CN1164613C - 简便分离血清高密度脂蛋白及其亚组分试剂盒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
简便分离血清高密度脂蛋白及其亚组分试剂盒的制备方法是将＜10℃的甲酰胺溶液放入冰水中搅拌，滴入氯磺酸溶液逐升温至50-52℃加分子量为25000氢化右旋糖酐控温搅拌至达到取样测定反应物粘度后，冷却至30℃再先后加98%乙醇沉淀两次，加蒸馏水调pH值搅拌，经阳离子交换树脂柱过滤，调pH沉淀得右旋糖酐硫酸酯，此物再分别与氯化镁，0.5M Tris-HCL缓冲剂组成高密度脂蛋白及其亚组分的沉淀剂I、II的试剂盒，为冠心病与脂蛋白研究提供一种快速可靠的新方法。
Description
本发明涉及一种有机高分子化合物的其它多糖类及其衍生物，尤其涉及一种葡聚糖及其衍生物试剂盒的制备方法。
冠心病是一种危害人类健康的严重疾病。过去认为其发病原因与血中胆固醇含量增高有关，但近来的研究表明，胆固醇有好坏之分好的胆固醇存在于一种叫高密度脂蛋白(即HDL)之中。其胆固醇含量增高不仅不会引起冠心病，相反，具有抗动脉粥样硬化作用。因此，测定血中HDL胆固醇含量具有重要的临床意义。
进一步的研究还发现HDL并不是均一的物质，它尚可分为HDL2和HDL3两种主要的亚组分。其中HDL2亚组分最受重视。据认为上述HDL的抗动脉粥样硬化作用是通过它而实现的，因为它能将沉积于动脉壁中的胆固醇运转到肝脏去进行分解代谢，人体动脉造影显示动脉粥样硬化的严重度与血中HDL2胆固醇含量呈显著的负相关。流行病学资料表明，人群中血清HDL2胆固醇含量增高者，冠心现发病率明显降低。临床研究也证实寇心病人组血中HDL2胆固醇含量显著低于健康对照组。以上事实提示，若能在测定HDL胆固醇同时，测定其亚组分胆固醇含量，则意义更为重大。
正因如此，近年来在分离HDL亚组分的技术方面有了很快的发展。虽然超速离心、层析和电泳方法比较精确，但设备昂贵，操作繁复费时，而沉淀方法，尤其是Warnick所发展的硫酸葡聚糖——镁离子二步沉淀法是同时分离HDL及其亚组分的最为可靠的方法，其结果与超速离心法相一致。
遗憾的是，这种方法所需的试剂制作方法复杂，材料费用较高，因此，我们拟对此课题进行新的研究。
发明的目的在于：利用新的原料和新的合成方法，研制一种具有与国外同类产品相同性质和功能的硫酸右旋扩酐酯，并以此作为主要成分进一步与其他物质以科学配比，组合成为两种特殊的沉淀剂。其中沉淀剂I用于分离血清中总的HDL；沉淀剂II则进一步用于分离HDL中的亚组分。由这两种沉淀剂组成的试剂盒，为冠心病发病原因的研究以诊断和防治提供了一项简便、快速和可靠的方法。
本发明是这样实现的：分两大步骤：
一、先简便、快速合成特定低分子量右旋糖酐硫酸酯其方法为：
1、取2000毫升圆底三口烧瓶置于冰水浴中，加入525毫升甲酰胺溶液，并不断搅拌，使溶液温度降至10℃以下。
2、滴加125毫升氯磺酸(注意滴加速度不宜过快，以维持内温在15℃以下)
3、待滴加完毕后，即可逐渐升温至50℃-52℃。然后加入干燥的分子量为
3、待滴加完毕后，即可逐渐升温至50℃-52℃。然后加入干燥的分子量为25000的氢化右旋糖酐50g，并不断搅拌和控制内温在50℃-52℃之间反应1小时后，应取样测定反应物的粘度。当比粘度在0.65±0.05范围时应立即中止反应。
4、冷却至30℃以下时，即可加入1000毫升98％以上的乙醇进行沉淀。放置半小时后，倾去上清液，再将沉淀物溶解于300毫升蒸馏水中，再加800毫升98％乙醇沉淀一次。最后将沉淀物溶解于250毫升蒸馏水中，并调节PH至9，搅拌1小时，再将溶液通过阳离子交换树脂柱以除去杂质，然后过滤并将滤液的PH调至7左右，即可沉淀干燥，成白色粉状之右旋糖酐硫酸酯，最后进行质量控制和功能对照试验。
二、分离HDL及其亚组分试剂盒的制作：
本试剂盒由沉淀剂I和沉淀剂II所组成
1、沉淀剂I(分离HDL用)
于每个洁净的10毫升小玻璃瓶中，精确加入4毫升沉淀剂I浓缩液(主要成分为：右旋糖酐硫酸酯1.25％，氯化镁10.5％，0.5M Tris-HCI缓冲液0.1％)。然后真空干燥，加盖密封予备以后应用。
2、沉淀剂II(分离HDL亚组分用)
于每个洁净的10毫升小玻璃瓶中，精确加入4毫升沉淀剂II浓缩液(主要成分为：右旋糖酐硫酸酯0.95％，氯化镁20％，0.5M Tris-HCL缓冲液0.1％)，然后真空干燥加盖密封。予备以后应用。
发明的优点与效果在于：
一、应用自行研制的原料和方法，合成国际上优质的研究产品。如前所述，本发明所用的右旋糖酐经由自己合成、水解和氢化，然后再用甲酰胺方法取代国外常用的叱啶合成法，制备这种特定的低分子量右旋糖酐硫酸酯，经比较研究证明本产品与国际报告者的分子量、含硫量以及在分离HDL及其亚组分方面的功能完全一致，而且我们的方法更为简便和更少环境污染。
