CN116472460A - 用于患者样品中的质谱测量的至少一种目标分析物的衍生化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于确定目标分析物的存在或水平的方法及其用途。此外，本发明涉及分析系统、采样管，以及所述采样管和亲核衍生化试剂的用途。

Description

用于患者样品中的质谱测量的至少一种目标分析物的衍生化
技术领域
本发明涉及一种用于确定目标分析物的存在或水平的方法及其用途。此外，本发明涉及分析系统、采样管，以及采样管和亲核衍生化试剂的用途。
背景技术
目标分析物可以为小分子，例如丙戊酸或水杨酸，其摩尔质量小于200Da。难以通过质谱法来对这些小分子进行裂解，因为它们未示出任何特征性的裂解模式。
丙戊酸(1，例如方案2)为小分子，其分子量仅为144g/mol，用于治疗癫痫。该化合物是从人体样品材料中定量的，以监测其在患者施用后的浓度。药物的治疗范围很窄，并且必须监测患者给药以防止毒性作用通过将血浆/血液药物浓度维持在限定的治疗范围内的该临床实践和药物剂量的个体化被称为治疗药物监测(TDM)。
水杨酸为小分子，其分子量仅为138g/mol，为乙酰水杨酸的主要活性代谢物。乙酰水杨酸具有其抗炎和解热作用，被用于治疗各种类型的疼痛以及发热。此外，它还被用作血液凝固的抑制剂。特别是对于该适应症，患者施用后血液水平/血浆水平的监测(TDM)被认为是用于监测治疗效果的宝贵工具。
优选地，小分子，例如丙戊酸或水杨酸，借助于LC-MS/MS来进行定量，其优化利用串联MS模块的特异性，从天然(即，完整)分子/化合物中生成独特碎片。然而，由于其体积小并且化学结构简单，因此丙戊酸和水杨酸生成稳定的碎片离子的能力差，从而使借助于串联质谱法来进行该丙戊酸和水杨酸的特异性确定具有挑战性。
为了回避该问题，目前使用伪多反应监测(MRM)。在该情况下，“伪MRM”是指经由完整分子的检测来对这些分析物进行定量(即，分子未裂解，并且三重四极杆MS的Q1四极杆和Q3四极杆选择相同的m/z)。因此，在丙戊酸的情况下，Q1和Q3选择在负模式下m/z为143的完整物质。
尽管被使用和承认，但该方法的消极方面为：这会导致损失
i)灵敏度，因为背景信号高，
ii)特异性，因为未执行裂解，和/或
iii)高干扰风险，因为定量不是经由以某一前体离子为特征的裂解产物离子来执行的，而TDM通常是借助于MS/MS来执行的。
在样品制备或LC-MS工作流程中所需的样品材料或所使用的材料中的一种所使用的材料中存在具有相同m/z的干扰化合物的情况下，假设保留时间与丙戊酸没有显著差异，则后者可能会导致化合物浓度被高估。因此，不正确的结果和由此的患者给药可能为此类方法的结果。
因此，在本领域中迫切需要克服如上所述的问题。
本发明的一个目的为提供一种用于确定目标分析物的存在或水平的方法及其用途。此外，本发明的一个目的为提供分析系统、采样管，以及采样管和用于确定目标分析物的存在或水平的亲核衍生化试剂的用途。
该目的或这些目的由独立权利要求的主题来解决。进一步的实施例服从于从属权利要求。
发明内容
在下文中，本发明涉及以下方面：
在第一方面，本发明涉及一种用于确定样品中摩尔质量小于200Da的目标分析物的存在或水平的方法，该方法包括以下步骤
a)提供包含目标分析物的样品，其中目标分析物包含羧酸基团，
b)任选地通过添加至少一种活化试剂来活化目标分析物，
c)用用于形成衍生化的目标分析物的亲核衍生化试剂，将由步骤a)
或b)提供的目标分析物衍生化，以及
d)使用免疫学测定法或质谱法(MS)来确定样品中衍生化的目标分析物的存在或水平。
在第二方面，本发明涉及一种适于执行本发明的第一方面的方法的分析系统。
在第三方面，本发明涉及一种用于收集患者样品的采样管，该采样管包含用于在样品中形成衍生化的目标分析物的亲核衍生化试剂，其中该一种或多种目标分析物为摩尔质量小于200Da的羧酸，优选地其中该一种或多种目标分析物为丙戊酸或水杨酸。
在第四方面，本发明涉及本发明的第三方面的采样管在根据本发明的第一方面的方法中的用途。
在第五方面，本发明涉及亲核衍生化试剂在根据本发明的第一方面的方法中的用途。
在第六方面，本发明涉及本发明的第一方面的方法用于确定样品中一种或多种目标分析物的存在或水平的用途。
附图说明
图1至图6示出了色谱图。
图1示出了血清中的丙戊酸-丁酰胺。
图2示出了按1:10稀释的血清中的丙戊酸-丁酰胺。
图3示出了按1:10稀释的血清中的丙戊酸-丙酰胺。
图4示出了血清中的丙戊酸-丙酰胺。
图5示出了使用富集工作流程从血清中提取的Cal 3(12μg/mL)，其根据现有技术检测伪MRM 143.1/143.1。S/N:710.5
图6示出了用衍生化然后用富集工作流程从血清中提取的Cal 3(12μg/mL)，其根据本发明检测MRM 200.1/116。S/N:2837.5
具体实施方式
在下文详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文所述的特定实施例和实例，因为这些实施例和实例可以变化。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求限制。除非另外指明，否则本文所用的所有科学技术术语具有如本领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
本说明书文本全文引用了若干文献。本文所引用的文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、使用说明等)中的每一篇，无论上文或下文中引用，均通过引用而以其整体并入本文。在此类并入的参考文献的定义或教导与本说明书中引用的定义或教导矛盾时，以本说明书文本为准。
下面将描述本发明的元件。这些元件与具体实施例一起列出，然而，应理解，它们可以任何方式和任何数目组合以创建另外的实施例。各种描述的实例和优选实施例不应解释为仅将本发明限制为明确描述的实施例。此描述应理解为支持并且涵盖将明确描述的实施例与任何数目的所公开和/或优选元件组合的实施例。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中所有所描述要素的任何排列和组合均应视为由本申请的说明书公开。
定义
词语“包括”以及变体诸如“包含”和“含有”应理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤组。
如在本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另外明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”、“该”和“所述”包括复数指代物。
百分比、浓度、量和其他数值数据在本文中可以“范围”格式表达或呈现。应当理解，此类范围格式仅出于方便和简洁而使用，因此应灵活地解释为不仅包括明确列举为范围限值的数值，而且包括该范围所涵盖的所有单独的数值或子范围，就如同明确列举出每个数值和子范围一样。作为例示，数值范围“4％至20％”应解释为不仅包括明确列举出的4％至20％的值，而且包括所示范围内的各个值和子范围。因此，此数值范围中包括个体值诸如4、5、6、7、8、9、10、…18、19、20％和子范围诸如4-10％、5-15％、10-20％等。此相同原则适用于引用最小值或最大值的范围。此外，无论所述范围或特征的广度如何，均适用此类解释。
当与数值相连使用时，术语“约”意为涵盖处于一定范围内的数值，该范围具有比所指示的数值小5％的下限和比所指示的数值大5％的上限。
术语“测量(measurement)”、“测量(measuring)”或“确定”优选地包括定性、半定量或定量的测量。如本文所用，术语“确定”目标分析物的存在或水平可以是指目标分析物的定性或定量，例如是指确定或测量样品中目标分析物的水平(采用本文别处描述的适当检测方法)。
在此上下文中，“水平”或“水平值”涵盖绝对量、相对量或浓度，以及与其相关或可从其导出的任何值或参数。
