常被分类为MDS-EB2。
与孤立del(5q)相关的MDS通常涉及少量的红细胞和在其DNA中具有特定突变(例如，del(5q31-33)细胞遗传学异常)的细胞。在一些实施例中，与孤立del(5q)相关的MDS的血液发现结果包括以下中的一种或多种：贫血、通常正常或增加的血小板计数、以及无或罕见原始细胞(＜1％)。在一些实施例中，与孤立del(5q)相关的MDS的血液发现结果包括以下中的一种或多种：正常至增加的具有低分叶核(hypolobated nuclei)的巨核细胞、＜5％的原始细胞、孤立del(5q)细胞遗传学异常、以及无奥氏小体。
不能分类的MDS(MDS-U)通常涉及三种类型的成熟血细胞之一的数量减少，并且白细胞或血小板在显微镜下看起来异常。在一些实施例中，MDS-U的血液发现结果包括以下中的一种或多种：血细胞减少症和≤1％的原始细胞。在一些实施例中，MDS-U的骨髓发现结果包括以下中的一种或多种：一种或多种骨髓细胞系中少于10％的细胞出现明确的发育异常、＜5％的原始细胞。
患有MDS的患者常用的临床预后工具是国际预后评分系统(IPSS)(Greenberg等人Blood.[血液]1997；89：2079-2088)。在该系统中，基于三个标准进行评分：骨髓原始细胞的百分比、外周血血细胞减少症的数量和细胞遗传学风险等级。基于总评分，患者被分配到结果显著不同的4个风险类别中的1个：低风险(LR)、中等-1(INT-1)、中等-2(INT-2)和高风险(HR)。在一些实施例中，根据IPSS标准对MDS患者进行评估和/或分类。
修订的国际预后评分系统(IPSS-R)是用于患有MDS的患者的风险分层和预后的另一示例性标准(Greenberg等人Blood.[血液]2012；120(12)：2454-2465)。IPSS-R基于临床特征区分患者，并将他们分为五个定义的风险组：极低、低、中等、高和极高。IPSS-R基于骨髓原始细胞百分比、细胞遗传学、血红蛋白水平、绝对中性粒细胞计数(ANC)和血小板计数对疾病进行评分。在一些实施例中，根据IPSS-R标准对MDS患者进行评估和/或分类。
如果患者根据IPSS标准被分类为具有中等-2风险或更高风险的MDS或根据IPSS-R标准被分类为具有高风险或极高风险的MDS，则该患者可被称为患有“较高风险MDS”。在一些实施例中，患有较高风险MDS的患者以约5％或更高的变体等位基因频率携带SF3B1突变(例如，SF3B1错义突变)。在一些实施例中，患有较高风险MDS的患者不耐受低甲基化剂(HMA)。在一些实施例中，患有较高风险MDS的患者在开始HMA后疾病状态进展和/或恶化。在一些实施例中，患有较高风险MDS的患者对地西他滨的约4个治疗周期和/或阿扎胞苷的约6个治疗周期无反应。
如果患者根据IPSS标准被分类为具有中等-1风险或更低风险的MDS或根据IPSS-R标准被分类为具有中等、低或极低风险的MDS，则该患者可被称为患有“较低风险MDS”。在一些实施例中，患有较低风险MDS的患者以约5％或更高的变体等位基因频率携带SF3B1突变(例如，SF3B1错义突变)。在一些实施例中，患有较低风险MDS的患者具有大于或等于约500/μL(0.5×109/L)的绝对中性粒细胞计数(ANC)。在一些实施例中，患有较低风险MDS的患者具有小于约50,000/μL(50×109/L)的血小板计数。
在一些实施例中，患有较低风险MDS的患者对红细胞(RBC)和/或血小板是输血依赖的。在一些实施例中，根据国际工作组(IWG)2006关于MDS的反应标准(Cheson等人Blood.[血液]2006；108：419-425)，患有较低风险MDS的患者是RBC输血依赖的。在一些实施例中，RBC输血依赖的较低风险MDS患者在第一剂量的化合物1之前针对＜9g/dL的血红蛋白(Hb)在8周内已接受至少4U的RBC。在一些实施例中，RBC输血依赖的较低风险患者对红细胞生成刺激剂(ESA)表现失败(原发性抗性或反应后复发)和/或具有＞500U/L的血清促红细胞生成素(EPO)水平。
如本文所用，术语“输血依赖性”或“输血依赖的”是指一种严重贫血情况，通常在红细胞生成减少时发生，使得患者在指定间隔(例如约连续56天(约8周))内持续需要一次或多次输血(例如红细胞(RBC)输血、血小板输血或两者)。如果患者在至少连续56天的时间段内需要一次或多次输血，则该患者可被认为是输血依赖的。在一些实施例中，患者在用化合物1治疗之前是输血依赖的。在一些实施例中，患者对红细胞(RBC)、血小板或两者是输血依赖的。在一些实施例中，患者对RBC是输血依赖的。在一些实施例中，输血依赖的患者在用第一剂量的化合物1治疗之前针对＜9g/dL的血红蛋白在连续56天(8周)内已接受至少4U的RBC。在一些实施例中，输血依赖的患者对红细胞生成刺激剂(ESA)表现失败。在一些实施例中，输血依赖的患者具有＞500U/L的血清促红细胞生成素水平。在一些实施例中，输血依赖的患者在约连续56天(约8周)没有输血的情况下具有高于50×109/L的血小板计数。
如本文所用，术语“非输血依赖性”或“非输血依赖的”是指患者在指定间隔(例如，约连续56天(约8周))内减少输血次数或频率或不再需要输血的情况。如果患者在用化合物1治疗期间的至少连续56天的任何时间段内(例如第156天、第257天、第3至58天等)不需要或接受任何输血，则该患者可被认为是非输血依赖的。在一些实施例中，患者在至少8周、至少9周、至少10周、至少12周、至少14周、至少16周或更长时间内是非输血依赖的。在一些实施例中，患者对红细胞(RBC)、血小板或两者是非输血依赖的。在一些实施例中，患者对RBC是非输血依赖的。
在一些实施例中，如在例如NCT00065156中定义和/或评估非输血依赖性。在NCT00065156(“Lenalidomide Safety/Efficacy in Myelodysplastic Syndromes(MDS)Associated With a Deletion(Del)(5q)Cytogenetic Abnormality[来那度胺在与缺失(Del)(5q)细胞遗传学异常相关的骨髓增生异常综合征(MDS)中的安全性/功效]”)中，非输血依赖性被定义为在至少连续56天的时间段不给予患者输血并且患者的血红蛋白浓度升高至少1g/分升；轻度反应被定义为与基线要求相比输血次数减少至少50％；并且将不再需要输血的患者的血红蛋白浓度的升高计算为在治疗前56天(8周)期间最大血红蛋白浓度与最小输血前值之间的差值。
治疗方法和用途
在一些实施例中，本披露提供了新型生物标记物治疗患有MDS的患者的输血依赖性的方法和用途。更具体地，在一些实施例中，本披露提供了治疗患有MDS的患者的输血依赖性的方法，其包括向具有升高的TMEM14C AJ/CJ比率的输血依赖的MDS患者施用治疗有效量的化合物1。在一些实施例中，本披露提供了治疗患有MDS的患者的输血依赖性的方法，其包括向与对照(例如，未患有MDS的对照受试者)相比具有升高水平的异常连接TMEM14C转录物(TMEM14C AJ)的输血依赖的MDS患者施用治疗有效量的化合物1。在一些实施例中，本披露提供了TMEM14C AJ/CJ比率作为生物标记物用于治疗患有MDS的患者的输血依赖性的用途。在一些实施例中，本披露提供了TMEM14C AJ/CJ比率作为生物标记物在制备用于治疗患有MDS的患者的输血依赖性的药物中的用途。在一些实施例中，本披露提供了用作生物标记物的TMEM14C AJ/CJ比率，用于治疗患有MDS的患者的输血依赖性。在一些实施例中，该治疗包括向具有升高的TMEM14C AJ/CJ比率的输血依赖的MDS患者施用治疗有效量的化合物1。在一些实施例中，患者或来自患者的生物样品具有低水平的TMEM14C表达。在一些实施例中，化合物1减少或抑制患者的TMEM14C异常剪接。
在一些实施例中，本披露提供了治疗患有MDS的患者的输血依赖性的方法，其包括：(a)确定该输血依赖的MDS患者具有升高的TMEM14C AJ/CJ比率；以及(b)向该患者施用治疗有效量的化合物1。在一些实施例中，本披露提供了治疗患有MDS的患者的输血依赖性的方法，其包括：(a)确定与对照(例如，未患有MDS的对照受试者)相比，该输血依赖的MDS患者具有升高水平的异常连接TMEM14C转录物(TMEM14C AJ)；以及(b)向该患者施用治疗有效量的化合物1。在一些实施例中，本披露提供了治疗患有MDS的患者的输血依赖性的方法，其包括：(a)通过确定患者具有升高的TMEM14C AJ/CJ比率来选择用于治疗的输血依赖的MDS患者；以及(b)向该患者施用治疗有效量的化合物1。在一些实施例中，本披露提供了TMEM14C AJ/CJ比率作为生物标记物用于治疗患有MDS的患者的输血依赖性的用途。在一些实施例中，本披露提供了TMEM14C AJ/CJ比率作为生物标记物在制备用于治疗患有MDS的患者的输血依赖性的药物中的用途。在一些实施例中，本披露提供了用作生物标记物的TMEM14C AJ/CJ比率，用于治疗患有MDS的患者的输血依赖性。在一些实施例中，该治疗包括：(a)确定该输血依赖的MDS患者具有升高的TMEM14C AJ/CJ比率；以及(b)向该患者施用治疗有效量的化合物1。在一些实施例中，患者或来自患者的生物样品具有低水平的TMEM14C表达。在一些实施例中，化合物1减少或抑制患者的TMEM14C异常剪接。
在一些实施例中，本披露还提供了鉴定适合用化合物1治疗的MDS患者和/或预测或监测MDS患者中的治疗功效的方法。在一些实施例中，本披露提供了鉴定适合用化合物1治疗的输血依赖的MDS患者的方法，其包括：(a)确定该患者具有升高的TMEM14C AJ/CJ比率；以及(b)鉴定该患者适合用化合物1治疗。在一些实施例中，本披露提供了TMEM14C AJ/CJ比率作为生物标记物用于鉴定适合用化合物1治疗的输血依赖的MDS患者的用途。在一些实施例中，本披露提供了TMEM14C AJ/CJ比率作为生物标记物在制备用于鉴定适合用化合物1治疗的输血依赖的MDS患者的组合物中的用途。在一些实施例中，本披露提供了用作生物标记物的TMEM14C AJ/CJ比率，用于鉴定适合用化合物1治疗的输血依赖的MDS患者。在一些实施例中，该鉴定包括：(a)确定该患者具有升高的TMEM14C AJ/CJ比率；以及(b)鉴定该患者适合用化合物1治疗。在一些实施例中，患者或来自患者的生物样品具有低水平的TMEM14C表达。在一些实施例中，化合物1减少或抑制患者的TMEM14C异常剪接。
