CN116490223A - 创伤接触构件 - Google Patents

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CN116490223A CN202080106470.XA CN202080106470A CN116490223A CN 116490223 A CN116490223 A CN 116490223A CN 202080106470 A CN202080106470 A CN 202080106470A CN 116490223 A CN116490223 A CN 116490223A
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吉田淑子
冈部素典
相古千加
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Abstract

课题在于提供施行负压创伤治疗(NPWT)时直接促进创伤愈合的创伤接触构件(接触层)。作为解决手段，为通过特定干燥处理而制造的干燥羊膜，即对于处理槽(10)内载置的新鲜羊膜利用处理槽(10)内设置的红外线加热器(14)连续进行加温、并且在使处理槽(10)内为减压状态的减压操作与使减压状态的处理槽(10)内向着大气压侧稍微上升的复压操作时从处理槽(10)内设置的微波发生装置(30)对该新鲜羊膜照射微波，一边对羊膜中存在的水分子施加能量一边进行干燥。通过在施行腹部开放创口和/或伤口裂开的负压创伤治疗(NPWT)时将该操作重复数次而保持了细胞/组织结构且干燥的羊膜用作接触层，从而能够提高NPWT的愈合效果。

Description

创伤接触构件
技术领域
本发明涉及施行负压创伤治疗(NPWT)时使用的创伤接触构件(接触层)。
背景技术
在急诊外科领域，由于严重腹部创伤、伴有败血症的腹膜炎等，经常会出现腹部开放(Open Abdomen)状态下的长期管理、伤口裂开等而无法关闭腹壁的状况。
这些与感染、筋膜坏死、腹壁侧方萎缩、肠管浮肿、腹压上升等有关。
在这期间，露出肠管与周围组织、肠管、腹壁等彼此形成粘连而形成伴有肠管露出的开放创口。这样的病例需要精心管理，避免露出肠管产生穿孔，必须使创部保持湿润环境、避免对创口的额外刺激并等待露出肠管被肉芽覆盖。
肉芽逐渐在露出肠管上生长，逐渐起到肠管外壁的作用。然后，通常在创部已被肉芽覆盖时尝试植皮、创口闭合。生长出的肉芽最初时较脆弱，需要注意避免干燥、接触刺激、感染、对肠管壁的张力和压力等。
肠管发生了穿孔时，即使将穿孔部缝合也难以关闭，会形成慢性瘘孔。这样的产生于露出肠管上的慢性瘘孔被称为消化管瘘孔(enteroatmospheric fistula：以下记作EAF)。EAF的发生机制至今不明，EAF是创伤、腹膜炎后的腹壁开放创口、创口撕裂等时发生的严重并发症之一。EAF使创口管理变得困难，使死亡率明显上升。
负压创伤治疗(Negative-pressure wound therapy：以下记作NPWT)是开放创口管理中有助于保持创口的湿润环境、刺激肉芽生长的治疗。例如，对于腹壁开放创口而言，可预防腹壁的侧向萎缩、减轻对露出肠管所施加的张力。但是，即使使用NPWT，彻底预防EAF的发生也非易事。目前，尚未确立预防EAF发生的方法，一般认为尽早使肉芽堆积于露出肠管上有助于有效预防EAF的发生。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2007-54015号公报
非专利文献
非专利文献1:Gruss,J.S.&Jirsch,D.W.Human amniotic membrane:A versatilewound dressing.Can.Med.Assoc.J.118,1237-1246(1978).
非专利文献2:Okabe,M.et al.Hyperdry human amniotic membrane is usefulmaterial for tissue engineering:Physical,morphological properties,and safetyas the new biological material.J.Biomed.Mater.Res.-Part A 102,862-870(2014).