如本文所用，术语“样品”或“患者样品”是指为了体外评估的目的获得的生物学样品。在本发明的方法中，样品或患者样品优选可以包括任何体液。样品可以包括血液、血清、血浆、尿液、唾液和滑液。优选的样品为全血液、血清或血浆。正如熟练的技术人员将理解，任何此类评定均是在体外进行的。之后丢弃患者样品。患者样品仅用于本发明的体外方法，并且不将患者样品的材料转移回患者身体中。
在本公开的上下文中，术语“分析物”、“分析物分子”或“目标分析物”可互换使用，其是指待经由质谱法分析的化学物质。适合经由质谱法分析的化学物质，即分析物，可以是活体生物体中存在的任何种类的分子，包括但不限于核酸(例如，DNA、mRNA、miRNA、rRNA等)、氨基酸、肽、蛋白质(例如，细胞表面受体、胞质蛋白等)、代谢物或激素(例如，睾酮、雌激素、雌二醇等)、脂肪酸、脂质、碳水化合物、类固醇、酮类固醇、开环甾类化合物(例如，维生素D)、以另一分子的某一修饰(例如，蛋白质上的糖部分或磷酰残基、基因组DNA上的甲基-残基)为特征的分子或已经由生物体内化的物质(例如，治疗性药物、滥用的药物、毒素等)或此类物质的代谢物。分析物的摩尔质量小于200Da(道尔顿)或200g/mol，优选地小于190g/mol或180g/mol或170g/mol或160g/mol或150g/mol。此外，分析物的摩尔质量大于100g/mol或110g/mol或120g/mol或130g/mol。优选地，分析物的摩尔质量介于130g/mol与150g/mol之间，优选地介于135g/mol与145g/mol之间。
术语目标分析物的“摩尔质量”是指给定化学元素或化合物的质量(g)除以物质的量(mol)。化合物的摩尔质量可以通过添加组成原子的标准原子质量(以g/mol为单位)来计算。摩尔质量的单位可以为kg/mole、g/mol或Da。以g/mol为单位的摩尔质量在数值上大约等于以道尔顿为单位的一个分子的质量(1Da＝1u＝1.66053906660(50)×10-27kg)。
在本发明的上下文中，术语“活化试剂”是指化合物或化合物的混合物，羧酸由其活化，从而使目标分析物的羰基基团易受亲核攻击。
在本发明的上下文中，术语“亲核衍生化试剂”或“衍生化试剂”是指具有具体化学结构的化学物质。所述衍生化试剂可以包含一个或多个反应性基团，该一个或多个反应性基团能够与目标分析物形成键，优选地共价键。产生衍生化的目标分析物。每个反应性基团可以履行不同的功能性，或者两个或更多个反应性基团可履行相同功能。反应性基团包括但不限于反应性单元、带电荷的单元和中性丢失单元。在本发明的上下文中，术语“亲核的”是指提供电子对以形成化学键的化学物质。在水介质中存在的亲核体包括但不限于–NH2、-OH、-SH、-Se、(R’、R”、R”’)P、N3-、RCOOH、F-、Cl-、Br-、I-。术语“亲核衍生化试剂”可以是指包含此类亲核体的试剂。亲核衍生化试剂包含携带轨道的部分，该轨道充当最高占据分子轨道(HOMO)，该最高占据分子轨道能够攻击目标物质(例如，目标分析物)的最低未占分子轨道(LUMO)，从而形成由以前的亲核单元和分析物部分组成的新分子。
术语“衍生化的目标分析物”可以是指由原始目标分析物形成并且通过化学反应扩大的任何分子。
术语“目标分析物包含羧酸基团”意指目标分析物具有羧酸基团作为官能团。官能团可以与亲核衍生化试剂反应，优选地与亲核衍生化试剂的反应性基团反应。羧基基团和羧酸基团可以在本发明的内容中互换使用。
术语“自动化的”是指主要由自动化设备操作的方法或过程，即由机器或计算机操作的方法或过程，以便减少人工完成的工作量和完成工作所花费的时间。因此，在自动化的方法中，以前由人类执行的任务现在由机器或计算机执行。通常，用户只需要配置工具和定义流程。本领域技术人员清楚地知道，在一些次要点上可能仍需要人工干预，但是该方法的很大程度上是自动执行的。
术语“与衍生化的目标分析物相比，目标分析物在质谱中未示出特征性的裂解模式”意指目标分析物(即，完整分子)不会由于稳定的分子键而发生任何裂解。通过衍生化来扩大分子质量，从而形成衍生化的目标分析物，分子变得更易于裂解，这可能导致特征性的裂解模式。
术语“质谱法”(“Mass Spec”或“MS”)或“质谱分析(mass spectrometricanalysis)”涉及通过化合物的质量用于鉴别化合物的分析技术。MS是基于离子的质荷比或“m/z”对离子进行过滤、检测和测量的方法。MS技术通常包括(1)将化合物离子化以形成带电荷的化合物；以及(2)检测该带电荷的化合物的分子量并计算质荷比。化合物可通过任何合适的手段来离子化并检测。“质谱仪”通常包括离子源和离子检测器。通常，将一个或多个目标分子离子化，后续将离子引入质谱仪器中，在该仪器中，由于磁场和电场的组合，离子遵循取决于质量(“m”)和电荷(“z”)的空间路径。术语“离子化”或“电离”是指生成具有等于一个或多个单位的净电荷的分析物离子的过程。负离子是那些具有一个或多个单位的净负电荷的离子，而正电荷是那些具有一个或多个单位的净正电荷的离子。MS方法既可以在其中生成并检测负离子的“负离子模式”下执行，也可以在其中生成并检测正离子的“正离子模式”下执行。“在经由质谱测定的裂解后”可能意味着，例如化合物、组合物或复合物通过质谱仪并裂解。
“串联质谱法”或“MS/MS”包括多个质谱法选择步骤，其中分析物的裂解在各级之间发生。在串联质谱法中，离子在离子源中形成，并且在质谱法的第一级(MS1)中按质荷比将其分离。选择特定质荷比的离子(前体离子或母离子)，并通过碰撞诱导解离、离子-分子反应或光解离产生碎片离子(或子离子)。然后，在质谱法(MS2)的第二级中分离并检测所得离子。
由于质谱仪分离并检测质量略有差异的离子，它容易区分给定元素的不同同位素。因此，质谱法是对包括但不限于低分子量分析物、肽、多肽或蛋白质的分析物进行精确质量测定和表征的重要方法。其应用包括蛋白质及其翻译后修饰的鉴别；蛋白质复合物、其亚基和功能性相互作用的阐明；以及蛋白质组学中蛋白质的全局测量。通常无需事先了解氨基酸序列，即可通过质谱法对肽或蛋白质执行从头测序。
MS中的大多数样品工作流程进一步包括样品制备和/或富集步骤，其中例如使用例如气相色谱法或液相色谱法将一种或多种目标分析物从基质中分离出来。通常，针对质谱测量执行以下三个步骤：
1.将包含目标分析物的样品离子化，一般通过与阳离子形成复合物来进行，经常通过质子化生成阳离子。离子化源包括但不限于电喷雾离子化(ESI)和大气压化学离子化(APCI)。
2.根据离子的质量和电荷对离子进行分选和分离。可使用高场非对称波形离子迁移谱(FAIMS)作为离子过滤器。
3.然后，例如以多反应模式(MRM)检测所分离的离子，并将结果展示在图表上。
术语“电喷雾离子化”或“ESI”是指如下方法：在该方法中，溶液沿着短毛细管行进至被施加高正电位或高负电位的末端。到达该管末端的溶液被蒸发(雾化)成在溶剂蒸汽中存在非常小的溶液液滴的喷射或喷雾。此液滴雾流经蒸发室，将该蒸发室略微加热以防止冷凝并且蒸发溶剂。随着液滴变得更小，表面电荷密度增加，直到同类电荷之间的天然斥力造成离子以及中性分子得以释放。
术语“大气压化学离子化”或“APCI”是指与ESI类似的质谱法方法，然而APCI通过在大气压力下于等离子体内发生的离子-分子反应来产生离子。通过喷雾毛细管与对电极之间的放电来维持等离子体。然后，通常使用一组差分泵分级分离器将离子提取至质量分析仪中。可使用干燥且预热的Ni气体逆流以改善溶剂的移除。对于分析极性较低的实体，APCI中的气相离子化可能比ESI更有效。
“高场非对称波形离子迁移谱(FAIMS)”是一种大气压离子迁移技术，其通过气相离子在强电场和弱电场中的行为来分离气相离子。
“多反应模式”或“MRM”是MS仪器的一种检测模式，在该模式下，选择性地检测前体离子和一种或多种碎片离子。
质谱测定可与另外的分析方法联用，包括色谱方法诸如气相色谱(GC)、液相色谱(LC)特别是HPLC和/或基于离子迁移的分离技术。
在本公开的上下文中，样品可以来源于“个体”或“受试者”。通常，受试者为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。