在一些实施例中，本披露提供了监测输血依赖的MDS患者中的治疗功效的方法，其包括：(a)确定该患者具有升高的TMEM14C AJ/CJ比率；(b)向该患者施用治疗有效量的化合物1；以及(c)确定施用后该患者的TMEM14C AJ/CJ比率，其中施用后该TMEM14C AJ/CJ比率的降低表明有效治疗。在一些实施例中，该TMEM14C AJ/CJ比率在步骤(c)之后保持升高，并且该方法还包括向该患者施用另外剂量的化合物1。在一些实施例中，该方法还包括向该患者施用另外剂量的化合物1直至该TMEM14C AJ/CJ比率不再升高。在一些实施例中，本披露提供了TMEM14C AJ/CJ比率作为生物标记物用于监测输血依赖的MDS患者中的治疗功效的用途。在一些实施例中，本披露提供了TMEM14C AJ/CJ比率作为生物标记物在制备用于监测输血依赖的MDS患者中的治疗功效的组合物中的用途。在一些实施例中，本披露提供了用作生物标记物的TMEM14C AJ/CJ比率，用于监测输血依赖的MDS患者中的治疗功效。在一些实施例中，该监测包括：(a)确定该患者具有升高的TMEM14C AJ/CJ比率；(b)向该患者施用治疗有效量的化合物1；以及(c)确定施用后该患者的TMEM14C AJ/CJ比率，其中施用后该TMEM14C AJ/CJ比率的降低表明有效治疗。在一些实施例中，该TMEM14C AJ/CJ比率在步骤(c)之后保持升高，并且该监测还包括向该患者施用另外剂量的化合物1。在一些实施例中，该监测还包括向该患者施用另外剂量的化合物1直至该TMEM14C AJ/CJ比率不再升高。在一些实施例中，患者或来自患者的生物样品具有低水平的TMEM14C表达。在一些实施例中，化合物1减少或抑制患者的TMEM14C异常剪接。
在本文披露的方法和用途的一些实施例中，MDS患者是已根据WHO 2008分类(在Vardiman等人.Blood[血液]2009；114(5)：937-951中综述)诊断为MDS的患者。在一些实施例中，MDS是伴多系发育异常的MDS(MDS-MLD)、伴单系发育异常的MDS(MDS-SLD)、伴环形铁粒幼红细胞的MDS(MDS-RS)、伴原始细胞过多的MDS(MDS-EB)、与孤立del(5q)相关的MDS或不能分类的MDS(MDS-U)。在一些实施例中，根据国际预后评分系统，MDS是具有中等-1风险或更低风险的MDS。在一些实施例中，根据国际预后评分系统，MDS是具有中等-2风险或更高风险的MDS。在一些实施例中，MDS是MDS-MLD。在一些实施例中，MDS是MDS-EB。在一些实施例中，MDS-EB是MDS-EB1或MDS-EB2。在一些实施例中，MDS是MDS-EB2。
在一些实施例中，根据IPSS标准，MDS是具有较低风险的MDS，即具有中等-1风险或更低风险。在一些实施例中，患有较低风险MDS的患者以约5％或更高的变体等位基因频率携带SF3B1突变(例如，SF3B1错义突变)。在一些实施例中，患有较低风险MDS的患者具有大于或等于约500/μL(0.5×109/L)的绝对中性粒细胞计数(ANC)。在一些实施例中，患有较低风险MDS的患者具有小于约50,000/μL(50×109/L)的血小板计数。
在一些实施例中，患有较低风险MDS的患者对红细胞(RBC)和/或血小板是输血依赖的。在一些实施例中，根据IWG 2006关于MDS的反应标准(Cheson等人Blood.[血液]2006；108：419-425)，患有较低风险MDS的患者是RBC输血依赖的。在一些实施例中，RBC输血依赖的较低风险MDS患者在第一剂量的化合物1之前在约6至约10周内(例如，在约8周内)已接受至少约4U的RBC(例如4U、6U、8U、10U或更多的RBC)。在一些实施例中，至少约4U的RBC是针对小于约9g/dL(例如，9g/dL、8g/dL、7g/dL、6g/dL或更少)的血红蛋白(Hb)。在一些实施例中，RBC输血依赖的较低风险MDS患者在第一剂量的化合物1之前针对＜9g/dL的血红蛋白(Hb)在8周内已接受至少4U的RBC。在一些实施例中，RBC输血依赖的较低风险患者对红细胞生成刺激剂(ESA)表现失败(原发性抗性或反应后复发)和/或具有＞500U/L的血清EPO水平。
在一些实施例中，使用身体检查和/或一种或多种诊断测试进行或确认MDS的诊断。用于诊断MDS的示例性测试包括血液测试、外周(循环)血涂片、骨髓穿刺和活检、分子测试、细胞遗传学(染色体)分析和免疫表型分析。
在一些实施例中，已使用血液测试(单独或与一种或多种另外的诊断测试组合)诊断MDS患者患有MDS。全血计数(CBC)可测量红细胞、白细胞和血小板的数量。也可进行血液测试以排除可引起类似于MDS的症状(如低水平的维生素B12、叶酸、铜和甲状腺问题)的其他病症。
在一些实施例中，已使用外周(循环)血涂片(单独或与一种或多种另外的诊断测试组合)诊断MDS患者患有MDS。在一些实施例中，将一滴血置于载玻片上，涂抹成薄膜，置于显微镜下进行检查，并对不同细胞类型的数量和/或百分比进行计数。还可以观察显微镜下细胞的外观(即细胞形态)以鉴定细胞是否或如何不同于健康细胞。
在一些实施例中，已使用骨髓穿刺和/或活检(单独或与一种或多种另外的诊断测试组合)诊断MDS患者患有MDS。这两种方法是相似的，并且通常同时进行以检查骨髓。骨髓具有固体和液体部分两者。骨髓穿刺用针取出流体样品。骨髓活检是使用针取出少量固体组织。在一些实施例中，然后对一个或多个样品进行分析以确定红细胞、白细胞、血小板和/或原始细胞的百分比。通常，骨髓组织的外观以及血细胞计数和染色体分析可用于确认MDS的诊断。
在一些实施例中，已使用分子测试(单独或与一种或多种另外的诊断测试组合)诊断MDS患者患有MDS。可进行实验室测试(例如在骨髓样品上)以鉴定MDS特有的特定基因、蛋白质和/或其他因子。
在一些实施例中，已使用细胞遗传学(染色体)分析(单独或与一种或多种另外的诊断测试组合)诊断MDS患者患有MDS。血液和/或骨髓中细胞的染色体可显示出有助于鉴定MDS和将MDS与其他血液障碍区分开的特定异常。
在一些实施例中，已使用免疫表型分析(单独或与一种或多种另外的诊断测试组合)诊断MDS患者患有MDS。免疫表型分析是对细胞表面上的抗原(一种特定类型的蛋白质)的检查。免疫表型分析可有助于鉴定MDS的类型。
在本文披露的方法和用途的各种实施例中，进一步评估已诊断患有MDS的MDS患者是否存在剪接体蛋白中的一个或多个突变，例如SF3B1、SRSF2、U2AF1和/或ZRSR2中的一个或多个突变(例如SF3B1中的一个或多个突变)。在一些实施例中，患者或来自患者的生物样品包含与RNA剪接相关的一个或多个基因的突变。在一些实施例中，患者或来自患者的生物样品包含选自SF3B1、SRSF2、U2AF1和ZRSR2的一个或多个基因的突变。
在一些实施例中，患者或来自患者的生物样品(例如，血液样品、骨髓样品和/或尿液样品)包含SF3B1的突变。在一些实施例中，SF3B1的突变包含在SF3B1中的位置E622、H662、K666、K700、R625或V701中的一个或多个处的突变或由其组成。在一些实施例中，SF3B1的突变包含在SF3B1中的位置H662、K700或R625中的一个或多个处的突变或由其组成。在一些实施例中，SF3B1的突变包含在SF3B1中的位置K700处的突变或由其组成。在一些实施例中，在位置K700处的突变是K700E。在一些实施例中，在位置R625处的突变是R625C。在一些实施例中，SF3B1的突变包含SF3B1中的K700E、R625C和/或至少一个另外的突变(例如，至少一个其他HEAT结构域突变)或由其组成。
在一些实施例中，患者或来自患者的生物样品(例如，血液样品、骨髓样品和/或尿液样品)包含SRSF2的突变。在一些实施例中，SRSF2的突变包含SRSF2中的P95H、P95L、P95_R102del和/或至少一个另外的突变或由其组成。
在一些实施例中，患者或来自患者的生物样品(例如，血液样品、骨髓样品和/或尿液样品)包含U2AF1的突变。在一些实施例中，U2AF1的突变包含U2AF1中的Q157P、S34F和/或至少一个另外的突变(例如，至少一个其他热点突变)或由其组成。
在一些实施例中，患者或来自患者的生物样品(例如，血液样品、骨髓样品和/或尿液样品)包含ZRSR2的突变。在一些实施例中，ZRSR2的突变包含ZRSR2中的至少一个截短或无义突变或由其组成。
本文描述了用于检测剪接体蛋白中的突变(例如上文鉴定的那些)的示例性方法。
在本文披露的方法和用途的各种实施例中，确定患有MDS的患者的TMEM14C AJ/CJ比率(例如，升高的TMEM14C AJ/CJ比率)包括从患者获得生物样品并确定样品中的TMEM14CAJ/CJ比率。在一些实施例中，生物样品包括血液样品。在一些实施例中，生物样品包括骨髓样品。在一些实施例中，生物样品包括尿液样品。
样品可以从多种生物来源获得。示例性生物样品包括但不限于血液或血液级分、血浆、唾液、血清、痰、尿液、脑脊液、一种或多种细胞、细胞培养物、细胞系、细胞提取物、器官、细胞器、组织样品、组织活检、皮肤样品、骨髓样品、粪便样品等。血液样品可以是全血、部分纯化的血液和/或全血或部分纯化的血液的级分，如外周血单核细胞(PBMC)或血浆。骨髓样品可以是骨髓穿刺物和/或骨髓活检物。样品可直接从患者获得或来源于从患者获得的细胞，如来源于生物流体或组织样品的培养细胞。样品也可以是存档的样品(archivedsample)，如冷冻保存的样品。
生物样品可用于本文披露的方法或用途中的任一种。在一些实施例中，生物样品获得自患有或疑似患有MDS的患者，例如被诊断患有MDS并确认为具有SF3B1突变的患者。在一些实施例中，生物样品包括血液样品或骨髓样品。在一些实施例中，血液样品包括外周血或血浆。在一些实施例中，骨髓样品包括骨髓穿刺物或骨髓活检物。在一些实施例中，生物样品包括尿液样品。
在本文披露的方法和用途的一些实施例中，患者或来自患者的生物样品包含升高的TMEM14C AJ/CJ比率，即TMEM14C AJ/CJ比率大于约0.1(例如，大于约0.1、约0.2、约0.5、约1、约2、约4、约10、约15、约20或约30)，例如，如通过核酸条形码所测量的。在一些实施例中，升高的TMEM14C AJ/CJ比率大于约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或更大，如通过核酸条形码所测量的。在一些实施例中，升高的TMEM14C AJ/CJ比率大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9或更大，如通过核酸条形码所测量的。在一些实施例中，升高的TMEM14C AJ/CJ比率大于约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或更大，如通过核酸条形码所测量的。在一些实施例中，升高的TMEM14C AJ/CJ比率大于约20、25、30、35或更大(例如，约40、45、50或更大)，如通过核酸条形码所测量的。在一些实施例中，升高的TMEM14C AJ/CJ比率是大于约4的比率，如通过核酸条形码所测量的。
剪接变体的检测
本文所述的方法和用途的某些实施例涉及剪接变体的检测和/或定量。存在多种用于检测和定量核酸的方法，并且每种方法都可以适用于检测所述实施例中的剪接变体。示例性方法包括定量核酸的测定，如核酸条形码、纳米颗粒探针、原位杂交、微阵列、核酸测序和基于PCR的方法(包括实时PCR(RT-PCR))。
