CN116490500A - 菁类化合物、含菁类化合物的染料以及菁类化合物的应用 - Google Patents

菁类化合物、含菁类化合物的染料以及菁类化合物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种菁类化合物、含菁类化合物染料以及菁类化合物的应用。菁类化合物具有通式I的结构。其中，X选自由C(CH3)2、O、S和Se组成的组。R1和R2各自独立地选自由H、C1‑C18烷基、苯基、OR6和卤素组成的组、R3和R4各自独立地选自由C1‑C18烷基、C1‑C18羧基、C1‑C18羟基、C1‑C18NR5R6、苄基和取代苄基组成的组，其中取代苄基的取代基选自由C1‑C18烷基、CN、COOH、NH2、NO2、OH、SH、C1‑C6烷氧基、C1‑C6烷基氨基、C1‑C6酰氨基、卤素和C1‑C6卤代烷基组成的组。R5和R6各自独立地选自由H和C1‑C18烷基组成的组。Y‑为负离子。根据本发明的菁类化合物，具有良好的活细胞通透性，能够在不破坏细胞膜的情况进入细胞对核酸进行染色；且激发光为波长较小的蓝绿色光。

Description

菁类化合物、含菁类化合物的染料以及菁类化合物的应用
说明书
技术领域
本发明涉及核酸定量检测及生物染色技术领域，具体而言涉及一种菁类化合物、含菁类化合物的染料以及菁类化合物在定量检测核酸和/或生物染色中的应用。
背景技术
DNA(DeoxyriboNucleic Acid，脱氧核糖核酸)是一类带有遗传信息的生物大分子。生物体正常细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量，只有当发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，才会发生异常改变。因此对DNA的特异性识别和精确测量，尤其是在活细胞内进行检测，在癌症的早期诊断中意义非常重大。
利用荧光技术进行DNA的定量分析因具有灵敏度高、响应快、仪器使用便捷等优点而引起广大科研工作者的兴趣。目前，商品化的此类染料主要有菲啶类、吖啶类、咪唑类和花菁家族类等。然而，这些染料都各自存在着应用的局限性。
其一，较大一部分染料与DNA结合后呈现荧光淬灭，导致在荧光成像等可视化应用中实用价值不高。其二，有相当一部分染料应用受限于固定细胞，需要通过增大细胞膜的通透性或类似使膜崩解的方法才能对生物样品进行有效的荧光标记。然而，这种固定方法往往对细胞和生物组织真实形态的观察有负面影响，参考[Kozubek S,Lukasova E,Amrichova J,Kozubek M,Liskova A,Slotova J.Anal Biochem2000；282:29-38]。其三，目前多数染料有很大的毒性和致癌性，这就更加限制在在活细胞中的应用。
在众多种类的荧光染料中，菁类荧光染料以其波长范围宽，摩尔消光系数大，荧光量子产率适中等优点，作为生物分子荧光探针、CD和VCD记录材料、感光材料光敏剂、光电转换材料等已被广泛的应用。
菁类染料中的有些品种已经商品化，但这些商品化的染料大部分分子较大，结构复杂，属于活细胞非通透性，即不具有活细胞通透性，只能应 用于活体外核酸的识别与检测。并且，多数商品菁类染料的激发光(激光器发出的光，或者说染料的吸收光)的波长较大，例如橙光，存在对微小物体的识别性差的问题。
因此，需要一种菁类化合物、含菁类化合物的染料以及菁类化合物的应用，以至少部分地解决以上问题。
发明内容
在发明内容部分中引入了一系列简化形式的概念，这将在具体实施方式部分中进一步详细说明。本发明的发明内容部分并不意味着要试图限定出所要求保护的技术方案的关键特征和必要技术特征，更不意味着试图确定所要求保护的技术方案的保护范围。
为至少部分地解决上述问题，本发明的第一方面提供了一种菁类化合物，其具有通式I所示的结构，
其中，X选自由C(CH 3) 2、O、S和Se组成的组；
R 1和R 2各自独立地选自由H、C 1-C 18烷基、苯基、OR 6和卤素组成的组；
R 3和R 4各自独立地选自由C 1-C 18烷基、C 1-C 18羧基、C 1-C 18羟基、C 1-C 18NR 5R 6、苄基和取代苄基组成的组，其中所述取代苄基的取代基选自由C 1-C 18烷基、CN、COOH、NH 2、NO 2、OH、SH、C 1-C 6烷氧基、C 1-C 6烷基氨基、C 1-C 6酰氨基、卤素和C 1-C 6卤代烷基组成的组；
R 5和R 6各自独立地选自由H和C 1-C 18烷基组成的组；
Y -为负离子。
根据本发明的菁类化合物，具有良好的活细胞通透性，能够在不破坏细胞膜的情况进入细胞对核酸进行染色，毒性小且致癌性低；并且，本发明的菁类化合物的激发光为波长较小的蓝绿色光，能够识别微小颗粒，提高了对小粒子的检测能力；本发明的菁类化合物能够使用普通绿色或蓝色半导体激光器作为光源，大大降低了使用成本；此外，本发明的菁类化合 物的结构简单，制备其的原料易得，合成产率高，易于实现产业化。
进一步地，所述X选自由C(CH 3) 2和S组成的组。
进一步地，所述R 1和所述R 2各自独立地选自由H、C 1-C 12烷基、苯基、OR 6和卤素组成的组。
进一步地，所述R 1和所述R 2各自独立地选自由H、C 1-C 6烷基、苯基、OR 6和卤素组成的组。
进一步地，所述R 1选自由H、C 1-C 6烷基、苯基和卤素组成的组；
进一步地，所述R 2为H。
进一步地，所述R 1选自由H、甲基、苯基和Cl组成的组。
进一步地，所述R 3和所述R 4各自独立地选自由C 1-C 12烷基、C 1-C 12羧基、C 1-C 12羟基、C 1-C 12NR 5R 6、苄基和取代苄基组成的组，其中所述取代苄基的取代基选自由C 1-C 12烷基、CN、COOH、NH 2、NO 2、OH、SH、C 1-C 6烷氧基、C 1-C 6烷基氨基、C 1-C 6酰氨基、卤素和C 1-C 6卤代烷基组成的组。
进一步地，所述R 3和所述R 4各自独立地选自由C 1-C 6烷基、C 1-C 6羧基、C 1-C 6羟基、C 1-C 6NR 5R 6、苄基和取代苄基组成的组，其中所述取代苄基的取代基选自由C 1-C 6烷基、CN、COOH、NH 2、NO 2、OH、SH、C 1-C 6烷氧基、C 1-C 6烷基氨基、C 1-C 6酰氨基、卤素和C 1-C 6卤代烷基组成的组。
进一步地，所述R 3选自由C 1-C 6烷基、C 1-C 6羟基、C 1-C 6羧基、C 1-C 6NR 5R 6和苄基组成的组；
进一步地，所述R 4选自由C 1-C 6烷基、C 1-C 6羟基、C 1-C 6羧基、和苄基组成的组。
进一步地，所述R 5和所述R 6各自独立地选自由H和C 1-C 12烷基组成的组。
进一步地，所述R 5和所述R 6各自独立地选自由H和C 1-C 6烷基组成的组。
进一步地，所述R 5和所述R 6各自独立地为C 1-C 6烷基。
进一步地，所述R 5和所述R 6为乙基。
进一步地，所述R 3选自由甲基、乙基、苄基、4-(二乙氨基)丁基、羟丙基和己羧基组成的组。
进一步地，所述R 4选自由甲基、苄基、羧基戊基和羟丙基组成的组。
进一步地，所述Y -选自由卤素负离子、ClO 4 -、PF 6 -、BF 4 -、CH 3COO - 或OTs -组成的组。
进一步地，所述菁类化合物包含化学式I、化学式II、化学式III、化学式IV、化学式V、化学式VI、化学式VII、化学式VIII、化学式IX、化学式X、化学式XI、化学式XII、化学式XIII、化学式XIV、化学式XV、化学式XVI、化学式XVII和化学式XVIII中的一种所示的结构，
本发明的第二方面提供一种染料，其包括上述第一方面所述的菁类化合物。
根据本发明的染料，包括菁类化合物，具有良好的活细胞通透性，能够在不破坏细胞膜的情况进入细胞对核酸进行染色，毒性小且致癌性低；并且，本发明的菁类化合物的激发光与发射光均为波长较小的蓝绿色光，能够识别微小颗粒，提高了对小粒子的检测能力；本发明的菁类化合物能够使用普通绿色半导体激光器作为光源，大大降低了使用成本；此外，本发明的菁类化合物的结构简单，制备其的原料易得，合成产率高，易于实现产业化。
本发明的第三方面涉及上述第一方面所述的菁类化合物在定量检测核酸和/或生物染色中的应用；或者
涉及上述第二方面的荧光染料在定量检测核酸和/或生物染色中的应用。
附图说明
本发明的下列附图在此作为本发明的一部分用于理解本发明。附图中 示出了本发明的实施例及其描述，用来解释本发明的原理。
附图中：