在经由质谱法进行分析之前，可按照特定于样品和/或分析物的方式对样品进行处理货预处理。在本公开的上下文中，术语“处理”或“预处理”是指允许经由质谱法对所期望的分析物进行后续分析所需的任何措施。(预)处理措施通常包括但不限于，洗脱固体样品(例如，洗脱干血斑)、将溶血试剂(HR)添加到全血液样品中、以及将酶试剂添加到尿液样品中。添加内部标准(ISTD)也被视为样品的预处理。
术语“溶血剂(HR)”是指裂解样品中存在的细胞的试剂，在本发明的上下文中，溶血剂特别是指裂解血液样品中存在的细胞(包括但不限于，全血液样品中存在的红细胞)的试剂。众所周知的溶血试剂是水(H2O)。溶血试剂的其他实例包括但不限于去离子水、高渗透性液体(例如，8M尿素)、离子液体和不同的清洗剂。
通常地，“内标”(ISTD)是已知量的物质，当经历质谱检测工作流程(即，包括任何(预)处理、富集和实际检测步骤)时，其表现出与目标分析物类似的特性。尽管ISTD表现出与目标分析物类似的特性，它仍可明显地与目标分析物区分开来。举例而言，在色谱分离诸如气相色谱和液相色谱过程中，ISTD具有大致与来自样品中的目标分析物相同的保留时间。因此，分析物和ISTD两者均同时进入质谱仪中。然而，ISTD表现出与来自样品的目标分析物不同的分子质量。这使得在来自ISTD的离子与来自分析物的离子之间能够通过其不同的质荷(m/z)比进行质谱区分。两者均经历裂解并提供子离子。这些子离子可通过其m/z比而彼此区分并与各自的母离子区分。因此，可对来自ISTD和分析物的信号执行独立确定和定量。由于ISTD的添加的量是已知的，因此来自样品的分析物的信号强度可归因于该分析物的具体定量性的量。因此，添加ISTD允许对所检测的分析物的量进行相对比较，并且当分析物到达质谱仪时，能够对样品中存在的目标分析物进行明确鉴定和定量。通常但不一定，ISTD是目标分析物的同位素标记的变体(包含例如2H、13C或15N等标记)。
除预处理以外，样品还可经过一个或多个富集步骤处理。在本公开的上下文中，术语“第一富集过程”或“第一富集工作流程”是指在样品的(预)处理之后发生的富集过程，并且提供包含相对于初始样品富集的分析物的样品。第一富集工作流程可包括化学沉淀(例如，使用乙腈)或使用固相。合适的固相包括但不限于固相萃取(SPE)盒和珠粒。珠粒可以是非磁性的、磁性的、顺磁性的或超磁性的。珠粒可以经差异性包被以具有对于目标分析物的特异性。依据预期的用途，即依据预期的捕获分子，涂层可以不同。哪种涂层适用于哪种分析物是技术人员众所周知的。珠可以由各种不同材料制成。珠可具有各种尺寸并且包含具有或不具有孔的表面。
在本公开的上下文中，术语“第二富集过程”或“第二富集工作流程”是指发生在样品(预)处理和第一富集过程之后的富集过程，其提供相对于初始样品和经过第一富集过程处理的样品包含富集的分析物的样品。
术语“色谱”是指一种过程，在该过程中，随着由液体或气体携带的化学混合物在液体或固体固定相周围或上方流动，作为化学实体的差异性分布的结果，该化学混合物被分离为多种组分。
术语“液相色谱法”或“LC”是指当流体均匀地渗透通过细碎物质的柱或通过毛细管通道时，选择性阻滞流体溶液中的一种或多种组分的过程。随着此流体相对于固定相移动，混合物组分在一种或多种固定相与体相流体(即，流动相)之间的分布导致该滞后。固定相的极性高于流动相(例如，甲苯作为流动相，二氧化硅作为固定相)的方法称为正相液相色谱(NPLC)，而固定相的极性小于流动相(例如，水-甲醇混合物作为流动相，而C18(十八烷基硅烷基)作为固定相)的方法称为反相液相色谱(RPLC)。
“高效液相色谱”或“HPLC”是指一种液相色谱方法，在该方法中，通过迫使流动相在压力下经过固定相，通常为密集填充柱，从而增加分离程度。通常地，使用由不规则形状或球形的颗粒、多孔整体层或多孔膜构成的固定相来填充柱。基于流动相和固定相的极性，HPLC历来分为两个不同的子类。固定相的极性高于流动相(例如，甲苯作为流动相，二氧化硅作为固定相)的方法称为正相液相色谱(NPLC)，反之(例如，水-甲醇混合物作为流动相，而C18(十八烷基硅烷基)作为固定相)则称为反相液相色谱(RPLC)。微流LC是指使用具有窄的内柱直径(通常低于1mm，例如约0.5mm)的柱的HPLC方法。“超高效液相色谱”或“UHPLC”是指使用120MPa(17,405lbf/in2)或约1200大气压的HPLC方法。快速LC是指使用具有如上所述的内径且长度短(<2cm，例如1cm)的柱的LC方法，其采用如上所述的流速并使用如上所述的压力(微流LC、UHPLC)。短快速LC方案包括使用单个分析柱的捕捉/洗涤/洗脱步骤，并在<1min的极短时间内实现LC。
其他众所周知的LC模式包括亲水作用色谱(HILIC)、体积排阻LC、离子交换LC和亲和LC。
LC分离可为单通道LC或包括多个平行布置的LC通道的多通道LC。在LC中，可根据分析物的极性或log P值、尺寸或亲和力来分离该分析物，如技术人员通常所知。
术语“采样管”或“样品收集管”是指具有适合于接收样品(例如，待收集的血液样品)的贮存器的任何装置。
实施例
在第一方面，本发明涉及一种用于确定样品中摩尔质量小于200Da的目标分析物的存在或水平的方法，该方法包括以下步骤
a)提供包含目标分析物的样品，其中目标分析物包含羧酸基团，
b)任选地通过添加至少一种活化试剂来活化目标分析物，
c)用用于形成衍生化的目标分析物的亲核衍生化试剂，将由步骤a)
或b)提供的目标分析物衍生化，以及
d)使用免疫学测定法或质谱法(MS)来确定样品中衍生化的目标分析物的存在或水平。
在本发明的第一方面的实施例中，该方法为自动化的。在特定实施例中，该方法由自动化系统执行。在特定实施例中，该方法不包括人工干预。
根据步骤(a)，提供了包含目标分析物的样品。目标分析物包含羧酸基团。优选地，目标分析物为羧酸。
在本发明的第一方面的实施例中，目标分析物包含羧酸基团并且不包含能够与目标分析物的羧酸基团反应的反应性基团。反应性基团可以为胺，例如伯胺。
在本发明的第一方面的实施例中，目标分析物包含羧酸基团并且不包含能够进行目标分析物的分子内反应的反应性基团。
在本发明的第一方面的实施例中，目标分析物不含亲核官能团，该亲核官能团可以与目标分析物的羧酸基团反应。
在本发明的第一方面的实施例中，目标分析物为丙戊酸或水杨酸。
在本发明的第一方面的实施例中，目标分析物不含普瑞巴林或目标分析物不是普瑞巴林。
在本发明的第一方面的实施例中，目标分析物的摩尔质量为150Da或更小。
在本发明的第一方面的实施例中，目标分析物的摩尔质量小于200Da(道尔顿)或200g/mol，优选地小于190g/mol或180g/mol或170g/mol或160g/mol或150g/mol。此外，分析物的摩尔质量大于100g/mol或110g/mol或120g/mol或130g/mol。优选地，分析物的摩尔质量介于130g/mol与150g/mol之间，优选地介于135g/mol与145g/mol之间。
任选地可以执行步骤(b)，即通过添加至少一种活化试剂来活化目标分析物。活化试剂可以为至少一种活化试剂或活化试剂的混合物。
在本发明的第一方面的实施例中，该至少一种活化试剂为第一活化试剂或第二活化试剂或它们的组合，
其中第一活化试剂选自由以下项组成的组：N-羟基琥珀酰亚胺(OHSu)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-OSu)、羟基苯并三唑(HOBt)和这些化合物的盐，
其中第二活化试剂选自由以下项组成的组：二环己基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺、N,N'-二环己基碳二亚胺、N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基-对甲苯磺酸盐、1,3-双(三甲基甲硅烷基)碳二亚胺和N,N'-甲烷四基双[4-甲基]苯胺。
原则上，可以使用每种合适的活化试剂，其在肽化学中用于形成酰胺键。
在本发明的第一方面的实施例中，在步骤(b)中形成目标分析物的酯。