在本文披露的方法和用途的一些实施例中，TMEM14C AJ/CJ比率通过测量患者或来自患者的生物样品中的RNA转录物来确定。在一些实施例中，测量RNA转录物包括核酸条形码和/或RT-PCR。在一些实施例中，测量RNA转录物包括核酸条形码。
可以利用条形码技术如测定(NanoString科技公司)进行核酸测定，例如，如美国专利号8,519，115；美国专利号7,919,237；和Kulkami(Current Protocolsin Molecular Biology[现行分子生物学方案]，2011；94：25B.10.1-25B.10.17)中所述。在示例性测定中，使用一对探针来检测感兴趣的特定核苷酸序列，如感兴趣的特定剪接变体。探针对由捕获探针和报告探针组成，每个探针包括对靶序列特异的长度为约35至50个碱基的序列。捕获探针在其3′端包含亲和标记(如生物素)，其为靶mRNA的表面附着提供分子手柄用于数字检测，并且报告探针在其5′端包含独特的色码(color code)，其提供杂交的mRNA靶序列的分子条形码。捕获和报告探针对与溶液中的靶mRNA杂交，并且在除去过量探针后，将靶mRNA-探针复合物固定在/>盒中。数字分析仪获取盒表面的直接图像以检测对应于特定mRNA剪接变体序列的色码。检测到特定剪接变体的颜色编码的(color-coded)条形码的次数反映了mRNA文库中特定剪接变体的水平。为了检测剪接变体，捕获探针或报告探针可以跨越给定剪接变体的外显子-外显子或内含子-外显子连接。在其他实施例中，捕获探针和报告探针的靶序列之一或两者对应于外显子-外显子连接处的两个外显子的末端序列或对应于内含子-外显子连接处的内含子和外显子的末端序列，由此一个探针延伸到外显子-外显子或内含子-外显子连接，但不跨越该连接，而另一个探针结合在该连接的相对侧开始并延伸到相应外显子或内含子中的序列。
在示例性基于PCR的方法中，可以通过特异性扩增含有剪接变体的序列来检测特定剪接变体。例如，该方法可以使用专门设计用于与剪接变体的第一部分杂交的第一引物，其中该剪接变体是跨越发生可变剪接的外显子-外显子或内含子-外显子连接的序列。该方法还可以使用与第一引物的PCR延伸产物的区段杂交的第二相对引物，该区段对应于基因中的另一序列，如上游或下游位置处的序列。PCR检测方法可以是定量(或实时)PCR。在定量PCR的一些实施例中，使用核酸探针检测扩增的PCR产物，其中该探针可含有一种或多种可检测标记。在某些定量PCR方法中，通过检测剪接变体的水平并将其与适当的内部对照进行比较来确定感兴趣的剪接变体的量。
使用原位杂交测定如(高级细胞诊断公司(Advanced CellDiagnostics))检测剪接变体的示例性方法包括Wang等人描述的那些(J Mol Diagn.[分子诊断学杂志]2012；14(1)：22-29)。/>测定可用于通过设计靶向给定剪接变体的一对探针并使探针与固定和透化细胞中的靶RNA杂交来检测剪接变体。靶探针被设计为成对杂交，当与靶序列杂交时，产生预扩增子(preamplifier)核酸的结合位点。预扩增子核酸又含有扩增子核酸的多个结合位点，这些扩增子核酸又含有携带显色或荧光分子的标记探针的多个结合位点。在一些实施例中，/>靶探针之一跨越给定剪接变体的外显子-外显子或内含子-外显子连接。在其他实施例中，靶探针的靶序列对应于外显子-外显子连接处的两个外显子的末端序列或对应于内含子-外显子连接处的内含子和外显子的末端序列，由此靶探针对中的一个探针延伸到外显子-外显子或内含子-外显子连接，但不跨越该连接，而另一个探针结合在该连接的相对侧开始并延伸到相应外显子或内含子中的序列。
使用纳米颗粒探针如SmartFlareTM(密理博公司(Millipore))检测剪接变体的示例性方法包括Seferos等人(J Am Chem Soc.[美国化学学会杂志]2007；129(50)：15477-15479)和Prigodich等人(Anal.Chem.[分析化学]2012；84(4)：2062-2066)描述的那些。SmartFlareTM检测探针可用于通过生成用一种或多种核酸修饰的金纳米颗粒来检测剪接变体，这些核酸包括(1)各自与待检测的特定剪接变体互补和(2)各自与互补的荧光团标记的报告核酸杂交的核苷酸识别序列。在细胞摄取探针后，靶剪接变体序列可与一个或多个核苷酸识别序列杂交并置换荧光团标记的报告核酸。荧光团标记的报告核酸(其荧光团由于接近金纳米颗粒表面而被淬灭)然后从金纳米颗粒释放，并且当没有纳米颗粒的淬灭效应时，则可以检测到荧光团。在一些实施例中，探针中的核苷酸识别序列识别跨越给定剪接变体的外显子-外显子或内含子-外显子连接的序列。在一些实施例中，探针中的核苷酸识别序列识别仅在剪接变体的外显子-外显子或内含子-外显子连接的一侧的序列，包括终止于该连接的序列和终止于距离该连接一个或多个核苷酸的序列。
使用核酸测序检测剪接变体的示例性方法包括Ren等人(Cell Res.[细胞研究]2012；22：806-821)；和van Dijk等人(Trends Genet.[遗传学趋势]2014；30(9)：418-426)描述的RNA测序(RNA-Seq)。在一些实施例中，高通量测序(如下一代测序(NGS)技术)可用于检测剪接变体。例如，该方法可以使用可用于RNA-Seq的商业测序平台，如Illumina、SOLID、Ion Torrent和Roche 454。在一些实施例中，测序方法可包括焦磷酸测序。例如，可以将样品与测序酶和引物混合，并一次暴露于一种未标记的核苷酸流，从而合成互补DNA链。当掺入核苷酸时，焦磷酸盐被释放，从而导致发光，对其进行实时监测。在一些实施例中，测序方法可以包括半导体测序。例如，可以在核苷酸掺入期间释放质子而不是焦磷酸盐，并通过离子传感器对其进行实时检测。在一些实施例中，该方法可包括用可逆终止子进行测序。例如，合成试剂可包括引物、DNA聚合酶和四种不同标记的可逆终止子核苷酸。在掺入通过其颜色鉴定的核苷酸后，除去碱基上的3′终止子和荧光团，并重复循环。在一些实施例中，该方法可包括通过连接进行测序。例如，测序引物可以与衔接子(adapter)杂交，其中可用于连接至寡核苷酸的引物的5′端与相邻序列杂交。八聚体的混合物(其中碱基4和5由四种颜色标记之一编码)可竞争与引物的连接。在颜色检测后，可以在位置5和6之间切割连接的八聚体以除去标记，并且可以重复循环。因此，在第一轮中，该方法可以确定位置4、5、9、10、14、15等中碱基的可能身份。可以重复该方法，使用较短的测序引物偏移一个碱基，以确定位置3、4、8、9、13、14等，直到到达测序引物中的第一个碱基。
可利用其他核酸检测和分析方法来检测或定量剪接变体，这些方法还通过鉴定连接两侧的核苷酸序列来区分基因中给定外显子-外显子或内含子-外显子连接的剪接变体。例如，可通过引物延伸方法检测外显子-外显子连接的剪接变体，在这些方法中，结合一个外显子的引物根据相邻外显子的序列延伸到连接另一侧的外显子中。参见，例如，McCullough等人(Nucleic Acids Research[核酸研究]，2005；33(11)：e99)；和Milani等人(Clin.Chem.[临床化学]2006；52：202-211)。可以使用携带外显子-外显子或内含子-外显子连接探针的表达微阵列进行大规模变体检测，例如在Johnson等人(Science[科学]2003；302：2141-2144)；和Modrek等人(Nucleic Acids Res.[核酸研究]2001；29：2850-2859)中所述。
各种实施例包括用于检测TMEM14C的剪接变体的试剂。在一个实例中，试剂包括设计用于测量TMEM14C的一种或多种异常或规范剪接变体的量的探针。用于核酸定量测定如条形码(例如，/>)、纳米颗粒探针(例如，SmartFlareTM)、原位杂交(例如，/>)、微阵列、核酸测序和基于PCR的测定的探针可如上所述进行设计。
在这些示例性方法或用于核酸检测的其他方法中，异常剪接变体可使用特异性识别存在于异常剪接变体中但不存在于规范剪接变体中的核酸序列的探针、引物或其他试剂来鉴定。在其他实施例中，通过检测特异于异常剪接变体(在发生连接的情况下)的序列来鉴定异常剪接变体，即独特序列(unique sequence)的两侧是存在于规范剪接变体中的剪接连接任一侧的序列。在这种情况下，特异性识别其靶序列的探针、引物或其他检测试剂的部分的长度可对应于异常序列的长度或对应于异常序列的一部分。在其他实施例中，特异性识别其靶序列的探针、引物或其他检测试剂的部分的长度可对应于异常序列的长度加上剪接连接处异常序列两侧的一个或两个序列中选定数目的核苷酸的长度。通常，探针或引物应设计成具有足够的长度以减少非特异性结合。检测异常或规范剪接变体的探针、引物和其他试剂可根据用于检测核酸的多种方法的技术特征和形式来设计。
治疗化合物
在本披露的各种实施例中，在所披露的方法和用途中使用的治疗化合物是剪接调节剂(如化合物1)，或通过治疗相同患者群体(例如，输血依赖的MDS患者)而鉴定的替代药剂。在一些实施例中，治疗化合物是剪接调节剂或替代药剂，如TGFβ1调节剂。已在输血依赖的MDS患者中评估的示例性TGFβ1调节剂是罗特西普。罗特西普(一种结合TGFβ超家族配体的重组融合蛋白)描述于例如Fenaux等人(N Engl J Med.[新英格兰医学杂志]2020；382(2)：140-151)中，将其通过引用并入本文。
在各种实施例中，治疗化合物是剪接调节剂。在一些实施例中，剪接调节剂是SF3b剪接体复合物的调节剂。此类调节剂可以为天然化合物或合成化合物。剪接调节剂的非限制性实例和此类调节剂的类别包括普拉二烯内酯(例如普拉二烯内酯B或普拉二烯内酯D)、普拉二烯内酯衍生物(例如普拉二烯内酯B或普拉二烯内酯D衍生物)、赫伯西地(herboxidiene)、赫伯西地衍生物、思普力西欧他汀(spliceostatin)、思普力西欧他汀衍生物、苏地霉素(sudemycin)或苏地霉素衍生物。如本文所用，当提及剪接调节剂或类似物时，术语“衍生物”和“类似物”意指保持与原始化合物基本上相同、相似或增强的生物功能或活性但具有改变的化学或生物结构的任何此类化合物。
在各种实施例中，剪接调节剂包括SF3B1调节剂。多种SF3B1调节化合物是本领域已知的并且可用于本文所述的方法和用途中。示例性SF3B1调节剂包括但不限于化合物1、普拉二烯内酯(例如普拉二烯内酯B、普拉二烯内酯D)、普拉二烯内酯衍生物(例如E7107(WO2003/099813的化合物45))、芳基普拉二烯内酯、芳基普拉二烯内酯衍生物、赫伯西地和赫伯西地衍生物。SF3B1调节化合物的非限制性实例披露于美国专利号9,481,669 B2、国际申请号PCT/US 2016/062525(国际公开号WO 2017/087667)、国际申请号PCT/US 2019/026313(国际公开号WO 2019/199667)、国际申请号PCT/US 2019/026992(国际公开号WO 2019/200100)、国际申请号PCT/US 2019/066029(国际公开号WO 2020/123836)、和国际申请号PCT/US 2019/035015(国际公开号WO 2019/232449)中，将其全部通过引用并入本文用于披露和/或合成此类化合物。