图1示出了根据本发明的实施例2的化合物B对DNA染色后的吸收光谱；
图2示出了根据本发明的实施例2的化合物B对DNA染色后的荧光光谱；
图3示出了根据本发明的实施例2的化合物B对RNA染色后的吸收光谱；
图4示出了根据本发明的实施例2的化合物B对RNA染色后的荧光光谱；
图5示出了根据本发明的实施例2的化合物B对DNA和RNA染色后的荧光强度随核酸浓度的变化曲线；
图6为根据本发明的实施例2的化合物B对活细胞染色后的明场显微照片；
图7为根据本发明的实施例2的化合物B对活细胞染色后的荧光显微照片；
图8为图6中的明场显微照片与图7中的荧光显微照片的叠加图；
图9示出了示出了根据本发明的实施例3的化合物C对DNA染色后的荧光光谱；
图10示出了根据本发明的实施例3的化合物C对RNA染色后的荧光光谱；
图11示出了根据本发明的实施例3的化合物C对DNA和RNA染色后的荧光强度随核酸浓度的变化曲线；
图12为根据本发明的实施例3的化合物C对活细胞染色后的明场显微照片；
图13为根据本发明的实施例3的化合物C对活细胞染色后的荧光显微照片。
图14示出了根据本发明的实施例13的化合物M对DNA染色后的荧光光谱；
图15示出了根据本发明的实施例13的化合物M对RNA染色后的荧光光谱；
图16示出了根据本发明的实施例13的化合物M对DNA和RNA染 色后的荧光强度随核酸浓度的变化曲线；
图17为根据本发明的实施例13的化合物M对活细胞染色后的明场显微照片；
图18为根据本发明的实施例13的化合物M对活细胞染色后的荧光显微照片；以及
图19为本发明的实施例21提供的的核酸荧光响应性能对比示意图。
具体实施方式
在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员而言显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
为了彻底理解本发明，将在下列的描述中提出详细的描述。显然，本发明实施方式的施行并不限定于本领域的技术人员所熟悉的特殊细节。本发明的较佳实施例详细描述如下，然而除了这些详细描述外，本发明还可以具有其他实施方式。
应予以注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施例，而非意图限制根据本发明的示例性实施例。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式。此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在所述特征、整体、步骤、操作、元件和/或组分，但不排除存在或附加一个或多个其他特征、整体、步骤、操作、元件、组分和/或它们的组合。
特别地，如本申请自始至终所使用的，术语烷基可以在最广义上理解为任何线性、支化或环状的烷基取代基。如本文使用的术语“C 1-18烷基”一般指在构型中具有1至18个碳原子的饱和烃基团，C 1-18烷基包括但不限于C 1-12烷基、C 1-6烷基等。在未描述为“取代烷基”的情况下，术语“烷基”通常指未取代的烷基。示例性地，术语烷基包括取代基甲基(Me)，乙基(Et)，正丙基(nPr)，异丙基(iPr)，环丙基，正丁基(nBu)，异丁基(iBu)，仲丁基(sBu)，叔丁基(tBu)，环丁基，2-甲基丁基，正戊基，仲戊基，叔戊基，2-戊基，新戊基，环戊基，正己基，仲己基，叔己基，2-己基，3-己基，新己基，环己基，1-甲基环戊基，2-甲基戊基，正庚基，2-庚基，3-庚基，4-庚基，环庚基，1-甲基环己基，正辛基，2-乙基己基， 环辛基，1-双环[2,2,2]辛基，2-双环[2,2,2]-辛基，2-(2,6-二甲基)辛基，3-(3,7-二甲基)辛基，金刚烷基，2,2,2-三氟乙基，1,1-二甲基-正己-1-基，1,1-二甲基-正庚-1-基，1,1-二甲基-正辛-1-基，1,1-二甲基-正癸-1-基，1,1-二甲基-正十二烷-1-基，1,1-二甲基-正十四烷-1-基，1,1-二甲基-正十六烷-1-基，1,1-二甲基-正十八烷-1-基，1,1-二乙基-正己-1-基，1,1-二乙基-正庚-1-基，1,1-二乙基-正辛-1-基，1,1-二乙基-正癸-1-基，1,1-二乙基-正十二烷-1-基，1,1-二乙基-正十四烷-1-基，1,1-二乙基-正十六烷-1-基，1,1-二乙基-正十八烷-1-基，1-(正丙基)-环己-1-基，1-(正丁基)-环己-1-基，1-(正己基)-环己-1-基，1-(正辛基)-环己-1-基和1-(正癸基)-环己-1-基等。
如上文和此处所使用的，术语羧基包括任何线性、支化或环状的羧基取代基。如本文使用的术语C 1-18羧基一般指在构型中具有1至18个碳原子的羧基取代基团，C 1-18羧基包括但不限于C 1-12羧基、C 1-6羧基等。特别的，术语羧基指与如前文定义的烷基连接的具有羧基的基团。术语羧基示例性地包括甲羧基，乙羧基(羧基甲基)，丙羧基(羧基乙基)，丁羧基(羧基丙基)，戊羧基(羧基丁基)、己羧基(羧基戊基)、庚羧基(羧基己基)和辛羧基(羧基庚基)，以及它们的同分异构体等。
如上文和此处所使用的，术语羟基包括任何线性、支化或环状的羟基取代基。如本文使用的术语C 1-18羟基一般指在构型中具有1至18个碳原子的羟基取代基团，C 1-18羟基包括但不限于C 1-12羟基、C 1-6羟基等。特别的，术语羟基指与如前文定义的烷基连接的具有羟基的基团。术语羟基示例性地包括羟甲基，羟乙基，羟丙基，羟丁基，羟戊基、羟己基、羟庚基和羟辛基，以及它们的同分异构体等。
如上文和此处所使用的，术语烷氧基包括任何线性、支化或环状的烷氧基取代基。特别的，术语烷氧基指与如前文定义的烷基连接的烷氧基基团。术语烷氧基示例性地包括甲氧基，乙氧基，正丙氧基，异丙氧基，正丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基和2-甲基丁氧基等。
如上文和此处所使用的，术语“卤素”和“卤代”可以在最广泛的意义上理解为优选氟、氯、溴或碘。
如本文所使用的，如果在特定的上下文中没有更具体地定义，发射的光的颜色的指定如下：蓝绿色波长约在420-560nm的范围。
本发明的第一方面提供了一种菁类化合物，其具有通式I所示的结构，
其中，X选自由C(CH 3) 2、O、S和Se组成的组。优选地X选自由C(CH 3) 2和S组成的组。
R 1和R 2各自独立地选自由H、C 1-C 18烷基、苯基、OR 6和卤素组成的组。优选地，R 1和R 2各自独立地选自由H、苯基、C 1-C 18烷基和卤素组成的组。优选地，R 1选自由H、苯基、C 1-C 18烷基和卤素组成的组。优选地，R 1选自由H、苯基、C 1-C 18烷基和Cl组成的组。优选地，R 2选自由H、苯基和卤素组成的组。优选地，R 2为H。
R 3和R 4各自独立地选自由C 1-C 18烷基、C 1-C 18羧基、C 1-C 18羟基、C 1-C 18NR 5R 6、苄基和取代苄基组成的组，其中所述取代苄基的取代基选自由C 1-C 18烷基、CN、COOH、NH 2、NO 2、OH、SH、C 1-C 6烷氧基、C 1-C 6烷基氨基、C 1-C 6酰氨基、卤素和C 1-C 6卤代烷基组成的组。优选地，R 3和R 4各自独立地选自由C 1-C 18烷基、C 1-C 18羧基、C 1-C 18羟基、C 1-C 18NR 5R 6和苄基组成的组。其中，R 3优选为C 1-C 18烷基、C 1-C 18羟基、C 1-C 18羧基、C 1-C 18NR 5R 6和苄基组成的组；R 4优选为C 1-C 18烷基、C 1-C 18羟基、C 1-C 18羧基和苄基组成的组。
R 3和R 4选用极性较大的基团，能够适当增大分子极性，减小了对细胞中膜脂和蛋白等输水物质的结合力，提高了对核酸的特异性结合。
R 5和R 6各自独立地选自由H和C 1-C 18烷基组成的组。优选地，R 5和R 6各自独立地为C 1-C 18烷基。
Y -为负离子。
具体地，上述C 1-C 18烷基可以进一步为C 1-C 12烷基。优选地，该C 1-C 12烷基可以进一步为C 1-C 6烷基。更优选地，C 1-C 6烷基可以为甲基、乙基、丙基和丁基组成的组。特别地，R 5和R 6各自独立地为乙基。特别地，R 3和R 4可以各自独立地为甲基，R 3还可以为乙基。示例性地，上述C 1-C 6烷基可以为直链烷基，也可以为与直链烷基呈同分异构体的支链烷基。