发明内容
发明要解决的问题
NPWT是如下的创伤管理方法：在创部上放置聚氨酯等泡沫材料，以包住创部整体的方式用膜材料覆盖，对被覆盖的创伤内持续地施加负压，从而促进创伤愈合。
此时，泡沫材料与脆弱的创部如果直接接触，则机械刺激可能会使组织受损，因此通常放置作为创伤接触构件(以下记作接触件)的由硅等制作的薄敷料。
在对开放创口进行NPWT时，通常在创伤底部铺设接触层，在其上放置泡沫材料，用膜进行密闭，用抽吸装置施加负压。开放创口内伴有露出肠管的情况下，由于目前没有适合用于肠管上的接触层、NPWT中负压直接作用于露出肠管而可能导致穿孔，因此严格来说不能使用NPWT。因此，现状是或者进行纱布敷料覆盖管理、或者以超规定方式放置接触层并以低压进行NPWT。
此次的研究中，根据在露出肠管上放置极度干燥羊膜可促进良好的肉芽形成的结果，在开放创口内的露出肠管上放置切成了合适大小的极度干燥羊膜，在其上放置接触层制品(任意均可)并使用NPWT制品(任意均可)，从而能够避免负压直接作用于露出肠管、并且也能对露出肠管上和周围组织安全地促进肉芽形成，这是本方法的优点。
以往用作接触层的敷料中，不存在具有直接促进创伤愈合的效果、抗炎症效果等的材料，其主要作用仅仅是简单地避免泡沫材料与创部直接接触。
用于解决问题的方案
羊膜是由胶原蛋白和弹性纤维构成的强韧的生物膜，据报道新鲜羊膜是对创伤、烧伤有用的覆盖材料(非专利文献1)。但是，由于需要时无法立即获得、保存和处理烦杂，实际的临床应用中使用受到限定。与此相对地，报道了通过特定的干燥处理而制造的干燥羊膜(极度干燥人干燥羊膜：以下记作HD-AM)(专利文献1、非专利文献2)。
发明人们制作了动物实验模型，从组织学、免疫化学、分子生物学角度确认了HD-AM促进了露出肠管上的肉芽生长。即，明确了HD-AM在组织再生中参与作为细胞支架(scaffold)的功能、生长因子和细胞游走类趋化因子的诱导、以及通过调整为向M2巨噬细胞分化实现的局部的抗炎症、组织再生促进等，从而完成了本发明。
根据本发明的创伤接触构件，其为用于负压创伤治疗的创伤修复材料，所述创伤接触构件是包裹包括人在内的动物的胎儿的新鲜羊膜经干燥处理而得的干燥羊膜，上述干燥羊膜经过了脱水干燥而能够在无菌状态的干燥大气中保存，并且浸渍于水或缓冲液而复水的羊膜中保持了构成上述新鲜羊膜的上皮细胞、基底膜和结缔组织。
通过采取该构成，不仅防止了负压管理中泡沫材料与创部直接接触而通过机械刺激造成组织受损，而且通过与创面接触的羊膜的创伤愈合促进作用、抗炎症作用等积极作用促进了创伤愈合。
另外，可以为腹部开放创口和/或伤口裂开的负压创伤治疗中使用的创伤接触构件。
根据本发明的创伤接触构件的应用，其特征在于，其为创伤修复材料的应用，用于负压创伤治疗中，所述创伤接触构件是包裹包括人在内的动物的胎儿的新鲜羊膜经干燥处理而得的干燥羊膜，上述干燥羊膜经过了脱水干燥而能够在无菌状态的干燥大气中保存，并且浸渍于水或缓冲液而复水的羊膜中保持了构成上述新鲜羊膜的上皮细胞、基底膜和结缔组织。
另外，可以为创伤接触构件的应用，用于腹部开放创口和/或伤口裂开的负压创伤治疗中。
根据本发明的负压创伤治疗，其特征在于，使用干燥羊膜作为创伤修复材料的创伤接触构件，所述干燥羊膜为包裹包括人在内的动物的胎儿的新鲜羊膜经干燥处理而得的干燥羊膜，其经过了脱水干燥而能够在无菌状态的干燥大气中保存，并且浸渍于水或缓冲液而复水的羊膜中保持了构成上述新鲜羊膜的上皮细胞、基底膜和结缔组织。
另外，可以为腹部开放创口和/或伤口裂开的治疗。
需要说明的是，本发明的负压创伤治疗中，可以以人类以外的动物(宠物等)为治疗对象。
发明的效果