在一些实施例中，剪接调节剂(例如SF3B1调节剂)是本文描述或通过引用并入本文的示例性SF3B1调节化合物中的任一种或多种。例如，在各种实施例中，SF3B1调节剂是化合物1。在其他实施例中，SF3B1调节剂是普拉二烯内酯B、普拉二烯内酯D或E7107。在其他实施例中，SF3B1调节剂是美国专利号9,481,669 B2中披露的SF3B1调节化合物中的任一种或多种。在其他实施例中，SF3B1调节剂是国际申请号PCT/US 2016/062525(国际公开号WO2017/087667)中披露的SF3B1调节化合物中的任一种或多种。在其他实施例中，SF3B1调节剂是国际申请号PCT/US 2019/026313(国际公开号WO 2019/199667)中披露的SF3B1调节化合物中的任一种或多种。在其他实施例中，SF3B1调节剂是国际申请号PCT/US 2019/026992(国际公开号WO 2019/200100)中披露的SF3B1调节化合物中的任一种或多种。在其他实施例中，SF3B1调节剂是国际申请号PCT/US 2019/066029(国际公开号WO 2020/123836)中披露的SF3B1调节化合物中的任一种或多种。在其他实施例中，SF3B1调节剂是国际申请号PCT/US 2019/035015(国际公开号WO 2019/232449)中披露的SF3B1调节化合物中的任一种或多种。在本段中引用的所有专利和出版物均通过引用整体并入，特别是其中披露的剪接调节剂(例如SF3B1调节剂)。
在一些实施例中，剪接调节剂和/或SF3B1调节剂(例如，本文描述或通过引用并入本文的示例性SF3B1调节化合物中的任一种或多种)调节和/或抑制SF3B1。在一些实施例中，剪接调节剂和/或SF3B1调节剂(例如，本文描述或通过引用并入本文的示例性SF3B1调节化合物中的任一种或多种)是SF3B1抑制剂。
在一些实施例中，剪接调节剂和/或SF3B1调节剂是普拉二烯内酯或普拉二烯内酯衍生物。如本文所用，“普拉二烯内酯衍生物”是指结构上与称为普拉二烯内酯的天然产物家族的成员相关且保持该起始化合物的一种或多种生物功能的化合物。普拉二烯内酯最先在细菌普拉特链霉菌(Streptomyces platensis)中鉴定(Mizui等人J Antibiot.[抗生素杂志]2004；57：188-196)为具有强效的细胞毒性且导致细胞周期停滞于细胞周期的G1和G2/M期(例如Bonnal等人Nat Rev Drug Dis[自然评论：药物发现]2012；11：847-859)。有七种天然存在的普拉二烯内酯，即普拉二烯内酯A-G(Mizui等人J Antibiot.[抗生素杂志]2004；57：188-196；Sakai等人J Antibiot.[抗生素杂志]2004；57：180-187)。这些化合物之一，即普拉二烯内酯B，靶向SF3b剪接体以抑制剪接并改变基因表达模式(Kotake等人Nature Chemical Biology[自然化学生物学]2007；3：570-575)。某些普拉二烯内酯B衍生物描述于WO 2002/060890；WO 2004/011459；WO 2004/011661；WO 2004/050890；WO 2005/052152；WO 2006/009276；和WO 2008/126918中，将其各自通过引用并入本文。
美国专利号7,884,128和7,816,401描述了合成普拉二烯内酯B和D的示例性方法，并且将这些文献各自关于这些方法通过引用并入本文。普拉二烯内酯B和D的合成还可使用Kanada等人(Angew Chem Int Ed.[应用化学国际版]2007；46：4350-4355)中所述的示例性方法进行。Kanada等人和国际公开号WO 2003/099813描述了由普拉二烯内酯D(WO 2003/099813的11107D)合成E7107(WO 2003/099813的化合物45)的示例性方法。对应的美国专利号为Kotake等人的7,550,503。将这些参考文献的每一个关于所述合成方法并入本文。在一些实施例中，SF3B1调节剂是普拉二烯内酯B、普拉二烯内酯D或E7107。在一些实施例中，SF3B1调节剂是化合物1。
在各种实施例中，剪接调节剂和/或SF3B1调节剂是化合物1，即选自具有式I的化合物及其药学上可接受的盐的至少一种实体。式I可以由以下表示：
和/或化学名称(2S，3S，4E，6S，7R，10R)-7，10-二羟基-3，7-二甲基-12-氧代-2-[(2E，4E，6R)-6-(吡啶-2-基)庚-2，4-二烯-2-基]氧杂环十二-4-烯-6-基-4-甲基哌嗪-1-甲酸酯。化合物1的合成描述于美国专利号9,481，669B2和国际申请号PCT/US 2016/062525(国际公开号WO 2017/087667)中，将其全部通过引用并入本文。
治疗方案
本披露的各种实施例包括施用化合物1。在一些实施例中，本文披露的方法和用途包括向患者施用治疗有效量的化合物1。在一些实施例中，化合物1减少或抑制患者的TMEM14C异常剪接。在一些实施例中，患者是输血依赖的MDS患者，其具有升高的异常连接与规范连接TMEM14C转录物的比率(TMEM14C AJ/CJ比率)。在一些实施例中，患者是输血依赖的MDS患者，其具有升高的TMEM14C AJ/CJ比率和剪接体蛋白中的一个或多个突变，例如SF3B1中的一个或多个突变。在一些实施例中，患者是输血依赖的MDS患者，其具有升高的TMEM14C AJ/CJ比率和低水平的TMEM14C表达。在一些实施例中，患者是输血依赖的MDS患者，其具有升高的TMEM14C AJ/CJ比率、低水平的TMEM14C表达和剪接体蛋白中的一个或多个突变，例如SF3B1中的一个或多个突变。示例性SF3B1突变包括在SF3B1中的位置E622、H662、K666、K700、R625或V701中的一个或多个处的突变。在一些实施例中.SF3B1的突变包含在SF3B1中的位置H662、K700或R625中的一个或多个处的突变或由其组成。在一些实施例中，SF3B1的突变包含在SF3B1中的位置K700处的突变或由其组成。在一些实施例中，在位置K700处的突变是K700E。在一些实施例中，在位置R625处的突变是R625C。在一些实施例中，SF3B1的突变包含K700E和/或R625C。SF3B1突变的另外的非限制性实例披露于美国专利号10,889,866B2和国际申请号PCT/US 2016/049490(国际公开号WO 2017/040526)中，将其各自通过引用并入本文用于披露此类突变。
本领域技术人员将理解，针对任何特定患者的特定剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄速率、药物组合、治疗医师的判断、以及所治疗特定疾病的严重程度。在一些实施例中，本文所述的方法和用途中使用的化合物1可以最初以合适的剂量施用，该剂量可根据临床反应按需要进行调整。通常，化合物1的合适剂量可以是有效产生治疗作用的最低剂量的化合物的量。这种有效剂量通常取决于上述因素。
在一些实施例中，将化合物1配制成口服剂型并口服施用给患者。口服剂型可以是例如片剂、胶囊、液体溶液或悬浮液、粉末、或者液体或固体晶体的形式，其含有与生理学上可接受的赋形剂(例如，药学上可接受的赋形剂)混合的活性剂。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂或填充剂(例如蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露糖醇、微晶纤维素、淀粉(包括马铃薯淀粉)、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠)；制粒剂和崩解剂(例如，纤维素衍生物(包括微晶纤维素)、淀粉(包括马铃薯淀粉)、交联羧甲基纤维素钠、海藻酸盐或海藻酸)；粘合剂(例如蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、阿拉伯胶、海藻酸、海藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、硅酸铝镁、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；以及润滑剂、助流剂和抗粘合剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石)。其他生理学上可接受的赋形剂(例如，药学上可接受的赋形剂)可以是着色剂、调味剂、增塑剂、湿润剂、缓冲剂等。
在一些实施例中，将化合物1配制为胶囊。在一些实施例中，胶囊包含化合物1和至少一种药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，至少一种药学上可接受的赋形剂包括羟丙基甲基纤维素(也称为羟丙甲纤维素)，其为半合成的惰性粘弹性聚合物。在一些实施例中，将化合物1配制为不透明的羟丙甲纤维素壳胶囊。在一些实施例中，胶囊为0号或2号。在一些实施例中，胶囊为2号并且含有0.5mg化合物1。在一些实施例中，胶囊为0号并且含有1mg或5mg化合物1。在一些实施例中，胶囊的颜色为橙色(例如瑞典橙)。在一些实施例中，胶囊被患者整个吞服。
在一些实施例中，将化合物1施用给空腹患者，即患者在化合物1给药之前2小时或之后1小时不进食任何食物。在一些实施例中，在每个治疗日的大约同一时间向患者施用化合物1。
在一些实施例中，将化合物1按照连续给药方案施用给患者。如本文所用，术语“连续给药方案”是指在治疗期间连续重复给药方案而无任何中断。在一些实施例中，将化合物1按照连续给药方案每天一次或每天两次施用给患者。在一些实施例中，将化合物1连续(例如，按照每天一次或每天两次的方案)施用给患者，持续至少连续3天、连续5天、至少连续7天、至少连续9天、至少连续14天、至少连续21天、至少连续28天或更长时间。在一些实施例中，将化合物1连续(例如，按照每天一次或每天两次的方案)施用给患者，持续一个或多个治疗周期。在一些实施例中，将化合物1连续施用给患者，持续至少1、2、3、4、5、6或更多个治疗周期。在一些实施例中.一个治疗周期是28天。
连续给药方案与间歇给药方案不同，间歇给药方案具有治疗(即“开始”)和非治疗(即“关闭”)期。非治疗期可有助于降低连续给药时可能观察到的药物相关毒性的风险(例如，皮疹、中性粒细胞减少症、血小板减少症)。治疗周期之间的非治疗期也可称为“治疗中断”或“治疗假期”。在一些实施例中，治疗期可以是至少3天、至少5天、至少7天、至少9天、至少14天、至少21天、至少28天或更长时间。在一些实施例中，非治疗期可以是至少3天、至少5天、至少7天、至少9天、至少14天、至少21天、至少28天或更长时间。在一些实施例中，间歇给药方案在治疗期和非治疗期之间交替。