上述C 1-C 18羧基可以进一步为C 1-C 12羧基。优选地，该C 1-C 12羧基可以进一步为C 1-C 6羧基。更优选地，C 1-C 6羧基可以为甲羧基、乙羧基、丙 羧基、丁羧基、戊羧基和己羧基组成的组。特别的，R 3和R 4可以各自独立地为己羧基(羧基戊基)。示例性地，上述C 1-C 6羧基可以为直链羧基，也可以为与直链羧基呈同分异构体的支链羧基。
上述C 1-C 18羟基可以进一步为C 1-C 12羟基。优选地，该C 1-C 12羟基可以进一步为C 1-C 6羟基。更优选地，C 1-C 6羟基可以为羟甲基、羟乙基、羟丙基和羟丁基组成的组。特别地，R 4可以为羟丙基。示例性地，上述C 1-C 6羟基可以为直链羟基，也可以为与直链羟基呈同分异构体的支链羟基。
上述C 1-C 18NR 5R 6可以进一步为C 1-C 12NR 5R 6。优选地，C 1-C 12NR 5R 6可以进一步为C 1-C 6NR 5R 6。更优选地，C 1-C 6NR 5R 6可以为由-CH 2NR 5R 6、-(CH 2) 2NR 5R 6、-(CH 2) 3NR 5R 6、-(CH 2) 4NR 5R 6和-(CH 2) 5NR 5R 6组成的组。进一步优选地，R 3和R 4各自独立地为-(CH 2) 4NR 5R 6。特别地，R 3可以为4-(二乙氨基)丁基。
根据本发明的菁类化合物，具有良好的活细胞通透性，能够在不破坏细胞膜的情况进入细胞对核酸进行染色，毒性小且致癌性低。
并且，本发明的菁类化合物的激发光为波长较小的蓝绿色光，能够识别微小颗粒，提高了对小粒子的检测能力。
本发明的菁类化合物能够使用普通绿色半导体激光器作为光源，大大降低了使用成本。
此外，根据本发明的本发明的菁类化合物的结构简单，制备其的原料易得，合成产率高，易于实现产业化。
更具体地，本发明的菁类化合物可以为包含化学式I、化学式II、化学式III、化学式IV、化学式V、化学式VI、化学式VII、化学式VIII、化学式IX、化学式X、化学式XI、化学式XII、化学式XIII、化学式XIV、化学式XV、化学式XVI、化学式XVII和化学式XVIII中的一种所示的结构，
现在，将参照实施例更详细地描述本发明。然而，这些示例性实施例可以多种不同的形式来实施，并且不应当被解释为只限于这里所阐述的实施例。应当理解的是，提供这些实施例是为了使得本发明的公开彻底且完整，并且将这些示例性实施例的构思充分传达给本领域普通技术人员。
实施例1
制备具有化学式I所示的结构的化合物A，
在本实施方式中，X为S，R 1为H，R 2为H，R 3为苄基，R 4为苄基。
化合物A的具体制备方法如下：
第一步，根据下述反应式I制备2-甲硫基苯并噻唑(反应I右侧)，
量取20mL的DMF放入容器中，将10mmol的2-巯基苯并噻唑(反应式I左侧)、11mmol的甲烷以及12mmol的碳酸钠加入容器。在氮气保护及温度为110℃的条件下搅拌反应8小时，之后停止反应。
将得到的混合物冷却至室温，之后将其倾入大量水中。使用适量的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取的有机相。使用蒸馏水洗涤上述有机相两次，之后用无水硫酸镁对其进行干燥过夜。
然后将干燥过夜后的物质经过色谱柱纯化，得到约8.5mmol的橙黄色 固体粉末，该橙黄色固体粉末即为2-甲硫基苯并噻唑。反应式I的产率约为85％。
第二步，根据下述反应式II制备1-苄基-4-甲基吡啶季铵盐(反应式II右侧)，
在容器中量取50mL甲苯，将10mmol的4-甲基吡啶(反应式II左侧)和12mmol的苄溴加入到容器中。在氮气保护的条件下回流并搅拌8小时，之后停止反应。
对反应后的混合物进行抽滤，之后使用50mL甲苯洗涤滤饼3次，得到粗产物。
将上述粗产物经过色谱柱纯化后得到约7.3mmol的白色固体粉末，白色固体粉末即为1-苄基-4-甲基吡啶季铵盐。该反应式II的产率约为73％。
第三步，根据下述反应式III制备3-苄基-2-硫酮苯并噻唑(反应式III右侧)，
量取30mL甲苯放入容器中，将3mmol的第一步反应得到的2-甲硫基苯并噻唑(反应式III左侧)、4mmol的苄溴以及5mmol的碳酸钾加入到容器中。在氮气保护及温度为110℃的条件下搅拌反应8小时。
对反应后的混合物进行抽滤，之后使用50mL甲苯洗涤滤饼3次，得粗产物。
将上述粗产物经过色谱柱纯化后得到约2.1mmol的白色固体粉末，该白色固体粉末即为3-苄基-2-硫酮苯并噻唑，反应式III的产率约为70％。
第四步，根据下述反应式IV制备3-苄基-2-乙硫基苯并噻唑(反应式IV右侧)，
在容器中量取30mL二氯甲烷，将2mmol的第三步反应得到的3-苄基 -2-硫酮苯并噻唑以及2mmol的锳盐加入到容器中。在氮气保护的条件下回流搅拌24小时。
产物经过色谱柱纯化后得到约1.1mmol的白色固体粉末，该白色固体粉末即为3-苄基-2-乙硫基苯并噻唑。反应式IV的产率约为55％。
第五步，根据下述反应式V制备化合物A(反应式V右侧)，
在容器中量取30mL的乙醇，称取第二步反应得到的的1-苄基-4-甲基吡啶季铵盐1mmol，称取第四步反应得到的3-苄基-2-乙硫基苯并噻唑1mmol，将二者加入到容器中。
在氮气保护地条件下回流搅拌24小时。产物经色谱柱纯化后得到约0.3mmol橙黄色固体粉末，该橙黄色固体粉末即为化合物A。反应式V的产率约为30％。
对化合物A进行核磁共振测试，结果如下。
1H-NMR(500MHz，DMSO，TMS)：δ4.00(s，3H)，5.59(s，2H)，6.39(s，1H)，7.26-7.31(m，4H)，7.35-7.38(t，2H)，7.40-7.42(d，2H)，7.45-7.48(t，1H)，7.52-7.54(d，1H)，7.94-7.96(d，1H)，8.33-8.35(d，2H)。
经验证，测试结果符合化学式I的结构。
实施例2
制备具有化学式II所示的结构的化合物B，
在本实施方式中，X为S，R 1为H，R 2为H，R 3为甲基，R 4为甲基。
化合物B的具体制备方法如下：
第一步，量取5mL二氯甲烷放入25mL容量的圆底烧瓶中，将10mmol的4-甲基吡啶和10mmol的碘甲烷加入到上述圆底烧瓶中。在氮气保护及室温的条件下搅拌1h后停止反应。
对得到的混合物进行沉淀并过滤，使用二氯甲烷洗涤滤饼。将滤出物 干燥后得到白色颗粒状固体，其为1,4-二甲基吡啶季铵盐。上述反应的粗收率约为97％。
第二步，量取10mL无水四氢呋喃放入50mL容量的圆底烧瓶中，将11.84mmol的2-巯基苯并噻唑加入该圆底烧瓶。在搅拌的条件下，向圆底烧瓶中缓慢滴加14.21mmol的碘甲烷，反应过夜。
在得到的混合物中加入少量石油醚，静置沉淀后过滤，使用大量石油醚洗涤滤饼。将滤出物干燥后得到白色固体，其为2-甲硫基苯并噻唑。第二步反应的粗收率约为98％。
第三步，量取10mL甲苯放入50mL容量的圆底烧瓶中，将10mmol第二步得到的2-甲硫基苯并噻唑加入其中。在氮气保护的条件下，向圆底烧瓶中缓慢滴加12mmol碘甲烷，以110℃的温度回流反应24h。
将得到的混合物冷却到室温后沉淀并过滤，使用二氯甲烷洗涤滤饼。将滤出物干燥后得到微黄色固体粉末，其为3-甲基-2-甲硫基苯并噻唑季铵盐。第三步反应的粗收率约为30％。
第四步，量取5mL无水乙醇放入50mL容量的双口圆底烧瓶中，将3mmol第三步反应得到的3-甲基-2-甲硫基苯并噻唑加入到其中。
在氮气保护的条件下，向双口圆底烧瓶内滴加10mmol三乙胺同时搅拌。将3.5mmol第一步得到的1,4-二甲基吡啶季铵盐溶于5mL的无水乙醇中，将所得到的溶液滴加入上述双口圆底烧瓶内。在60℃的温度下回流反应7h。之后将反应液蒸干，使其通过中性硅胶色谱柱分离，分离过程中使用二氯甲烷和甲醇得混合溶剂作为洗脱液。收集分离后的黄色组分，将其蒸干干燥，得黄色固体粉末，其即为化合物B，其粗收率约为20％。
对化合物B进行核磁共振测试，结果如下。
1H-NMR(500MHz，DMSO，TMS)：δ3.73(s，3H)，3.99(s，3H)，6.25(s，1H)，7.29-7.32(t，1H)，7.40-7.41(d，2H)，7.51-7.54(t，1H)，7.58-7.60(d，1H)，7.90-7.92(d，1H)，8.29-8.30(d，2H)。
经验证，测试结果符合化学式II的结构。
实施例3
制备具有化学式III所示的结构的化合物C，
在本实施方式中，X为S，R 1为H，R 2为H，R 3为苄基，R 4为甲基。
化合物C的具体制备方法如下：