根据步骤(c)，用用于形成衍生化的目标分析物的亲核衍生化试剂，将由步骤a)或b)提供的目标分析物衍生化。
在本发明的第一方面的实施例中，在步骤c)中形成衍生化的目标分析物的酰胺。
在本发明的第一方面的实施例中，在步骤c)之后提供的衍生化的目标分析物的摩尔质量大于在步骤c)之前提供的目标分析物的摩尔质量。
在本发明的第一方面的实施例中，与衍生化的目标分析物相比，目标分析物在质谱中未示出特征性的裂解模式。由于目标分析物具有小分子质量和稳定的分子键，因此可以在碰撞池内实现低裂解至无裂解。通过衍生化来扩大分子质量，衍生化的分子变得更易于裂解，从而导致特征性的裂解模式。
在本发明的第一方面的实施例中，亲核衍生化试剂包含胺基团，特别是伯胺基团或仲胺基团或叔胺基团，更特别是仲胺基团，更特别是伯胺基团。
在本发明的第一方面的实施例中，亲核衍生化试剂包含1个C-原子，特别是3个至20个C-原子，特别是3个至10个C-原子，特别是3个至5个C-原子，特别是4个C-原子。
在本发明的第一方面的实施例中，亲核衍生化试剂选自由以下项组成的组：甲胺、乙胺、丁胺、正丙胺、异丙胺、戊胺、己胺
在实施例中，亲核衍生化试剂包含胺基团，特别是伯胺或仲胺，特别是包含伯胺基团。在实施例中，亲核衍生化试剂包含超过3个C-原子，特别是3个至20个C-原子，特别是3个至10个C-原子，特别是3个至5个C-原子，特别是4个C-原子。在实施例中，亲核衍生化试剂为直链或支链的，特别是具有直链胺，特别是具有直链伯胺，特别是具有包含3个至5个C-原子的直链伯胺。在实施例中，亲核衍生化试剂选自由以下项组成的组：丙胺、丁胺或戊胺，特别是伯直链丁胺或伯直链戊胺。
在实施例中，亲核衍生化试剂在其化学部分中的至少一个化学部分中将抗生素分析物衍生化。化学领域的技术人员清楚地知道适于被衍生化的化学部分，特别是用亲核衍生化试剂。
在本发明的第一方面的实施例中，亲核衍生化试剂选自由以下项组成的组：丙胺、丁胺，特别是伯直链丁胺。
在本发明的第一方面的实施例中，亲核衍生化试剂为直链或支链的亲核衍生化试剂，特别是直链胺，特别是直链伯胺，特别是包含3个至5个C-原子的直链伯胺。
在本发明的第一方面的实施例中，所述方法包括额外的步骤：
e)富集样品，特别是使用磁珠。
在本发明的第一方面的实施例中，富集步骤e)包括使用磁珠，特别是A型或B型磁珠。
在本发明的第一方面的实施例中，富集步骤e)包括至少一个富集工作流程。
在本发明的第一方面的实施例中，富集步骤a)包括两个富集步骤，特别是包括使用磁珠的第一富集步骤和使用蒸发的第二富集步骤。
样品可以进一步经历至少一个富集工作流程。富集工作流程可以包括一种或多种富集方法。富集方法在本领域中众所周知，包括但不限于化学富集方法(包括但不限于化学沉淀)和使用固相的富集方法(包括但不限于固相萃取方法、珠粒工作流程和色谱方法(例如气相色谱法或液相色谱法))。哪种富集方法适用于哪种目标分析物也是技术人员众所周知的。
在本发明的第一方面的实施例中，第一富集工作流程包括向样品添加固相，特别是携带分析物选择性基团的固相珠粒。在实施例中，第一富集工作流程包括向经过预处理的样品添加携带分析物选择性基团的磁珠或顺磁珠。
在本发明的第一方面的实施例中，磁珠包括涂覆有苯乙烯基聚合物的磁芯，该聚合物经由Friedel-Crafts烷基化来进行超交联并且通过添加–OH基团来进一步改性。
在本发明的第一方面的实施例中，磁珠，优选地B型磁珠，包括涂覆有苯乙烯基聚合物的磁芯，该聚合物经由二胺(例如TMEDA)来进行超交联并且进一步改性，从而二胺也充当侧链(即，在这些类型的珠粒中，TMEDA提供季胺功能和叔胺功能两者)。有关此类珠粒的完整描述，参见例如WO 2019/141779 A1。
在本发明的第一方面的实施例中，磁珠的添加包括搅拌或混合。然后经过预定义的孵育期，将一种或多种目标分析物捕获到珠粒上。在实施例中，工作流程包括在与磁珠孵育之后的洗涤步骤(W1)。根据一种或多种分析物，执行一个或多个额外的洗涤步骤(W2)。一个洗涤步骤(W1、W2)包括一系列包括以下项的步骤：通过包含磁体或电磁体的磁珠处置单元来分离磁珠、抽吸液体、添加洗涤缓冲液、将磁珠重新悬浮、另一个磁珠分离步骤和另一次抽吸液体。此外，除了洗涤循环的体积和次数或组合之外，洗涤步骤可以在溶剂类型(水/有机物/盐/pH)层面上有所不同。如何选择相应参数是技术人员众所周知的。在最后一个洗涤步骤(W1、W2)之后，添加洗脱试剂，之后将磁珠重新悬浮，并经历预定义孵育期，以用于从磁珠释放目标分析物。然后分离无结合物的磁珠，并捕获含有经过衍生化的目标分析物的上清液。
在本发明的第一方面的实施例中，第一富集工作流程包括向经过预处理的样品添加携带基质选择性基团的磁珠。在实施例中，磁珠的添加包括搅拌或混合。之后是用于将基质捕获在珠粒上的预定义孵育期。此时，目标分析物并未与磁珠结合，而是保留在上清液中。之后，分离磁珠，并收集含有经过富集的目标分析物的上清液。
在本发明的第一方面的实施例中，使上清液经历第二富集工作流程，特别是色谱富集工作流程。在本发明的实施例中，色谱分离为气相色谱法或液相色谱法。两种方法均是技术人员众所周知的。在实施例中，液相色谱法选自由以下项组成的组：HPLC、快速LC、微流-LC、流动注射以及捕集和洗脱。这里，将上清液转移至LC站，或在通过添加稀释液体进行的稀释步骤之后转移至LC站。还可通过改变例如溶剂的类型(水/有机物/盐/pH)和体积，使用不同的洗脱程序/试剂。各种参数是技术人员众所周知并且容易选择的。
在本发明的第一方面的实施例中，第一富集过程包括使用分析物选择性磁珠。在实施例中，第二富集过程包括使用色谱分离，特别是使用液相色谱法。在实施例中，使用分析物选择性磁珠的第一富集过程在使用液相色谱法的第二富集过程之前执行。
在本发明的第一方面的实施例中，富集步骤(e)在步骤(c)之后执行并且在步骤(d)之前执行。
在本发明的第一方面的实施例中，在步骤d)之前执行色谱步骤，特别是液相色谱法(LC)。
在本发明的第一方面的实施例中，色谱步骤和步骤d)组合或通过使用LC-MS来依次执行，其中LC为HPLC，特别是RP-HPLC，或者其中LC为快速LC。
在本发明的第一方面的实施例中，色谱步骤和步骤d)组合或通过使用LC-MS来依次执行，其中离子形成基于电喷雾离子化(ESI)，特别是正极性模式ESI。
在本发明的第一方面的实施例中，色谱步骤和步骤d)组合或通过使用LC-MS来依次执行，其中质谱法由质量装置来执行，其中质量装置为串联质谱仪，特别是三重四极杆装置，特别是自动化的、随机存取的LC-MS装置。
在本发明的第一方面的实施例中，步骤c)包括溶剂，特别是选自由以下项组成的组的溶剂：水、CH3CN、THF、二噁烷、DMF、DMSO、丙酮、叔丁醇、二甘醇二甲醚、DME、MeOH、EtOH、1-PrOH、2-PrOH、乙二醇、六甲基磷酰胺(HMPA)、六甲基亚磷酰三胺(HMPT)和甘油，特别是选自由以下项组成的组的溶剂：水、CH3CN、THF、二噁烷、DMF、DMSO、丙酮、tBuOH、二甘醇二甲醚和DME。
在本发明的第一方面的实施例中，步骤c)包括稳定且与水可混溶的非亲核碱，特别是选自由以下项组成的组：DBU、TEA、DIPEA、Na3PO4、Na2CO3和Cs2CO3。
在本发明的第一方面的实施例中，在步骤b)中，样品用活化试剂样品处理超过30秒，特别是超过1min，特别是超过2min。
在本发明的第一方面的实施例中，在步骤c)中，在获得样品之后，特别是在获得样品之后小于10min内，特别是在获得样品之后小于5min或3min内，立即用亲核衍生化试剂处理样品。
在本发明的第一方面的实施例中，在步骤c)中，样品用亲核衍生化试剂样品处理超过30秒，特别是超过1min，特别是超过2min。
根据步骤(d)，使用免疫学测定法或质谱法(MS)来确定样品中衍生化的目标分析物的存在或水平。
在本发明的第一方面的实施例中，步骤(d)包括使用免疫学方法来确定该一种或多种分析物的存在或水平，以下步骤被包括：
i)用特异性地结合该一种或多种衍生化的分析物的一种或多种抗体来孵育患者的(任选地经过富集的)样品，从而在抗体与该一种或多种衍生化的分析物之间生成复合物，以及