在一些实施例中，将化合物1按照给药5天/停药9天的给药方案施用给患者(例如，按照每天一次或每天两次的方案)。在一些实施例中，该14天方案重复一次以完成一个28天的治疗周期。在一些实施例中，将化合物1按照给药5天/停药9天的给药方案施用给患者，持续一个或多个治疗周期。在一些实施例中，将化合物1按照给药5天/停药9天的给药方案施用给患者，持续至少1、2、3、4、5、6个或更多个治疗周期。在一些实施例中，一个治疗周期是28天。
在一些实施例中，将化合物1按照给药21天/停药7天的给药方案施用给患者(例如，按照每天一次或每天两次的方案)。在一些实施例中，将化合物1按照给药21天/停药7天的给药方案施用给患者，持续一个或多个治疗周期。在一些实施例中，将化合物1按照给药21天/停药7天的给药方案施用给患者，持续至少1、2、3、4、5、6个或更多个治疗周期。在一些实施例中，一个治疗周期是28天。
在一些实施例中，将化合物1每天一次施用给患者。在一些实施例中，将化合物1按照给药5天/停药9天的给药方案每天一次施用给患者。在一些实施例中，将化合物1按照给药21天/停药7天的给药方案每天一次施用给患者。在一些实施例中，将化合物1按照连续给药方案每天一次施用给患者。在一些实施例中，将化合物1按照连续给药方案每天一次施用给患者，直到观察到不良事件或药物相关毒性。在一些实施例中，将治疗假期并入每天一次给药方案中。在一些实施例中，在每天一次连续给药至少约5天后(例如，约5天后、约7天后、约14天后、约21天后或更多天后)并入治疗假期。在一些实施例中，将化合物1每天一次(例如，连续地或间歇地)施用给患者，持续一个或多个28天周期。
在一些实施例中，化合物1的治疗有效量是在施用当天以单剂量给予的约2mg至约20mg。在一些实施例中，化合物1的治疗有效量是在施用当天以单剂量给予的约2mg、约3.5mg、约5mg、约7mg、约10mg、约12mg、约14或约20mg。在一些实施例中，与较高剂量相比，低于约14或20mg(例如，每天一次5mg、10mg或低至约2mg)的剂量降低药物相关毒性(例如，心血管事件(如心动过缓和QTc延长))的风险。
在一些实施例中，将化合物1每天两次施用给患者。在一些实施例中，将化合物1按照给药5天/停药9天的给药方案每天两次施用给患者。在一些实施例中，将化合物1按照给药21天/停药7天的给药方案每天两次施用给患者。在一些实施例中，将化合物1按照连续给药方案每天两次施用给患者。在一些实施例中，将化合物1按照连续给药方案每天两次施用给患者，直到观察到不良事件或药物相关毒性。在一些实施例中，将治疗假期并入每天两次给药方案中。在一些实施例中，在每天两次连续给药至少约5天后(例如，约5天后、约7天后、约14天后、约21天后或更多天后)并入治疗假期。在一些实施例中，将化合物1每天两次(例如，连续地或间歇地)施用给患者，持续一个或多个28天周期。
在一些实施例中，化合物1的治疗有效量是在施用当天以两个分剂量给予的总共约2mg至约20mg。在一些实施例中，化合物1的治疗有效量是在施用当天以两个分剂量给予的约10mg、约15mg或约20mg。在一些实施例中，第一剂量为约10mg，并且第二剂量为约5mg。在一些实施例中，第一剂量为约5mg，并且第二剂量为约10mg。在一些实施例中，第一剂量和第二剂量各自为约5mg。在一些实施例中，第一剂量和第二剂量各自为约7.5mg。在一些实施例中，第一剂量和第二剂量各自为约10mg。在一些实施例中，第一剂量和第二剂量之间的间隔为至少约8小时(例如，约8小时、约10小时、约12小时)。
在一些实施例中，与按照每天一次的方案施用的较高剂量(例如，约40mg的一个剂量)相比，按照每天两次的方案(例如，每剂量约10mg的两个剂量)施用给患者的化合物1降低药物相关毒性的风险。在一些实施例中，与按照每天一次的方案施用的较高剂量相比，按照每天两次的方案施用给患者的化合物1降低药物相关毒性的风险，但实现了相似或更高的生物标记物调节。例如，与按照每天一次的方案施用的较高剂量相比，按照每天两次的方案施用给患者的化合物1可降低患者的TMEM14C AJ/CJ比率长达约10小时，同时使药物相关毒性的风险最小化。在每天两次施用的一些实施例中，第一剂量和第二剂量各自为约5mg至约10mg或更多。在一些实施例中，第一剂量为约10mg，并且第二剂量为约5mg。在一些实施例中，第一剂量为约5mg，并且第二剂量为约10mg。在一些实施例中，第一剂量和第二剂量各自为约5mg。在一些实施例中，第一剂量和第二剂量各自为约7.5mg。在一些实施例中，第一剂量和第二剂量各自为约10mg。在一些实施例中，第一剂量和第二剂量之间的间隔为至少约8小时(例如，约8小时、约10小时、约12小时)。
施用给患者的化合物1的剂量可随时间减少。例如，在治疗开始时，化合物1可以以约10mg的剂量每天两次施用，即第一剂量和第二剂量各自为约10mg。在一些实施例中，第一剂量和第二剂量之间的间隔为约10小时至约14小时(例如约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时)。然后这种每日给药可减少一次或多次。在一些实施例中，第一剂量减少包括约5mg的第一剂量和约10mg的第二剂量，或反之亦然。在一些实施例中，第二或随后的剂量减少包括各自为约5mg的第一剂量和第二剂量。
在一些实施例中，用化合物1治疗降低或消除患者的输血依赖性。在一些实施例中，与治疗前的次数或频率相比，用化合物1治疗使给予患者的输血次数或频率减少至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％或约60％。在一些实施例中，与治疗前的次数或频率相比，用化合物1治疗使给予患者的输血次数或频率减少至少约30％。在一些实施例中，与治疗前的次数或频率相比，用化合物1治疗使给予患者的输血次数或频率减少至少约60％。在一些实施例中，用化合物1观察到的输血次数或频率的减少大于用替代治疗(例如List等人(N Engl J Med.[新英格兰医学杂志]2006；355(14)：1456-1465)、Fenaux等人(Blood.[血液]2011；118(14)：3765-3776)、或Fenaux等人(N Engl J Med.[新英格兰医学杂志]2020；382(2)：140-151)描述的治疗)观察到的减少。在一些实施例中，用化合物1观察到的输血之间的时间段长于用替代治疗观察到的输血之间的时间段。在一些实施例中，在至少连续56天(8周)的时间段内测量输血次数或频率的减少，其中该时间段在治疗开始后的任何时间开始。在一些实施例中，患者在至少连续56天(8周)的时间段内未接受任何输血，其中该时间段在治疗开始后的任何时间开始。在一些实施例中，患者在至少8周、至少9周、至少10周、至少12周、至少14周、至少16周或更长时间的时间段内未接受任何输血，其中该时间段在治疗开始后的任何时间开始。在一些实施例中，在治疗的前24周期间，在至少8周或更长时间的时间段内测量输血次数或频率的减少。在一些实施例中，在治疗的前24周期间，在至少12周或更长时间的时间段内测量输血次数或频率的减少。在一些实施例中，在治疗的前48周期间，在至少12周或更长时间的时间段内测量输血次数或频率的减少。在一些实施例中，在治疗的前24周期间，在至少16周或更长时间的时间段内测量输血次数或频率的减少。在一些实施例中，在治疗的前48周期间，在至少16周或更长时间的时间段内测量输血次数或频率的减少。在一些实施例中，输血包括红细胞(RBC)输血、血小板输血或两者。在一些实施例中，输血包括RBC输血。
在一些实施例中，与治疗前的量相比，用化合物1治疗增加患者中骨髓铁粒幼红细胞的量。在一些实施例中，与治疗前的量相比，用化合物1治疗使患者中骨髓铁粒幼红细胞的量增加至少约10％、约20％、约30％或约40％。
实例
以下实例提供了本披露的说明性实施例。本领域普通技术人员将认识到可以在不改变本披露的精神或范围的情况下进行多种修改和变型。此类修改和变型涵盖在本披露的范围内。提供的这些实例不以任何方式限制本披露。
实例1.在生物标记物定义的用化合物1治疗的MDS患者子集中评估非输血依赖性
在患有骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)或急性骨髓性白血病(AML)的成年患者(包括具有剪接因子突变的患者和具有野生型蛋白的患者)中测试化合物1(一种结合SF3B1并调节前体mRNA剪接的小分子)(NCT02841540；还参见Steensma等人Blood[血液](2019)134(增刊1)：673)。在84名患者中，42名患有MDS，4名患有CMML，38名患有AML。剂量递增队列对两种每天一次的给药方案进行检查：方案I(给药5天/停药9天)和方案II(给药21天/停药7天)。施用的剂量范围为按照方案I的1-40mg(n＝65)和按照方案II的7-20mg(n＝19名患者)；25名患者(30％)接受≥180天的治疗。
患者和方法
研究设计
使用常规的3+3剂量递增I期设计招募患者，其中递增基于修改的斐波那契数列(Fibonacci sequence)方案(Storer Biometrics.[存储生物识别技术]1989；45(3)：925-937)。剂量递增一直持续到3-6名入组患者中有≥2名患者经历剂量限制性毒性(DLT)的剂量水平。最大耐受剂量(MTD)被定义为6名患者中不超过1名经历DLT的最高剂量。DLT被定义为以下中的任一种：除了在1周内消退至1级或更低的3级恶心、呕吐、疲劳或腹泻之外的任何3级或更高的研究药物相关的非血液学毒性；未能施用至少70％的方案特定剂量；或暂停给药后21天或更多天，在不存在持续性白血病或原始细胞增加的情况下持续存在4级血细胞减少症的延长的骨髓抑制期。在前28天内使用美国国家癌症研究所(NCI)不良事件通用毒性标准(CTCAE)4.03版评估DLT。
测量的主要终点包括DLT的发生、治疗中出现的不良事件(TEAE)的类型和频率、以及严重不良事件(SAE)。关键的次要终点包括药物药代动力学(PK)和初步抗肿瘤活性，如总反应率(ORR)、药物疗法对输血需求的影响、和总存活期(OS)。生物标记物分析和药物药效动力学(PD)被包括作为探索性终点。按照给药5天，停药9天的方案(方案I)1mg/天的起始剂量是基于非人灵长类动物的经验；该模型系统中的DLT是胃肠不适和结肠炎。此外，探索了21天接受治疗，其余7天不接受治疗的第二方案(方案II)。该方案最初被设计为基于表明当间歇施用时化合物1的活性的临床前数据来评估方案I。然而，当按照方案I观察到有限的临床活性时，引入方案II以测试更长时间的剪接体调节是否会导致更高的临床活性。每个治疗周期的长度为28天。患者可继续治疗直至疾病进展或出现不可接受的毒性。在第4周期及以后，允许患者内剂量递增达到经证明在其他随后的入组患者中是安全的剂量水平，但患者必须维持其原始给药方案。
入选标准