第一步，量取10mL甲苯放入50mL容量的圆底烧瓶中，将10mmol的2-甲硫基苯并噻唑加入到其中。在氮气保护下，向圆底烧瓶内缓慢滴加12mmol苄溴，同时在110℃的温度下持续回流反应24h。
将反应得到的混合物冷却到室温，之后对混合物进行沉淀并过滤，使用二氯甲烷洗涤滤饼。将滤出物干燥后得到棕黄色固体粉末，即为3-苄基-2-硫酮苯并噻唑，其粗收率约为25％。
第二步，量取5mL二氯甲烷放入25mL容量的圆底烧瓶中，再将0.4mmol的3-苄基-2-硫酮苯并噻唑加入其中，在液氮冷却至-20℃的条件下搅拌缓慢滴加0.5mmol三乙基氧鎓四氟硼酸，持续搅拌6h后反应停止。混合物加入过量石油醚静置沉淀过滤，并用石油醚洗涤滤饼。干燥后得到白色固体粉末，3-苄基-2-乙硫基苯并噻唑季铵盐，粗收率30％。
第三步，将5mL无水乙醇加入50mL容量的双口圆底烧瓶中，称取第二步反应得到的3-苄基-2-乙硫基苯并噻唑3mmol，将其加入到上述双口圆底烧瓶中。
在氮气保护并搅拌的条件下，向双口圆底烧瓶中滴加10mmol三乙胺。将3.5mmol的1,4-二甲基吡啶溶于5mL的无水乙醇中，之后将溶液滴加到上述双口圆底烧瓶内，并在60℃温度下回流反应7h。之后将反应液蒸干，通过中性硅胶色谱柱分离，在分离过程中使用二氯甲烷和甲醇混合溶剂作为洗脱液。收集分离后的黄色组分并蒸干进行干燥，得到黄色固体粉末，即化合物C，其粗收率约为22％。
对化合物C进行核磁共振测试，结果如下。
1H-NMR(500MHz，DMSO，TMS)：δ4.00(s，3H)，5.59(s，2H)，6.39(s，1H)，7.26-7.31(m，4H)，7.35-7.38(t，2H)，7.40-7.42(d，2H)，7.45-7.48(t，1H)，7.52-7.54(d，1H)，7.94-7.96(d，1H)，8.33-8.35(d，2H)。
经验证，测试结果符合化学式III的结构。
实施例4
制备具有化学式IV所示的结构的化合物D，
在本实施方式中，X为S，R 1为H，R 2为H，R 3为4-(二乙氨基)丁基，R 4为甲基。
化合物D的具体制备方法如下：
第一步，将13.4mmol(2g，1eq)的2-甲基苯并噻唑和67.0mmol(14.52g，5eq)的1，4-二溴丁烷加入至20mL容量的微波管中，将其微波加热至140℃反应3小时。
之后对微波管降温，有大量固体析出。对反应液进行过滤，得到的滤饼与20mL乙酸乙酯在室温下进行打浆，再次过滤。将滤出物真空干燥后得到2.5g白色固体，其为3-(4-溴丁基)-2-甲基苯并噻唑季胺盐。
第二步，将10mmol(2.05g，1eq)的4-碘吡啶和50mmol(7.1g，5eq)的碘甲烷加入至20mL容量的微波管中，并在微波管中加入10mL二氯甲烷。
将微波管通过微波加热至60℃，并维持反应2小时。之后对其降温，有大量固体析出。对反应液进行过滤，得到的滤饼与20mL乙酸乙酯在室温下进行打浆，再次过滤。将滤出物真空干燥后得到2.0g棕色固体，其为1-甲基-4-碘吡啶季胺盐。
第三步，在20mL容量的微波管中加入10mL甲醇，称取2.75mmol(1g，1eq)的第一步反应得到的3-(4-溴丁基)-2-甲基苯并噻唑季胺盐并将其溶解在微波管内的甲醇中。
在室温下称取2.75mmol(955mg，1eq)的第二步反应得到的1-甲基-4-碘吡啶季胺盐，称取5.5mmol(462mg，2.5eq)的碳酸氢钠，将二者分别加入反应瓶(微波管)中。
将反应瓶微波加热至60℃，并维持2小时。之后对反应液进行降温过滤，滤液浓缩后，通过硅胶柱分离，分离过程中用二氯甲烷和甲醇的混合 液作为洗脱剂。收集分离产物，得400mg的黄色固体粉末，即为3-(4-溴丁基)-2-((1-甲基吡啶-4(1H)-亚甲基)甲基)苯并噻唑，其收率约为32％。
第四步，称取0.88mmol(400mg，1eq)的第三步的到的3-(4-溴丁基)-2-((1-甲基吡啶-4(1H)-亚甲基)甲基)苯并噻唑，称取4.4mmol(321mg，5eq)的二乙基胺，并将二者均加入到20mL容量的微波管中。
将上述微波管微波加热至60℃，并维持2小时。之后对反应液进行降温过滤，滤液浓缩后，通过硅胶柱分离，分离过程中用二氯甲烷和甲醇的混合液作为洗脱剂。收集分离产物，得到150mg的黄色固体粉末，即化合物D，其名称为3-(4-(二乙氨基)丁基)-2-((1-甲基吡啶-4(1H)-亚甲基)甲基)苯并噻唑季胺盐。化合物D的收率约为38％。
对化合物D进行液相色谱-质谱连用测试，结果如下。
LCMS:Calculated Exact Mass＝368.22，Found[M+H]+(ESI+)＝368.22。
结果显示对化合物D的分子量的计算值与测试值对应，证明化合物D具有化学式IV的结构。
对化合物D进行核磁共振测试，结果如下。
1H-NMR(400MHz，DMSO)：δ8.33(d，J＝7.1Hz，2H)，7.93(d，J＝7.7Hz，1H)，7.64(s，1H)，7.54(s，1H)，7.46(d，J＝7.2Hz，2H)，7.32(s，1H)，6.36(s，1H)，4.00(s，3H)，3.12(d，J＝5.8Hz，6H)，1.78(s，4H)，1.20(d，J＝15.5，8.3Hz，8H)。
经验证，测试结果符合化学式IV的结构。
实施例5
制备具有化学式V所示的结构的化合物E，
在本实施方式中，X为S，R 1为Cl，R 2为H，R 3为甲基，R 4为甲基。
化合物E的具体制备方法如下：
在50mL容量的双口圆底烧瓶中5mL无水乙醇，之后加入3mmol的3-甲基-2-甲硫基-6-氯苯并噻唑。在氮气保护并搅拌的条件下，向双口圆底烧瓶中滴加10mmol三乙胺。
将3.5mmol的1,4-二甲基吡啶溶于5mL无水乙醇中，将所得到的溶液 滴加至上述双口圆底烧瓶内，并在60℃温度下回流反应7h。
将反应液蒸干后通过中性硅胶柱进行分离，分离过程中使用二氯甲烷和甲醇得混合溶剂作为洗脱液。收集分离得到的黄色组分，将其蒸干干燥，最终得到黄色固体粉末，即化合物E，其粗收率约为20％。
对化合物E进行核磁共振测试，结果如下。
1H-NMR(500MHz，DMSO，TMS)：δ3.73(s，3H)，3.99(s，3H)，6.25(s，1H)，7.29-7.32(t，1H)，7.40-7.41(d，2H)，7.51-7.54(t，1H)，7.58-7.60(s，1H)，8.29-8.30(d，2H)。
经验证，测试结果符合化学式V的结构。
实施例6
制备具有化学式VI所示的结构的化合物F，
在本实施方式中，X为C(CH 3) 2，R 1为H，R 2为H，R 3为乙基，R 4为甲基。
化合物F的具体制备方法如下：
第一步，将25mmol(4g，1eq)的2,3,3-三甲基-3H-吲哚和37.7mmol(5.89g，1.5mmol)的碘乙烷加入至20mL容量的微波管中，并在其中加入5mL甲苯。
将微波管微波加热至140℃，反应3小时。反应结束后对微波管降温，有大量固体析出。将反应液过滤，将滤饼与20mL的乙酸乙酯在室温下打浆，再次过滤。将最后得到的固体真空干燥，最终得到7.34g红色固体，即为1-乙基-2,3,3-三甲基-3-氢吲哚季胺盐。
第二步，将10mmol(2.05g，1eq)的4-碘吡啶和100mmol(14.2g，10eq)的碘甲烷加入到100mL容量的单口瓶中。在氮气保护及60℃油浴的条件下搅拌反应3小时。反应结束后对单口瓶降温，有大量固体析出。将反应液过滤，将滤饼与20mL的乙酸乙酯在室温下打浆，再次过滤。将第二次过滤得到的固体真空干燥，最终得到2.0g的棕色固体，即为1-甲基-4-碘吡啶季胺盐。
第三步，称取3.17mmol(1g，1eq)的由第一步得到的1-乙基-2,3,3-三甲基-3-氢吲哚季胺盐，将其溶解在反应瓶内的10mL乙腈中。
称取3.17mmol(1g，1eq)的由第二步反应得到的1-甲基-4-碘吡啶季胺盐，称取7.94mmol(665mg，2.5eq)的碳酸氢钠，在室温下将二者分别加入反应瓶中。将反应瓶微波加热到100℃并维持反应2小时。
反应结束后使用二氯甲烷萃取反应液，对萃取得到的有机相依次进行水洗、饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥以及浓缩。之后将浓缩产物通过硅胶柱分离，分离过程中使用二氯甲烷和甲醇的混合液作为洗脱剂，收集得到500mg的黄色油状粗产品。将粗产品用Pre-HPLC处理得到100mg黄色油状最终产物，即为化合物F。
对化合物F进行液相色谱-质谱连用测试，结果如下。
LCMS:Calculated Exact Mass:279.19，Found[M+H]+(ESI+)＝279.2。