通过在NPWT中使用本发明的创伤接触构件，从而不仅防止了负压管理中泡沫材料与创部直接接触而通过机械刺激造成组织受损，而且能够通过与创面接触的羊膜的创伤愈合促进作用、抗炎症作用等积极作用促进了创伤愈合。
附图说明
图1中，图1A和图1B是说明实验小鼠模型和HD-AM的应用的图(图中，*为盲肠、**为腹部肌层)。图1A的左图为实验用小鼠的示意图。以15mm×20mm的创伤尺寸在腹部中央形成了皮肤全部层的缺损。白线上进行了15mm的切开。图1A的右图为小鼠模型的创伤部位的照片。抬高盲肠并以6点缝合固定于腹部肌层。图1B为图1A的虚线的剖视图。
图2是说明HD-AM的应用的图。图2的左图为HD-AM和露出的肠壁的示意图。图2的右图为使上皮侧朝上(HD-AM组)或使间质侧朝上(倒过来，HD-AM UD组)、并且将HD-AM配置在创伤区域上。在对照组中不使用HD-AM(HD-AM(-)组)。
图3是定量逆转录聚合酶链式反应(q RT-PCR)中使用的引物。
图4中，图4A是测定肉芽组织厚度的方法的示意图。肉芽组织在露出的肠部与纤维蛋白块一起增加。白色箭头表示肉芽组织的厚度。对包括中央部分和中央部分两侧的5mm处在内的合计3处进行测定并取平均。图4B为各组的代表性显微镜照片(×50)。肉芽组织的厚度用白色箭头来示出。对照组(POD 7)中肉芽组织过薄，因此无箭头。图4C为肉芽组织的测定平均厚度的比较图。HD-AM组中，POD 7和POD 14这两组显示出显著厚于对照组的肉芽组织。POD 7的HD-AM UD组的肉芽组织的厚度显著低于HD-AM组(n＝5、*p<0.05、**p<0.01)。
图5中，图5A和图5B是说明细胞向HD-AM中的浸润的表和图。使用H-E染色观察细胞向HD-AM的浸润(×200)。白色表示HD-AM。图5A的表中示出细胞浸润的结果。HD-AM组中，5只POD 7小鼠中的2只观察到浸润，5只POD 14小鼠中的3只观察到浸润，但HD-AM UD组未观察到浸润。图5B上排的照片：观察到细胞向HD-AM的浸润。图5B下排的照片：未观察到细胞浸润。
图6A至图6D是示出POD 7时基于对照组的各组的RNA相对值的平均的图(n＝5、*p<0.05、**p<0.01)。图6A中，POD 0上的HD-AM(-)组的各引物的RNA值为1(实线)。假定生长因子和细胞游走，在图上示出POD 0上的相对值。图6B为趋化因子、图6C为抗炎症标记物、图6D为炎症标记物。
图7中，图7A和图7B是实施了免疫组织化学染色而得的显微镜照片。白色的箭头表示HD-AM。*为裸露的肠。图7A的左图为TGFβ-1染色(×100)，图7A的右图为VEGF染色(×100)。图7B的上图为CD163染色。将图7B上排左侧的照片上的虚线框的焦点部分(×50)放大显示于图7B上排右侧的照片(200倍)。HD-AM的上皮侧为上侧，且间质侧为下侧。图7B的下图为对照的CD163染色(×50)。
图8是制作HD羊膜的干燥装置。
具体实施方式
(本实施方式的概要)
通过特定干燥处理(极度干燥)而制造的干燥羊膜例如为专利文献1中记载的干燥羊膜。即，对于处理槽内载置的新鲜羊膜，利用处理槽内设置的红外线加热器连续加温，在使处理槽内为减压状态的减压操作与使减压状态的处理槽内向着大气压侧稍微上升的复压操作时，从处理槽内设置的微波发生装置对该新鲜羊膜照射微波，一边对羊膜中存在的水分子赋予能量一边进行干燥。将其重复进行数次而制造的干燥羊膜(HD-AM)虽然羊膜细胞本身失活，但是其细胞/组织结构得以保持。
常规的负压创伤治疗如下：(1)根据伤口的形状而盖上聚氨酯等泡沫材料(覆盖材料)，用透明膜密封。(2)使引流管从透明膜所开设的孔中通过并与泡沫材料连接。(3)将引流管与抽吸源连接，进行调整而使开放的伤口闭合，同时清除创面多余液体以促进循环和渗出液的排出。由此形成湿润治疗环境，防止溶胀。