ii)对步骤i)中形成的复合物进行定量，由此对患者的样品中该一种或多种衍生化的分析物的量进行定量。
在特定实施例中，在步骤i)中，将样品与特异性地结合该一种或多种衍生化的分析物的两种抗体一起孵育。正如对本领域技术人员显而易见的，可以按任意所期望的顺序使样品接触第一抗体和第二抗体，即首先接触第一抗体，然后接触第二抗体；或首先接触第二抗体，然后接触第一抗体；或同时接触第一和第二抗体。在充分的时间和条件下接触，以形成第一抗体/衍生化的分析物/第二抗体复合物。如本领域技术人员将容易理解的，这仅仅是用于建立对于以下而言适当或充分的时间和条件的常规实验：在特异性抗体与衍生化的分析物之间形成复合物，或形成二级复合物或夹心复合物，其包含第一抗体、衍生化的分析物和第二抗体。
可以通过任何适当的方式来执行对抗体-分析物复合物的检测。本领域的技术人员充分熟悉所述方式/方法。在本发明的第一方面的实施例中，抗体被直接或间接地可检测地标记。在特定实施例中，抗体用发光染料，特别是化学发光染料或电化学发光染料来可检测地标记。
在本发明的第一方面的实施例中，步骤(d)包括使用质谱法来确定一种或多种衍生化的抗生素分析物的存在或水平，以下步骤被包括：
(i)使衍生化的分析物的离子进入质谱分析的第一级，从而根据其质荷(m/z)比来表征衍生化的分析物的母离子，
(ii)引起衍生化的分析物母离子的裂解，由此生成子离子，其中衍生化的分析物的子离子在其m/z比层面上不同于衍生化的分析物母离子，以及
(iii)使衍生化的分析物的子离子进入质谱分析的第二级，从而根据其m/z比来表征衍生化的分析物的子离子。
在实施例中，所测量的母离子和/或碎片离子为如表X中所示出的那些。
表X：丙戊酸酰胺化合物和水杨酸酰胺化合物的MRM转换：
在本发明的第一方面的实施例中，在步骤d)中，衍生化的目标分析物的存在或水平由LC-MS来确定，其中衍生化的丙戊酸丁酰胺(N-丁基-2-丙基戊酰胺)的母离子在正模式下以m/z值200.2±1测量，和/或衍生化的水杨酸丁酰胺(2-羟基-N-丁基苯甲酰胺)的母离子在负模式下以m/z值191.87±1测量。
在第二方面，本发明涉及一种适于执行本发明的第一方面的方法的分析系统。
对于本发明的第一方面提及的所有实施例都适用于本发明的第二方面，反之亦然。
在本发明的第二方面的实施例中，分析系统为质谱法系统，特别是LC-MS系统。
在本发明的第二方面的实施例中，分析系统为自动化的。在特定实施例中，分析系统不需要人工干预，即，系统的操作为完全自动化的。在特定实施例中，LC-MS系统为自动化的、随机存取的LC-MS系统。
在本发明的第二方面的实施例中，MS装置为串联质谱仪，特别是三重四极杆装置。在实施例中，LC为HPLC，特别是RP-HPLC，或快速LC。
在本发明的第二方面的实施例中，离子形成基于电喷雾离子化(ESI)或大气压化学离子化(APCI)，特别是正极性模式ESI。
在本发明的第二方面的实施例中，分析系统为临床诊断系统。
“临床诊断系统”是实验室自动化仪器，专用于分析用于体外诊断的样品。根据需要和/或根据期望的实验室工作流，临床诊断系统可具有不同的配置。通过将多个设备和/或模块耦接在一起，可获得附加配置。“模块”是具有专用功能的工作单元，通常比整个临床诊断系统更小。此功能可以是分析功能，但也可以是分析前功能或分析后功能，或者可以是分析前功能、分析功能或分析后功能中的任一个的辅助功能。特别地，模块可配置为与一个或多个其他模块协作以用于例如通过执行一个或多个分析前步骤和/或分析步骤和/或分析后步骤来执行样品处理工作流程的专用任务。特别地，临床诊断系统可以包括一个或多个分析设备，其被设计为执行针对某些类型的分析(例如，临床化学、免疫化学、凝血、血液学、液相色谱分离、质谱法等)而优化的相应工作流程。因此，临床诊断系统可以包括一个分析设备或者具有各自工作流程的任何这种分析设备的组合，其中分析前和/或分析后模块可以耦接到单独的分析设备或者由多个分析设备共享。在替代方案中，可通过集成在分析设备中的单元来执行分析前功能和/或分析后功能。临床诊断系统可包括功能单元，诸如用于吸移和/或泵送和/或混合样品和/或试剂和/或系统流体的液体处理单元，以及用于分类、存储、运输、识别、分离、检测的功能单元。临床诊断系统可以包括用于自动制备包含目标分析物的样品的样品制备站、任选地包括多个LC通道的液相色谱(LC)分离站和/或任选地用于将制备的样品输入到LC通道中任何一个通道中的样品制备/LC接口。临床诊断系统还可以包括控制器，其被编程为将样品分配至预先定义的样品制备工作流程，每个工作流程包括预先定义的样品制备步骤序列且需要预先定义的完成时间(视目标分析物而定)。临床诊断系统可以进一步包括质谱仪(MS)和用于将LC分离站连接到质谱仪的LC/MS接口。如本文所用，术语“自动地”或“自动化”是广义的术语且被赋予对本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体地可指但不限于完全借助于至少一台计算机和/或至少一个计算机网络和/或至少一台机器来执行的过程，特别地，不需要手动操作和/或与用户交互。
在本发明的至少一个方面或所有方面的实施例中，临床诊断系统包括样品制备站。
“样品制备站”可耦接至一个或多个分析设备或分析设备中的单元的预分析模块，其设计为执行一系列样品处理步骤，这些样品处理步骤旨在除去或至少减少样品中的干扰基质成分和/或富集样品中的目标分析物。此类处理步骤可包括对一个样品或多个样品顺序地、并行地或交错地执行的以下处理操作中的任一项或多项：吸移(抽吸和/或分配)流体、泵送流体、与试剂混合、在一定温度下培育、加热或冷却、离心、分离、过滤、筛分、干燥、洗涤、重悬、等分、转移、储存等)。
临床诊断系统(例如样品制备站)还可以包括用于在启动新的样品制备开始序列之前接收多个样品的缓冲单元，其中可以单独随机访问样品，并且可以根据样品制备开始序列启动单独制备。
临床诊断系统使质谱法的使用更方便、更可靠，因此适用于临床诊断。特别地，在随机存取样品制备和LC分离情况下，可以获得高通量，例如高达100个样品/小时或更多，同时能够在线耦接到质谱法。此外，该过程可以完全自动化，增加了离开时间并降低了所需的技能水平。
本发明人意外发现，可以在全自动化装置，例如cobas i601分析仪(血清工作区溶液)中实施所述方法。这可以意指在通过LC-MS/MS进行的免疫珠粒捕获和检测之前存在软分析物释放步骤。
在第三方面，本发明涉及一种用于收集患者样品的采样管，该采样管包含用于在样品中形成衍生化的目标分析物的亲核衍生化试剂，其中该一种或多种目标分析物为摩尔质量小于200Da的羧酸，优选地其中该一种或多种目标分析物为丙戊酸或水杨酸。
对于本发明的第一方面和/或本发明的第二方面提及的所有实施例都适用于本发明的第三方面，反之亦然。
适合用于收集患者样品的采样管是本领域中众所周知的，并且被从业者常规使用。如本领域技术人员将理解的，采样管实际上优选地将为管。特别地，采样管具有适于匹配自动化分析仪(例如，Roche Diagnostics的分析仪)的样品接收站的要求的大小和尺寸。采样管可以具有圆锥形底部或优选地圆形底部。在临床常规中，使用与市场上的分析仪系统兼容的标准管大小。标准管和优选管例如具有以下尺寸：13x75 mm；13x100mm或16x100 mm。
在本发明的第三方面的实施例中，根据本发明的采样管仅使用一次，即，该采样管为一次性装置。在特定实施例中，根据本发明的采样管不仅适合于样品的收集，而且该采样管还适于允许对样品进行进一步处理。通过将样品收集至含有亲核衍生化试剂的采样管中，可以实现所期望的结果，即，抗生素分析物的衍生化。
在本发明的第三方面的实施例中，采样管包括具有适于接收待收集样品的贮存器的装置。样品可以为流体样品，诸如血液、血清、血浆、滑液、脊髓液、尿液、唾液和淋巴液；或固体样品，诸如干血斑和组织提取物。优选地，样品为血液样品。
在本发明的第三方面的实施例中，亲核衍生化试剂包含胺基团，特别是伯胺基团或仲胺基团，特别是伯胺基团。