合格标准是疾病特异性的，并总结在表1中。此外，患者必须≥18岁，美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)体能状态为0-2，且器官功能正常，定义如下：肌酐≤1.7mg/dL或计算的肌酐清除率(Cockroft-Gault公式)≥50mL/min，直接胆红素≤正常上限(ULN)的1.5倍，丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶≤ULN的3.0倍，且白蛋白≥2.5mg/dL。使用国际预后评分系统(IPSS)进一步表征患有MDS的患者，其中总的来说，“较低风险”包括IPSS低和中等-1风险患者，而“较高风险”是IPSS中等-2和高风险类别(Greenberg等人Blood.[血液]1997；89：2079-2088)。患者不需要具有剪接突变才符合条件。
表1.疾病特异性合格标准
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AML，急性骨髓性白血病；CMML，慢性骨髓单核细胞性白血病；ESA，红细胞生成刺激剂；HMA，低甲基化剂；IPSS，国际预后评分系统；MDS，骨髓增生异常综合征；RBC，红细胞；WBC，白细胞。
眼科安全性
因为在与化合物1具有化学相似性的普拉二烯内酯衍生物(E7107)的先前1期试验中治疗的受试者中观察到视力丧失(Folco等人Genes Dev.[基因与发育]2011；25(5)：440-444；Hong等人Invest New Drugs.[实验性新药]2014；32(3)：436-444)，并且因为次要剪接因子PRPF8和其他相关剪接因子的种系突变与色素性视网膜炎有关(Grainger和Beggs，RNA.2005；11(5)：533-557)，所以实施了详细的眼科安全性计划。合格标准包括正常的维生素A水平以及矫正到20/40的视敏度，除非存在白内障。在研究筛选期间和整个试验期间定期进行眼科评估，包括眼底镜成像和视觉诱发电位。
反应评估
使用2006国际工作组(IWG)关于MDS的反应标准(Cheson等人Blood.[血液]2006；108：419-425)、IWG 2003关于AML的标准和2015国际联合会关于骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤(MDS/MPN)和CMML的统一反应标准的提案(Savona等人Blood.[血液]2015；125(12)：1857-1865)评估临床反应。在筛选时以及第1、2和4周期之后，进行外周血取样、骨髓穿刺、骨髓活检、骨髓细胞遗传学和通过流式细胞术进行的细胞组成。在第4周期之后，基于外周血计数的变化按照临床指示或根据需要进行骨髓穿刺以建立完全反应或疾病进展。进行独立的中心确认和解释用于疾病评估。
药代动力学、药效动力学和生物标记物分析
在第1周期第1天和第4天(给药前及给药后0.5、1、2、4、6、8、10和24小时)以及在第1周期第15天的给药前和给药后4小时收集用于PK分析的血浆样品。使用WinNonlin进行PK分析。对于药效动力学和生物标记物分析，在第1周期第1天(给药前及给药后1、2、4、10和24小时)将所有患者的外周血样品收集到/>Blood RNA管(BD生物科学公司(BD Biosciences)，加利福尼亚州圣何塞市)中。使用/>simplyRNABlood试剂盒(普洛麦格公司(Promega)，威斯康星州麦迪逊市)提取RNA。使用定制的Nanostring nCounter基因表达板(NanoString科技公司，华盛顿州西雅图市)，通过评估在给药后时间点(与给药前相比)的代表性前体mRNA和成熟mRNA或异常和规范转录物的相对表达来测量靶接合(即剪接调节)。为了进行剪接突变分析，将外周血收集到/>Blood DNA管(BD生物科学公司，加利福尼亚州圣何塞市)中。使用由癌症遗传学公司(Cancer Genetics Inc.)(新泽西州卢瑟福市)集中测定的Focus：MyeloidTM下一代测序(NGS)板鉴定基线剪接突变。使用单向ANOVA和/>软件进行预处理样品的生物标记物分析。根据Hanley和McNeil(Radiology.[放射学]1982；143(1)：29-36；也参见Zweig和Campbell，Clin Chem.[临床化学]1993；39(4)：561-577)描述的方法进行接收者操作特征(ROC)曲线。
结果
入组患者
在2016年10月至2018年12月期间，在美国和欧洲的26家参与中心共入组84名患者。在入组患者中，65名患者接受了方案I的治疗，19名患者接受了方案II的治疗。接受方案II的患者的数量较少，反映出在按照方案I增加了7个剂量水平但没有观察到临床反应后，随后添加该方案作为方案补正。入组患者的基线特征总结在表2中。在入组患者中，38名患者患有AML，4名患有CMML，20名患有IPSS较高风险MDS，21名患有较低风险MDS。在23名MDS患者中观察到正常核型，并且在5名、4名、4名和2名患者中分别观察到8号染色体三体性、7q缺失、20q缺失和5q缺失。九名患者具有其他染色体异常，2名患者具有复杂的(3个或更多个异常)核型。对于1名MDS患者，核型分析失败，因此无法计算IPSS。具有骨髓发育异常相关变化的AML是最常见的AML诊断(N＝20)，而伴原始细胞过多的难治性贫血是针对MDS(N＝21)。未指定CMML1/CMML2诊断。AML、CMML和MDS患者的先前方案的中位数和范围分别为2(1-9)、2(2-5)和2(1-4)。据报告，在研究入组前的8周内，共有62名患者是RBC输血依赖的。
施用的剂量水平范围为按照方案I的1-40mg和按照方案II的7-20mg。在患有SF3B1突变型较低风险MDS的患者在7mg剂量水平的研究疗法(方案I，给药5天/停药9天的方案)的第一周内出现全血细胞减少症和骨髓发育不全后，暂停较低风险MDS患者的入组。此后，在试验的剂量递增部分中只入组AML、较高风险MDS和CMML患者。在入组患者中，88％具有感兴趣的剪接突变(表2和3)。
表2.入组患者的基线特征
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表3.特异性剪接突变
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药代动力学
初步PK分析表明化合物1被快速吸收且在血浆暴露中表现出剂量成比例的增加(图2)。通过非房室分析获得的关键PK参数列于表4中。在两个方案中评估相似的最大累积剂量/周期(对于方案I，400mg/28天周期；对于方案II，420mg/28天周期)。未评估协变量(包括体重和性别)对化合物1血浆PK的潜在影响，因为在2个方案的每个剂量水平上入组的患者数量有限；然而，PK参数的总体可变性适中，在癌症患者中通常观察到的范围内，没有明显的异常值(表4)。初步群体PK模型估计清除率/生物利用度的个体间可变性为约34％，表明潜在协变量影响(如果有的话)可能没有意义，或目前可用的数据可能不足以鉴定有意义的协变量影响。
对于方案I(测试的剂量范围为1mg-40mg)，未观察到治疗相关的TEAE(所有等级)发生率的明显剂量依赖性。这些事件的发生率范围为43％至100％治疗的受试者/剂量水平。在最低组合剂量水平(1、2、3.5和5mg，N＝25)下，76％的受试者报告了治疗相关的TEAE。在测试的最高剂量水平(40mg，N＝6)下，83％的受试者报告了治疗相关的TEAE。在以≥2mg剂量治疗的受试者中报告了3级或更高的治疗相关的TEAE，其中在以40mg治疗的6名受试者中有3名报告了3级AE。对于方案II(7mg-20mg)，在以测试的最低剂量水平治疗的20％受试者和以测试的最高剂量水平治疗的100％受试者中观察到治疗相关的AE(所有等级)，这表明在给药21天/停药7天的方案中AE的剂量依赖性趋势。在方案II中使用≥12mg的剂量水平报告了3级或更高的治疗相关的TEAE，其中以20mg治疗的4名受试者中有3名报告了3级AE。
在治疗相关的AE中未观察到明显的性别差异，尽管73％的入组受试者是男性，因此对化合物I的耐受性的潜在性别差异的评估可能是有限的。在报告治疗相关的AE(所有等级)的63名受试者中，45名(71％)为男性，并且在报告3级治疗相关的AE的12名受试者中，9名(75％)为男性。
表4.按照每天一次的给药方案第4天的化合物1血浆PK参数的汇总
Tmax的中位数(最小值-最大值)和其他参数的几何平均值(CV％)
实例2.在生物标记物定义的用化合物1治疗的MDS患者子集中进一步分析非输血依赖性
对来自实例1中所述研究的数据的进一步分析显示如下，如本实例中所述。
进一步分析-入组患者
据报告，在研究入组前的8周内，共有62名患者是RBC输血依赖的。
进一步分析-不良事件和剂量限制性毒性
在按照方案I治疗的患者中，最常见的治疗相关的、治疗中出现的不良事件(TEAE，根据研究者判断，频率≥10％)是腹泻(42％)、恶心(28％)、疲劳(17％)和呕吐(14％)(表5)。在按照方案II治疗的患者中，最常见的治疗相关的TEAE是腹泻(42％)、呕吐(21％)、QTcF(弗里德里恰氏法(Fridericia method))延长(16％)、恶心(16％)、味觉障碍(11％)、疲劳(11％)和低磷血症(11％)(表5)。表6总结了最常见的3级和4级事件。报告了一起3级眼视乳头水肿事件，无视敏度丧失。
总共有6名患者经历了以DLT为特征的AE。按照方案I，1名患有较低风险MDS且具有SF3B1突变的患者在7mg剂量水平下出现骨髓发育不全，6名患者中有2名在40mg剂量水平下被研究者评估为QTcF延长＞500msec。按照方案II，以14mg剂量水平治疗的5名患者中有1名经历了3级窦性心动过缓，以20mg剂量水平治疗的4名患者中有2名经历了DLT：一名患者发生3级QTc延长，另一名发生3级恶心，但未迅速消退。基于这些结果，方案I中的40mg和方案II中的20mg似乎超过了DLT阈值，并且MTD最初被定义为方案I的30mg(28天周期中累积剂量300mg化合物I)和方案II的14mg(28天周期中294mg化合物I)，并停止进一步的剂量递增。然后对患者的ECG进行了一次特别的(ad hoc)独立心脏病学审查，以便更好地理解化合物I的心血管作用的潜力。通过该独立审查，无法确认在方案I中的40mg和方案II中的20mg下报告为DLT的2起QTc延长事件，并且40mg下的另外的事件被报告为可能与伴随药物有关。因此，尽管未正式确认方案I或方案II的最大耐受剂量(MTD)，但考虑到全部数据，推荐的化合物1QD剂量被定义为方案I的30mg/天和方案II的14mg/天。
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表6.根据给药方案＞2％的患者报告的3级或4级治疗相关的TEAE
TEAE的严重程度使用NCI-CTCAE(4.03版)进行分级。ECG，心电图；美国国家癌症研究所临床不良事件常用术语；TEAE，治疗中出现的不良事件。
进一步分析-治疗持续时间