结果显示对化合物F的分子量的计算值与测试值对应，证明化合物F具有化学式VI的结构。
对化合物F进行核磁共振测试，结果如下。
1H-NMR(400MHz，DMSO)：δ8.33(s，2H)，7.70(s，1H)，7.42-7.40(m，1H)，7.29(m，1H)，7.06(t，J＝7.3Hz，2H)，5.76(s，1H)，4.04(s，3H)，3.92(s，2H)，1.73(s，3H)，1.54(s，3H)，1.32(s，3H)。
经验证，测试结果符合化学式VI的结构。
实施例7
制备具有化学式VII所示的结构的化合物G，
在本实施方式中，X为C(CH 3) 2，R 1为H，R 2为H，R 3为苄基，R 4为甲基。
化合物G的具体制备方法如下：
第一步，将12mmol(2g，1eq)的2,3,3-三甲基-3H-吲哚和60mmol(10g，5mol)的溴化苄加入至20mL容量的微波管中。对微波管进行微波加热， 使其在140℃条件下反应1小时。反应结束后对其进行降温，有大量固体析出。将反应液过滤，将滤饼与20mL的乙酸乙酯在室温下打浆，再次过滤。将第二次过滤得到的固体真空干燥，最终得到1.7g白色固体，即为1-苄基-2,3,3-三甲基-3-氢吲哚季胺盐。
第二步，将10mmol(2.05g，1eq)的4-碘吡啶和100mmol(14.2g，10eq)的碘甲烷加入100mL容量的单口瓶中，在氮气保护和60℃油浴的条件下搅拌反应3小时。反应结束后对单口瓶进行降温，有大量固体析出。将反应液过滤，将滤饼与20mL的乙酸乙酯在室温下打浆，再次过滤。将第二次过滤得到的固体真空干燥，最终得到2.0g棕色固体，即为1-甲基-4-碘吡啶季胺盐。
第三步，在反应器中加入10毫升的二氯甲烷，称取由第一步反应得到的1-苄基-2,3,3-三甲基-3-氢吲哚季胺盐3mmol(1g，1eq)，将其溶解在二氯甲烷中。然后在反应器中加入1mL的甲醇
在室温下称取3mmol(1.1g，1eq)的由第二步反应得到的1-甲基-4-碘吡啶季胺盐，称取7mmol(630mg，2.3eq)的碳酸氢钠，将二者分别加入反应器中，之后在室温下搅拌反应3小时。反应结束后，将反应液过滤并浓缩，通过硅胶柱将浓缩液分离，分离过程中使用二氯甲烷和甲醇的混合液作为洗脱剂。收集分离产物，得366mg的黄色固体粉末，即为化合物G，其收率约为35.2％。
对化合物G进行液相色谱-质谱连用测试，结果如下。
LCMS:Calculated Exact Mass＝341.2，Found[M+H]+(ESI+)＝341.2。
结果显示对化合物G的分子量的计算值与测试值对应，证明化合物G具有化学式VII的结构。
对化合物G进行核磁共振测试，结果如下。
1H-NMR(400MHz，MeOD)：δ8.16(s，2H)，7.61(s，1H)，7.41–7.18(m，7H)，7.09(s，2H)，6.96(s，1H)，5.72(d，J＝26.5Hz，1H)，5.10(d，J＝59.2Hz，2H)，4.07(s，3H)，1.82(s，3H)，1.50(s，3H)。
经验证，测试结果符合化学式VII的结构。
实施例8
制备具有化学式VIII所示的结构的化合物H，
在本实施方式中，X为S，R 1为H，R 2为H，R 3为甲基，R 4为羟丙基。
化合物H的具体制备方法如下：
在50mL容量的双口圆底烧瓶中加入5mL无水乙醇，将2.55mmol的3-甲基-2-甲硫基苯并噻唑加入其中。在氮气保护及搅拌的条件下，向双口圆底烧瓶中滴加10mmol的三乙胺。
将3.04mmol的1-(3-羟丙基)-4-甲基吡啶溶于5mL无水乙醇中，将得到的溶液滴加到上述双口圆底烧瓶内，在60℃条件下加热回流反应1.5h。
反应结束后，将反应液蒸干并通过中性硅胶柱分离，分离过程中使用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂作为洗脱液。收集分离后的黄色组分，将其蒸干干燥，最终得黄色固体粉末，即为化合物H，其粗收率约为20％。
对化合物H进行核磁共振测试，结果如下。
1H-NMR(500MHz，DMSO，TMS)：δ1.95-2.00(m，2H)，3.44(s，2H)，3.74(s，3H)，4.28-4.31(t，2H)，4.74(s，1H)，6.27(s，1H)，7.30-7.33(t，1H)，7.40-7.42(d，2H)，7.51-7.54(t，1H)，7.60-7.61(d，1H)，7.92-7.93(d，1H)，8.35-8.37(d，2H)。
经验证，测试结果符合化学式VIII的结构。
实施例9
制备具有化学式IX所示的结构的化合物I，
在本实施方式中，X为C(CH 3) 2，R 1为H，R 2为H，R 3为己羧基，R 4为甲基。
化合物I的具体制备方法如下：
第一步，将25mmol(4g，1eq)的2,3,3-三甲基-3H-吲哚和37.7mmol(7.3g，1.5eq)的6-溴己酸加入到20mL容量的微波管中，并在其中加入5mL甲苯。之后对微波管进行微波加热，在140℃条件下反应3小时。
反应结束后对微波管进行降温，有大量固体析出。将反应液过滤，将滤饼与20mL的乙酸乙酯在室温下打浆，再次过滤。将第二次过滤得到的固体真空干燥，最终得到7.34g红色固体，即为1-己羧基-2,3,3-三甲基-3-氢吲哚季胺盐。
第二步，将10mmol(2.05g，1eq)的4-碘吡啶和100mmol(14.2g，10eq)的碘甲烷加入100mL容量的单口瓶中，在氮气保护下和60℃油浴的条件下搅拌反应3小时。
反应结束后对单口瓶进行降温，有大量固体析出。将反应液过滤，将滤饼与20mL的乙酸乙酯在室温下打浆，再次过滤。将第二次过滤得到的固体真空干燥，最终得到2.0g棕色固体，即为1-甲基-4-碘吡啶季胺盐。
第三步，盛取3.17mmol(1g，1eq)的由第一步反应得到的1-己羧酸-2,3,3-三甲基-3-氢吲哚季胺盐，将其溶解在反应瓶内的10mL乙腈中。
称取3.17mmol(1g，1eq)的由第二步反应得到的1-甲基-4-碘吡啶季胺盐，称取7.94mmol(665mg，2.5eq)的碳酸氢钠，在室温下将二者分别加入反应瓶中。将反应瓶微波加热到100℃并维持反应2小时。
反应结束后使用二氯甲烷萃取反应液，对萃取得到的有机相依次进行水洗、饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥以及浓缩。之后将浓缩产物通过硅胶柱分离，分离过程中使用二氯甲烷和甲醇的混合液作为洗脱剂，收集得到500mg的黄色油状粗产品。将粗产品用Pre-HPLC处理得到100mg黄色油状最终产物，即为化合物I。
对化合物I进行核磁共振测试，结果如下。
1H-NMR(400MHz，DMSO)：δ8.33(s，2H)，7.70(s，1H)，7.42-7.40(m，1H)，7.29(m，1H)，7.06(t，J＝7.3Hz，2H)，5.76(s，1H)，4.04(s，3H)，3.92(s，2H)，1.73(s，3H)，1.54(s，3H)，1.32(s，3H)。
经验证，测试结果符合化学式IX的结构。
实施例10
制备具有化学式X所示的结构的化合物J，
在本实施方式中，X为S，R 1为H，R 2为H，R 3为羧基戊基，R 4为甲基。
化合物J的具体制备方法如下：
第一步，在50mL容量的圆底烧瓶中装10mL乙酸乙酯，将5.37mmol的4-甲基吡啶和10.7mmol的6-溴己酸加入到上述圆底烧瓶中，并在80℃的条件下回流反应8h。使用乙酸乙酯对得到的混合物进行重结晶并抽滤，抽滤过程中使用乙酸乙酯充分洗涤。将得到的滤出物用甲醇溶解，之后进行蒸干。最终干燥后得到黄色油性液体，其为1-(5-羧基戊基)-4-甲基吡啶，其粗收率约为91.07％。
第二步，在50mL容量的圆底烧瓶中装10mL无水四氢呋喃，将11.84mmol的2-巯基苯并噻唑加入到该圆底烧瓶中，之后在搅拌的状态下缓慢向圆底烧瓶中滴加14.21mmol的碘甲烷，反应过夜。之后在反应得到的混合物中加入少量石油醚并静置沉淀。之后过滤，并用大量石油醚洗涤滤出物。最终将滤出物干燥后得到白色固体，其为2-甲硫基苯并噻唑，其粗收率约为98％。
第三步，在50mL容量的圆底烧瓶中盛装10mL甲苯，将10mmol的2-甲硫基苯并噻唑加入到上述圆底烧瓶中。之后在氮气保护下，向该圆底烧瓶中缓慢滴加12mmol的碘甲烷，并在110℃及回流的条件下持续反应24h。将反应得到的混合物冷却到室温，之后对混合物进行过滤，并用二氯甲烷洗涤滤出物。最终将滤出物干燥后得到微黄色固体粉末，其为3-甲基-2-甲硫基苯并噻唑，其粗收率约为30％。