在本实施方式中，配置HD-AM作为创伤接触构件(接触层)。通过将HD-AM作为创伤接触构件配置在创部与泡沫材料之间，从而防止泡沫材料与脆弱的创部直接接触而通过机械刺激造成组织受损，另外促进与创面接触的羊膜的创伤愈合促进作用、抗炎症作用等积极作用。
在本实施方式中，在接触层中使用HD-AM时，例如可以根据腹部开放(OpenAbdomen)创等创伤部位用剪刀等剪成合适的形状，另外，也可以制作引流孔。另外，HD-AM按照其上皮侧朝上、间质侧朝创面的方式放置，从而能够活用羊膜所具有的抗炎症效果、创伤愈合促进效果和作为支架(Scaffold)的功能。
(模型动物中的开放创口的制作)
将出生后8周的雄性ICR小鼠麻醉取仰卧位后将四肢固定。将腹壁的皮肤除去15×20mm(横×纵)而露出腹壁肌鞘，将腹壁从正中切开15mm而确定盲肠(图1A)。接着将盲肠抬高并用7-0尼龙线将盲肠的浆膜肌层和腹壁肌层进行6针固定(图1B)，由此制作具有露出肠管的脆弱的开放创口。
需要说明的是，实验动物的处理按照National Institutes of Health的指南且得到了富山大学动物实验委员会的批准。另外，实验按照富山大学动物实验委员会的指南进行。
(HD-AM的应用)
人羊膜主要由单层上皮层(Epithelium)、薄的基底膜(Basement membrane)、无血管的间质层(Stroma)这3层构成(图2的左图)。实验中，设置了如下3组：将HD-AM剪成15×20mm的大小，以上皮层朝上的组(HD-AM组)和间质层朝上的组(HD-AM UD组)来区分羊膜的表侧背侧；作为对照的不放置HD-AM的组(HD-AM(-)组)(图2的右图)。创部(Wall ofexposed bowel)均用作为聚氨酯泡沫覆盖材料的Hydrosite plus(Smith&amp；NephewWound Management公司制，由聚氨酯形成的非固着性的创面接触层、亲水性泡沫的吸收垫、背面膜的3层结构敷料)覆盖。
各组(HD-AM(-),HD-AM,HD-AM UD)分别为5只小鼠，分别在术后7天(POD 7)和术后14天(POD 14)进行评价，因此使用了合计30只。创部用不锈钢网(0.06mmΦ,150m/s)盖住，以避免HD-AM、创伤覆盖材料因小鼠的行动而脱离。
(组织学染色和免疫组织化学染色)
为了进行组织学观察，在POD 7和POD 14，连同露出肠管一起从各小鼠采集腹壁，进行石蜡包埋。对于从石蜡块切出的切片用苏木精-伊红(H&E)和AZAN染色。另外，对于CD163、TGFβ-1(transforming growth factor beta-1，转化生长因子β-1)、VEGF(vascularendothelial growth factor，血管内皮生长因子)进行免疫组织化学染色。将染色后的组织用Leica DMRBE显微镜(Leica、Wetzlar、Germany)和DP73系统(Olympus、Tokyo、Japan)进行拍摄。
(露出的肠的肉芽组织的测定)
为了观察肉芽组织，通过AZAN染色来容易地区分胶原蛋白纤维和纤维蛋白。含有胶原蛋白纤维的肉芽组织的厚度使用Olympus CellSens成像程序(版本1.7；Olympus、Tokyo、Japan)来测定。测定部位设为：从露出肠管被固定于左右肌层的位置起的中心、和中心起向两侧的5mm处，计算所测定的3处的平均值(图2A)。
(定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR))