患者持续接受治疗12至1162天；27名患者(32％)的治疗时间超过180天，18％超过1年，2％超过2年(图1A-1C)。较低风险MDS的中位治疗持续时间为32.2周，较高风险MDS/CMML为13.0周，AML为8.0周，这反映了每种疾病的自然病程。
进一步分析-临床反应
未观察到符合2006 IWG标准的完全或部分反应。根据MDS/MPN标准，在诊断患有CMML的4名受试者中，报告了1名完全细胞遗传学缓解和1名临床获益(血小板反应)。在剩余的2名CMML受试者中未观察到反应。此外，截至2020年4月，根据IWG标准29，在研究入组时依赖输血的62名患者中有9名(15％)报告了＞56天的1至6个间隔没有进行RBC输血(表7)。除了1名基线时血红蛋白为9.1g/dL的患者外，所有这些患者均符合IWG对红系血液学改善反应的标准。所有患者在方案I内均接受化合物1。9名患者中有8名在研究的第1-24周开始出现首次RBC TI。在9例RBC TI病例中，CMML受试者中观察到1例(25％)，MDS中观察到8例(19％)。CMML患者还经历了21周的血小板非输血依赖期。9名患者中有4名在7mg剂量下经历了RBC TI。RBC TI的中位持续时间为13周。RBC TI发生的中位时间为15周。另外两名患者(1名AML，1名MDS)经历了＞56天的RBC TI期，但无法证实他们在研究入组前的输血依赖性。在接受方案II中的7mg剂量的较高风险MDS患者中，还观察到一例22周血小板非输血依赖性但无RBC TI。
表7.经历RBC TI≥56天的患者
RARS-T诊断。*基线Hb为9.1g/dL。**患者在他最后两个RBC TI期间接受7mg化合物1。
表8.第1周期第1天外周血中具有SF3B1错义突变的患者列表
| 年龄，种族，性别 | 诊断＊ | 组织学＊ | SF3B1 |
| 58，W，M | MDS | RARS | p.K700E |
| 66，W，M | MDS | RARS | p.R625G |
| 61，W，M | MDS | RARS | p.K700E |
| 68，W，M | MDS | RARS | p.H662Q |
| 85，U，M | MDS | RARS | p.H662Q |
| 72，W，F | AML | 伴骨髓发育异常的AML | p.K700E |
| 81，W，M | MDS | RARS | p.K700E |
| 80，O，M | MDS | RARS | p.K700E |
| 69，W，M | MDS | RA | p.R625C |
| 82，W，M | AML | 成熟型AML | p.K666N |
| 79，U，M | AML | 伴骨髓发育异常的AML | p.K700E |
| 71，W，M | N/E | N/E | p.K700E |
| 81，W，M | N/E | N/E | p.R625C |
| 84，W，M | MDS | RARS | p.K700E |
| 72，W，M | N/E | N/E | p.E592K |
| 76，W，M | MDS | RA | p.K700E |
| 72，W，F | AML | 伴骨髓发育异常的AML | p.R625H |
| 68，W，F | MDS | RAEB | p.R625C |
| 69，W，M | MDS | RARS | p.K700E |
| 72，W，M | MDS | RAEB | p.E622D |
*基于中心病理学评估。2名MDS和1名AML患者的诊断未得到确认(N/E)。O，其他；W，白种人；M，男性；U，未知；F，女性；MDS，骨髓增生异常综合征；AML，急性骨髓性白血病；N/E，不可评估；RARS，伴环形铁粒幼红细胞的难治性贫血；RA，难治性贫血。
进一步分析-生物标记物
剪接体蛋白(SF3B1、SRSF2、U2AF1和ZRSR2)的突变数据是使用2个NGS板在重复样品中从PBMC产生的(图1A-C)。SF3B1突变是MDS患者中最常见的突变(41名患者中有15个错义突变，36.6％)，特别是在较低风险MDS中(57％)(图4)。在38名AML患者中的5名中(13％)也观察到SF3B1突变但在4名CMML患者中没有观察到。表8示出了具有SF3B1错义突变的患者子集的患者特征列表。在研究治疗中没有足够的PBMC样品来确定经历RBC TI事件的所有患者的克隆变化。在研究入组时具有SF3B1错义突变的20名患者中，5名(25％)经历了RBC TI事件。三名具有RBC TI期的患者被诊断为伴环形铁粒幼红细胞的难治性贫血(RARS)，1名为伴原始细胞过多的难治性贫血，1名为伴血小板增多的RARS。在4名具有SF3B1突变且诊断为AML的患者中未观察到RBC TI期。
在没有SF3B1突变的患者中也观察到化合物I治疗的RBC TI期(图7)，这表明野生型SF3B1蛋白对剪接的调节也在该药剂在一些患者中的作用机制中起作用，并且值得进一步研究。令人感兴趣的是，与具有SF3B1野生型状态的患者相比，具有SF3B1突变的患者似乎在更低的剂量下经历了RBC TI(图7)。
ABCB7表达(治疗前)与SF3B1突变状态之间的关系表明，具有SF3B1突变的患者具有较低的ABCB7表达，如通过RT-PCR测量的(图8A)。此外，在化合物1治疗时或在治疗随访期间ABCB7表达(治疗前)与RBC TI发生率之间的关系表明具有较低ABCB7表达的患者具有较高的RBC TI情况(图8B)。
突变的SF3B1与环形铁粒幼红细胞表型有关，其特征在于血红素生物合成的缺陷和线粒体中的铁积累。参与血红素生物合成和铁代谢的三个基因在患有MDS的SF3B1突变的患者中被反复异常剪接：ABCB7、PPOX和TMEM14C(Shiozawa等人Nat Commun.[自然通讯]2018；9：3649)。PPOX与TMEM14C一起促进卟啉的线粒体转运。ABCB7或PPOX的调节可能有助于化合物I诱导的RBC TI并且应在未来的研究中进行研究。
从84名患者中的59名收集用于药效动力学评估的PBMC样品，包括来自MDS患者的26个治疗前样品和使用NanoString探针产生的基因表达数据。总共研究761个剪接标记物(表9)。观察到给药后剪接标记物的一般调节(图5)。七名经历RBC TI＞56天的患者具有可用的基因表达数据。在经历RBC TI的MDS患者中观察到编码TMEM14C的基因的治疗前异常剪接连接(AJ)转录物增加和治疗前规范剪接连接(CJ)转录物减少的趋势(图3A)。ROC曲线分析表明，TMEM14C AJ/CJ的治疗前比率可预测MDS患者接受化合物I治疗后RBC TI的发生，对于＞4.01的相关标准而言，最佳约登(Youden)指数J＝0.733，灵敏度为83.3％，特异性为90％。在具有(TMEM14C AJ/CJ＞4.01，图3B)的7名MDS患者中，5名使用化合物I后经历了RBCTI事件(71％)。在除了1个以外的所有患者中均检测到SF3B1突变(图3B)。在经历RBC TI的患者中也观察到化合物I给药使TMEM14C AJ/CJ比率下调，最低点在2-10小时(图3C)。由于这些发现结果的潜在相关性，因此在残留研究样品(N＝20，包括4名经历RBC TI的患者)中使用RT-qPCR重复TMEM14C异常和规范转录物的定量。另外的时间点也包括在这些实验中(第1周期第4天)。TMEM14C AJ的治疗前表达在来自用化合物I治疗的、经历RBC TI的患者的第1周期第1天PBMC样品中较高(图6)。同样，TMEM14C AJ的治疗前表达在来自那些患者的第1周期第4天样品中也较高(图6)。
所选序列：
TMEM14C的规范序列(SEQ ID NO：1)
TMEM14C的异常序列(SEQ ID NO：2)
人SF3B1-氨基酸序列(SEQ ID NO：3)
人SF3B1-核酸序列(SEQ ID NO：4)
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/>
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TMEM14C-规范和异常剪接位点(SEQ ID NO：5)
AG＝规范3’剪接位点
＝隐蔽3’剪接位点
A＝SVM-BP预测的规范分支点
＝SVM-BP预测的隐蔽分支点/>
ABCB7-规范和异常剪接位点(SEQ ID NO：6)
AG＝规范3’剪接位点
＝隐蔽3’剪接位点
A＝SVM-BP预测的规范分支点
＝SVM-BP预测的隐蔽分支点
ABCB7-正向引物序列(SEQ ID NO：7)
ABCB7-反向引物序列(SEQ ID NO：8)
PPOX-正向引物序列(SEQ ID NO：9)
PPOX-反向引物序列(SEQ ID NO：10)
/>
Claims (76)
1.一种治疗患有骨髓增生异常综合征(MDS)的患者的输血依赖性的方法，其包括向具有升高的异常连接与规范连接TMEM14C转录物的比率(TMEM14C AJ/CJ比率)的输血依赖的MDS患者施用治疗有效量的化合物1。
2.一种治疗患有MDS的患者的输血依赖性的方法，其包括：
(a)确定该输血依赖的MDS患者具有升高的TMEM14C AJ/CJ比率；以及
(b)向该患者施用治疗有效量的化合物1。
3.一种鉴定适合用化合物1治疗的输血依赖的MDS患者的方法，其包括：
(a)确定该患者具有升高的TMEM14C AJ/CJ比率；以及
(b)鉴定该患者适合用化合物1治疗。
4.一种监测输血依赖的MDS患者中的治疗功效的方法，其包括：
(a)确定该患者具有升高的TMEM14C AJ/CJ比率；
(b)向该患者施用治疗有效量的化合物1；以及
(c)确定施用后该患者的TMEM14C AJ/CJ比率，其中施用后该TMEM14C AJ/CJ比率的降低表明有效治疗。
5.根据权利要求4所述的方法，其中该TMEM14C AJ/CJ比率在步骤(c)之后保持升高，并且该方法还包括向该患者施用另外剂量的化合物1。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中该方法还包括向该患者施用另外剂量的化合物1直至该TMEM14C AJ/CJ比率不再升高。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中确定升高的AJ/CJ比率包括从该患者获得生物样品并确定该样品中的TMEM14C AJ/CJ比率。
8.根据权利要求7所述的方法，其中该生物样品包括血液样品或骨髓样品。
9.根据权利要求8所述的方法，其中该血液样品包括外周血或血浆。
10.根据权利要求8所述的方法，其中该骨髓样品包括骨髓穿刺物或骨髓活检物。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中该TMEM14C AJ/CJ比率通过测量该患者或来自该患者的生物样品中的RNA转录物来确定。