第四步，在25mL容量的圆底烧瓶中加入5mL二氯甲烷。将0.500mmol的3-甲基-2-甲硫基苯并噻唑与0.509mmol的1-(5-羧基戊基)-4-甲基吡啶加入到上述圆底烧瓶中。在室温以及避光的条件下搅拌10min后，再向其中缓慢滴加756μL三乙胺，之后在室温及避光的条件下反应21h左右。之后 将反应得到的混合物蒸干，剩余物通过中性硅胶柱进行分离，其中使用二氯甲烷和甲醇混合溶剂作为洗脱液。收集分离后的黄色组分并对其蒸干干燥，最终得到棕黄色粘稠物，即为化合物J，其粗收率50％。
对化合物J进行核磁共振测试，结果如下。
1H-NMR(400MHz，DMSO)：δ8.36(s，1H)，7.90(d，J＝7.6Hz，1H)，7.58(d，J＝8.0Hz，1H)，7.51(t，J＝7.4Hz，1H)，7.40(s，1H)，7.30(t，J＝7.1Hz，1H)，6.25(s，1H)，4.21(s，1H)，3.72(s，3H)，2.10(s，1H)，1.82(s，1H)，1.53(s，1H)，1.28(s，1H)。
经验证，测试结果符合化学式X的结构。
实施例11
制备具有化学式XI所示的结构的化合物K，
在本实施方式中，X为S，R 1为H，R 2为H，R 3为羟丙基，R 4为甲基。
化合物K的具体制备方法如下：
第一步：将4.88mmol的4-碘吡啶和9.76mmol的碘甲烷加入到具有25mL容量且在其内含有5mL四氢呋喃的圆底烧瓶中，在75℃的温度下回流反应3h。将反应得到的混合物用乙酸乙酯充分洗涤，干燥后得到棕黄色固体粉末，其为4-碘-1-甲基吡啶季铵盐，粗收率约为93％。
第二步：将670.19mmol的2-甲基苯并噻唑加入到25mL容量的双口圆底烧瓶中，缓慢向其中滴加804.23mmol的3-溴-1-丙醇，在80℃和回流条件下反应8h左右，结束后将反应器冷却到室温。将得到的混合物加入乙醚中进行静置沉淀并过滤，之后使用大量乙醚洗涤滤饼。干燥后得到绿色固体，其为3-(3-羟丙基)-2-甲基苯并噻唑，粗收率约为54％。
第三步：在25mL容量的双口圆底烧瓶中装入4mL无水甲醇，之后在双口圆底烧瓶中加入480.08mmol的上述第二步的得到的3-(3-羟丙基)-2-甲基苯并噻唑，之后再加入576.10mmol的NaHCO 3(已溶于2mL水中)，在室温下搅拌0.5h，之后再将576.10mmol的上述第一步得到的4-碘-1-甲 基吡啶加到双口圆底烧瓶内，在110℃和回流条件下反应过夜。将得到的反应液先用水洗涤，然后用二氯甲烷萃取，之后进行干燥浓缩，最后加入乙酸乙酯进行结晶并过滤。将过滤得到的粗产品通过中性硅胶柱分离(洗脱液采用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂)，收集分离得到的黄色组分并进行蒸干干燥。最终得到黄色固体粉末，即为化合物K，其粗收率约为1.12％。
对化合物K进行核磁共振测试，结果如下。
1H-NMR(400MHz，DMSO)：δ8.31(d，J＝6.7Hz，1H)，7.92(d，J＝7.8Hz，1H)，7.60-7.48(m，1H)，7.41(d，J＝6.6Hz，1H)，7.31(t，J＝7.5Hz，1H)，6.30(s，1H)，4.81(t，J＝4.8Hz，1H)，4.31(t，J＝7.2Hz，1H)，3.99(s，1H)，3.64-3.45(m，1H)，2.00-1.73(m，1H)。
经验证，测试结果符合化学式XI的结构。
实施例12
制备具有化学式XII所示的结构的化合物L，
在本实施方式中，X为S，R 1为甲基，R 2为H，R 3为甲基，R 4为甲基。
化合物L的具体制备方法如下：
第一步：在25mL容量的圆底烧瓶中装入5mL四氢呋喃，之后加入4.88mmol的4-碘吡啶和9.76mmol的碘甲烷，在75℃和回流的条件下反应3h。将反应得到的混合物用乙酸乙酯进行充分洗涤，干燥后得到棕黄色固体粉末，其为4-碘-1-甲基吡啶季铵盐，粗收率约为93％。
第二步：将612.60mmol的2,6-二甲基苯并噻唑加入到10mL容量的双口圆底烧瓶中，在搅拌的同时缓慢滴加1.23mmol的碘甲烷，之后在70℃的温度下回流反应1.5h。反应结束后将反应器冷却到室温，在反应得到的混合物中加入乙酸乙酯静置沉淀并过滤，之后使用大量乙酸乙酯洗涤滤饼。将滤出物干燥后得到白色固体，其为2,3,6-三甲基苯并噻唑，粗收率约为98％。
第三步：在25mL容量的双口圆底烧瓶中装入4mL无水甲醇，之后加入560.94mmol的上述第二步制得的2,3,6-三甲基苯并噻唑以及1.12mmol 的NaHCO 3(已溶于1mL水中)，在室温条件下搅拌0.5h。将673.13mmol的上述第一步得到的4-碘-1-甲基吡啶溶于5mL的无水甲醇中后，再滴加到圆底烧瓶内，在110℃及回流的条件下反应8h。将得到的反应液用先水洗涤，然后用二氯甲烷萃取，之后进行干燥浓缩，最后加入乙酸乙酯进行结晶并过滤。过滤得到的粗产品通过中性硅胶柱进行分离(二氯甲烷和甲醇混合溶剂作为洗脱液)，收集分离得到的黄色组分并蒸干干燥，最终得黄色固体粉末，即为化合物L，粗收率约为4.2％。
对化合物L进行核磁共振测试，结果如下。
1H-NMR(400MHz，DMSO)：δ8.26(d，J＝7.1Hz，1H)，7.72(s，1H)，7.50(d，J＝8.4Hz，1H)，7.36(t，J＝9.0Hz，1H)，6.21(s，1H)，3.97(s，2H)，3.71(s，2H)，2.39(s，1H)。
经验证，测试结果符合化学式XII的结构。
实施例13
制备具有化学式XIII所示的结构的化合物M，
在本实施方式中，X为S，R 1为苯基，R 2为H，R 3为甲基，R 4为甲基。
化合物M的具体制备方法如下：
第一步：在25mL容量的圆底烧瓶中装入5mL四氢呋喃，之后加入4.88mmol的4-碘吡啶和9.76mmol的碘甲烷，在75℃和回流的条件下反应3h。将反应得到的混合物用乙酸乙酯进行充分洗涤，干燥后得到棕黄色固体粉末，其为4-碘-1-甲基吡啶季铵盐，粗收率约为93％。
第二步：将501.83mmol的2-甲基萘噻唑加入到25mL容量的双口圆底烧瓶中，之后再加入4mL氯仿，然后在搅拌的同时缓慢滴加1.00mmol的碘甲烷，再80℃及回流的条件下反应8h左右。反应结束后将反应器冷却到室温，在得到的混合物中加入乙醚进行静置沉淀并过滤，使用大量乙醚洗涤滤饼。将滤出物干燥后得到黄色固体，其为2,3-二甲基萘噻唑，粗收率约为56.35％。
第三步：在25mL的双口圆底烧瓶中装入4mL无水甲醇，之后加入 466.62mmol的上述第二步得到的2,3-二甲基萘噻唑，再加入559.95mmol NaHCO 3(已溶于2mL水中)，在室温条件下搅拌0.5h。之后再将559.95mmol的上述第一步得到的4-碘-1-甲基吡啶加到反应器内，在110℃温度下回流反应过夜。将得到的反应液用先水洗涤，之后用二氯甲烷萃取，然后干燥浓缩，最后加入乙酸乙酯进行结晶并过滤。过滤得到的粗产品通过中性硅胶柱分离(二氯甲烷和甲醇混合溶剂作为洗脱液)，收集分离后的黄色组分，将其蒸干干燥，最终得黄色固体粉末，即为化合物M，粗收率约为1.40％。
对化合物M进行核磁共振测试，结果如下。
1H-NMR(400MHz，DMSO)：δ8.30(d，J＝6.9Hz，1H)，8.13(dd，J＝11.7，8.6Hz，1H)，7.99(d，J＝7.9Hz，1H)，7.90(d，J＝9.1Hz，1H)，7.73(t，J＝7.7Hz，1H)，7.59(t，J＝7.5＝Hz，1H)，7.49(d，J＝7.2Hz，1H)，6.34(s，1H)，4.00(s，1H)，3.86(s，1H)。
经验证，测试结果符合化学式XIII的结构。
实施例14
制备具有化学式XVIII所示的结构的化合物N，
化合物N的具体制备方法如下：第一步：在25mL容量的圆底烧瓶中装入50mL，之后加入50mmol的氢化钠和46mmol的2-巯基、6-壬烷苯并噻唑，在75℃回流的条件下反应3h。将反应得到的混合物用乙酸乙酯进行充分洗涤，干燥后得到淡黄色固体粉末，其为2-巯甲基、6-壬烷苯并噻唑，粗收率约为93％。
第二步：将45mmol的2-巯甲基、6-壬烷苯并噻唑加入到25mL容量的双口圆底烧瓶中，之后再加入4mL氯仿，然后在搅拌的同时缓慢滴加1.00mmol的碘甲烷，再80℃及回流的条件下反应8h左右。反应结束后将反应器冷却到室温，在得到的混合物中加入乙醚进行静置沉淀并过滤，使用大量乙醚洗涤滤饼。将滤出物干燥后得到黄色固体，其为1-甲基、2-巯甲基、6-壬烷苯并噻唑，粗收率约为56.35％。