为了提取露出肠管上的肉芽组织中的mRNA，从各试样选择性采集靶标部位。采集时，在露出的肠管的中央部分，每个被检体均同样地切下肉芽组织，使它们在解剖学上尽可能保持一致，以避免受到采集部位、范围的差异的影响。使用Isogen II(Nippon GeneCo.LTD.,Tokyo,Japan)按照制造商的指示从组织提取总mRNA。将该mRNA中的一部分即3μg在室温下用脱氧核糖核酸酶I(DNase I、Sigma-Aldrich,Inc.,Tokyo,Japan)处理15分钟。
使用Rever Tra Ace qPCR RT Kit(Toyobo Co.,Ltd.,Osaka,Japan)，用500ng的DNase I处理RNA合成cDNA。基因表达中，使用Mx3000P定量聚合酶链式反应(qPCR)系统(Stratagene；Agilent Technologies Japan Ltd,Japan)且使用Brilliant SYBR GreenQRT-PCR Mix(Stratagene；Agilent Technologies Japan Ltd.Japan)利用实时RT-PCR分析来定量。在POD 7和POD 14，对于各5只小鼠/组，提取mRNA并以三次重复方式测定作为生长因子的TGFβ130、VEGFA31、α-SMA32、bFGF33、PDGF34、细胞游走系趋化因子CXCL-535、SDF-135、抗炎症性M2巨噬细胞的标记物CD163、抗炎症细胞因子IL-1037、炎症系细胞因子IL-637、肿瘤坏死因子(TNF-α38)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS38)。
为了明确细胞因子的变动为术后变化，在制作5只模型小鼠后立即采集组织，设为POD 0，调查手术即刻的各引物的mRNA表达量。各mRNA的表达量进行以GAPDH为内标的校正，以POD 7的HD-AM(-)组的平均值为基准进行相对比较。将此次使用的引物的序列示于图3。
(露出的肠的肉芽组织厚度的评价)
在各组中，测定露出肠管上的肉芽组织的厚度，在POD 7和POD 14之间进行比较。
HD-AM组和HD-AM UD组与HD-AM(-)组相比，POD 7和POD 14这两个时间点肉芽组织均显著厚(p<0.05和p<0.01)。另一方面，POD 7时，HD-AM组与HD-AM UD组相比，肉芽组织显著厚(p<0.05)，但在POD 14时达到同等程度(图4A-图4C)。
(细胞向HD-AM的浸润)
HD-AM组中观察到了细胞向HD-AM内的浸润。但是，HD-AM UD组中未观察到。HD-AM中以5/10的比例观察到细胞浸润，HD-AM UD中以0/10的比例观察到细胞浸润，HD-AM组中显著多(p<0.05)。(图5A、图5B)。
(POD 7时与HD-AM(-)组相比的基于POD 0的表达评价)
VEGFA、α-SMA、PDGF以外的细胞因子在手术后即刻(POD0)几乎未表达(图6A)。
(生长因子和细胞游走趋化因子)
关于TGFβ-1的表达，POD 7时HD-AM和HD-AM UD组显著高于HD-AM(-)组，POD 14时均反转。与TGFβ1同样，CXCL-5也是POD 7时HD-AM组显著高于HD-AM(-)组、POD 14时也反转。关于VEGF，POD 7时仅HD-AM UD组明显高于HD-AM(-)组，关于SDF-1的表达，POD 14时HD-AM组和HD-AM UD组显著低于HD-AM(-)组。对于其它生长因子，没有确认到特别显著的差异(图6B)。
(抗炎症标记物)
关于CD163，POD 7时HD-AM组与HD-AM(-)组相比显著高表达。关于IL-10，POD 7时HD-AM UD组与HD-AM(-)组相比显著高表达。另外，虽然没有显著差异，但是POD7时存在HD-AM组高于HD-AM(-)组的倾向(p＝0.057)(图6C)。