12.根据权利要求11所述的方法，其中测量RNA转录物包括核酸条形码和/或实时聚合酶链式反应(RT-PCR)。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中测量RNA转录物包括核酸条形码。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中升高的TMEM14C AJ/CJ比率是大于约0.1、约0.2、约0.5、约1、约2、约4、约10、约15、约20或约30的比率，例如，如通过核酸条形码所测量的。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中升高的TMEM14C AJ/CJ比率是大于约4的比率，如通过核酸条形码所测量的。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中该方法还包括确定该患者具有升高的ABCB7 AJ/CJ比率。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中该方法还包括确定该患者具有升高的PPOX AJ/CJ比率。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中该方法还包括确定该患者具有升高的ABCB7 AJ/CJ比率和升高的PPOX AJ/CJ比率。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中该MDS是伴多系发育异常的MDS(MDS-MLD)、伴单系发育异常的MDS(MDS-SLD)、伴环形铁粒幼红细胞的MDS(MDS-RS)、伴原始细胞过多的MDS(MDS-EB)、与孤立del(5q)相关的MDS或不能分类的MDS(MDS-U)。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中根据国际预后评分系统，该MDS是具有中等-1风险或更低风险的MDS。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中根据国际预后评分系统，该MDS是具有中等-2风险或更高风险的MDS。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中该MDS是MDS-MLD。
23.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中该MDS是MDS-EB。
24.根据权利要求23所述的方法，其中该MDS-EB是MDS-EB1或MDS-EB2。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中该MDS是MDS-EB2。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中该患者或来自该患者的生物样品包含与RNA剪接相关的一个或多个基因的突变。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中该患者或来自该患者的生物样品包含选自SF3B1、SRSF2、U2AF1和ZRSR2的一个或多个基因的突变。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中该患者或来自该患者的生物样品包含SF3B1的突变。
29.根据权利要求28所述的方法，其中SF3B1的该突变包含在SF3B1中的位置E622、H662、K666、K700、R625或V701中的一个或多个处的突变或由其组成。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其中SF3B1的该突变包含在SF3B1中的位置H662、K700或R625中的一个或多个处的突变或由其组成。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中SF3B1的该突变包含在SF3B1中的位置K700处的突变或由其组成。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的方法，其中SF3B1的该突变包含K700E和/或R625C。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中该患者或来自该患者的生物样品包含低水平的TMEM14C表达。
34.根据权利要求1、2或4至33中任一项所述的方法，其中将化合物1口服施用给该患者。
35.根据权利要求1、2或4至34中任一项所述的方法，其中将化合物1每天一次施用给该患者。
36.根据权利要求35所述的方法，其中将化合物1按照给药5天/停药9天的给药方案每天一次施用给该患者。
37.根据权利要求35所述的方法，其中将化合物1按照给药21天/停药7天的给药方案每天一次施用给该患者。
38.根据权利要求35所述的方法，其中将化合物1按照连续给药方案每天一次施用给该患者。
39.根据权利要求35至38中任一项所述的方法，其中将化合物1每天一次施用给该患者，持续一个或多个28天周期。
40.根据权利要求35至39中任一项所述的方法，其中化合物1的治疗有效量是在施用当天以单剂量给予的约2mg至约20mg。
41.根据权利要求35至40中任一项所述的方法，其中化合物1的治疗有效量是在施用当天以单剂量给予的约2mg、约3.5mg、约5mg、约7mg、约10mg、约12mg、约14或约20mg。
42.根据权利要求1、2或4至34中任一项所述的方法，其中将化合物1每天两次施用给该患者。
43.根据权利要求42所述的方法，其中将化合物1按照给药5天/停药9天的给药方案每天两次施用给该患者。
44.根据权利要求42所述的方法，其中将化合物1按照给药21天/停药7天的给药方案每天两次施用给该患者。
45.根据权利要求42所述的方法，其中将化合物1按照连续给药方案每天两次施用给该患者。
46.根据权利要求42至45中任一项所述的方法，其中将化合物1每天两次施用给该患者，持续一个或多个28天周期。
47.根据权利要求42至46中任一项所述的方法，其中化合物1的治疗有效量是在施用当天以两个分剂量给予的总共约2mg至约20mg。
48.根据权利要求42至47中任一项所述的方法，其中化合物1的治疗有效量是在施用当天以两个分剂量给予的约10mg、约15mg或约20mg。
49.根据权利要求47或48所述的方法，其中该第一剂量为约10mg且该第二剂量为约5mg。
50.根据权利要求47或48所述的方法，其中该第一剂量为约5mg且该第二剂量为约10mg。
51.根据权利要求47或48所述的方法，其中该第一剂量和该第二剂量各自为约5mg。
52.根据权利要求47或48所述的方法，其中该第一剂量和该第二剂量各自为约7.5mg。
53.根据权利要求47或48所述的方法，其中该第一剂量和该第二剂量各自为约10mg。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的方法，其中用化合物1治疗降低或消除该患者的输血依赖性。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的方法，其中与治疗前的次数或频率相比，用化合物1治疗使给予该患者的输血次数或频率减少至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％或约60％。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的方法，其中与治疗前的次数或频率相比，用化合物1治疗使给予该患者的输血次数或频率减少至少约30％。
57.根据权利要求1至56中任一项所述的方法，其中与治疗前的次数或频率相比，用化合物1治疗使给予该患者的输血次数或频率减少至少约60％。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的方法，其中该患者在至少连续56天的时间段内未接受任何输血，其中该时间段在治疗开始后的任何时间开始。
59.根据权利要求1至58中任一项所述的方法，其中这些输血包括红细胞(RBC)输血和/或血小板输血。
60.根据权利要求1至59中任一项所述的方法，其中这些输血包括RBC输血。
61.根据权利要求1至60中任一项所述的方法，其中与治疗前的量相比，用化合物1治疗增加该患者中骨髓铁粒幼红细胞的量。
62.根据权利要求1至61中任一项所述的方法，其中与治疗前的量相比，用化合物1治疗使该患者中骨髓铁粒幼红细胞的量增加至少约10％、约20％、约30％或约40％。
63.一种治疗患有MDS的患者的输血依赖性的方法，其包括向具有升高的ABCB7 AJ/CJ比率的输血依赖的MDS患者施用治疗有效量的化合物1。
64.一种治疗患有MDS的患者的输血依赖性的方法，其包括：
(a)确定该输血依赖的MDS患者具有升高的ABCB7 AJ/CJ比率；以及
(b)向该患者施用治疗有效量的化合物1。
65.一种鉴定适合用化合物1治疗的输血依赖的MDS患者的方法，其包括：
(a)确定该患者具有升高的ABCB7 AJ/CJ比率；以及
(b)鉴定该患者适合用化合物1治疗。
66.根据权利要求63至65中任一项所述的方法，其中确定升高的AJ/CJ比率包括从该患者获得生物样品并确定该样品中的ABCB7 AJ/CJ比率。
67.根据权利要求63至66中任一项所述的方法，其中该ABCB7 AJ/CJ比率通过测量该患者或来自该患者的生物样品中的RNA转录物来确定。
68.根据权利要求67所述的方法，其中测量RNA转录物包括核酸条形码和/或实时聚合酶链式反应(RT-PCR)。
69.根据权利要求67或68所述的方法，其中测量RNA转录物包括核酸条形码。
70.一种治疗患有MDS的患者的输血依赖性的方法，其包括向具有升高的PPOX AJ/CJ比率的输血依赖的MDS患者施用治疗有效量的化合物1。
71.一种治疗患有MDS的患者的输血依赖性的方法，其包括：
(a)确定该输血依赖的MDS患者具有升高的PPOX AJ/CJ比率；以及
(b)向该患者施用治疗有效量的化合物1。
72.一种鉴定适合用化合物1治疗的输血依赖的MDS患者的方法，其包括：
(a)确定该患者具有升高的PPOX AJ/CJ比率；以及
(b)鉴定该患者适合用化合物1治疗。
73.根据权利要求70至72中任一项所述的方法，其中确定升高的AJ/CJ比率包括从该患者获得生物样品并确定该样品中的PPOX AJ/CJ比率。
74.根据权利要求70至73中任一项所述的方法，其中该PPOX AJ/CJ比率通过测量该患者或来自该患者的生物样品中的RNA转录物来确定。
75.根据权利要求74所述的方法，其中测量RNA转录物包括核酸条形码和/或实时聚合酶链式反应(RT-PCR)。
76.根据权利要求74或75所述的方法，其中测量RNA转录物包括核酸条形码。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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