第三步：在25mL的双口圆底烧瓶中装入4mL无水甲醇，之后加入 40mmol的上述第二步得到的1-甲基、2-巯甲基、6-壬烷苯并噻唑，再加入559.95mmol DIEA(已溶于2mL水中)，在80℃条件下搅拌0.5h。之后再将559.95mmol的上述第一步得到的4-碘-1-甲基吡啶加到反应器内，在80℃温度下回流反应过夜。将得到的反应液用先水洗涤，之后用二氯甲烷萃取，然后干燥浓缩，最后加入乙酸乙酯进行结晶并过滤。过滤得到的粗产品通过中性硅胶柱分离(二氯甲烷和甲醇混合溶剂作为洗脱液)，收集分离后的黄色组分，将其蒸干干燥，最终得黄色固体粉末，即为化合物M，粗收率约为5.8％。
对化合物M进行核磁共振测试，结果如下。
1H-NMR(400MHz，DMSO)：δ7.84(d，J＝6.9Hz，2H)，7.18(dd，J＝11.7，8.6Hz，2H)，7.2(d，J＝7.9Hz，2H)，7.75(tJ＝7.7Hz，1H)，7.63(t，J＝7.5＝Hz，1H)，4.39(s，3H)，3.58(s，3H)1.60(t，14H)，1.26(t，3H)。
经验证，测试结果符合化学式XVIII的结构。
使用实施例1-14中合成的化合物对小牛胸腺DNA及RNA进行染色，并使用紫外可见分光光度计以及荧光分光光度计分别测试吸收光(激发光)谱和荧光(发射光)光谱。结果为实施例1-14中合成的化合物的激发光波长在蓝绿色区间。
使用实施例1-14中合成的化合物对HeLa活细胞进行染色，并使用共聚焦激光扫描显微镜观察观察。结果显示实施例1-14中合成的化合物均能在不破坏细胞膜的情况下对HeLa细胞染色，成像清晰。
下面将以实施例2合成的化合物B、实施例3合成的化合物C和实施例13合成的化合物M为例，对小牛胸腺核酸染色实验以及HeLa活细胞染色实验进行详细说明。
实施例15
化合物B对小牛胸腺DNA的染色实验：
配置浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL、100μg/mL、110μg/mL、120μg/mL、130μg/mL、140μg/mL、150μg/mL、200μg/mL的小牛胸腺DNA的水溶液。
将一定量的化合物B溶解在DMSO(二甲基亚砜)中，并向其中加入pH为7.4且浓度为10mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液，配制 出具有一定浓度的化合物B的缓冲溶液。
将一定量的化合物B的缓冲溶液与一定量的上述不同浓度的小牛胸腺DNA的水溶液混合，放置在比色皿中并在37℃环境中静置3min后，测定其吸收光谱。并以一定量的化合物B的缓冲溶液与一定量的水作为对比试验。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号为Hp8453。
化合物B随DNA浓度变化的吸收光谱如图1所示。在图中，以440nm处为例，沿纵坐标自上而下的不同曲线所代表的核酸浓度依次增加。其中，最高处的曲线代表0μg/mL，即无DNA；最低处的曲线代表200μg/mL的核酸浓度。从图中可以看出，化合物B对波长440nm左右的光的吸收最强，此波长附近的光是蓝绿色光。
取每个浓度的小牛胸腺DNA溶液的吸收曲线的最大吸收峰处(如440nm附近)的波长，以该波长的光为激发光，对上述不同浓度的小牛胸腺DNA溶液与化合物B的混合溶液进行荧光激发实验，测定荧光光谱。所用仪器为荧光分光光度计，型号为FP-6500。
化合物B随DNA浓度变化的荧光光谱如图2所示。在图中，以475nm处为例，沿纵坐标自上而下的不同曲线所代表的核酸浓度依次降低。其中，最高处的曲线代表200μg/mL的DNA浓度；最低处的曲线代(几乎与横轴重叠)表0μg/mL，即无DNA。从图中可以看出，受激发后的化合物B发出的荧光在485nm附近的强度最大，说明化合物B能够成功的发射荧光，能够作为荧光染料使用。
化合物B对小牛胸腺RNA的染色实验与上述DNA染色实验过程相类似，在次不再赘述。化合物B随小牛胸腺RNA浓度变化的吸收光谱如图3所示，化合物B随小牛胸腺RNA浓度变化的荧光光谱如图4所示。
在图3中，以440nm处为例，沿纵坐标自上而下的不同曲线所代表的核酸浓度依次增加。其中，最高处的曲线代表0μg/mL，即无RNA；最低处的曲线代表200μg/mL的RNA浓度。从图中可以看出，化合物B对波长440nm左右的光的吸收最强，此波长附近的光是蓝绿色光。
在图4中，以475nm处为例，沿纵坐标自上而下的不同曲线所代表的核酸浓度依次降低。其中，最高处的曲线代表200μg/mL的RNA浓度；最低处的曲线代(几乎与横轴重叠)表0μg/mL，即无RNA。从图中可以看出，受激发后的化合物B发出的荧光在485nm附近的强度最大，说明化合物B能够成功的发射荧光，能够作为荧光染料使用。
由此可见，化合物B对波长较短的蓝绿色激光的吸收良好，波长较短有利于对微小颗粒物体的识别，能够使用普通半导体绿色激光器或蓝色激光器作为光源，成本较低。
图5示出了化合物B对DNA和RNA染色后的荧光强度随核酸浓度变化的曲线。在图中，更加清楚地示出了随着核酸浓度的增加，化合物B的荧光强度越高。在无核酸时化合物B受激发几乎不发光，这有利于减弱本底荧光的背景干扰，能够提高灵敏度。
实施例16
化合物B对HeLa活细胞的染色试验。所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号为FV1000IX81，Japan。
将化合物B加入PBS缓冲液中，配制出浓度为1mmol/L的化合物B缓冲溶液。在六孔板中培养好HeLa细胞，在其中加入10μL上述化合物B缓冲溶液。之后在条件为37℃以及CO 2含量5％的细胞培养箱中孵育30min。
孵育结束后，使用PBS震荡清洗3次，再加入细胞培养基，使用共聚焦激光扫描显微镜观察细胞形态。观察结果如图6所示的代表性区域的明场显微照片，从图中能够清晰的看到形态完整的活细胞。
对上述代表性区域使用488nm通道激发，用100倍油镜观察，重复三次。结果如图7所示的化合物B对HeLa活细胞染色的荧光显微照片。从图中，能够清楚地看到每个细胞中均能够发出荧光。
图8为图6的明场显微照片与图7的荧光显微照片的叠加照片。在图中，能够更加清楚地看到细胞核被染色，并且细胞结构完整。
由图6-图8可知，化合物B能够有效穿透活细胞膜对核酸进行染色，并且不会破坏细胞结构，这样就能够在细胞存活状态下进行染色观察，更加有利于对细胞的形态、种类等进行识别。
实施例17
化合物C对小牛胸腺DNA及RNA的染色实验，试验过程与实施例10中的方案相类似，区别仅在于不配置200μg/mL浓度的核酸溶液。具体过程在此不再赘述。
图9示出了化合物C随小牛胸腺DNA浓度变化的荧光光谱。在图中，以475nm处为例，沿纵坐标自上而下的不同曲线所代表的核酸浓度依次降低。其中，最高处的曲线代表200μg/mL的DNA浓度；最低处的曲线代(几乎与横轴重叠)表0μg/mL，即无DNA。从图中可以看出，受激发后的化 合物C发出的荧光在485nm附近的强度最大，说明化合物C能够成功的发射荧光，能够作为荧光染料使用。
图10示出了化合物C随小牛胸腺RNA浓度变化的荧光光谱。在图中，以475nm处为例，沿纵坐标自上而下的不同曲线所代表的核酸浓度依次降低。其中，最高处的曲线代表200μg/mL的RNA浓度；最低处的曲线代(几乎与横轴重叠)表0μg/mL，即无RNA。从图中可以看出，受激发后的化合物C发出的荧光在485nm附近的强度最大，说明化合物C能够成功的发射荧光，能够作为荧光染料使用。
图11示出了化合物C对DNA和RNA染色后的荧光强度随核酸浓度变化的曲线。在图中，更加清楚地示出了随着核酸浓度的增加，化合物C的荧光强度越高。
实施例18
化合物C对HeLa活细胞的染色试验。所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号为FV1000IX81，Japan。实验过程与实施例15相类似，在此不再赘述。
图12示出了化合物C对HeLa活细胞的染色的代表性区域的明场显微照片，从图中能够清晰的看到形态完整的活细胞，并且细胞结构完整未被破坏。
图13示出了，化合物C对HeLa活细胞的染色的代表性区域的荧光显微照片。从图中，能够清楚地看到每个细胞中均能够发出荧光，证明HeLa已被成功染色，且识别度高。
实施例19