(炎症标记物)
关于IL-6、TNF-α、iNOS的表达，在与各组的比较中未观察到显著差异(图6D)。
(免疫组织化学染色)
关于TGFβ-1、VEGF和CD163，利用免疫组织化学染色调查了局部存在性。TGFβ-1和VEGF在创伤的渗出液中和羊膜周边高度表达(图7A)。需要注意的是，POD7时CD163在HD-AM的上皮侧集中表达(图7B、箭头)。
·HD-AM的制造
使用图8所示的干燥装置，在下述的真空/远红外线/微波各装置的条件下对新鲜羊膜进行干燥。
图8的干燥装置在处理槽10内具备载置新鲜羊膜的旋转台12、和作为加温单元的远红外线加热器14。另外，为了对处理槽10内进行减压，在处理槽10上连接有电磁阀20和真空泵18。另外，为了对处理槽10内进行复压，处理槽10上连接有电磁阀26和过滤器24。
另外，在从减压状态进行复压操作时，为了一边对羊膜中的水分子施加能量一边进行干燥，在处理槽10上设置微波照射装置30。
·干燥槽加温：50℃、F.I.R：50℃、关闭阀：37％、最高到达压力0.34kPa空转最高到达压力0.33kPa·干燥处理的方法
(1)减压180sec
(2)复压30sec(关闭阀开度37％)
微波照射
0.1kw-180sec(复压时持续进行)
(3)减压180sec
(4)此后重复(2)和(3)
(5)确认(3)的180sec减压后到达压力(0.30～0.35kPa)并手动进行干燥结束。
恢复至大气压，结束。
产业上的可利用性
通过特定干燥处理而制造的干燥羊膜(HD-AM)，即对于处理槽内载置的新鲜羊膜利用处理槽内设置的红外线加热器连续进行加温、并且在使处理槽内为减压状态的减压操作与使减压状态的处理槽内向着大气压侧稍微上升的复压操作时从处理槽内设置的微波发生装置对该新鲜羊膜照射微波，一边对羊膜中存在的水分子施加能量一边进行干燥、并且将其重复进行数次而在保持了细胞/组织结构的情况下干燥而得的羊膜，不仅保存性提高，而且容易进行处理。在施行腹部开放创口和/或伤口裂开的负压创伤治疗(NPWT)时，为了防止敷料即泡沫材料与创伤面接触而将该干燥羊膜用作接触层，从而能够提高NPWT的愈合效果。

Claims (6)

1.一种创伤接触构件，其特征在于，其为负压创伤治疗中使用的创伤修复材料，所述创伤接触构件是包裹包括人在内的动物的胎儿的新鲜羊膜经干燥处理而得的干燥羊膜，上述干燥羊膜经过了脱水干燥而能够在无菌状态的干燥大气中保存，并且浸渍于水或缓冲液而复水的羊膜中保持了构成上述新鲜羊膜的上皮细胞、基底膜和结缔组织。
2.根据权利要求1所述的创伤接触构件，其用于腹部开放创口和/或伤口裂开的负压创伤治疗中。
3.一种创伤接触构件的应用，其特征在于，其为负压创伤治疗中使用的创伤修复材料的应用，所述创伤接触构件是包裹包括人在内的动物的胎儿的新鲜羊膜经干燥处理而得的干燥羊膜，上述干燥羊膜经过了脱水干燥而能够在无菌状态的干燥大气中保存，并且浸渍于水或缓冲液而复水的羊膜中保持了构成上述新鲜羊膜的上皮细胞、基底膜和结缔组织。
4.根据权利要求3所述的创伤接触构件的应用，其用于腹部开放创口和/或伤口裂开的负压创伤治疗中。
5.一种负压创伤治疗，其使用干燥羊膜作为创伤修复材料的创伤接触构件，所述干燥羊膜是包裹包括人在内的动物的胎儿的新鲜羊膜经干燥处理而得的干燥羊膜，其经过了脱水干燥而能够在无菌状态的干燥大气中保存，并且浸渍于水或缓冲液而复水的羊膜中保持了构成上述新鲜羊膜的上皮细胞、基底膜和结缔组织。
6.根据权利要求5所述的负压创伤治疗，其为腹部开放创口和/或伤口裂开的治疗。
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