在本发明的第三方面的实施例中，亲核衍生化试剂包含1个C-原子，特别是3个至20个C-原子，特别是3个至10个C-原子，特别是3个至5个C-原子，特别是4个C-原子。
在本发明的第三方面的实施例中，亲核衍生化试剂为直链或支链的胺，特别是直链胺，特别是直链伯胺，特别是包含3个至5个C-原子的直链伯胺。
在本发明的第三方面的实施例中，亲核衍生化试剂选自由以下项组成的组：丙胺、丁胺或戊胺，特别是伯直链丁胺。
在本发明的第三方面的实施例中，亲核衍生化试剂以液体或冻干形式被包含。
在本发明的第三方面的实施例中，亲核衍生化试剂进一步包含稳定且与水可混溶的非亲核碱，特别是选自由以下项组成的组：DBU、TEA、DIPEA、Na3PO4、Na2CO3和Cs2CO3。
在本发明的第三方面的实施例中，亲核衍生化试剂以液体形式体现在溶剂中，特别是选自由以下项组成的组的溶剂：水、CH3CN、THF、二噁烷、DMF、DMSO、丙酮、tBuOH、二甘醇二甲醚、DME、MeOH、EtOH、1-PrOH、2-PrOH、乙二醇、六甲基磷酰胺(HMPA)、六甲基亚磷酰三胺(HMPT)和甘油，特别是选自由以下项组成的组的溶剂：水、CH3CN、THF、二噁烷、DMF、DMSO、丙酮、tBuOH、二甘醇二甲醚和DME。
在第四方面，本发明涉及本发明的第三方面的采样管在根据本发明的第一方面的方法中的用途。对于本发明的第一方面和/或本发明的第二方面和/或本发明的第三方面提及的所有实施例都适用于本发明的第四方面，反之亦然。
在第五方面，本发明涉及亲核衍生化试剂在根据本发明的第一方面的方法中的用途。
对于本发明的第一方面和/或本发明的第二方面和/或本发明的第三方面和/或本发明的第四方面提及的所有实施例都适用于本发明的第五方面，反之亦然。
在第六方面，本发明涉及本发明的第一方面的方法用于确定样品中一种或多种目标分析物的存在或水平的用途。
针对本发明第一方面和/或本发明第二方面和/或本发明第三方面和/或本发明第四方面和/或本发明第五方面所提及的所有实施例均适用于本发明的第六方面，反之亦然。
在进一步的实施例中，本发明涉及以下方面：
1.一种用于确定样品中摩尔质量小于200Da的目标分析物的存在或水平的方法，该方法包括以下步骤
a)提供包含目标分析物的样品，其中目标分析物包含羧酸基团，
b)任选地通过添加至少一种活化试剂来活化目标分析物，
c)用用于形成衍生化的目标分析物的亲核衍生化试剂，将由步骤a)或b)提供的目标分析物衍生化，以及
d)使用免疫学测定法或质谱法(MS)来确定样品中衍生化的目标分析物的存在或水平。
2.根据方面1所述的方法，其中该方法为自动化的。
3.根据方面1或2所述的方法，其中目标分析物的摩尔质量为150
Da或更小。
4.根据前述方面中任一项所述的方法，其中目标分析物为丙戊酸或水杨酸。
5.根据前述方面中任一项所述的方法，其中目标分析物不是普瑞巴林或不含普瑞巴林。
6.根据前述方面中任一项所述的方法，其中在步骤c)中形成衍生化的目标分析物的酰胺。
7.根据前述方面中任一项所述的方法，其中在步骤c)之后提供的衍生化的目标分析物的摩尔质量大于在步骤c)之前提供的目标分析物的摩尔质量。
8.根据前述方面中任一项所述的方法，其中与衍生化的目标分析物相比，目标分析物在质谱中未示出特征性的裂解模式。
9.根据前述方面中任一项所述的方法，其中亲核衍生化试剂包含胺基团，特别是伯胺基团或仲胺基团或叔胺基团，更特别是仲胺基团，更特别是伯胺基团。
10.根据前述方面中任一项所述的方法，其中亲核衍生化试剂包含1个C-原子，特别是3个至20个C-原子，特别是3个至10个C-原子，特别是3个至5个C-原子，特别是4个C-原子。
11.根据前述方面中任一项所述的方法，其中亲核衍生化试剂为直链或支链的亲核衍生化试剂，特别是直链胺，特别是直链伯胺，特别是包含3个至5个C-原子的直链伯胺。
12.根据前述方面中任一项所述的方法，其中亲核衍生化试剂选自由以下项组成的组：丙胺、丁胺或戊胺，特别是伯直链丁胺。
13.根据前述方面中任一项所述的方法，其中该至少一种活化试剂为第一活化试剂或第二活化试剂或它们的组合，
其中第一活化试剂选自由以下项组成的组：N-羟基琥珀酰亚胺(OHSu)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-OSu)、羟基苯并三唑(HOBt)和这些化合物的盐，
其中第二活化试剂选自由以下项组成的组：二环己基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺、N,N'-二环己基碳二亚胺、N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基-对甲苯磺酸盐、1,3-双(三甲基甲硅烷基)碳二亚胺和N,N'-甲烷四基双[4-甲基]苯胺。
14.根据前述方面中任一项所述的方法，其中目标分析物不含亲核官能团，该亲核官能团可以与目标分析物的羧酸基团反应。
15.根据前述方面中任一项所述的方法，其中所述方法包括额外的步骤：
e)富集样品，特别是使用磁珠。
16.根据前述方面中任一项所述的方法，其中富集步骤e)包括使用磁珠，特别是A型或B型磁珠。
17.根据前述方面中任一项所述的方法，其中富集步骤e)包括至少一个富集工作流程。
18.根据前述方面中任一项所述的方法，其中富集步骤a)包括两个富集步骤，特别是包括使用磁珠的第一富集步骤和使用蒸发的第二富集步骤。
19.根据前述方面中任一项所述的方法，其中在步骤d)之前执行色谱步骤，特别是液相色谱法(LC)。
20.根据前述方面中任一项所述的方法，其中色谱步骤和步骤d)组合或通过使用LC-MS来依次执行，其中LC为HPLC，特别是RP-HPLC，或者其中LC为快速LC。
21.根据前述方面中任一项所述的方法，其中色谱步骤和步骤d)组合或通过使用LC-MS来依次执行，其中离子形成基于电喷雾离子化(ESI)，特别是正极性模式ESI。
22.根据前述方面中任一项所述的方法，其中色谱步骤和步骤d)组合或通过使用LC-MS来依次执行，其中质谱法由质量装置来执行，其中质量装置为串联质谱仪，特别是三重四极杆装置，特别是自动化的、随机存取的LC-MS装置。
23.根据前述方面中任一项所述的方法，其中在步骤d)中，衍生化的目标分析物的存在或水平由LC-MS来确定，其中衍生化的丙戊酸丁酰胺(N-丁基-2-丙基戊酰胺)的母离子在正模式下以m/z值200.2±1测量，和/或衍生化的水杨酸丁酰胺(2-羟基-N-丁基苯甲酰胺)的母离子在负模式下以m/z值191.87±1测量。
24.根据前述方面中任一项所述的方法，其中步骤c)包括溶剂，特别是选自由以下项组成的组的溶剂：水、乙腈(CH3CN)、四氢呋喃(THF)、二噁烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、丙酮、叔丁醇、二甘醇二甲醚、二甲醚(DME)、甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、1-丙醇(1-PrOH)、2-丙醇(2-PrOH)、乙二醇、六甲基磷酰胺(HMPA)、六甲基亚磷酰三胺(HMPT)和甘油，特别是选自由以下项组成的组的溶剂：水、CH3CN、THF、二噁烷、DMF、DMSO、丙酮、叔丁醇(tBuOH)、二甘醇二甲醚和DME。
25.根据前述方面中任一项所述的方法，其中步骤c)包括稳定且与水可混溶的非亲核碱，特别是选自由以下项组成的组：1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、三甲胺(TEA)、二异丙基乙胺(DIPEA)、Na3PO4、Na2CO3和Cs2CO3。
26.根据前述方面中任一项所述的方法，其中在步骤c)中，在获得样品之后，特别是在获得样品之后小于10min内，特别是在获得样
品之后小于5min或3min内，立即用亲核衍生化试剂处理样品。
27.根据前述方面中任一项所述的方法，其中在步骤c)中，样品用亲核衍生化试剂样品处理超过30秒，特别是超过1min，特别是超过2min。
28.一种适于执行根据方面1至27中任一项所述的方法的分析系统。