化合物M对小牛胸腺DNA及RNA的染色实验，试验过程与实施例10中的方案相类似，区别仅在于不配置200μg/mL浓度的核酸溶液。具体过程在此不再赘述。
图14示出了化合物M随小牛胸腺DNA浓度变化的荧光光谱。在图中，以475nm处为例，沿纵坐标自上而下的不同曲线所代表的核酸浓度依次降低。其中，最高处的曲线代表200μg/mL的DNA浓度；最低处的曲线代(几乎与横轴重叠)表0μg/mL，即无DNA。从图中可以看出，受激发后的化合物M发出的荧光在520nm附近的强度最大，说明化合物M能够成功的发射荧光，能够作为荧光染料使用。
图15示出了化合物M随小牛胸腺RNA浓度变化的荧光光谱。在图中， 以475nm处为例，沿纵坐标自上而下的不同曲线所代表的核酸浓度依次降低。其中，最高处的曲线代表200μg/mL的RNA浓度；最低处的曲线代(几乎与横轴重叠)表0μg/mL，即无RNA。从图中可以看出，受激发后的化合物M发出的荧光在520nm附近的强度最大，说明化合物M能够成功的发射荧光，能够作为荧光染料使用。
图16示出了化合物M对DNA和RNA染色后的荧光强度随核酸浓度变化的曲线。在图中，更加清楚地示出了随着核酸浓度的增加，化合物M的荧光强度越高。
实施例20
化合物M对HeLa活细胞的染色试验。所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号为FV1000IX81，Japan。实验过程与实施例15相类似，在此不再赘述。
图17示出了化合物M对HeLa活细胞的染色的代表性区域的明场显微照片，从图中能够清晰的看到形态完整的活细胞，并且细胞结构完整未被破坏。
图18示出了化合物M对HeLa活细胞的染色的代表性区域的荧光显微照片。从图中，能够清楚地看到每个细胞中均能够发出荧光，证明HeLa已被成功染色，且识别度高。
实施例21
为了研究R1为苯基对核酸荧光响应的影响，向同浓度化合物B和化合物N中分别加入了0、10、20、30和40微克\毫升的DNA，检测加入体系的荧光强度。结果如图19所示，化合物N荧光强度显著高于化合物B，该结果表明R1为苯基显著地增强了化合物对核酸的响应性，使其更适用于核酸生物染色。其它R1为苯基的化合物相比于R1为氢的化合物也呈现出类似的结果，具有更高的核酸荧光响应性能。
综上所述，本发明的实施例1到实施例14的化合物均能穿透活细胞膜，且不破坏原有细胞结构，能够对核酸有效染色；并且吸收光的波长范围均位于蓝绿光区，能够使用蓝色或绿色激光器，使用成本低。
表1
编号 化合物 吸收光颜色 能否穿透活细胞膜 是否破坏细胞结构
实施例1 化合物A 蓝绿光 能 否
实施例2 化合物B 蓝绿光 能 否
实施例3 化合物C 蓝绿光 能 否
实施例4 化合物D 蓝绿光 能 否
实施例5 化合物E 蓝绿光 能 否
实施例6 化合物F 蓝绿光 能 否
实施例7 化合物G 蓝绿光 能 否
实施例8 化合物H 蓝绿光 能 否
实施例9 化合物I 蓝绿光 能 否
实施例10 化合物J 蓝绿光 能 否
实施例11 化合物K 蓝绿光 能 否
实施例12 化合物L 蓝绿光 能 否
实施例13 化合物M 蓝绿光 能 否
实施例14 化合物N 蓝绿光 能 否
因此，本发明的菁类化合物能够作为染料使用，特别是作为荧光染料使用，正如本发明的第二方面所涉及的。
并且，包含本发明的菁类化合物的上述荧光染料，能够在定量检测核酸和/或生物染色中进行应用。特别是能够在活细胞染色中应用。
除非另有定义，本文中所使用的技术和科学术语与本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中使用的术语只是为了描述具体的实施目的，不是旨在限制本发明。本文中在一个实施方式中描述的特征可以单独地或与其它特征结合地应用于另一个实施方式，除非该特征在该另一个实施方式中不适用或是另有说明。
本发明已经通过上述实施例进行了说明，但应当理解的是，上述实施例只是用于举例和说明的目的，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明并不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围以内。本发明的保护范围由附属的权利要求书及其等效范围所界定。

Claims (17)

  1. 一种菁类化合物，其特征在于，具有通式I所示的结构，
    其中，X选自由C(CH 3) 2、O、S和Se组成的组；
    R 1和R 2各自独立地选自由H、C 1-C 18烷基、苯基、OR 6和卤素组成的组；
    R 3和R 4各自独立地选自由C 1-C 18烷基、C 1-C 18羧基、C 1-C 18羟基、C 1-C 18NR 5R 6、苄基和取代苄基组成的组，其中所述取代苄基的取代基选自由C 1-C 18烷基、CN、COOH、NH 2、NO 2、OH、SH、C 1-C 6烷氧基、C 1-C 6烷基氨基、C 1-C 6酰氨基、卤素和C 1-C 6卤代烷基组成的组；
    R 5和R 6各自独立地选自由H和C 1-C 18烷基组成的组；
    Y -为负离子。
  2. 根据权利要求1所述的菁类化合物，其特征在于，所述X选自由C(CH 3) 2和S组成的组。
  3. 根据权利要求1所述的菁类化合物，其特征在于，所述R 1和所述R 2各自独立地选自由H、C 1-C 12烷基、苯基、OR 6和卤素组成的组。
  4. 根据权利要求3所述的菁类化合物，其特征在于，所述R 1和所述R 2各自独立地选自由H、C 1-C 6烷基、苯基、OR 6和卤素组成的组。
  5. 根据权利要求4所述的菁类化合物，其特征在于，所述R 1选自由H、C 1-C 6烷基、苯基和卤素组成的组。
  6. 根据权利要求4所述的菁类化合物，其特征在于，所述R 2为H。
  7. 根据权利要求1所述的菁类化合物，其特征在于，所述R 3和所述R 4各自独立地选自由C 1-C 12烷基、C 1-C 12羧基、C 1-C 12羟基、C 1-C 12NR 5R 6、苄基和取代苄基组成的组，其中所述取代苄基的取代基选自由C 1-C 12烷基、CN、COOH、NH 2、NO 2、OH、SH、C 1-C 6烷氧基、C 1-C 6烷基氨基、C 1-C 6酰氨基、卤素和C 1-C 6卤代烷基组成的组。
  8. 根据权利要求7所述的菁类化合物，其特征在于，所述R 3和所述R 4各自独立地选自由C 1-C 6烷基、C 1-C 6羧基、C 1-C 6羟基、C 1-C 6NR 5R 6、苄基和取代苄基组成的组，其中所述取代苄基的取代基选自由C 1-C 6烷基、CN、COOH、NH 2、NO 2、OH、SH、C 1-C 6烷氧基、C 1-C 6烷基氨基、C 1-C 6酰氨基、卤素和C 1-C 6卤代烷基组成的组。
  9. 根据权利要求8所述的菁类化合物，其特征在于，所述R 3选自由C 1-C 6烷基、C 1-C 6羟基、C 1-C 6羧基、C 1-C 6NR 5R 6和苄基组成的组。
  10. 根据权利要求8所述的菁类化合物，其特征在于，所述R 4选自由C 1-C 6烷基、C 1-C 6羟基、C 1-C 6羧基、和苄基组成的组。
  11. 根据权利要求1所述的菁类化合物，其特征在于，所述R 5和所述R 6各自独立地选自由H和C 1-C 12烷基组成的组。
  12. 根据权利要求11所述的菁类化合物，其特征在于，所述R 5和所述R 6各自独立地选自由H和C 1-C 6烷基组成的组。
  13. 根据权利要求12所述的菁类化合物，其特征在于，所述R 5和所述R 6各自独立地为C 1-C 6烷基。
  14. 根据权利要求1所述的菁类化合物，其特征在于，所述Y -选自由卤素负离子、ClO 4 -、PF 6 -、BF 4 -、CH 3COO -或OTs -组成的组。
  15. 根据权利要求1所述的菁类化合物，其特征在于，所述菁类化合物包含化学式I、化学式II、化学式III、化学式IV、化学式V、化学式VI、化学式VII、化学式VIII、化学式IX、化学式X、化学式XI、化学式XII、化学式XIII、化学式XIV、化学式XV、化学式XVI、化学式XVII和化学式XVIII中的一种所示的结构，
  16. 一种染料，其特征在于，包括权利要求1-15中任意一项所述的菁类化合物。
  17. 权利要求1-15中任意一项所述的菁类化合物在定量检测核酸、生物染色、和/或血细胞分析中的应用。
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