二、目前国际上关于诊断试剂的发展趋势已逐渐地将多种必需的成分组合成单一的试剂盒，既便于工业化生产，也方便用户使用和标准化操作，只是目前国内外尚未有此类试剂盒，因此，本发明尤有意义。其优点表现在如下几个方面：
1、简便快速从右旋糖酐硫酸酯的合成到试剂盒的制备过程并不复杂，设备也很简单，所花时间也不长，至于应用则只需加入蒸馏水溶解即成，省去用户配制试剂的繁复过程，同时也减低各家的操作误差。
2、重复性良好
为了验证本试剂盒的质量，我们进行了系列重复性试验，对同一试剂盒进行10次重复测定(批内试验)以及对6个不同批号的试剂盒进行重复试验(批间试验)，各项指标的相对误差均小于2％，证明重复性十分良好。
3、稳定性
本试剂盒由于进行真空干燥和真空包装，故存放三年13保持原有洁白的粉末状态，分离效果没有改变，溶解后放置冰箱也可使用1个月，这种稳定性，完全达到国际上的要求。
4、可靠性
采用本试剂盒与采用进口法国Sochibo公司产品比较HDL胆固醇含量两者相关系数r＝0.991，与超速离心法比较相关性也十分良好。提示本试剂盒十分可靠。
三、由于以上原因，本发明已收到很好的科研和社会效益，从全国大城市到边疆山区，从大的医疗研究机构到基层医务站，都试用本试剂盒，获得相当满意的结果，例如，上海医科大学，上海市心血管病研究所，用于流行病学的研究显示中国人冠心病发病率，显著低于西方国家，可能与血中HDL及其亚组分HDL胆固醇含量较高有关。苏州医学院以此试剂盒完成研究生论文，论证此试剂盒对研究避孕药物与脂蛋白代谢和冠心病之间的关系十分有价值，北京中国中医研究院西苑医院则用于研究中药与脂蛋白及冠心病防治的关系，较多的医疗单位则以此试剂盒作为新的诊断手段，为病人服务。
分离HDL及其亚组分试剂盒的使用方法
上述两种沉淀剂组成的试剂盒，使分离血清HDL及其亚组分HDL3的过程变得十分简便、快速和可靠。以此可测定其中的胆固醇含量，并间接计算出HDL2的胆固醇含量。具体方法如下：
1、沉淀剂的溶解
在使用试剂盒时，只需打开沉淀剂I和沉淀剂II的瓶盖，然后分别加入8毫升和10毫升蒸馏水，充分摆动使溶置冰箱备用(有效期一月)
2、HDL的分离
吸取0.5毫升血清标本于微量离心管中，加入50微升沉淀剂I水溶液，倾倒充分混匀，于3000-5000转/分速度下离心15分钟，上层清液含HDL，其他脂蛋白成分则沉淀于离心管底。
3、HDL亚组分的分离
吸取上述离心分离的上清液(内含HDL)300微升，置于另一微量离心管中，加入30微升沉淀剂II水溶液，倾倒充分混匀，于3000-5000转/分速度下离心30分钟，上清液中含有HDL3亚组分，而HDL2亚组分则沉淀于离心管底。
4、HDL及其亚组分胆固醇含量的测定
分别吸取上述(2)和(3)离心沉淀后的上清液，测定其中的胆固醇含量，即可得到HDL胆固醇和HDL3胆固醇含量，两者之间的差值，即为HDL2胆固醇含量。
Claims (2)
- 简便分离血清高密度脂蛋白及其亚组分试剂盒的制备方法。其特征在于：分两大步制作：一、先简便快速合成特定低分子量右旋糖酐硫酸酯，其方法为：1、取2000毫升圆底三口烧瓶置于冰水浴中，加入525毫升甲酰胺溶液，并不断搅拌使溶液温度低至10℃以下：2、在维持内温在15℃以下的情况滴加125毫升氯磺酸：至滴完；3、逐渐升温至50-52℃，之后加干燥的分子量为25,000的氢化右旋糖酐50克，并不断搅拌和控制内温在50-52℃之间，一小时后取样测定反应物的粘度当比粘度在0.65±0.05范围时应中止反应；4、冷却至30℃以下时加入1000毫升98％以上的乙醇进行沉淀，放置半小时后，倾去上清液，再将沉淀物溶解于300毫升蒸馏水中，再加800毫升98％乙醇沉淀一次，之后将沉淀物溶解于250毫升蒸馏水中，并调节PH至9搅拌1小时，再将溶液通过阳离子交换树脂柱以除去杂质之后过滤将滤液的PH调至7，即可沉淀干燥成白色粉状的右旋糖酐硫酸酯；
- 二、制作分离高密度脂蛋白及其组分试剂盒：本试剂盒由沉淀剂I和沉淀剂II组成1、分离高密度脂蛋白的沉淀剂I：将由组分右旋糖酐硫酸酯1.25％、氯化镁10.5％和0.5Mtris-HCL缓冲液0.1％组成的沉淀剂I的4毫升浓缩液加在每个洁净的10毫升的小玻璃瓶中，然后真空干燥加盖密封；2、分离高密度脂蛋白亚组分的沉淀剂II将由组分右旋糖酐硫酸酯0.95％、氯化镁20％，0.5M Tris-HCL缓冲液0.1％组成的沉淀剂II的4毫升加在每个洁净的10毫升小玻璃瓶中然后真空干燥加盖密封。
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