29.根据方面28所述的分析系统，其为LC-MS装置。
30.根据方面28或29所述的分析系统，其中分析系统为自动化的。
31.根据方面28或29或30所述的分析系统，其为临床诊断系统。
32.一种用于收集患者样品的采样管，该采样管包含用于在样品中形成衍生化的目标分析物的亲核衍生化试剂，其中该一种或多种目标分析物为摩尔质量小于200Da的羧酸，优选地其中该一种或多种目标分析物为丙戊酸或水杨酸。
33.根据方面32所述的采样管，该采样管包括具有适于接收待收集样品的贮存器的装置。
34.根据方面32或33所述的采样管，其中亲核衍生化试剂包含胺基团，特别是伯胺基团或仲胺基团，特别是伯胺基团。
35.根据方面32至34中任一项所述的采样管，其中亲核衍生化试剂包含1个C-原子，特别是3个至20个C-原子，特别是3个至10个C-原子，特别是3个至5个C-原子，特别是4个C-原子。
36.根据方面32至35中任一项所述的采样管，其中亲核衍生化试剂为直链或支链的胺，特别是直链胺，特别是直链伯胺，特别是包含3个至5个C-原子的直链伯胺。
37.根据方面32至36中任一项所述的采样管，其中亲核衍生化试剂选自由以下项组成的组：丙胺、丁胺或戊胺，特别是伯直链丁胺。
38.根据方面32至37中任一项所述的采样管，其中亲核衍生化试剂以液体或冻干形式被包含。
39.根据方面32至38中任一项所述的采样管，其中亲核衍生化试剂进一步包含稳定且与水可混溶的非亲核碱，特别是选自由以下项组成的组：DBU、TEA、DIPEA、Na3PO4、Na2CO3和Cs2CO3。
40.根据方面32至39中任一项所述的采样管，其中亲核衍生化试剂以液体形式体现在溶剂中，特别是选自由以下项组成的组的溶剂：水、CH3CN、THF、二噁烷、DMF、DMSO、丙酮、tBuOH、二甘醇二甲醚、DME、MeOH、EtOH、1-PrOH、2-
PrOH、乙二醇、六甲基磷酰胺(HMPA)、六甲基亚磷酰三胺(HMPT)和甘油，特别是选自由以下项组成的组的溶剂：水、CH3CN、THF、二噁烷、DMF、DMSO、丙酮、tBuOH、二甘醇二甲醚和DME。
41.根据方面32至40中任一项所述的采样管在根据前述方面1至27中任一项所述的方法中的用途。
42.亲核衍生化试剂在根据前述方面1至27中任一项所述的方法中的用途。
43.根据方面1至27中任一项所述的方法用于确定样品中一种或多种目标分析物的存在或水平的用途。
实例
提供以下实例来例示而非限制本文要求保护的发明。
实例1：通用方法
方案1示出了用于确定样品中摩尔质量小于200Da的目标分析物的存在或水平的方法。目标分析物可以为例如丙戊酸或水杨酸。目标分析物优选地为羧酸。在提供包含目标分析物的样品之后，可以任选地通过添加至少一种用于形成目标分析物的酯的活化试剂来将该目标分析物活化。然后，可以执行用于形成衍生化的目标分析物的衍生化步骤，例如通过使用任何伯胺(例如，伯烷基胺)进行酰胺化。然后，可以使用质谱法(例如，结合色谱步骤(例如，LC-MS))来确定样品中衍生化的目标分析物的存在或水平。残基X、Y和R独立地选自由以下项组成的组：氢、C1-C10-烷基、C1-C10-烯基、C5-C10-环烷基、C5-C12-芳基、C4-C10-杂芳基和–(-O-CH2-CH2-)n-O-CH3，其中n为1至15的范围内的整数，其中X、Y中的每一者均可以具有至少一个选自由以下项组成的组的其他取代基：氢、C1-C5-烷基、C5-C12-芳基、C4-C10-杂芳基。替代地，X和Y为氨基酸或肽或蛋白质的残基，从而X或Y为氨基酸、肽或蛋白质的N-或分别的C-末端基团。
方案1：目标分析物的一般反应
实例2：作为目标分析物的丙戊酸
方案2示出了用于确定(例如，在血清中)作为目标分析物的丙戊酸的存在或水平的方法。作为活化试剂，可以使用HO-琥珀酰亚胺(HO-Su)和碳二亚胺(例如，二异丙基碳二亚胺(DIC)或N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC))或它们的替代品。衍生化步骤可以为使用亲核衍生化试剂(例如，任何胺，优选地伯胺)来进行酰胺化。该反应可以在水环境下和许多其他物质的存在下执行。可以使用其他适用于亲核衍生化试剂和/或活化试剂的试剂。在下文中，本发明人展现的数据示出使用简单的烷基胺(如丁胺或丙胺)的该反应在血清中也起作用，该烷基胺形成比天然化合物大并且因此可以在MS/MS中适当地裂解的丙戊酸酰胺。在方案3中，对于作为亲核衍生化试剂的丁胺或丙胺的生成产物编号为3和4。
方案2：丙戊酸的O-Su活化，然后通过使用任何伯胺来进行酰胺化的一般反应
方案3：
/>
将加标血清和用丁胺或丙胺按1:10稀释的血清的每种组合执行重复5次，从而总共给出20个样品。接下来使用LC-MS/MS用如下方法测量所有样品，该方法含有用于丙戊酸-丁酰胺的3个多反应监测(MRM)转换和用于丙戊酸-丙酰胺的另外3个MRM转换。接下来，在ABSciex Multiquant软件中处理所有色谱图，从中获得S/N值。
酰胺化和纯化
将丙戊酸加标至血清中，至浓度为3μg/mL。将50μL该血清转移至反应容器中，并且添加活化混合物(HOSu和DIC，40μL的50mg/mL水溶液)。活化后，添加丙胺或丁胺(50μL的5M水溶液)以允许酰胺化。
随后，任选地添加磁珠(B型磁珠)，在其上捕获分析物。然后用水(150μL)洗涤两次，然后使用90％MeOH水溶液(50μL)来洗脱分析物。然后将洗脱液(25μL)转移至具有微型插入物的小瓶，并且添加水(25μL)。然后将其注射至LC-MS/MS中，以用于使用下文所述的方法来定量丙戊酸酰胺。
定量-LC-设置
使用Poroshel-Sb-Aq柱(50x2.1 mm)以及具有0.1％HCOOH的水作为流动相A和具有0.1％HCOOH的CH3CN作为流动相B，应用以下梯度(其中流速为0.5mL/min)(表1)：
表1：
时间(min) A(％) B(％)
0.0 98 2
5.00 5 95
5.30 5 95
5.50 98 2
7.50 98 2
定量-MS/MS设置
表2：
监测了丙戊酸-丁酰胺以及丙戊酸-丙酰胺的三种不同MRM转换(Q1和Q3质量)。此外，丙戊酸及其内标丙戊酸-d3的伪MRM被包括在MS方法中。每个转换均根据去簇电位(DP)、入口电位(EP)、碰撞能量(CE)和池出口电位(CXP)来进行单独调整。
色谱结果
在加标血清中用丁胺来进行酰胺化，以获得产物4，并且随后如上所述进行纯化和LC-MS/MS，在1.66分钟处获得峰，其中S/N值＞9000。图1中描绘了一个示例(血清中的丙戊酸-丁酰胺。S/N:9152)。
在加标血清和按1:10稀释的血清中用丁胺来进行酰胺化，以获得产物4，并且随后如上所述进行纯化和LC-MS/MS，我们在1.66分钟处获得峰，其中S/N值＞9300。图2中描绘了一个示例(按1:10稀释的血清中的丙戊酸-丁酰胺。S/N:9403)。考虑到该产物仅含有0.3μg/ml，则获得的S/N等于原始浓度为3μg/mL的未稀释样品。这示出预稀释对灵敏度有积极影响。
在加标血清中用丙胺来进行酰胺化，以获得产物3，并且随后如上所述进行纯化和LC-MS/MS，我们在1.35分钟处获得峰，其中S/N值＞12000(图3，按1:10稀释的血清中的丙戊酸-丙酰胺。S/N:12016)。图4示出，酰胺化在稀释和未稀释的血清中同样有效，并且对S/N的影响最小(图4：血清中的丙戊酸-丙酰胺S/N:16991)。
经由伪MRM测量的两个校准品的示例(在定量限(LOQ)处，图5，和在测量间隔上限(ULMI)处，图6)，相对于酰胺化产物的MRM转换，示出了低S/N值。
图5示出了使用富集工作流程从血清中提取的Cal 3(12μg/mL)，其检测伪MRM143.1/143.1。S/N:710.5
图6.用衍生化然后用富集工作流程从血清中提取的Cal 3(12μg/mL)，其检测MRM200.1/116。S/N:2837.5
使用3条MRM迹线以对所获得的丙戊酸-丁酰胺进行定量，并且使用另外3条MRM迹线以对丙戊酸-丙酰胺进行定量，峰积分示出高信噪比(S/N)值，该高信噪比值对于MRM转换为惯常的。与从伪MRM方法获得的当前S/N值相比，此处呈现的S/N值要高得多。
表3：对于所有3条MRM迹线的丙戊酸-丁酰胺的S/N值。
预稀释1:10 MRM迹线 信噪比(平均值)
否 Valp-丁酰胺-pos1 8528
否 Valp-丁酰胺-pos2 50481
否 Valp-丁酰胺-pos3 8709
是 Valp-丁酰胺-pos1 10664
是 Valp-丁酰胺-pos2 55288
是 Valp-丁酰胺-pos3 11382
表4：对于所有3条MRM迹线的丙戊酸-丙酰胺的S/N值。
预稀释1:10 MRM迹线 信噪比(平均值)
否 Valp-丙酰胺-pos1 20044
否 Valp-丙酰胺-pos2 22783
否 Valp-丙酰胺-pos3 9911
是 Valp-丙酰胺-pos1 13896
是 Valp-丙酰胺-pos2 15236
是 Valp-丙酰胺-pos3 7442
所得产物3和4可以在血清中在自动化工作流程中容易地生成，它们为较大的分子，可以在MS分析仪中裂解，生成特异性或特征性的碎片，因此能够更灵敏并且对丙戊酸进行特异性定量，如以高S/N值为例。未观察到残留的天然物质(即，未反应的丙戊酸)，这示出该反应在动力学上非常有效。
此外，可以添加同位素标记的内标，以便校正任何不完全反应。
反应速度和反应是否完成并不重要，因为这对于分析物和内标来说将是相同的。考虑到该化合物的测量范围的高浓度，将有足够的材料发生反应以允许准确定量。
对于获得高S/N值和高峰值强度，特别是与从具有伪MRM转换的方法获得的结果相比，样品的预稀释不是强制性的。优选地，用水进行预稀释对灵敏度具有积极影响。
所获得的结果示出，使用衍生化，可以使用MS(优选地MRM转换)来测量丙戊酸，从而获得高S/N值。这允许对该抗癫痫药物进行更灵敏且精确的定量。
实例3：衍生化方法对比标准方法之间的精密度和准确度比较。
血清加标有丙戊酸并且用相同的血清来进一步稀释，以获得6个校准水平(参见下表)。此外，通过加标与用于制备校准品的血清样品不同的血清样品来制备质量控制样品。该QC样品的浓度为11.2μg/mL。
接下来，所有校准和QC样品均用标准富集工作流程并且用衍生化工作流程一式三份进行处理。
标准富集工作流程如下执行：向50μL样品添加20μL甲酸溶液(100mM)。将A型磁珠(40μL的50mg/mL悬浮液)添加至该溶液。孵育之后，用150μL水将珠粒洗涤两次。随后，使用50μL的MeOH(90％)、水(10％)的混合物来将分析物从珠粒上洗脱下来。
衍生化工作流程如下执行：将N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐和N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐的混合物(50μL的5a混合物，其含有50mg/mL在水中稀释的每种化合物)添加至50μL样品。孵育之后，添加丁胺(50μL的5M水溶液)。在短暂的反应期之后，添加B型磁珠(40μL的50mg/mL悬浮液)。孵育之后，用150μL水将珠粒洗涤两次。随后，使用50μL的MeOH(90％)、水(10％)的混合物来将分析物从珠粒上洗脱下来。随后，将该洗脱液(30μL)用水(30μL)稀释。
表5：校准品浓度
校准品 浓度(μg/mL)
CAL1 1
CAL2 2
CAL3 12
CAL4 60
CAL5 120
CAL6 144
在这些样品制备之后，经由LC-MS/MS来测量所获得的样品。在Agilent InfinityII自动进样器-泵系统上，使用Poroshel-Sb-Aq柱(50x2.1 mm)以及具有0.1％HCOOH的水作为流动相A和具有0.1％HCOOH的CH3CN作为流动相B，应用以下梯度(表6)：
表6：梯度
对于MS/MS测量和一起使用的AB-Sciex 6500+系统，使用了以下MS设置(表7)：
表7：
测量后，使用Multiquant 3.03版来处理数据。对于这两种方法的数据，均使用了线性校准，从中获得了质量控制样品的计算浓度。从这些中，计算了精密度和准确度。
在表8中可以看出，衍生化方法比使用伪MRM的方法产生更好的精密度和准确度。由此可以得出结论，此处提出的方法为对现有技术的实质性改善。
表8：
该专利申请请求欧洲专利申请20206044.8的优先权，其中该欧洲专利申请的内容通过引用并入本文。

Claims (15)

1.一种用于确定样品中摩尔质量小于200Da的目标分析物的存在或水平的方法，所述方法包括以下步骤
a)提供包含所述目标分析物的所述样品，其中所述目标分析物包含羧酸基团，
b)任选地通过添加至少一种活化试剂来活化所述目标分析物，
c)用用于形成衍生化的目标分析物的亲核衍生化试剂，将由步骤a)或b)提供的所述目标分析物衍生化，以及
d)使用免疫学测定法或质谱法(MS)来确定所述样品中衍生化的目标分析物的存在或水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法为自动化的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述目标分析物的摩尔质量为150Da或更小。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述目标分析物为丙戊酸或水杨酸。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤c)中形成所述衍生化的目标分析物的酰胺。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述亲核衍生化试剂包含胺基团，特别是伯胺基团或仲胺基团或叔胺基团，更特别是仲胺基团，更特别是伯胺基团。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述亲核衍生化试剂选自由以下项组成的组：丙胺、丁胺或戊胺，特别是伯直链丁胺。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种活化试剂为第一活化试剂或第二活化试剂或它们的组合，
其中所述第一活化试剂选自由以下项组成的组：N-羟基琥珀酰亚胺(OHSu)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-OSu)、羟基苯并三唑(HOBt)和这些化合物的盐，
其中所述第二活化试剂选自由以下项组成的组：二环己基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺、N,N'-二环己基碳二亚胺、N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基-对甲苯磺酸盐、1,3-双(三甲基甲硅烷基)碳二亚胺和N,N'-甲烷四基双[4-甲基]苯胺。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述目标分析物不含亲核官能团，所述亲核官能团可以与所述目标分析物的所述羧酸基团反应。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括额外的步骤：
e)富集所述样品，特别是使用磁珠。
11.一种适于执行根据权利要求1至10中任一项所述的方法的分析系统。
12.一种用于收集患者样品的采样管，所述采样管包含用于在样品中形成衍生化的目标分析物的亲核衍生化试剂，其中一种或多种目标分析物为摩尔质量小于200Da的羧酸，优选地其中所述一种或多种目标分析物为丙戊酸或水杨酸。
13.根据权利要求12所述的采样管在根据前述权利要求1至10中任一项所述的方法中的用途。
14.亲核衍生化试剂在根据前述权利要求1至10中任一项所述的方法中的用途。
15.根据权利要求1至10中任一项所述的方法用于确定样品中一种或多种目标分析物的存在或水平的用途。
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